KR20140082794A - 메디토프와 메디토프-결합 항체 및 이들의 용도 - Google Patents

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율롱 마
헹 웨이 창
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신디 제르
크르지스토프 브지멕
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Abstract

항체와 상기 항체에 결합하는 메디토프, 뿐만 아니라 상기 메디토프와 항체를 함유하는 복합체, 조성물 및 조합물과, 치료 및 진단 방법과 용도를 포함하여, 이들을 제조, 사용, 시험, 및 선별하는 방법이 제공된다.

Description

메디토프와 메디토프-결합 항체 및 이들의 용도{MEDITOPES AND MEDITOPE-BINDING ANTIBODIES AND USES THEREOF}
우선권 주장
본원은 2012년 2월 10일자에 출원된 미국 가출원 제61/597,708호; 2011년 10월 10일자에 출원된 미국 특허 제13/270,207호; 및 2011년 10월 10일자에 출원된 국제 출원 번호 PCT/US2011/055656호의 이익을 주장하며, 이들은 그 전문이 참조문헌으로 본원에 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 메디토프와 메디토프-결합 항체 및 이들의 용도에 관한 것이다.
단일클론 항체(mAbs)는 다수의 치료, 진단 및 연구 응용에 사용된다. 치료 및 진단 분야는 암, 항바이러스 치료, 자가면역 및 염증성 질환, 알레르기, 심혈관 실환, 골다공증, 및 류머티스학(rheumatology)을 포함한다.
단백질 공학 및 기타 노력으로 효과와 표적화가 개선된 mAbs (예들 들면, 이중특이적 mAbs), 편재화, 조직 침투, 및 혈액 배출이 개선된 mAbs (예들 들면, 단일쇄 Fab 가변 단편 (scFvs), 2중항체(diabodies), 미니항체(minibodies), 및 기타 단편), 및 면역자극, 안전성, 독성, 및/또는 약동학적/약력학적 특성을 변경시킨 mAbs, 예로서 변형된 Fc 영역을 함유하는 것들 (예들 들면, 돌연변이 또는 글리코실화를 통하여)이 생성되었다. mAbs는 전달 개선을 위하여 소분자의 부위-특이적 접합을 허용하거나 (예를 들면, ThioMABs) 이의 항원에 비가역적으로 결합하도록 (예를 들면, 무한 친화도 mAb) 재조작되었다. mAbs는 또한 생물활성 펩타이드 및 다른 생물물질 (예를 들면, CovX-항체)의 순환 및 제시를 개선하도록 개발되었다. 다양한 약제에 접합시킴으로써 표적화된 면역요법 및 진단 방법이 가능케되었다. 이종 다합체(hetero-multimeric) scFvs와 아비딘에 융합된 scFvs 또는 mAbs가 또한 예비-표적화 치료 및 종양 영상화를 위한 검출 한계를 개선하기 위하여 개발되었다.
mAbs가 효과적일 수 있으며 소분자 접근법에 비해 이점을 갖지만, 현존하는 항체와 방법은 다양한 제한사항을 갖는다. 이들은 표적 이탈(off-target) 상호작용으로 인한 부작용, 및/또는 그중에서도 항체-약물 접합체의 긴 순환 시간으로 인한 부수적 손상을 포함할 수 있다. 개선된 효과, 특이성, 및 안전성을 제공하는 것들을 포함한, 개선된 항체와 관련 화합물, 및 이들의 방법과 용도에 대한 필요성이 있다. 그러한 필요성에 맞춘 항체, 화합물 및 펩타이드와 기타 분자를 포함하는 조성물, 및 관련 방법에 제공된다.
발명의 개요
제공되는 실시양태 중에는, 항체, 화합물, 및 항체와 함께 사용하기 위한 펩타이드와 다른 분자를 포함하는 조성물, 뿐만 아니라 이들, 뿐만 아니라 화합물, 조성물, 복합체, 혼합물 및 시스템, 예를 들면, 이들을 함유하는 키트의 생산 방법 및 용도가 있다. 일부 양태로, 상기 제공되는 실시양태에 의해 입수가능한 항체 및 관련 화합물, 조성물, 방법 및 용도와 비교하여 개선된 효과, 시너지, 특이성 및/또는 안전성이 제공된다.
1개 이상의 메디토프에 결합하는 (즉, 메디토프에 결합할 수 있는), 메디토프-이용가능한 항체 (이들의 단편 포함)가 제공된다. 일부 양태로, 상기 항체는 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로부터 유래된 환형 펩타이드인 메디토프에 결합한다.
일부 양태로, 상기 항체는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로부터 유래된 환형 펩타이드인 메디토프에 결합한다. 일부 양태로, 상기 항체는 서열 번호: 1, 2, 16-18, 23, 29, 31, 32, 36, 39, 42, 43, 45, 46, 51, 52, 54, 및 55에 기재된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 이로부터 유래된 환형 펩타이드, 또는 서열 번호: 1, 2, 및 15-55에 기재된 서열, 또는 이로부터 유래된 환형 펩타이드, 또는 본 명세서에 기재된 임의의 메디토프에 결합한다. 일부 경우에 있어서, 상기 메디토프가 서열 번호: 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열의 펩타이드로부터 유래된 환형 펩타이드이다.
일부 양태로, 상기 항체 또는 이의 단편이 메디토프에, 세툭시맙(cetuximab), 메디토프-이용가능한 트라스투주맙(trastuzumab), 메디토프-이용가능한 M5A, 또는 기타 예시된 항체와 같은, 본 명세서에 기재되는 예시적인 항체들 중 하나와 대등하거나 실질적으로 대등한 친화도와 같은, 특정의 친화도를 갖고 메디토프에 결합한다. 일부 실시예에서, 상기 항체는 메디토프 또는 메디토프들에 약 10 μM 또는 미만, 약 5 μM 또는 미만, 또는 약 2 μM 또는 미만, 약 1 μM 또는 미만, 약 500, 400, 300, 200, 100 nM 또는 미만, 예로서 약 200 피코몰로 또는 그 미만의 해리 상수로, 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 등온 적정 열량측정법(ITC), 형광, 형광 편광, NMR, IR, 열량측정 적정법; 운동 배제법(Kinetic exclusion); 원이색법(Circular dichroism), 차동 주사 열량측정법, 또는 기타 공지의 방법, 예를 들면, SPR과 같은 특정 기술에 의해 측정된 바와 같은 해리 상수로 결합한다.
일부 양태로, 상기 항체는 중쇄 가변(VH) 영역 및/또는 경쇄 가변(VL)영역을 포함한다. 일부 양태로, 상기 VL 영역은 Kabat 넘버링에 따라, 40번 위치에서 트레오닌, 세린, 또는 아스파르테이트, 41번 위치에서 글리신을 제외한 잔기, 및/또는 85번 위치에서 아스파르테이트 또는 아스파라긴을 포함하고/하거나 Kabat 넘버링에 따라, 10번 위치에서 이소류신 또는 류신과 83번 위치에서 이소류신을 포함하고/하거나, Kabat 넘버링에 따라, 9번 위치에서 발린 또는 이소류신과 100번 위치에서 글루타민을 제외한 잔기를 포함한다. 일부 예로, 상기 VL 영역의 아미노산 서열은 Kabat 넘버링에 따라, 40번 위치에서 트레오닌, 41번 위치에서 아스파라긴과 85번 위치에서 아스파르테이트를 갖는다.
일부 양태로, 상기 VH 영역은 Kabat 넘버링에 따라, 40번 위치에서 세린 또는 프롤린과 89번 위치에서 이소류신, 티로신, 메티오닌, 페닐알라닌, 또는 트립토판을 갖는다. 일부 예로, 상기 VH 영역의 아미노산 서열은 Kabat 넘버링에 따라, 40번 위치에서 세린과 89번 위치에서 이소류신을 갖는다.
일부 예로, 상기 VL 영역의 아미노산 서열은 Kabat 넘버링에 따라, 9번 위치에서 발린 또는 이소류신, 10번 위치에서 이소류신 또는 류신, 39번 위치에서 아르기닌, 40번 위치에서 트레오닌, 41번 위치에서 아스파라긴, 42번 위치에서 글리신, 43번 위치에서 세린, 83번 위치에서 이소류신, 85번 위치에서 아스파르테이트, 및 100번 위치에서 알라닌을 갖고/갖거나 상기 VH 영역의 아미노산 서열은 Kabat 넘버링에 따라, 40번 위치에서 세린과 89번 위치에서 이소류신을 갖는다.
제공되는 항체의 일부 양태에서, 상기 VL영역이 Kabat 넘버링에 따라, 40번 위치에서 프롤린, 41번 위치에서 글리신, 및/또는 85번 위치에서 트레오닌을 함유 하지 않고/않거나 상기 VH 영역이 Kabat 넘버링에 따라, 40번 위치에서 아스파라긴 또는 알라닌 및/또는 89번 위치에서 발린을 함유하지 않는다.
일부 양태로, 상기 VL 영역이 Kabat 넘버링에 따라, 10번 위치에서 세린, 40번 위치에서 프롤린, 41번 위치에서 글리신, 및 83번 위치에서 페닐알라닌, 및/또는 85번 위치에서 트레오닌을 함유하지 않고/않거나 상기 VH 영역이 Kabat 넘버링에 따라, 40번 위치에서 아스파라긴 또는 알라닌 및/또는 89번 위치에서 발린을 함유하지 않는다.
일부 양태로, 상기 항체 (단편 포함)가 1개 이상의 불변 영역, 전형적으로는 인간 불변 영역(들), 예로서 CL 및/또는 CH1, 예를 들면, 인간 CL 및/또는 CH1을 추가로 포함한다.
