CN106459927B - 杂交瘤细胞系(My-C-cC0C2-259-1A4)及其生产抗人心脏肌球蛋白结合蛋白C(C蛋白、MYBPC3、cMyBP-C或者My-C)单克隆抗体的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于，通过生成可产生具有表位特异性的特异性抗体的骨髓瘤细胞克隆，在体外生产抗人My‑C的心脏表位的单克隆抗体。此外，这些单克隆抗体还可以使得ELISA(酶联免疫吸附测定)能够特异的、没有交叉反应性的定量测定血清、血浆或者全血中形成的My‑C。该目的通过产生能生产单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆实现，所述单克隆抗体识别并结合My‑C中的心脏表位，并且与骨骼肌的肌球蛋白结合蛋白没有交叉反应性。将骨髓瘤细胞与对重组My‑C免疫的试验动物尤其是小鼠的脾细胞融合，即可获得所述杂交瘤细胞系。本发明还涉及杂交瘤细胞系产生的表位特异性抗体及其应用。

Description

杂交瘤细胞系(My-C-cC0C2-259-1A4)及其生产抗人心脏肌球 蛋白结合蛋白C(C蛋白、MYBPC3、cMyBP-C或者My-C)单克隆抗 体的应用
技术领域
本发明涉及小鼠杂交瘤克隆，其产生针对心脏肌球蛋白结合蛋白C(C-蛋白、MYBPC3、cMyBP-C或My-C)的单克隆抗体(抗-My-C-cC0C2-259-1A4；IgG1，κ)，且其不与来自骨骼肌的My-C的密切相关异构体反应。这种mAb适合作为捕获或检测抗体用于ELISA(酶联免疫吸附测定)以定量测定血清、血浆、全血或其他体液中的My-C以用于心脏病早期诊断的开发。根据这一诊断程序，可以更早期治疗心肌梗死。
背景技术
由于存在急性生命危险，必须迅速诊断心肌梗死并与其它胸部疼痛原因区分开来。[1]
心肌坏死生物标志物的测定现在对于疑似NSTE-ACSs(非-ST抬高急性冠状动脉综合征)的梗死诊断是必需的并且是作出相应临床诊断的必要依据。心脏肌钙蛋白(cTn)目前是十分重要的生物标志物。他们是一般性梗死定义的一部分。[2]但是心脏肌钙蛋白(cTn)有缺陷，新的生物标志物可能是非常有价值的。[3]
血清中的cTn浓度只有在出现症状之后16～18小时才会达到最大值，并且之前cTn检测的缺陷是缺乏分析敏感性，不足以在症状开始之后的起初数小时之内检测低cTn浓度。[4；5]
新的cTn检测方法目的是可靠测定低cTn值，但是其对于梗死降低的特异性减少了其价值，因为cTn浓度在大约99％的健康对象中观察到。但是即便如此，多达25％梗死患者的cTn浓度还是低于该阈值。[6]
鉴于cTn检测的敏感性和特异性有限，在相应的指南(NICE)中建议在症状(胸部疼痛)开始之后10～12小时测定cTn，以使得诊断可靠。[1]尽管有一系列生物标志物会在梗死之后更快释放，但因为他们不是心脏特异性表达的，因此没有一个能够实施。[7]为此，目前的努力均集中于分析cTn浓度随时间变化的程度，以便改善cTn检测的说服力。仍然不清楚绝对浓度差必须有多大，才会让cTn浓度的分析和生物学变化差异对于预期诊断来说毫无意义。
理想的生物标志物在梗死后从心肌快速释放，但与以前类似的标志物不同，其是心脏特异性的。心脏肌球蛋白结合蛋白C(C-蛋白、MYBPC3、cMyBP-C或My-C)是符合这些标准的一种蛋白质。其在缺血小鼠心脏冠状动脉流量蛋白质组学分析中鉴别。[8]其是心肌中具有最高表达的蛋白质之一(2300个蛋白质中是19)并且是cTnI和cTnT浓度的至少两倍(2300个蛋白质中分别是92和118)。[9]
存在3种不同的My-C异构体，通过不同基因编码。与快骨骼肌的My-C和慢骨骼肌的My-C的区别在于，心脏特异性异构体具有独特的N端结构域(图1)并具有可作为特异性表位的其它心脏特异性区域。[10]
已证明心肌梗死或损伤之后释放My-C[8；11；12；13；14]，并且将随时间变化的浓度上升曲线与cTn的进行了比较。
发明内容
本发明的目的在于，通过生成可产生表位特异性的特异性抗体的骨髓瘤细胞克隆，在体外生产抗人My-C心脏表位的单克隆抗体。此外，所述单克隆抗体还可以建立一种ELISA(酶联免疫吸附测定)，以没有交叉反应的方式特异性定量测定血清、血浆或者全血中形成的My-C。
通过产生生产单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆实现该目的，所述单克隆抗体识别并结合My-C中的心脏表位，并且对骨骼肌的肌球蛋白结合蛋白没有交叉反应性。将骨髓瘤细胞与一种对重组My-C免疫的试验动物尤其是小鼠的脾细胞融合，即可获得所述杂交瘤细胞系。根据布达佩斯条约的要求，已在2013年12月10日以登记号DSM ACC3224将杂交瘤细胞系保藏于DSMZ。该杂交瘤细胞克隆产生的抗体组合一或多种其他mAb适用于ELISA中以用于灵敏测定血清中My-C的浓度并且因此适合于早期诊断心肌梗死。
本发明的另一目的是杂交瘤细胞系产生的表位特异性抗体及其应用。
为了生成生产抗人心脏特异性My-C的单克隆抗体的杂交瘤克隆，以已知方式间隔六至八周使用My-C的重组结构域cC0C2(图2)对Balb/c小鼠进行免疫。在取出脾脏之前给予小鼠加强剂量。以已知方式将分离的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系P3X63Ag8.653(ATCC CPL1580)的细胞融合，并且在合适的培养基中进行培养。[15]
选择仅产生抗人My-C的抗体的杂交瘤，多次克隆和增殖。将My-C的C0C2肽吸附到微量滴定板的表面上，利用ELISA初步选择这些特异性杂交瘤。
通过肽扫描(Pepscan)确定根据这些标准从克隆中选择的本发明所述克隆的单克隆抗体的表位特异性(16，17，18)。为此合成了长度为15个氨基酸残基的肽(与用于免疫的My-c的cC0C2结构域序列一致)作为膜上的各个斑点。相邻斑点的15肽的序列相互重叠，使得My-C的cC0C2结构域的整个氨基酸序列在总计111个斑点中重叠合成。在具有本发明所述单克隆抗体的定位膜上保温这些肽。在膜上利用ECLTM系统(增强化学发光法)检测已结合的抗体。
