JP2017219634A - レーザ走査型顕微鏡、レーザ走査型顕微鏡の制御方法、レーザ走査型顕微鏡の制御プログラム - Google Patents

レーザ走査型顕微鏡、レーザ走査型顕微鏡の制御方法、レーザ走査型顕微鏡の制御プログラム Download PDF

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Abstract

【課題】標本を配置する空間を犠牲にすることなく、且つ、広い倍率範囲で検出レンズを切り替えることなく、透過画像を取得する技術を提供する。【解決手段】レーザ走査型顕微鏡１００は、レーザ光を標本に照射する対物レンズ５と、標本を挟んで対物レンズ５と向かい合うように配置され、標本を透過したレーザ光を集光する検出レンズ７を備える。レーザ走査型顕微鏡１００は、さらに、検出レンズ７が標本の像を形成する像面ＩＰと検出レンズ７の最も標本側のレンズ面である第１面ＬＳ１との間に挿脱自在に配置される光学素子８と、光学素子８から像面ＩＰに向けて出射される検出光を検出する光検出器１２と、光学素子８と光検出器１２との間に配置されるリレー光学系１１を備える。光学素子８は、光学素子８に入射したレーザ光を拡散光に変換する、又は、光学素子８に入射したレーザ光の一部を偏向する。【選択図】図１

Description

本発明の開示は、レーザ走査型顕微鏡、レーザ走査型顕微鏡の制御方法、レーザ走査型顕微鏡の制御プログラムに関する。
従来から、生体標本を挟んで対物レンズと向かい合う検出レンズと、生体標本を透過し検出レンズで集光した光を検出する光検出器と、を備えるレーザ走査型顕微鏡頭が知られている（特許文献１参照）。
このようなレーザ走査型顕微鏡によれば、一回の生体標本の走査で、蛍光画像に加えて、生体標本内の細胞の形状を把握可能な透過画像を取得することが可能であり、透過画像に蛍光画像を重ねて表示することで、細胞内で生じる生命現象をより良く観察することができる。
特開２０１０−１０２２６４号公報
近年、顕微鏡には、細胞内での現象だけでなく細胞同士の相互作用を観察する能力が求められている。このため、レーザ走査型顕微鏡においても従来よりも広い倍率範囲、特に１０倍未満の極低倍を含む広い倍率範囲への対応が求められている。
レーザ走査型顕微鏡では、一般に、倍率の異なる対物レンズを切り替えて使用することで広い倍率範囲で蛍光画像を取得することが可能である。また、対物レンズの倍率に応じて検出レンズを切り替えることで、透過画像についても広い倍率範囲で取得することができる。
その一方で、ユーザの作業負担、コスト等を勘案すると、透過画像の取得に関しては、切り替えることなく広い倍率範囲で同じ検出レンズが使用されることが望ましい。このため、検出レンズでの軸外光のケラレを抑制するため比較的大きなレンズ径を有する検出レンズを広い倍率範囲で使用するレーザ走査型顕微鏡、検出レンズの物体側に挿脱自在な補助レンズを有するレーザ走査型顕微鏡などが提案されている。
しかしながら、検出レンズを極低倍での観察にまで対応させようとするとそのレンズ径は非常に大きくなってしまう。また、検出レンズのレンズ径を大きくしても、検出レンズよりも光検出器側で発生するケラレの抑制には限界がある。このため、検出レンズのレンズ径を大きくするだけでは従来よりも倍率範囲をより低倍にまで広げることは難しい。また、検出レンズの物体側に補助レンズを挿脱する構成では、補助レンズを挿入する空間が必要となる。このため、生体標本を配置するための空間が狭くなり、その結果、生体標本の大きさが制限されてしまう。また、ステージ上で行われる種々の作業の効率も低下してしまう。
以上の実情を踏まえ、本発明の一側面は、標本を配置する空間を犠牲にすることなく、且つ、検出レンズを切り替えることなく、広い倍率範囲で透過画像を取得する技術を提供することを目的とする。
本発明の一側面に係るレーザ走査型顕微鏡は、レーザ光を標本に照射する対物レンズと、前記標本を挟んで前記対物レンズと向かい合うように配置される、前記標本を透過した前記レーザ光を集光する検出レンズと、前記検出レンズが前記標本の像を形成する像面と前記検出レンズの最も前記標本側のレンズ面である第１面との間に挿脱自在に配置される光学素子であって、当該光学素子に入射した前記レーザ光を拡散光に変換する、又は、当該光学素子に入射した前記レーザ光の一部を偏向する光学素子と、前記像面と前記第１面との間に配置された前記光学素子から前記像面に向けて出射される検出光を検出する光検出器と、を備える。
本発明の別の一側面に係るレーザ走査型顕微鏡は、標本を透過したレーザ光を集光するコンデンサレンズと、前記コンデンサレンズが前記標本の像を形成する像面と前記コンデンサレンズの最も前記標本側のレンズ面である第１面との間に挿脱自在に配置される光学素子であって、当該光学素子に入射した前記レーザ光を拡散光に変換する、又は、当該光学素子に入射した前記レーザ光の一部を偏向する光学素子と、前記像面と前記第１面との間に配置された前記光学素子から前記像面に向けて出射される検出光を検出する光検出器と、を備える。
本発明の更に別の一側面に係るレーザ走査型顕微鏡の制御方法は、レーザ光を標本に照射する対物レンズの倍率に応じて、前記標本を挟んで前記対物レンズと向かい合うように配置された検出レンズが前記標本の像を形成する像面と前記検出レンズの最も前記標本側のレンズ面である第１面との間への、前記レーザ光を拡散光に変換する、又は、前記レーザ光の一部を偏向する光学素子の挿脱を制御し、前記光学素子の挿脱に応じて、前記光学素子から前記像面に向けて出射された検出光を検出する光検出器の増倍係数、又は、前記レーザ光を出射するレーザ光源の出力の少なくとも一方を制御する。
本発明の更に別の一側面に係るレーザ走査型顕微鏡の制御プログラムは、コンピュータに、レーザ光を標本に照射する対物レンズの倍率に応じて、前記標本を挟んで前記対物レンズと向かい合うように配置された検出レンズが前記標本の像を形成する像面と前記検出レンズの最も前記標本側のレンズ面である第１面との間への、前記レーザ光を拡散光に変換する、又は、前記レーザ光の一部を偏向する光学素子の挿脱を制御する処理と、前記光学素子の挿脱に応じて、前記光学素子から前記像面に向けて出射された検出光を検出する光検出器の増倍係数、又は、前記レーザ光を出射するレーザ光源の出力の少なくとも一方を制御する処理と、を実行させる。