일부 양태로, 상기 제공되는 항체 또는 이의 단편이 서열 번호: 71 또는 서열 번호: 61에 기재된 경쇄 서열의 경쇄 프레임워크 영역(FR) 1(FR-L1), FR-L2, FR-L3, 및/또는 FR-L4 (또는 서열 번호:71 또는 61의 경쇄의 FR-L1, FR-L2, FR-L3, 및/또는 FR-L4와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 또는 그와 대략 동일한 FR-L1, FR-L2, FR-L3, 및/또는 FR-L4)을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 VL 영역, 및 일부 양태로, 서열 번호: 71에 기재된 경쇄 서열의 CDRs와 구별되는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR); 및/또는 서열 번호: 72 또는 서열 번호: 63에 기재된 중쇄 서열의 중쇄 FR1(FR-H1), FR-H2, FR-H3, 및/또는 FR-H4 (또는 또는 서열 번호:72 또는 63의 중쇄의 FR-H1, FR-H2, FR-H3, 및/또는 FR-H4와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 또는 그와 대략 동일한 FR-H1, FR-H2, FR-H3, 및/또는 FR-H4)를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH 영역, 및 일부 양태로 서열 번호: 72에 기재된 중쇄 서열의 CDRs와 구별되는 하나 이상의 CDR을 갖는다.
일부 양태로, 제공되는 항체 또는 이의 단편이 서열 번호: 61에 기재된 경쇄 서열의 CDR, 서열 번호: 63에 기재된 중쇄 서열의 CDR을 갖는다.
일부 양태로, 상기 VL이 서열 번호: 76의 아미노산 서열을 포함하며 상기 VH가 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태로, 상기 항체가 서열 번호: 9에 기재된 경쇄 서열의 경쇄 프레임워크 영역(FR) 1(FR-L1), FR-L2, FR-L3, 및/또는 FR-L4 (또는 서열 번호: 9의 경쇄의 FR-L1, FR-L2, FR-L3, 및/또는 FR-L4와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 또는 그와 대략 동일한 FR-L1, FR-L2, FR-L3, 및/또는 FR-L4)을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 VL 영역; 및/또는 서열 번호: 9에 기재된 중쇄 서열의 중쇄 FR1(FR-H1), FR-H2, FR-H3, 및/또는 FR-H4 (또는 또는 서열 번호:9의 FR-H1, FR-H2, FR-H3, 및/또는 FR-H4와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 또는 그와 대략 동일한 FR-H1, FR-H2, FR-H3, 및/또는 FR-H4)를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 갖는다. 일부 예로, 상기 VL 영역이 서열 번호: 9에 기재된 VL 서열의 CDRs와 구별되는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고/하거나 상기 VH 영역이 서열 번호: 6에 기재된 VH 서열의 CDRs와 구별되는 하나 이상의 CDR을 포함한다.
일부 예로, 상기 VL 영역이 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 예로, 상기 VH 영역이 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태로, 상기 항체 또는 이의 단편이 서열 번호: 68에 기재된 경쇄 서열의 경쇄 프레임워크 영역(FR) 1(FR-L1), FR-L2, FR-L3, 및/또는 FR-L4 (또는 서열 번호: 68의 경쇄의 FR-L1, FR-L2, FR-L3, 및/또는 FR-L4와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 또는 그와 대략 동일한 FR-L1, FR-L2, FR-L3, 및/또는 FR-L4)을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 예로, 상기 VL 영역이 서열 번호: 69에 기재된 경쇄 서열의 CDRs와 구별되는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고/하거나 상기 VH 영역이 서열 번호: 70에 기재된 중쇄 서열의 CDRs와 구별되는 하나 이상의 CDR을 포함한다.
일부 예로, 상기 VL 영역이 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태로, 상기 항체가 세툭시맙(cetuximab)에 의해 특이적으로 결합되는 EGFR의 에피토프에 특이적으로 결합하지 않으며, 세툭시맙의 CDRs를 함유하지 않고/않거나 세툭시맙과 결합하는 항원에 대해 경쟁하지 않는다. 다른 양태로, 상기 항체가 세툭시맙이다.
일부 양태로, 항체 또는 이의 단편이 결합하는 항원에 대해 경쟁하며, 동일한 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하고/하거나, 1개 이상 또는 모든 CDRs (또는 상기 CDRs와 적어도 약 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 또는 그와 대략 동일한 CDRs), 예를 들면, 임의의 상업적으로 입수가능한 항체, 예로서, 아바고보맙(abagovomab), 아브식시맙(abciximab), 아달리무맙(adalimumab), 아데카투무맙(adecatumumab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 알투모맙(altumomab), 알투모맙 펜테테이트(altumomab pentetate), 아나투모맙(anatumomab), 아나투모맙 마페나톡스(anatumomab mafenatox), 아르시투모맙(arcitumomab), 아틀리주맙(atlizumab), 바실릭시맙(basiliximab), 벡투모맙(bectumomab), 엑투모맙(ectumomab), 벨리무맙(belimumab), 벤랄리주맙(benralizumab), 베바시주맙(bevacizumab), 브렌툭시맙(brentuximab), 카나키누맙(canakinumab), 카프로맙(capromab), 카프로맙 펜데타이드(capromab pendetide), 카투막소맙(catumaxomab), 세르톨리주맙(certolizumab), 클리바투주맙 테트락세탄(clivatuzumab tetraxetan), 다클리주맙(daclizumab), 데노수맙(denosumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 에드레콜로맙(edrecolomab), 에팔리주맙(efalizumab), 에타르시주맙(etaracizumab), 에르툭소맙(ertumaxomab), 파놀레소맙(fanolesomab), Fbta05, 폰톨리주맙(fontolizumab), 겜투주맙(gemtuzumab), 기렌툭시맙(girentuximab), 골리무맙(golimumab), 이브리투모맙(ibritumomab), 이고보맙(igovomab), 인플릭시맙(infliximab), 이필리무맙(ipilimumab), 라베투주맙(labetuzumab), 메폴리주맙(mepolizumab), 무로모납(muromonab), 무로모납-CD3, 나탈리주맙(natalizumab), 네시투무맙(necitumumab), 니모투주맙(nimotuzumab), 오파투무맙(ofatumumab), 오말리주맙(omalizumab), 오레고보맙(oregovomab), 팔리비주맙(palivizumab), 파니투무맙(panitumumab), 라니비주맙(ranibizumab), 리툭시맙(rituximab), 사투모맙(satumomab), 술레소맙(sulesomab), 이브리투모맙(ibritumomab), 이브리투모맙 티욱세탄(ibritumomab tiuxetan), 토실리주맙(tocilizumab), 토시투모맙(tositumomab), 트라스투주맙(trastuzumab), Trbs07, 우스테키누맙(ustekinumab), 비실리주맙(visilizumab), 보투무맙(votumumab), 잘루투무맙(zalutumumab), 및/또는 브로달루맙(brodalumab); 및/또는 안루킨주맙(anrukinzumab), 바피네우주맙(bapineuzumab), 달로투주맙(dalotuzumab), 뎀시주맙(demcizumab), 가니투맙(ganitumab), 이노투주맙(inotuzumab), 마브릴리무맙(mavrilimumab), 목세투모맙 파수도톡스(moxetumomab pasudotox), 릴로투무맙(rilotumumab), 사이팔리무맙(sifalimumab), 타네주맙(tanezumab), 트랄로키누맙(tralokinumab), 트레멜리무맙(tremelimumab), 우렐루맙(urelumab), 하이브리도마(hybridoma) 10B5에 의해 생산된 항체 (참조: Edelson & Unanue, Curr Opin Immunol, 2000 Aug;12(4):425-31), B6H12.2 (abcam) 또는 기타 항-CD47 항체 (참조: Chao et al., Cell, 142, 699-713, September 3, 2010); 및/또는 서열 번호: 78-124, 및/또는 125-170 중 어느 하나에 기재된 서열을 갖는 항체 또는 이의 단편을 포함하여, 공지의 항체 1개 이상의, 중쇄 CDR 1, 2, 및/또는 3 및/또는 경쇄 CDR1, 2, 및/또는 3을 포함하는 CDRs를 1개 이상 또는 모두 포함한다.
일부 양태로, 상기 항체 또는 이의 단편이 CA-125, 당단백질 (GP) IIb/IIIa 수용체, TNF-알파, CD52, TAG-72, 암배아성 항원 (CEA), 인터류킨-6 수용체 (IL-6R), IL-2, 인터류킨-2 수용체 a-쇄 (CD25), CD22, B-세포 활성화 인자, 인터류킨-5 수용체 (CD125), VEGF, VEGF-A, CD30, IL-1베타, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), CD3, EpCAM, EGF 수용체 (EGFR), MUC1, 인간 인터류킨-2 수용체, Tac, RANK 리간드, 보체 단백질, 예를 들면, C5, EpCAM, CD11a, 예를 들면, 인간 CD11a, 인테그린(integrin), 예를 들면, 알파-v 베타-3 인테그린, 비트로넥틴(vitronectin) 수용체 알파 v 베타 3 인테그린, HER2, neu, CD3, CD15, CD20 (작은 루프 및/또는 큰 루프), 인터페론 감마, CD33, CA-IX, TNF 알파, CTLA-4, 암배아성 항원, IL-5, CD3 엡실론, CAM, 알파-4-인테그린, IgE, 예를 들면, IgE Fc 영역, RSV 항원, 예를 들면, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)의 F 단백질, TAG-72, NCA-90(과립구 세포 항원), IL-6, GD2, GD3, IL-12, IL-23, IL-17, CTAA16.88, IL13, 인터류킨-1 베타, 베타-아밀로이드, IGF-1 수용체 (IGF-1R), 델타-유사 리간드 4 (DLL4), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 수용체의 알파 서브유닛, 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor), IFN-알파, 신경 성장 인자, IL-13, CD326, 프로그램된 세포 사멸 1 리간드 1 (PD-L1, a.k.a. CD274, B7-H1), CD47, 및 CD137로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 양태로, 상기 항체 또는 이의 단편이 Kabat 넘버링에 따라서, P8　, V9 또는 I9, I10 또는 L10, Q38, R39, T40, N41 G42, S43, P44, R45, D82, I83, A84, D85, Y86, Y87, G99, A100, G101, T102, K103, L104, E105, R142, S162, V163, T164, E165, Q166, D167, S168, 및/또는 Y173을 갖는 경쇄를 갖고/갖거나 Kabat 넘버링에 따라서, Q6, P9, R38, Q39, S40, P41, G42, K43, G44, L45, S84, D86, T87, A88, I89, Y90, Y91, W103, G104, Q105, G106, T107, L108, V111, T110, Y147, E150, P151, V152, T173, F174, P175, A176, V177, Y185, S186, 및/또는 L187을 갖는 중쇄를 갖는다.
