JP2017500038A - ゲノム組込みのための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年12月19日に出願された米国仮特許出願第61/918,625号および2014年2月7日に出願された米国仮特許出願第61/937,444号の利益を主張し、当該出願の各々は、その全体が参考として援用される。
1.発明の分野
本明細書中に提供される方法および組成物は、概して、分子生物学および遺伝子操作の分野に関する。
宿主細胞のゲノムに改変を標的化導入する遺伝子操作の技法は、種々の分野において用途が見出されている。基本的には、遺伝子型が表現型にどのように影響するのかを明らかにすることは、挿入または欠失を標的化導入することにより、天然の遺伝子機能を損なうかまたは無効にする能力に依存する。合成生物学の分野において、目的の化合物を産生することができる遺伝的に改変された微生物の作製には、カスタマイズされたDNA配列を宿主細胞の染色体に挿入することが必要であり;工業規模での生産には、一般に、数十個の遺伝子、例えば、生合成経路全体を単一の宿主ゲノムに導入することが必要である。治療の状況において、正確なゲノムの改変を導入する能力は、単一遺伝子欠陥に起因する疾患、例えば、X連鎖重症複合免疫不全(SCID)、血友病B、ベータサラセミア、嚢胞性線維症、筋ジストロフィおよび鎌状赤血球症に対処する非常に大きな潜在能力を有する。
したがって、宿主細胞ゲノムへの1つまたはそれを超える外来性核酸のHDR媒介性組込みの効率および/または選択を改善する方法および組成物が必要とされている。さらに、選択マーカーのコード配列の共組込みを必要としないゲノム操作ストラテジーが必要とされている。これらのニーズおよび他のニーズが、本明細書中に提供される組成物および方法によって満たされる。
本明細書中に提供される方法および組成物は、相同組換え(HR)に適格性である宿主細胞を選択するための方法に関する。実施の理論に拘束されるものではないが、細胞集団の中のHR適格性は、宿主細胞に導入される1つまたはそれを超える直鎖状フラグメントを相同的に組み換えて、選択マーカーを発現する環状ベクターを形成することができる宿主細胞を選択することによって選択され得ると考えられている。ここで、この特徴を利用することにより、1つまたはそれを超える外来性核酸を宿主細胞のゲノムに、HRを介して部位特異的に組み込んだ宿主細胞の同定が向上する。いくつかの実施形態において、部位特異的組込みは、意図した組込み部位に断裂をもたらすことができる部位特異的ヌクレアーゼと宿主細胞ゲノムとを接触させることによって増強する。したがって、宿主細胞に、
(i)宿主細胞ゲノムの1つまたはそれを超える標的部位に対する相同領域を有する1つまたはそれを超える外来性核酸;
(ii)意図した標的部位(複数可)に断裂を選択的にもたらすことができる1つまたはそれを超えるヌクレアーゼ;および
(iii)それ自体によって、または宿主細胞に導入された1つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状DNAフラグメントと、相同的に組み換わることにより、選択マーカーを発現する環状の機能発現ベクターを形成することができる、直鎖状核酸
を導入すること
ならびに選択マーカーの発現について選択すること
によって、1つまたはそれを超える外来性核酸をそれらのそれぞれの標的部位(複数可)に組み込んだ細胞の共選択も達成される。本明細書中に提供される方法および組成物によって提供される所望の組込みを行った宿主細胞を回収する頻度が上昇すれば、別途操作が困難な遺伝子操作または処理が困難な宿主細胞の遺伝子操作が可能になり、より高次の操作デザイン、例えば、多重組込みの効率が改善される。
(a)1つまたはそれを超える宿主細胞を、それ自体との相同組換えまたは細胞の集団と接触される1つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸と接触させる工程(ここで、前記相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される);および
(b)選択マーカーを発現する宿主細胞を選択する工程
を含む。
(a)1つまたはそれを超える宿主細胞を、
(i)宿主細胞ゲノムの標的部位(TS)において、相同組換えを介して組み換わることができる外来性核酸(ES);
(ii)TSに断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ(N);および
(iii)それ自体との相同組換えまたは宿主細胞と接触される1つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸(ここで、前記相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される);
と接触させる工程;
ならびに
(b)選択マーカーを発現する宿主細胞を選択する工程
を含む。
(a)1つまたはそれを超える宿主細胞を、
(i)宿主細胞ゲノムの1つまたはそれを超える標的部位(TS)において、相同組換えを介して組み換わることができる1つまたはそれを超える外来性ドナー核酸(ES);
(ii)RNAガイドエンドヌクレアーゼ(RGEN);
(iii)RGENによる1つまたはそれを超えるTSの部位特異的な認識および切断を可能にする1つまたはそれを超えるリボ核酸;および
(iv)それ自体との相同組換えまたは宿主細胞と接触される1つまたはそれを超えるさらなる組換え前の直鎖状核酸との相同組換えが可能な組換え前の直鎖状核酸(ここで、前記相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される)
と接触させる工程;
ならびに
(b)選択マーカーを発現する宿主細胞を選択することにより、宿主細胞ゲノムの1つまたはそれを超える標的部位に1つまたはそれを超える外来性核酸を組み込んだ細胞を選択する工程
を含む。
(i)前記複数の外来性核酸(ここで、xは、1からnまで変動する整数であり、各整数xに対して、外来性核酸(ES)xの各々は、前記宿主細胞ゲノムの前記複数(n個)の標的部位から選択される標的部位(TS)xにおいて、相同組換えを介して組み換わることができる);
(ii)前記標的部位(TS)xの各々に対して、RGENによる(TS)xの部位特異的な認識および切断を可能にするガイドRNA(gRNA)x
と接触させる工程を含む。
(a)宿主細胞ゲノムの1つまたはそれを超える標的部位(TS)において、相同組換えを介して組み換わることができる1つまたはそれを超える外来性ドナー核酸(ES);
(b)RNAガイドエンドヌクレアーゼ(RGEN)または前記RGENをコードする核酸;
(c)RGENによる1つもしくはそれを超えるTSの部位特異的な認識および切断を可能にする1つもしくはそれを超えるリボ核酸、または前記1つもしくはそれを超えるリボ核酸をコードする1つもしくはそれを超える核酸;および
(d)それ自体とのインビボでの相同組換えまたは組成物中の1つもしくはそれを超えるさらなる組換え前の直鎖状核酸とのインビボでの相同組換えが可能な組換え前の直鎖状核酸(ここで、前記インビボでの相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される)
を含む。
(a)宿主細胞ゲノムの複数(n個)の標的部位に組み込むことができる複数(n個)の外来性核酸(ここで、nは、少なくとも2であり、xは、1からnまで変動する整数であり、各整数xに対して、外来性核酸(ES)xの各々は、前記宿主細胞ゲノムの前記複数(n個)の標的部位から選択される標的部位(TS)xにおいて、相同組換えを介して組み換わることができる);ならびに
(b)前記標的部位(TS)xの各々に対して、RGENによる(TS)xの部位特異的な認識および切断を可能にするガイドRNA(gRNA)x
を含む。
4.図面の簡単な説明
5.1 定義
本明細書中で使用されるとき、ヌクレアーゼ、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TAL−エフェクターヌクレアーゼまたはRNAガイドDNAエンドヌクレアーゼ(例えば、CRISPR/Cas9)に関して、用語「切断する(cleaves)」、「切断」および/または「切断する(cleaving)」とは、特定の核酸において断裂をもたらす行為のことを指す。当業者が理解するように、その断裂は、平滑末端または粘着末端(すなわち、5’または3’オーバーハング)を残し得る。これらの用語は、一本鎖DNA断裂(「ニック」)および二本鎖DNA断裂も包含する。
5.2 外来性核酸を組み込む方法
(a)宿主細胞を、
(i)第1の相同性領域(HR1)および第2の相同性領域(HR2)を含む外来性核酸(ES)(ここで、(HR1)および(HR2)は、前記標的部位(TS)において、宿主細胞によって媒介される相同組換えを惹起することができる);
(ii)(TS)において切断することができるヌクレアーゼ(N)(ここで、前記切断によって、(TS)において(ES)の相同組換えがもたらされる);および
(iii)それ自体との相同組換えまたは宿主細胞と接触される1つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸(ここで、前記相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される)
と接触させる工程;
ならびに
(b)その選択マーカーを発現する宿主細胞を選択する工程
を含む。いくつかの実施形態において、その方法は、(TS)において(ES)が組み込まれた宿主細胞を回収する工程を含み、ここで、前記回収する工程は、選択マーカーの組込みを必要としない。
(a)宿主細胞を、
(i)複数の外来性核酸(ここで、外来性核酸(ES)xの各々は、第1の相同性領域(HR1)xおよび第2の相同性領域(HR2)xを含み、(HR1)xおよび(HR2)xは、前記宿主細胞ゲノムの標的部位(TS)xにおいて(ES)xの宿主細胞媒介性の相同組換えを惹起することができる);
(ii)前記標的部位(TS)xの各々に対して、(TS)xにおいて切断することができるヌクレアーゼ(N)x(前記切断によって、(TS)xにおいて(ES)xの相同組換えがもたらされる);および
(iii)それ自体との相同組換えまたは宿主細胞と接触される1つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸(ここで、前記相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される)
と接触させる工程;
ならびに
(b)その選択マーカーを発現する宿主細胞を選択する工程
を含む。いくつかの実施形態において、その方法は、宿主細胞を回収する工程をさらに含み、ここで、選択された外来性核酸(ES)xの各々は、選択された標的配列(TS)xの各々において組み込まれており、
xは、1〜nの任意の整数であり、nは、少なくとも2である。
5.2.1 環状マーカー発現ベクターのHR媒介性インビボアセンブリ
5.2.1.1 選択マーカー
5.2.1.2 細胞培養
5.2.2.外来性ドナー核酸
5.2.2.1 ゲノム組込み配列
5.2.2.2 目的の核酸
5.2.3.ヌクレアーゼ
5.2.3.1 クラスター化規則性散在短パリンドローム反復(CRISPR)
5.2.3.2 転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)
5.2.3.3 ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)
5.2.3.4 エンドヌクレアーゼ
5.2.3.5 ゲノム標的部位
5.3 宿主細胞
5.4 適用
5.4.1.遺伝子治療および細胞治療
5.4.2.代謝経路を操作するための方法
5.4.2.1 イソプレノイド経路の操作
6.1 実施例1:CRISPRを使用し、欠失構築物の組込みを介して3つの遺伝子を同時に欠失させるための複数のgRNA送達形式の比較
この実施例は、S.cerevisiaeにおいてRHR2、HOおよびADH5のORFを(短いリンカー配列の組込みによって)同時に欠失させるためのCRISPRの使用を実証する結果を提供する。手短に言えば、RHR2、HOおよびADH5のORFに含まれるユニーク配列を標的化するキメラgRNAを作製し、それらをStreptococcus pyogenesのタイプII細菌CRISPRシステム由来のCas9タンパク質を発現している宿主細胞において様々な配置で形質転換した。形質転換されたコロニーを、コロニーPCR(cPCR)によって、短いリンカー配列による1つ、2つまたは3つのORFの置き換えについてスクリーニングした。
6.1.1.Cas9pの構成的発現
6.1.2.RHR2、HOおよびADH5のORFにおけるCRISPR標的部位の選択
6.1.4.直鎖状のドナーDNAの作製
6.1.5.CRISPRを用いた、ORFの同時の欠失および短いリンカー配列の組込み
6.2 実施例2:ギャップ修復を介したHR適格性細胞の選択
6.3 実施例3:マルチピースギャップ修復を介したHR適格性細胞の選択の向上
6.4 実施例4:ギャップ修復と組み合わせてCRISPRを用いた単一および多重の点変異の導入
6.5 実施例5:二倍体細胞の二対立遺伝子操作
6.6 実施例6:完全な生合成経路の多重組込み
6.7 実施例7:哺乳動物細胞における組込みの改善
例えば、本発明は、以下の項目を提供する。
(項目1)
相同組換えに適格性である宿主細胞を選択する方法であって、該方法は、
(a)1つまたはそれを超える宿主細胞を、それ自体との相同組換えまたは細胞の集団と接触される1つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸と接触させる工程であって、ここで、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、工程;および
(b)該選択マーカーを発現する宿主細胞を選択する工程
を含む、方法。
(項目2)
宿主細胞ゲノムの標的部位に外来性核酸を組み込むための方法であって、該方法は、
(a)1つまたはそれを超える宿主細胞を、
(i)該宿主細胞ゲノムの標的部位(TS)において、相同組換えを介して組み換わることができる外来性核酸(ES);
(ii)TSに断裂を作製することができるヌクレアーゼ(N);および
(iii)それ自体との相同組換えまたは該宿主細胞と接触される1つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸であって、ここで、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、直鎖状核酸
と接触させる工程;
ならびに
(b)該選択マーカーを発現する宿主細胞を選択する工程
を含む、方法。
(項目3)
前記直鎖状核酸が、互いとの相同組換えが可能な2つの内部相同性領域を含み、ここで、該内部相同性領域の相同組換えによって、前記選択マーカーを発現する前記環状の染色体外核酸が形成される、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
前記直鎖状核酸が、前記宿主細胞と接触されるさらなる直鎖状核酸の相同性領域と組み換わることができる相同性領域を含み、2つの該直鎖状核酸の相同組換えによって、前記選択マーカーを発現する前記環状の染色体外核酸が形成される、項目1または2に記載の方法。
(項目5)
前記直鎖状核酸が、前記選択マーカーの部分的なコード配列、中断されたコード配列および/または不連続のコード配列を含み、該選択マーカーは、該直鎖状核酸から発現され得ず、前記環状の染色体外核酸の前記形成によって、該選択マーカーの完全なコード配列が形成され、該選択マーカーは、該環状の染色体外核酸から発現され得る、項目1〜4のいずれか1項に記載の方法。
