JP2017131214A - メディトープおよびメディトープ結合性抗体ならびにそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離されたメディトープ利用可能抗体又はそのフラグメントであって、VL領域が、Kabatナンバリングに従うと40位にトレオニン、セリン又はアスパルタート、41位にグリシン以外の残基及び85位にアスパルタート又はアスパラギンを含むアミノ酸配列を有し、抗体又はフラグメントが、セツキシマブが特異的に結合するEGFRのエピトープに特異的に結合せず、かつ抗体又はフラグメントが、特定のアミノ酸配列を有するペプチド、又はそれに由来する環式ペプチドであるメディトープに結合する、単離されたメディトープ利用可能抗体又はそのフラグメント。
【選択図】なし
Description
本出願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる2012年2月10日出願の米国特許仮出願第61/597,708号;2011年10月10日出願の米国特許出願公開第13/270,207号;および2011年10月10日出願の国際出願PCT/US2011/055656号に基づく利益を主張するものである。
提供する実施形態には、抗体、化合物、ならびに抗体と共に使用するためのペプチドおよび他の分子を包含する組成物、さらにはそれらを生産するための方法および使用、さらには化合物、組成物、複合体、混合物、およびシステム、例えば、それらを含有するキットがある。一部の態様では、提供する実施形態は、利用可能な抗体および関連化合物、組成物、方法および使用と比較して、有効性、相乗作用、特異性、および/または安全性の改善をもたらす。
チドに由来する環式ペプチドであるメディトープに結合する。
またはVH領域は、Kabatナンバリングに従うと40位にアスパラギンもしくはアラニン、および/または89位にバリンを含有しない。
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12(式I)
[式中、
X1=Cys、Gly、β−アラニン、2,3−ジアミノプロピオン酸、β−アジドアラニン、または存在しない;
X2=Glnまたは存在しない;
X3=Phe、Tyr、β−β’−ジフェニル−Ala、His、Asp、2−ブロモ−L−フェニルアラニン、3−ブロモ−L−フェニルアラニンもしくは4−ブロモ−L−フェニルアラニン、Asn、Gln、修飾Phe、水和性カルボニル含有残基;またはボロン酸含有残基;
X4=AspまたはAsn;
X5=Leu;β−β’−ジフェニル−Ala;Phe;フェニルアラニン、トリプトファン、もしくはチロシンの非天然類似体;水和性カルボニル含有残基;またはボロン酸含有残基;
X6=SerまたはCys;
X7=ThrまたはSerまたはCys;
X8=Arg、修飾Arg、または水和性カルボニルもしくはボロン酸含有残基;
X9=Arg、Ala;
X10=Leu、Gln、Glu、β−β’−ジフェニル−Ala;Phe;フェニルアラニン、トリプトファン、もしくはチロシンの非天然類似体;水和性カルボニル含有残基;またはボロン酸含有残基;
X11=Lys;および
X12=Cys、Gly、7−アミノヘプタン酸、β−アラニン、ジアミノプロピオン酸、プロパルギルグリシン、イソアスパラギン酸、または存在しない、
ここで、
修飾Argは、図34に示されている式の構造を有し、
修飾Pheは、フェニル環に組み込まれている1個または複数のハロゲンを有するPheであり、かつ
式Iは、配列番号1もしくは配列番号2、またはそれに由来する環式ペプチドではない]。
「*」でマークされている中心は、「R」または「S」配置であり;
R3およびR3’はそれぞれ独立に、Hか、またはC1〜4アルキル、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、または3個の置換基で置換されていてもよいフェニルであり;
R5は以下の(A)あるいは(B)であり:
(A)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CO2C1〜4アルキル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、および−CONH2基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基で置換されていてもよいC1〜8アルキル;あるいは
(B)以下のa)またはb)で置換されているC1〜4アルキル基:
a)1個もしくは2個のフェニル基(ここで、各フェニルは、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、もしくは3個の置換基で置換されていてもよい);または
b)ナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基;
R6は、−C1〜4アルキル−OHまたは−C1〜4アルキル−SHであり;
R7は、−C1〜4アルキル−OHまたは−C1〜4アルキル−SHであり;
mは、0、1、2、3、4、または5であり;
R8は下記の(a)あるいは(b)であり:
(a)−OH、−NRaRb、−N(Rc)C(O)Re、または−N(Rc)C(=NRd)Re;(ここで、
RaはHであり;
Rbは、Hか、またはオキソ、アセタールおよびケタール、−B(OH)2、−SH、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、もしくは−CO2C1〜4アルキル基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基で置換されていてもよいC1〜8アルキルであり;
Rcは、H、C1〜8アルキル、C3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、またはアリールであり;
Rdは、Hか、またはそれぞれ、−N3、−NH2、−OH、−SH、ハロゲン、オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、および−CO2C1〜4アルキル基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基で置換されていてもよいC1〜8アルキル、C2〜8アルケニル、C2〜8アルキニル、C3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、もしくはアリール基であり;かつ
Reは、H;−NHRd;または−N3、−NH2、−OH、−SH、オキソ、C2〜4アセタール、C2〜4ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、および−CO2C1〜4アルキル基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基でそれぞれ置換されていてもよいC1〜12アルキル、C3〜8シクロアルキル、C2〜12アルケニル、C2〜8アルキニル、またはアリール基である);あるいは
(b)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、−SH、−OH、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、または−CO2C1〜4アルキル基で置換されているC1〜12アルキル;
R9は、C1〜4アルキルまたは−C1〜2アルキレン−Rxであり;
(ここで、Rxは、−CO2H、−CONH2、−CH2NHC(O)NH2、または−CH2NHC(=NH)NH2である);
R10は下記の(1)あるいは(2)であり:
(1)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、および−CONH2基からなる群から選択される1個または複数の置換基で置換されていてもよいC1〜8アルキル;あるいは
(2)1もしくは2個のフェニル基、または1個のナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基で置換されているC1〜4アルキル基(ここで、各フェニルは、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、または3個の置換基で置換されていてもよい);
nは、0または1であり;
pは、0または1であり;
Xは、その各炭素が−CO2H、−NH2、または−NHC(O)Ryで置換されていてもよいC1〜8アルキレンまたはC2〜8アルケニレンであり;
(ここで、前記アルキレンのうちの1個の炭素は、−C(O)NH−、5員のヘテロアリール環、または−S−S−で置き換えられていてもよい);かつ
Ryは、−C1〜4アルキルまたは−CH(Rz)CO2Hである
(ここで、Rzは、−Hか、または−OH、−SH、もしくは−NH2で置換されていてもよい−C1〜4アルキルである)]。
の態様では、このメディトープを、蛍光物質、発光物質、色素、指示薬、および放射性物質からなる群から選択されるイメージング剤などの診断剤とカップリングさせる。場合によっては、イメージング剤はDOTAである。
、N41 G42、S43、P44、R45、D82、I83、A84、D85、Y86、Y87、G99、A100、G101、T102、K103、L104、E105、R142、S162、V163、T164、E165、Q166、D167、S168、およびY173を有する軽鎖、ならびにKabatナンバリングに従うとQ6、P9、R38、Q39、S40、P41、G42、K43、G44、L45、S84、D86、T87、A88、I89、Y90、Y91、W103、G104、Q105、G106、T107、L108、V111、T110、Y147、E150、P151、V152、T173、F174、P175、A176、V177、Y185、S186、およびL187を有する重鎖を含有する。
は、修飾されたメディトープにおける修飾に基づき、抗体を修飾するか、またはその逆などによって、互いに結合する修飾されたメディトープおよび修飾されたメディトープ利用可能抗体を生成する修飾方法を同時に提供する。
「抗体」は、本明細書で使用される場合、抗原またはエピトープに特異的に結合するか、または免疫学的に反応する免疫グロブリン分子を指し、これには、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方、さらには、これらに限定されないが、フラグメント抗原結合性(Fab)フラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fab’フラグメント、Fvフラグメント、組換えIgG(rIgG)フラグメント、単鎖可変フラグメント(scFv)、および単一ドメイン抗体(例えば、sdAb、sdFv、ナノボディ)フラグメントを包含する機能性抗体フラグメントが包含される。用語「抗体」には、細胞内抗体、ペプチボディ(peptibody)、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、メディトープ利用可能抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体(例えば、二重特異性抗体、ディアボディ(diabody)、トリアボディ(triabody)、テトラボディ(tetrabody)、タンデムdi−scFv、タンデムtri−scFv)など、免疫グロブリンの遺伝子操作されているか、または別段に修飾された形態が包含される。別段に述べられていない限り、用語「抗体」には、これらの機能性抗体フラグメントが包含されると理解すべきである。
両方とも、最も共通する抗体領域の配列長さに基づき、挿入は、例えば「30a」など、挿入文字によって収められ、欠失が一部の抗体で現れる。これら2つのスキームは、異なる位置に一定の挿入および欠失(「インデル」)を設けるので、ナンバリングに相違が生じる。Contactスキームは複雑な結晶構造の分析に基づき、多くの観点においてChothiaナンバリングスキームと類似している。
プ利用可能抗体の例には、これに限定されないが、本明細書において記載されているセツキシマブなどが包含される。「メディトープ結合部位」は、結合したメディトープと相互作用するアミノ酸残基を含有するメディトープ利用可能抗体の領域であり、その残基には、重鎖および軽鎖のフレームワーク領域(FR)の残基が包含される。抗体のFabフラグメントまたはFab部分に関して、メディトープ結合部位は、Fabフラグメントまたは部分の中央空洞内に位置している。
くは状態の治療をもたらす状態のイメージングまたは診断を可能にすることなど、所望の治療効果を対象においてもたらす化合物の量である。正確な治療有効量は、所与の対象における治療の有効性に関して、最も有効な結果をもたらす組成物の量である。この量は、これらに限定されないが、治療用化合物の特徴(活性、薬物速度、薬物動態、および生物学的利用能を包含)、対象の生理学的状態(年齢、性別、疾患の種類および段階、全身状態、所与の投薬量および薬物種に対する反応性を包含)、製剤中の薬学的に許容される1種の担体または複数の担体の性質、ならびに投与経路を包含する様々な因子に応じて変化するはずである。臨床分野および薬理学的分野の当業者であれば、日常的な実験を介して、即ち、化合物の投与に対する対象の反応をモニタリングし、それにしたがって投薬量を調節することによって、治療有効量を決定することができる。補足的なガイダンスについては、Remington:The Science and Practice of
Pharmacy 第21版、Univ. of Sciences in Philadelphia(USIP)、Lippincott Williams & Wilkins、Philadelphia、PA、2005を参照されたい。
ブ)、Simulect(バシリキシマブ)、Remicade(インフリキシマブ);Orthoclone OKT3(ムロモナブ(muromonab)−CD3);Rituxan(リツキシマブ)、Bexxar(トシツモマブ)、Humira(アダリムマブ)、Campath(アレムツズマブ)、Simulect(バシリキシマブ)、Avastin(ベバシズマブ)、Cimzia(セルトリズマブペゴル)、Zenapax(ダクリズマブ)、Soliris(エクリズマブ)、Raptiva(エファリズマブ)、Mylotarg(ゲムツズマブ)、Zevalin(イブリツモマブ・チウキセタン)、Tysabri(ナタリズマブ)、Xolair(オマリズマブ)、Synagis(パリビズマブ)、Vectibix(パニツムマブ)、Lucentis(ラニビズマブ)、およびHerceptin(トラスツズマブ)が包含される。
書において示されているいずれの式の化合物も不斉中心またはキラル中心を有することがあり、したがって種々の立体異性体型で存在し得る。その一般式の化合物の、光学異性体、鏡像異性体、およびジアステレオ異性体を包含する立体異性体およびその混合物は全て、その式の範囲内にあるものとみなす。さらに、ある種の構造は、幾何異性体(すなわち、シスおよびトランス異性体)として、互変異性体として、またはアトロプ異性体として存在し得る。そのような異性体型およびその混合物は全て、本明細書においては、本発明の一部として企図される。したがって、本明細書において示されている式はいずれも、ラセミ化合物、1種もしくは複数の鏡像異性体型、1種もしくは複数のジアステレオ異性体型、1種もしくは複数の互変異性体型、またはアトロプ異性体型、およびその混合物を表すことが意図されている。
1974推奨によって定義されるとおり「R」もしくは「S」と、またはペプチド文献に合わせて「D」もしくは「L」名称によって命名することができる。
らに限定されないが、ピリジンまたはイミダゾールなどの塩基性部分と、これらに限定されないが、カルボン酸などの酸性部分との両方を含有する場合、当業者は、その化合物が双性イオン(分子内塩)として存在し得ることが分かるであろう;そのような塩は、本明細書で使用されるとおりの用語「塩」の範囲内に包含される。例えば、塩がその中で沈殿するものなどの媒体中か、または水性媒体中で化合物を、当量などの量の適切な酸または塩基と反応させ、続いて凍結乾燥させることによって、本発明の化合物の塩を調製することができる。
tion、MD、FDAから入手可能)において検討されている。これらの開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書では、モノクローナル抗体(mAb)およびそのフラグメント、例えば、機能性フラグメントを包含する抗体と、その抗体に結合するメディトープなどのペプチドおよびメディトープ類似体を包含する化合物および組成物とを提供する。これらの物質、例えば、メディトープは一般的に、相補性決定領域(CDR)以外の(例えば、それとは別の)抗体およびフラグメントの領域/結合部位に、典型的には、抗体およびフラグメントのフレームワーク領域(FR)および/または定常領域内の残基に結合する。また、抗体および物質、例えば、メディトープを含有する複合体、化合物、および組成物、さらにはこれらの抗体および物質の治療用、診断用、研究用の使用、および他の使用を包含するそれらの方法および使用、ならびにそれらを製造する方法を提供する。
書において記載されているとおり、これらのペプチドの結合能は、セツキシマブに特異的なある種の態様に基づくものであり、本明細書に記載の研究では、例えば、完全ヒト抗体、マウス抗体、または他のキメラ抗体に対しては結合は観察されなかった。本明細書において実証されているとおり、これらのメディトープは、このキメラ抗体を同時にその抗原と結合させ得る。図4を参照されたい。本明細書において実証されているとおり、セツキシマブ上でのこれらのメディトープの結合部位は、超抗原ブドウ球菌プロテインA(SpA)およびペプトストレプトコッカス−マグヌスプロテインL(PpL)などの他のフレームワーク結合抗原の結合部位とも別である(図7)。ある種の態様では、提供する実施形態は、この発見に基づき、例えば、他のmAbを、これらのメディトープおよび他のメディトープにそれらが結合できるように修飾(すなわち、「メディトープ利用可能化」)することによって、かつ変異型メディトープおよび/または改変型メディトープ利用可能抗体、例えば、結合親和性、毒性、PK/PDおよび/またはpH依存性の向上を包含する、特性が改変されたものを生じさせることによって成されている。
メディトープ結合部位を介して1つまたは複数のメディトープに結合し得るメディトープ利用可能抗体を提供する。場合によっては、メディトープ利用可能抗体は、配列番号1または2(メディトープ1または2)の環式ペプチドに、かつ/あるいはメディトープ1、2、16〜18、23、29、31、32、36、39、42、43、45、46、51、52、54、または55(配列番号1、2、16〜18、23、29、31、32、36、39、42、43、45、46、51、52、54、または55で示される配列を有するペプチドに基づくメディトープ)などの1種または複数のその変異体、または場合によっては、メディトープ1、2、または15〜55の任意のものに結合する。提供するメディトープ利用可能抗体のうちには、セツキシマブの親和性と類似の親和性で1つのメディトープまたは複数のメディトープに結合するものがある。例えば、ある種の態様では、10(または約10)μM以下、5(または約5)μM以下、または2(または約2)μM以下、1(または約1)μM以下、500、400、300、200、100(または約500、400、300、200、100)nM以下、あるいはそれ未満、例えば(または約)200ピコモル以下の解離定数で、抗体はメディトープに結合する。場合によっては、本明細書に列挙されているもののうちの任意のものなど解離定数は、表面プラスモン共鳴(SPR)、等温滴定熱量測定(ITC)、蛍光、蛍光偏光、NMR、IR、熱量滴定;結合平衡除外;円偏光二色性、示差走査熱分析、または他の知られている方法などの特定の技術を使用して測定される解離定数である。例えば、場合によっては、類似体またはメディトープは、SPRによって測定した場合に、もしくはITCによって測定した場合に、またはこれらの方法のうちの任意の方法によって測定した場合に、10(または約10)μM以下、5(または約5)μM以下、または2(または約2)μM以下、1(または約1)μM以下、500、400、300、200、100(または約500、400、300、200、100)nM以下、あるいはそれ未満の結合定数を示す。
ツキシマブの、詳細にはFabフラグメントの中央空洞のフレームワークおよび定常領域内の特定の構造的特徴に基づく。メディトープ結合部位を構成するセツキシマブの領域は独自のものであり、かつこの抗体のキメラ性の結果であるようである。具体的には、Fab可変領域(Fvs)はマウス由来であり、Fab定常領域(CH1およびCL)はヒト由来である。このFabの操作によって、マウスおよびヒトキメラ抗体の配列アラインメントには存在しない残基の組合せが生じた。例えば、本明細書のデータは、メディトープは、完全ヒトIgGフレームワーク(例えば、トラスツズマブ)、リツキシマブなどの他のキメラ抗体(図29)、マウス抗体には結合しなかったことを示しており、このことによって、セツキシマブメディトープ結合部位が高度に特異的なものであることが確認される。これらの結果に加えて、トラスツズマブ(1N8Z;Choら、Nature、「Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab」、2003年2月13日;421(6924):756〜60)およびリツキシマブ(2OSL;Duら、J Biol Chem、2007年5月18日;282(20):15073〜80. Epub 2007年3月29日)Fabの分子構造を、メディトープ結合セツキシマブFab構造の上に重ね合わせることで、このフレームワークの独自性がさらに強調された。いくつかのヒトおよびマウスFabをセツキシマブ−環式ペプチド(メディトープ1)構造に重ね合わせたところ、このペプチドとマウス−ヒトキメラFabとの間での重要な相互作用は、この研究において比較されたヒトのみおよびマウスのみのIgG構造のいずれにも存在しないことが示された。cQFD環式ペプチド(メディトープ1)内の重要な残基を点突然変異させると、セツキシマブFabに対するその結合親和性が低減されたので、高い特異性および構造モデルがさらに確認された。したがって、この相互作用は、この特異的マウス−ヒトキメラFabの中央空洞および選択されたメディトープに特異的なものであるようである。
て、抗原性予測アルゴリズムをさらに使用して、点突然変異を有するヒト配列が抗原性であるはずがないことをさらに示すことができる。
Interest、第5版、NIH Publication No.91〜3242を参照されたい)に従うと軽鎖フレームワーク残基10、39〜43、83、85、100、および104および/またはKabatナンバリングに従うと重鎖フレームワーク残基番号40、89、および105から選択される(図2を参照されたい)。一般に、別段の指定がない限り、抗体の重鎖または軽鎖中のアミノ酸位置は、Kabatナンバリングに関する。セツキシマブメディトープ結合部位内の残基などの本明細書において記載されているセツキシマブの残基に対応する他の抗体中の残基も、本開示内に包含される。一部の実施形態では、軽鎖残基9、10、39、40、41、42、43、83、85、100、および/もしくは104ならびに/または重鎖残基40、89、および/もしくは105に対応するテンプレート抗体中の残基を、例えば、セツキシマブ内でそれらの位置に存在するアミノ酸で置き換える。
residues on loop conformation」、Protein Eng.、4:773〜783(1991)を参照されたい。したがって、ある種の実施形態では、目的の既存抗体または新たに生じさせた抗体のCDRをグラフト化することによって、メディトープ利用可能抗体の抗原特異性を改変する。また、提供するメディトープ利用可能抗体のうちには、そのようなCDRグラフト化されたメディトープ利用可能抗体がある。
99%同一であるFR−H1、FR−H2、FR−H3、および/またはFR−H4)ならびに一部の態様では、配列番号70で示される重鎖配列のCDRとは別である少なくとも1つのCDRを有するアミノ酸配列を有する。
ツモマブ、エクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、カプロマブ、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、セルトリズマブ、クリバツズマブテトラキセタン、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エタラシズマブ、エルツマキソマブ、ファノレソマブ、Fbta05、フォントリズマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、メポリズマブ、ムロモナブ、ムロモナブ−CD3、ナタリズマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、サツモマブ、スレソマブ、イブリツモマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、Trbs07、ウステキヌマブ、ビシリズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ハイブリドーマ10B5によって産生される抗体、およびブロダルマブまたはチウゼタン(tiuzetan)のうちから選択される。一部のそのような例では、1つまたは複数のCDRは、これらのテンプレート抗体に存在するCDRであり、かつ/または抗体は、そのような抗体と同じ抗原もしくはエピトープに特異的に結合し、かつ/またはそれらの抗原への結合について、そのような抗体と競合する。