1개 이상의 메디토프에 결합된 항체 또는 항체들 (예를 들면, 메디토프-이용가능한 항체)을 함유하는 복합체가 또한 제공된다. 상기 항체 또는 항체들은 전술한 항체들 (이들의 단편을 포함하여) 중 임의의 하나와 같은, 본 명세서에 기재된 메디토프-이용가능한 항체들 중 임의의 하나일 수 있다. 상기 1개 이상의 메디토프는 1가 및 다가 메디토프, 및 표지화된 메디토프, 뿐만 아니라 메디토프 융합 단백질을 포함하여, 본 섹션에 기재된 것들과 같이, 본 명세서에 기재된 1개 이상의 메디토프 중 임의의 하나를 포함할 수 있다.
메디토프, 예를 들면, 분리된 메디토프가 또한 제공된다. 상기 제공된 메디토프 중에는 상기한 것들이 있다. 상기 제공된 메디토프 중에는 메디토프-이용가능한 항체의 메디토프 결합 부위에 결합하는 펩타이드를 포함하는 것들이 있으며, 여기서 상기 펩타이드는 서열 번호: 1 또는 2의 펩타이드 또는 이로부터 유래된 환형 펩타이드가 아니다. 다른 양태로, 상기 메디토프가 서열 번호: 1 또는 2의 펩타이드, 또는 이로부터 유래된 환형 펩타이드이다.
일부 양태로, 상기 메디토프 (예를 들면, 펩타이드)가 약 10 μM 또는 미만, 약 5 μM 또는 미만, 또는 약 2 μM 또는 미만, 약 1 μM 또는 미만, 약 500, 400, 300, 200, 100 nM 또는 미만, 예로서 약 200 피코몰로 또는 그 미만의 해리 상수로, 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 등온 적정 열량측정법(ITC), 형광, 형광 편광, NMR, IR, 열량측정 적정법; 운동 배제법(Kinetic exclusion); 원이색법(Circular dichroism), 차동 주사 열량측정법, 또는 기타 공지의 방법, 예를 들면, SPR과 같은 특정 기술에 의해 측정된 바와 같은 해리 상수로 메디토프 결합 부위에 결합한다.
일부 양태로, 상기 메디토프 결합 부위가 Kabat 넘버링에 따라, 메디토프-이용가능한 항체의 경쇄의 40, 41, 83, 및/또는 85번 잔기, 및/또는 Kabat 넘버링에 따라, 메디토프-이용가능한 항체의 중쇄의 108번 잔기를 포함한다.
일부 양태로, 상기 메디토프가 서열 번호: 71에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 번호: 72에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 갖는 메디토프-이용가능한 항체; 서열 번호: 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 번호: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 갖는 메디토프-이용가능한 항체; 및/또는 서열 번호: 68에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및/또는 서열 번호: 70에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 갖는 메디토프-이용가능한 항체에 결합한다.
일부 양태로, 상기 펩타이드는 길이상 5 내지 16개 아미노산이다.
일부 양태로, 상기 펩타이드가 하기 화학식 I를 갖는다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12 (화학식 I)
상기 식에서,
X1는 Cys, Gly, β-알라닌, 2,3-디아미노프로피온산, β-아지도알라닌이거나, 존재하지 않으며;
X2는 Gln이거나 존재하지 않고;
X3은 Phe, Tyr, β-β'-디페닐-Ala, His, Asp, 2-브로모-L-페닐알라닌, 3-브로모-L-페닐알라닌, 또는 4-브로모-L-페닐알라닌, Asn, Gln, 변형된 Phe, 수화가능한 카르보닐-함유 잔기; 또는 붕산-함유 잔기이며;
X4는 Asp 또는 Asn이고;
X5는 Leu; β-β'-디페닐-Ala; Phe; 페닐알라닌, 트립토판, 또는 티로신의 비-천연 유사체; 수화가능한 카르보닐-함유 잔기; 또는 붕산-함유 잔기이며;
X6는 Ser 또는 Cys이고;
X7은 Thr 또는 Ser 또는 Cys이며;
X8은 Arg, 변형된 Arg, 또는 수화가능한 카르보닐 또는 붕산-함유 잔기이고;
X9은 Arg, Ala이며;
X10은 Leu, Gln, Glu, β-β'-디페닐-Ala; Phe; 페닐알라닌, 트립토판, 또는 티로신의 비-천연 유사체; 수화가능한 카르보닐-함유 잔기; 또는 붕산-함유 잔기이고;
X11은 Lys이며;
X12는 Cys, Gly, 7-아미노헵타노산, β-알라닌, 디아미노프로피온산, 프로파르길글리신, 이소아스파르트산이거나 존재하지 않고,
여기서,
상기 변형된 Arg는 도 34에 나타낸 화학식의 구조를 가지며,
상기 변형된 Phe는 하나 이상의 할로겐이 페닐 환으로 혼입된 Phe이고,
화학식 I은 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2 또는 이로부터 유래된 환형 펩타이드가 아니다.
일부 양태로, 상기 펩타이드가 고리화(cyclization)가 디설파이드 가교, 티오에테르 가교, 락탐 연결, 고리화첨가반응(cycloaddition)에 의한 것과 같은, 환형 펩타이드이다. 특정 양태로, 상기 펩타이드가 화학식 (I)의 것일 때, 고리화는 X1과 X12, X1과 X11, X3과 X11, X4와 X11, 또는 X21와 X12 사이에서의 연결을 통한다. 일부 양태로, 상기 펩타이드가 화학식(I)의 것일 때, 테논(thenon)-천연 아미노산이 β-β'-디페닐-Ala, 분지된 알킬, 또는 연장된 방향족이다. 일부 양태로, 상기 펩타이드가 화학식(I)의 것일 때, 1개 이상의 할로겐 각각은 오르토-, 메타-, 또는 파라-브로모 페닐 치환기이다.
제공되는 메디토프중에 서열 번호: 1, 2, 및 15-55, 예를 들면, 1, 2, 16-18, 23, 29, 31, 32, 36, 39, 42, 43, 45, 46, 51, 52, 54, 및 55에 기재된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 예를 들면, 16-18, 23, 29, 31, 32, 36, 39, 42, 43, 45, 46, 51, 52, 54, 및 55에 기재된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖는 펩타이드, 또는 이로부터 유래된 환형 펩타이드가 있다.
일부 양태로, 상기 메디토프가 화학식(X)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다:
Figure pct00001
상기 식에서,
"*"로 표시된 중심은 "R" 또는 "S" 배열로 존재하고;
R3 및 R3'는, 각각 독립적으로, H이거나 C1-4 알킬, -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된, 페닐이며;
R5는
(A) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CO2C1-4 알킬, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CONH2 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬이거나;
(B) a) 1개 또는 2개의 페닐 기 (여기서 각각의 페닐은 -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된다); 또는
b) 나프틸, 이미다졸, 또는 인돌 기
로 치환된 C1-4 알킬이고;
R6는 -C1-4 알킬-OH 또는 -C1-4 알킬-SH이며;
R7은 -C1-4 알킬-OH 또는 -C1-4 알킬-SH이고;
m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이며;
R8은
(a) -OH, -NRaRb, -N(Rc)C(O)Re, 또는 -N(Rc)C(=NRd)Re; 또는
(여기서,
Ra는 H이고;
Rb는 H이거나, 옥소, 아세탈, 및 케탈, -B(OH)2, -SH, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 또는 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬이며;
Rc는 H, C1-8 알킬, C3-8 사이클로알킬, 분지된 알킬, 또는 아릴이고;
Rd는 H이거나, 각각 -N3, -NH2, -OH, -SH, 할로겐, 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬, C2-8 알케닐, C2-8 알키닐, C3-8 사이클로알킬, 분지된 알킬, 또는 아릴 기이며;
Re는 H; -NHRd; 또는 각각 -N3, -NH2, -OH, -SH, 옥소, C2-4아세탈, C2-4케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, 및 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-12알킬, C3-8사이클로알킬, C2-12알케닐, C2-8알키닐, 또는 아릴 기이다)
(b) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, -SH, -OH, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, 또는 -CO2C1-4알킬 기로 치환된 C1-12 알킬이고;
R9는 C1-4알킬 또는-C1-2알킬렌-Rx이며, 여기서 Rx는 -CO2H, -CONH2, -CH2NHC(O)NH2, 또는 -CH2NHC(=NH)NH2이고;
R10은
(1) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CONH2 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬; 또는
(2) 1개 또는 2개의 페닐 기, 또는 1개의 나프틸, 이미다졸, 또는 인돌 기로 치환된 C1-4 알킬 기 (여기서, 각각의 페닐은 -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개, 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된다)이고;
n은 0 또는 1이며;
p는 0 또는 1이고;
X는 각각의 탄소가 -CO2H, -NH2, 또는 -NHC(O)Ry로 임의로 치환된, C1-8 알킬렌 또는 C2-8 알케닐렌이며, 여기서 상기 알킬렌의 탄소 1개는 -C(O)NH-, 5-원 헤테로아릴 환, 또는 -S-S-로 임의로 치환되며;
Ry는 -C1-4알킬 또는-CH(Rz)CO2H이고, Rz는 -H이거나 -OH, -SH, 또는 -NH2로 임의로 치환된, -C1-4알킬이다.
