ES2879956T3 - Línea celular de hibridoma (My-C-cC0C2-259-1A4) y su uso para la preparación de un anticuerpo monoclonal contra la proteína C humana, específica del corazón que se une a la miosina (proteína C, MYBPC3, cMyBP- C o My-C) - Google Patents

Línea celular de hibridoma (My-C-cC0C2-259-1A4) y su uso para la preparación de un anticuerpo monoclonal contra la proteína C humana, específica del corazón que se une a la miosina (proteína C, MYBPC3, cMyBP- C o My-C) Download PDF

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Abstract

Línea celular de hibridoma DSM ACC3224, que produce el anticuerpo monoclonal anti-My-C-1A4 contra la proteína C cardíaca humana que se une a miosina.

Description

DESCRIPCIÓN
Línea celular de hibridoma (My-C-cC0C2-259-1A4) y su uso para la preparación de un anticuerpo monoclonal contra la proteína C humana, específica del corazón que se une a la miosina (proteína C, MYBPC3, cMyBP- C o My-C)
La invención se refiere a un clon de hibridoma de ratón que produce un anticuerpo monoclonal (anti-My-C-cC0C2-259-1A4; IgG1, kappa) que está dirigido contra la proteína C cardiaca que se une a la miosina (proteína C, MYBPC3, cMyBP-C o My-C) y la detecta y no reacciona con los isómeros estrechamente relacionados de My-C del músculo esquelético. Este AcMo es adecuado como anticuerpo capturador o detector para crear un ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) para la determinación cuantitativa de My-C en suero, plasma, sangre completa u otros líquidos corporales, para el diagnóstico precoz de infartos cardíacos. Dentro del alcance de este procedimiento de diagnóstico, éste puede posibilitar una terapia claramente más temprana de los infartos de miocardio.
Debido al grave peligro de muerte, los infartos de miocardio deben diagnosticarse rápidamente y diferenciarse de otras causas de dolor torácico. [1]
La determinación de biomarcadores para las necrosis miocárdicas es ahora fundamental para el diagnóstico de infartos cuando se sospecha de SCASESTs (síndromes coronarios agudos sin elevación del ST) y es imperativa para establecer un diagnóstico en un contexto clínico correspondiente. Las troponinas cardíacas (cTn) se consideran actualmente los biomarcadores más importantes. Forman parte de la definición general de infarto. [2] Sin embargo, las troponinas cardíacas (cTn) tienen déficits y nuevos biomarcadores podrían resultar muy valiosos. [3]
La concentración de cTn en suero no alcanza el máximo hasta 16-18 horas después del inicio de los síntomas y una desventaja de las pruebas de cTn anteriores, es su falta de sensibilidad analítica para registrar las concentraciones bajas de cTn en las primeras horas después del inicio de los síntomas. [4; 5]
Las pruebas de cTn más novedosas tienen como objetivo determinar de forma fiable valores más bajos de cTn, pero su reducida especificidad frente a los infartos reduce su valor porque se deben tener en cuenta concentraciones de cTn cercanas al percentil 99 de los sujetos sanos. Pero incluso entonces, las concentraciones de cTn están por debajo de este umbral hasta en un 25% de los pacientes con infarto. [6]
Dada la limitada sensibilidad y especificidad de las pruebas de cTn, en las directrices correspondientes (NICE) se recomienda que la cTn se determine 10-12 horas después del inicio de los síntomas (dolor en la región torácica) para confirmar el diagnóstico. [1] Aunque existe una serie de biomarcadores que se liberan más rápidamente después de un infarto, ninguno de ellos se ha impuesto porque no se expresan de una manera cardioselectiva. [7] Por esta razón, los esfuerzos se dirigen actualmente al análisis del alcance de los cambios en las concentraciones de cTn a lo largo del tiempo, con el fin de mejorar el valor informativo de las pruebas de cTn. Sigue sin quedar claro qué tamaño debe tener la diferencia absoluta en la concentración, para que las diferencias en la variación analítica y biológica de las concentraciones de cTn sean irrelevantes para el diagnóstico pretendido.