(項目6)
接触される前記宿主細胞(複数可)が、前記選択する工程の前に、少なくとも約12、24、36、48、72時間または72時間より長い期間にわたって培養される、項目1〜5のいずれか1項に記載の方法。
(項目7)
接触される前記細胞が、前記選択マーカーを発現しない細胞の生存に対して選択する培養条件下で培養される、項目1〜6のいずれか1項に記載の方法。
(項目8)
工程(b)という前記選択する工程が、視覚的検出法、比色法または蛍光検出法によって前記選択マーカーの発現を検出する工程を含む、項目1〜7のいずれか1項に記載の方法。
(項目9)
ESがTSにおいて相同的に組み換えられた宿主細胞を回収する工程をさらに含む、項目2〜8のいずれか1項に記載の方法。
(項目10)
前記回収する工程が、前記宿主細胞ゲノムへの選択マーカーの組込みを必要としない、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記回収する工程が、スクリーニングされた10、9、8、7、6、5、4、3もしくは2個の接触された宿主細胞毎またはそれらのクローン集団毎に少なくとも約1回の頻度で行われる、項目9に記載の方法。
(項目12)
選択された前記宿主細胞から前記環状の染色体外核酸を除去する工程をさらに含む、項目2〜11のいずれか1項に記載の方法。
(項目13)
複数(n個)の外来性核酸が、前記宿主細胞ゲノムの複数(n個)の標的部位に組み込まれ、ここで、nは、少なくとも2であり、工程(a)は、前記宿主細胞を
(i)該複数の外来性核酸であって、ここで、
xは、1からnまで変動する整数であり、各整数xに対して、外来性核酸(ES) x の各々は、該宿主細胞ゲノムの該複数(n個)の標的部位から選択される標的部位(TS) x において、相同組換えを介して組み換わることができる、外来性核酸;
(ii)該標的部位(TS) x の各々に対して、(TS) x において断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ(N) x
と接触させる工程を含む、項目2〜12のいずれか1項に記載の方法。
(項目14)
単一のヌクレアーゼが、(TS) x の各々を切断することができる、項目13に記載の方法。
(項目15)
n=3、4、5、6、7、8、9または10である、項目13または14に記載の方法。
(項目16)
ESが、第1の相同性領域(HR1)および第2の相同性領域(HR2)を含み、ここで、HR1およびHR2は、相同組換えを介して、それぞれ第3の相同性領域(HR3)および第4の相同性領域(HR4)と組み換わることができ、HR3およびHR4は各々、TSに存在する、項目2〜15のいずれか1項に記載の方法。
(項目17)
Nが、TSに一本鎖断裂または二本鎖断裂をもたらすことができる、項目2〜16のいずれか1項に記載の方法。
(項目18)
ESが、目的の核酸Dをさらに含む、項目2〜17のいずれか1項に記載の方法。
(項目19)
Dが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群より選択される、項目18に記載の方法。
(項目20)
ESが、直鎖状である、項目2〜19のいずれか1項に記載の方法。
(項目21)
前記環状の染色体外核酸が、前記ヌクレアーゼのコード配列をさらに含む、項目2〜20のいずれか1項に記載の方法。
(項目22)
前記ヌクレアーゼが、RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼである、項目2〜21のいずれか1項に記載の方法。
(項目23)
前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼが、Cas9エンドヌクレアーゼである、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記環状の染色体外核酸が、前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼによるTSの部位特異的な認識および切断を可能にする、crRNA活性およびtracrRNA活性をコードする配列をさらに含む、項目22または23に記載の方法。
(項目25)
前記crRNA活性および前記tracrRNA活性が、単一の連続したRNA分子として発現される、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TAL−エフェクターDNA結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質(TALEN)、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される、項目2〜21のいずれか1項に記載の方法。
(項目27)
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたタイプIIS制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記タイプIIS制限エンドヌクレアーゼが、HOエンドヌクレアーゼおよびFokIエンドヌクレアーゼからなる群より選択される、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記ジンクフィンガー結合ドメインが、3、5または6つのジンクフィンガーを含む、項目27に記載の方法。
(項目30)
前記エンドヌクレアーゼが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His−Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY−YIGホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである、項目26に記載の方法。
(項目31)
前記エンドヌクレアーゼが、H−DreI、I−SceI、I−SceII、I−SceIII、I−SceIV、I−SceV、I−SceVI、I−SceVII、I−CeuI、I−CeuAIIP、I−CreI、I−CrepsbIP、I−CrepsbIIP、I−CrepsbIIIP、I−CrepsbIVP、I−TliI、I−PpoI、Pi−PspI、F−SceI、F−SceII、F−SuvI、F−CphI、F−TevI、F−TevII、I−AmaI、I−AniI、I−ChuI、I−CmoeI、I−CpaI、I−CpaII、I−CsmI、I−CvuI、I−CvuAIP、I−DdiI、I−DdiII、I−DirI、I−DmoI、I−HmuI、I−HmuII、I−HsNIP、I−LlaI、I−MsoI、I−NaaI、I−NanI、I−NclIP、I−NgrIP、I−NitI、I−NjaI、I−Nsp236IP、I−PakI、I−PboIP、I−PcuIP、I−PcuAI、I−PcuVI、I−PgrIP、I−PobIP、I−PorI、I−PorIIP、I−PbpIP、I−SpBetaIP、I−ScaI、I−SexIP、I−SneIP、I−SpomI、I−SpomCP、I−SpomIP、I−SpomIIP、I−SquIP、I−Ssp68031、I−SthPhiJP、I−SthPhiST3P、I−SthPhiSTe3bP、I−TdeIP、I−TevI、I−TevII、I−TevIII、i−UarAP、i−UarHGPAIP、I−UarHGPA13P、I−VinIP、I−ZbiIP、PI−MgaI、PI−MtuI、PI−MtuHIP PI−MtuHIIP、PI−PfuI、PI−PfuII、PI−PkoI、PI−PkoII、PI−Rma43812IP、PI−SpBetaIP、PI−SceI、PI−TfuI、PI−TfuII、PI−ThyI、PI−TliIまたはPI−TliIIからなる群より選択される、項目26に記載の方法。
(項目32)
前記エンドヌクレアーゼが、内在性ゲノム配列に特異的に結合するように改変されており、該改変されたエンドヌクレアーゼは、もはやその野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合しない、項目26に記載の方法。
(項目33)
前記改変されたエンドヌクレアーゼが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His−Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY−YIGホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼに由来する、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記改変されたエンドヌクレアーゼが、H−DreI、I−SceI、I−SceII、I−SceIII、I−SceIV、I−SceV、I−SceVI、I−SceVII、I−CeuI、I−CeuAIIP、I−CreI、I−CrepsbIP、I−CrepsbIIP、I−CrepsbIIIP、I−CrepsbIVP、I−TliI、I−PpoI、Pi−PspI、F−SceI、F−SceII、F−SuvI、F−CphI、F−TevI、F−TevII、I−AmaI、I−AniI、I−ChuI、I−CmoeI、I−CpaI、I−CpaII、I−CsmI、I−CvuI、I−CvuAIP、I−DdiI、I−DdiII、I−DirI、I−DmoI、I−HmuI、I−HmuII、I−HsNIP、I−LlaI、I−MsoI、I−NaaI、I−NanI、I−NclIP、I−NgrIP、I−NitI、I−NjaI、I−Nsp236IP、I−PakI、I−PboIP、I−PcuIP、I−PcuAI、I−PcuVI、I−PgrIP、I−PobIP、I−PorI、I−PorIIP、I−PbpIP、I−SpBetaIP、I−ScaI、I−SexIP、I−SneIP、I−SpomI、I−SpomCP、I−SpomIP、I−SpomIIP、I−SquIP、I−Ssp68031、I−SthPhiJP、I−SthPhiST3P、I−SthPhiSTe3bP、I−TdeIP、I−TevI、I−TevII、I−TevIII、i−UarAP、i−UarHGPAIP、I−UarHGPA13P、I−VinIP、I−ZbiIP、PI−MgaI、PI−MtuI、PI−MtuHIP
PI−MtuHIIP、PI−PfuI、PI−PfuII、PI−PkoI、PI−PkoII、PI−Rma43812IP、PI−SpBetaIP、PI−SceI、PI−TfuI、PI−TfuII、PI−ThyI、PI−TliIまたはPI−TliIIからなる群より選択されるエンドヌクレアーゼに由来する、項目32に記載の方法。
(項目35)
前記宿主細胞が、原核細胞である、項目1〜34のいずれか1項に記載の方法。
(項目36)
前記宿主細胞が、真核細胞である、項目1〜34のいずれか1項に記載の方法。
(項目37)
前記宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択される、項目1〜34のいずれか1項に記載の方法。
(項目38)
前記宿主細胞が、げっ歯類細胞、霊長類細胞およびヒト細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞である、項目1〜34のいずれか1項に記載の方法。
(項目39)
前記宿主細胞が、ヒト細胞である、項目1〜34のいずれか1項に記載の方法。
(項目40)
前記宿主細胞が、酵母細胞である、項目1〜34のいずれか1項に記載の方法。
(項目41)
前記酵母が、Saccharomyces cerevisiaeである、項目40に記載の方法。
(項目42)
宿主細胞であって、(i)該宿主細胞ゲノムの標的部位(TS)において、相同組換えを介して組み換わることができる、外来性核酸(ES);
(ii)TSにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ(N);および
(iii)それ自体との相同組換えまたは該宿主細胞内の1つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸であって、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、直鎖状核酸
を含む、宿主細胞。
(項目43)
前記直鎖状核酸が、互いとの相同組換えが可能な2つの内部相同性領域を含み、ここで、該内部相同性領域の相同組換えによって、前記選択マーカーを発現する前記環状の染色体外核酸が形成される、項目42に記載の宿主細胞。
(項目44)
前記直鎖状核酸が、前記宿主細胞内のさらなる直鎖状核酸の相同性領域と組み換わることができる相同性領域を含み、2つの該直鎖状核酸の相同組換えによって、前記選択マーカーを発現する前記環状の染色体外核酸が形成される、項目42に記載の宿主細胞。
(項目45)
前記直鎖状核酸が、前記選択マーカーの部分的なコード配列、中断されたコード配列および/または不連続のコード配列を含み、該選択マーカーは、該直鎖状核酸から発現され得ず、前記環状の染色体外核酸の前記形成によって、該選択マーカーの完全なコード配列が形成され、該選択マーカーは、該環状の染色体外核酸から発現され得る、項目42〜44のいずれか1項に記載の宿主細胞。
(項目46)
前記宿主細胞が、
(i)複数の外来性核酸であって、ここで、
xは、1からnまで変動する整数であり、各整数xに対して、外来性核酸(ES) x の各々は、該宿主細胞ゲノムの前記複数(n個)の標的部位から選択される標的部位(TS) x において、相同組換えを介して組み換わることができる、外来性核酸;
(ii)該標的部位(TS) x の各々に対して、(TS) x において断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ(N) x
を含む、項目42〜45のいずれか1項に記載の宿主細胞。
(項目47)
ESが、第1の相同性領域(HR1)および第2の相同性領域(HR2)を含み、ここで、HR1およびHR2は、相同組換えを介して、それぞれ第3の相同性領域(HR3)および第4の相同性領域(HR4)と組み換わることができ、HR3およびHR4は各々、TSに存在する、項目42〜46のいずれか1項に記載の宿主細胞。
(項目48)
Nが、TSに一本鎖断裂または二本鎖断裂をもたらすことができる、項目42〜41のいずれか1項に記載の宿主細胞。
(項目49)
ESが、目的の核酸Dをさらに含む、項目42〜48のいずれか1項に記載の宿主細胞。
(項目50)
Dが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群より選択される、項目49に記載の宿主細胞。
(項目51)
ESが、直鎖状である、項目42〜50のいずれか1項に記載の宿主細胞。
(項目52)
前記環状の染色体外核酸が、前記ヌクレアーゼのコード配列をさらに含む、項目42〜51のいずれか1項に記載の宿主細胞。
(項目53)
前記ヌクレアーゼが、RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼである、項目42〜52のいずれか1項に記載の宿主細胞。
(項目54)
前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼが、Cas9エンドヌクレアーゼである、項目53に記載の宿主細胞。
(項目55)
前記環状の染色体外核酸が、前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼによるTSの部位特異的な認識および切断を可能にする、crRNA活性およびtracrRNA活性をコードする配列をさらに含む、項目53または54に記載の宿主細胞。
(項目56)
前記crRNA活性および前記tracrRNA活性が、単一の連続したRNA分子として発現される、項目55に記載の宿主細胞。