하나의 실시양태로, 메디토프가 메디토프 결합 부위에서 시스테인에 공유결합식으로 결합하는 시스테인을 함유한다. 그러한 메디토프는 치료학적 분자, 예로서 마커(marker)와 같은 소분자 진단 분자일 수 있는 임의의 물질, 분자 또는 화합물에 접합될 수 있다. 일부 양태로, 상기 "Cys 메디토프"가 상기 접합체가 Ig로 향하도록 하고 공유결합 연결을 통하여 결합한다.
또한, 상기 제공되는 메디토프중에, 표지화된 메디토프, 예로서 메디토프 (예로서 상기한 것들 중 임의의 하나)와 치료제 또는 진단제를 포함하는 것들이 있다. 일부 양태로, 상기 치료제 또는 진단제가 금속 이온에 결합된 금속 킬레이터, 소분자, 화학요법제, 치료적 항체 또는 작용성 단편, 독소, 방사성동위원소, 효소, 뉴클레아제, 호르몬, 면역조절제, 올리고뉴클레오타이드, 유기 또는 무기 나노입자, RNAi 분자, siRNA, 킬레이터, 붕소 화합물, 광활성제, 염료, 형광 또는 발광 물질, 효소, 증진제, 방사성 물질, 및 킬레이터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한 상기 제공되는 메디토프중에, 예를 들면, 상기 2종 이상의 메디토프 각각은 메디토프-이용가능한 항체의 메디토프 결합 부위에 결합하는 펩타이드일 때, 2종 이상의 메디토프와 1종 이상의 링커(linker)를 포함하는 것들과 같은 다가 메디토프가 있다. 그러한 다가 메디토프는 본 명세서, 예를 들어 상기 기재된 메디토프 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 하나의 양태로, 상기 2종 이상의 메디토프가 적어도 3종의 메디토프, 또는 적어도 4종의 메디토프를 포함한다. 하나의 양태로, 상기 1종 이상의 링커가 펩타이드, 작은 화학적 스캐폴드, 바이오틴-스트렙트아비딘, 유기 또는 무기 나노입자, 폴리뉴클레오타이드 서열, 펩타이드 핵산, 유기 폴리머, 또는 면역글로불린 Fc 도메인을 포함한다.
또한 상기 제공되는 양태중에 메디토프-이용가능한 항체중 임의의 것과 본 명세서에 기재된, 예를 들면 상기한 바와 같은 메디토프중 임의의 것을 함유하는 것들을 포함하여, 메디토프-이용가능한 항체-메디토프 복합체가 있다. 일부 경우에 있어서, 상기 펩타이드는 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정될 때, 10 μM 미만의 해리 상수로, 또는 상기한 바와 같은 다른 친화도로 메디토프 결합 부위에 결합한다.
또한, 상기 메디토프 및/또는 항체중 임의의 것과 같은, 메디토프 및/또는 항체를 사용하는 방법이 제공된다. 예를 들면, 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편, 또는 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편을 발현시키는 세포를 정제하는 방법이 제공된다. 하나의 양태로, 그러한 방법은 메디토프-이용가능한 항체, 단편, 또는 세포를 포함하는 조성물을 메디토프와, 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편이 펩타이드에 결합하는 조건하에서 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 양태로, 이들은 이후 상기 항체 또는 이의 단편 또는 세포를 분리시키는 단계를 포함한다. 일부 양태로 그러한 방법에 의해 항체, 단편, 또는 세포를 정제한다.
일부 양태로, 메디토프를 고체 지지체에 커플링시킨다. 일부 양태로, 상기 분리 또는 정제가 pH에서의 변화에 의해 수행된다.
메디토프 (다가 및 표지화된 메디토프를 포함), 메디토프-이용가능한 항체, 및 복합체, 및/또는 본 명세서, 예를 들면 상기에 기재된 기타 화합물을 포함하는 조성물, 예를 들면, 약학 조성물이 또한 제공된다. 하나의 예로, 상기 조성물이 복합체, 메디토프, 및/또는 메디토프-이용가능한 항체와 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
상기와 같은 약학 조성물, 또는 메디토프-이용가능한 항체 중 임의의 것, 메디토프, 복합체, 및/또는 본 명세서, 예를 들면, 상기에 기재된 기타 화합물을 피험체에 투여함으로써 수행되는 것과 같은 치료 방법이 또한 제공된다. 하나의 예로, 상기 방법은 피험체에게 상기한 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 투여하는 단계를 포함한다.
하나의 예로, 상기 치료 방법이 피험체에게 1개 이상의 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편, 예를 들면, 상기한 바와 같은 것들 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 예로, 상기 방법이 상기한 바와 같은 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편 1개 이상, 및 메디토프, 예를 들면, 다가 메디토프와 치료제 또는 진단제에 커플링되어 있는 메디토프를 포함하여, 상기한 것들 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 양태로, 상기 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편과 1개 이상의 메디토프를 순차적으로 투여한다. 다른 양태로, 이들을 동시적으로 투여한다. 일반적으로, 상기 1개 이상의 메디토프는 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편의 메디토프 결합 부위에 결합하는 펩타이드를 포함한다. 하나의 양태로, 상기 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편이 상기 1개 이상의 메디토프에 결합되어 있어, 메디토프-이용가능한 항체와 1개 이상의 메디토프의 투여가 메디토프-이용가능한 항체와 메디토프의 복합체가 투여되도록 한다. 다른 양태로, 상기 메디토프-이용가능한 항체가 상기 1개 이상의 메디토프 투여 전에 투여된다.
일부 양태로, 상기 1개 이상의 메디토프가 치료제, 예로서 약물, 화학요법제, 치료적 항체, 독소, 방사성동위원소, 효소, 킬레이터, 붕소 화합물, 광활성제, 염료, 금속, 금속 합금, 및 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료제에 커플링되어 있다.
피험체에게 상기와 같은 약학 조성물, 또는 메디토프-이용가능한 항체 중 임의의 것, 메디토프, 복합체, 및/또는 본 명세서, 예를 들면, 상기에 기재된 기타 화합물을 투여하고, 투여된 조성물, 항체, 메디토프, 복합체, 및/또는 화합물이 피험체중의 물질, 예를 들면, 항원에 결합하는 것을 검출함으로써 수행되는 것과 같은, 진단 방법이 또한 제공된다. 일부 양태로, 상기 진단 방법이 피험체에게 1개 이상의 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편, 예를 들면, 상기 기재된 것들 중 임의의 것을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태로, 진단 방법이 상기 항체 또는 이의 단편이 피험체중의 항원에 결합하는 것을 검출하는 단계를 또한 포함한다. 일부 양태로, 상기 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편 및 1개 이상의 메디토프가 순차적으로 투여되며; 다른 양태로, 이들이 동시적으로 투여된다. 하나의 예로, 상기 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편이 1개 이상의 메디토프에 결합되어 있어, 메디토프-이용가능한 항체와 1개 이상의 메디토프의 투여에 메디토프-이용가능한 항체와 메디토프의 복합체의 투여 단계를 포함하도록 한다. 다른 예로, 상기 메디토프-이용가능한 항체가 1개 이상의 메디토프 투여전에 투여된다. 일부 양태로, 상기 메디토프 또는 메디토프들이 다가 메디토프이다. 일부 양태로, 상기 메디토프가 진단제, 예로서 영상화제, 예를 들면, 형광 물질, 발광 물질, 염료, 표시제(indicators), 및 방사성 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 영상화제에 커플링되어 있다. 일부 경우에 있어서, 상기 영상화제가 DOTA이다.
메디토프-이용가능한 항체 또는 이들의 단편을 예를 들면, 주형 항체를 기본으로 하여 생성시키는 방법이 또한 제공된다. 일부 양태로, 그러한 방법은 주형 항체 또는 이의 단편에서 아미노산 1개이상을 치환시키는 단계를 포함한다. 하나의 예로, 상기 치환은 Kabat 넘버링에 따라, Vㅣ 영역의 40번, 41번, 또는 85번 위치, 및/또는 VH 영역의 40번 또는 89번 위치에서의 치환을 포함한다.
일부 양태로, 상기 방법은 서열 번호: 1, 2, 16-18, 23, 29, 31, 32, 36, 39, 42, 43, 45, 46, 51, 52, 54, 및 55에 기재된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 이로부터 유래된 환형 펩타이드인 메디토프에 결합하는 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편을 생성시킨다.
일부 양태로, 상기 주형 항체 또는 이의 단편이 아바고보맙(abagovomab), 아브식시맙(abciximab), 아달리무맙(adalimumab), 아데카투무맙(adecatumumab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 알투모맙(altumomab), 알투모맙 펜테테이트(altumomab pentetate), 아나투모맙(anatumomab), 아나투모맙 마페나톡스(anatumomab mafenatox), 아르시투모맙(arcitumomab), 아틀리주맙(atlizumab), 바실릭시맙(basiliximab), 벡투모맙(bectumomab), 엑투모맙(ectumomab), 벨리무맙(belimumab), 벤랄리주맙(benralizumab), 베바시주맙(bevacizumab), 브렌툭시맙(brentuximab), 카나키누맙(canakinumab), 카프로맙(capromab), 카프로맙 펜데타이드(capromab pendetide), 카투막소맙(catumaxomab), 세르톨리주맙(certolizumab), 클리바투주맙 테트락세탄(clivatuzumab tetraxetan), 다클리주맙(daclizumab), 데노수맙(denosumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 에드레콜로맙(edrecolomab), 에팔리주맙(efalizumab), 에타라시주맙(etaracizumab), 에르투막소맙(ertumaxomab), 파놀레소맙(fanolesomab), Fbta05, 폰톨리주맙(fontolizumab), 겜투주맙(gemtuzumab), 기렌툭시맙(girentuximab), 골리무맙(golimumab), 이브리투모맙(ibritumomab), 이고보맙(igovomab), 인플릭시맙(infliximab), 이필리무맙(ipilimumab), 라베투주맙(labetuzumab), 메폴리주맙(mepolizumab), 무로모납(muromonab), 무로모납-CD3, 나탈리주맙(natalizumab), 네시투무맙(necitumumab), 니모투주맙(nimotuzumab), 오파투무맙(ofatumumab), 오말리주맙(omalizumab), 오레고보맙(oregovomab), 팔리비주맙(palivizumab), 파니투무맙(panitumumab), 라니비주맙(ranibizumab), 리툭시맙(rituximab), 사투모맙(satumomab), 술레소맙(sulesomab), 이브리투모맙(ibritumomab), 이브리투모맙 티욱세탄(ibritumomab tiuxetan), 토실리주맙(tocilizumab), 토시투모맙(tositumomab), 트라스투주맙(trastuzumab), Trbs07, 우스테키누맙(ustekinumab), 비실리주맙(visilizumab), 보투무맙(votumumab), 잘루투무맙(zalutumumab), 및 브로달루맙(brodalumab)으로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 하이브리도마 10B5에 의해 생산된 항체이거나, B6H12.2이다.