本発明の一側面によれば、標本を配置する空間を犠牲にすることなく、且つ、検出レンズを切り替えることなく、広い倍率範囲で透過画像を取得することができる。
第１の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１００の構成を例示した図である。 光学素子８の作用を説明するための図である。 第２の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡２００の構成を例示した図である。 制御装置１４のハードウェアの構成を例示した図である。 第２の実施形態に係る制御処理の手順を示すフローチャートである。 第３の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡３００の構成を例示した図である。 第３の実施形態に係る制御処理の手順を示すフローチャートである。 第４の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡４００の構成を例示した図である。 光学素子２６の作用を説明するための図である。 光学素子２７を例示した図である。 光学素子２８を例示した図である。 遮光部材２９を例示した図である。 遮光部材３０を例示した図である。 遮光部材３１を例示した図である。 第５の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡５００の構成を例示した図である。 第５の実施形態に係る制御処理の手順を示すフローチャートである。 第６の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡６００の構成を例示した図である。 第６の実施形態に係る制御処理の手順を示すフローチャートである。 偏射照明された標本の画像３４を例示した図である。 遮光部材２９を例示した図であり、図１２とは開口部２９ａの位置を変更した様子を示した図である。 偏射照明された標本の別の画像３５を例示した図である。 図１９の画像３４と図２１の画像３５から生成した新たな画像３６を例示した図である。 遮光部材３７を例示した図である。 第７の実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡７００の構成を例示した図である。 第７の実施形態に係る制御処理の手順を示すフローチャートである。
［第１の実施形態］
図１は、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１００の構成を例示した図である。図２は、レーザ走査型顕微鏡１００に含まれる光学素子８の作用を説明するための図である。以下、レーザ走査型顕微鏡１００で生体標本を観察する場合を例にして、本実施形態について説明する。
レーザ走査型顕微鏡１００は、レーザ光を出射するレーザ１を備え、さらに、レーザ１からステージ６に至る照明光路上に、スキャナ２と、リレー光学系３と、ミラー４と、対物レンズ５を備える。
レーザ１は、標本を励起するレーザ光を出射するレーザ光源である。スキャナ２は、レーザ光を偏向する方向を変更することで、ステージ６に配置された標本を対物レンズ５の光軸と直交する方向に走査する２次元スキャナである。スキャナ２は、例えば、レゾナントスキャナとガルバノミラーを含む。リレー光学系３は、対物レンズ５の瞳位置又はその近傍にスキャナ２の像を投影する光学系である。対物レンズ５は、無限遠補正型の対物レンズであり、レーザ光をステージ６に配置された標本に照射する。レーザ走査型顕微鏡１００では、図示しないレボルバなどを用いて様々な倍率の対物レンズを切り替えて使用することができる。
レーザ走査型顕微鏡１００は、透過検出用の光検出器１２を備え、さらに、ステージ６から光検出器１２へ至る光路上に、検出レンズ７と、光学素子８と、視野絞り９と、ミラー１０と、リレー光学系１１を備える。
なお、上述したミラー４、ミラー１０は、ともにダイクロイックミラーであってもよく、又は、ハーフミラーであってもよい。このとき、ミラー４、ミラー１０の対物レンズ５の光軸方向に沿った透過光路上には、それぞれ他の検出光学系、照明光学系を配置することができる。
検出レンズ７は、標本を透過したレーザ光を集光するレンズであり、ステージ６（又はステージ６に配置される標本）を挟んで対物レンズ５と向かい合うように配置される。光学素子８は、光学素子８に入射したレーザ光を拡散光に変換する光拡散素子であり、ここでは、光拡散板である。光学素子８は、検出レンズ７が標本の像を形成する像面ＩＰと検出レンズ７の最も標本側のレンズ面である第１面ＬＳ１との間に挿脱自在に配置される。
視野絞り９は、標本面（ステージ６の表面）と光学的に共役な像面ＩＰに設けられている。リレー光学系１１は、検出レンズ７の射出瞳を光検出器１２へ投影するリレー光学系であり、像面ＩＰと第１面ＬＳ１の間に配置された光学素子８と、光検出器１２との間に配置される。光検出器１２は、検出したレーザ光の強度に応じた信号を出力する光検出器であり、例えば、光電子増倍管（PMT：Photomultiplier Tube）である。
以上のように構成されたレーザ走査型顕微鏡１００では、スキャナ２がレーザ光を偏向する方向によってレーザ光が標本に照射される位置が変化するが、標本を透過したレーザ光は、光路上でケラレが生じない限り、照射位置によらず光検出器１２に入射する。このため、レーザ光の照射位置毎に光検出器１２から出力された信号に基づいて輝度データを取得し、それらを照射位置に基づいて二次元にマッピングすることで、標本の走査画像を得ることができる。この走査画像は、標本を透過した光を検出して得る画像であるので透過画像ともいう。