El biomarcador ideal se debería liberar rápidamente desde el miocardio después de un infarto, pero a diferencia de los marcadores anteriores comparables, debería ser específico del corazón. La proteína C cardiaca que se une a la miosina (proteína C, MYBPC3, cMyBP-C o My-C) es una proteína que cumple con esos criterios. Se ha identificado en el curso del análisis proteómico del efluente coronario procedente de corazones de ratón isquémicos. [8] Es una de las proteínas con mayor expresión en el miocardio (19a entre 2.300 proteínas) y está al menos dos veces más concentrada que cT nl y cT nT (92a y 1 1 8 a entre 2.300 proteínas). [9]
Existen 3 isómeros de My-C diferentes que están codificados por genes distintos. En contraste con My-C de los músculos esqueléticos rápidos y My-C de los músculos esqueléticos lentos, la isoforma específica del corazón tiene un dominio N-terminal único (Fig. 1) y otras regiones específicas del corazón que podrían servir como epítopos específicos. [10]
Se ha demostrado la liberación de My-C después de infartos o lesiones del miocardio [8; 11; 12; 13; 14] y los aumentos de la concentración a lo largo del tiempo se compararon con los de cTn. El documento EP 0 435 185 describe anticuerpos monoclonales que se unen a la proteína C del miocardio.
El objeto de la invención era preparar anticuerpos monoclonales que se pueden producir in vitro contra epítopos específicos del corazón de My-C humana, mediante la generación de clones de células de mieloma que producen tales anticuerpos específicos, con especificidad de epítopo. Estos anticuerpos monoclonales deben permitir, entre otras cosas, la creación de un ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) para una determinación cuantitativa específica y sin reactividad cruzada, de My-C en suero, plasma o sangre total.
El objeto se logra mediante la generación de un clon de célula de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que reconoce y se une a un epítopo específico del corazón en My-C y que no tiene reactividad cruzada con las proteínas que se unen a miosina del músculo esquelético. La línea celular de hibridoma se puede obtener mediante la fusión de células de mieloma con células de bazo de un animal de laboratorio inmunizado contra My-C recombinante, en particular el ratón. La línea celular de hibridoma se depositó en la DSMZ el 10 de diciembre de 2013, de acuerdo con los requisitos del T ratado de Budapest con el número de orden DSM ACC3224. El anticuerpo producido por este clon de célula de hibridoma es adecuado en combinación con uno o varios AcMos en un ELISA para una determinación sensible de la concentración de My-C en suero y, por tanto, para el diagnóstico precoz de infartos cardiacos.
La invención también tiene como objeto el anticuerpo específico de epítopo producido por la línea celular de hibridoma y su uso.
Para generar clones de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales contra My-C humana, específica del corazón, se inmunizaron ratones Balb/c de una manera conocida, a intervalos de seis a ocho semanas, con los dominios recombinantes cC0C2 de My-C (Figura 2). Los ratones se estimulan antes de extirpar el bazo. Las células de bazo aisladas se fusionan de una manera conocida con células de la línea celular de mieloma de ratón P3X63Ag8.653 (ATCC CPL 1580) y se cultivan en un medio adecuado. [15] Los hibridomas que producen exclusivamente anticuerpos contra My-C humana, se seleccionan, se clonan varias veces y se multiplican. La selección primaria de estos hibridomas específicos se llevó a cabo con la ayuda de un ELISA, en el que el péptido C0C2 de My-C se adsorbió en la superficie de placas de microvaloración.
La especificidad del epítopo del anticuerpo monoclonal del clon de acuerdo con la invención que se había seleccionado a partir de los clones de acuerdo con estos criterios, se determinó mediante un barrido de péptidos (Pepscan) (16, 17, 18). Para ello, se sintetizaron péptidos (secuencia idéntica al dominio cC0C2 de My-C usado para la inmunización) con una longitud de 15 residuos de aminoácidos como manchas individuales sobre una membrana. Las secuencias de los péptidos de 15 meros de manchas adyacentes se solapaban entre sí, de modo que la secuencia de aminoácidos completa del dominio cC0C2 de My-C se sintetizó como un solapamiento con un total de 111 manchas. Estos péptidos se incubaron sobre la membrana de cartografiado con el anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invención. El anticuerpo unido se detectó usando el sistema ECL™ (quimioluminiscencia mejorada, del inglés “Enhanced Chemiluminescence”) sobre una película.
Con la ayuda de este procedimiento era posible determinar cuáles de los péptidos de 15 meros eran reconocidos por el anticuerpo monoclonal preparado de acuerdo con la invención. A partir de la secuencia conocida de los péptidos en las manchas individuales detectadas (véase la Figura 3), se pudo deducir la secuencia de aminoácidos del epítopo de My-C humana reconocida por el anticuerpo monoclonal del clon de hibridoma (Figura 4).