(項目57)
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TAL−エフェクターDNA結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質(TALEN)、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される、項目42〜56のいずれか1項に記載の宿主細胞。
(項目58)
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたタイプIIS制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である、項目57に記載の宿主細胞。
(項目59)
前記タイプIIS制限エンドヌクレアーゼが、HOエンドヌクレアーゼおよびFokIエンドヌクレアーゼからなる群より選択される、項目58に記載の宿主細胞。
(項目60)
前記ジンクフィンガー結合ドメインが、3、5または6つのジンクフィンガーを含む、項目58に記載の宿主細胞。
(項目61)
前記エンドヌクレアーゼが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His−Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY−YIGホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである、項目58に記載の宿主細胞。
(項目62)
前記エンドヌクレアーゼが、H−DreI、I−SceI、I−SceII、I−SceIII、I−SceIV、I−SceV、I−SceVI、I−SceVII、I−CeuI、I−CeuAIIP、I−CreI、I−CrepsbIP、I−CrepsbIIP、I−CrepsbIIIP、I−CrepsbIVP、I−TliI、I−PpoI、Pi−PspI、F−SceI、F−SceII、F−SuvI、F−CphI、F−TevI、F−TevII、I−AmaI、I−AniI、I−ChuI、I−CmoeI、I−CpaI、I−CpaII、I−CsmI、I−CvuI、I−CvuAIP、I−DdiI、I−DdiII、I−DirI、I−DmoI、I−HmuI、I−HmuII、I−HsNIP、I−LlaI、I−MsoI、I−NaaI、I−NanI、I−NclIP、I−NgrIP、I−NitI、I−NjaI、I−Nsp236IP、I−PakI、I−PboIP、I−PcuIP、I−PcuAI、I−PcuVI、I−PgrIP、I−PobIP、I−PorI、I−PorIIP、I−PbpIP、I−SpBetaIP、I−ScaI、I−SexIP、I−SneIP、I−SpomI、I−SpomCP、I−SpomIP、I−SpomIIP、I−SquIP、I−Ssp68031、I−SthPhiJP、I−SthPhiST3P、I−SthPhiSTe3bP、I−TdeIP、I−TevI、I−TevII、I−TevIII、i−UarAP、i−UarHGPAIP、I−UarHGPA13P、I−VinIP、I−ZbiIP、PI−MgaI、PI−MtuI、PI−MtuHIP PI−MtuHIIP、PI−PfuI、PI−PfuII、PI−PkoI、PI−PkoII、PI−Rma43812IP、PI−SpBetaIP、PI−SceI、PI−TfuI、PI−TfuII、PI−ThyI、PI−TliIまたはPI−TliIIからなる群より選択される、項目58に記載の宿主細胞。
(項目63)
前記エンドヌクレアーゼが、内在性ゲノム配列に特異的に結合するように改変されており、該改変されたエンドヌクレアーゼは、もはやその野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合しない、項目58に記載の宿主細胞。
(項目64)
前記改変されたエンドヌクレアーゼが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His−Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY−YIGホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼに由来する、項目63に記載の宿主細胞。
(項目65)
前記改変されたエンドヌクレアーゼが、H−DreI、I−SceI、I−SceII、I−SceIII、I−SceIV、I−SceV、I−SceVI、I−SceVII、I−CeuI、I−CeuAIIP、I−CreI、I−CrepsbIP、I−CrepsbIIP、I−CrepsbIIIP、I−CrepsbIVP、I−TliI、I−PpoI、Pi−PspI、F−SceI、F−SceII、F−SuvI、F−CphI、F−TevI、F−TevII、I−AmaI、I−AniI、I−ChuI、I−CmoeI、I−CpaI、I−CpaII、I−CsmI、I−CvuI、I−CvuAIP、I−DdiI、I−DdiII、I−DirI、I−DmoI、I−HmuI、I−HmuII、I−HsNIP、I−LlaI、I−MsoI、I−NaaI、I−NanI、I−NclIP、I−NgrIP、I−NitI、I−NjaI、I−Nsp236IP、I−PakI、I−PboIP、I−PcuIP、I−PcuAI、I−PcuVI、I−PgrIP、I−PobIP、I−PorI、I−PorIIP、I−PbpIP、I−SpBetaIP、I−ScaI、I−SexIP、I−SneIP、I−SpomI、I−SpomCP、I−SpomIP、I−SpomIIP、I−SquIP、I−Ssp68031、I−SthPhiJP、I−SthPhiST3P、I−SthPhiSTe3bP、I−TdeIP、I−TevI、I−TevII、I−TevIII、i−UarAP、i−UarHGPAIP、I−UarHGPA13P、I−VinIP、I−ZbiIP、PI−MgaI、PI−MtuI、PI−MtuHIP
PI−MtuHIIP、PI−PfuI、PI−PfuII、PI−PkoI、PI−PkoII、PI−Rma43812IP、PI−SpBetaIP、PI−SceI、PI−TfuI、PI−TfuII、PI−ThyI、PI−TliIまたはPI−TliIIからなる群より選択されるエンドヌクレアーゼに由来する、項目63に記載の宿主細胞。
(項目66)
(a)部位特異的ヌクレアーゼ、または部位特異的ヌクレアーゼのコード配列を含む核酸;および
(b)宿主細胞において互いとの相同組換えが可能な2つの内部相同性領域を含む直鎖状核酸であって、ここで、該内部相同性領域の相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状核酸が形成される、直鎖状核酸
を含む、組成物。
(項目67)
前記直鎖状核酸が、前記選択マーカーの部分的なコード配列、中断されたコード配列および/または不連続のコード配列を含み、該選択マーカーは、宿主細胞において該直鎖状核酸から発現され得ず、前記環状核酸の前記形成によって、該選択マーカーの完全なコード配列が形成され、該選択マーカーは、該宿主細胞において該環状核酸から発現され得る、項目66に記載の組成物。
(項目68)
(a)部位特異的ヌクレアーゼ、または部位特異的ヌクレアーゼのコード配列を含む核酸;ならびに
(b)第1の直鎖状核酸および1つまたはそれを超えるさらなる直鎖状核酸であって、ここで、該第1および第2の直鎖状核酸は、宿主細胞において互いとの相同組換えが可能であり、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状核酸が形成される、第1の直鎖状核酸および1つまたはそれを超えるさらなる直鎖状核酸
を含む、組成物。
(項目69)
各直鎖状核酸が、前記選択マーカーの部分的なコード配列、中断されたコード配列および/または不連続のコード配列を含み、該選択マーカーは、宿主細胞において各直鎖状核酸から発現され得ず、前記環状核酸の前記形成によって、該選択マーカーの完全なコード配列が形成され、該選択マーカーは、宿主細胞において該環状核酸から発現され得る、項目68に記載の組成物。
(項目70)
前記環状核酸が、部位特異的ヌクレアーゼのコード配列をさらに含む、項目66〜69のいずれか1項に記載の組成物。
(項目71)
前記部位特異的ヌクレアーゼが、RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼである、項目66〜70のいずれか1項に記載の組成物。
(項目72)
前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼが、Cas9エンドヌクレアーゼである、項目71に記載の組成物。
(項目73)
(i)crRNA活性を有するリボ核酸およびtracrRNA活性を有するリボ核酸;または
(ii)crRNA活性を有するリボ核酸をコードするデオキシリボ核酸およびtracrRNA活性を有するリボ核酸をコードするデオキシリボ核酸
をさらに含む、項目71または72に記載の組成物。
(項目74)
前記環状核酸が、crRNA活性を有するリボ核酸をコードするデオキシリボ核酸およびtracrRNA活性を有するリボ核酸をコードするデオキシリボ核酸をさらに含む、項目72または73に記載の組成物。
(項目75)
前記crRNA活性および前記tracrRNA活性をコードする前記デオキシリボ核酸が、単一の連続したRNA分子上で該活性をコードする、項目73または74に記載の組成物。
(項目76)
前記部位特異的ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TAL−エフェクターDNA結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質(TALEN)、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される、項目66〜70のいずれか1項に記載の組成物。
(項目77)
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたタイプIIS制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である、項目76に記載の組成物。
(項目78)
前記タイプIIS制限エンドヌクレアーゼが、HOエンドヌクレアーゼおよびFokIエンドヌクレアーゼからなる群より選択される、項目77に記載の組成物。
(項目79)
前記ジンクフィンガー結合ドメインが、3、5または6つのジンクフィンガーを含む、項目77に記載の組成物。
(項目80)
前記エンドヌクレアーゼが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His−Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY−YIGホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである、項目76に記載の組成物。
(項目81)
前記エンドヌクレアーゼが、H−DreI、I−SceI、I−SceII、I−SceIII、I−SceIV、I−SceV、I−SceVI、I−SceVII、I−CeuI、I−CeuAIIP、I−CreI、I−CrepsbIP、I−CrepsbIIP、I−CrepsbIIIP、I−CrepsbIVP、I−TliI、I−PpoI、Pi−PspI、F−SceI、F−SceII、F−SuvI、F−CphI、F−TevI、F−TevII、I−AmaI、I−AniI、I−ChuI、I−CmoeI、I−CpaI、I−CpaII、I−CsmI、I−CvuI、I−CvuAIP、I−DdiI、I−DdiII、I−DirI、I−DmoI、I−HmuI、I−HmuII、I−HsNIP、I−LlaI、I−MsoI、I−NaaI、I−NanI、I−NclIP、I−NgrIP、I−NitI、I−NjaI、I−Nsp236IP、I−PakI、I−PboIP、I−PcuIP、I−PcuAI、I−PcuVI、I−PgrIP、I−PobIP、I−PorI、I−PorIIP、I−PbpIP、I−SpBetaIP、I−ScaI、I−SexIP、I−SneIP、I−SpomI、I−SpomCP、I−SpomIP、I−SpomIIP、I−SquIP、I−Ssp68031、I−SthPhiJP、I−SthPhiST3P、I−SthPhiSTe3bP、I−TdeIP、I−TevI、I−TevII、I−TevIII、i−UarAP、i−UarHGPAIP、I−UarHGPA13P、I−VinIP、I−ZbiIP、PI−MgaI、PI−MtuI、PI−MtuHIP PI−MtuHIIP、PI−PfuI、PI−PfuII、PI−PkoI、PI−PkoII、PI−Rma43812IP、PI−SpBetaIP、PI−SceI、PI−TfuI、PI−TfuII、PI−ThyI、PI−TliIまたはPI−TliIIからなる群より選択される、項目76に記載の組成物。
(項目82)
前記エンドヌクレアーゼが、内在性ゲノム配列に特異的に結合するように改変されており、該改変されたエンドヌクレアーゼは、もはやその野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合しない、項目76に記載の組成物。
(項目83)
前記改変されたエンドヌクレアーゼが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His−Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY−YIGホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼに由来する、項目77に記載の組成物。
(項目84)
前記改変されたエンドヌクレアーゼが、H−DreI、I−SceI、I−SceII、I−SceIII、I−SceIV、I−SceV、I−SceVI、I−SceVII、I−CeuI、I−CeuAIIP、I−CreI、I−CrepsbIP、I−CrepsbIIP、I−CrepsbIIIP、I−CrepsbIVP、I−TliI、I−PpoI、Pi−PspI、F−SceI、F−SceII、F−SuvI、F−CphI、F−TevI、F−TevII、I−AmaI、I−AniI、I−ChuI、I−CmoeI、I−CpaI、I−CpaII、I−CsmI、I−CvuI、I−CvuAIP、I−DdiI、I−DdiII、I−DirI、I−DmoI、I−HmuI、I−HmuII、I−HsNIP、I−LlaI、I−MsoI、I−NaaI、I−NanI、I−NclIP、I−NgrIP、I−NitI、I−NjaI、I−Nsp236IP、I−PakI、I−PboIP、I−PcuIP、I−PcuAI、I−PcuVI、I−PgrIP、I−PobIP、I−PorI、I−PorIIP、I−PbpIP、I−SpBetaIP、I−ScaI、I−SexIP、I−SneIP、I−SpomI、I−SpomCP、I−SpomIP、I−SpomIIP、I−SquIP、I−Ssp68031、I−SthPhiJP、I−SthPhiST3P、I−SthPhiSTe3bP、I−TdeIP、I−TevI、I−TevII、I−TevIII、i−UarAP、i−UarHGPAIP、I−UarHGPA13P、I−VinIP、I−ZbiIP、PI−MgaI、PI−MtuI、PI−MtuHIP
PI−MtuHIIP、PI−PfuI、PI−PfuII、PI−PkoI、PI−PkoII、PI−Rma43812IP、PI−SpBetaIP、PI−SceI、PI−TfuI、PI−TfuII、PI−ThyI、PI−TliIまたはPI−TliIIからなる群より選択されるエンドヌクレアーゼに由来する、項目77に記載の組成物。
