JP2017505618A - ハイブリドーマ細胞系統（Ｍｙ−Ｃ−ｃＣ０Ｃ２−２５９−１Ａ４）および該細胞系統の、ヒトの心臓特異的なミオシン結合タンパク質Ｃ（Ｃ−タンパク質、ＭＹＢＰＣ３、ｃＭｙＢＰ−ＣまたはＭｙ−Ｃ）に対するモノクローナル抗体の製造のための使用 - Google Patents

Abstract

本発明の課題は、ヒトＭｙ−Ｃの心臓特異的エピトープに対するインビトロで生産可能なモノクローナル抗体を、そのようなエピトープ特異性を有する特異抗体を産生する骨髄腫細胞クローンの生成によって製造することであった。これらのモノクローナル抗体は、とりわけ、血清、血漿または全血におけるＭｙ−Ｃの特異的な交差反応性のない定量的な測定のためのＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）の構成を可能にするべきである。前記課題は、Ｍｙ−Ｃにおける心臓特異的なエピトープを認識して結合するとともに、骨格筋組織のミオシン結合タンパク質に対する交差反応性を示さないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞クローンを生成することによって解決される。該ハイブリドーマ細胞系統は、骨髄腫細胞と、組換え型のＭｙ−Ｃに対して免疫化された実験動物、特にマウスの脾臓細胞とを融合させることによって得られる。更に、本発明の主題は、該ハイブリドーマ細胞系統から産生されたエピトープ特異的な抗体および該抗体の使用である。

Description

本発明は、モノクローナル抗体（抗Ｍｙ−Ｃ−ｃＣ０Ｃ２−２５９−１Ａ４；ＩｇＧ１，κ）であって、心筋ミオシン結合タンパク質（Ｃ−タンパク質、ＭＹＢＰＣ３、ｃＭｙＢＰ−ＣまたはＭｙ−Ｃ）に対するものであり、かつ該タンパク質を検出するが、骨格筋組織由来のＭｙ−Ｃの近縁のアイソマーとは反応しないモノクローナル抗体を産生するマウスのハイブリドーマクローンに関する。このモノクローナル抗体は、心筋梗塞の早期診断のために血清、血漿、全血または他の体液中のＭｙ−Ｃを定量的に測定するＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）の構成のための捕捉抗体または検出抗体として適している。この診断法の範囲では、前記抗体は、心筋梗塞の明らかにより早期の療法を可能にしうる。