る。したがって、提供するメディトープ利用可能抗体のうちには、ヒト、マウス、もしくはニワトリなどの他のIgG、または他の免疫グロブリン中の残基の変異によって生じるものがある。言い換えると、本明細書において提供するメディトープ利用可能化方法は、IgA、IgE、IgD、およびIgMを包含し、かつこれらに限定されないが、ニワトリ、マウス、ラット、ウシ、ウサギ、霊長類、およびヤギを包含する、抗体を産生する任意の生物に由来する任意の抗体のために使用することができる。
また、メディトープ利用可能抗体に結合する、変異型、修飾型、および多価メディトープを包含するメディトープ、ならびにそれらを含有する複合体および組成物、ならびにそれらの方法および使用を提供する。ある種の実施形態では、そのメディトープには、メディトープ1および2(cQFD(配列番号1)およびcQYN(配列番号2))が包含さ
れるが、これらは元々は、Riemerら(2004);J Immunol 173、394〜401;Riemerら(2005);J Natl Cancer Inst
97、1663〜1670に記載されているとおり、セツキシマブのCDR領域に結合させるためのペプチド候補として同定されたものであった。本明細書において実証されているとおり、cQFDおよびcQYNメディトープは、セツキシマブCDRとは別であるセツキシマブ内の部位に結合するので、おそらく、ワクチンとして使用するための特異的セツキシマブ様抗体免疫原のための候補にはならなかった。
提供するメディトープのうちには、メディトープ1または2(配列番号1または2のメディトープ)と比較して1つまたは複数の修飾、例えば、構造的修飾を有するメディトープ変異体(変異型メディトープとも呼ばれる)があり、かつそれらを生産する方法を提供する。一部の実施形態では、cQFDおよびcQYNメディトープを、メディトープ変異体を設計する際の出発点として使用する。一部の態様では、例えば、未修飾のメディトープ、cQFDおよびcQYNと比較して、セツキシマブおよび本明細書において記載されている他の抗体を包含する1つまたは複数の提供するメディトープ利用可能抗体についての親和性の上昇または改変、pH依存性の改変、または異なる生理学的条件下での異なる親和性などの改変された特性を有するように、メディトープ変異体を設計する。様々な化学的および生物物理的方法を使用して、メディトープ変異体を設計および生産する。
にセリンをさらに包含するメディトープ1、2、または15〜55のうちの一つである。表3に列挙されているメディトープは、CおよびN末端を接続するためにジスルフィド結合を利用し(ただし、メディトープ31は追加のテール部を含有し、これは、2個の末端残基の間にジスルフィド結合がないことを意味している);表4のペプチドでは、ラクタム架橋、ジスルフィド以外の結合([3+2]付加環化など)または結合なしが利用されている(例えば、非環式または線状変異体)。本明細書において記載されている実施形態に従って使用することができる追加のメディトープには、本明細書において定義されるとおりの任意のメディトープ、セツキシマブまたは任意の他の治療用抗体の抗体フレームワーク結合インターフェース(すなわち、Fab軽鎖および重鎖の間)に結合するペプチドが包含される。例えば、環式ペプチドcQFDおよびcQYNに加えて、一部の実施形態は、cQFDおよびcQYNの1つまたは複数の変異体を包含する。
環式ペプチドを包含し得る:
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12(式I)
[例えば、式中:
X1=Cys、Gly、β−アラニン、ジアミノプロピオン酸、β−アジドアラニン、または存在しない;
X2=Glnまたは存在しない;
X3=Phe、Tyr、β−β’−ジフェニル−Ala、His、Asp、2−ブロモ−L−フェニルアラニン、3−ブロモ−L−フェニルアラニンもしくは4−ブロモ−L−フェニルアラニン、Asn、Gln、修飾Phe、水和性カルボニル含有残基;またはボロン酸含有残基;
X4=AspまたはAsn;
X5=Leu;β−β’−ジフェニル−Ala;Phe;フェニルアラニン、トリプトファン、もしくはチロシンの非天然類似体;水和性カルボニル含有残基;またはボロン酸含有残基;
X6=Ser;
X7=ThrまたはSer;
X8=Arg、修飾Arg、または水和性カルボニルもしくはボロン酸含有残基;
X9=Arg、Ala;
X10=Leu、Gln、Glu、β−β’−ジフェニル−Ala;Phe;フェニルアラニン、トリプトファン、もしくはチロシンの非天然類似体;水和性カルボニル含有残基;またはボロン酸含有残基;
X11=Lys;および
X12=Cys、Gly、7−アミノヘプタン酸、β−アラニン、ジアミノプロピオン酸、プロパルギルグリシン、イソアスパラギン酸、または存在しない]。
「*」でマークされている中心は、「R」または「S」配置であり;
R3およびR3’はそれぞれ独立に、Hか、またはC1〜4アルキル、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、または3個の置換基で置換されていてもよいフェニルであり;
R5は以下の(A)あるいは(B)であり:
(A)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CO2C1〜4アルキル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、および−CONH2基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基で置換されていてもよいC1〜8アルキル;あるいは
(B)以下のa)またはb)で置換されているC1〜4アルキル:
a)1個もしくは2個のフェニル基(ここで、各フェニルは、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、もしくは3個の置換基で置換されていてもよい);または
b)ナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基;
R6は、−C1〜4アルキル−OHまたは−C1〜4アルキル−SHであり;
R7は、−C1〜4アルキル−OHまたは−C1〜4アルキル−SHであり;
mは、0、1、2、3、4、または5であり;
R8は下記の(a)あるいは(b)であり:
(a)−OH、−NRaRb、−N(Rc)C(O)Re、または−N(Rc)C(=NRd)Re;(ここで、
RaはHであり;
Rbは、Hか、またはオキソ、アセタールおよびケタール、−B(OH)2、−SH、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、もしくは−CO2C1〜4アルキル基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基で置換されていてもよいC1〜8アルキルであり;
Rcは、H、C1〜8アルキル、C3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、またはアリールであり;
Rdは、Hか、またはそれぞれ、−N3、−NH2、−OH、−SH、ハロゲン、オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、および−CO2C1〜4アルキル基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基で置換されていてもよいC1〜8アルキル、C2〜8アルケニル、C2〜8アルキニル、C3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、もしくはアリール基であり;かつ
Reは、H;−NHRd;または−N3、−NH2、−OH、−SH、オキソ、C2〜4アセタール、C2〜4ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、および−CO2C1〜4アルキル基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基でそれぞれ置換されていてもよいC1〜12アルキル、C3〜8シクロアルキル、C2〜12アルケニル、C2〜8アルキニル、またはアリール基である);あるいは
(b)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、−SH、−OH、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、または−CO2C1〜4アルキル基で置換されているC1〜12アルキル;
R9は、C1〜4アルキルまたは−C1〜2アルキレン−Rxであり;
(ここで、Rxは、−CO2H、−CONH2、−CH2NHC(O)NH2、または−CH2NHC(=NH)NH2である);
R10は下記の(1)あるいは(2)であり:
(1)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、および−CONH2基からなる群から選択される1個または複数の置換基で置換されていてもよいC1〜8アルキル;あるいは
(2)1もしくは2個のフェニル基、または1個のナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基で置換されているC1〜4アルキル基(ここで、各フェニルは、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、または3個の置換基で置換されていてもよい);
nは、0または1であり;
pは、0または1であり;
Xは、その各炭素が−CO2H、−NH2、または−NHC(O)Ryで置換されていてもよいC1〜8アルキレンまたはC2〜8アルケニレンであり;
(ここで、前記アルキレンのうちの1個の炭素は、−C(O)NH−、5員のヘテロアリール環、または−S−S−で置き換えられていてもよい);かつ
Ryは、−C1〜4アルキルまたは−CH(Rz)CO2Hである
(ここで、Rzは、−Hか、または−OH、−SH、もしくは−NH2で置換されていてもよい−C1〜4アルキルである)]。
構造データおよび熱力学的データに基づき、本明細書において記載されているメディトープ1および2内のいくつかの位置が、全体結合親和性を増強し、かつ/または本明細書において記載されているとおりの他の特性を改変するために例えば、種々の天然または非天然アミノ酸で修飾するための標的部位として同定されている。そのような修飾には、こ
れらに限定されないが、ヘッドトゥテールの環式ラクタムペプチドを作成するためのcQFDまたはcQYNの修飾、Arg8の修飾、3位の修飾(例えば、cQFDまたはその変異体のPhe3)、Leu5の修飾、Leu10の修飾、および/または水和性カルボニル官能基の組み込みが包含される(図31を参照されたい)。本明細書において実証されているとおり、cQFDの元のメディトープにおいてPhe3、Leu5、およびArg8をそれぞれアラニンに変異させると、メディトープ利用可能抗体結合インターフェースに対する、生じた化合物の親和性が10〜140分の1に低下する。一部の態様では、変異型メディトープには、配列番号1もしくは2のメディトープまたは表3もしくは4に列挙されている他のメディトープの1、3、5、8、10、および12位のうちの1つまたは複数に修飾を有するものが包含される。
一部の実施形態では、メディトープ変異体は、メディトープ1または2の8位(Arg8)に対応する位置に修飾を含有する。未修飾のメディトープ(cQFD;配列番号1)において、Arg8は伸長されて、メディトープ利用可能抗体重鎖のQ105の重鎖カルボニルと水素結合を形成している。この残基のすぐ周囲の範囲は、溶媒に曝露されても疎水性である(図33A)。一部の態様では、このメディトープは、この位置に修飾された残基を含有する(例えば、修飾されたArg8)。一部の例では、この修飾された残基は、メディトープ利用可能抗体H−結合のために有用なArg8残基のイミニウム官能基を維持しており、置換または非置換の疎水性アームを導入して、空洞を満たす。リガンドドッキング計算によって裏付けられるとおり、そのような修飾は、エントロピーの上昇によって結合をかなり増大させる。N−アルキルグアニジニウム基またはアルキル−アミジン官能基を使用することによって、そのような修飾を組み込むことができる。いずれの場合においても、末端N原子の置換される基は、アルキルまたはアリールであってよく、その場合、そのアルキルまたはアリール基の各位置は、末端位を包含する基内で、追加の官能基で場合によって置換されていてよい。一例では、図34に示されているとおりの構造を有する修飾されたアルギニン(修飾されたArg8)は、例えば、配列番号1または2のメディトープのArg8について、NH2上でブチル基で置換されている(図34ではNHRとして示されている)。一部の態様では、変異型メディトープは、8位にn−ブチル−アルギニンまたはブチルアミジン修飾を含有する。
一部の実施形態では、メディトープ変異体は、メディトープ1のPhe3など、3位に対応する位置に修飾を含有する。構造データで本明細書において示されているとおり、メディトープ変異体Phe3Tyr cQYN(配列番号2)のヒドロキシル基は、cQFD(配列番号1)と比較して、Arg8側鎖の伸長された立体配座中に改変を有する(図30Cおよび35を参照されたい)。本明細書のデータによって、Fabへの水結合を伴う、好ましい水素結合ネットワークの形成が示唆されている。エンタルピーによって駆動される最適化は、薬物設計における多くの小分子手法で成功することが判明しており、提供するメディトープには、エントロピーの上昇を操作する機会が存在する。一部の実施形態では、メディトープ設計においてエンタルピーおよび/またはエントロピーを上昇させる手法を使用して、様々なメディトープを作成する、例えば、結合を最適化する。
、メディトープ利用可能抗体のそれぞれTyr87(軽鎖)、Gln38、および/またはTyr91(重鎖)位でのハロゲン結合に適した位置に臭素原子が位置するように、Phe3を、2−ブロモ−、3−ブロモ−、または4−ブロモフェニルアラニンで置き換える。そのようなフェニルアラニン誘導体は市販されており、かつ一部の態様では固相ペプチド合成(SPPS)によって、環式ペプチドメディトープ変異体に組み込まれる。例示的な変異型メディトープには、2−ブロモ−L−フェニルアラニン、3−ブロモ−L−フェニルアラニン、または4−ブロモ−L−フェニルアラニンをメディトープ1のPhe3に対応する位置に含有するものが包含される。
一部の実施形態では、メディトープ変異体は、メディトープ1または2の5または10位(Leu5またはLeu10)に対応する位置に修飾を含有する。本明細書において示されているとおり、メディトープ1のLeu5およびLeu10の側鎖は、メディトープ利用可能Fab、セツキシマブに疎水性に接触している(図36、右側のパネルを参照されたい;Leu10)。ある種の実施形態では、異なる天然アミノ酸または非天然アミノ酸をこれらの位置のうちの一方または両方に組み込み、例えばそれによって、伸長され得る表面積量を変えることによって、メディトープの1つまたは複数の特性、例えば、親和性を改変する。一実施形態では、天然アミノ酸(Phe/Tyr/Trp)および非天然類似体(例えば、β,β’−ジフェニル−L−アラニンまたは、分枝アルキル、ナフチルなどの伸長された芳香族、もしくは他の疎水基を包含する側鎖が組み込まれているアミノ酸)を、SPPSを介して、一方または両方の位置に体系的に導入する。
ある種の実施形態では、メディトープ利用可能抗体のメディトープ結合部位を囲む1個または複数のFabヒドロキシル支持側鎖を、選択的なトラッピングを介して、水和性官能基が組み込まれているメディトープと共有結合を形成することによって利用する。したがって、一部の実施形態では、例えば、高度に選択的であるが、メディトープ利用可能抗体または他の物質との不可逆的な相互作用を生じさせるために、メディトープは、水和性置換基を有する1個または複数の残基を含有する。例えば、メディトープ1のArg8は、Kabatナンバリングに従うとメディトープ利用可能抗体の軽鎖のSer43(3.5Å)および重鎖のTyr91(3.8Å)の近傍まで伸長している(図36、左側のパネル)。メディトープのArg8またはLeu10の末端に水和性官能基を組み込むことで、セリンまたはチロシンヘミアセタールの選択的な形成が可能になるであろう。そのような共有付加物は本質的に、不可逆的な結合をもたらすであろう。加えて、ボロン酸を含有する残基も、水和性基としてメディトープに取り込むことができる。ボロン酸は、多発性骨髄腫を治療するために使用されるボルテザミブ(bortezamib)(Velcade(登録商標))の構造活性において重要な役割を果たす。水和性残基のさらなる代表的な例を図34にも示すが、ここで、R=−CH2CHOまたは−CH2B(OH)2である。一部の例では、SPPSを使用して、そのような基を含有する残基を組み込むことによって、そのような変異体を調製する。
またはチオール同等官能基を含有するメディトープとの間に選択的ジスルフィド結合(−S−S−)を作るために使用する。このアイデアによる他の実施形態には、α,β−不飽和カルボニル官能基などの、メディトープに含有されるマイケルアクセプタを導入することが包含されるであろう。これらの官能基は、チオールと選択的に反応して、安定な共有炭素−硫黄結合を形成することがよく知られている。
ある種の実施形態では、変異型メディトープは、cQFDおよびcQYN中においてと同様に、ジスルフィド架橋を包含する。2個のシステイン残基の側鎖が反応することによって、ジスルフィド架橋が形成され得る。ある種の実施形態では、メディトープ、例えば、メディトープ1または2中のジスルフィド架橋を、別の結合に置き換えるか、または除去する。したがって、変異型メディトープのうちには、元のメディトープとは別の結合を有するか、またはそれらのジスルフィド架橋を欠いたものがある。
Peptide Sci. 2003、9、471〜501を参照されたい。一実施形態では、メディトープは、反応性基を、p−アセチルフェニルアラニンなどのFabに組み込まれている非天然アミノ酸に向けることもできる。
およびペプチド模倣物質を環化するそのような方法は、当技術分野でよく知られている。
一部の実施形態では、例えば、本明細書において実施例で記載されている方法などのITC、SPR、および/または回折、および/または他の方法によって、変異型メディトープなどのメディトープをキャラクタライズする。一例では、例えば、最も望ましい特性、例えば、1つまたは複数のメディトープ利用可能抗体に対して最大の親和性、またはpH依存性などの他の望ましい特性を有するメディトープ変異体を引き続き修飾して望ましい特性を向上させるように、メディトープの合成およびそのキャラクタリゼーションを反復して実施する。
ブまたは他のメディトープ利用可能抗体の全IgGまたはFabフラグメントを使用して、結合測定を実施することができる。一例では、回折のために、セツキシマブFabフラグメントおよび配列番号1のメディトープの共結晶化条件を十分に確立し、回折品質の結晶を典型的には、1〜3日、典型的には1日で得る。全データセットは社内ソース(Rigaku 007−HFおよびR−Axis IV++)では8〜12時間で、かつStanford Synchrotron Radiation Lightsourceでは10分間で収集されるので、メディトープ変異体とメディトープ利用可能抗体との相互作用を迅速にキャラクタライズすることができる。
れらを使用するイメージング方法もしくは他の方法を増強することができる。別の実施形態では、メディトープは、メディトープ結合部位のFab中の1個または複数の操作システイン(例えば、ThioMAb)に結合する1個または複数のシステイン残基を含有してよい。これによって、このメディトープは、任意の診断用および/または治療用物質、分子、または化合物にコンジュゲートする。例えば、その物質は、マーカーなどの小分子診断用分子であってよい。この「Cysメディトープ」は、そのコンジュゲートを抗体に向かわせ、共有結合を介して結合する。別法では、このメディトープをFabに、メディトープ結合部位に組み込まれている1つまたは複数の非天然アミノ酸にコンジュゲートさせることができる。
また、提供するメディトープのうちには、多価メディトープがある。ある種の態様では、メディトープをリンカーまたはスキャフォールド(例えば、多価テザリング体を形成するための)にコンジュゲートさせることで、抗原、例えば、腫瘍関連抗原に結合するメディトープ利用可能mAbに対する全体親和性およびその標的化をかなり向上させる。
models」、Cancer Res、2009年12月15日;69(24):9330〜6;Cardarelli PMら、「Binding to CD20 by
anti−B1 antibody or F(ab’)(2) is sufficient for induction of apoptosis in B−cell lines」、Cancer Immunol Immunother、2002年3月;51(1):15〜24. Epub 2001年12月18日を参照されたい。この細胞死増強の正確な機構については論争中であるが、研究によって、効果の増強を達成するためには、mAbは両方とも多価(例えば、全抗体またはF(ab)’2)であるべきことが示されており、このことは、第2の二価mAb(同じ抗原上で独自のエピトープに結合する)が細胞表面抗原をクラスター化し、より有効に作用する、例えば、腫瘍細胞をより有効に死滅させ得ることを示唆している。図8および16を参照されたい。
ディトープはまた、比較的より簡単に腫瘍などの疾患部位に標的化される。メディトープ結合部位(抗体CDRとは別のメディトープ結合部位内)の性質および選択される任意の抗体をメディトープ利用可能化するために本明細書において提供されている広く適用可能な方法によって、多価メディトープは、治療的に許容される特徴を有する第2の抗体またはエピトープを同定することを必要とせずに、広い範囲の治療用抗体に容易に適用し得るという利点も有する。したがって、一部の態様では、多価メディトープを使用することで、許容される特徴を有する第2のmAbを同定する必要性およびその開発に付随するかなりのコストが回避される。
とができる。ある種の実施形態では、リンカーの組成は、あり得る抗原性を緩和するために、ヒト由来のものである。
改変するために、種々の長さのポリエチレングリコール(PEG)および/または他のリンカーを使用する。一部の態様では、PEG長さは、10(または約10)A〜1000(または約1000)Aまたはその付近である。合成手法は、放射性核種イメージング用のDOTAを組み込むためにも適している。例えば、FITC標識二価メディトープ、すなわち化合物13の合成では、30ÅのPEG二官能性アームが組み込まれている(図13)。IgG内のCDR領域間の距離は、約130Åである。この手法が最適であることを保証するために、PEGリンカーの長さを体系的に変えることができる。市販のPEGのエンドツーエンド距離は、90Åに達し(Pierce)、これは、IgG距離を超えるであろう。
4、245〜248(2009)を参照されたい)などの使用が包含される。これらに限定されないが、DNA(一本鎖、二重鎖、Hollidayジャンクション、アプタマーなど)、RNA(一本鎖、ヘアピン、ステムループ、アプタマーなど)、PNA(ペプチド核酸)、硬直のためのDNA/PNA二重鎖および三重鎖、有機およびまたは無機ナノ粒子(直接カップリングしているか、またはPEGなどの有機ポリマーを介してカップリングしている)、それ自体と、および/またはDNAもしくはPNAと二重鎖を形成し得る有機ポリマーを包含する分子を使用して、化学的スキャフォールドを作ることもできる。
例えば、多価スキャフォールドへのコンジュゲーションが、メディトープ−Ig相互作用に影響を及ぼさないことを保証するために、SPRおよびITCを包含するいくつかの知られている方法のうちのいずれかによって、メディトープ利用可能抗体への多価メディトープの結合特性をキャラクタライズすることができる。これらの手法が一般的に、細胞表面上に(腫瘍細胞の表面上などに)存在する抗原に関連していない場合、場合によっては、そのような測定は、多価および相乗効果を決定するその能力において制限を受け得る。したがって、一部の態様では、FACS分析および/または細胞生存率アッセイを使用して、メディトープ利用可能抗体(例えば、セツキシマブの状況では、EGFRを過剰発現する細胞)が認識する抗原を発現する細胞そのものに対する多価メディトープの作用を定量する。例示的なプロトコルを実施例7において記載する。一般に、メディトープ利用可能抗体が認識する抗原を発現(例えば、過剰発現)する細胞系をメディトープ利用可能抗体と共に、抗体が、細胞上に発現されている抗原に結合する条件下でインキュベートする。場合によっては、様々な濃度の抗体を使用する。同時にか、またはその後に、細胞を多価メディトープと共に、場合によっては濃度を変えてインキュベートする。適切なインキュベーション時間および洗い出しを実施する。第2の抗体および一価メディトープを、陽性対照および陰性対照としてそれぞれ使用することができる。抗体およびメディトープを、よく知られているフローサイトメトリーまたは顕微鏡によって検出可能な薬剤で標識することもできる。一部の例では、一価メディトープと比較して、多価メディトープの存在下でのシグナルのシフト(FACSの場合)または上昇は、相乗作用または相加作用を示している。他の例では、多価メディトープの相加作用をさらに確認するために、非標識
の一価メディトープを競合アッセイで使用して、それが、抗原結合したメディトープ利用可能抗体について、標識された多価メディトープと競合し得るかどうかを決定する。