(項目85)
項目66〜84のいずれか1項に記載の組成物を含む、宿主細胞。
(項目86)
前記宿主細胞が、原核細胞である、項目42〜65および85のいずれか1項に記載の宿主細胞。
(項目87)
前記宿主細胞が、真核細胞である、項目42〜65および85のいずれか1項に記載の宿主細胞。
(項目88)
前記宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択される、項目42〜65および85のいずれか1項に記載の宿主細胞。
(項目89)
前記宿主細胞が、げっ歯類細胞、霊長類細胞およびヒト細胞からなる群から選択される哺乳動物細胞である、項目42〜65および85のいずれか1項に記載の宿主細胞。
(項目90)
前記宿主細胞が、ヒト細胞である、項目42〜65および85のいずれか1項に記載の宿主細胞。
(項目91)
前記宿主細胞が、酵母細胞である、項目42〜65および85のいずれか1項に記載の宿主細胞。
(項目92)
前記酵母が、Saccharomyces cerevisiaeである、項目91に記載の宿主細胞。
(項目93)
細胞培養培地ならびに項目42〜65および85〜92のいずれか1項に記載の宿主細胞を含む、細胞培養組成物。
(項目94)
前記選択マーカーの発現について選択する化合物をさらに含む、項目93に記載の細胞培養組成物。
(項目95)
宿主細胞ゲノムの標的部位に外来性核酸を組み込むための方法であって、該方法は、
(a)1つまたはそれを超える宿主細胞を、
(i)該宿主細胞ゲノムの該標的部位(TS)において、相同組換えを介して組み換わることができる外来性核酸(ES);および
(ii)それ自体との相同組換えまたは該宿主細胞と接触される1つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸であって、ここで、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列およびTSにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ(N)のコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、直鎖状核酸
と接触させる工程;
ならびに
(b)該選択マーカーを発現する宿主細胞を選択する工程
を含む、方法。
(項目96)
前記ヌクレアーゼが、CRISPR関連RNAガイドエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TAL−エフェクターDNA結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質(TALEN)、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される、項目95に記載の方法。
(項目97)
前記ヌクレアーゼが、CRISPR関連RNAガイドエンドヌクレアーゼであり、前記環状の染色体外核酸が、前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼによるTSの部位特異的な認識および切断を可能にするcrRNA活性およびtracrRNA活性をコードする配列をさらに含む、項目96に記載の方法。
(項目98)
宿主細胞であって、(i)該宿主細胞ゲノムの標的部位(TS)において、相同組換えを介して組み換わることができる外来性核酸(ES);および
(ii)それ自体との相同組換えまたは該宿主細胞と接触される1つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸であって、ここで、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列およびTSにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ(N)のコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、直鎖状核酸
を含む、宿主細胞。
(項目99)
前記ヌクレアーゼが、CRISPR関連RNAガイドエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TAL−エフェクターDNA結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質(TALEN)、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される、項目98に記載の宿主細胞。
(項目100)
前記ヌクレアーゼが、CRISPR関連RNAガイドエンドヌクレアーゼであり、前記環状の染色体外核酸が、前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼによるTSの部位特異的な認識および切断を可能にするcrRNA活性およびtracrRNA活性をコードする配列をさらに含む、項目99に記載の宿主細胞。
(項目101)
第1の相同性領域(HR1)および第2の相同性領域(HR2)を含む直鎖状核酸であって、ここで、HR1およびHR2は、相同組換えを介して互いと組み換わることができ、HR1とHR2との相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状核酸が形成される、直鎖状核酸。
(項目102)
HR1が、前記選択マーカーの第1の不完全なコード配列を含み、HR2が、該選択マーカーの第2の不完全なコード配列を含み、HR1とHR2との相同組換えによって、該選択マーカーの完全なコード配列が再構成される、項目101に記載の直鎖状核酸。
(項目103)
部位特異的ヌクレアーゼのコード配列をさらに含む、項目101または102に記載の直鎖状核酸。
(項目104)
前記部位特異的ヌクレアーゼが、RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼである、項目103に記載の直鎖状核酸。
(項目105)
前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼが、Cas9エンドヌクレアーゼである、項目104に記載の直鎖状核酸。
(項目106)
前記環状核酸が、crRNA活性およびtracrRNA活性をコードする配列をさらに含む、項目101〜105のいずれか1項に記載の直鎖状核酸。
(項目107)
前記crRNA活性および前記tracrRNA活性をコードする配列が、単一の連続したRNA分子上で該活性をコードする、106に記載の直鎖状核酸。
(項目108)
前記部位特異的ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TAL−エフェクターDNA結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質(TALEN)、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される、項目103に記載の直鎖状核酸。
(項目109)
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたタイプIIS制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である、項目108に記載の直鎖状核酸。
(項目110)
前記タイプIIS制限エンドヌクレアーゼが、HOエンドヌクレアーゼおよびFokIエンドヌクレアーゼからなる群より選択される、項目109に記載の直鎖状核酸。
(項目111)
前記ジンクフィンガー結合ドメインが、3、5または6つのジンクフィンガーを含む、項目109に記載の直鎖状核酸。
(項目112)
前記エンドヌクレアーゼが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His−Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY−YIGホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである、項目108に記載の直鎖状核酸。
(項目113)
前記エンドヌクレアーゼが、H−DreI、I−SceI、I−SceII、I−SceIII、I−SceIV、I−SceV、I−SceVI、I−SceVII、I−CeuI、I−CeuAIIP、I−CreI、I−CrepsbIP、I−CrepsbIIP、I−CrepsbIIIP、I−CrepsbIVP、I−TliI、I−PpoI、Pi−PspI、F−SceI、F−SceII、F−SuvI、F−CphI、F−TevI、F−TevII、I−AmaI、I−AniI、I−ChuI、I−CmoeI、I−CpaI、I−CpaII、I−CsmI、I−CvuI、I−CvuAIP、I−DdiI、I−DdiII、I−DirI、I−DmoI、I−HmuI、I−HmuII、I−HsNIP、I−LlaI、I−MsoI、I−NaaI、I−NanI、I−NclIP、I−NgrIP、I−NitI、I−NjaI、I−Nsp236IP、I−PakI、I−PboIP、I−PcuIP、I−PcuAI、I−PcuVI、I−PgrIP、I−PobIP、I−PorI、I−PorIIP、I−PbpIP、I−SpBetaIP、I−ScaI、I−SexIP、I−SneIP、I−SpomI、I−SpomCP、I−SpomIP、I−SpomIIP、I−SquIP、I−Ssp68031、I−SthPhiJP、I−SthPhiST3P、I−SthPhiSTe3bP、I−TdeIP、I−TevI、I−TevII、I−TevIII、i−UarAP、i−UarHGPAIP、I−UarHGPA13P、I−VinIP、I−ZbiIP、PI−MgaI、PI−MtuI、PI−MtuHIP PI−MtuHIIP、PI−PfuI、PI−PfuII、PI−PkoI、PI−PkoII、PI−Rma43812IP、PI−SpBetaIP、PI−SceI、PI−TfuI、PI−TfuII、PI−ThyI、PI−TliIまたはPI−TliIIからなる群より選択される、項目108に記載の直鎖状核酸。
(項目114)
前記エンドヌクレアーゼが、内在性ゲノム配列に特異的に結合するように改変されており、該改変されたエンドヌクレアーゼは、もはやその野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合しない、項目108に記載の直鎖状核酸。
(項目115)
前記改変されたエンドヌクレアーゼが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His−Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY−YIGホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼに由来する、項目114に記載の直鎖状核酸。
(項目116)
前記改変されたエンドヌクレアーゼが、H−DreI、I−SceI、I−SceII、I−SceIII、I−SceIV、I−SceV、I−SceVI、I−SceVII、I−CeuI、I−CeuAIIP、I−CreI、I−CrepsbIP、I−CrepsbIIP、I−CrepsbIIIP、I−CrepsbIVP、I−TliI、I−PpoI、Pi−PspI、F−SceI、F−SceII、F−SuvI、F−CphI、F−TevI、F−TevII、I−AmaI、I−AniI、I−ChuI、I−CmoeI、I−CpaI、I−CpaII、I−CsmI、I−CvuI、I−CvuAIP、I−DdiI、I−DdiII、I−DirI、I−DmoI、I−HmuI、I−HmuII、I−HsNIP、I−LlaI、I−MsoI、I−NaaI、I−NanI、I−NclIP、I−NgrIP、I−NitI、I−NjaI、I−Nsp236IP、I−PakI、I−PboIP、I−PcuIP、I−PcuAI、I−PcuVI、I−PgrIP、I−PobIP、I−PorI、I−PorIIP、I−PbpIP、I−SpBetaIP、I−ScaI、I−SexIP、I−SneIP、I−SpomI、I−SpomCP、I−SpomIP、I−SpomIIP、I−SquIP、I−Ssp68031、I−SthPhiJP、I−SthPhiST3P、I−SthPhiSTe3bP、I−TdeIP、I−TevI、I−TevII、I−TevIII、i−UarAP、i−UarHGPAIP、I−UarHGPA13P、I−VinIP、I−ZbiIP、PI−MgaI、PI−MtuI、PI−MtuHIP
PI−MtuHIIP、PI−PfuI、PI−PfuII、PI−PkoI、PI−PkoII、PI−Rma43812IP、PI−SpBetaIP、PI−SceI、PI−TfuI、PI−TfuII、PI−ThyI、PI−TliIまたはPI−TliIIからなる群より選択されるエンドヌクレアーゼに由来する、項目114に記載の直鎖状核酸。
(項目117)
宿主細胞ゲノムの1つまたはそれを超える標的部位に1つまたはそれを超える外来性核酸を組み込むための方法であって、該方法は、
(a)1つまたはそれを超える宿主細胞を、
(i)該宿主細胞ゲノムの1つまたはそれを超える標的部位(TS)において、相同組換えを介して組み換わることができる1つまたはそれを超える外来性ドナー核酸(ES);(ii)RNAガイドエンドヌクレアーゼ(RGEN);
(iii)該RGENによる該1つまたはそれを超えるTSの部位特異的な認識および切断を可能にする1つまたはそれを超えるリボ核酸;および
(iv)それ自体との相同組換えまたは該宿主細胞と接触された1つまたはそれを超えるさらなる組換え前の直鎖状核酸との相同組換えが可能な組換え前の直鎖状核酸であって、ここで、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、組換え前の直鎖状核酸
と接触させる工程;
ならびに
(b)該選択マーカーを発現する宿主細胞を選択することにより、宿主細胞ゲノムの該1つまたはそれを超える標的部位に該1つまたはそれを超える外来性核酸を組み込んだ細胞を選択する工程
を含む、方法。
(項目118)
前記相同組換えによって、前記環状の染色体外核酸内に前記選択マーカーの完全なコード配列が形成される、項目117に記載の方法。
(項目119)
少なくとも1つの組換え前の直鎖状核酸が、前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼによるTSの部位特異的な認識および切断を可能にする前記1つまたはそれを超えるリボ核酸をコードする配列を含む、項目117または118に記載の方法。
(項目120)
前記1つまたはそれを超えるリボ核酸が、単一の連続したガイドRNA(gRNA)分子においてcrRNA活性およびtracrRNAを含む、項目119に記載の方法。
(項目121)
少なくとも1つの組換え前の直鎖状核酸が、前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼをコードする配列を含む、項目117〜120のいずれか1項に記載の方法。
(項目122)
前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼが、Cas9である、項目117〜121のいずれか1項の項目に記載の方法。
(項目123)
前記環状の染色体外核酸の形成が、2つまたは3つの組換え前の直鎖状核酸の相同組換えに起因する、項目117〜122のいずれか1項に記載の方法。
(項目124)
前記1つまたはそれを超える組換え前の直鎖状核酸が、該1つまたはそれを超える組換え前の核酸を含む1つまたはそれを超える環状核酸のRGEN切断によってインビボにおいて生成される、項目117〜123のいずれか1項に記載の方法。