可以借助该方法确定按照本发明所述生产的单克隆抗体识别哪些15肽。所检测的单个斑点中肽的已知序列(参考图3)表明杂交瘤克隆的单克隆抗体识别的人My-C的表位的氨基酸序列。(图4)
按本发明所述生成的杂交瘤克隆所产生的单克隆抗体1A4结合人My-C中具有以下序列的表位
-A124-A-E-L-G-E-S-A-P-S-P-K-
在ELISA的使用证明按照本发明所述制备的单克隆抗体不仅可检测Pepspot膜上的肽，而且也可检测含有该表位的人My-C的cC0C2结构域的整个分子。图5示出使用单克隆抗体1A4的ELISA示例。
可以修饰或者标记以上列举的表位特征化单克隆抗体(IgG1,kappa)的天然形式或者片段。该抗体或者其修饰形式可用于解释人My-C的处理、其释放动力学及其血清清除，可在免疫组织学领域用于定性检测和定量测定(例如ELISA和Western Blot)或者作为诊断剂。
通过以下示例性实施方案更详细说明本发明。
附图说明
图1示出单克隆抗体抗-My-C-cC0C2-259-1A4所检测表位的范围内的心肌My-C的一级结构(已标记)，与骨骼肌和平滑肌MyC(MYC1_人和MYC2_人)的一级结构相比。
图2示出心肌My-C(肌球蛋白结合蛋白C)的cC0C2结构域的氨基酸序列。
图3示出抗-My-C-cC0C2-259-1A4的表位作图。ECL胶片：证实结合在My-C-cC0C2-Pepspot膜斑点31和32的mAb 1A4。
图4示出表位作图：位于作图-膜Pepspot 1～41中包含的相互重叠的15肽列表。
图5示出在ELISA中检测证实重组cC0C2的单克隆抗体抗-My-C-cC0C2-259-1A4。
实施例
实施例1：
制备杂交瘤细胞系
在无菌条件下取出以已知方式用My-C的cC0C2免疫的小鼠的脾脏，使用RPMI 1640培养基(Life TechnologiesTM,Karlsruhe)利用注射器从脾包膜中冲洗出并稀释脾细胞。沉淀脾细胞(10分钟，300x g)，使用RPMI 1640培养基洗涤三次，重悬于RPMI 1640培养基中。然后，将其与骨髓瘤细胞系P3X63Ag8.653(ATTC CPL 1580)融合。为此，同样沉淀经过培养后处在生长对数期的骨髓瘤细胞并洗涤三次。将1x 108脾细胞和5x 107骨髓瘤细胞吸移到离心管中，充分混合并离心，离心管在37℃连续旋转，在一分钟之内将1.5ml预热的50％聚乙二醇1500(Roche,Basel)逐滴加入到细胞沉淀物中。然后将融合反应在37℃再保温一分钟。在随后的三分钟内逐滴加入预热的培养基(RPMI 1640)-在第一分钟内加入1ml，在第二分钟内加入3ml，然后加入18ml。接着，立即以200x g离心10分钟。将细胞沉淀收入在含有10％FCS和HAT的RPMI 1640培养基中。将一部分细胞沉淀接种在96孔培养板中，在-196℃液氮中冷冻其余部分。培养小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合之前将其培养1天(每孔1x 104巨噬细胞，HAT培养基)。在CO2-培养箱中37℃保温细胞。每3～5天，将培养基替换成新鲜的RPMI 1640-HAT培养基，根据融合细胞的生长情况，大约2周后利用ELISA检测培养上清液对抗原(My-C)的反应性。
实施例2：
选择产生抗体的克隆
利用ELISA(酶联免疫吸附测定)检测所有生长克隆或者其抗体的反应性。使用的免疫吸附剂是免疫原，My-C的重组cC0C2结构域(大约2μg/ml)。ELISA方案：
1.在4℃用每孔50μl免疫原溶液包被微量滴定板(Costar，高结合力)过夜；
2.洗涤微量滴定板(MTP)，用TBS(TRIS-缓冲盐水)pH 7.4洗3次；
3.封闭MTP，每孔200μl封闭剂(Boehringer,Mannheim)，37℃、1小时；
4.洗涤MTP，用NaCl-Tween 20洗3次；
5.使用杂交瘤培养上清液保温；每孔50μl，用TBS-Tween 20大约1:2稀释；
6.洗涤MTP，用NaCl-Tween 20洗3次；
7.使用偶联过氧环物酶的抗小鼠Ig抗体保温，每孔50μl，室温1小时；
8.洗涤MTP，用NaCl-Tween 20洗3次；
9.用ABTS溶液(100mg ABTS每100ml底物缓冲液[柠檬酸盐，过硼酸钠，pH 4.4])保温，每孔50μl；
10.室温保温60分钟后，用微孔板读数器(SLT)在405nm测量。
实施例3：
人心脏特异性My-C中单克隆抗体1A4的表位作图
利用肽扫描方法鉴定单克隆抗体1A4的结合位点。为此，将用于免疫的My-C的人cC0C2结构域的全部氨基酸序列分为总计111个相互重叠的氨基酸序列，长度15个氨基酸。直接在纤维素膜上合成这些序列作为斑点中的各个肽。用含有抗体的杂交瘤培养上清液保温膜，并且通过用过氧化物酶偶联的抗小鼠Ig抗体保温使得抗体结合位点可见。为此，在用TBS-Tween洗涤三次后，将膜放在复制胶片之间，然后与ECLTM(增强化学发光法)检测试剂(Amersham,Braunschweig)保温3分钟。接着将放置的胶片(Hyperfilm-ECLTM[RPN 2103HAmersham,Braunschweig])曝光30秒-3分钟。
将胶片上曝光的斑点31和32(图4)对应于位于斑点中的免疫原(My-C的cC0C2结构域)的15肽亚序列，鉴定抗体检测的序列。
斑点31 121 PAPAAELGESAPSPK 15 1A4
斑点32 125 AELGESAPSPKGSSS 15 1A4
识别的两个亚序列的中心序列是氨基酸序列-A124-A-E-L-G-E-S-A-P-S-P-K-。该序列是所检测的人My-C中抗体1A4结合的表位。
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Claims (7)