また、1つまたは複数のメディトープを含有する融合タンパク質を提供する。本明細書において実証されているとおり、cQFDメディトープ(メディトープ1)に結合しているメディトープ利用可能Fabフラグメントの回折によって、抗体結合メディトープのN末端およびC末端が、IgM、IgD、IgG、IgE、およびIgAを包含するヒト抗体に結合する結合プロテインL、細菌タンパク質の位置と並列していることが示された。一部の実施形態では、メディトープ−プロテインL融合タンパク質(MPL)を提供する。一部の態様では、プロテインL−メディトープ融合体は、メディトープ単独および/またはタンパク質単独と比較して、例えば、エネルギー相加性を介して、より大きな親和性でメディトープ利用可能抗体への結合を示す。MPLはまた、プロテインL単独ならびに他の、プロテインL、プロテインA、および/または類似の抗体結合性タンパク質の多価コンジュゲートと比較して、有利であり得、その際、MPLは、メディトープ利用可能抗体に対する特異性をもたらし、かつ治療で投与された場合に、内因性免疫グロブリン分子を標的化しない。
、例えば、抗原性の分析に従って、例えば、アミノ酸置換を行うことができる。他の例では、特異性を向上させるために、変異を導入する。他の実施形態では、メディトープを、他の抗体結合性タンパク質、例えば、プロテインAまたはプロテインGなどの他の抗体結合性物質と融合させる。
SCQFDLSTRRLKCGGGGSEVTIKVNLIFADGKIQTAEFKGTFEEATAEAYRYAALLAKVNGEYTADLEDGGNHMNIKFAG(配列番号58)。
ある種の実施形態では、1つまたは複数のメディトープ、メディトープ変異体、多価メディトープ、メディトープ−プロテインL融合体(MPL)、多価テザリング剤、または多価メディトープ変異体テザリング剤を包含するメディトープを、治療有効量の1種または複数の治療剤もしくは診断剤に、例えば、イメージング剤、治療上有効な薬剤もしくは
化合物に、または両方にコンジュゲートする。メディトープおよび1種または複数の薬剤を含有するそのような複合体を提供する。
体化させて、本明細書において記載されている抗体および担体と共に使用すると、そのキレートはMRIのために有用である。NOTA、DOTA、およびTETAなどの大環状キレートが、様々な金属、ならびにこれらに限定されないが、それぞれガリウム、イットリウム、および銅の放射性核種を包含する放射性金属と共に使用される。RAITのために223Raなどの核種を安定的に結合するために重要な大環状ポリエーテルなどの他の環状キレートも使用することができる。ある種の実施形態では、Al−18F複合体などのPETイメージング剤をPET分析において使用するための標的化分子に結合させるために、キレート部分を使用することができる。
イトマイシンC、ミトタン、ミトキサントロン、ネララビン、ニルタミド、オクトレオチド、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペメトレキセド、パニツムマブ、PEGインターフェロン、ペグアスパラガーゼ、ペグフィルグラスチム、PEG−L−アスパラギナーゼ、ペントスタチン、プリカマイシン、プレドニゾロン、プレドニゾン、プロカルバジン、ラロキシフェン、リツキシマブ、ロミプロスチム、ラリトレキセド(ralitrexed)、サパシタビン、サルグラモスチム、サトラプラチン、ソラフェニブ、スニチニブ、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テガフール、テガフール−ウラシル、テムシロリムス、テモゾラミド(temozolamide)、テニポシド、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、トリミトレキサート(trimitrexate)、アルルビシン(alrubicin)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ボリノスタット、またはゾレドロン酸が包含される。
また、治療用および診断用の使用を包含するメディトープ、メディトープ利用可能抗体、およびそれらを含有する複合体の方法および使用、さらには抗体の精製を包含する他の使用を提供する。また、そのような診断および治療方法において使用するための、メディトープ(変異型および多価メディトープならびにメディトープ融合タンパク質を包含する)を含有する医薬組成物を提供する。
一実施形態では、典型的には、(同時にか、または別々に)1つまたは複数のメディトープ利用可能モノクローナル抗体と組み合わせて投与する場合に、メディトープ、メディトープ変異体、多価メディトープ、MPL、多価メディトープテザリング剤、および多価メディトープ変異体テザリング剤などの特異性および結合を使用して、疾患または状態を治療、診断(例えば、イメージング)するための治療剤、診断剤(例えば、イメージング剤)、またはそれらの組合せを送達する。
証されているとおり、多価メディトープを使用することによって、選択性を増強し、かつ腫瘍の検出を改善することができるが、これらの非ヒトコンストラクトに固有の起こり得る免疫原性は回避される。
どの非タンパク質イメージング剤または送達ビヒクルとさらにコンジュゲートさせるか、または別段に会合させることができる。加えて、一部のナノ粒子、例えば量子ドットおよび金属ナノ粒子(下記)は、イメージング剤または治療剤として使用するためにも適し得ることに留意すべきである(例えば、温熱および光線力学的療法を使用して、さらには蛍光およびまたはMRIコントラストを介するイメージング剤)。
(「DOTA」))、または上記の任意の薬剤が包含される。一実施形態では、本明細書において記載されている方法で使用されるイメージング剤は、DOTAである。
ブのメディトープ利用可能バージョンを使用して、治療またはイメージングすることができる)、結腸直腸癌(例えば、ラベツズマブ、パニツムマブ、ペンテト酸アルツムマブ、ボツムマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる)、胃腸癌(例えば、アルシツムマブ、カツマキソマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる)、卵巣癌(例えば、アバゴボマブ、カツマキソマブ、エタラシズマブ、イゴボマブ、オレゴボマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる)、肺癌(例えば、アナツムマブマフェナトックスのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる)、膵臓癌(例えば、クリバツズマブテトラキセタンのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる)、腎臓癌(例えば、ギレンツキシマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる)、黒色腫癌(例えば、エタラシズマブ、イピリムマブ、TRBS07のメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる)、膠腫(例えば、ニモツズマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる)、骨転移(例えば、デノスマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる)、頭頚部癌(例えば、ザルツムマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる)、心臓血管疾患(例えば、アブシキシマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる)、自己免疫障害(例えば、アダリムマブ、インフリキシマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる)、関節リウマチ(例えば、アトリズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる)、移植拒絶(例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ、ムロモナブ−CD3のメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる)、クローン病(例えば、セルトリズマブ、フォントリズマブ、ナタリズマブ、インフリキシマブ、ビシリズマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる)、ヘモグロビン尿(エクリズマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる)、乾癬(例えば、エファリズマブ、インフリキシマブ、ウステキヌマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる)、多発性硬化症(例えば、ナタリズマブ、ウステキヌマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる)、喘息(例えば、ベンラリズマブ、メポリズマブ、オマリズマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる)、呼吸系発疹ウイルス(RSV)(例えば、パリビズマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる)、黄斑変性(例えば、ラニビズマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる)、虫垂炎(例えば、ファノレソマブのメディトープ利用可能バージョンを使用して治療またはイメージングすることができる)、および抗体で標的化または治療され得る任意の他の状態が包含される。上記で列挙された抗体および関連疾患または障害は単なる例であり、プラットフォームを制限するものではない。
また、scFv(単一鎖Fab可変)フラグメントを安定化させるための方法および組成物を提供する。一般に、scFvフラグメント(例えば、所与のFabのscFvフォーマット)は、Fab自体などの全長mAbおよび他のフラグメントよりもかなり低い親和性で抗原に結合する。そのような低い親和性は、少なくとも部分的には、Fvドメインの配向、配座の変動に直接的に影響を及ぼすFab定常ドメインが存在しないことと、おそらく不十分なリンカー設計に帰せられる。他方で、scFvおよびより小さな他のフラグメントは、より良好な組織、例えば腫瘍への浸透を包含する別の利点を有し得る。
生産に関連する高いコストの削減、これらのタンパク質の限られたライフサイクルに比較しての改善、およびプロテインLまたはAの使用に関連する細菌性病原体などの外来生物材料を導入するリスクの回避を包含する、プロテインAまたはプロテインLを使用する他の精製方法を上回る追加の利点を有する。
I. メディトープ利用可能抗体の修飾
また、メディトープに関連する結合親和性もしくは特異性などの1つまたは複数の抗体の特性および/または他の特性を改変するために、メディトープ利用可能抗体を修飾するための方法を提供する。また、その方法によって生産される修飾抗体およびそれを産生するためのライブラリを提供する。一実施形態では、メディトープ利用可能抗体のメディトープ結合部位をライニングし、かつ/または他の点で、そのような抗体をメディトープに結合するために重要である残基を体系的に、または無作為に改変して(例えば、縮重ライブラリおよび選択を使用して)、例えば、メディトープまたはメディトープ類似体の特異性を増強および/または変化させる(例えば、改変を行う方法については、参照によって本明細書に組み込まれるSheedyら、2007およびAkamatsuら、2007を参照されたい)。一部の態様では、メディトープ相互作用の親和性を向上させ、かつ/またはメディトープ−抗体相互作用の他の特性を改変するために、残基を天然もしくは非天然アミノ酸または両方で置換する。二重特異性抗体を作成するために抗体に非天然アミノ酸を組み込むことは、Hutchinsら(2011)によって記載された。
G42、S43、P44、R45、D82、I83、A84、D85、Y86、Y87、G99、A100、G101、T102、K103、L104、E105、K107、R142、S162、V163、T164、E165、Q166、D167、S168、またはY173)および/または1個または複数の重鎖残基(例えば、Kabatナンバリングに基づき、かつセツキシマブ、メディトープ利用可能トラスツズマブ、もしくはメディトープ利用可能M5A、または他のメディトープ利用可能抗体中の類似の残基に関して、重鎖のQ6、P9、R38、Q39、S40、P41、G42、K43、G44、L45、S84、D86、T87、A88、I89、Y90、Y91、W103、G104、Q105、G106、T107、L108、V109、T110、V111、Y147、E150、P151、V152、T173、F174、P175、A176、V177、Y185、S186、またはL187)あるいはそれらの組合せが包含され得る。
6、およびL187のうちの1個もしくは複数(セツキシマブまたは他のメディトープ利用可能抗体中の類似の残基に関して)を変異させる。
セスを例えば複数回繰り返して、結合または他の所望の特徴(複数可)を「展開/最適化」することによって、この方法を実施する。
また、メディトープ類似体ならびにそのような類似体を同定、生産、およびスクリーニングするための方法を提供する。したがって、一部の実施形態では、他の分子も、メディトープの特徴と類似の機能的特徴で、メディトープ利用可能抗体のメディトープ結合部位に結合する。そのような分子をメディトープ類似体と呼び、それらには、これらに限定されないが、小分子、アプタマー、核酸分子、ペプチボディ、およびメディトープと同じ結合インターフェースに結合し得る任意の他の物質が包含される。一例では、この類似体は、DOTA誘導体である。
一部の態様では、この方法は、蛍光偏光アッセイおよび/または他の競合をベースとするアッセイを包含する。一例では、メディトープ部位に結合することができ、かつ類似の機能のために使用することができる別の分子を同定するために、例えば、適切な方法(例えば、アミン、スルフヒドリル、カルボキシラート、糖、または他の知られている方法)を使用して、蛍光マーカー(例えば、Alexafluor、ローダミン、フルオレセイン)をメディトープにコンジュゲートし、メディトープ利用可能抗体と相互作用させる。一般に、標識されたメディトープとメディトープ利用可能抗体との間の相互作用は、蛍光タグの蛍光偏光/強度の変化をもたらす。確立されたら、小分子化合物(MW<1000Da)などの試験化合物(有望な類似体)を加え、例えば、蛍光標識されたメディトープ−抗体複合体と平衡させ、蛍光偏光をモニタリングする。メディトープ−抗体相互作用をブロックする試験化合物は、蛍光偏光特性を改変する。したがって、他の実施形態は、標的送達のために最適化され、使用され得る化合物を同定する方法である。類似体または有望な類似体をスクリーニングし、メディトープをキャラクタライズするために、本明細書において記載されている結晶学または他の方法によって、さらにキャラクタライズすることができる。
リード化合物を同定するための回折をベースとする方法は、十分に確立されている(Shukerら、1996;Erlansonら、2001;Hughesら、2011)
。セツキシマブおよび他のメディトープ利用可能Fabは2.5Å超で回折するので、ある種の実施形態では、この手法を使用して、メディトープにカップリングさせるか、または類似体として使用することができるリード化合物または小分子フラグメントを同定する。例えば、そのような化合物には、次いで一緒に連結して合成メディトープ類似体を形成するフラグメントが包含される。一例では、セツキシマブまたは他のメディトープ利用可能抗体の結晶に吸収される化合物ライブラリを開発している。これらの吸収からの回折データを収集し、データセットを分析する。そのような方法によって、フラグメントの成長および最適化に適したメディトープ利用可能抗体上の追加の部位を同定することができる。
NMRを使用して、本明細書において記載されているとおりに最適化して、使用することができる類似体およびフラグメント(例えば、ペプチドフラグメント、非ペプチドベースの小分子)を同定することもできる。一例では、そのようなリード化合物を同定するために、フラグメント、例えば、15〜20のフラグメントを含有するプールの一次元(1D)スペクトルを収集する。一実施形態では、使用されるフラグメントは、非ペプチドベースの小分子である。次いで、メディトープ利用可能抗体を各プールに加えて、第2の1Dスペクトルを収集する。メディトープ利用可能抗体に結合(過渡的に)する化合物を迅速な磁化移動に掛けると、強度の低下が生じる。したがって、一部の態様では、メディトープ利用可能抗体の結合前後のスペクトルを比較し、変化したピークを同定することで、相互作用が示される。これらのピークを具体的な化合物に事前に割り当てることができるので、ピークはすぐに分かるか、またはそのプールを細分して、スペクトルを再収集することができる。数ラウンドの後に、化合物の正確なアイデンティティが分かる。これらの実験では、相互作用の正確な位置は分からない。NMRまたは蛍光偏光アッセイによって、結合部位を決定することができる。別法では、Fabフラグメントを、NMR活性および不活性核(例えば、13C、15Nおよび2H)で標識し、複数回のNMR実験を行って、スペクトルを割り当て、次いで、結合位置を同定するためにフラグメントライブラリと共に使用することができる。
バーチャルリガンドスクリーニングは、リードメディトープ類似体、フラグメント、および他の化合物を同定するために使用することができる別の方法である。結晶構造を使用すると、標準的なプログラム(例えば、Schroerdinger Glide)が、高分子の部位の周囲の「囲み」(メディトープ結合部位)を定義して、既知のリガンドをこの部位にドッキングさせることができる。有望なリード化合物を、選んだエネルギー関数によってスコアリングし、上位50〜200の化合物を購入することができる。本発明者らの当初の研究では、約100種のリード化合物を同定したが、結晶学を使用して、これらのリード化合物がメディトープ部位に結合することの実証を示さなければならない。
本明細書では提供する。そのような方法は、これらに限定されないが、推定されるメディトープまたは小分子のライブラリをメディトープ利用可能抗体と接触させるステップと;推定されるメディトープまたは小分子がメディトープ利用可能抗体にフレームワーク結合インターフェースで結合するかどうかを決定するステップと;1種または複数のメディトープまたはメディトープ類似体候補を同定するステップと;1種または複数の候補の結合親和性を決定するステップと;結合解離定数が0.70μM未満である場合に、候補のうちの1種または複数をメディトープまたはメディトープ類似体として同定するステップとを包含し得る。他の状況では、最小解離定数が指定されている、例えば、0.70μMであるような低親和性メディトープが望ましい。一部の例では、10(または約10)μM未満、5(または約5)μM未満、もしくは2(または約2)μM未満、1(または約1)μM未満、500、400、300、200、100(または約500、400、300、200、100)nm未満、またはそれら未満の結合定数を示したら、その候補をメディトープまたはその類似体と同定する。場合によっては、本明細書に列挙されている解離定数のうちの任意のものなどの解離定数は、SPR、等温滴定熱量測定(ITC)、蛍光、蛍光偏光、NMR、IR、熱量滴定;結合平衡除外;円偏光二色性、示差走査熱分析、または他の知られている方法などの特定の技術を使用して測定されるものである。例えば、場合によっては、類似体またはメディトープは、SPRによって測定した場合に、またはITCによって測定した場合に、またはこれらの方法のうちの任意の方法によって測定した場合に、10(または約10)μM未満、5(または約5)μM未満、もしくは2(または約2)μM未満、1(または約1)μM未満、500、400、300、200、100(または約500、400、300、200、100)nm未満、またはそれら未満の結合定数を示す。
高い特異性および親和性で、セツキシマブのFab領域およびFabフラグメントの中央空洞内に結合するメディトープを発見した。これらのメディトープを、セツキシマブFabに結合させ、その構造を結晶学的に決定した。
試薬
セツキシマブIgGを固定化パパイン(Pierce)と共に温浸し、続いてプロテインAおよびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)で、Superdex 75カラム
(GE Healthcare)で逆精製することによって、セツキシマブの抗原結合フラグメント(Fab)を得た。セツキシマブの単一鎖可変フラグメント(scFvC225)を、軽鎖と重鎖との間の20アミノ酸リンカーで合成した。ScFvC225および可溶性上皮成長因子受容体ドメインIII(sEGFRdIII)を、Sf9細胞で発現させ、既に記載されているとおりに精製した(Donaldson,J.M.、Kari,C.、Fragoso,R.C.、Rodeck,U.およびWilliams,J.C.、Design and development of masked therapeutic antibodies to limit off−target effects: Application to anti−EGFR antibodies. Cancer Biol Ther 8(2009))。
mimotopes and biological properties of induced anti−epidermal growth factor receptor antibodies、J Natl Cancer Inst 97、1663〜70(2005)に記載されているとおりのファージディスプレイバイオパニング実験から単離されたメディトープCQFDLSTRRLKC(cQFD;配列番号1)およびCQYNLSSRALKC(cQYN;配列番号2)をCity of Hope
Synthetic and Polymer Chemistry Core Facilityで合成し、酸化させ、精製した。
セツキシマブFab(5mg/mL)をcQFDおよびcQYNメディトープと1:10のモル比で混合し、Qiagen JCSG Core Suites(IIV)を20℃で使用して、結晶形成をスクリーニングした。2.2Å超で回折した共結晶を100mMのリン酸/クエン酸ナトリウム(pH4.5)、2.5Mのリン酸ナトリウム/カリウム、および1.6%w/vのメソエリトリトール中で成長させた。結晶を14%w/vのメソエリトリトールを介してウィック処理(wicked)し、液体窒素中で急速冷凍した。結晶化試験および当初スクリーニング研究をCity of HopeのX線施設内で実施した。回折データをStanford Synchrotron Radiation Lab(ビームライン9.1および11.1)で収集した。プログラムPhaser(McCoy,A.J.ら、Phaser crystallographic software.、J Appl Crystallogr 40、658〜674 (2007))を使用し、セツキシマブ(pdb:1YY8−鎖AおよびB)のリガンド非結合型構造で(Li,S.ら、Structural basis for inhibition of the epidermal growth factor receptor by cetuximab. Cancer Cell 7、301〜11(2005))、分子置き換えによって初期位相を決定した。2つのFabを非対称単位にMatthews係数3.26、溶媒含有率62.4%で配置した。Zスコア(平均値に対する解の標準偏差)は、ローテショナル・サーチでは27および25、トランスレーショナル・サーチでは38および71であった。第3のFabフラグメントは配置することができなかった(非対称単位格子中のFab3つで、溶媒43%で適正なMatthews係数2.18が生じる)。Coot(Emsley,P.およびCowtan,K.Coot:model−building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60、2126〜32(2004))およびPhenix(Adams,P.D.ら、PHENIX:building new software for automated crystallographic structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 58、1948〜54(2002))を使用して複数回反復し、手動でcQ
FDおよびcQYNメディトープを密度内に構築した。
上述のとおり、セツキシマブFabを作成および精製し、cQFDメディトープ(配列番号1の環式ペプチド)と1:10の比で混合し、市販のファクトリアル(factorials)を使用して、結晶形成をスクリーニングした。20℃で1日後に、結晶が形成した。これらの結晶の初期回折解析によって、単位格子寸法および空間群は、Protein Data Bankに既に寄託されているセツキシマブFab(1YY8.pdb)(Li,Sら、Structural basis for inhibition of the epidermal growth factor receptor by cetuximab. Cancer Cell 7、301〜11(2005))のものと類似していることが示された。寄託された構造中のCDRループが広範な結晶接点を作成しているという観察は、cQFDメディトープが結晶中には存在しないということを示唆し得るであろう。しかしながら、分子置換によって構造を解明し、実験で得られたマップを調査することで、メディトープと一致するモデリングされていない電子密度を同定した。初期Fo−Fcマップは、Fabフラグメントの中央部分を有望な結合部位として明示している(図1)。Fabモデルだけを使用する初期ラウンドの精密化の後、メディトープと一致する連続したモデリングされていない密度が観察された。メディトープを密度に構築すると、RおよびRFreeが低下した。Phenix(Adams,P.D.ら、PHENIX: building new software for automated crystallographic structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 58、1948〜54(2002))を使用する精密化の際に、水分子を付加した。回折データおよび精密化統計値を、以下の表5に示す。