(項目125)
複数(n個)の外来性核酸が、前記宿主細胞ゲノムの複数(n個)の標的部位に組み込まれ、ここで、nは、少なくとも2であり、工程(a)は、前記宿主細胞を、
(i)該複数の外来性核酸であって、ここで、
xは、1からnまで変動する整数であり、各整数xに対して、外来性核酸(ES) x の各々は、該宿主細胞ゲノムの該複数(n個)の標的部位から選択される標的部位(TS) x において、相同組換えを介して組み換わることができる、外来性核酸;
(ii)該標的部位(TS) x の各々に対して、前記RGENによる(TS) x の部位特異的な認識および切断を可能にするガイドRNA(gRNA) x
と接触させる工程を含む、項目117〜124のいずれか1項に記載の方法。
(項目126)
前記選択マーカーが、薬物耐性マーカー、蛍光タンパク質、または比色法もしくは蛍光検出法によって検出可能なタンパク質である、項目117〜125のいずれか1項に記載の方法。
(項目127)
ESが、目的の核酸Dをさらに含む、項目117〜126のいずれか1項に記載の方法。
(項目128)
Dが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群より選択される、項目127に記載の方法。
(項目129)
前記宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択される、項目117〜128のいずれか1項に記載の方法。
(項目130)
接触された前記宿主細胞(複数可)が、前記選択する工程の前に、少なくとも約12、24、36、48、72時間または72時間より長い期間にわたって培養される、項目117〜129のいずれか1項に記載の方法。
(項目131)
接触された前記細胞が、前記選択マーカーを発現しない細胞の生存に対して選択する培養条件下で培養される、項目117〜130のいずれか1項に記載の方法。
(項目132)
工程(b)という前記選択する工程が、視覚的検出法、比色法または蛍光検出法によって前記選択マーカーの発現を検出する工程を含む、項目117〜130のいずれか1項に記載の方法。
(項目133)
宿主細胞ゲノムの1つまたはそれを超える標的部位に1つまたはそれを超える外来性核酸を組み込むための組成物であって、該組成物は、
(a)宿主細胞ゲノムの1つまたはそれを超える標的部位(TS)において、相同組換えを介して組み換わることができる1つまたはそれを超える外来性ドナー核酸(ES);
(b)RNAガイドエンドヌクレアーゼ(RGEN)または該RGENをコードする核酸;
(c)該RGENによる該1つもしくはそれを超えるTSの部位特異的な認識および切断を可能にする1つもしくはそれを超えるリボ核酸、または該1つもしくはそれを超えるリボ核酸をコードする1つもしくはそれを超える核酸;および
(d)それ自体とのインビボでの相同組換えまたは該組成物中の1つもしくはそれを超えるさらなる組換え前の直鎖状核酸とのインビボでの相同組換えが可能な組換え前の直鎖状核酸であって、ここで、該インビボでの相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、組換え前の直鎖状核酸
を含む、組成物。
(項目134)
前記相同組換えによって、前記環状の染色体外核酸内に前記選択マーカーの完全なコード配列が形成される、項目133に記載の組成物。
(項目135)
少なくとも1つの組換え前の直鎖状核酸が、前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼによるTSの部位特異的な認識および切断を可能にする前記1つまたはそれを超えるリボ核酸をコードする配列を含む、項目133〜134のいずれか1項に記載の組成物。
(項目136)
前記1つまたはそれを超えるリボ核酸分子が、単一の連続したガイドRNA(gRNA)分子においてcrRNA活性およびtracrRNA活性を含む、項目135に記載の組成物。
(項目137)
少なくとも1つの組換え前の直鎖状核酸が、前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼをコードする配列を含む、項目133〜136のいずれか1項に記載の組成物。
(項目138)
前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼが、Cas9である、項目133〜137のいずれか1項に記載の組成物。
(項目139)
前記組成物が、相同的に組み換わることにより前記環状の染色体外核酸を形成することができる、2つまたは3つの組換え前の直鎖状核酸を含む、項目133〜138のいずれか1項に記載の組成物。
(項目140)
前記1つまたはそれを超える組換え前の直鎖状核酸が、該1つまたはそれを超える組換え前の核酸を含む1つまたはそれを超える環状核酸のRGEN切断によってインビボにおいて生成される、項目133〜139のいずれか1項に記載の組成物。
(項目141)
前記組成物が、
(a)前記宿主細胞ゲノムの複数(n個)の標的部位に組み込むことができる複数(n個)の外来性核酸であって、ここで、nは、少なくとも2であり、xは、1からnまで変動する整数であり、各整数xに対して、外来性核酸(ES) x の各々は、該宿主細胞ゲノムの該複数(n個)の標的部位から選択される標的部位(TS) x において、相同組換えを介して組み換わることができる、外来性核酸;ならびに
(b)該標的部位(TS) x の各々に対して、前記RGENによる(TS) x の部位特異的な認識および切断を可能にするガイドRNA(gRNA) x
を含む、項目133〜140のいずれか1項に記載の組成物。
(項目142)
前記選択マーカーが、薬物耐性マーカー、蛍光タンパク質、または比色法もしくは蛍光検出法によって検出可能なタンパク質である、項目133〜141のいずれか1項に記載の組成物。
(項目143)
ESが、目的の核酸Dをさらに含む、項目133〜142のいずれか1項に記載の組成物。
(項目144)
Dが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群より選択される、項目143に記載の組成物。
(項目145)
項目133〜144のいずれか1項に記載の組成物を含む、宿主細胞。
(項目146)
前記宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択される、項目145に記載の宿主細胞。
Claims (146)
- 相同組換えに適格性である宿主細胞を選択する方法であって、該方法は、
(a)1つまたはそれを超える宿主細胞を、それ自体との相同組換えまたは細胞の集団と接触される1つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸と接触させる工程であって、ここで、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、工程;および
(b)該選択マーカーを発現する宿主細胞を選択する工程
を含む、方法。 - 宿主細胞ゲノムの標的部位に外来性核酸を組み込むための方法であって、該方法は、
(a)1つまたはそれを超える宿主細胞を、
(i)該宿主細胞ゲノムの標的部位(TS)において、相同組換えを介して組み換わることができる外来性核酸(ES);
(ii)TSに断裂を作製することができるヌクレアーゼ(N);および
(iii)それ自体との相同組換えまたは該宿主細胞と接触される1つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸であって、ここで、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、直鎖状核酸
と接触させる工程;
ならびに
(b)該選択マーカーを発現する宿主細胞を選択する工程
を含む、方法。 - 前記直鎖状核酸が、互いとの相同組換えが可能な2つの内部相同性領域を含み、ここで、該内部相同性領域の相同組換えによって、前記選択マーカーを発現する前記環状の染色体外核酸が形成される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記直鎖状核酸が、前記宿主細胞と接触されるさらなる直鎖状核酸の相同性領域と組み換わることができる相同性領域を含み、2つの該直鎖状核酸の相同組換えによって、前記選択マーカーを発現する前記環状の染色体外核酸が形成される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記直鎖状核酸が、前記選択マーカーの部分的なコード配列、中断されたコード配列および/または不連続のコード配列を含み、該選択マーカーは、該直鎖状核酸から発現され得ず、前記環状の染色体外核酸の前記形成によって、該選択マーカーの完全なコード配列が形成され、該選択マーカーは、該環状の染色体外核酸から発現され得る、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 接触される前記宿主細胞(複数可)が、前記選択する工程の前に、少なくとも約12、24、36、48、72時間または72時間より長い期間にわたって培養される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 接触される前記細胞が、前記選択マーカーを発現しない細胞の生存に対して選択する培養条件下で培養される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(b)という前記選択する工程が、視覚的検出法、比色法または蛍光検出法によって前記選択マーカーの発現を検出する工程を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- ESがTSにおいて相同的に組み換えられた宿主細胞を回収する工程をさらに含む、請求項2〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記回収する工程が、前記宿主細胞ゲノムへの選択マーカーの組込みを必要としない、請求項9に記載の方法。
- 前記回収する工程が、スクリーニングされた10、9、8、7、6、5、4、3もしくは2個の接触された宿主細胞毎またはそれらのクローン集団毎に少なくとも約1回の頻度で行われる、請求項9に記載の方法。
- 選択された前記宿主細胞から前記環状の染色体外核酸を除去する工程をさらに含む、請求項2〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 複数(n個)の外来性核酸が、前記宿主細胞ゲノムの複数(n個)の標的部位に組み込まれ、ここで、nは、少なくとも2であり、工程(a)は、前記宿主細胞を
(i)該複数の外来性核酸であって、ここで、
xは、1からnまで変動する整数であり、各整数xに対して、外来性核酸(ES)xの各々は、該宿主細胞ゲノムの該複数(n個)の標的部位から選択される標的部位(TS)xにおいて、相同組換えを介して組み換わることができる、外来性核酸;
(ii)該標的部位(TS)xの各々に対して、(TS)xにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ(N)x
と接触させる工程を含む、請求項2〜12のいずれか1項に記載の方法。 - 単一のヌクレアーゼが、(TS)xの各々を切断することができる、請求項13に記載の方法。
- n=3、4、5、6、7、8、9または10である、請求項13または14に記載の方法。
- ESが、第1の相同性領域(HR1)および第2の相同性領域(HR2)を含み、ここで、HR1およびHR2は、相同組換えを介して、それぞれ第3の相同性領域(HR3)および第4の相同性領域(HR4)と組み換わることができ、HR3およびHR4は各々、TSに存在する、請求項2〜15のいずれか1項に記載の方法。
- Nが、TSに一本鎖断裂または二本鎖断裂をもたらすことができる、請求項2〜16のいずれか1項に記載の方法。
- ESが、目的の核酸Dをさらに含む、請求項2〜17のいずれか1項に記載の方法。
- Dが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群より選択される、請求項18に記載の方法。
- ESが、直鎖状である、請求項2〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記環状の染色体外核酸が、前記ヌクレアーゼのコード配列をさらに含む、請求項2〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼである、請求項2〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼが、Cas9エンドヌクレアーゼである、請求項22に記載の方法。
- 前記環状の染色体外核酸が、前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼによるTSの部位特異的な認識および切断を可能にする、crRNA活性およびtracrRNA活性をコードする配列をさらに含む、請求項22または23に記載の方法。
- 前記crRNA活性および前記tracrRNA活性が、単一の連続したRNA分子として発現される、請求項24に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TAL−エフェクターDNA結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質(TALEN)、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項2〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたタイプIIS制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である、請求項26に記載の方法。
- 前記タイプIIS制限エンドヌクレアーゼが、HOエンドヌクレアーゼおよびFokIエンドヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項27に記載の方法。
- 前記ジンクフィンガー結合ドメインが、3、5または6つのジンクフィンガーを含む、請求項27に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His−Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY−YIGホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項26に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼが、H−DreI、I−SceI、I−SceII、I−SceIII、I−SceIV、I−SceV、I−SceVI、I−SceVII、I−CeuI、I−CeuAIIP、I−CreI、I−CrepsbIP、I−CrepsbIIP、I−CrepsbIIIP、I−CrepsbIVP、I−TliI、I−PpoI、Pi−PspI、F−SceI、F−SceII、F−SuvI、F−CphI、F−TevI、F−TevII、I−AmaI、I−AniI、I−ChuI、I−CmoeI、I−CpaI、I−CpaII、I−CsmI、I−CvuI、I−CvuAIP、I−DdiI、I−DdiII、I−DirI、I−DmoI、I−HmuI、I−HmuII、I−HsNIP、I−LlaI、I−MsoI、I−NaaI、I−NanI、I−NclIP、I−NgrIP、I−NitI、I−NjaI、I−Nsp236IP、I−PakI、I−PboIP、I−PcuIP、I−PcuAI、I−PcuVI、I−PgrIP、I−PobIP、I−PorI、I−PorIIP、I−PbpIP、I−SpBetaIP、I−ScaI、I−SexIP、I−SneIP、I−SpomI、I−SpomCP、I−SpomIP、I−SpomIIP、I−SquIP、I−Ssp68031、I−SthPhiJP、I−SthPhiST3P、I−SthPhiSTe3bP、I−TdeIP、I−TevI、I−TevII、I−TevIII、i−UarAP、i−UarHGPAIP、I−UarHGPA13P、I−VinIP、I−ZbiIP、PI−MgaI、PI−MtuI、PI−MtuHIP PI−MtuHIIP、PI−PfuI、PI−PfuII、PI−PkoI、PI−PkoII、PI−Rma43812IP、PI−SpBetaIP、PI−SceI、PI−TfuI、PI−TfuII、PI−ThyI、PI−TliIまたはPI−TliIIからなる群より選択される、請求項26に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼが、内在性ゲノム配列に特異的に結合するように改変されており、該改変されたエンドヌクレアーゼは、もはやその野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合しない、請求項26に記載の方法。