일부 양태로, 상기 메디토프-이용가능한 항체가 1개 이상의 메디토프 (예를 들면, 서열 번호: 1, 2 중 하나, 또는 이로부터 유래된 환형 펩타이드), 예를 들면, 상기 기재된 것들에, SPR에 의해, 또는 상기 기재된 다른 방법에 의해 측정된 바, 10, 5, 또는 2 μM(또는 상기 명시된 다른 숫자) 미만의 해리 상수와 같은, 특정의 친화도로 결합한다.
일부 양태로, 상기 1개 이상의 아미노산 치환 각각이 Kabat 넘버링에 따라, 경쇄의 8　, 9, 10, 38, 39, 40, 41 42, 43, 44, 45, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 142, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 및 173번, 및/또는 중쇄의 6, 9, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 147, 150, 151, 152, 173, 174, 175, 176, 177, 185, 186, 및 187번 위치로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 있다. 일부 양태로, 상기 메디토프-이용가능한 항체가 Kabat 넘버링에 따라, P8　, V9 또는 I9, I10 또는 L10, Q38, R39, T40, N41 G42, S43, P44, R45, D82, I83, A84, D85, Y86, Y87, G99, A100, G101, T102, K103, L104, E105, R142, S162, V163, T164, E165, Q166, D167, S168, 및 Y173을 갖는 경쇄와 Kabat 넘버링에 따라, Q6, P9, R38, Q39, S40, P41, G42, K43, G44, L45, S84, D86, T87, A88, I89, Y90, Y91, W103, G104, Q105, G106, T107, L108, V111, T110, Y147, E150, P151, V152, T173, F174, P175, A176, V177, Y185, S186, 및 L187을 갖는 중쇄를 함유한다.
메디토프-이용가능한 항체와 메디토프를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 뿐만 아니라 이를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터를 포함하는 라이브러리가 또한 제공된다.
또한, 상기 라이브러리로부터 항체 또는 이의 단편을 발현시키는 단계, 및 발현된 항체 또는 이의 단편으로부터 항체 또는 이의 단편을 선택하는 단계를 포함하는 것과 같은, 선별 방법이 제공된다. 일부 경우에 있어서, 상기 선택은 선택된 항체 또는 이의 단편의 결합 친화도, pH 내성, pH 의존성, 독성, PK, 또는 PD를 기초로 하고/하거나 항체 또는 이의 단편을 메디토프와 접촉시키고 1개 이상의 항체 또는 이의 단편에 대한 결합을 검출함으로써 수행된다.
또한, 메디토프 유사체 또는 메디토프 변이체를 선택하는 방법이 제공되며, 이는 (a) 메디토프와 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편을 합하여, 항체 또는 이의 단편에 메디토프가 비-공유결합으로 결합하도록 하는 단계; 및 (b) 후보 메디토프 변이체 또는 유사체를 첨가하는 단계; 및 (c) 후보 메디토프 변이체 또는 유사체에 의한 메디토프의 대체량을 측정함으로서, 후보 변이체 또는 유사체에 의한 메디토프의 대체로 메디토프 변이체 또는 유사체로서 확인하는 단계를 포함한다.
메디토프의 변형 방법을 포함하여, 메디토프와 메디토프-이용가능한 항체를 변형시키는 방법이 또한 제공되는데, 이 방법은 1개 이상의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 서열 번호: 1, 2, 16-18, 23, 29, 31, 32, 36, 39, 42, 43, 45, 46, 51, 52, 54, 및 55 중 임의의 하나에 기재된 서열을 갖는 펩타이드, 또는 이로부터 유래된 환형 펩타이드에 대해 수행하여, 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편, 예로서 상기 기재된 것들 중 임의의 것에 대한 상기 펩타이드의 결합 친화도의 pH-의존성을 변형시킴을 특징으로 한다. 일부 양태로, 상기 방법은 리소좀 pH 수준에서 항체 또는 이의 단편에 대한 펩타이드의 결합 친화도를 감소시킨다. 다른 양태로, 상기 방법은 저산소 환경에서 결합 친화도를 증가시킨다.
또한, 메디토프-이용가능한 항체의 변형 방법이 제공되는데, 이 방법은 Kabat 넘버링에 따라, 메디토프-이용가능한 항체의, 경쇄의 8　, 9, 10, 38, 39, 40, 41 42, 43, 44, 45, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 142, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 및/또는 173번 위치, 또는 중쇄의 6, 9, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 147, 150, 151, 152, 173, 174, 175, 176, 177, 185, 186, 및/또는 187번 위치에서 1개 이상 변형을 수행함을 특징으로 한다. 일부 양태로, 상기 변형 방법이 변형된 메디토프에서의 변형을 기본으로 하여 항체에서 변형, 또는 역으로 변형시키는 것과 같이, 탠덤(tandem)으로 제공되어 변형된 메디토프와 다른 하나에 결합하는 변형된 메디토프-이용가능한 항체를 생산한다.
상기 기재된 메디토프-이용가능한 항체 중 임의의 것에 결합하고/하거나 상기 기재된 메디토프 중 임의의 것에 필적하는 결합 특성을 갖는 것들을 포함한, 메디토프 유사체가 또한 제공된다.
도 1은 세툭시맙의 프레임워크 루프에 결합하는 메디토프 펩타이드를 나타낸다. 도 1a: 세툭시맙 Fab (경쇄는 VL 및 CL로 나타내고, 중쇄는 VH 및 CH로 나타냄)와 환형 CQFDLSTRRLKC (음역 영역 내에 도시되고 "메디토프"라는 단어로 표지됨)(서열 번호: 1)의 복합체는 메디토프가 세툭시맙의 CDR 루프와 구별되는, 상기 Fab 프레임워크의 계면에 결합하는 것을 나타낸다. 도 1b는 cQFD 메대ㅣ토프의 막대 표현(상부)과 cQYN 메디토프의 막대 표현(하부)을 나타낸다. N-말단 및 C-말단 시스테인은 용매 노출되고 높은 열 인자를 나타낸다.
도 2는 세툭시맙 Fab 결합 계면의 특정 실시양태를 나타낸다. 세툭시맙은 인간-뮤린 키메라이며, 따라서, 뮤린 Ig 가변 도메인과 인간 불변 Ig 도메인의 혼합을 갖는다. 도 2A는 메디토프와 접촉하게 되는 세툭시맙의 잔기에 상응하는, 초14.18과 인간화된 트라스투주맙의 잔기를 나타낸다. 도 2B는 세툭시맙의 뮤린 서열(전경)에 의해 암호화된 명확한 포켓을 점유하는 cQFD 메디토프의 Arg9의 입체뷰를 나타낸다. 세툭시맙 경쇄의 Asp85로부터 메디토프 Arg9의 구아니디늄 기와 Leu10의 주쇄 아미드로의 염 가교(bridge)가 존재한다.
도 3은 고정화된 Fab를 갖는 cQFD와 cQYN의 표면 플라즈몬 공명(SPR) 트레이스를 나타낸다. 결정학 연구에 사용되는 세툭시맙 Fab는 저밀도로 CM5 칩에 커플링된다. cQFD(도 3A)와 cQYN(도 3B) 메디토프의 증가하는 농도의 트레이스가 도시되어 있다. 일련의 트레이스를 단순 1:1 랭뮤어 결합 모델(Langmuir binding model)에 맞춘다. 상기 핏의 잔차가 하기에 각각 도시되어 있다.
도 4는 cQFD와 cQYN 메디토프가 이전에 가설세운 바와 같이, 세툭시맙의 CDRs에 결합하지 않음을 설명한다. 도 4A는 2개의 결정 구조의 오버레이를 보여주는데, 하나는 세툭시맙 Fab과 이의 항원인 EGFR 도메인 III이고, 다른 하나는 cQFD 메디토프와 세툭시맙 Fab를 나타내는데, 여기서 cQFD 메디토프는 세툭시맙 Fab의 중앙 구멍(cavity)에 결합한다. 상기 항원, EGFR 도메인 III은 상보성 결정 영역에서 메디토프 결합 부위로부터 상당한 거리로 결합한다. 도 4B는 왼편 측에서는 SDS-PAGE 결과를 보여주며 오른편 측에서는 상응하는 크기 배제 크로마토그라피 결과를 보여준다. 각 성분, Fab, EGFR 도메인 III, 및 SMT-cQFD 메디토프, 뿐만 아니라 상기 3종의 혼합물의 크기 배제 실험은 이종-3합체(hetero-trimeric) 복합체의 형성을 나타내며, 상기 이종-3합체 복합체는 함께 용출된다(coeluted). 비-환원 SDS-PAGE 겔은 먼저 용출되는 분획을 보여주는데, 이는 혼합물로부터 관찰되는 새로운 피크 (연회색 음영의 "복합체"에 대한 맨 왼쪽 피크)내에 3종 성분이 존재함을 나타낸다. 도 4C는 FACS 분석 결과를 보여주는데, 이는 cQFD 메디토프가 세툭시맙의 존재 하에서만 (화살표) EGFR 포지티브 MD-MBA-468 세포에 결합함을 나타낸다. 메디토프 단독 또는 M425, 뮤린 EGFR 항체의 존재하의 메디토프는 결합하지 않는다. 도 4D는 세툭시맙 scFv 또는 Fab와 커플링시킨 센서 칩을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 실험 결과를 보여준다. 이 실험은 scFv의 포화가 100 μM 만큼 높은 농도의 cQFD 메디토프로 성취될 수 없음을 나타낸다. 세툭시맙 Fab 커플링된 센서 칩을 사용하는 동일한 실험은 완전 포화를 나타낸다. 이 실험으로부터의 해리 상수는 660 nM이다. 대조군 SPR 실험 (하부 패널)은 세툭시맙 scFv이 가용성 EGFR 도메인 III 단편에 용이하게 결합함을 보여주는데, 이는 CDR 루프가 작용성이라는 것을 나타낸다.