セツキシマブのメディトープ結合部位を、下記で検討するとおりキャラクタライズした。このメディトープ結合部位は独自のものであることが実証され、今日までに調査された
免疫グロブリンにおいて、その存在は見出されていなかった。
上記実施例1において記載したものに加え、以下の材料および方法を使用した。
SPRによるアフィニティー分析を、既に記載されているとおりに(Donaldsonら、2009;Liら、2005、前出)行った。簡潔には、scFvC225またはFabC225(セツキシマブFab)を、アミン化学を用いてCM5チップ上に固定化した。ペプチドまたはsEGFRdIIIの親和性を20℃で平衡法によって測定し、式RU=[Rmax*[L]]/[[L]*Kd]+Roffsetにフィットさせた。Superdex 200 10/300カラム(GE Healthcare社)を用いてSECを行った。タンパク質を混合し、室温で20分間インキュベートし、4℃でカラムに適用した。
メディトープ(配列番号1)とセツキシマブFabとの間の結合部位のインターフェースは、IgG Fabの4つのドメイン全てによって形成されていると決定された(例えば、重鎖および軽鎖の可変ドメイン、軽鎖定常領域、ならびに重鎖CH1)。PISAサーバーを使用すると、cQFDまたはcQYNメディトープ−Fabインターフェースの埋没した表面積は、それぞれ904(±28)Å2および787(±42)Å2であり、軽鎖および重鎖にほぼ等しく分布していた。図2、35、および36に、メディトープと接触すると決定されたFabの残基およびループを示す。
および2.9Å)。しかしながら、cQYNペプチドのTyr3のヒドロキシル基は立体的にArg8側鎖に干渉し(図2B)、cQYNメディトープのArg8と重鎖のAsn105との間の相互作用をブロックする。この観察と一致して、cQYN複合体中のArg8側鎖は両方とも、電子密度マップ中で不明瞭であり、少なくとも2つの異なる回転体をとる(非対称単位中に2つのFab−メディトープ複合体が存在する)。この変化に伴って、バックボーン水素結合パターンのシフトが観察された。cQFDメディトープ中のThr7のアミドカルボニルは、セツキシマブFab軽鎖中のアミドAsn41と水素結合を構成する(dN−H・・・O=C=2.7および2.8Å)。この水素結合は、cQYNペプチドではAsn41のバックボーンのアミドでArg8バックボーンのカルボニルにシフトする(dC=O・・・H−N=3.0および3.1Å)。
メディトープ−セツキシマブFabインターフェースの位置に基づいて、メディトープが非ライゲート構造および/またはライゲート構造に対するIgGドメインの相対配向を妨害するか否かを決定した。初めに、両方のメディトープ複合体の非対称単位格子内の軽鎖および重鎖を比較し、次いで、各鎖を非ライゲート構造およびEGFRライゲート構造と比較した。いずれのメディトープに結合した軽鎖の可変ドメインも、本質的にセツキシマブのリガンド非結合型構造と同一であった(r.m.s.d.平均:cQFD,0.231±0.014Å;cQYN,0.18±0.01Å)。しかしながら、重鎖の可変ドメインは、より大きな相違性を示した(r.m.s.d.平均:cQFD,0.85±0.01Å;cQYN,0.88±0.01Å)。この相違は主に、フレームワーク領域2(残基39〜46)の位置に起因するものであり、これは、この領域中の残基を欠失させて、r.m.s.d.を再計算すると、かなり低い値となるためである(cQFD、0.18±0.01Å;cQYN,0.31±0.01Å)(図6)。加えて、この領域がF
ab C225−EGFR(セツキシマブFab−抗原)共結晶構造中では置き換えられたことが示され、かつその相対B因子値は、これがフレキシブルであることを示唆した(図6)。最終的に、メディトープの存在は、EGFR結合型または非結合型構造に関してCDR構造に有意な変化を与えなかった。EGFR−リガンド結合型構造の重鎖CDRループ3中のTyr98のバックボーンは、いずれのメディトープに結合したFab構造と比較しても反転していることが示され、この反転は、リガンド非結合型セツキシマブFab構造でも観察される(Liら、2005、前出)。
cQFDメディトープ−Fab複合体の構造、さらにはcQYNおよびcQFDの配列同一性に基づき、いくつかの点突然変異をcQFDメディトープ中に作成し(Phe3→Ala、Leu5→Ala、Arg8→Ala、およびLeu10→Ala)、メディトープの全体結合親和性に対するこれらの残基の役割をキャラクタライズした。結合親和性を評価するために、標準的なアミン化学を用いてセツキシマブFabフラグメントをCM5チップにカップリングさせ、表面プラスモン共鳴(SPR)を使用して、様々なメディトープの結合特性を測定した。セツキシマブFabに対する合成cQFDおよびcQYNメディトープの親和性はそれぞれ、950±30nMおよび3.5±0.1μMであると測定された(n=3)。結合反応速度も測定した(図3)。二分子相互作用としてモデリングした場合の会合定数は、cQFDおよびcQYNでそれぞれ4.2(±0.1)×104M−1s−1および1.8(±0.1)×104M−1s−1であった。解離定数は、cQFDおよびcQYNでそれぞれ2.5(±0.1)×10−2s−1および8.6(±0.1)×10−2s−1であった。これらの測定値に基づくKD値(cQFDで430(±30)nMおよびcQYNで3.5(±0.1)μΜ)は、平衡測定とほぼ一致する。
材料および方法
メディトープ利用可能抗体(セツキシマブ)へのメディトープcQFDおよびcQYNなどの結合は、抗原に結合するその抗体の能力に影響を及ぼさないことが実証されたが、このことは、メディトープ利用可能抗体が抗原およびメディトープに同時に結合し得ることを意味している。
セツキシマブFabを、sEGFRdIIIおよびcQFDと共にインキュベートし、分析用SECカラムに適用した。13.9mLにピークが観察されたが、このことは、こ
れら3つの成分の間でヘテロ三量体複合体が形成したことを示している。このピークの非還元SDS−PAGEにより、3つの成分全ての存在が示された(図4B)。比較すると、個々の成分は、15.2mL(Fab C225)、15.6mL(sEGFRdIII)、および16.3mL(SMT−CQFDLSTRRLKC;配列番号1)で溶出された。この結果は、メディトープおよびEGFRがセツキシマブに同時に結合し得たことを示しており、このことは、このメディトープ結合が、セツキシマブによる抗原結合を塞がなかったことを示している。
メディトープがCDRに結合しないことをさらに確認するために、cQFDメディトープとセツキシマブのscFvフラグメントとの間の結合を評価した。scFvでは、CDRループは無傷のままであるが、Fab可変ドメインは短鎖ペプチドリンカーを介して直接結合しており、Fab定常ドメインは除去されている。言い換えると、scFvではメディトープ結合ポケットの多くが除去されており、CDRは最小限の影響しか受けていない。SPRは、EGFRドメインIIIおよびcQFDメディトープがCM5チップにテザーされたセツキシマブFabに結合することを実証した(図4Dを参照されたい)。加えて、EGFRドメインIIIは、第2のCM5チップにテザーされたscFvに、最小限の親和性の低下で結合した。しかしながら、Fab結合に比較して、cQFDメディトープは、100μMという高濃度のメディトープでもscFvを飽和しなかった。これは、CDRに対するメディトープの親和性が(あったとしても)最小限であることを示しており、結晶学的研究と一致している。
上記のとおり、セツキシマブFabは、cQFDメディトープおよびEGFRドメインIIIに同時に結合し得た。さらに、このメディトープは、セツキシマブ(全長IgG)のEGFR発現細胞への結合に影響を及ぼさないことが示された。FACS分析を使用して、メディトープ濃度を関数として、IgGのMDA MB−468細胞(EGFRを過剰発現する)への結合を追跡した。細胞を、漸増濃度のcQFDメディトープの存在下でセツキシマブと共にインキュベートした。60μMを超えるメディトープ濃度でも、セツキシマブの細胞への結合に有意な変化は観察されなかった。この観察は上記のSEC研究と一致しており、メディトープが抗原結合のアロステリック調節剤として作用しないことを示している。
ディトープのKDより有意に高い濃度で示されている。cQFDおよびcQYNメディトープと同様に、スーパー抗原SpAおよびPpLはFabフレームワーク領域に結合し、抗原結合に影響を与えない(Graille,M.ら、Crystal structure of a Staphylococcus aureus Protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody:structural basis for recognition of B−cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A 97、5399〜404(2000));Graille,M.ら、Complex between Peptostreptococcus magnus
Protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure 9、679〜87(2001);Young,W.W.,Jr.、Tamura,Y.、Wolock,D.M.およびFox,J.W.、Staphylococcal
Protein A binding to the Fab fragments of mouse monoclonal antibodies. J Immunol 133、3163〜6(1984);Graille,M.ら、Evidence for plasticity and structural mimicry at
the immunoglobulin light chain−Protein L interface. J Biol Chem 277、47500〜6(2002)を参照されたい)。
Fab上のメディトープ結合部位は、Fabのフレームワーク領域に結合する他のタンパク質のものとは別である。例えば、Staphylococcus aureusから単離されたプロテインAのドメインDは、ヒトIgGの重鎖(VH)のフレームワークに結合し;Peptostreptococcus magnusから単離されたプロテインLのB1ドメインは、ヒトIgGのκ軽鎖(VL)のフレームワーク領域に結合し;かつStreptococcal株から単離されたプロテインGのドメインIIは、ヒトIgGの重鎖(VC)のフレームワークに結合する。インターフェースが、溶媒に曝露される単一Fabドメインに主に限られるこれらの相互作用とは異なり、メディトープ−Fabインターフェースは、4つのドメイン全て(例えば、重鎖および軽鎖の可変および定常ドメイン)によって形成されることが示された。
メディトープを、マウスキメラ化またはメディトープ利用可能ヒトmAbの軽鎖または重鎖N末端いずれかのN末端に、フレキシブルなリンカーを介してテザーすることができる(図11)。mAb IgGのN末端は抗原結合部位と並列しており、フレキシブル・リンカーを介するN末端からの伸長によって抗原結合は立体的に妨害される。リンカー内に腫瘍特異的プロテアーゼ部位(例えば、MMP9、MMP14、前立腺特異的抗原(P
SA)セリンプロテアーゼ、または他の好適な部位)をコードさせることによって、分子内「マスキングされた」IgGコンストラクトの立体的な制約が腫瘍部位で切断され、抗体結合が可能となる。この設計原理では、分子内「マスキングされた」IgGの正常組織への結合が回避され、オフターゲット結合による有害な副作用が回避される。セツキシマブ上のアビジン−ペプチドマスクのオフレート決定は、多価メディトープが一価メディトープより高い親和性で結合するが、マスキングはしないことを示した。
構造情報に基づき、追加のメディトープ利用可能抗体を作成した。
トラスツズマブを変異させることによって、メディトープ利用可能HER2結合抗体を作成した。セツキシマブのものと比較した場合の、ヒトIgG(トラスツズマブ−1N8Z.pdb)の重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク領域の間での配列の相違を、cQFDメディトープに結合しているセツキシマブFabの結晶構造上にマッピングした。セツキシマブ中のメディトープ結合部位をライニングしている残基に対応するヒトフレームワーク中の残基を変異させて、セツキシマブ中に存在する対応する残基を含有するようにした;加えて、Kabatナンバリングに従うと軽鎖のS9およびS10をそれぞれイソロイシンおよびロイシンに変異させた。図23Aおよび23Cは、変異型(メディトープ利用可能)トラスツズマブの重鎖(配列番号5)および軽鎖(配列番号8)の一部の核酸配列をそれぞれ示している。図23Bおよび23Dは、メディトープ利用可能トラスツズマブの重鎖(配列番号6)および軽鎖(配列番号9)の一部のアミノ酸配列をそれぞれ示している。図23Bおよび23Dは、これらのアミノ酸配列と、野生型トラスツズマブの重鎖および軽鎖の一部のアミノ酸配列(それぞれ配列番号7および配列番号10)との比較も示している。
抗原結合をキャラクタライズするための研究の一つにおいて、標準的なプロトコルを使用して、野生型トラスツズマブおよびメディトープ利用可能トラスツズマブをAlexa
647で標識した。同じプロトコルを使用して、cQFD(配列番号1)メディトープ−Fc融合タンパク質(実施例7に記載されていて、図15および16に示されているとおりに生成)をAlexa488で標識した。メディトープ−Fcが、メディトープ利用可能トラスツズマブには結合し、野生型トラスツズマブには結合しないことを示すために、HER2を過剰発現するSKBR3細胞(0.5×106)を、標識された野生型およびメディトープ利用可能トラスツズマブと共に30分間インキュベートした。未結合の抗体を洗い出し、その細胞をメディトープ−Fcコンストラクトと共に30分間インキュベートした。抗体結合およびメディトープ結合をFACS分析によって分析した。FACSデータによって、メディトープ利用可能トラスツズマブは、SKBR3細胞で発現されるHER2に結合すること(例えば、そのメディトープ部位は、抗原特異性を低下させることなく、抗体上にグラフト化され得る)(図22A)、およびメディトープ−Fcは、メディトープ利用可能トラスツズマブには結合するが、野生型トラスツズマブには結合しないこと(図22B)が実証された。
ラスツズマブをAlexafluor 488で標識した。SKBR3細胞(0.5×106)をトリプシン処理し、0.1%のBSAで1回洗浄し、1、10、または100nMの野生型またはメディトープ利用可能トラスツズマブと共に30分間インキュベートした。未結合の抗体を2回洗浄し、フローサイトメトリーによって解析した。結果を図43に示すが、これは、メディトープ利用可能トラスツズマブが、野生型トラスツズマブと同様の、抗原発現細胞に対する同様の親和性を有したことを実証している。
、問題にならないと決定された。下段のパネルは、重ね合わせた3つの構造全ての「イラスト/リボンダイアグラム」図であり、全体に有意な相違がないことが実証されている。CDRループにおいて多少の相違が観察されたが、これは、予期されたとおりである(これらの抗体が異なる抗原に結合することによる)。
他の研究によって、細胞を抗体と事前に結合させたか(逐次的)、または事前に形成させたメディトープ−抗体複合体(事前混合)を細胞に適用したかにかかわらず、同様の効率で、メディトープはメディトープ利用可能トラスツズマブに結合することが実証された。結果を図46に示す。この研究では、SKBR3細胞をトリプシン処理し、0.1%のBSAで1回洗浄し、次いで、10nMのメディトープ利用可能トラスツズマブ(TM)と共に30分間インキュベートし、洗浄し、次いで、4、20、または100nMのMPL(左側のパネル)と共にさらに30分間インキュベートした。別法では、10nMのTMを4、20、または100nMのMPLと共に氷上で30分間事前に混合し、続いて、その混合物を細胞に1時間適用した(右側のパネル)。細胞を2回洗浄し、FACSによって分析した。無処置対照に対するMPL陽性細胞のパーセンテージを、説明文中に示す。
トラスツズマブのCDRをセツキシマブ上にグラフト化することによって、メディトープ利用可能HER2結合抗体を作成した。
加えて、セツキシマブの残基に対応する残基を変異させることによって、抗CEA抗体(M5A)をメディトープ利用可能化した。具体的には、図56において網掛けで示されているとおり、8つの点突然変異を、M5A抗体の軽鎖に導入して、これがメディトープに結合し得るようにした。野生型重鎖配列およびメディトープ利用可能軽鎖配列を、Lonzaグルタミン選択発現ベクターにクローニングし、かつ、NS0細胞にトランスフェ
クトした。メディトープ利用可能mAbを約5mg/Lで発現する2つの安定な系が得られた。
例えば、縮重ライブラリおよび選択を使用して、セツキシマブなどの提供するメディトープ利用可能抗体の1つまたは複数のメディトープ結合部位をライニングしている残基を体系的または無作為に改変して、メディトープまたはメディトープ類似体の特異性を増強または変化させる(改変を行う方法については、Sheedyら、2007およびAkamatsuら、2007を参照されたい)。これらの位置にある残基を、天然もしくは非天然アミノ酸または両方で置換して、例えば、メディトープ相互作用の親和性を向上させ、かつ/またはメディトープ−抗体相互作用の他の特性を改変する。
メディトープ利用可能トラスツズマブが、下記の実施例10に記載されているとおりに生成されたメディトープ−プロテインL(MPL)に結合したことを示している。この研究では、1×106細胞/試料を使用した。穏やかなピペット処理によって、細胞をプレートから外し、PBS中0.1%のBSA(w/v)で1回洗浄した。AF647 MPLを洗浄緩衝液中で10nMに希釈し、細胞と共に室温で30分間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、次いで、FACSによって分析した。
いくつかの変異型メディトープを作成した。例えば、セツキシマブに対する結合親和性が実証されている表3および4(上記)のいくつかのメディトープ変異体を合成した。表3中のペプチドでは、CおよびN末端を接続するために、ジスルフィド結合を使用した(追加のテールを含有するメディトープ31は除くが、これは、2つの末端残基の間にジスルフィド結合が存在しないことを意味している)。メディトープ26、27、28、および29は生合成されるので、この実施例では、第1のシステインの前、即ち、0位に追加のセリンを含有した。さらに、一部の実施形態では、メディトープ31は場合によって、GGSKリンカーを包含してよい。表4中のペプチドでは、ラクタム橋、ジスルフィド以外の結合([3+2]付加環化など)、または結合なしが、コネクタとして使用された。例えば、メディトープ55は、メディトープ結合部位内で結合している線状ペプチドである。これらの表中の個々のメディトープを以下で検討する。
構造的および熱力学的データに基づき、提供するメディトープ内の複数の位置を、例えば、全体結合親和性を増強し、かつ/または他の特性を改変するために例えば、置換および/または非天然アミノ酸で修飾するためのターゲットとして同定した。修飾には、ヘッドトゥテール環式ラクタムペプチドの作成、Arg8の修飾、Phe3の修飾、Leu5の修飾、Leu10の修飾、および水和性カルボニル官能基の組み込みが包含される(図31を参照されたい)。
Arg8を修飾した。構造データに基づき、未修飾のメディトープ(cQFD;配列番号1)のArg8を伸長させて、メディトープ利用可能抗体重鎖のQ105の重鎖カルボニルと水素結合させることを決定した。この残基のすぐ周囲の領域は疎水性であり、なお溶媒に曝露される(図33A)。
)、4.61(d,J=5.4Hz,2H)、4.44〜4.30(m,3H)、4.16(t,J=6.4Hz,1H)、3.30〜3.02(m,4H)、2.92(s,2H)、2.54(s,3H)、2.48(s,3H)、2.07(s,3H)、1.98
〜1.80(m,1H)、1.76〜1.50(m,3H)、1.45(s,6H)、1.36〜1.26(m,4H)、0.85(t,J=7.2Hz,3H);13C NMR(100MHz,CDCl3)δ 171.9、158.7、156.4、155.0、144.0、143.8、141.5、138.5、133.8、132.4、131.5、128.0、127.3、125.2、124.6、120.3、119.6、117.6、86.5、67.4、66.5、53.3、47.3、43.5、41.5、41.0、30.9、30.7、28.8、25.4、20.2、19.5、18.2、13.9、12.7; HRMS C41H52N4O7S [M+Na]+ 計算値 767.3449、実測
値。767.3455。
4(m,2H)、7.40〜7.34(m,2H)、7.30〜7.24(m,2H)、5.95〜5.83(m,1H)、4.48
〜4.10(m,5H)、3.30〜3.02(m,4H)、2.90(s,2H)、2.58(s,3H)、2.50(s,3H
)、2.07(s,3H)、2.00〜1.86(m,1H)、1.86〜1.74(m,1H)、1.72〜1.60(m,2H)、1.45(s,6H)、1.30〜1.22(m,4H)、0.82(t,J=7.2Hz,3H);13C NMR(100MHz,CDCl3)δ 174.9、158.9、156.6、155.2、144.0、143.8、141.5、138.5、133.3、132.4、129.3、128.5、128.0、127.3、125.3、124.8、120.2、117.7、86.6、67.4、53.4、47.4、43.4、41.6、41.1、31.4、29.9、28.8、25.2、20.1、19.5、18.2、13.9、12.7;HRMS C38H48N4O7S [M+Na]+ 計算値 727.3136、実測値。727.3144。
cQFDのPhe3を様々に修飾した。構造データによって、メディトープ変異体Phe3Tyr cQYN(配列番号2)のヒドロキシル基は、cQFD(メディトープ1)と比較して、Arg8側鎖の伸長構造に改変を有することが実証された(図30Cおよび35を参照されたい)。SPRによって、セツキシマブFabに対するこの変異体の全体親和性が低下したことが実証された。ITC測定によって、未修飾のメディトープ(配列番号1)と比較して、このPhe3Tyr cQYN変異体では、結合すると、エントロピーがかなり低下することが示されたが、これは、エンタルピーの有利な上昇によって相殺された(−2.1kCal/molから−7.9kCal/molへ[n=3])(図30D)。構造データによって、水がFabに結合している有利な水素結合ネットワーク
の形成が示唆されている。
Leu5およびLeu10を修飾した。Leu5およびLeu10側鎖は、メディトープ利用可能Fabに対する疎水性接点を構成することが決定された(図36、右側のパネル;Leu10)。一例では、天然アミノ酸(Phe/Tyr/Trp)および/または非天然類似体(例えば、β,β’−ジフェニルアラニン、分枝アルキル、ナフチルなどの伸長芳香族など)を体系的に、SPPSを介して、これらの位置の一方または両方に導入する。β,β’−ジフェニルアラニンを3位に導入すると、セツキシマブFabに対する全体親和性が上昇するという上記の観察(図41〜42を参照されたい)は、そのような非天然アミノ酸をメディトープに導入することによる成功を実証した。したがって、β,β’−ジフェニルアラニンを5位に導入し、生じたメディトープ(メディトープ18、配列番号18)の平均親和性をSPRによって、687nMであると決定した(以下の表7を参照されたい)。これらのデータによって、残基を改変および変異させるための領域を同定するために、構造生物学を使用することは、その結合反応速度を向上させるためなど、メディトープの特徴を改変するために有用であることが確認される。別の実施形態では、Leu10を同様に修飾することができる。
別の環化ストラテジーを使用して、cQFDおよび他のメディトープ中のジスルフィド架橋を置き換えた。表4に示したとおり、種々のラクタム環サイズを生成するためにグリシン、β−Ala、7−アミノヘプタン酸、ジアミノプロピオン酸、およびイソアスパラギン酸を包含する種々の出発物質に基づき作成される、天然および非天然アミノ酸を含むものを包含する様々なラクタム環化ストラテジーを使用した(図31の左側および中央の囲みを参照されたい)。
ド架橋を置き換え、かつ生じたメディトープの、セツキシマブFabフラグメントに対する親和性をSPRによって決定した(メディトープ42、配列番号42)。SPRデータを図41の下段のパネルに示す。結合親和性は、cQFDと比較すると低下したが、これらのデータは、動物およびヒト研究において薬物速度、薬物動態、および毒性について起こり得る問題に対処するために、メディトープを修飾することができることを示している。別のリンカーを非天然アミノ酸と、メディトープ内の他の位置で組み合わせることができることに注意する。