- 前記改変されたエンドヌクレアーゼが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His−Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY−YIGホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼに由来する、請求項32に記載の方法。
- 前記改変されたエンドヌクレアーゼが、H−DreI、I−SceI、I−SceII、I−SceIII、I−SceIV、I−SceV、I−SceVI、I−SceVII、I−CeuI、I−CeuAIIP、I−CreI、I−CrepsbIP、I−CrepsbIIP、I−CrepsbIIIP、I−CrepsbIVP、I−TliI、I−PpoI、Pi−PspI、F−SceI、F−SceII、F−SuvI、F−CphI、F−TevI、F−TevII、I−AmaI、I−AniI、I−ChuI、I−CmoeI、I−CpaI、I−CpaII、I−CsmI、I−CvuI、I−CvuAIP、I−DdiI、I−DdiII、I−DirI、I−DmoI、I−HmuI、I−HmuII、I−HsNIP、I−LlaI、I−MsoI、I−NaaI、I−NanI、I−NclIP、I−NgrIP、I−NitI、I−NjaI、I−Nsp236IP、I−PakI、I−PboIP、I−PcuIP、I−PcuAI、I−PcuVI、I−PgrIP、I−PobIP、I−PorI、I−PorIIP、I−PbpIP、I−SpBetaIP、I−ScaI、I−SexIP、I−SneIP、I−SpomI、I−SpomCP、I−SpomIP、I−SpomIIP、I−SquIP、I−Ssp68031、I−SthPhiJP、I−SthPhiST3P、I−SthPhiSTe3bP、I−TdeIP、I−TevI、I−TevII、I−TevIII、i−UarAP、i−UarHGPAIP、I−UarHGPA13P、I−VinIP、I−ZbiIP、PI−MgaI、PI−MtuI、PI−MtuHIP PI−MtuHIIP、PI−PfuI、PI−PfuII、PI−PkoI、PI−PkoII、PI−Rma43812IP、PI−SpBetaIP、PI−SceI、PI−TfuI、PI−TfuII、PI−ThyI、PI−TliIまたはPI−TliIIからなる群より選択されるエンドヌクレアーゼに由来する、請求項32に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、原核細胞である、請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、真核細胞である、請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択される、請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、げっ歯類細胞、霊長類細胞およびヒト細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞である、請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、ヒト細胞である、請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、酵母細胞である、請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記酵母が、Saccharomyces cerevisiaeである、請求項40に記載の方法。
- 宿主細胞であって、(i)該宿主細胞ゲノムの標的部位(TS)において、相同組換えを介して組み換わることができる、外来性核酸(ES);
(ii)TSにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ(N);および
(iii)それ自体との相同組換えまたは該宿主細胞内の1つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸であって、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、直鎖状核酸
を含む、宿主細胞。 - 前記直鎖状核酸が、互いとの相同組換えが可能な2つの内部相同性領域を含み、ここで、該内部相同性領域の相同組換えによって、前記選択マーカーを発現する前記環状の染色体外核酸が形成される、請求項42に記載の宿主細胞。
- 前記直鎖状核酸が、前記宿主細胞内のさらなる直鎖状核酸の相同性領域と組み換わることができる相同性領域を含み、2つの該直鎖状核酸の相同組換えによって、前記選択マーカーを発現する前記環状の染色体外核酸が形成される、請求項42に記載の宿主細胞。
- 前記直鎖状核酸が、前記選択マーカーの部分的なコード配列、中断されたコード配列および/または不連続のコード配列を含み、該選択マーカーは、該直鎖状核酸から発現され得ず、前記環状の染色体外核酸の前記形成によって、該選択マーカーの完全なコード配列が形成され、該選択マーカーは、該環状の染色体外核酸から発現され得る、請求項42〜44のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、
(i)複数の外来性核酸であって、ここで、
xは、1からnまで変動する整数であり、各整数xに対して、外来性核酸(ES)xの各々は、該宿主細胞ゲノムの前記複数(n個)の標的部位から選択される標的部位(TS)xにおいて、相同組換えを介して組み換わることができる、外来性核酸;
(ii)該標的部位(TS)xの各々に対して、(TS)xにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ(N)x
を含む、請求項42〜45のいずれか1項に記載の宿主細胞。 - ESが、第1の相同性領域(HR1)および第2の相同性領域(HR2)を含み、ここで、HR1およびHR2は、相同組換えを介して、それぞれ第3の相同性領域(HR3)および第4の相同性領域(HR4)と組み換わることができ、HR3およびHR4は各々、TSに存在する、請求項42〜46のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- Nが、TSに一本鎖断裂または二本鎖断裂をもたらすことができる、請求項42〜41のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- ESが、目的の核酸Dをさらに含む、請求項42〜48のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- Dが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群より選択される、請求項49に記載の宿主細胞。
- ESが、直鎖状である、請求項42〜50のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記環状の染色体外核酸が、前記ヌクレアーゼのコード配列をさらに含む、請求項42〜51のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記ヌクレアーゼが、RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼである、請求項42〜52のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼが、Cas9エンドヌクレアーゼである、請求項53に記載の宿主細胞。
- 前記環状の染色体外核酸が、前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼによるTSの部位特異的な認識および切断を可能にする、crRNA活性およびtracrRNA活性をコードする配列をさらに含む、請求項53または54に記載の宿主細胞。
- 前記crRNA活性および前記tracrRNA活性が、単一の連続したRNA分子として発現される、請求項55に記載の宿主細胞。
- 前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TAL−エフェクターDNA結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質(TALEN)、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項42〜56のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたタイプIIS制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である、請求項57に記載の宿主細胞。
- 前記タイプIIS制限エンドヌクレアーゼが、HOエンドヌクレアーゼおよびFokIエンドヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項58に記載の宿主細胞。
- 前記ジンクフィンガー結合ドメインが、3、5または6つのジンクフィンガーを含む、請求項58に記載の宿主細胞。
- 前記エンドヌクレアーゼが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His−Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY−YIGホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項58に記載の宿主細胞。
- 前記エンドヌクレアーゼが、H−DreI、I−SceI、I−SceII、I−SceIII、I−SceIV、I−SceV、I−SceVI、I−SceVII、I−CeuI、I−CeuAIIP、I−CreI、I−CrepsbIP、I−CrepsbIIP、I−CrepsbIIIP、I−CrepsbIVP、I−TliI、I−PpoI、Pi−PspI、F−SceI、F−SceII、F−SuvI、F−CphI、F−TevI、F−TevII、I−AmaI、I−AniI、I−ChuI、I−CmoeI、I−CpaI、I−CpaII、I−CsmI、I−CvuI、I−CvuAIP、I−DdiI、I−DdiII、I−DirI、I−DmoI、I−HmuI、I−HmuII、I−HsNIP、I−LlaI、I−MsoI、I−NaaI、I−NanI、I−NclIP、I−NgrIP、I−NitI、I−NjaI、I−Nsp236IP、I−PakI、I−PboIP、I−PcuIP、I−PcuAI、I−PcuVI、I−PgrIP、I−PobIP、I−PorI、I−PorIIP、I−PbpIP、I−SpBetaIP、I−ScaI、I−SexIP、I−SneIP、I−SpomI、I−SpomCP、I−SpomIP、I−SpomIIP、I−SquIP、I−Ssp68031、I−SthPhiJP、I−SthPhiST3P、I−SthPhiSTe3bP、I−TdeIP、I−TevI、I−TevII、I−TevIII、i−UarAP、i−UarHGPAIP、I−UarHGPA13P、I−VinIP、I−ZbiIP、PI−MgaI、PI−MtuI、PI−MtuHIP PI−MtuHIIP、PI−PfuI、PI−PfuII、PI−PkoI、PI−PkoII、PI−Rma43812IP、PI−SpBetaIP、PI−SceI、PI−TfuI、PI−TfuII、PI−ThyI、PI−TliIまたはPI−TliIIからなる群より選択される、請求項58に記載の宿主細胞。
- 前記エンドヌクレアーゼが、内在性ゲノム配列に特異的に結合するように改変されており、該改変されたエンドヌクレアーゼは、もはやその野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合しない、請求項58に記載の宿主細胞。
- 前記改変されたエンドヌクレアーゼが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His−Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY−YIGホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼに由来する、請求項63に記載の宿主細胞。
- 前記改変されたエンドヌクレアーゼが、H−DreI、I−SceI、I−SceII、I−SceIII、I−SceIV、I−SceV、I−SceVI、I−SceVII、I−CeuI、I−CeuAIIP、I−CreI、I−CrepsbIP、I−CrepsbIIP、I−CrepsbIIIP、I−CrepsbIVP、I−TliI、I−PpoI、Pi−PspI、F−SceI、F−SceII、F−SuvI、F−CphI、F−TevI、F−TevII、I−AmaI、I−AniI、I−ChuI、I−CmoeI、I−CpaI、I−CpaII、I−CsmI、I−CvuI、I−CvuAIP、I−DdiI、I−DdiII、I−DirI、I−DmoI、I−HmuI、I−HmuII、I−HsNIP、I−LlaI、I−MsoI、I−NaaI、I−NanI、I−NclIP、I−NgrIP、I−NitI、I−NjaI、I−Nsp236IP、I−PakI、I−PboIP、I−PcuIP、I−PcuAI、I−PcuVI、I−PgrIP、I−PobIP、I−PorI、I−PorIIP、I−PbpIP、I−SpBetaIP、I−ScaI、I−SexIP、I−SneIP、I−SpomI、I−SpomCP、I−SpomIP、I−SpomIIP、I−SquIP、I−Ssp68031、I−SthPhiJP、I−SthPhiST3P、I−SthPhiSTe3bP、I−TdeIP、I−TevI、I−TevII、I−TevIII、i−UarAP、i−UarHGPAIP、I−UarHGPA13P、I−VinIP、I−ZbiIP、PI−MgaI、PI−MtuI、PI−MtuHIP PI−MtuHIIP、PI−PfuI、PI−PfuII、PI−PkoI、PI−PkoII、PI−Rma43812IP、PI−SpBetaIP、PI−SceI、PI−TfuI、PI−TfuII、PI−ThyI、PI−TliIまたはPI−TliIIからなる群より選択されるエンドヌクレアーゼに由来する、請求項63に記載の宿主細胞。
- (a)部位特異的ヌクレアーゼ、または部位特異的ヌクレアーゼのコード配列を含む核酸;および