도 5는 세포수와 비교된 형광 강도의 그래프이며 cQFD의 존재하에서 MDA-MB-468 세포에 대한 형광-표지화된 세툭시맙 결합을 보여준다. 세툭시맙은 메디토프 부재하에, 그리고 6 μM 및 60 μM의 메디토프의 존재하에서 MDA-MB-468 세포에 결합한다. 예측되었던 바와 같이, 이 도면은 이소타입(isotype) IgG 대조군은 MDA-MB468 세포상의 EGFR에 결합하지 않음을 보여준다.
도 6은 메디토프와 EGFR이 명확한 부위에 어떻게 결합하는지를 보여준다. 상부 이미지는 cQFD-Fab 복합체와 EGFR-Fab 복합체(1YY8)의 중첩을 입체적으로 보여준다. 하부 이미지는중쇄의 39-46번 잔기가 가요성이고 메디토프를 수용한다는 것을 보여준다.
도 7은 Fab 프레임워크 결합제를 보여준다. 메디토프, 단백질 A, 및 단백질 L에 결합된 Fab의 중첩은 각각 세툭시맙 Fab상의 독특한 자리에 결합함을 나타낸다.
도 8은 종양 치료를 증진시키기 위한 실시양태 중 하나의 작용 메카니즘을 설명한다. 예시된 실시양태에서, 항원에 결합된 2가 항체 (예를 들면, ErbB 수용체 족)이 종양 세포에서 과발현되어 (왼쪽 패널) 수용체 신호전달을 차단하고, 내포작용(endocytosis)과 수용체 재순환을 변경하고/하거나 면역 반응을 유발한다. 일부 경우에 있어서, EGFR의 다른 도메인을 인식하는 마투주맙을 세툭시맙과 함께 첨가하면 표면 수용체의 데이지 체인(daisy chaining)으로 인하여 더욱 효과적일 수 있다 (오른쪽 패널 1). 다가 메디토프 (특정 예에서는, 3가)는 치료용 mAB에 테더링/가교-결합하여 이의 치료학적 잠재성(오른쪽)을 증대시킬 수 있다. 또한, 다가 메디토프 (여기서는 3가 버젼으로 나타냄)는 영상화제를 운반할 수 있어, 증대된 치료제 뿐만 아니라 영상화가 둘다 가능토록 할 수 있다.
도 9는 scFv-메디토프 링커를 보여준다. scFvs는 12-20개의 아미노선 링커 (전형적으로 {GGGS}3-5)를 통하여 경쇄 가변 도메인을 중쇄 가변 도메인 (또는 역으로)에 융합시킴으로써 생성된다. 이 실시예에서, 가요성 링커 서열 부분이 메디토프 서열로 대체될 수 있다.
도 10은 SDS-PAGE로부터의 결과를 보여주는데 이는 비드에 커플링되어 있는 cQFD 메디토프가 세툭시맙에 결합할 수 있음을 보여준다. 비오티닐화된 cQFD 펩타이드를 아비딘-커플링된 비드에 첨가하고, 철저히 세척한 다음, PBS에서 평형화시킨다. 이후, 세툭시맙을 비드에 첨가하고 (레인 1), 세척하여 (레인 2-4), 이후 용출시킨다 (레인 5). 상부 밴드는 IgG 중쇄이고 하부 밴드는 IgG 경쇄이다.
도 11은 입체 마스크의 예시적 실시양태의 도식이다. 이 예시적 실시양태에서, 메디토프는 종양 회합 프로테아제 부위를 함유하는 가요성 링커를 통하여 Fab 경쇄 또는 중쇄의 N-말단에 융합하여 항원 결합 부위를 입체적으로 폐쇄한다.
도 12는 세툭시맙으로의 1가 (왼쪽 패널) 및 4가(오른쪽 패널) 메디토프에 대한 SPR-결정된 결합 동역한을 보여준다. 표면 플라즈몬 공명 트레이스 위의 패널은 1가 메디토프가 2가 IgG를 통과하는 카툰을 도시한 것이다. 오른쪽 패널에 나타낸 바와 같이, 아비딘은 비오티닐화된 메디토프로 포화되어 상기와 동일한 고정화된 세툭시맙 IgG를 통과한다. 다가 메디토프의 오프-레이트(off-rate)는 적어도 36배 감소하였다 (2회 실험 사이의 시간 스케일이 다르다는 것에 유의한다).
도 13은 락탐 연결기를 함유하는 메디토프에 대한, 일부 실시양태에 따르는 2합체 및 3합체 메디토프의 합성을 설명한다.
도 14는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-표지화된 메디토프 2합체 (도 13에서 "14")의 특성화를 설명하는데, 최종 2가 메디토프의 HPLC 트레이스와 이의 질량 스펙트럼을 보여준다.
도 15는 일부 실시양태에 따르는 메디토프-Fc 융합 단백질에 대한 핵산 서열 (서열 번호: 3) 및 상응하는 아미노산 서열 (서열 번호: 4)을 보여준다.
도 16은 예시적인 2가 메디포트를 보여준다. 메디토프는 펩타이드 링커의 N-말단에 직접 융합되며, 상기 링커는 IgG의 Fc 영역에 직접 융합되어있다. 이 실시예에서, Fc가 발현중에 자연적으로 동종이량화되기 때문에, 상기 메디토프-Fc 작제물로부터의 최종 생성물은 2가이다.
도 17은 세툭시맙 전처리된 EGFR-발현 세포에 대한 1가 및 2가 메디토프의 결합을 모니터링하는 일련의 예시적 FACS 분석 결과를 보여준다. EGFR을 과발현하는 MDA-MB-468 세포를 10 nM의 세툭시맙으로 30분간 전처리하고, 세정한 다음, 4가지 농도의 메디토프-Fc 작제물 또는 단량체 메디토프로 처리하였다. 하부 트레이스는 네가티브 대조군 (항체가 없는 것)이다. 다음 4개의 트레이스는 단량체 메디토프가 세툭시맙으로 전처리된 세포에 농도 의존적 방식으로 결합함을 보여준다. 상부 4개의 트레이스도 2가 메디토프 Fc가 세툭시맙으로 전처리된 세포에 농도 의존적 방식으로 결합하지만 친화성이 더 높음 (즉, 오른쪽으로 더 많이 이동)을 보여준다. 이는 예상되었던 것이며 다가 상호작용과 일치한다.
도 18은 특정의 실시양태에 따라 사용될 수 있는 대안적 메디토프-Fc 링커, 코일형 코일의 도식이다.
도 19는 NMR에 의한 단편 선별이다. 세툭시맙 첨가 전(상부 트레이스)과 후(하부 트레이스)의 단편 풀의 대표적인 NMR 스펙트럼. 이 방법을 사용하여, 선두 화합물 (예를 들면, 본 명세서에 제시된 것들)을 확인하였고 회절 연구를 이용하여 결합 부위가 결정된다.
도 20은 지시된 랜덤 라이브러리를 이용하여 메디토프 부위에서의 메디토프 또는 화합물 결합에 대한 mAb의 결합 친화도를 변경하고/증대시키는 (또는 다른 특성을 변경) 예시적 단계를 설명한다. 구체적으로, 메디토프 결합 부위에 줄지은 mAb 잔기에 대한 코돈이 NNK (여기서 N은 임의의 뉴클레오타이드이고 K는 티미딘 또는 구아노신이다)로 대체되는 유전자 라이브러리가 FACS 분류 (여기서 메디토프와 항원은 명확한 형광단으로 표지화된다)를 이용하여 선택될 수 있다. 다른 실시양태에서는, 상기 코돈이 NNN으로 치환되는데, 여기서 N은 임의의 뉴클레오타이드이다. GPI 링커는 선택된 mAb가 유전자 서열을 암호화하는 벡터로 형질감염된 세포와 회합되어 남아있도록 할 수 있다. 선택된 세포로부터 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 유전자를 서열화하여 친화도가 높은 mAbs를 확인하도록 한다. 이 방법은 친화도가 더 높은 메디토프 또는 메디토프 유사체에 대해 선택하도록 반복할 수 있다.
도 21은 세툭시맙과 트라스투주맙의 서열 차이를 나타내는 표면을 보여준다. 상부 패널에서의 진회색 영역은 세툭시맙과 완전 인간화된 트라스투주맙 프레임워크 사이의 아미노산 차이를 나타낸다. 박스 내부의 특정 잔기는 트라스투주맙 프레임워크 위로 돌연변이되었다. 트라스투주맙의 CDR 루프가 확인되었고 (어두운 영역; 하부 패널) 세툭시맙 프레임워크상으로 그라프팅되었다.
도 22는 메디토프-이용가능한 트라스투주맙이 메디토프-Fc 융합 단백질에 결합한다는 것을 설명한다. 메디토프 결합 부위가 종양 항원, HER2에 결합하는 트라스트주맙, 인간화된 mAb 상에 생성되었다. 상부 패널에서의 FACS 분석은 메디토프-이용가능한 트라스투주맙이 HER2를 과발현시키는 SKBR3 세포에 결합한다는 것을 보여준다 (상부 2개의 트레이스). 하부 그래프에서는, 메디토프-Fc가 메디토프-이용가능한 트라스투주맙에 결합하지만 (상부 2개의 트레이스 - 오른쪽으로 이동된 피크), 야생형 트라스투주맙 (하부로부터 두번째) 또는 네가티브 대조군 (하부 트레이스)에는 결합하지 않는다.