1.杂交瘤细胞系DSMACC3224，其产生针对人心脏肌球蛋白结合蛋白C(My-C)的单克隆抗体。
2.单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞系产生。
3.权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体识别并结合人心脏My-C的氨基酸A125-K135序列区域中的表位。
4.产生权利要求2或3所述的单克隆抗体的方法，其特征在于，培养权利要求1所述的杂交瘤细胞系和分离所产生的单克隆抗体。
5.权利要求2所述的单克隆抗体在制备用于测定血清或血浆中My-C浓度并因此早期诊断心肌梗死的试剂中的应用。
6.权利要求5所述的应用，其中所述试剂是ELISA中的捕获或检测抗体。
7.权利要求2所述的单克隆抗体在免疫印迹和免疫组织化学中的应用。
CN201580011262.0A 2014-01-27 2015-01-23 杂交瘤细胞系(My-C-cC0C2-259-1A4)及其生产抗人心脏肌球蛋白结合蛋白C(C蛋白、MYBPC3、cMyBP-C或者My-C)单克隆抗体的应用 Active CN106459927B (zh)

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PCT/DE2015/000028 WO2015110114A2 (de) 2014-01-27 2015-01-23 Hybridom-zelllinie (my-c-cc0c2-259-1 a4) und deren verwendung zur herstellung eines monoklonalen antikörpers gegen das humane, herzspezifische myosin binding protein c (c-protein, mybpc3, cmybp-c oder my-c)

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