他の例では、水和性カルボニル機能(capabilities)を備えたメディトープを開発して、高度に選択的であるが、不可逆的な相互作用を得る。メディトープ空洞を囲むメディトープ利用可能抗体中のいくつかのFabヒドロキシル担持側鎖を、選択的なトラッピングを介して、水和性−可能化メディトープを使用する、その対応するヘミ−アセタールまたは−ケタールの形成によって利用する。例えば、メディトープのArg8を、Kabatナンバリングに従うとメディトープ利用可能抗体軽鎖のSer43(3.5Å)および重鎖のTyr91(3.8および4.0Å)付近まで伸長する(図36、左のパネル)。一例では、水和性カルボニル官能基をメディトープのArg8またはLeu10の末端に組み込むことで、セリンまたはチロシンヘミ−アセタールを選択的に形成することができ、これによって、不可逆的な結合が本質的に得られる。別の実施例では、ボロ
ン酸を含有する残基を水和性カルボニル基の代わりとして、メディトープに組み込む。ボロン酸は、多発性骨髄腫を治療するために使用されるボルテザミブ(Velcade(登録商標))の構造活性において重要な役割を果たす。そのような水和性残基の代表的な例は、図36または34にも示してあり、ここで、R=−CH2CHOまたは−CH2B(OH)2である。一部の例では、SPPSを使用して、そのような類似体を修飾する(Duggan,P.J.およびD.A.Offermann(2007)、「The Preparation of Solid−Supported Peptide Boronic Acids Derived from 4−Borono−L−phenylalanine and their Affinity for Alizarin」、Australian Journal of Chemistry、60(11):829〜834)。
一部の例では、蛍光偏光アッセイを使用して、配列番号1などの所与のメディトープに代わり得るメディトープ変異体を同定することができる。他の例では、同じ技術を使用して、そのメディトープに代わり得る小分子を同定し、次いで、これらの小分子を、メディトープの結合親和性をさらに向上させるためのテンプレートとして使用する。
キャラクタリゼーションのために、変異型メディトープペプチドの凍結乾燥粉末を10mMのトリスpH8.0緩衝液500μL中に懸濁させ、かつ各回H2O1Lに3回透析した。透析後の最終体積を慎重に測定し、かつ吸光度測定を行って、濃度を推定した(典型的には、1〜10mM)。これらの保存液を使用して、SPR測定のためのHBS−EP緩衝液(10mMのHepes、pH7.4、150mMのNaCl、3mMのEDTA、および0.05%v/vの界面活性剤P20)中で希釈した。SPR測定をGE Biacore T100機器で、アミンカップリング化学を使用して固定化されたセツキシマブIgGまたはセツキシマブFabリガンドを備えたCM5チップを使用して実施した。反応速度データに適した低レベルで、リガンドを固定化した。ランニング緩衝液および再生緩衝液の両方としてHBS−EPを使用して、典型的な反応速度SPR実験を30μL/分の流速で実施した。Biacore T100評価ソフトウェアのバージョン2.0.1を使用して、反応速度パラメーターを算出した。
Instruments)を使用して、等温滴定熱量測定実験を行った。典型的な実験では、0.03〜0.06mMのタンパク質(FabまたはIgG)250μlを熱量計セル(163μlまたは185μl)を負荷し、滴定液(0.3〜0.8mMのメディトープ)を50μlシリンジに負荷した。セル溶液を250rpmで撹拌し、平衡したら、滴定液を2〜2.5μl刻みで加えた。反応物の熱を測定し、NanoAnalyzeソフトウェア(TA Instruments)を使用して、データを処理した。最後の4つの測定を平均することによって、またはタンパク質を含有しない緩衝液中に同じ濃度のメディトープを滴定することで得られた反応物の熱を引くことによって、バックグラウンド熱を引いた。
Kaに基づく計算によって、セツキシマブに対するメディトープのマイクロモルからナノモルまでの親和性の相違は、強い水素結合程度に基づく300Kでの約4kCal/molの自由エネルギーの変化から生じていることが示されている。したがって、タンパク質結合ポケットから、整列していた水分子が失われるか、またはアミノ酸残基鎖が再配向するだけでも十分に、結合は数桁変わり得る。
例えば、メディトープ利用可能抗体を、抗原を発現する細胞の表面に「架橋する」ことによって選択性および/または結合親和性を増強する際に使用するために、二価および他の多価メディトープを作成した。
リガンドを「二量体化」するためのFc領域の使用は確立されており、例えば、Jazayeri JAおよびCarroll GJ.、「Fc−based cytokines: prospects for engineering superior therapeutics」、BioDrugs、22(1):11〜26(2008)に記載されている。二価メディトープを作成するために、グリシンおよびセリンからなる17アミノ酸長さのフレキシブルなペプチドリンカーを介して、メディトープcQFD(配列番号1)をIgGのFc領域のN末端に融合した。IgGのFab間の距離におおむね一致するように、リンカーの長さを選択した。生じた「メディトープ−Fc」の核酸およびアミノ酸配列を図15に示す(それぞれ配列番号3および4)。メディトープ−Fcの構造を図16に示す。
インとの間に設ける。ある種の実施例では、リンカーの組成は、起こり得る抗原性を軽減するために、例えば、ヒト由来のものである。
リンカー上での受容体の制約に対処するために、メディトープを多価スキャフォールドにカップリングさせた。
一例では、多価スキャフォールドへのコンジュゲーションがメディトープ−IgG相互作用に影響を及ぼさないことを立証するために、多価メディトープをSPRおよびITCによってキャラクタライズする。
メディトープの組成を改変して、pHを関数とする結合親和性に影響を与える。図27に示されているとおり、3つの異なるメディトープ変異体の結合親和性を、緩衝液pHを関数として測定した。結果によって、cQYD(配列番号16、メディトープ16)メディトープ変異体は、低pHで、メディトープ利用可能抗体セツキシマブに対する親和性の著しい低下を示すことが実証された。cQYN変異体中のアスパルタートをアスパラギンに置換すると、pH依存性はフラットになる。cQFDメディトープ(配列番号1)の親和性は、pHが高くなるにつれて、わずかに上昇すると決定された。総合すると、これらのデータは、メディトープ−memAb相互作用の親和性を、使用されるpHに合わせて調整して、薬物送達のために、リゾチーム中においてなどの低pHでは特異的に放出され、かつ/または例えば、腫瘍間質などの低酸素環境においてはより高い親和性で結合するメディトープ変異体を作成することができることを実証している。
メディトープ利用可能抗体にメディトープ結合部位付近で結合し、かつ一部の態様では、メディトープに結合して、例えば、メディトープ結合部位へのその親和性を向上させ得る小分子、フラグメント、アプタマー、核酸分子、ペプチボディ、および/または他の物質などのメディトープ類似体および化合物を同定するために、スクリーニング方法を実施した。
互作用は、蛍光タグの蛍光偏光/強度を変化させる。ほぼ一致する値である解離定数、1μMが、表面プラスモン共鳴および等温滴定熱量測定から得られた。非標識メディトープ、AcCQFDLSTRRLRCGGGSK(配列番号31)を使用して、セツキシマブに事前結合していたフルオレセイン標識ペプチドを置き換えた。蛍光偏光をモニタリングした。メディトープ−抗体の相互作用をブロックした化合物は蛍光偏光特性を変えた。図37に示されているとおり、競合反応を示すS字状曲線が観察された。したがって、この方法は、メディトープ類似体を同定するために有用である。
セツキシマブFabは、上記で示した通り、2.5Å超で回折することが示された。確立されている回折をベースとする方法(リード化合物を同定するために十分に確立されている(Shukerら、1996;Erlansonら、2001;Hughesら、2011))を使用して、メディトープにカップリングさせて、例えば、メディトープ結合部位に対する親和性を向上させ得る化合物を包含する候補化合物を同定した。小分子のライブラリは、セツキシマブの結晶中に吸収されることが明らかになった。これらの吸収からの回折データを収集し、いくつかのデータセットを解析した。これらの当初研究で、フラグメント成長および最適化のために修正することができる2つの追加の部位をセツキシマブ上で同定した。
NMRを使用して、例えば、メディトープに結合し、かつ/またはメディトープの代わりに(すなわち、メディトープ類似体として)使用することによってメディトープを最適化するためのフラグメントを同定した。これらのリード化合物を同定するために、15〜20のフラグメントを含有するプールの一次元(1D)スペクトルを収集した。セツキシマブを各プールに加えて、第2の1Dスペクトルを収集した。セツキシマブに(過渡的に)結合した化合物を、迅速な磁化移動に掛けると、強度の低下が生じた。セツキシマブの付加前後のスペクトルを比較すると、ピークの変化が同定され、これは相互作用を示した。
メディトープに結合しているcQFDメディトープ利用可能Fabフラグメントの回折によるキャラクタリゼーションによって、メディトープのN末端およびC末端は、結合しているプロテインL、ヒトIgGに結合する細菌性タンパク質と並列していることが実証された。メディトープ18(5−β,β’−ジフェニル)、プロテインL(左側)、プロテインA(右側)、およびFab(灰色のイラスト)、およびメディトープ利用可能トラスツズマブFabの結晶構造を示している図52を参照されたい。
HHHHHHSSGLVPRGSHMASMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGSCQFDLSTRRLKCGGGGSEVTIKVNLIFADGKIQTAEFKGTFEEATAEAYRYAALLAKVNGEYTADLEDGGNHMNIKFAG(配列番号57)
で示される。
SCQFDLSTRRLKCGGGGSEVTIKVNLIFADGKIQTAEFKGTFEEATAEAYRYAALLAKVNGEYTADLEDGGNHMNIKFAG(配列番号58)
(メディトープは下線付き;環化(例えば、ペルオキシドまたは空気中で一晩によって)している2個のシステインは太字で表示)で示される。
L)についての表面プラスモン共鳴(SPR)データを示しており:上段のパネルは、10nMまでの濃度でメディトープ利用可能トラスツズマブに加えられたMPLのトレースを示している。フィットデータは、165pMの結合親和性を示している。下段のパネルは、メディトープ利用可能トラスツズマブに同じ濃度で加えられたプロテインL(単独)のトレースを示しており、これは、この研究において、この濃度では結合が存在しなかったことを示している。この結果によって、個々の相互作用と比較して、融合タンパク質とメディトープ利用可能抗体との間の結合ははるかに強いことが実証されたが、このことは、加算性を介して、親和性が向上することを示している。
様々な比(0.5:1、2:1、10:1、30:1、60:1、120:1、240:1)の出発物質(DOTA−NHS:MPL)を用いて、リン酸緩衝液(80mM)中、10分間で、N末端コンジュゲーションと比較して、リシンへのコンジュゲーションに好ましいpH=10で実施される反応で、配列番号59で示される配列を有するMPLをDOTA−NHSにコンジュゲートした。DOTA−NHSが増加するにつれて、モノ−DOTA−コンジュゲート生成物は増加する。かなりの量のMPL−モノ−DOTA−MPLが60:1の比で形成され、かつかなりの量のMPL−モノ−DOTAおよびMPL−ジ−DOTAの両方が120:1の比で形成された(図60)。
以下及び上記本明細書中で引用したすべての参考文献は、ここに完全に記載したように、参照としてその全体を本明細書に組み入れるものとする。
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Claims (115)
- 重鎖可変(VH)領域および軽鎖可変(VL)領域を含む単離されたメディトープ利用可能抗体またはそのフラグメントであって:
VL領域が、Kabatナンバリングに従うと40位にトレオニン、セリンまたはアスパルタート、41位にグリシン以外の残基、および85位にアスパルタートまたはアスパラギンを含むアミノ酸配列を有し;
抗体またはフラグメントが、セツキシマブが特異的に結合するEGFRのエピトープに特異的に結合せず;かつ
抗体またはフラグメントが、配列番号1、2、16〜18、23、29、31、32、36、39、42、43、45、46、51、52、54、もしくは55で示される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド、またはそれに由来する環式ペプチドであるメディトープに結合する、単離されたメディトープ利用可能抗体またはそのフラグメント。 - VH領域が、Kabatナンバリングに従うと40位にセリンまたはプロリン、および89位にイソロイシン、チロシン、メチオニン、フェニルアラニン、またはトリプトファンを含むアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のメディトープ利用可能抗体またはフラグメント。
- VL領域のアミノ酸配列が、Kabatナンバリングに従うと10位にイソロイシンまたはロイシン、および83位にイソロイシンをさらに含む、請求項1または2に記載のメディトープ利用可能抗体またはフラグメント。
- VL領域のアミノ酸配列が、Kabatナンバリングに従うと9位にバリンまたはイソロイシン、および100位にグルタミン以外の残基をさらに含む、請求項1から3のいずれかに記載のメディトープ利用可能抗体またはフラグメント。
- VL領域のアミノ酸配列が、Kabatナンバリングに従うと40位にトレオニン、41位にアスパラギン、および85位にアスパルタートを有する、請求項1から4のいずれかに記載のメディトープ利用可能抗体またはフラグメント。
- VH領域のアミノ酸配列が、Kabatナンバリングに従うと40位にセリン、および89位にイソロイシンを有する、請求項1から5のいずれかに記載の抗体またはフラグメント。
- VL領域のアミノ酸配列が、Kabatナンバリングに従うと9位にバリンまたはイソロイシン、10位にイソロイシンまたはロイシン、39位にアルギニン、40位にトレオニン、41位にアスパラギン、42位にグリシン、43位にセリン、83位にイソロイシン、85位にアスパルタート、および100位にアラニンを有し;かつ
VH領域のアミノ酸配列が、Kabatナンバリングに従うと40位にセリンおよび89位にイソロイシンを有する、請求項1から6のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。 - 重鎖可変(VH)領域および軽鎖可変(VL)領域を含む単離された抗体またはそのフラグメントであって、
VL領域が、配列番号71または配列番号61で示される軽鎖配列の軽鎖フレームワーク領域(FR)1(FR−L1)、FR−L2、FR−L3、およびFR−L4ならびに配列番号71で示される軽鎖配列のCDRとは別である少なくとも1つのCDRを含むアミノ酸配列を有し;かつ
VH領域が、配列番号72または配列番号63で示される重鎖配列の重鎖FR1(FR−H1)、FR−H2、FR−H3、およびFR−H4を有するアミノ酸配列ならびに配列番号72で示される重鎖配列のCDRとは別である少なくとも1つのCDRを有する、単離された抗体またはそのフラグメント。 - 配列番号71で示される軽鎖配列のCDRとは別である少なくとも1つのCDRが、配列番号61で示される軽鎖配列のCDRを包含し;かつ
配列番号72で示される重鎖配列のCDRとは別である少なくとも1つのCDRが、配列番号63で示される重鎖配列のCDRを包含する、請求項8に記載の抗体またはフラグメント。 - VLが、配列番号76のアミノ酸配列を含み、かつVHが、配列番号77のアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の抗体またはフラグメント。
- 重鎖可変(VH)領域および軽鎖可変(VL)領域を含む単離された抗体またはそのフラグメントであって:
VL領域が、配列番号9で示される軽鎖配列の軽鎖フレームワーク領域(FR)1(FR−L1)、FR−L2、FR−L3、およびFR−L4を含むアミノ酸配列を有し;かつ
VH領域が、配列番号6で示される重鎖配列の重鎖FR1(FR−H1)、FR−H2、FR−H3、およびFR−H4を有するアミノ酸配列を有する、単離された抗体またはそのフラグメント。 - VL領域が、配列番号9で示されるVL配列のCDRとは別である少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含み;かつ
VH領域が、配列番号6で示されるVH配列のCDRとは別である少なくとも1つのCDRを含む、請求項11に記載の抗体またはそのフラグメント。 - VL領域が配列番号73のアミノ酸配列を含み;かつ
VH領域が配列番号74のアミノ酸配列を含む、請求項11に記載の抗体。 - 重鎖可変(VH)領域および軽鎖可変(VL)領域を含む単離された抗体またはそのフラグメントであって、
VL領域が、配列番号68で示される軽鎖配列の軽鎖フレームワーク領域(FR)1(FR−L1)、FR−L2、FR−L3、およびFR−L4を含むアミノ酸配列を有する、単離された抗体またはそのフラグメント。 - VL領域が、配列番号69で示される軽鎖配列のCDRとは別である少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含み;
VH領域が、配列番号70で示される重鎖配列のCDRとは別である少なくとも1つのCDRを含む、請求項14に記載の抗体またはそのフラグメント。 - VL領域が、配列番号75のアミノ酸配列を含む、請求項14に記載の抗体。
- 配列番号1、2、16〜18、23、29、31、32、36、39、42、43、45、46、51、52、54、もしくは55で示される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するメディトープ、またはそれに由来する環式ペプチドに結合する、請求項8から16のいずれかに記載の抗体またはフラグメント。
- 表面プラスモン共鳴(SPR)によって決定した場合に10μM未満の解離定数で、メ
ディトープに結合する、請求項1から7および17のいずれかに記載の抗体またはフラグメント。 - 解離定数が5μM未満である、請求項18に記載の抗体またはそのフラグメント。
- 解離定数が2μM未満である、請求項19に記載の抗体またはフラグメント。
- メディトープが、配列番号1または2で示されるアミノ酸配列のペプチドに由来する環式ペプチドである、請求項1から7および17から20のいずれかに記載の抗体またはフラグメント。
- 重鎖可変(VH)領域および軽鎖可変(VL)領域を含む単離された抗体またはそのフラグメントであって、
SPRによって決定した場合に10μM未満の解離定数でメディトープに結合し、その際、メディトープは、配列番号1または2のアミノ酸配列を有するペプチドに由来する環式ペプチドであり;かつ
セツキシマブが特異的に結合するEGFRのエピトープに特異的に結合しない、単離された抗体またはそのフラグメント。 - VL領域が、Kabatナンバリングに従うと40位にP、41位にG、または85位にTを含有せず、かつVH領域が、Kabatナンバリングに従うと40位にNもしくはA、または89位にVを含有しない、請求項22に記載の抗体またはフラグメント。
- VL領域が、Kabatナンバリングに従うと10位にS、40位にP、41位にG、83位にF、または85位にTを含有せず、かつVH領域がKabatナンバリングに従うと40位にNもしくはA、または89位にVを含有しない、請求項22または23に記載の抗体またはそのフラグメント。
- ヒト定常領域をさらに含む、請求項1から24のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。
- アバゴボマブ、アブシキシマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、ペンテト酸アルツモマブ、アナツモマブ、アナツモマブマフェナトクス、アルシツモマブ、アトリズマブ、バシリキシマブ、ベクツモマブ、エクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、カプロマブ、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、セルトリズマブ、クリバツズマブテトラキセタン、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エタラシズマブ、エルツマキソマブ、ファノレソマブ、Fbta05、フォントリズマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、メポリズマブ、ムロモナブ、ムロモナブ−CD3、ナタリズマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、サツモマブ、スレソマブ、イブリツモマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、Trbs07、ウステキヌマブ、ビシリズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ブロダルマブ、アンルキンズマブ、バピヌズマブ、ダロツズマブ、デムシズマブ、ガニツマブ、イノツズマブ、マブリリムマブ、モキセツモマブパスドトックス、リロツムマブ、シファリムマブ、タネズマブ、トラロキヌマブ、トレメリムマブ、ハイブリドーマ10B5によって産生される抗体、およびウレルマブからなる群から選択される抗体または抗体フラグメントと、抗原結合について競合するか、またはそれらと同じエピトープに結合する、請求項1から25のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。
- アバゴボマブ、アブシキシマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、ペンテト酸アルツモマブ、アナツモマブ、アナツモマブマフェナトクス、アルシツモマブ、アトリズマブ、バシリキシマブ、ベクツモマブ、エクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、カプロマブ、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、セルトリズマブ、クリバツズマブテトラキセタン、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エタラシズマブ、エルツマキソマブ、ファノレソマブ、Fbta05、フォントリズマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、メポリズマブ、ムロモナブ、ムロモナブ−CD3、ナタリズマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、サツモマブ、スレソマブ、イブリツモマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシリズマブ、トシツモマブ、Trbs07、ウステキヌマブ、ビシリズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ブロダルマブ、アンルキンズマブ、バピヌズマブ、ダロツズマブ、デムシズマブ、ガニツマブ、イノツズマブ、マブリリムマブ、モキセツモマブパスドトックス、リロツムマブ、シファリムマブ、タネズマブ、トラロキヌマブ、トレメリムマブ、ハイブリドーマ10B5によって産生される抗体、およびウレルマブからなる群から選択される抗体または抗体フラグメントの少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含有する、請求項1から25のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。
- 少なくとも1つのCDRが、重鎖CDR1、2、および3、ならびに軽鎖CDR1、2、および3を包含する、請求項27に記載の抗体またはフラグメント。
- CA−125、糖タンパク質(GP)IIb/IIIa受容体、TNF−α、CD52、TAG−72、癌胎児性抗原(CEA)、インターロイキン−6受容体(IL−6R)、IL−2、インターロイキン−2受容体a−鎖(CD25)、CD22、B細胞活性化因子、インターロイキン−5受容体(CD125)、VEGF、VEGF−A、CD30、IL−1β、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、CD3、EpCAM、EGF受容体(EGFR)、MUC1、ヒトインターロイキン−2受容体、Tac、RANKリガンド、C5または他の補体タンパク質、EpCAM、CD11a、αvβ3インテグリン、ビトロネクチン受容体αvβ3インテグリン、HER2、neu、CD3、CD15、CD20、インターフェロンγ、CD33、CA−IX、TNFα、CTLA−4、癌胎児性抗原、IL−5、CD3ε、CAM、α−4−インテグリン、IgE、IgE Fc領域、RSV抗原、呼吸系発疹ウイルス(RSV)のF(または融合)タンパク質、TAG−72、NCA−90(顆粒細胞抗原)、IL−6、GD2、GD3、IL−12、IL−23、IL−17、CTAA16.88、IL13、インターロイキン−1β、β−アミロイド、IGF−1受容体(IGF−1R)、デルタ様リガンド4(DLL4)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体のαサブユニット、肝細胞成長因子、IFN−α、神経成長因子、IL−13、CD326、PD−L1、CD47、およびCD137からなる群から選択される抗原に特異的に結合する、請求項1から28のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。