El anticuerpo monoclonal 1A4 producido por el clon del hibridoma creado de acuerdo con la invención, se une a My-C humana en el epítopo con la secuencia
-A125 -E-L-G-E-S-A-P-S-P-K-
La prueba de que el anticuerpo monoclonal preparado de acuerdo con la invención no solo detecta péptidos sobre esa membrana de Pepspot, sino también la molécula completa del dominio cC0C2 de My-C humana, que contiene ese epítopo, se mostró mediante su uso en un ELISA. Un ELISA ejemplar de este tipo con el anticuerpo monoclonal 1A4 se muestra en la Figura 5.
El anticuerpo monoclonal caracterizado por el epítopo (IgG1, kappa) se puede modificar o marcar en su forma natural o como un fragmento. Este anticuerpo o sus formas modificadas se pueden utilizar para dilucidar el procesamiento de My-C humana, la cinética de su liberación y su aclaramiento desde el suero, para su detección cualitativa y su determinación cuantitativa (por ejemplo, con ELISA y transferencia Western), en inmunohistología o como diagnóstico.
La invención se explica a continuación con más detalle mediante ejemplos de realizaciones.
Ejemplos de realizaciones
Ejemplo 1:
Preparación de la línea celular de hibridoma
El bazo de un ratón inmunizado de manera conocida con cC0C2 de My-C, se extrae en condiciones estériles y las células del bazo se liberan por lavado desde la cápsula del bazo con una jeringa con medio RPMI1640 (Life Technologies™, Karlsruhe) y se aíslan. Las células del bazo se sedimentan (10 minutos a 300 x g), se lavan tres veces con medio RPMI1640 y se resuspenden en medio RPMI1640. A continuación se fusionan con células de mieloma de la línea P3X63Ag8.653 (ATTC CPL 1580). Para ello, las células de mieloma cultivadas que se encuentran en la fase logarítmica de crecimiento, también se sedimentan y se lavan tres veces. Se pipetean 1 x 108 células de bazo y 5 x 107 células de mieloma en un tubo de centrífuga, se mezclan a fondo y se centrifugan, y al cabo de un minuto se añade gota a gota al sedimento celular 1,5 ml de polietilenglicol 1500 (Roche, Basilea) al 50% precalentado, mientras que el tubo gira continuamente a 37°C. A continuación, la mezcla de la fusión se incuba a 37°C durante un minuto adicional. En los siguientes tres minutos, se añade gota a gota medio precalentado (RPMI1640) - 1 ml en el primer minuto, 3 ml en el segundo minuto y luego 18 ml. A continuación se centrifuga inmediatamente a 200 x g durante 10 minutos. El sedimento celular se recoge en medio RPMI1640 con FCS al 10% y HAT. Una parte del sedimento se siembra en placas de cultivo de 96 pocillos y el resto se congela en nitrógeno líquido a -196°C. Como células alimentadoras en el cultivo se emplean macrófagos peritoneales de ratón, que se llevaron al cultivo 1 día antes de la fusión (1 x 104 macrófagos por pocillo en medio HAT). Las células se incuban en una incubadora con CO2 a 37°C. El medio se reemplaza por medio RPMI1640-HAT de nuevo aporte después de 3-5 días y, dependiendo del crecimiento de las células fusionadas, se analiza el material sobrenadante de los cultivos con un ELISA para determinar su reactividad frente al antígeno (My-C), después de aproximadamente 2 semanas.
Ejemplo 2:
Selección de los clones productores de anticuerpos
Todos los clones en crecimiento o sus anticuerpos se sometieron a ensayo para determinar su reactividad con la ayuda de un ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas). El agente inmunoabsorbente era el inmunógeno, el dominio cC0C2 recombinante de My-C (aproximadamente 2 pg/ml).