ところで、レーザ走査型顕微鏡１００では、検出レンズ７で集光されたレーザ光は、検出レンズ７の射出瞳位置を通過後、射出瞳位置から離れるほど光軸から離れる。照明範囲（視野）が広い低倍の対物レンズを使用するほど、標本上の光軸から離れた位置からのレーザ光が射出瞳位置を急な角度で通過するのでその傾向が顕著になる。このため、使用する対物レンズの倍率が低くなる（例えば、ある倍率以下になる）と、検出レンズ７の後段に位置する構成（例えば、視野絞り９、リレー光学系１１）でケラレが発生し、透過画像が視野の周辺部分の暗い画像になりやすい。
そこで、レーザ走査型顕微鏡１００では、利用者が状況に応じて、光学素子８を第１面ＬＳ１と像面ＩＰの間に挿脱する。典型的には、使用する対物レンズの倍率が低いときには、光学素子８を光路中に配置する。また、透過画像の視野周辺が暗いときに、光学素子８を光路中に配置してもよい。
これにより、図２に示すように、光学素子８が光路中に挿入されていなければ視野絞り９で遮光されてしまう視野の周辺部分からの光Ｌ１が、光学素子８で拡散光Ｌ２に変換されて、その一部が視野絞り９を通過する。このため、周辺光量不足を抑制することができる。一方で、使用する対物レンズの倍率が高いときには、光学素子８を光路外に配置する。これにより、光学素子８での不要な拡散による検出光量の低下を防止することができる。
従って、レーザ走査型顕微鏡１００によれば、光学素子８を必要に応じて光路に対して挿脱することで、検出レンズを切り替えることなく広い倍率範囲で透過画像を取得することができる。特に光学素子８が第１面ＬＳ１と像面ＩＰの間に挿脱されることで、標本を配置する空間を犠牲にすることなく、広い倍率範囲で透過画像を取得することができる。
図１では図示されていないが、レーザ走査型顕微鏡１００は、レーザ光の照射により標本から対物レンズ５へ向けて放射される蛍光を検出するための光学系と光検出器とを備えてもよい。この場合、ミラー４には、例えば、ダイクロイックミラーが使用される。これにより、レーザ走査型顕微鏡１００は、一回の走査で透過画像に加えて蛍光画像を取得することができる。
また、図１では図示されていないが、レーザ走査型顕微鏡１００は、検出レンズ７側から標本を照明する照明ユニットを備えても良い。その場合、検出レンズ７は、コンデンサレンズであってもよく、視野絞り９は照明範囲を制限するために使用される。また、ミラー１０には、例えば、ハーフミラーが使用される。
以上では、光検出器１２がレーザ光を検出する例を示したが、光検出器１２で検出する光はレーザ光に限らない。光学素子８は、光学素子８に入射したレーザ光を拡散光に変換する光拡散素子であればよい。このため、例えば、レーザ光の入射により蛍光を放射する蛍光板であってもよく、また、レーザ光の入射によりレーザ光よりも短波長の光を放射するアップコンバージョン発光素子であってもよい。即ち、光学素子８は、レーザ光を異なる波長の光に変換して放射する光学素子であってもよく、光検出器１２は、光学素子８から像面ＩＰに向けて出射される光（以降、検出光）を検出してもよい。検出光は、レーザ光であっても、レーザ光よりも長い波長の光であっても短い波長の光であってもよい。
［第２の実施形態］
図３は、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡２００の構成を例示した図である。レーザ走査型顕微鏡２００は、光学素子８を光路に対して挿脱するターレット１３と、レーザ１、光検出器１２及びターレット１３に接続された制御装置１４と、を備える点がレーザ走査型顕微鏡１００とは異なる。その他の点は、レーザ走査型顕微鏡１００と同様である。なお、ターレット１３は、制御装置１４からの指示に従って回転駆動する電動ターレットである。制御装置１４は、光学素子８の光路に対する挿脱に応じて、光検出器１２の増倍係数又はレーザ１の出力の少なくとも一方を制御するように構成されている。また、制御装置１４は、光学素子８の光路に対する挿脱を制御するように構成されている。
なお、図３では、光学素子８を光路に対して挿脱する機構としてターレット１３を例示したが、光学素子８を光路に対して挿脱する機構は特に限定されず、任意の機構が採用し得る。例えば、ターレット１３の代わりに、スライド方式で光学素子８を挿脱する駆動機構が採用されてもよい。
図４は、制御装置１４のハードウェアの構成を例示した図である。制御装置１４は、例えば、標準的なコンピュータであり、プロセッサ１５、メモリ１６、入出力インターフェース１７、ストレージ１８、及び、可搬記録媒体２０が挿入される可搬記録媒体駆動装置１９を備え、これらがバス２１によって相互に接続されている。なお、図４は、制御装置１４のハードウェア構成の一例であり、制御装置１４はこの構成に限定されるものではない。
プロセッサ１５は、例えば、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、ＭＰＵ（Micro Processing Unit）、ＤＳＰ（Digital Signal Processor）などであり、プログラムを実行してプログラムされた処理を行う。メモリ１６は、例えば、ＲＡＭ（Random Access Memory）であり、プログラムの実行の際に、ストレージ１８または可搬記録媒体２０に記録されているプログラムまたはデータを一時的に記憶する。
入出力インターフェース１７は、制御装置１４以外の装置（例えば、レーザ１、光検出器１２、ターレット１３など）と信号をやり取りする回路である。ストレージ１８は、例えば、ハードディスク、フラッシュメモリであり、主に各種データやプログラムの記録に用いられる。可搬記録媒体駆動装置１９は、光ディスクやコンパクトフラッシュ（登録商標）等の可搬記録媒体２０を収容するものである。可搬記録媒体２０は、ストレージ１８を補助する役割を有する。
図５は、本実施形態に係る制御処理の手順を示すフローチャートである。以下、図５を参照しながら、制御装置１４がプログラムを実行することで行われる制御処理について具体的に説明する。