- Kabatナンバリングに従うとP8、V9またはI9、I10またはL10、Q38、R39、T40、N41 G42、S43、P44、R45、D82、I83、A84、D85、Y86、Y87、G99、A100、G101、T102、K103、L104、E105、R142、S162、V163、T164、E165、Q166、D167、S168、およびY173を有する軽鎖、ならびにKabatナンバリングに従うとQ6、P9、R38、Q39、S40、P41、G42、K43、G44、L45、S84、D86、T87、A88、I89、Y90、Y91、W103、G104、Q105
、G106、T107、L108、V111、T110、Y147、E150、P151、V152、T173、F174、P175、A176、V177、Y185、S186、およびL187を有する重鎖を有する、請求項1から29のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。 - メディトープに結合している、請求項1から30のいずれかに記載の抗体を含む複合体。
- メディトープ利用可能抗体のメディトープ結合部位に結合するペプチドを含み、ペプチドが、配列番号1もしくは2のペプチド、またはそれに由来する環式ペプチドではない、単離されたメディトープ。
- 表面プラスモン共鳴(SPR)によって測定した場合に10μM未満の解離定数で、ペプチドがメディトープ結合部位に結合する、請求項32に記載のメディトープ。
- メディトープ結合部位が、Kabatナンバリングに従うとメディトープ利用可能抗体の軽鎖の残基40、41、83、および85、ならびにKabatナンバリングに従うとメディトープ利用可能抗体の重鎖の残基39、89、105、および108を包含する、請求項32または33に記載のメディトープ。
- 配列番号71で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号72で示されるアミノ酸配列を含む重鎖;
配列番号9で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む重鎖;または
配列番号68で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号70で示されるアミノ酸配列を有する重鎖
を有するメディトープ利用可能抗体に結合する、請求項31から34のいずれかに記載のメディトープ。 - ペプチドが5から16アミノ酸長さである、請求項32から35のいずれかに記載のメディトープ。
- ペプチドが下式を有する、請求項32から36のいずれかに記載のメディトープ:
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12(式I)
[式中、
X1=Cys、Gly、β−アラニン、ジアミノプロピオン酸、β−アジドアラニン、または存在しない;
X2=Glnまたは存在しない;
X3=Phe、Tyr、β−β’−ジフェニル−Ala、His、Asp、2−ブロモ−L−フェニルアラニン、3−ブロモ−L−フェニルアラニンもしくは4−ブロモ−L−フェニルアラニン、Asn、Gln、修飾Phe、水和性カルボニル含有残基;またはボロン酸含有残基;
X4=AspまたはAsn;
X5=Leu;β−β’−ジフェニル−Ala;Phe;フェニルアラニン、トリプトファン、もしくはチロシンの非天然類似体;水和性カルボニル含有残基;またはボロン酸含有残基;
X6=SerまたはCys;
X7=ThrまたはSerまたはCys;
X8=Arg、修飾Arg、または水和性カルボニルもしくはボロン酸含有残基;
X9=Arg、Ala;
X10=Leu、Gln、Glu、β−β’−ジフェニル−Ala;Phe;フェニルアラニン、トリプトファン、もしくはチロシンの非天然類似体;水和性カルボニル含有残基;またはボロン酸含有残基;
X11=Lys;および
X12=Cys、Gly、7−アミノヘプタン酸、β−アラニン、ジアミノプロピオン酸、プロパルギルグリシン、イソアスパラギン酸、または存在しない
修飾Argは、図34に示されている式の構造を有し、
修飾Pheは、フェニル環に組み込まれている1個または複数のハロゲンを有するPheであり、かつ
式Iは、配列番号1もしくは配列番号2、またはそれに由来する環式ペプチドではない]。 - ペプチドが環式ペプチドである、請求項32から37のいずれかに記載のメディトープ。
- 環化が、ジスルフィド架橋、チオエーテル架橋、ラクタム結合、付加環化によるものである、請求項38に記載のメディトープ。
- ペプチドが式Iのペプチドであり、環化が、X1とX12との、X1とX11との、X3とX11との、X4とX11との、またはX2とX12との結合を介するものである、請求項38または39に記載のメディトープ。
- ペプチドが式Iのペプチドであり、非天然アミノ酸がβ−β’−ジフェニル−Ala、分枝アルキル、または伸長された芳香族である、請求項37から40のいずれかに記載のメディトープ。
- 式Iのペプチドであり、1個または複数のハロゲンがそれぞれ、オルト−、メタ−、またはパラ−ブロモフェニル置換基である、請求項37から40のいずれかに記載のペプチド。
- 配列番号16〜18、23、29、31、32、36、39、42、43、45、46、51、52、54、もしくは55で示される配列からなる群から選択されるアミノ酸を有するペプチド、またはそれに由来する環式ペプチドである、請求項32から42のいずれかに記載のペプチド。
- 式(X)の化合物または薬学的に許容されるその塩を含む、単離されたメディトープ:
「*」でマークされている中心は、「R」または「S」配置であり;
R3およびR3’はそれぞれ独立に、Hか、またはC1〜4アルキル、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、または3個の置換基で置換されていてもよいフェニルであり;
R5は以下の(A)あるいは(B)であり:
(A)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CO2C1〜4アルキル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、および−CONH2基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基で置換されていてもよいC1〜8アルキル;あるいは
(B)以下のa)またはb)で置換されているC1〜4アルキル基:
a)1個もしくは2個のフェニル基(ここで、各フェニルは、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、もしくは3個の置換基で置換されていてもよい);または
b)ナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基;
R6は、−C1〜4アルキル−OHまたは−C1〜4アルキル−SHであり;
R7は、−C1〜4アルキル−OHまたは−C1〜4アルキル−SHであり;
mは、0、1、2、3、4、または5であり;
R8は下記の(a)あるいは(b)であり:
(a)−OH、−NRaRb、−N(Rc)C(O)Re、または−N(Rc)C(=NRd)Re;(ここで、
RaはHであり;
Rbは、Hか、またはオキソ、アセタールおよびケタール、−B(OH)2、−SH、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、もしくは−CO2C1〜4アルキル基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基
で置換されていてもよいC1〜8アルキルであり;
Rcは、H、C1〜8アルキル、C3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、またはアリール
であり;
Rdは、Hか、またはそれぞれ、−N3、−NH2、−OH、−SH、ハロゲン、オキソ
、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、
オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、および−CO2C1〜4アルキル基からなる
群から選択され1個もしくは複数の置換基で置換されていてもよいC1〜8アルキル、C2
〜8アルケニル、C2〜8アルキニル、C3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、もしくはア
リール基であり;かつ
Reは、H;−NHRd;または−N3、−NH2、−OH、−SH、オキソ、C2〜4アセタール、C2〜4ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、
オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、および−CO2C1〜4アルキル基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基でそれぞれ置換されていてもよいC1〜12アルキル、C3〜8シクロアルキル、C2〜12アルケニル、C2〜8アルキニル、またはアリール基である);あるいは
(b)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、−SH、−
OH、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、または−CO2C1〜4アルキル基で置換されているC1〜12アルキル;
R9は、C1〜4アルキルまたは−C1〜2アルキレン−Rxであり;
(ここで、Rxは、−CO2H、−CONH2、−CH2NHC(O)NH2、または−CH2NHC(=NH)NH2である);
R10は下記の(1)あるいは(2)であり:
(1)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナー
トエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、お
よび−CONH2基からなる群から選択される1個または複数の置換基で置換されていて
もよいC1〜8アルキル;あるいは
(2)1もしくは2個のフェニル基、または1個のナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基で置換されているC1〜4アルキル基(ここで、各フェニルは、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、または3個の置換基で置換されていてもよい);
nは、0または1であり;
pは、0または1であり;
Xは、その各炭素が−CO2H、−NH2、または−NHC(O)Ryで置換されていて
もよいC1〜8アルキレンまたはC2〜8アルケニレンであり;
(ここで、前記アルキレンのうちの1個の炭素は、−C(O)NH−、5員のヘテロアリール環、または−S−S−で置き換えられていてもよい);かつ
Ryは、−C1〜4アルキルまたは−CH(Rz)CO2Hであるが;
(ここで、Rzは、−Hか、または−OH、−SH、もしくは−NH2で置換されていてもよい−C1〜4アルキルである);
ただし、化合物は、配列番号1または配列番号2の化合物ではない]。 - mが0または1である、請求項44に記載のメディトープ。
- R3がHまたはフェニルであり、R3'がフェニル、2−ブロモフェニル、3−ブロモフ
ェニル、または4−ブロモフェニルである、請求項44に記載のメディトープ。 - R5が、オキソ、−B(OH)2、−CO2H、および−CONH2基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基で、またはブロモもしくはクロロ置換基でそれぞれ置換されていてもよい1個もしくは2個のフェニル基でそれぞれ置換されていてもよいメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、またはtert−ブチルである、請求項44に記載のメディトープ。
- R8が−OH、−NH2、−N(Rc)C(O)Re、または−N(Rc)C(=NRd)R
eである、請求項44に記載のメディトープ。 - RcがHまたはメチルであり、RdがHまたはC1〜4アルキルであり、ReがC1〜4アル
キルまたは−NH(C1〜4アルキル)である、請求項48に記載のメディトープ。 - R9が、−CO2H、−CONH2、−CH2NHC(O)NH2、または−CH2NHC(=NH)NH2で置換されていてもよいメチルまたはエチルである、請求項44に記載の
メディトープ。 - R10が、オキソ、−B(OH)2、−CO2H、および−CONH2基からなる群から選
択される1個または複数の置換基でそれぞれ置換されていてもよいメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、またはtert−ブチルである、請求項44に記載のメディトープ。 - −X−NH−は、−Cys−Cys−、−Gly−Gly−、−C(O)(CH2)6−NH−、−β−Ala−β−Ala−、−C(O)CH(NH2)CH2CH=CHCH2
CH(CO2H)−NH−、−C(O)CH(NH2)CH2NHC(O)CH2CH(CO2H)−NH−、−β−Ala−C(O)CH2CH(CO2H)−NH−、または−C(
O)CH(NH2)CH2−トリアジニル−CH2−CH(CO2H)−NH−である、請求項44に記載のメディトープ。 - メディトープ利用可能抗体もしくはそのフラグメント、またはメディトープ利用可能抗体もしくはそのフラグメントを発現する細胞を精製するための方法であって:
(a)メディトープ利用可能抗体またはフラグメントがペプチドに結合する条件下で、メディトープ利用可能抗体、フラグメント、または細胞を含有する組成物をメディトープと接触させるステップと;
(b)抗体またはフラグメントまたは細胞を単離して、抗体、フラグメント、または細胞を精製するステップと
を含み、その際、メディトープが、メディトープ利用可能抗体のメディトープ結合部位に結合するペプチドである方法。 - 表面プラスモン共鳴(SPR)によって測定した場合に10μM未満の解離定数で、ペプチドがメディトープ結合部位に結合する、請求項53に記載の方法。
- ペプチドが、5および16アミノ酸長さである、請求項53または54に記載の方法。
- ペプチドが、式(X)のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩である、請求項53から55のいずれかに記載の方法:
「*」でマークされている中心は、「R」または「S」配置であり;
R3およびR3'はそれぞれ独立に、Hか、またはC1〜4アルキル、−OH、フルオロ、
クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、または3個の置換基で置換されていてもよいフェニルであり;
R5は以下の(A)あるいは(B)であり:
(A)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナ
ートエステル、オルトエステル、−CO2C1〜4アルキル、−CH=CH−CHO、−C
H=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、および−CONH2基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基で置換されて
いてもよいC1〜8アルキル;あるいは
(B)以下のa)またはb)で置換されているC1〜4アルキル:
a)1個もしくは2個のフェニル基(ここで、各フェニルは、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、もしくは3個の置換基で置換されていてもよい);または
b)ナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基;
R6は、−C1〜4アルキル−OHまたは−C1〜4アルキル−SHであり;
R7は、−C1〜4アルキル−OHまたは−C1〜4アルキル−SHであり;
mは、0、1、2、3、4、または5であり;
R8は下記の(a)あるいは(b)であり:
(a)−OH、−NRaRb、−N(Rc)C(O)Re、または−N(Rc)C(=NRd)Re;(ここで、
RaはHであり;
Rbは、Hか、またはオキソ、アセタールおよびケタール、−B(OH)2、−SH、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、もしくは−CO2C1〜4アルキル基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基
で置換されていてもよいC1〜8アルキルであり;
Rcは、H、C1〜8アルキル、C3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、またはアリール
であり;
Rdは、Hか、またはそれぞれ、−N3、−NH2、−OH、−SH、ハロゲン、オキソ
、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、
オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、および−CO2C1〜4アルキル基からなる
群から選択される1個もしくは複数の置換基で置換されていてもよいC1〜8アルキル、C2〜8アルケニル、C2〜8アルキニル、C3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、もしくはアリール基であり;かつ
Reは、H;−NHRd;または−N3、−NH2、−OH、−SH、オキソ、C2〜4アセタール、C2〜4ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、
オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、および−CO2C1〜4アルキル基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基でそれぞれ置換されていてもよいC1〜12アルキル、C3〜8シクロアルキル、C2〜12アルケニル、C2〜8アルキニル、またはアリール基である);あるいは
(b)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、−SH、−
OH、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、または−CO2C1〜4アルキル基で置換されているC1〜12アルキル;
R9は、C1〜4アルキルまたは−C1〜2アルキレン−Rxであり;
(ここで、Rxは、−CO2H、−CONH2、−CH2NHC(O)NH2、または−CH2NHC(=NH)NH2である);
R10は下記の(1)あるいは(2)であり:
(1)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナー
トエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、お
よび−CONH2基からなる群から選択される1個または複数の置換基で置換されていて
もよいC1〜8アルキル;あるいは
(2)1もしくは2個のフェニル基、または1個のナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基で置換されているC1〜4アルキル基(ここで、各フェニルは、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、または3個の置換基で置換されていてもよい);
nは、0または1であり;
pは、0または1であり;
Xは、その各炭素が−CO2H、−NH2、または−NHC(O)Ryで置換されていて
もよいC1〜8アルキレンまたはC2〜8アルケニレンであり;
(ここで、前記アルキレンのうちの1個の炭素は、−C(O)NH−、5員のヘテロアリール環、または−S−S−で置き換えられていてもよい);かつ
Ryは、−C1〜4アルキルまたは−CH(Rz)CO2Hである
(ここで、Rzは、−Hか、または−OH、−SH、もしくは−NH2で置換されていてもよい−C1〜4アルキルである)]。 - メディトープが固体支持体にカップリングされている、請求項53から56のいずれかに記載の方法。
- 単離をpHの変化によって行う、請求項53から57のいずれかに記載の方法。
- メディトープ利用可能抗体のメディトープ結合部位に結合するペプチドを含むメディトープ;および
治療剤または診断剤を含む、標識されたメディトープ。 - 治療剤または診断剤が、金属イオンに結合している金属キレート剤、小分子、化学療法剤、治療用抗体または機能性フラグメント、毒素、放射性同位体、酵素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、オリゴヌクレオチド、有機または無機ナノ粒子、RNAi分子、siRNA、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤、色素、蛍光または発光物質、酵素、
増感剤、放射性物質、およびキレート剤からなる群から選択される、請求項59に記載の標識されたメディトープ。 - 2つ以上のメディトープおよび1つまたは複数のリンカーを含み、2つ以上のメディトープがそれぞれ、メディトープ利用可能抗体のメディトープ結合部位に結合するペプチドである、多価メディトープ。
- 2つ以上のメディトープが少なくとも3つのメディトープを含む、請求項61に記載の多価メディトープ。
- 1つまたは複数のリンカーが、ペプチド、小さな化学的スキャフォールド、ビオチン−ストレプトアビジン、有機または無機ナノ粒子、ポリヌクレオチド配列、ペプチド核酸、有機ポリマー、または免疫グロブリンFcドメインを包含する、請求項61または62に記載の多価メディトープ。
- メディトープに結合している請求項1から30のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントを含み、その際、メディトープが、抗体またはフラグメントのメディトープ結合部位に結合するペプチドを含む、単離されたメディトープ利用可能抗体−メディトープ複合体。
- 表面プラスモン共鳴(SPR)によって測定した場合に10μM未満の解離定数で、ペプチドがメディトープ結合部位に結合している、請求項64に記載の複合体。
- ペプチドが、5から16アミノ酸長さである、請求項64または65に記載の複合体。
- ペプチドが、式(X)の化合物または薬学的に許容されるその塩である、請求項64から66のいずれかに記載の複合体:
「*」でマークされている中心は、「R」または「S」配置であり;
R3およびR3'はそれぞれ独立に、Hか、またはC1〜4アルキル、−OH、フルオロ、
クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、または3個の置換基で置換されていてもよいフェニルであり;
R5は以下の(A)あるいは(B)であり:
(A)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナ
ートエステル、オルトエステル、−CO2C1〜4アルキル、−CH=CH−CHO、−C
H=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、および−CONH2基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基で置換されて
いてもよいC1〜8アルキル;あるいは
(B)以下のa)またはb)で置換されているC1〜4アルキル:
a)1個もしくは2個のフェニル基(ここで、各フェニルは、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、もしくは3個の置換基で置換されていてもよい);または
b)ナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基;
R6は、−C1〜4アルキル−OHまたは−C1〜4アルキル−SHであり;
R7は、−C1〜4アルキル−OHまたは−C1〜4アルキル−SHであり;
mは、0、1、2、3、4、または5であり;
R8は下記の(a)あるいは(b)であり:
(a)−OH、−NRaRb、−N(Rc)C(O)Re、または−N(Rc)C(=NRd)Re;(ここで、
RaはHであり;
Rbは、Hか、またはオキソ、アセタールおよびケタール、−B(OH)2、−SH、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、もしくは−CO2C1〜4アルキル基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基
で置換されていてもよいC1〜8アルキルであり;
Rcは、H、C1〜8アルキル、C3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、またはアリール
であり;
Rdは、Hか、またはそれぞれ、−N3、−NH2、−OH、−SH、ハロゲン、オキソ
、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、
オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、および−CO2C1〜4アルキル基からなる
群から選択される1個もしくは複数の置換基で置換されていてもよいC1〜8アルキル、C2〜8アルケニル、C2〜8アルキニル、C3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、もしくはアリール基であり;かつ