Realización del ELISA:
1. Recubrimiento de las placas de microvaloración (Costar, unión elevada) con 50 pl de solución de inmunógeno por pocillo a 4°C durante la noche;
2. Lavado de las placas de microvaloración (MTP) 3 veces con TBS (solución salina tamponada con TRIS), pH 7,4;
3. Bloqueo de las MTP con 200 pl de reactivo de bloqueo (Boehringer, Mannheim) por pocillo, 1 hora a 37°C; 4. Lavado de las MTP, 3 veces con NaCl-Tween 20;
5. Incubación con material sobrenadante de los cultivos de hibridomas; 50 pl por pocillo, diluidos aproximadamente 1:2 con TBS-Tween 20;
6. Lavado de las MTP, 3 veces con NaCl-Tween 20;
7. Incubación con anticuerpos Ig anti-ratón, acoplados a peroxidasa, 50 pl por pocillo, 1 hora a temperatura ambiente;
8. Lavado de las MTP, 3 veces con NaCl-Tween 20;
9. Incubación con solución ABTS (100 mg de ABTS por 100 ml de tampón de sustrato [citrato, perborato de sodio, pH 4,4]), 50 pl por pocillo;
10. Medición a 405 nm tras un tiempo de incubación de 60 minutos a temperatura ambiente con un lector de microplacas (SLT).
Ejemplo 3:
Cartografiado de los epítopos para el anticuerpo monoclonal 1A4 en My-C humana, específica del corazón
La identificación del sitio de unión del anticuerpo monoclonal 1A4 se llevó a cabo utilizando el método de barrido de péptidos. Para ello, la secuencia completa de aminoácidos del dominio cC0C2 humano de My-C, que se había empleado para la inmunización, se divide en un total de 111 secuencias solapantes de aminoácidos, cada una con 15 aminoácidos de longitud. Esas secuencias se sintetizan como péptidos individuales en manchas directamente sobre una membrana de celulosa. La membrana se incuba con el material sobrenadante de los cultivos que contienen anticuerpos de los hibridomas y los sitios de unión de los anticuerpos se hacen visibles mediante una incubación con un anticuerpo de Ig anti-ratón acoplado a peroxidasa. Para ello, después de lavar tres veces con TBS-Tween, la membrana se coloca entre láminas de copiado y luego se incuba durante 3 minutos con el reactivo de detección ECL™ (quimioluminiscencia mejorada) (Amersham, Braunschweig). A continuación, una película colocada sobre la membrana (Hyperfilm-ECL™ [RPN 2103H Amersham, Braunschweig]) se expone a la luz durante 30 segundos a 3 minutos. Las secuencias detectadas por el anticuerpo se identifican asignando las manchas 31 y 32 expuestas sobre la película (Figura 4), a las secuencias parciales de 15 meros del inmunógeno localizadas en las manchas (dominio cC0C2 de My-C).
Mancha 31 121 PAPAAELGESAPSPK 15 1A4 Mancha 32 125 AELGESAPSPKGSSS 15 1A4 La secuencia central identificada de las dos secuencias parciales, es la secuencia de aminoácidos -A125-E-L-G-E-S-A-P-S-P-K-. Esta secuencia es el epítopo detectado al que se une el anticuerpo 1A4 en My-C humana.
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Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Línea celular de hibridoma DSM ACC3224, que produce el anticuerpo monoclonal anti-My-C-1 A4 contra la proteína C cardíaca humana que se une a miosina.
2. Anticuerpo monoclonal anti-My-C-1A4, caracterizado por que reconoce y se une al epítopo de la secuencia AELGESAPSPK en la región de los aminoácidos Alanina 125 a Lisina 135 de la secuencia de My-C cardíaca humana.
3. Anticuerpo monoclonal anti-My-C-1A4 según la reivindicación 2, caracterizado por que es producido por una línea celular de hibridoma según la reivindicación 1.
4. Procedimiento para la preparación de anticuerpos monoclonales según la reivindicación 2 o 3, caracterizado por que se cultiva una línea celular de hibridoma según la reivindicación 1 y se aíslan los anticuerpos monoclonales producidos.
5. Uso in vitro del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2 y/o 3, con fines analíticos, como anticuerpo capturador o detector en un ELISA para determinar la concentración de My-C en suero o plasma y, por tanto, para el diagnóstico precoz de infartos de miocardio.
6. Uso in vitro del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2 y/o 3, con fines analíticos, en inmunotransferencias, en inmunohistoquímica y otros procedimientos analíticos in vitro.
ES15713829T 2014-01-27 2015-01-23 Línea celular de hibridoma (My-C-cC0C2-259-1A4) y su uso para la preparación de un anticuerpo monoclonal contra la proteína C humana, específica del corazón que se une a la miosina (proteína C, MYBPC3, cMyBP- C o My-C) Active ES2879956T3 (es)

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