まず、図示しない入力装置を用いて利用者が光学素子８の挿脱を指示すると、制御装置１４は、光学素子８の挿脱指示を受信する（ステップＳ１）。そして、受信した指示が光学素子８を光路へ挿入する指示であると判断すると（ステップＳ２、ＹＥＳ）、制御装置１４は、光学素子８を光路へ挿入する（ステップＳ３）。ここでは、制御装置１４は、光学素子８が光路上に位置するようにターレット１３の回転を制御する。なお、すでに光学素子８が光路上に位置する場合には、ステップＳ３及び後述するステップＳ５はスキップしてもよい。
一方、受信した指示が光学素子８を光路から取り除く指示であると判断すると（ステップＳ２、ＮＯ）、制御装置１４は、光学素子８を光路から取り除く（ステップＳ４）。ここでは、制御装置１４は、光学素子８が光路外に位置するようにターレット１３の回転を制御する。なお、すでに光学素子８が光路外に位置する場合には、ステップＳ４及び後述するステップＳ５はスキップしてもよい。
ステップＳ３又はステップＳ４の処理が終了すると、制御装置１４は、光検出器１２の増倍係数又はレーザ１の出力の少なくとも一方を変更し（ステップＳ５）、その後、透過画像を取得する（ステップＳ６）。
ステップＳ５の処理は、光学素子８を光路から取り除くことで透過画像が明るくなりすぎる、及び、光学素子８を光路へ挿入することで透過画像が暗くなりすぎる、といった事態を防止するために行われる。
具体的には、制御装置１４は、光学素子８が光路から取り除かれると、光検出器１２の増倍係数を小さくするか、レーザ１の出力を小さくするか、又は、その両方を行う。また、光学素子８が光路に挿入されると、光検出器１２の増倍係数を大きくするか、レーザ１の出力を大きくするか、又は、その両方を行う。望ましくは、制御装置１４は、光学素子８が光路から取り除かれている状態と挿入されている状態で取得される透過画像の明るさが同程度になるように、光検出器１２の増倍係数又はレーザ１の出力の少なくとも一方を制御し調整する。これにより、観察倍率によらず、およそ一定の明るさで標本の観察を行うことが可能となる。
さらに、ダメージを受けやすい生体標本を観察対象とするケースを想定すると、制御装置１４は、ノイズの影響が過度に生じない範囲において、レーザ１の出力の制御よりも光検出器１２の増倍係数の制御を優先して、透過画像の明るさを調整することが望ましい。特に、透過画像とともに蛍光画像も取得される場合には、蛍光画像の明るさの変動を抑えるため、レーザ１の出力の制御よりも光検出器１２の増倍係数の制御を優先することがさらに望ましい。
レーザ走査型顕微鏡２００によっても、レーザ走査型顕微鏡１００と同様に、光学素子８を第１面ＬＳ１と像面ＩＰの間に挿脱することで、広い倍率範囲で検出レンズを切り替えることなく透過画像を取得することができ、また、標本を配置する空間を犠牲にすることなく透過画像を取得することができる。さらに、レーザ走査型顕微鏡２００では、光学素子８の挿脱に応じて、透過画像の明るさが自動的に調整されるため、画像の明るさの大幅な変動を抑えることができる。
［第３の実施形態］
図６は、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡３００の構成を例示した図である。レーザ走査型顕微鏡３００は、対物レンズ５の代わりに、レボルバ２２に装着された複数の対物レンズ（対物レンズ５ａ、対物レンズ５ｂ）を備える点、レーザ１、光検出器１２、ターレット１３及びレボルバ２２に接続された制御装置２３と、を備える点がレーザ走査型顕微鏡２００とは異なる。その他の点は、レーザ走査型顕微鏡２００と同様である。なお、レボルバ２２は、制御装置２３からの指示に従って回転駆動することで、使用する対物レンズを切り替える電動レボルバである。制御装置２３は、使用する対物レンズの倍率に応じて光学素子８の光路に対する挿脱を制御し、且つ、光学素子８の光路に対する挿脱に応じて光検出器１２の増倍係数又はレーザ１の出力の少なくとも一方を制御する、ように構成されている。
図７は、本実施形態に係る制御処理の手順を示すフローチャートである。以下、図７を参照しながら、制御装置２３がプログラムを実行することで行われる制御処理について具体的に説明する。
まず、図示しない入力装置を用いて利用者が対物レンズの切り替えを指示すると、制御装置２３は、対物レンズの切り替え指示を受信して、指示に従って対物レンズを切り替える（ステップＳ１１）。ここでは、制御装置２３は、指示された対物レンズが光路上に位置するようにレボルバ２２の回転を制御する。次に、受信した指示が所定倍率以下の対物レンズへの切り替え指示である否かを判定する（ステップＳ１２）。
所定倍率以下の対物レンズへの切り替え指示であると判断すると（ステップＳ１２、ＹＥＳ）、制御装置２３は、さらに、光学素子８が光路に挿入されているか否かを判定する（ステップＳ１３）。
光学素子８が光路に挿入されていると判断すると（ステップＳ１３、ＹＥＳ）、制御装置２３は、透過画像を取得する（ステップＳ１８）。一方、光学素子８が光路に挿入されていないと判断すると（ステップＳ１３、ＮＯ）、制御装置２３は、光学素子８を光路に挿入し（ステップＳ１４）、さらに、光検出器１２の増倍係数又はレーザ１の出力の少なくとも一方を変更する（ステップＳ１７）。そして、その後に、透過画像を取得する（ステップＳ１８）。なお、ステップＳ１４及びステップＳ１７は、図５のステップＳ３及びステップＳ５と同様である。
所定倍率以下の対物レンズへの切り替え指示ではないと判断すると（ステップＳ１２、ＮＯ）、制御装置２３は、さらに、光学素子８が光路から取り除かれているか否かを判定する（ステップＳ１５）。
光学素子８が光路から取り除かれていると判断すると（ステップＳ１５、ＹＥＳ）、制御装置２３は、透過画像を取得する（ステップＳ１８）。一方、光学素子８が光路から取り除かれていないと判断すると（ステップＳ１５、ＮＯ）、制御装置２３は、光学素子８を光路から取り除き（ステップＳ１６）、さらに、光検出器１２の増倍係数又はレーザ１の出力の少なくとも一方を変更する（ステップＳ１７）。そして、その後に、透過画像を取得する（ステップＳ１８）。なお、ステップＳ１６及びステップＳ１７は、図５のステップＳ４及びステップＳ５と同様である。