急激な命の危険のため、心筋梗塞は、即座に診断して他の胸郭の痛みの原因と区別せねばならない［１］。心筋壊死のためのバイオマーカーの決定は、こうしたなか、ＮＳＴＥ−ＡＣＳ（非ＳＴ上昇型急性冠症候群）と推測された場合の梗塞の診断のために必須であるとともに、相応の臨床的関連において診断を下すためには決して欠かすことはできない。心筋トロポニン（ｃＴｎ）は、目下、決定的なバイオマーカーとみなされている。該心筋トロポニンは、一般的な梗塞定義の構成要素である［２］。しかし、該心筋トロポニン（ｃＴｎ）には欠点があるため、新たなバイオマーカーがあれば非常に有益であろうことが分かっている。血清中のｃＴｎ濃度は、症状が出だした最初の１６時間〜１８時間で最大に到達し、今までのｃＴｎ試験の欠点は、それらの試験の、症状の始まりの最初の１時間における低いｃＴｎ濃度を把握するための分析感度不足である［４；５］。近年のｃＴｎ試験は、低いｃＴｎ値の確度の高い測定をするように努力がなされているが、ｃＴｎ濃度は、健康な被験者の９９パーセンタイル近くでも見られるべきであるため、その値の梗塞に対して低下された特異性はその価値を下げる。しかし、その場合でも、該梗塞患者の２５％以下でのｃＴｎ濃度は、その閾値を下回る［６］。ｃＴｎ試験の限られた感度および特異性に鑑みて、相応のガイドライン（ＮＩＣＥ）では、診断を確実なものにするために、症状（胸郭の範囲の痛み）の開始から１０時間〜１２時間後にｃＴｎを測定することを推奨している［１］。梗塞後に先んじて放出される一連のバイオマーカーが存在するにもかかわらず、それらのバイオマーカーは心臓特異的に発現されないため、そのうちのいずれも成果を収めることができなかった［７］。この理由から、目下、ｃＴｎ試験の裏付け能力を向上させるために、ｃＴｎ濃度の時間的変化の程度の分析に尽力が寄せられている。この場合、意図した診断を下すためのｃＴｎ濃度の分析的および生物学的な変動の差が些細なものであるようにするために、絶対的な濃度差がどれほど大きくなければならないかは不透明なままである。理想的なバイオマーカーは、梗塞後に心筋から素早く放出されねばならないが、匹敵する今までのマーカーとは異なり心臓特異的でなければならない。前記心筋ミオシン結合タンパク質Ｃ（Ｃ−タンパク質、ＭＹＢＰＣ３、ｃＭｙＢＰ−ＣまたはＭｙ−Ｃ）は、この基準を満たすタンパク質である。該タンパク質は、虚血マウス心臓の冠動脈流出液のプロテオーム分析で同定された［８］。該タンパク質は、心筋中で非常に多く発現されるタンパク質（２３００種のタンパク質のうち１９番目）に該当し、ｃＴｎＩおよびｃＴｎＴ（２３００種のタンパク質のうち９２番目または１１８番目）の少なくとも二倍の濃度である［９］。異なる遺伝子によってコードされる３種の異なるＭｙ−Ｃアイソマーが存在する。その心臓特異的アイソフォームは、速筋骨格筋組織のＭｙ−Ｃおよび遅筋骨格筋組織のＭｙ−Ｃと異なり、ユニークなＮ末端ドメイン（図１）と、特異的なエピトープとして用いることができるであろうもう一つの心臓特異的領域とを有する［１０］。心筋梗塞または心筋損傷後のＭｙ−Ｃの放出は検出されており［８；１１；１２；１３；１４］、その濃度上昇の時間的推移はｃＴｎの時間的推移と比較されている。

本発明の課題は、ヒトＭｙ−Ｃの心臓特異的エピトープに対するインビトロで生産可能なモノクローナル抗体を、そのようなエピトープ特異性を有する特異抗体を産生する骨髄腫細胞クローンの生成によって製造することであった。これらのモノクローナル抗体は、とりわけ、血清、血漿または全血におけるＭｙ−Ｃの特異的な交差反応性のない定量的な測定のためのＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）の構成を可能にするべきである。

前記課題は、Ｍｙ−Ｃにおける心臓特異的なエピトープを認識して結合するとともに、骨格筋組織のミオシン結合タンパク質に対する交差反応性を示さないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞クローンを生成することによって解決される。該ハイブリドーマ細胞系統は、骨髄腫細胞と、組換え型のＭｙ−Ｃに対して免疫化された実験動物、特にマウスの脾臓細胞とを融合させることによって得られる。該ハイブリドーマ細胞系統は、２０１３年１２月１０日に、ブダペスト条約の要件に準じてＤＳＭＺで寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ３２２４で寄託された。このハイブリドーマ細胞クローンから産生された抗体は、１種以上の別のモノクローナル抗体と組み合わせて、血清中のＭｙ−Ｃの濃度の測定と、更に心筋梗塞の早期診断のためのＥＬＩＳＡにおいて適している。

更に、本発明の主題は、該ハイブリドーマ細胞系統から産生されたエピトープ特異的な抗体および該抗体の使用である。

ヒトの心臓特異的なＭｙ−Ｃに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンの生成のために、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、公知のようにして、６週間から８週間までの間隔においてＭｙ−Ｃの組換え型のドメインｃＣ０Ｃ２（図２）で免疫化した。該マウスを、脾臓を取り出す前に追加免疫する。単離された脾臓細胞を、公知のようにしてマウス骨髄腫細胞系統Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＰＬ １５８０）の細胞と融合させ、そして適切な培地中で培養する［１５］。ヒトＭｙ−Ｃに対する抗体のみを産生するハイブリドーマを選択し、繰り返しクローニングし、そして増殖させる。この特異的ハイブリドーマの一次選択は、Ｍｙ−ＣのＣ０Ｃ２ペプチドがマイクロタイタープレートの表面に吸着されたＥＬＩＳＡを用いて実施した。