Reは、H;−NHRd;または−N3、−NH2、−OH、−SH、オキソ、C2〜4アセタール、C2〜4ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、
オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、および−CO2C1〜4アルキル基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基でそれぞれ置換されていてもよいC1〜12アルキル、C3〜8シクロアルキル、C2〜12アルケニル、C2〜8アルキニル、またはアリール基である);あるいは
(b)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、−SH、−
OH、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、または−CO2C1〜4アルキル基で置換されているC1〜12アルキル;
R9は、C1〜4アルキルまたは−C1〜2アルキレン−Rxであり;
(ここで、Rxは、−CO2H、−CONH2、−CH2NHC(O)NH2、または−CH2NHC(=NH)NH2である);
R10は下記の(1)あるいは(2)であり:
(1)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナー
トエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、お
よび−CONH2基からなる群から選択される1個または複数の置換基で置換されていて
もよいC1〜8アルキル;あるいは
(2)1もしくは2個のフェニル基、または1個のナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基で置換されているC1〜4アルキル基(ここで、各フェニルは、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、または3個の置換基で置換されていてもよい);
nは、0または1であり;
pは、0または1であり;
Xは、その各炭素が−CO2H、−NH2、または−NHC(O)Ryで置換されていて
もよいC1〜8アルキレンまたはC2〜8アルケニレンであり;
(ここで、前記アルキレンのうちの1個の炭素は、−C(O)NH−、5員のヘテロアリール環、または−S−S−で置き換えられていてもよい);かつ
Ryは、−C1〜4アルキルまたは−CH(Rz)CO2Hである
(ここで、Rzは、−Hか、または−OH、−SH、もしくは−NH2で置換されていてもよい−C1〜4アルキルである)]。 - メディトープが多価メディトープである、請求項64から67のいずれかに記載の複合体。
- 請求項31から50のいずれかに記載のメディトープ、請求項59もしくは60に記載の標識されたメディトープ、または請求項61から63のいずれかに記載の多価メディトープに結合しているメディトープ利用可能抗体またはそのフラグメントを含む単離された抗体−メディトープ複合体。
- 請求項64から69のいずれかに記載の複合体;および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- 対象に、請求項70に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、治療方法。
- (a)対象に、請求項64から69のいずれかに記載の抗体−メディトープ複合体を投与するステップと;
(b)抗体−メディトープ複合体と抗原との結合を対象において検出するステップと
を含む診断方法。 - 対象に、請求項1から30のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントを投与するステップを含む治療方法。
- 対象に、メディトープ利用可能抗体またはそのフラグメントを投与するステップと、対象に、1つまたは複数のメディトープを投与するステップとを含み、その際、メディトープ利用可能抗体またはフラグメントおよび1つまたは複数のメディトープを、逐次的にまたは同時に投与し、かつ1つまたは複数のメディトープが、メディトープ利用可能抗体またはフラグメントのメディトープ結合部位に結合するペプチドを含む治療方法。
- メディトープ利用可能抗体またはフラグメントが重鎖可変(VH)領域および軽鎖可変(VL)領域を含み、その際、VL領域が、Kabatナンバリングに従うと40位にトレオニン、セリン、またはアスパルタート、41位にグリシン以外の残基、および85位にアスパルタートまたはアスパラギンを含むアミノ酸配列を有する、請求項71に記載の方法。
- メディトープ利用可能抗体および1つまたは複数のメディトープの投与が、メディトープ利用可能抗体およびメディトープの複合体の投与を含むように、メディトープ利用可能抗体またはフラグメントを1つまたは複数のメディトープに結合させる、請求項74また
は75に記載の方法。 - 1つまたは複数のメディトープを投与する前に、メディトープ利用可能抗体を投与する、請求項74または75に記載の方法。
- ペプチドが、式(X)の化合物または薬学的に許容されるその塩である、請求項74から77のいずれかに記載の方法:
「*」でマークされている中心は、「R」または「S」配置であり;
R3およびR3'はそれぞれ独立に、Hか、またはC1〜4アルキル、−OH、フルオロ、
クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、または3個の置換基で置換されていてもよいフェニルであり;
R5は以下の(A)あるいは(B)であり:
(A)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナ
ートエステル、オルトエステル、−CO2C1〜4アルキル、−CH=CH−CHO、−C
H=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、および−CONH2基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基で置換されて
いてもよいC1〜8アルキル;あるいは
(B)以下のa)またはb)で置換されているC1〜4アルキル基:
a)1個もしくは2個のフェニル基(ここで、各フェニルは、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、もしくは3個の置換基で置換されていてもよい);または
b)ナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基;
R6は、−C1〜4アルキル−OHまたは−C1〜4アルキル−SHであり;
R7は、−C1〜4アルキル−OHまたは−C1〜4アルキル−SHであり;
mは、0、1、2、3、4、または5であり;
R8は下記の(a)あるいは(b)であり:
(a)−OH、−NRaRb、−N(Rc)C(O)Re、または−N(Rc)C(=NRd)Re;(ここで、
RaはHであり;
Rbは、Hか、またはオキソ、アセタールおよびケタール、−B(OH)2、−SH、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、もしくは−CO2C1〜4アルキル基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基
で置換されていてもよいC1〜8アルキルであり;
Rcは、H、C1〜8アルキル、C3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、またはアリール
であり;
Rdは、Hか、またはそれぞれ、−N3、−NH2、−OH、−SH、ハロゲン、オキソ
、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、
オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、および−CO2C1〜4アルキル基からなる
群から選択される1個もしくは複数の置換基で置換されていてもよいC1〜8アルキル、C2〜8アルケニル、C2〜8アルキニル、C3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、もしくはアリール基であり;かつ
Reは、H;−NHRd;または−N3、−NH2、−OH、−SH、オキソ、C2〜4アセタール、C2〜4ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、
オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、および−CO2C1〜4アルキル基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基でそれぞれ置換されていてもよいC1〜12アルキル、C3〜8シクロアルキル、C2〜12アルケニル、C2〜8アルキニル、またはアリール基である);あるいは
(b)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、−SH、−
OH、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、または−CO2C1〜4アルキル基で置換されているC1〜12アルキル;
R9は、C1〜4アルキルまたは−C1〜2アルキレン−Rxであり;
(ここで、Rxは、−CO2H、−CONH2、−CH2NHC(O)NH2、または−CH2NHC(=NH)NH2である);
R10は下記の(1)あるいは(2)であり:
(1)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナー
トエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、お
よび−CONH2基からなる群から選択される1個または複数の置換基で置換されていて
もよいC1〜8アルキル;あるいは
(2)1もしくは2個のフェニル基、または1個のナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基で置換されているC1〜4アルキル基(ここで、各フェニルは、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、または3個の置換基で置換されていてもよい);
nは、0または1であり;
pは、0または1であり;
Xは、その各炭素が−CO2H、−NH2、または−NHC(O)Ryで置換されていて
もよいC1〜8アルキレンまたはC2〜8アルケニレンであり;
(ここで、前記アルキレンのうちの1個の炭素は、−C(O)NH−、5員のヘテロアリール環、または−S−S−で置き換えられていてもよい);かつ
Ryは、−C1〜4アルキルまたは−CH(Rz)CO2Hである
(ここで、Rzは、−Hか、または−OH、−SH、もしくは−NH2で置換されていてもよい−C1〜4アルキルである)]。 - 抗体またはそのフラグメントが1つまたは複数のメディトープに結合していて、1つまたは複数のメディトープが式(X)のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩を含む、請求項73に記載の方法:
「*」でマークされている中心は、「R」または「S」配置であり;
R3およびR3'はそれぞれ独立に、Hか、またはC1〜4アルキル、−OH、フルオロ、
クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、または3個の置換基で置換されていてもよいフェニルであり;
R5は以下の(A)あるいは(B)であり:
(A)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナ
ートエステル、オルトエステル、−CO2C1〜4アルキル、−CH=CH−CHO、−C
H=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、および−CONH2基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基で置換されて
いてもよいC1〜8アルキル;あるいは
(B)以下のa)またはb)で置換されているC1〜4アルキル基:
a)1個もしくは2個のフェニル基(ここで、各フェニルは、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、もしくは3個の置換基で置換されていてもよい);または
b)ナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基;
R6は、−C1〜4アルキル−OHまたは−C1〜4アルキル−SHであり;
R7は、−C1〜4アルキル−OHまたは−C1〜4アルキル−SHであり;
mは、0、1、2、3、4、または5であり;
R8は下記の(a)あるいは(b)であり:
(a)−OH、−NRaRb、−N(Rc)C(O)Re、または−N(Rc)C(=NRd)Re;(ここで、
RaはHであり;
Rbは、Hか、またはオキソ、アセタールおよびケタール、−B(OH)2、−SH、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、もしくは−CO2C1〜4アルキル基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基
で置換されていてもよいC1〜8アルキルであり;
Rcは、H、C1〜8アルキル、C3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、またはアリール
であり;
Rdは、Hか、またはそれぞれ、−N3、−NH2、−OH、−SH、ハロゲン、オキソ
、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、
オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、および−CO2C1〜4アルキル基からなる
群から選択される1個もしくは複数の置換基で置換されていてもよいC1〜8アルキル、C2〜8アルケニル、C2〜8アルキニル、C3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、もしくはアリール基であり;かつ
Reは、H;−NHRd;または−N3、−NH2、−OH、−SH、オキソ、C2〜4アセタール、C2〜4ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、
オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、および−CO2C1〜4アルキル基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基でそれぞれ置換されていてもよいC1〜12アルキル、C3〜8シクロアルキル、C2〜12アルケニル、C2〜8アルキニル、またはアリール基である);あるいは
(b)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、−SH、−
OH、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、または−CO2C1〜4アルキル基で置換されているC1〜12アルキル;
R9は、C1〜4アルキルまたは−C1〜2アルキレン−Rxであり;
(ここで、Rxは、−CO2H、−CONH2、−CH2NHC(O)NH2、または−CH2NHC(=NH)NH2である);
R10は下記の(1)あるいは(2)であり:
(1)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナー
トエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、お
よび−CONH2基からなる群から選択される1個または複数の置換基で置換されていて
もよいC1〜8アルキル;あるいは
(2)1もしくは2個のフェニル基、または1個のナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基で置換されているC1〜4アルキル基(ここで、各フェニルは、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、または3個の置換基で置換されていてもよい);
nは、0または1であり;
pは、0または1であり;
Xは、その各炭素が−CO2H、−NH2、または−NHC(O)Ryで置換されていて
もよいC1〜8アルキレンまたはC2〜8アルケニレンであり;
(ここで、前記アルキレンのうちの1個の炭素は、−C(O)NH−、5員のヘテロアリール環、または−S−S−で置き換えられていてもよい);かつ
Ryは、−C1〜4アルキルまたは−CH(Rz)CO2Hである
(ここで、Rzは、−Hか、または−OH、−SH、もしくは−NH2で置換されていてもよい−C1〜4アルキルである)]。 - 次いで、対象に、1つまたは複数のメディトープを投与するステップをさらに含み、1つまたは複数のメディトープが式(X)のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩を含む、請求項73に記載の方法:
「*」でマークされている中心は、「R」または「S」配置であり;
R3およびR3'はそれぞれ独立に、Hか、またはC1〜4アルキル、−OH、フルオロ、
クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、または3個の置換基で置換されていてもよいフェニルであり;
R5は以下の(A)あるいは(B)であり:
(A)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナ
ートエステル、オルトエステル、−CO2C1〜4アルキル、−CH=CH−CHO、−C
H=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、および−CONH2基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基で置換されて
いてもよいC1〜8アルキル;あるいは
(B)以下のa)またはb)で置換されているC1〜4アルキル:
a)1個もしくは2個のフェニル基(ここで、各フェニルは、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、もしくは3個の置換基で置換されていてもよい);または
b)ナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基;
R6は、−C1〜4アルキル−OHまたは−C1〜4アルキル−SHであり;
R7は、−C1〜4アルキル−OHまたは−C1〜4アルキル−SHであり;
mは、0、1、2、3、4、または5であり;
R8は下記の(a)あるいは(b)であり:
(a)−OH、−NRaRb、−N(Rc)C(O)Re、または−N(Rc)C(=NRd)Re;(ここで、
RaはHであり;
Rbは、Hか、またはオキソ、アセタールおよびケタール、−B(OH)2、−SH、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、もしくは−CO2C1〜4アルキル基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基
で置換されていてもよいC1〜8アルキルであり;
Rcは、H、C1〜8アルキル、C3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、またはアリール
であり;
Rdは、Hか、またはそれぞれ、−N3、−NH2、−OH、−SH、ハロゲン、オキソ
、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、
オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、および−CO2C1〜4アルキル基からなる
群から選択される1個もしくは複数の置換基で置換されていてもよいC1〜8アルキル、C2〜8アルケニル、C2〜8アルキニル、C3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、もしくはアリール基であり;かつ
Reは、H;−NHRd;または−N3、−NH2、−OH、−SH、オキソ、C2〜4アセタール、C2〜4ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、
オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、および−CO2C1〜4アルキル基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基でそれぞれ置換されていてもよいC1〜12アルキル、C3〜8シクロアルキル、C2〜12アルケニル、C2〜8アルキニル、またはアリール基である);あるいは
(b)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、−SH、−
OH、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、または−CO2C1〜4アルキル基で置換されているC1〜12アルキル;
R9は、C1〜4アルキルまたは−C1〜2アルキレン−Rxであり;
(ここで、Rxは、−CO2H、−CONH2、−CH2NHC(O)NH2、または−CH2NHC(=NH)NH2である);
R10は下記の(1)あるいは(2)であり:
(1)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナー
トエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、お
よび−CONH2基からなる群から選択される1個または複数の置換基で置換されていて
もよいC1〜8アルキル;あるいは
(2)1もしくは2個のフェニル基、または1個のナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基で置換されているC1〜4アルキル基(ここで、各フェニルは、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、または3個の置換基で置換されていてもよい);
nは、0または1であり;
pは、0または1であり;
Xは、その各炭素が−CO2H、−NH2、または−NHC(O)Ryで置換されていて
もよいC1〜8アルキレンまたはC2〜8アルケニレンであり;
(ここで、前記アルキレンのうちの1個の炭素は、−C(O)NH−、5員のヘテロアリール環、または−S−S−で置き換えられていてもよい);かつ
Ryは、−C1〜4アルキルまたは−CH(Rz)CO2Hである
(ここで、Rzは、−Hか、または−OH、−SH、もしくは−NH2で置換されていてもよい−C1〜4アルキルである)]。 - 1つまたは複数のメディトープが多価メディトープを含む、請求項74から80のいずれかに記載の方法。
- 1つまたは複数のメディトープが治療剤にカップリングされている、請求項74から81のいずれかに記載の方法。
- 治療剤が、薬物、化学療法剤、治療用抗体、毒素、放射性同位体、酵素、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤、染料、金属、金属合金、およびナノ粒子からなる群から選択される、請求項82に記載の方法。
- (a)対象に、請求項1から30のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントを投与するステップと;
(b)抗体またはフラグメントと抗原との結合を対象において検出するステップと
を含む診断方法。 - 対象に、メディトープ利用可能抗体またはそのフラグメントおよび1つまたは複数のメディトープを投与するステップと、抗体またはフラグメントと抗原との結合を対象において検出するステップとを含み、その際、
メディトープ利用可能抗体またはフラグメントおよび1つまたは複数のメディトープを逐次的にまたは同時に投与し;かつ
1つまたは複数のメディトープが、メディトープ利用可能抗体またはフラグメントのメディトープ結合部位に結合するペプチドを含む診断方法。 - メディトープ利用可能抗体またはフラグメントが重鎖可変(VH)領域および軽鎖可変(VL)領域を含み、ここで、VL領域が、Kabatナンバリングに従うと40位にトレオニン、セリン、またはアスパルタート、41位にグリシン以外の残基、および85位にアスパルタートまたはアスパラギンを含むアミノ酸配列を有する、請求項85に記載の診断方法。
- メディトープ利用可能抗体および1つまたは複数のメディトープの投与が、メディトープ利用可能抗体およびメディトープの複合体の投与を含むように、メディトープ利用可能抗体またはフラグメントを1つまたは複数のメディトープに結合させる、請求項85または86に記載の方法。
- 1つまたは複数のメディトープを投与する前に、メディトープ利用可能抗体を投与する、請求項85または86に記載の方法。
- ペプチドが、式(X)の化合物または薬学的に許容されるその塩である、請求項85から88のいずれかに記載の方法:
「*」でマークされている中心は、「R」または「S」配置であり;
R3およびR3'はそれぞれ独立に、Hか、またはC1〜4アルキル、−OH、フルオロ、
クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、または3個の置換基で置換されていてもよいフェニルであり;
R5は以下の(A)あるいは(B)であり:
(A)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナ
ートエステル、オルトエステル、−CO2C1〜4アルキル、−CH=CH−CHO、−C
H=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、および−CONH2基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基で置換されて
いてもよいC1〜8アルキル;あるいは
(B)以下のa)またはb)で置換されているC1〜4アルキル:
a)1個もしくは2個のフェニル基(ここで、各フェニルは、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、もしくは3個の置換基で置換されていてもよい);または
b)ナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基;
R6は、−C1〜4アルキル−OHまたは−C1〜4アルキル−SHであり;
R7は、−C1〜4アルキル−OHまたは−C1〜4アルキル−SHであり;
mは、0、1、2、3、4、または5であり;
R8は下記の(a)あるいは(b)であり:
(a)−OH、−NRaRb、−N(Rc)C(O)Re、または−N(Rc)C(=NRd)Re;(ここで、
RaはHであり;
Rbは、Hか、またはオキソ、アセタールおよびケタール、−B(OH)2、−SH、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、もしくは−CO2C1〜4アルキル基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基
で置換されていてもよいC1〜8アルキルであり;
Rcは、H、C1〜8アルキル、C3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、またはアリール
であり;
Rdは、Hか、またはそれぞれ、−N3、−NH2、−OH、−SH、ハロゲン、オキソ
、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、
オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、および−CO2C1〜4アルキル基からなる
群から選択される1個もしくは複数の置換基で置換されていてもよいC1〜8アルキル、C2〜8アルケニル、C2〜8アルキニル、C3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、もしくはアリール基であり;かつ
Reは、H;−NHRd;または−N3、−NH2、−OH、−SH、オキソ、C2〜4アセタール、C2〜4ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、
オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、および−CO2C1〜4アルキル基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基でそれぞれ置換されていてもよいC1〜12アルキル、C3〜8シクロアルキル、C2〜12アルケニル、C2〜8アルキニル、またはアリール基である);あるいは
(b)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、−SH、−
OH、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、または−CO2C1〜4アルキル基で置換されているC1〜12アルキル;
R9は、C1〜4アルキルまたは−C1〜2アルキレン−Rxであり;
(ここで、Rxは、−CO2H、−CONH2、−CH2NHC(O)NH2、または−CH2NHC(=NH)NH2である);
R10は下記の(1)あるいは(2)であり:
(1)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナー
トエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、お
よび−CONH2基からなる群から選択される1個または複数の置換基で置換されていて
もよいC1〜8アルキル;あるいは
(2)1もしくは2個のフェニル基、または1個のナフチル、イミダゾール、もしくはイ
ンドール基で置換されているC1〜4アルキル基(ここで、各フェニルは、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、または3個の置換基で置換されていてもよい);
nは、0または1であり;
pは、0または1であり;
Xは、その各炭素が−CO2H、−NH2、または−NHC(O)Ryで置換されていて
もよいC1〜8アルキレンまたはC2〜8アルケニレンであり;
(ここで、前記アルキレンのうちの1個の炭素は、−C(O)NH−、5員のヘテロアリール環、または−S−S−で置き換えられていてもよい);かつ
Ryは、−C1〜4アルキルまたは−CH(Rz)CO2Hである
(ここで、Rzは、−Hか、または−OH、−SH、もしくは−NH2で置換されていてもよい−C1〜4アルキルである)]。 - 抗体またはフラグメントが1つまたは複数のメディトープに結合していて、1つまたは複数のメディトープが式(X)のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩を含む、請求項84に記載の方法:
「*」でマークされている中心は、「R」または「S」配置であり;
R3およびR3'はそれぞれ独立に、Hか、またはC1〜4アルキル、−OH、フルオロ、
クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、または3個の置換基で置換されていてもよいフェニルであり;
R5は以下の(A)あるいは(B)であり:
(A)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナ
ートエステル、オルトエステル、−CO2C1〜4アルキル、−CH=CH−CHO、−C
H=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、および−CONH2基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基で置換されて
いてもよいC1〜8アルキル;あるいは
(B)以下のa)またはb)で置換されているC1〜4アルキル:
a)1個もしくは2個のフェニル基(ここで、各フェニルは、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、もしくは3個の置換基で置換されていてもよい);または
b)ナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基;
R6は、−C1〜4アルキル−OHまたは−C1〜4アルキル−SHであり;
R7は、−C1〜4アルキル−OHまたは−C1〜4アルキル−SHであり;
mは、0、1、2、3、4、または5であり;
R8は下記の(a)あるいは(b)であり:
(a)−OH、−NRaRb、−N(Rc)C(O)Re、または−N(Rc)C(=NRd)Re;(ここで、
RaはHであり;
Rbは、Hか、またはオキソ、アセタールおよびケタール、−B(OH)2、−SH、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、もしくは−CO2C1〜4アルキル基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基
で置換されていてもよいC1〜8アルキルであり;
Rcは、H、C1〜8アルキル、C3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、またはアリール
であり;
Rdは、Hか、またはそれぞれ、−N3、−NH2、−OH、−SH、ハロゲン、オキソ
、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、
オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、および−CO2C1〜4アルキル基からなる
群から選択される1個もしくは複数の置換基で置換されていてもよいC1〜8アルキル、C2〜8アルケニル、C2〜8アルキニル、C3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、もしくはアリール基であり;かつ
Reは、H;−NHRd;または−N3、−NH2、−OH、−SH、オキソ、C2〜4アセタール、C2〜4ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、
オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、および−CO2C1〜4アルキル基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基でそれぞれ置換されていてもよいC1〜12アルキル、C3〜8シクロアルキル、C2〜12アルケニル、C2〜8アルキニル、またはアリール基である);あるいは
(b)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、−SH、−
OH、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、または−CO2C1〜4アルキル基で置換されているC1〜12アルキル;
R9は、C1〜4アルキルまたは−C1〜2アルキレン−Rxであり;
(ここで、Rxは、−CO2H、−CONH2、−CH2NHC(O)NH2、または−CH2NHC(=NH)NH2である);
R10は下記の(1)あるいは(2)であり:
(1)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナー
トエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、お
よび−CONH2基からなる群から選択される1個または複数の置換基で置換されていて
もよいC1〜8アルキル;あるいは
(2)1もしくは2個のフェニル基、または1個のナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基で置換されているC1〜4アルキル基(ここで、各フェニルは、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、または3個の置換基で置換されていてもよい);
nは、0または1であり;
pは、0または1であり;
Xは、その各炭素が−CO2H、−NH2、または−NHC(O)Ryで置換されていて
もよいC1〜8アルキレンまたはC2〜8アルケニレンであり;
(ここで、前記アルキレンのうちの1個の炭素は、−C(O)NH−、5員のヘテロアリール環、または−S−S−で置き換えられていてもよい);かつ
Ryは、−C1〜4アルキルまたは−CH(Rz)CO2Hである
(ここで、Rzは、−Hか、または−OH、−SH、もしくは−NH2で置換されていてもよい−C1〜4アルキルである)]。 - 対象に、1つまたは複数のメディトープを投与するステップ(c)をさらに含み、その際、1つまたは複数のメディトープが、式(X)のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩を含む、請求項84に記載の方法:
「*」でマークされている中心は、「R」または「S」配置であり;
R3およびR3'はそれぞれ独立に、Hか、またはC1〜4アルキル、−OH、フルオロ、
クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、または3個の置換基で置換されていてもよいフェニルであり;
R5は以下の(A)あるいは(B)であり:
(A)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナ
ートエステル、オルトエステル、−CO2C1〜4アルキル、−CH=CH−CHO、−C
H=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、および−CONH2基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基で置換されて
いてもよいC1〜8アルキル;あるいは
(B)以下のa)またはb)で置換されているC1〜4アルキル:
a)1個もしくは2個のフェニル基(ここで、各フェニルは、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、もしくは3個の置換基で置換されていてもよい);または
b)ナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基;
R6は、−C1〜4アルキル−OHまたは−C1〜4アルキル−SHであり;
R7は、−C1〜4アルキル−OHまたは−C1〜4アルキル−SHであり;
mは、0、1、2、3、4、または5であり;
R8は下記の(a)あるいは(b)であり:
(a)−OH、−NRaRb、−N(Rc)C(O)Re、または−N(Rc)C(=NRd)Re;(ここで、
RaはHであり;
Rbは、Hか、またはオキソ、アセタールおよびケタール、−B(OH)2、−SH、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、もしくは−CO2C1〜4アルキル基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基
で置換されていてもよいC1〜8アルキルであり;
Rcは、H、C1〜8アルキル、C3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、またはアリール
であり;
Rdは、Hか、またはそれぞれ、−N3、−NH2、−OH、−SH、ハロゲン、オキソ
、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、
オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、および−CO2C1〜4アルキル基からなる
群から選択される1個もしくは複数の置換基で置換されていてもよいC1〜8アルキル、C2〜8アルケニル、C2〜8アルキニル、C3〜8シクロアルキル、分枝アルキル、もしくはアリール基であり;かつ
Reは、H;−NHRd;または−N3、−NH2、−OH、−SH、オキソ、C2〜4アセタール、C2〜4ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナートエステル、
オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、および−CO2C1〜4アルキル基からなる群から選択される1個もしくは複数の置換基でそれぞれ置換されていてもよいC1〜12アルキル、C3〜8シクロアルキル、C2〜12アルケニル、C2〜8アルキニル、またはアリール基である);あるいは
(b)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、−SH、−
OH、ホスホナートエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、または−CO2C1〜4アルキル基で置換されているC1〜12アルキル;
R9は、C1〜4アルキルまたは−C1〜2アルキレン−Rxであり;
(ここで、Rxは、−CO2H、−CONH2、−CH2NHC(O)NH2、または−CH2NHC(=NH)NH2である);
R10は下記の(1)あるいは(2)であり:
(1)オキソ、アセタール、ケタール、−B(OH)2、ボロン酸エステル、ホスホナー
トエステル、オルトエステル、−CH=CH−CHO、−CH=CH−C(O)C1〜4アルキル、−CH=CH−CO2C1〜4アルキル、−CO2C1〜4アルキル、−CO2H、お
よび−CONH2基からなる群から選択される1個または複数の置換基で置換されていて
もよいC1〜8アルキル;あるいは
(2)1もしくは2個のフェニル基、または1個のナフチル、イミダゾール、もしくはインドール基で置換されているC1〜4アルキル基(ここで、各フェニルは、−OH、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードから独立に選択される1、2、または3個の置換基で置換されていてもよい);
nは、0または1であり;
pは、0または1であり;
Xは、その各炭素が−CO2H、−NH2、または−NHC(O)Ryで置換されていて
もよいC1〜8アルキレンまたはC2〜8アルケニレンであり;
(ここで、前記アルキレンのうちの1個の炭素は、−C(O)NH−、5員のヘテロアリール環、または−S−S−で置き換えられていてもよい);かつ
Ryは、−C1〜4アルキルまたは−CH(Rz)CO2Hである
(ここで、Rzは、−Hか、または−OH、−SH、もしくは−NH2で置換されていてもよい−C1〜4アルキルである)]。 - 1つまたは複数のメディトープが多価メディトープである、請求項85から91のいずれかに記載の方法。
- メディトープが診断剤にカップリングされている、請求項85から92のいずれかに記載の方法。
- 診断剤がイメージング剤である、請求項93に記載の方法。
- イメージング剤が、蛍光物質、発光物質、色素、指示薬、および放射性物質からなる群から選択される、請求項94に記載の方法。
- イメージング剤がDOTAである、請求項95に記載の方法。
- メディトープ利用可能抗体またはそのフラグメントを作成する方法であって:
テンプレート抗体またはそのフラグメントにおいて1つまたは複数のアミノ酸置換を行うが、その際、置換は、Kabatナンバリングに従うとVL領域の40、41、もしくは85位、またはVH領域の40位もしくは89位での置換を包含し、
それによって、配列番号1、2、16〜18、23、29、31、32、36、39、42、43、45、46、51、52、54、および55で示される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド、またはそれに由来する環式ペプチドであるメディトープに結合するメディトープ利用可能抗体またはそのフラグメントを作成するステップを含む方法。 - テンプレート抗体またはそのフラグメントが、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、ペンテト酸アルツモマブ、アナツモマブ、アナツモマブマフェナトクス、アルシツモマブ、アトリズマブ、バシリキシマブ、ベクツモマブ、エクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、カプロマブ、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、セルトリズマブ、クリバツズマブテトラキセタン、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エタラシズマブ、エルツマキソマブ、ファノレソマブ、Fbta05、フォントリズマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、ラベツズマブ、メポリズマブ、ムロモナブ、ムロモナブ−CD3、ナタリズマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、サツモマブ、スレソマブ、イブリツモマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、Trbs07、ウステキヌマブ、ビシリズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ブロダルマブ、アンルキンズマブ、バピヌズマブ、ダロツズマブ、デムシズマブ、ガニツマブ、イノツズマブ、マブリリムマブ、モキセツモマブパスドトックス、リロツムマブ、シファリムマブ、タネズマブ、トラロキヌマブ、トレメリムマブ、ウレルマブ、B6H12.2、およびハイブリドーマ10B5によって産生される抗体からなる群から選択される、請求項97に記載の方法。
- SPRによって測定した場合に10μM未満の解離定数で、メディトープ利用可能抗体がメディトープに結合する、請求項97または98に記載の方法。
- 解離定数が5μM未満である、請求項99に記載の方法。
- 解離定数が2μM未満である、請求項100に記載の方法。
- メディトープが、配列番号1もしくは2で示されるアミノ酸配列のペプチド、またはそれに由来する環式ペプチドである、請求項97から101のいずれかに記載の方法。
- 1つまたは複数のアミノ酸置換がそれぞれ、Kabatナンバリングに従うと軽鎖の8、9、10、38、39、40、41、42、43、44、45、82、83、84、85、86、87、99、100、101、102、103、104、105、142、162、163、164、165、166、167、168、および173位、または重鎖の6、9、38、39、40、41、42、43、44、45、84、86、87、88
、89、90、91、103、104、105、106、107、108、109、110、147、150、151、152、173、174、175、176、177、185、186、および187位からなる群から選択される位置においての置換である、請求項97から102のいずれかに記載の方法。 - メディトープ利用可能抗体が、Kabatナンバリングに従うとP8、V9またはI9、I10またはL10、Q38、R39、T40、N41 G42、S43、P44、R45、D82、I83、A84、D85、Y86、Y87、G99、A100、G101、T102、K103、L104、E105、R142、S162、V163、T164、E165、Q166、D167、S168、およびY173を有する軽鎖、ならびにKabatナンバリングに従うとQ6、P9、R38、Q39、S40、P41、G42、K43、G44、L45、S84、D86、T87、A88、I89、Y90、Y91、W103、G104、Q105、G106、T107、L108、V111、T110、Y147、E150、P151、V152、T173、F174、P175、A176、V177、Y185、S186、およびL187を有する重鎖を含有する、請求項103に記載の方法。
- 請求項1から30のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
- 請求項105に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項106に記載のベクターを含む、ライブラリ。
- (a)請求項107に記載のライブラリから、抗体またはそのフラグメントを発現させるステップと;
(b)発現された抗体またはフラグメントのうちから、抗体またはそのフラグメントを選択するステップと
を含むスクリーニング方法。 - 選択が、選択される抗体またはそのフラグメントの結合親和性、pH耐性、pH依存性、毒性、PK、またはPDに基づく、請求項108に記載のスクリーニング方法。
- 抗体またはそのフラグメントをメディトープと接触させ、かつ抗体またはフラグメントのうちの1つまたは複数とメディトープとの結合を検出するステップによって、選択を行う、請求項108または109に記載の方法。
- メディトープ類似体またはメディトープ変異体を選択する方法であって、
(a)メディトープおよびメディトープ利用可能抗体またはそのフラグメントを組み合わせ、それによってメディトープが抗体またはそのフラグメントに非共有結合するステップと;
(b)メディトープ変異体または類似体候補を加えるステップと;
(c)メディトープ変異体または類似体候補によるメディトープの置き換えを測定するが、その際、変異体または類似体候補によってメディトープが置き換えられたら、その変異体または類似体候補を、メディトープ変異体または類似体と同定するステップと
を含む、方法。 - 1つまたは複数のアミノ酸置換、挿入または欠失を、配列番号1、2、16〜18、23、29、31、32、36、39、42、43、45、46、51、52、54、および55のうちの任意のもので示される配列を有するペプチド、またはそれに由来する環式
ペプチドに対して行うステップを含み、それによって、請求項1から30のいずれかに記載の抗体またはフラグメントに対するペプチドの結合親和性のpH依存性を変更する、メディトープを修飾するための方法。 - リソソームのpHレベルでの、抗体またはフラグメントに対するペプチドの結合親和性を低下させる、請求項112に記載の方法。
- 低酸素環境下での結合親和性を上昇させる、請求項112または113に記載の方法。
- メディトープ利用可能抗体を修飾するための方法であって、1つまたは複数の修飾を、Kabatナンバリングに従うとメディトープ利用可能抗体の軽鎖の8、9、10、38、39、40、41、42、43、44、45、82、83、84、85、86、87、99、100、101、102、103、104、105、142、162、163、164、165、166、167、168、および/もしくは173位、または重鎖の6、9、38、39、40、41、42、43、44、45、84、86、87、88、89、90、91、103、104、105、106、107、108、109、110、147、150、151、152、173、174、175、176、177、185、186、および/もしくは187位で行うステップを含む、方法。
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