レーザ走査型顕微鏡３００によっても、レーザ走査型顕微鏡１００と同様に、光学素子８を第１面ＬＳ１と像面ＩＰの間に挿脱することで、検出レンズを切り替えることなく広い倍率範囲で透過画像を取得することができ、また、標本を配置する空間を犠牲にすることなく広い倍率範囲で透過画像を取得することができる。また、レーザ走査型顕微鏡２００と同様に、光学素子８の挿脱に応じて、画像の明るさが自動的に調整されるため、透過画像の明るさの大幅な変動を抑えることができる。さらに、レーザ走査型顕微鏡３００では、対物レンズの切り替え指示に応じて光学素子８が自動的に挿脱される。このため、顕微鏡の利用者は、光学素子８を意識することなく、対物レンズの切り替え操作といった従来の操作を行うだけで必要に応じて光学素子８を挿脱し、上記の効果を得ることができる。
［第４の実施形態］
図８は、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡４００の構成を例示した図である。図９は、レーザ走査型顕微鏡４００に含まれる光学素子２６の作用を説明するための図である。レーザ走査型顕微鏡４００は、検出レンズ７の代わりに複数のレンズからなる光学系である検出レンズ２４を備える点、検出レンズ２４と光検出器１２の間に配置された遮光部材である開口絞り２５を備える点、光拡散素子である光学素子８の代わりに光学素子２６を備える点がレーザ走査型顕微鏡１００とは異なる。その他の点は、レーザ走査型顕微鏡１００と同様である。
開口絞り２５は、開口の大きさが可変な絞りであり、検出レンズ２４の射出瞳位置ＰＰまたはその近傍に設けられる。光学素子２６は、光学素子２６に入射したレーザ光の一部を偏向する光偏向素子であり、例えば、図９に示すようなアキシコンレンズの頂点付近が面取りされたレンズである。光学素子２６は、面取りされた面に入射する光Ｌ４はほとんど偏向することなく、円錐底面の中心からある程度逸れた位置に入射する光Ｌ５及び光Ｌ６を偏向するように構成されている。
レーザ走査型顕微鏡４００では、光学素子２６は、検出レンズ２４の射出瞳位置ＰＰから光軸方向に少し離れた位置に、即ち、検出レンズ２４の射出瞳位置ＰＰとは異なる位置に、検出レンズ２４の光軸が光学素子２６の円錐底面の中心を通るように配置される。このように配置することで、軸上光の偏向を極力抑えながら、視野絞り９又はリレー光学系１１などでケラレやすい軸外光を偏向することができる。なお、光検出器１２よりも手前に瞳がリレーされる構成の場合には、光学素子２６は、射出瞳位置ＰＰと光学的に共役な位置とも異なる位置に配置される。
レーザ走査型顕微鏡４００によっても、レーザ走査型顕微鏡１００と同様に、検出レンズを切り替えることなく広い倍率範囲で透過画像を取得することができ、また、標本を配置する空間を犠牲にすることなく広い倍率範囲で透過画像を取得することができる。また、レーザ走査型顕微鏡４００では、開口絞り２５の開口の大きさを調整することで、透過画像のコントラストを調整することができる。このため、例えば、波長が長いため標本で散乱が起こりにくい赤外域のレーザ光を用いた場合であっても、開口絞り２５を調整して良好な透過画像を取得することができる。
本実施形態では、レーザ走査型顕微鏡４００が光学素子２６を備える例を示したが、レーザ走査型顕微鏡４００は、レーザ光の一部を偏向する光偏向素子を備えればよい。このため、レーザ走査型顕微鏡４００は、光学素子２６の代わりに、図１０に示す光学素子２７、又は、図１１に示す光学素子２８を備えてもよい。光学素子２７は、フレネルレンズの中心部分の曲面を平面に置き換えたものである。光学素子２８は、同心円状のパターンが中心部分を除いて形成された回折格子である。レーザ走査型顕微鏡４００は、光学素子２６の代わりにこれらの光学素子を備える場合であっても、上述した効果を得ることができる。
本実施形態では、レーザ走査型顕微鏡４００が開口絞り２５を備える例を示したが、レーザ走査型顕微鏡４００は、開口を有し、入射光束を部分的に遮光する遮光部材を検出レンズ２４と光検出器１２の間に備えればよい。このため、開口絞り２５の代わりに、図１２に示す遮光部材２９、図１３に示す遮光部材３０、又は、図１４に示す遮光部材３１を射出瞳位置ＰＰ又はその近傍に備えても良い。遮光部材２９は、遮光部２９ａと開口部２９ｂを有する偏射照明用の絞りである。遮光部材３０は、偏心開口を有する絞りであり、遮光部３０ａと光軸上から偏心した位置に形成された開口部３０ｂを有する。遮光部材３１は、遮光部３１ａとリング状のスリットである開口部３１ｂを有する。レーザ走査型顕微鏡４００は、開口絞り２５の代わりにこれらの遮光部材を備える場合であっても、上述した効果を得ることができる。
また、レーザ走査型顕微鏡４００が射出瞳位置ＰＰ近傍にターレットを有する場合には、光学素子２６は、射出瞳位置ＰＰ近傍に設けられたターレットに装着されて、光路に対して挿脱されてもよい。
また、像面ＩＰと第１面ＬＳ１との間に挿脱自在に配置される光学素子がレーザ光の一部を偏向する光偏向素子である例を示したが、挿脱自在に配置される光学素子は、光拡散板、蛍光板などの、レーザ光を拡散光に変換する光拡散素子であってもよい。また、光拡散素子は、上述した遮光部材（開口絞り２５、遮光部材２９、遮光部材３０、遮光部材３１）と一体に構成されていてもよい。即ち、光拡散素子と上述した遮光部材からなる新たな部材は、光拡散素子で構成された開口を有する遮光部材として機能しても良い。この場合、新たな部材は、像面ＩＰと第１面ＬＳ１との間に挿脱自在に配置されることが望ましい。
［第５の実施形態］