(b)宿主細胞において互いとの相同組換えが可能な2つの内部相同性領域を含む直鎖状核酸であって、ここで、該内部相同性領域の相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状核酸が形成される、直鎖状核酸
を含む、組成物。 - 前記直鎖状核酸が、前記選択マーカーの部分的なコード配列、中断されたコード配列および/または不連続のコード配列を含み、該選択マーカーは、宿主細胞において該直鎖状核酸から発現され得ず、前記環状核酸の前記形成によって、該選択マーカーの完全なコード配列が形成され、該選択マーカーは、該宿主細胞において該環状核酸から発現され得る、請求項66に記載の組成物。
- (a)部位特異的ヌクレアーゼ、または部位特異的ヌクレアーゼのコード配列を含む核酸;ならびに
(b)第1の直鎖状核酸および1つまたはそれを超えるさらなる直鎖状核酸であって、ここで、該第1および第2の直鎖状核酸は、宿主細胞において互いとの相同組換えが可能であり、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状核酸が形成される、第1の直鎖状核酸および1つまたはそれを超えるさらなる直鎖状核酸
を含む、組成物。 - 各直鎖状核酸が、前記選択マーカーの部分的なコード配列、中断されたコード配列および/または不連続のコード配列を含み、該選択マーカーは、宿主細胞において各直鎖状核酸から発現され得ず、前記環状核酸の前記形成によって、該選択マーカーの完全なコード配列が形成され、該選択マーカーは、宿主細胞において該環状核酸から発現され得る、請求項68に記載の組成物。
- 前記環状核酸が、部位特異的ヌクレアーゼのコード配列をさらに含む、請求項66〜69のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記部位特異的ヌクレアーゼが、RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼである、請求項66〜70のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼが、Cas9エンドヌクレアーゼである、請求項71に記載の組成物。
- (i)crRNA活性を有するリボ核酸およびtracrRNA活性を有するリボ核酸;または
(ii)crRNA活性を有するリボ核酸をコードするデオキシリボ核酸およびtracrRNA活性を有するリボ核酸をコードするデオキシリボ核酸
をさらに含む、請求項71または72に記載の組成物。 - 前記環状核酸が、crRNA活性を有するリボ核酸をコードするデオキシリボ核酸およびtracrRNA活性を有するリボ核酸をコードするデオキシリボ核酸をさらに含む、請求項72または73に記載の組成物。
- 前記crRNA活性および前記tracrRNA活性をコードする前記デオキシリボ核酸が、単一の連続したRNA分子上で該活性をコードする、請求項73または74に記載の組成物。
- 前記部位特異的ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TAL−エフェクターDNA結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質(TALEN)、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項66〜70のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたタイプIIS制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である、請求項76に記載の組成物。
- 前記タイプIIS制限エンドヌクレアーゼが、HOエンドヌクレアーゼおよびFokIエンドヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項77に記載の組成物。
- 前記ジンクフィンガー結合ドメインが、3、5または6つのジンクフィンガーを含む、請求項77に記載の組成物。
- 前記エンドヌクレアーゼが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His−Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY−YIGホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項76に記載の組成物。
- 前記エンドヌクレアーゼが、H−DreI、I−SceI、I−SceII、I−SceIII、I−SceIV、I−SceV、I−SceVI、I−SceVII、I−CeuI、I−CeuAIIP、I−CreI、I−CrepsbIP、I−CrepsbIIP、I−CrepsbIIIP、I−CrepsbIVP、I−TliI、I−PpoI、Pi−PspI、F−SceI、F−SceII、F−SuvI、F−CphI、F−TevI、F−TevII、I−AmaI、I−AniI、I−ChuI、I−CmoeI、I−CpaI、I−CpaII、I−CsmI、I−CvuI、I−CvuAIP、I−DdiI、I−DdiII、I−DirI、I−DmoI、I−HmuI、I−HmuII、I−HsNIP、I−LlaI、I−MsoI、I−NaaI、I−NanI、I−NclIP、I−NgrIP、I−NitI、I−NjaI、I−Nsp236IP、I−PakI、I−PboIP、I−PcuIP、I−PcuAI、I−PcuVI、I−PgrIP、I−PobIP、I−PorI、I−PorIIP、I−PbpIP、I−SpBetaIP、I−ScaI、I−SexIP、I−SneIP、I−SpomI、I−SpomCP、I−SpomIP、I−SpomIIP、I−SquIP、I−Ssp68031、I−SthPhiJP、I−SthPhiST3P、I−SthPhiSTe3bP、I−TdeIP、I−TevI、I−TevII、I−TevIII、i−UarAP、i−UarHGPAIP、I−UarHGPA13P、I−VinIP、I−ZbiIP、PI−MgaI、PI−MtuI、PI−MtuHIP PI−MtuHIIP、PI−PfuI、PI−PfuII、PI−PkoI、PI−PkoII、PI−Rma43812IP、PI−SpBetaIP、PI−SceI、PI−TfuI、PI−TfuII、PI−ThyI、PI−TliIまたはPI−TliIIからなる群より選択される、請求項76に記載の組成物。
- 前記エンドヌクレアーゼが、内在性ゲノム配列に特異的に結合するように改変されており、該改変されたエンドヌクレアーゼは、もはやその野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合しない、請求項76に記載の組成物。
- 前記改変されたエンドヌクレアーゼが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His−Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY−YIGホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼに由来する、請求項77に記載の組成物。
- 前記改変されたエンドヌクレアーゼが、H−DreI、I−SceI、I−SceII、I−SceIII、I−SceIV、I−SceV、I−SceVI、I−SceVII、I−CeuI、I−CeuAIIP、I−CreI、I−CrepsbIP、I−CrepsbIIP、I−CrepsbIIIP、I−CrepsbIVP、I−TliI、I−PpoI、Pi−PspI、F−SceI、F−SceII、F−SuvI、F−CphI、F−TevI、F−TevII、I−AmaI、I−AniI、I−ChuI、I−CmoeI、I−CpaI、I−CpaII、I−CsmI、I−CvuI、I−CvuAIP、I−DdiI、I−DdiII、I−DirI、I−DmoI、I−HmuI、I−HmuII、I−HsNIP、I−LlaI、I−MsoI、I−NaaI、I−NanI、I−NclIP、I−NgrIP、I−NitI、I−NjaI、I−Nsp236IP、I−PakI、I−PboIP、I−PcuIP、I−PcuAI、I−PcuVI、I−PgrIP、I−PobIP、I−PorI、I−PorIIP、I−PbpIP、I−SpBetaIP、I−ScaI、I−SexIP、I−SneIP、I−SpomI、I−SpomCP、I−SpomIP、I−SpomIIP、I−SquIP、I−Ssp68031、I−SthPhiJP、I−SthPhiST3P、I−SthPhiSTe3bP、I−TdeIP、I−TevI、I−TevII、I−TevIII、i−UarAP、i−UarHGPAIP、I−UarHGPA13P、I−VinIP、I−ZbiIP、PI−MgaI、PI−MtuI、PI−MtuHIP PI−MtuHIIP、PI−PfuI、PI−PfuII、PI−PkoI、PI−PkoII、PI−Rma43812IP、PI−SpBetaIP、PI−SceI、PI−TfuI、PI−TfuII、PI−ThyI、PI−TliIまたはPI−TliIIからなる群より選択されるエンドヌクレアーゼに由来する、請求項77に記載の組成物。
- 請求項66〜84のいずれか1項に記載の組成物を含む、宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、原核細胞である、請求項42〜65および85のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、真核細胞である、請求項42〜65および85のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択される、請求項42〜65および85のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、げっ歯類細胞、霊長類細胞およびヒト細胞からなる群から選択される哺乳動物細胞である、請求項42〜65および85のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、ヒト細胞である、請求項42〜65および85のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、酵母細胞である、請求項42〜65および85のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記酵母が、Saccharomyces cerevisiaeである、請求項91に記載の宿主細胞。
- 細胞培養培地ならびに請求項42〜65および85〜92のいずれか1項に記載の宿主細胞を含む、細胞培養組成物。
- 前記選択マーカーの発現について選択する化合物をさらに含む、請求項93に記載の細胞培養組成物。
- 宿主細胞ゲノムの標的部位に外来性核酸を組み込むための方法であって、該方法は、
(a)1つまたはそれを超える宿主細胞を、
(i)該宿主細胞ゲノムの該標的部位(TS)において、相同組換えを介して組み換わることができる外来性核酸(ES);および
(ii)それ自体との相同組換えまたは該宿主細胞と接触される1つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸であって、ここで、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列およびTSにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ(N)のコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、直鎖状核酸
と接触させる工程;
ならびに
(b)該選択マーカーを発現する宿主細胞を選択する工程
を含む、方法。 - 前記ヌクレアーゼが、CRISPR関連RNAガイドエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TAL−エフェクターDNA結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質(TALEN)、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項95に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、CRISPR関連RNAガイドエンドヌクレアーゼであり、前記環状の染色体外核酸が、前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼによるTSの部位特異的な認識および切断を可能にするcrRNA活性およびtracrRNA活性をコードする配列をさらに含む、請求項96に記載の方法。
- 宿主細胞であって、(i)該宿主細胞ゲノムの標的部位(TS)において、相同組換えを介して組み換わることができる外来性核酸(ES);および
(ii)それ自体との相同組換えまたは該宿主細胞と接触される1つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸であって、ここで、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列およびTSにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ(N)のコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、直鎖状核酸
を含む、宿主細胞。 - 前記ヌクレアーゼが、CRISPR関連RNAガイドエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TAL−エフェクターDNA結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質(TALEN)、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項98に記載の宿主細胞。
- 前記ヌクレアーゼが、CRISPR関連RNAガイドエンドヌクレアーゼであり、前記環状の染色体外核酸が、前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼによるTSの部位特異的な認識および切断を可能にするcrRNA活性およびtracrRNA活性をコードする配列をさらに含む、請求項99に記載の宿主細胞。
- 第1の相同性領域(HR1)および第2の相同性領域(HR2)を含む直鎖状核酸であって、ここで、HR1およびHR2は、相同組換えを介して互いと組み換わることができ、HR1とHR2との相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状核酸が形成される、直鎖状核酸。
- HR1が、前記選択マーカーの第1の不完全なコード配列を含み、HR2が、該選択マーカーの第2の不完全なコード配列を含み、HR1とHR2との相同組換えによって、該選択マーカーの完全なコード配列が再構成される、請求項101に記載の直鎖状核酸。
- 部位特異的ヌクレアーゼのコード配列をさらに含む、請求項101または102に記載の直鎖状核酸。
- 前記部位特異的ヌクレアーゼが、RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼである、請求項103に記載の直鎖状核酸。
- 前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼが、Cas9エンドヌクレアーゼである、請求項104に記載の直鎖状核酸。
- 前記環状核酸が、crRNA活性およびtracrRNA活性をコードする配列をさらに含む、請求項101〜105のいずれか1項に記載の直鎖状核酸。