도 23A는 메디토프-이용가능한 트라스투주맙 중쇄 서열의 핵산(서열 번호: 5) 서열을 보여준다. 시그날 펩타이드 서열은 회색으로 음영되어 있다. 도 23B는 야생형 (서열 번호: 7)과 비교되는 메디토프-이용가능한 트라스투주맙 중쇄 서열의 아미노산(서열 번호: 6) 서열을 보여준다. 차이는 회색으로 강조되어 있다. 도 23B에 나타낸 아미노산 후, 상기 나타낸 중쇄의 인간 서열에 남아있는 차이는 없다. 도 23C는 메디토프-이용가능한 트라스투주맙 경쇄 서열의 핵산(서열 번호: 8) 서열을 보여준다. 도 23D는 야생형 (서열 번호: 10)과 비교되는 메디토프-이용가능한 트라스투주맙 경쇄 서열의 아미노산(서열 번호: 9) 서열을 보여준다. 차이는 회색으로 강조되어 있다.
도 24는 세툭시맙-유사 프레임워크 위에 그라프팅되어 있는 항체 함유 HER2-결합 CDR 루프가 HER2 및 메디토프-Fc에 결합함을 보여준다. 도 24A에서, FACS 분석은 HER2-CDR 그라프팅된 메디토프-이용가능한 mAb가 SKBR3 세포에 결합하며, 이는 HER2를 과발현시킴을 보여준다 (상이한 농도에서의 상부 3개의 트레이스). 도 24B는 메디토프-Fc가 HER2-CDR 그라프팅된, 메디토프-이용가능한 mAb에 결합하지만 (상부 3개의 트레이스 - 농도 의존적 방식으로 오른쪽으로 이동된 피크), 야생형 트라스투주맙 (하부에서 2번째) 또는 네가티브 대조군 (하부 트레이스)에는 결합하지 않는다는 것을 보여준다.
도 25A는 분비 서열가 조작된 제한 부위 (밑줄친 부위)를 갖는 트라스투주맙의 중쇄에 대한 핵산(서열 번호: 11)과 아미노산 (서열 번호: 12) 서열을 보여준다. 도 25B는 분비 서열과 조작된 제한 부위 (밑줄친 부위)를 갖는 트라스투주맙의 경쇄에 대한 핵산(서열 번호: 13)과 아미노산 (서열 번호: 14) 서열을 보여준다. 음영 영역은 일부 양태에서 메디토프의 특이성이 증대되거나 변경되도록 변경될 수 있거나, 변형된 에피토프와의 결합 상호반응에 참가할 수 있는 예시적 잔기를 나타낸다.
도 26은 IgG와 IgE 도메인의 서열과 구조적 정렬의 예를 설명하는 것으로, 음영 영역은 메디토프 결합 부위 근처의 잔기에 상응하는 특정 잔사를 나타낸다.
도 27은 표면 플라즈몬 공명(SPR) 연구를 보여주는 그래프이다. 세툭시맙에 대한 상이한 메디토프 [cQFD (메디토프 1, 서열 번호: 1), cQYN (메디토프 2, 서열 번호: 2), 및 cQYD (메디토프 16, 서열 번호: 16)]의 결합 친화도가 pH=4.0 내지 pH=8.0 사이에서 결정되었다.
도 28은 MDA-MB-468 세포 성장을 억제하는 단량체 메디토프의 효과와 2가 메디토프-Fc의 효과를 비교하는 MTT 검정 결과를 설명한다. 도 28A는 단량체 메디토프가 아닌, 메디토프-Fc가 세툭시맙과 조합될 때 세포 성장을 억제하는 연구 결과를 나타낸다. 도 28B는 메디토프-Fc가 M425와 세툭시맙의 조합과 유사한, 세툭시맙의 세포-사멸 능력을 증대시킴을 보여준다.
도 29는 메디토프가 세툭시맙 메디토프 결합 부위에 (도면에 나타낸 바와 같은 "세툭시맙 결합") 결합하지만, 완전 인간화된 프레임워크 (도면에 나타낸 바와 같이 "트라스투주맙 결합 없음") 또는 다른 뮤린-키메라 프레임워크 (도면에 나타낸 바와 같이 "리툭시맙 결합 없음")에는 결합하지 않음을 설명한다. cQFD 메디토프 (메디토프 1, 서열 번호: 1)를 표면 플라즈몬 공명 연구를 위하여 CM5 칩에 접합시키고 세툭시맙 (메디토프 결합 Fab), 트라스투주맙 (완전 인간화된 프레임워크), 리툭시맙 (뮤린-인간 키메릭 프레임워크)을 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 및 1 μM 농도에서 시험하였다. 세툭시맙만이 메디토프-접합된 칩에 결합하였다.
도 30은 메디토프에 대해 수득한 생물물리학적 데이타를 보여준다. 도 30A는 변형되지 않은 메디토프 cQFD (서열 번호: 1)와 QYN 메디토프 (서열 번호: 2)의, 세툭시맙 Fab 칩을 사용한 SPR 센소그램을 보여준다. 도 30B는 메디토프(서열 번호: 1)와 세툭시맙 Fab (상부) 및 통합(하부)의 대표적인 결합 등온선을 보여준다. 도 30C는 두 메디토프의 중첩을 보여준다. 타원형 1은 Phe/Tyr 위치를 표시한다. 화살표는 수소 결합 네트워크에 유리하도록 하여 엔탈피에서 유리한 변화를 차지할 수 있는 골격의 이동을 나타낸다. 소수성 기인, F/Y3 L5, 및 L10은 거의 동일하게 위치하지만, cQFD 메디토프에서 관찰된 바와 같이, cQYN 메디토프중에서 Y5의 히드록실 기는 R8이 Q105 골격과 반응하는 것을 방지한다 ("입체적 클래쉬(steric clash)"). 이런 재배열로 β-턴(turn)의 골격 잔기에서의 동시 변화가 일어난다 ("골격 회전"). 도 30D는 상이한 메디토프 변이체의 ITC에 의해 결정된 개별적 열역학적 변수를 나타낸다. Phe3Tyr 변이체 (메디토프 2, 서열 번호: 2)는 친화도가 더 낮은데도 △H에서 확실한 변화를 보여준다. 그런 구조를 기본으로, 서열 번호: 1의 메디토프 중의 Gln2이 D-입체이성체로 대체되었다. 상기 메디토프 (서열 번호: 15)의 ITC 분석으로 엔트로피가 현격하게 증가하고 엔탈피가 소실되는 것으로 밝혀졌다.
도 31은 일부 실시양태에 따르는 메디토프의 화학적 구조를 보여준다. 원(circles)은 예를 들어, Fab에 대한 메디토프 친화도를 증진시키기 위하여 변형시킬 수 있는 위치를 나타낸다. 박스들은 고리화 전략을 나타낸다. '클릭(click)' 화학과 올레핀 복분해(metathesis), 맨오른쪽에 있는 박스의 상부 및 하부는 메디토프를 고리화시키기 위한 추가적인 경로이다.
도 32는 락탐(2, 서열 번호: 32)과 플루오레세인-표지화된 락탐(3)의 합성을 설명한다.
도 33은 일부 실시양태에 따르는 최적화 부위를 나타낸다. 타원형은 mAb의 Fab 영역중의 구멍을 표시하며, 이 구멍은 메디토프의 친화도를 최적화시키기 위하여 활용될 수 있다.
도 34는 메디토프 결합 변수를 최적화하기 위하여 사용될 수 있으며, 본 명세서에 기재된 실시양태 (R=알킬, 치환된 알킬, 방향족 또는 NHR"', 여기서 R"'=알킬, 치환된 알킬, 또는 방향족)에 따라서 사용될 수 있는 변형된 Arg8 잔기를 나타낸다.
도 35는 메디토프의 Phe3 부근의 친수성 계면을 나타낸다. 페닐 환으로 내포된 할로겐은 세툭시맙 Tyr87 또는 Tyr91의 히드록실 기, 뿐만 아니라 골격 카르보닐에 대해 강력한 비공유결합성 결합을 형성할 수 있다.
도 36은 메디토프와 세툭시맙의 골격 간의 공유결합성 상호반응을 설명한다. 수화가능한 측쇄는 Arg8(왼쪽) 또는 Leu10(오른쪽)에 내포되어 Fab의 Ser 또는 Tyr의 히드록실 기에 대해 공유결합성 결합을 형성할 수 있다.
도 37은 표지되지 않은 펩타이드에 의한, 세툭시맙과 플루오레세인-표지화된 펩타이드 사이의 상호반응의 투여량-의존적 억제의 형광 편광 검정법을 설명한다. 상기 검정법으로 mAb 결합에 대해 메디토프와 경쟁할 수 있는 소분자 화합물이 확인되었으며 따라서 이는 메디토프와 유사한 방식으로 작용하도록 개발될 수 있다. 대조군으로서, 비-표지화된 메디토프가 형광으로 표지화된 메디토프를 대체할 수 있는 것이 증명되었다. 3개의 시점에서의 변위 평형은 상기 검정법이 견고하며 높은 처리량으로 선별할 수 있음을 나타낸다.
도 38은 상기 형광 편광 선별로부터 확인된 5개의 선두 화합물을 나타낸다.