図１５は、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡５００の構成を例示した図である。レーザ走査型顕微鏡５００は、光学素子２６を光路に対して挿脱するターレット１３と、レーザ１、光検出器１２、ターレット１３及び開口絞り２５に接続された制御装置３２と、を備える点がレーザ走査型顕微鏡４００とは異なる。その他の点は、レーザ走査型顕微鏡４００と同様である。なお、ターレット１３は、制御装置３２からの指示に従って回転駆動する電動ターレットである。制御装置３２は、光学素子２６の光路に対する挿脱に応じて、光検出器１２の増倍係数又はレーザ１の出力の少なくとも一方を制御するように構成されている。制御装置３２は、さらに、光検出器１２からの出力に基づいて生成される標本の走査画像（透過画像）のコントラストに応じて、開口絞り２５の開口の大きさを制御するように構成されている。
図１６は、本実施形態に係る制御処理の手順を示すフローチャートである。以下、図１６を参照しながら、制御装置３２がプログラムを実行することで行われる制御処理について具体的に説明する。
ステップＳ３１からステップＳ３６は、図５のステップＳ１からステップＳ６と同様である。ステップＳ３６で透過画像が取得されると、制御装置３２は、透過画像のコントラストを算出する（ステップＳ３７）。コントラストは任意の既知の方法で算出される。
その後、制御装置３２は、算出した透過画像のコントラストが所定値以上である否かを判定し（ステップＳ３８）、所定値未満であると判断すると、開口絞り２５を絞って（ステップＳ３９）、ステップＳ３６へ戻る。ステップＳ３９では、制御装置３２は、開口絞り２５の開口の大きさが小さくなるように開口絞り２５を制御する。
以降、透過画像のコントラストが所定値以上になるまで、ステップＳ３６からステップＳ３９を繰り返し、所定値以上になると制御処理を終了する。
レーザ走査型顕微鏡５００によっても、レーザ走査型顕微鏡１００と同様に、検出レンズを切り替えることなく広い倍率範囲で透過画像を取得することができ、標本を配置する空間を犠牲にすることなく広い倍率範囲で透過画像を取得することができる。また、レーザ走査型顕微鏡５００では、レーザ走査型顕微鏡２００と同様に、光学素子２６の挿脱に応じて、画像の明るさが自動的に調整されるため、透過画像の明るさの大幅な変動を抑えることができる。また、レーザ走査型顕微鏡５００では、開口絞り２５の開口の大きさを調整することで、透過画像のコントラストを調整することができる。このため、例えば、波長が長く標本で散乱が起こりにくい赤外域のレーザ光を用いた場合であっても、開口絞り２５を調整して良好な透過画像を取得することができる。さらに、レーザ走査型顕微鏡５００では、取得した透過画像のコントラストに基づいて自動的に開口絞り２５が制御されるため、顕微鏡の利用者は、容易にコントラストの高い画像を得ることができる。
［第６の実施形態］
図１７は、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡６００の構成を例示した図である。レーザ走査型顕微鏡６００は、開口絞り２５の代わりに偏射照明用の遮光部材２９を備える点、制御装置３２の代わりにレーザ１、光検出器１２、ターレット１３及び遮光部材２９に接続された制御装置３３を備える点がレーザ走査型顕微鏡５００とは異なる。その他の点は、レーザ走査型顕微鏡５００と同様である。なお、制御装置３３は、光学素子２６の光路に対する挿脱に応じて、光検出器１２の増倍係数又はレーザ１の出力の少なくとも一方を制御するように構成されている。また、制御装置３３は、開口の位置が移動するように、遮光部材２９を回転制御するように構成されている。さらに、制御装置３３は、画像処理装置としても機能する。具体的には、遮光部材２９の開口の位置が異なる複数の状態で取得された複数の走査画像（透過画像）から、標本の新たな画像を生成する。
図１８は、本実施形態に係る制御処理の手順を示すフローチャートである。以下、図１８を参照しながら、制御装置３３がプログラムを実行することで行われる制御処理について具体的に説明する。
ステップＳ４１からステップＳ４６は、図５のステップＳ１からステップＳ６と同様である。図１９は、ステップＳ４６で取得された透過画像３４を示している。透過画像３４では画像中の構造物の左側に影ができているが、これは、遮光部材２９が初期状態では図１２に示すように配置されていて、右側から光が標本に入射しているためである。
ステップＳ４６で透過画像が取得されると、制御装置３３は、照明方向を切り替える（ステップＳ４７）。ここでは、制御装置３３は、遮光部材２９が１８０度回転し、開口部２９ｂが回転前後で光軸に対して対称な位置に配置されるように制御する。図２０は、回転後の遮光部材２９を示している。
その後、制御装置３３は、再び透過画像を取得する（ステップＳ４８）。図２１は、ステップＳ４８で取得された透過画像３５を示している。透過画像３５では透過画像３４とは異なり、画像中の構造物の右側に影ができているが、これは、遮光部材２９が図２０に示すように配置されていて、左側から光が標本に入射しているためである。
最後に、制御装置３３は、開口部２９ｂの位置が異なる複数の状態で取得された複数の走査画像から標本の新たな透過画像を生成する（ステップＳ４９）。ここでは、例えば、２枚の画像の差分をとる等の演算処理等が行われて、コントラストが強調された画像が生成される。図２２は、ステップＳ４９で生成された画像３６を示している。
レーザ走査型顕微鏡６００によっても、レーザ走査型顕微鏡１００と同様に、検出レンズを切り替えることなく広い倍率範囲で透過画像を取得することができ、標本を配置する空間を犠牲にすることなく広い倍率範囲で透過画像を取得することができる。また、レーザ走査型顕微鏡６００では、レーザ走査型顕微鏡２００と同様に、光学素子２６の挿脱に応じて画像の明るさが自動的に調整されるため、透過画像の明るさの大幅な変動を抑えることができる。さらに、レーザ走査型顕微鏡６００では、画像処理によりコントラストが強調された画像が得ることができる。
本実施形態では、レーザ走査型顕微鏡６００が遮光部材２９を備える例を示したが、レーザ走査型顕微鏡６００は、遮光部材２９の代わりに、遮光部３７ａと開口部３７ｂを有する、図２３に示す遮光部材３７を備えてもよい。この場合、制御装置３３は、図２３（ａ）から（ｃ）に示すように、遮光部材３７を１２０度ずつ回転させて、それぞれの状態で透過画像を取得し、取得した３枚の透過画像からコントラストが強調された新たな透過画像を生成しても良い。