それらのクローンから前記基準に従って選択された本発明によるクローンのモノクローナル抗体のエピトープ特異性を、ペプチドスキャニング（Ｐｅｐｓｃａｎ）によって測定した（１６，１７，１８）。そのために、１５のアミノ酸残基の長さを有するペプチド（免疫化のために使用されるＭｙ−ＣのｃＣ０Ｃ２ドメインと配列的に同一）をメンブレン上に個々のスポットとして合成した。隣接したスポットの１５マーのペプチドの配列は重複しているので、Ｍｙ−ＣのｃＣ０Ｃ２ドメインの全アミノ酸配列は、全体で１１１個のスポットにおいて重複して合成された。これらのペプチドを、マッピングメンブレン上で本発明によるモノクローナル抗体と一緒にインキュベートした。結合された抗体の検出は、フィルム上でＥＣＬ（商標）（増強化学発光（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ））システムを用いて行った。この方法を用いて、本発明により製造されたモノクローナル抗体によって、前記１５マーのどのペプチドが認識されるかを測定できた。検出された個々のスポット（図３を参照）におけるペプチドの既知の配列を通じて、該ハイブリドーマクローンのモノクローナル抗体によって認識されるヒトＭｙ−Ｃのエピトープのアミノ酸配列を推定することができた（図４）。

本発明により作製されたハイブリドーマクローンによって産生されるモノクローナル抗体１Ａ４は、ヒトＭｙ−Ｃにおいて、配列−Ａ１２９−Ａ−Ｅ−Ｌ−Ｇ−Ｅ−Ｓ−Ａ−Ｐ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−を有するエピトープへと結合する。

本発明により製造されたモノクローナル抗体が前記Ｐｅｐｓｐｏｔメンブレン上でペプチドを検出するだけでなく、前記エピトープを含むヒトＭｙ−ＣのｃＣ０Ｃ２ドメインの全分子も検出するということは、該抗体をＥＬＩＳＡで使用することによって立証された。モノクローナル抗体１Ａ４を用いたそのような例示的なＥＬＩＳＡが、図５に示されている。上述のエピトープに特徴的なモノクローナル抗体（ＩｇＧ₁，κ）は、該抗体のネイティブな形態においてまたは断片として改変もしくは標識されてよい。この抗体または該抗体の改変された形態は、ヒトＭｙ−Ｃのプロセシング、その遊離のキネティックおよびその血清からのクリアランスの解明のために、前記Ｍｙ−Ｃの定性的検出およびその定量的測定（例えばＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）のために、免疫組織学において、または診断学として使用することができる。

モノクローナル抗体の抗Ｍｙ−Ｃ−ｃＣ０Ｃ２−２５９−１Ａ４によって検出されたエピトープ（印を付けた）の範囲内の心筋Ｍｙ−Ｃの一次構造と、骨格筋組織のＭｙＣおよび平滑筋組織のＭｙＣ（ＭＹＣ１＿ＨＵＭＡＮおよびＭＹＣ２＿ＨＵＭＡＮ）の一次構造との比較を示す図 心筋Ｍｙ−Ｃ（ミオシン結合タンパク質Ｃ）のｃＣ０Ｃ２ドメインのアミノ酸配列を示す図 抗Ｍｙ−Ｃ−ｃＣ０Ｃ２−２５９−１Ａ４のエピトープマッピングを示す図 エピトープマッピング：マッピングメンブレンのＰｅｐｓｐｏｔ１〜４１に含まれる重複した１５マーのペプチドのリストを示す図 モノクローナル抗体の抗Ｍｙ−Ｃ−ｃＣ０Ｃ２−２５９−１Ａ４についてのＥＬＩＳＡにおける組換え型のｃＣ０Ｃ２への結合の検出を示す図