- 前記crRNA活性および前記tracrRNA活性をコードする配列が、単一の連続したRNA分子上で該活性をコードする、106に記載の直鎖状核酸。
- 前記部位特異的ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TAL−エフェクターDNA結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質(TALEN)、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項103に記載の直鎖状核酸。
- 前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたタイプIIS制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である、請求項108に記載の直鎖状核酸。
- 前記タイプIIS制限エンドヌクレアーゼが、HOエンドヌクレアーゼおよびFokIエンドヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項109に記載の直鎖状核酸。
- 前記ジンクフィンガー結合ドメインが、3、5または6つのジンクフィンガーを含む、請求項109に記載の直鎖状核酸。
- 前記エンドヌクレアーゼが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His−Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY−YIGホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項108に記載の直鎖状核酸。
- 前記エンドヌクレアーゼが、H−DreI、I−SceI、I−SceII、I−SceIII、I−SceIV、I−SceV、I−SceVI、I−SceVII、I−CeuI、I−CeuAIIP、I−CreI、I−CrepsbIP、I−CrepsbIIP、I−CrepsbIIIP、I−CrepsbIVP、I−TliI、I−PpoI、Pi−PspI、F−SceI、F−SceII、F−SuvI、F−CphI、F−TevI、F−TevII、I−AmaI、I−AniI、I−ChuI、I−CmoeI、I−CpaI、I−CpaII、I−CsmI、I−CvuI、I−CvuAIP、I−DdiI、I−DdiII、I−DirI、I−DmoI、I−HmuI、I−HmuII、I−HsNIP、I−LlaI、I−MsoI、I−NaaI、I−NanI、I−NclIP、I−NgrIP、I−NitI、I−NjaI、I−Nsp236IP、I−PakI、I−PboIP、I−PcuIP、I−PcuAI、I−PcuVI、I−PgrIP、I−PobIP、I−PorI、I−PorIIP、I−PbpIP、I−SpBetaIP、I−ScaI、I−SexIP、I−SneIP、I−SpomI、I−SpomCP、I−SpomIP、I−SpomIIP、I−SquIP、I−Ssp68031、I−SthPhiJP、I−SthPhiST3P、I−SthPhiSTe3bP、I−TdeIP、I−TevI、I−TevII、I−TevIII、i−UarAP、i−UarHGPAIP、I−UarHGPA13P、I−VinIP、I−ZbiIP、PI−MgaI、PI−MtuI、PI−MtuHIP PI−MtuHIIP、PI−PfuI、PI−PfuII、PI−PkoI、PI−PkoII、PI−Rma43812IP、PI−SpBetaIP、PI−SceI、PI−TfuI、PI−TfuII、PI−ThyI、PI−TliIまたはPI−TliIIからなる群より選択される、請求項108に記載の直鎖状核酸。
- 前記エンドヌクレアーゼが、内在性ゲノム配列に特異的に結合するように改変されており、該改変されたエンドヌクレアーゼは、もはやその野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合しない、請求項108に記載の直鎖状核酸。
- 前記改変されたエンドヌクレアーゼが、LAGLIDADGホーミングエンドヌクレアーゼ、HNHホーミングエンドヌクレアーゼ、His−Cysボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、GIY−YIGホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼに由来する、請求項114に記載の直鎖状核酸。
- 前記改変されたエンドヌクレアーゼが、H−DreI、I−SceI、I−SceII、I−SceIII、I−SceIV、I−SceV、I−SceVI、I−SceVII、I−CeuI、I−CeuAIIP、I−CreI、I−CrepsbIP、I−CrepsbIIP、I−CrepsbIIIP、I−CrepsbIVP、I−TliI、I−PpoI、Pi−PspI、F−SceI、F−SceII、F−SuvI、F−CphI、F−TevI、F−TevII、I−AmaI、I−AniI、I−ChuI、I−CmoeI、I−CpaI、I−CpaII、I−CsmI、I−CvuI、I−CvuAIP、I−DdiI、I−DdiII、I−DirI、I−DmoI、I−HmuI、I−HmuII、I−HsNIP、I−LlaI、I−MsoI、I−NaaI、I−NanI、I−NclIP、I−NgrIP、I−NitI、I−NjaI、I−Nsp236IP、I−PakI、I−PboIP、I−PcuIP、I−PcuAI、I−PcuVI、I−PgrIP、I−PobIP、I−PorI、I−PorIIP、I−PbpIP、I−SpBetaIP、I−ScaI、I−SexIP、I−SneIP、I−SpomI、I−SpomCP、I−SpomIP、I−SpomIIP、I−SquIP、I−Ssp68031、I−SthPhiJP、I−SthPhiST3P、I−SthPhiSTe3bP、I−TdeIP、I−TevI、I−TevII、I−TevIII、i−UarAP、i−UarHGPAIP、I−UarHGPA13P、I−VinIP、I−ZbiIP、PI−MgaI、PI−MtuI、PI−MtuHIP PI−MtuHIIP、PI−PfuI、PI−PfuII、PI−PkoI、PI−PkoII、PI−Rma43812IP、PI−SpBetaIP、PI−SceI、PI−TfuI、PI−TfuII、PI−ThyI、PI−TliIまたはPI−TliIIからなる群より選択されるエンドヌクレアーゼに由来する、請求項114に記載の直鎖状核酸。
- 宿主細胞ゲノムの1つまたはそれを超える標的部位に1つまたはそれを超える外来性核酸を組み込むための方法であって、該方法は、
(a)1つまたはそれを超える宿主細胞を、
(i)該宿主細胞ゲノムの1つまたはそれを超える標的部位(TS)において、相同組換えを介して組み換わることができる1つまたはそれを超える外来性ドナー核酸(ES);
(ii)RNAガイドエンドヌクレアーゼ(RGEN);
(iii)該RGENによる該1つまたはそれを超えるTSの部位特異的な認識および切断を可能にする1つまたはそれを超えるリボ核酸;および
(iv)それ自体との相同組換えまたは該宿主細胞と接触された1つまたはそれを超えるさらなる組換え前の直鎖状核酸との相同組換えが可能な組換え前の直鎖状核酸であって、ここで、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、組換え前の直鎖状核酸
と接触させる工程;
ならびに
(b)該選択マーカーを発現する宿主細胞を選択することにより、宿主細胞ゲノムの該1つまたはそれを超える標的部位に該1つまたはそれを超える外来性核酸を組み込んだ細胞を選択する工程
を含む、方法。 - 前記相同組換えによって、前記環状の染色体外核酸内に前記選択マーカーの完全なコード配列が形成される、請求項117に記載の方法。
- 少なくとも1つの組換え前の直鎖状核酸が、前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼによるTSの部位特異的な認識および切断を可能にする前記1つまたはそれを超えるリボ核酸をコードする配列を含む、請求項117または118に記載の方法。
- 前記1つまたはそれを超えるリボ核酸が、単一の連続したガイドRNA(gRNA)分子においてcrRNA活性およびtracrRNAを含む、請求項119に記載の方法。
- 少なくとも1つの組換え前の直鎖状核酸が、前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼをコードする配列を含む、請求項117〜120のいずれか1項に記載の方法。
- 前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼが、Cas9である、請求項117〜121のいずれか1項の請求項に記載の方法。
- 前記環状の染色体外核酸の形成が、2つまたは3つの組換え前の直鎖状核酸の相同組換えに起因する、請求項117〜122のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1つまたはそれを超える組換え前の直鎖状核酸が、該1つまたはそれを超える組換え前の核酸を含む1つまたはそれを超える環状核酸のRGEN切断によってインビボにおいて生成される、請求項117〜123のいずれか1項に記載の方法。
- 複数(n個)の外来性核酸が、前記宿主細胞ゲノムの複数(n個)の標的部位に組み込まれ、ここで、nは、少なくとも2であり、工程(a)は、前記宿主細胞を、
(i)該複数の外来性核酸であって、ここで、
xは、1からnまで変動する整数であり、各整数xに対して、外来性核酸(ES)xの各々は、該宿主細胞ゲノムの該複数(n個)の標的部位から選択される標的部位(TS)xにおいて、相同組換えを介して組み換わることができる、外来性核酸;
(ii)該標的部位(TS)xの各々に対して、前記RGENによる(TS)xの部位特異的な認識および切断を可能にするガイドRNA(gRNA)x
と接触させる工程を含む、請求項117〜124のいずれか1項に記載の方法。 - 前記選択マーカーが、薬物耐性マーカー、蛍光タンパク質、または比色法もしくは蛍光検出法によって検出可能なタンパク質である、請求項117〜125のいずれか1項に記載の方法。
- ESが、目的の核酸Dをさらに含む、請求項117〜126のいずれか1項に記載の方法。
- Dが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群より選択される、請求項127に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択される、請求項117〜128のいずれか1項に記載の方法。
- 接触された前記宿主細胞(複数可)が、前記選択する工程の前に、少なくとも約12、24、36、48、72時間または72時間より長い期間にわたって培養される、請求項117〜129のいずれか1項に記載の方法。
- 接触された前記細胞が、前記選択マーカーを発現しない細胞の生存に対して選択する培養条件下で培養される、請求項117〜130のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(b)という前記選択する工程が、視覚的検出法、比色法または蛍光検出法によって前記選択マーカーの発現を検出する工程を含む、請求項117〜130のいずれか1項に記載の方法。
- 宿主細胞ゲノムの1つまたはそれを超える標的部位に1つまたはそれを超える外来性核酸を組み込むための組成物であって、該組成物は、
(a)宿主細胞ゲノムの1つまたはそれを超える標的部位(TS)において、相同組換えを介して組み換わることができる1つまたはそれを超える外来性ドナー核酸(ES);
(b)RNAガイドエンドヌクレアーゼ(RGEN)または該RGENをコードする核酸;
(c)該RGENによる該1つもしくはそれを超えるTSの部位特異的な認識および切断を可能にする1つもしくはそれを超えるリボ核酸、または該1つもしくはそれを超えるリボ核酸をコードする1つもしくはそれを超える核酸;および
(d)それ自体とのインビボでの相同組換えまたは該組成物中の1つもしくはそれを超えるさらなる組換え前の直鎖状核酸とのインビボでの相同組換えが可能な組換え前の直鎖状核酸であって、ここで、該インビボでの相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、組換え前の直鎖状核酸
を含む、組成物。 - 前記相同組換えによって、前記環状の染色体外核酸内に前記選択マーカーの完全なコード配列が形成される、請求項133に記載の組成物。
- 少なくとも1つの組換え前の直鎖状核酸が、前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼによるTSの部位特異的な認識および切断を可能にする前記1つまたはそれを超えるリボ核酸をコードする配列を含む、請求項133〜134のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1つまたはそれを超えるリボ核酸分子が、単一の連続したガイドRNA(gRNA)分子においてcrRNA活性およびtracrRNA活性を含む、請求項135に記載の組成物。
- 少なくとも1つの組換え前の直鎖状核酸が、前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼをコードする配列を含む、請求項133〜136のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼが、Cas9である、請求項133〜137のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物が、相同的に組み換わることにより前記環状の染色体外核酸を形成することができる、2つまたは3つの組換え前の直鎖状核酸を含む、請求項133〜138のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記1つまたはそれを超える組換え前の直鎖状核酸が、該1つまたはそれを超える組換え前の核酸を含む1つまたはそれを超える環状核酸のRGEN切断によってインビボにおいて生成される、請求項133〜139のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物が、
(a)前記宿主細胞ゲノムの複数(n個)の標的部位に組み込むことができる複数(n個)の外来性核酸であって、ここで、nは、少なくとも2であり、xは、1からnまで変動する整数であり、各整数xに対して、外来性核酸(ES)xの各々は、該宿主細胞ゲノムの該複数(n個)の標的部位から選択される標的部位(TS)xにおいて、相同組換えを介して組み換わることができる、外来性核酸;ならびに
(b)該標的部位(TS)xの各々に対して、前記RGENによる(TS)xの部位特異的な認識および切断を可能にするガイドRNA(gRNA)x
を含む、請求項133〜140のいずれか1項に記載の組成物。 - 前記選択マーカーが、薬物耐性マーカー、蛍光タンパク質、または比色法もしくは蛍光検出法によって検出可能なタンパク質である、請求項133〜141のいずれか1項に記載の組成物。
- ESが、目的の核酸Dをさらに含む、請求項133〜142のいずれか1項に記載の組成物。
- Dが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群より選択される、請求項143に記載の組成物。
- 請求項133〜144のいずれか1項に記載の組成物を含む、宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択される、請求項145に記載の宿主細胞。
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