［第７の実施形態］
図２４は、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡７００の構成を例示した図である。レーザ走査型顕微鏡７００は、ステージ６の代わりにステージ３９を備える点、制御装置１４の代わりにレーザ１、光検出器１２、ターレット１３及びステージ３９に接続された制御装置３８を備える点がレーザ走査型顕微鏡２００とは異なる。その他の点は、レーザ走査型顕微鏡２００と同様である。なお、ステージ３９は、制御装置３８からの指示に従って少なくとも対物レンズ５の光軸方向に移動する電動ステージである。制御装置３８は、光学素子８の光路に対する挿脱に応じて、光検出器１２の増倍係数又はレーザ１の出力の少なくとも一方を制御するように構成されている。また、制御装置３８は、検出レンズ７の焦点位置がステージ３９の前後へ移動するように、ステージ３９の光軸方向への移動を制御する。さらに、制御装置３８は、画像処理装置としても機能する。具体的には、検出レンズ７の焦点位置がステージ３９よりも前側にある状態（いわゆる前ピン状態）と検出レンズ７の焦点位置がステージ３９よりも後側にある状態（いわゆる後ピン状態）の各々で取得した複数の走査画像（透過画像）から、標本の新たな透過画像を生成する。
図２５は、本実施形態に係る制御処理の手順を示すフローチャートである。以下、図２５を参照しながら、制御装置３８がプログラムを実行することで行われる制御処理について具体的に説明する。
ステップＳ５１からステップＳ５５は、図５のステップＳ１からステップＳ５と同様である。ステップＳ５５で光検出器の増倍係数又はレーザ光源の出力の少なくとも一方が変更されると、制御装置３８は、ステージ３９を前ピン位置に移動し（ステップＳ５６）、前ピン状態で透過画像を取得する（ステップＳ５７）。その後、制御装置３８は、ステージ３９を後ピン位置に移動し（ステップＳ５８）、後ピン状態で透過画像を取得する（ステップＳ５９）。
最後に、制御装置３８は、前ピン状態と後ピン状態で取得された２枚の透過画像から、コントラストが強調された標本の新たな画像を生成し（ステップＳ６０）、制御処理を終了する。
レーザ走査型顕微鏡７００によっても、レーザ走査型顕微鏡１００と同様に、検出レンズを切り替えることなく広い倍率範囲で透過画像を取得することができ、標本を配置する空間を犠牲にすることなく広い倍率範囲で透過画像を取得することができる。また、レーザ走査型顕微鏡７００では、レーザ走査型顕微鏡２００と同様に、光学素子８の挿脱に応じて、画像の明るさが自動的に調整されるため、透過画像の明るさの大幅な変動を抑えることができる。また、レーザ走査型顕微鏡７００では、レーザ走査型顕微鏡６００と同様に、画像処理によりコントラストが強調された画像が得ることができる。
上述した実施形態は、発明の理解を容易にするための具体例を示したものであり、本発明の実施形態はこれらに限定されるものではない。レーザ走査型顕微鏡、その制御方法及びプログラムは、特許請求の範囲に記載された発明を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。
１・・・レーザ、２・・・スキャナ、３・・・リレー光学系、４、１０・・・ミラー、５、５ａ、５ｂ・・・対物レンズ、６、３９・・・ステージ、７、２４・・・検出レンズ、８、２６、２７、２８・・・光学素子、９・・・視野絞り、１１・・・リレー光学系、１２・・・光検出器、１３・・・ターレット、１４、２３、３２、３３、３８・・・制御装置、１５・・・プロセッサ、１６・・・メモリ、１７・・・入出力Ｉ／Ｆ、１８・・・ストレージ、１９・・・可搬記録媒体駆動装置、２０・・・可搬記録媒体、２１・・・バス、２２・・・レボルバ、２５・・・開口絞り、２９、３０、３１、３７・・・遮光部材、２９ａ、３０ａ、３１ａ、３７ａ・・・遮光部、２９ｂ、３０ｂ、３１ｂ、３７ｂ・・・開口部、３４、３５、３６・・・画像、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００・・・レーザ走査型顕微鏡

Claims (15)

  1. レーザ光を標本に照射する対物レンズと、
    前記標本を挟んで前記対物レンズと向かい合うように配置される、前記標本を透過した前記レーザ光を集光する検出レンズと、
    前記検出レンズが前記標本の像を形成する像面と前記検出レンズの最も前記標本側のレンズ面である第１面との間に挿脱自在に配置される光学素子であって、当該光学素子に入射した前記レーザ光を拡散光に変換する、又は、当該光学素子に入射した前記レーザ光の一部を偏向する光学素子と、
    前記像面と前記第１面との間に配置された前記光学素子から前記像面に向けて出射される検出光を検出する光検出器と、を備える
    ことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
  2. 請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡において、さらに、
    前記レーザ光を出射するレーザ光源と、
    前記光学素子の前記光路に対する挿脱に応じて、前記光検出器の増倍係数又は前記レーザ光源の出力の少なくとも一方を制御する制御装置と、を備える
    ことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
  3. 請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡において、
    前記制御装置は、前記光学素子の前記光路に対する挿脱を制御する
    ことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
  4. 請求項２又は請求項３に記載のレーザ走査型顕微鏡において、
    前記制御装置は、前記対物レンズの倍率に応じて前記光学素子の前記光路に対する挿脱を制御する
    ことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
  5. 請求項２乃至請求項４のいずれか１項に記載のレーザ走査型顕微鏡において、さらに、
    前記検出レンズと前記光検出器の間に配置された遮光部材であって、開口を有し、入射光束を部分的に遮光する遮光部材を備える
    ことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
  6. 請求項５に記載のレーザ走査型顕微鏡において、
    前記遮光部材は、前記開口の大きさが可変な開口絞りであり、
    前記制御装置は、前記光検出器からの出力に基づいて生成される前記標本の走査画像のコントラストに応じて、前記開口絞りの開口の大きさを制御する
    ことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
  7. 請求項５に記載のレーザ走査型顕微鏡において、
    前記制御装置は、前記光検出器からの出力に基づいて生成された前記標本の複数の走査画像であって、各々が前記遮光部材の開口の位置が異なる複数の状態で生成された複数の走査画像から、前記標本の新たな画像を生成する
    ことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
  8. 請求項２乃至請求項５のいずれか１項に記載のレーザ走査型顕微鏡において、
    前記制御装置は、前記検出レンズの焦点面が標本面よりも前記検出レンズ側にある状態で前記光検出器からの出力に基づいて生成された前記標本の第１の走査画像と、前記検出レンズの焦点面が前記標本面よりも前記対物レンズ側にある状態で前記光検出器からの出力に基づいて生成された前記標本の第２の走査画像と、を含む複数の走査画像から、前記標本の新たな画像を生成する
    ことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
  9. 請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載のレーザ走査型顕微鏡において、
    前記光学素子は、前記光学素子に入射した前記レーザ光を拡散光に変換する光拡散素子である
    ことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
  10. 請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載のレーザ走査型顕微鏡において、
    前記光学素子は、
    前記光学素子に入射した前記レーザ光の一部を偏向する光偏向素子であり、
    前記検出レンズの瞳位置及び瞳共役位置とは異なる位置に挿脱自在に配置される
    ことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
  11. 請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載のレーザ走査型顕微鏡において、さらに、
    前記レーザ光で標本を走査するためのスキャナを備える
    ことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
  12. 請求項１乃至請求項１１のいずれか１項に記載のレーザ走査型顕微鏡において、さらに、
    前記像面と前記第１面との間に配置された前記光学素子と前記光検出器との間に配置されるリレー光学系を備える
    ことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
  13. 標本を透過したレーザ光を集光するコンデンサレンズと、
    前記コンデンサレンズが前記標本の像を形成する像面と前記コンデンサレンズの最も前記標本側のレンズ面である第１面との間に挿脱自在に配置される光学素子であって、当該光学素子に入射した前記レーザ光を拡散光に変換する、又は、当該光学素子に入射した前記レーザ光の一部を偏向する光学素子と、
    前記像面と前記第１面との間に配置された前記光学素子から前記像面に向けて出射される検出光を検出する光検出器と、を備える
    ことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
  14. レーザ光を標本に照射する対物レンズの倍率に応じて、前記標本を挟んで前記対物レンズと向かい合うように配置された検出レンズが前記標本の像を形成する像面と前記検出レンズの最も前記標本側のレンズ面である第１面との間への、前記レーザ光を拡散光に変換する、又は、前記レーザ光の一部を偏向する光学素子の挿脱を制御し、
    前記光学素子の挿脱に応じて、前記光学素子から前記像面に向けて出射された検出光を検出する光検出器の増倍係数、又は、前記レーザ光を出射するレーザ光源の出力の少なくとも一方を制御する
    ことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡の制御方法。
  15. コンピュータに、
    レーザ光を標本に照射する対物レンズの倍率に応じて、前記標本を挟んで前記対物レンズと向かい合うように配置された検出レンズが前記標本の像を形成する像面と前記検出レンズの最も前記標本側のレンズ面である第１面との間への、前記レーザ光を拡散光に変換する、又は、前記レーザ光の一部を偏向する光学素子の挿脱を制御する処理と、
    前記光学素子の挿脱に応じて、前記光学素子から前記像面に向けて出射された検出光を検出する光検出器の増倍係数、又は、前記レーザ光を出射するレーザ光源の出力の少なくとも一方を制御する処理と、を実行させる
    ことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡の制御プログラム。
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