本発明を以下に実施例によってより詳細に説明する。

実施例
例１：
ハイブリドーマ細胞系統の製造
Ｍｙ−ＣのｃＣ０Ｃ２で公知のようにして免疫化されたマウスの脾臓を、滅菌条件下で取り出し、そして脾臓細胞を、脾臓皮膜内からシリンジを用いてＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）、カールスルーエ）ですすぎ出して、ばらばらにする。該脾臓細胞をペレット化（３００×ｇで１０分間）させ、ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、そしてＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁させる。次いで、該脾臓細胞を、系統Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＴＣ ＣＰＬ １５８０）の骨髄腫細胞と融合させる。そのために、対数増殖期にある培養された骨髄腫細胞を同様にピペットで取り、３回洗浄する。１×１０⁸個の脾臓細胞と５×１０⁷個の骨髄腫細胞を、遠心分離チューブ中にピペットで取り、激しく混ぜ、遠心分離し、その細胞沈降物に、１分以内で、１．５ｍｌの予熱された５０％のポリエチレングリコール１５００（ロシュ、バーゼル）を３７℃でその小さいチューブを連続的に回転させながら滴加する。次いで、その融合バッチを更に１分間にわたり３７℃でインキュベートする。引き続き３分間で、予熱された培地（ＲＰＭＩ１６４０）を、最初の１分間で１ｍｌで、２番目の１分間で３ｍｌで、そして次に１８ｍｌで滴加する。引き続き、直ちに２００×ｇで１０分間にわたり遠心分離する。その細胞ペレットを、１０％ＦＣＳおよびＨＡＴを含むＲＰＭＩ１６４０培地中に取る。該ペレットの一部を、９６ウェル培養プレート中に撒き、残りを液体窒素中で−１９６℃において凍結させる。その培養に際してフィーダー細胞として、前記融合前に１日間培養したマウス腹腔マクロファージ（１ウェル当たりＨＡＴ培地中１×１０⁴個のマクロファージ）を用いる。それらの細胞を、ＣＯ₂インキュベーター中で３７℃でインキュベートする。培地をそれぞれ３日〜５日後に新たなＲＰＭＩ１６４０−ＨＡＴ培地と交換し、前記融合された細胞の増殖に応じて、培養上清を、約２週間後にＥＬＩＳＡで、抗原（Ｍｙ−Ｃ）に対するその反応性について試験する。

例２：
抗体を産生するクローンの選択
増殖している全てのクローンまたは該クローンの抗体を、その反応性についてＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を用いて試験した。免疫吸着剤は、免疫原、つまりＭｙ−Ｃの組換え型のｃＣ０Ｃ２ドメイン（約２μｇ／ｍｌ）であった。

ＥＬＩＳＡの実施：
１． マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ、高結合）を１ウェル当たり５０μｌずつの免疫原溶液により４℃で一晩にわたりコーティングする。
２． 該マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）を、ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）で３回洗浄する。
３． 該ＭＴＰを、１ウェル当たりに２００μｌのブロッキング試薬（ベーリンガー、マンハイム）を用いて３７℃で１時間にわたりブロッキングする。
４． 該ＭＴＰを、ＮａＣｌ−Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄する。
５． １ウェル当たりに５０μｌずつのハイブリドーマ培養の培養上清と一緒に、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０による約１：２希釈でインキュベートする。
６． 該ＭＴＰを、ＮａＣｌ−Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄する。
７． １ウェル当たりに５０μｌのペルオキシダーゼに結合された抗マウスＩｇ抗体と一緒に、室温で１時間にわたりインキュベートする。
８． 該ＭＴＰを、ＮａＣｌ−Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄する。
９． １ウェル当たり５０μｌのＡＢＴＳ溶液（１００ｍｌの基質バッファー［クエン酸塩、過ホウ酸ナトリウム、ｐＨ４．４］当たりに１００ｍｇのＡＢＴＳ）と一緒にインキュベートする。
１０． ６０分間のインキュベーション時間後に室温でマイクロプレートリーダー（ＳＬＴ）により４０５ｎｍで測定する。

例３：
ヒト心臓特異的Ｍｙ−Ｃにおけるモノクローナル抗体１Ａ４についてのエピトープマッピング
モノクローナル抗体１Ａ４の結合部位の同定は、ペプチドスキャニング法により行った。その場合に、前記免疫化のために使用されたＭｙ−ＣのヒトｃＣ０Ｃ２ドメインの全アミノ酸配列は、全部で１１１種の、それぞれ１５アミノ酸長の重複しているアミノ酸配列に分けられる。これらの配列は、個々のペプチドとしてスポットにおいてセルロースメンブレン上で直接的に合成される。前記メンブレンを、抗体を含有するハイブリドーマの培養上清と一緒にインキュベートし、そしてペルオキシド結合された抗マウスＩｇ抗体と一緒にインキュベートすることによって抗体の結合部位を可視化させる。そのために、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後に、該メンブレンを転写シート間に置き、次いでＥＣＬ（商標）（増強化学発光（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ））検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ブラウンシュバイク）と一緒に３分間にわたりインキュベートする。フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ−ＥＣＬ（商標）［ＲＰＮ ２１０３Ｈ Ａｍｅｒｓｈａｍ、ブラウンシュバイク］）を載せて、それを引き続き３０秒から３分の間露光させる。抗体により検知された配列の同定は、前記フィルムに露光されたスポット３１と３２（図４）を、該スポットに局在する免疫原（Ｍｙ−ＣのｃＣ０Ｃ２ドメイン）の１５マーの部分配列に割り当てることによって行われる。

２つの部分配列の認識された中心配列は、アミノ酸配列−Ａ₁₂₄−Ａ−Ｅ−Ｌ−Ｇ−Ｅ−Ｓ−Ａ−Ｐ−Ｓ−Ｐ−Ｋ−である。この配列は、ヒトＭｙ−Ｃにおいて抗体１Ａ４が結合すると検出されたエピトープである。

文献目録

Claims (10)

1. ヒトの心筋ミオシン結合タンパク質Ｃ（Ｍｙ−Ｃ）に対するモノクローナル抗体（抗Ｍｙ−Ｃ−ｃＣ０Ｃ２−２５９−１Ａ４）を産生するハイブリドーマ細胞系統ＤＳＭ ＡＣＣ３２２４。
2. Ｍｙ−ＣのｃＣ０Ｃ２ドメインに対して免疫化されたマウスの脾臓細胞（リンパ芽球）と骨髄腫細胞とを融合させることによって得られ、かつ該Ｍｙ−Ｃにおける心臓特異的なエピトープに対するモノクローナル抗体を産生することを特徴とする、請求項１に記載のハイブリドーマ細胞系統。
3. 脾臓細胞として、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の脾臓細胞が使用され、かつ骨髄腫細胞として、系統Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３の骨髄腫細胞または該系統のサブクローンの骨髄腫細胞が使用されることを特徴とする、請求項１または２に記載のハイブリドーマ細胞系統。
4. ヒトの心筋Ｍｙ−Ｃの配列のアミノ酸Ａ１２４〜Ｋ１３４の範囲のエピトープに対する特異的モノクローナル抗体を産生することを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項に記載のハイブリドーマ細胞系統。
5. ヒトの心筋Ｍｙ−Ｃの配列のアミノ酸Ａ１２４〜Ｋ１３４の範囲のエピトープを認識して結合することを特徴とする、モノクローナル抗体（抗Ｍｙ−Ｃ−ｃＣ０Ｃ２−２５９−１Ａ４）。
6. 請求項１から４までのいずれか１項に記載のハイブリドーマ細胞系統によって産生されることを特徴とする、請求項５に記載のモノクローナル抗体（抗Ｍｙ−Ｃ−ｃＣ０Ｃ２−２５９−１Ａ４）。
7. 請求項１から４までのいずれか１項に記載の骨髄腫細胞系統の製造方法であって、ヒトｃＣ０Ｃ２ペプチドによって免疫化された実験動物（マウス）の脾臓細胞が骨髄腫細胞（系統Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）と融合されたことを特徴とする、前記製造方法。
8. 請求項５および／または６に記載のマウスのモノクローナル抗体の製造方法であって、請求項１から４までのいずれか１項に記載の骨髄腫細胞系統を培養し、そして産生されたモノクローナル抗体を単離することを特徴とする、前記製造方法。
9. 請求項５および／または６に記載のモノクローナル抗体の、分析目的のための、特に血清中のＭｙ−Ｃの濃度を測定するための、更に心筋梗塞の早期診断のためのＥＬＩＳＡにおける捕捉抗体または検出抗体としての使用。
10. 請求項５および／または６に記載のモノクローナル抗体の、分析目的のための、特にイムノブロットにおける、免疫組織学における、およびその他の分析法における使用。

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