도 39는 서열 번호:22 (A), 서열 번호:16 (B), 서열 번호:17 (C), 서열 번호:18 (D), 서열 번호:15 (E), 서열 번호:23 (F), 서열 번호:24 (G), 서열 번호:25 (H), 서열 번호:32 (I), 서열 번호:33 (J), 서열 번호:34 (K), 서열 번호:35 (L), 서열 번호:36 (M), 서열 번호:37 (N), 서열 번호:38 (O), 서열 번호:39 (P), 서열 번호:40 (Q) 및 서열 번호:41 (R), 서열 번호:42 (S), 서열 번호:43 (T), 서열 번호:44 (U), 서열 번호:46 (V) 서열 번호:49 (W), 서열 번호:51 (X), 서열 번호:52 (Y), 서열 번호:53 (Z), 서열 번호:54 (AA), 및 서열 번호:55 (BB)에 상응하는, 18종의 변형된 메디토프에 대한 막대 구조를 나타낸다. 이들 구조의 서열은 표 3 및 4에 제시되어 있다.
도 40은 도 39에 나타낸 구조와 표 3과 4의 추가적인 메디토프에 대한 X-선 회절 데이타를 나타내는 표이다.
도 41은 메디토프 변이체의 대표적인 표면 플라즈몬 공명 연구를 나타낸다. cQFD 메디토프에서의 Phe3His 돌연변이의 구조적인 정보를 기본으로 하여, 3번 위치에서 β,β'-디페닐알라닌을 갖는 변이체 메디토프를 합성하였다 (상부 트레이스). 세툭시맙에 대한 결합 친화도에서의 대략 4배에 달하는 현격한 증진이 표면 플라즈몬 공명에 의해 관찰되었다. 아미노헥사노산을 사용하여 원래의 메디토프의 디설파이드 가교를 대체하였다 (하부 트레이스). 결합 친화도가 감소하였지만, 이들 데이타는 동물 및 인간 연구에서 약동학, 약력학 및 독성에 대한 잠재적 이슈에 맞춰 메디토프가 변형될 수 있음을 나타낸다. 이런 조합은 메디토프 내의 다른 위치에서 비천연 아미노산과 조합될 수 있음을 주지해야 한다.
도 42는 예를 들면, 메디토프 친화도를 증진시키기 위하여 사용할 수 있는 구조적 정보를 설명한다. 상부 패널은 메디토프 결합된 세툭시맙의 결정 구조를 나타내며, 세툭시맙의 Fab 구멍내에 결합된 Phe3을 보여주고 있다. 이 위치에서 히스티딘으로 치환하고 후속된 구조 분석은 측쇄 (이미다졸)가 새로운 구조를 취함을 나타낸다 (중간 패널). 이런 관찰을 근거로, 원 위치에서 페닐 측쇄 1개와 이미다졸 환에 페닐 측쇄 1개를 놓을 수 있는 β,β'-디페닐알라닌이 3번 위치에서 치환되었다. 결정 구조는 이런 치환이 두 측쇄 구조를 모방하고 있음을 나타낸다. 표면 플라즈몬 공명 연구는 상기 치환기가 더 높은 친화도로 결합함을 나타낸다 (도 41, 상부 패널).
도 43은 실시예 4에 기재되는 바와 같이, 본 발명에서 제공되는 메디토프-이용가능한 트라스투주맙이 야생형 트라스투주맙과 유사한 항원에 대한 결합 친화도를 갖고 있음을 증명하는 연구 결과를 나타낸다.
도 44는 실시예 4에 기재된 연구 결과를 나타내는데, 이는 메디토프-이용가능한 트라스투주맙(TM)과 미리 결합시켰으나, 야생형 트라스투주맙(WT T)과는 미리 결합시키지 않은 HER2-발현 세포는 cQFD (서열 번호: 1) 메디토프-단백질 L 융합체(MPL)에 결합하였음을 증명한다. 미리-결합된 항체가 없는 대조군 세포(MPL(WT) 만)도 MPL에 결합하지 않았다.
도 45는 실시예 4에 기재된 연구 결과를 나타내는데, 이는 메디토프-이용가능한 트라스투주맙(TM)과 미리 결합시켰으나, 야생형 트라스투주맙(WT T)과는 미리 결합시키지 않은 HER2-발현 세포 (SKBR3)는 모두가 아니라 단백질 L의 리신 1개가 아르기닌과 아스파라긴으로 돌연변이되어 있는 cQFD (서열 번호: 1) 메디토프-단백질 L 융합체(MPL-5K)에 결합하였음을 증명한다. 항체에 미리 결합시키지 않은 대조군 세포(MPL-5K 만)도 MPL-5K에 결합하지 않았다.
도 46은 실시예 4에 기재된 연구 결과를 나타내는데, 이는 항체를 메디토프와 배양시키기전 항원을 발현시키는 세포에 미리 결합시켰는지(왼쪽 패널), 아니면 메디토프-단백질 L과 항체를 미리 혼합한 다음 항원을 발현시키는 세포와 배양시켰는지(오른쪽 패널)와 유사한 정도로 메디토프가 메디토프-이용가능한 트라스투주맙에 결합한다는 것을 증명한다. TM = 메디토프-이용가능한 트라스투주맙. 비-처리 대조군에 대한 MPL-포지티브 세포의 퍼센트가 범례에 제시되어 있다.
도 47A는 음영으로 표시된 시그날 서열과 기타 잔기와 함께, CDR-그라프팅된 메디토프-이용가능한 트라스투주맙 (세툭시맙-유사 프레임워크상에 그라프팅된 트라스투주맙-유사 CDRs로)의 경쇄 핵산(서열 번호: 61)과 경쇄 아미노산(서열 번호: 61) 서열을 보여준다. 도 47B는 상기 항체의 중쇄 핵산(서열 번호: 62)과 중쇄 아미노산(서열 번호: 63)을 보여준다.
도 48은 중첩된(superimposed) 5번-위치 β,β'-디페닐알라닌 메디토프(서열 번호: 18, 메디토프 18) 및 cQFD (메디토프 1, 서열 번호: 1)의 구조를 갖는, 세툭시맙 Fab 단편(후면측 뷰)에 결합되어 있는 메디토프 54(표 4 참조)의 구조를 보여준다.
도 49는 Alexa488-표지화된 메디토프-Fc 융합 단백질(600 nM, 180 nM, 또는 60 nM)을 세툭시맙 또는 M425(마우스 항-EGFR 항체)로 미리-표지화된, MDA-MB0468 세포와 함께 30분간 배양시키고, 항체 결합 및 메디토프 결합을 FACS 분석법으로 분석한 연구 결과를 보여준다.
도 50은 (상부 패널) 중첩된, 5번-위치에서 세툭시맙에 결합된 β,β'-디페닐알라닌(진한 회색 막대), 메디토프-이용가능한 트라스투주맙에 결합된 동일한 메디토프(18)(백색 막대), 및 야생형 트라스투주맙(윤곽선)과 함께, 표 3에 나타낸, 메디토프 18(서열 번호: 18)의 구조를 막대 표시를 보여준다. 하부 패널은 야생형 및 메디토프-이용가능한 트라스투주맙과 비교하는 리본 카툰을 보여준다.
도 51은 위쪽-왼쪽 패널에, 막대로 설명되는 메디토프-이용가능한 항체에서 메디토프-결합에 관여하는 특정 잔기를 갖는 트라스투주맙과 트라스투주맙 메맙 (본 도면에서, 트라스투주맙 메맙은 "메디토프-이용가능한 메맙"으로 표지화된다) 구조의 중첩을 보여준다. 상부 오른쪽 패널은 동일한 표지화된 잔기를 갖는, 메디토프-이용가능한 트라스투주맙(메맙)과 세툭시맙의 중첩을 보여준다. 하부 패널은 중첩된 이들 3종 모두의 구조의 "카툰/리본 다이아그램"을 보여준다.
도 52는 메디토프(3번 위치에 β,β'-디페닐), 단백질 L(왼쪽), 단백질 A(오른쪽) 및 Fab(회색 카툰)의 구조를 보여준다. 단백질 L 중의 리신과 본 명세서에 기재된 MPLs에서 돌연변이된 메디토프는 흑색으로 표시된다.
도 53은 메디토프-단백질 L 융합체(MPL)에 대한 표면 플라즈몬 공명(SPR) 데이타를 보여준다: 상부 패널은 MPL이 10 nM 이하의 농도로 메디토프-이용가능한 트라스투주맙에 첨가되었을 때의 트레이스를 보여준다. 핏(fit) 데이타는 165 pM의 결합 친화도를 표시한다. 하부 패널은 동일 농도로 메디토프-이용가능한 트라스투주맙에 첨가된 단백질 L(단독)의 트레이스를 보여주며, 이는 이 농도에서는 결합이 없음을 나타낸다.
도 54는 GPI-연결된 메디토프-이용가능한 트라스투주맙이 메디토프-단백질 L(MPL) 융합 단백질에 결합하는 것을 보여준다. 1x10∧6개의 세포/샘플이 사용되었다. 부드럽게 피펫팅하여 세포를 플레이트로부터 회수하여 PBS 중 0.1% BSA(w/v)로 1회 세척하였다. AF647-표지화된-MPL을 세척용 완충액에 10 nM로 희석시켜 세포와 함께 30분간 RT에서 배양시켰다. 세포를 2회 세척한 다음 FACS로 분석하였다.
도 55A는 인간 IgG2, IgG4, IgG3, 및 IgG1 (서열 번호: 64-67)의 CH1 도메인간 서열 비교를 보여준다. 도 55B는 세툭시맙과 메디토프 1(서열 번호: 1, cQFD)의 공-결정 구조상에 맵핑된 이들 서열간 차이를 보여준다.
도 56은 야생형 M5A 경쇄 서열(서열 번호: 69)와 비교한, 메디토프-이용가능한("메디") 항-CEA 항체 (메디토프-이용가능한 M5A)의 아미노산 서열(서열 번호: 68)을 보여준다. 음영으로 표시된 잔기는 메디토프에 결합하도록, M5A 항체의 경쇄에 도입된 8개의 점 돌연변이를 표시한다 (중쇄 M5A 서열의 경우 서열 번호: 70에 기재되어 있다).
도 57은 메디토프-이용가능한 M5A 항체(M5A 8M)가 LS174T 세포상의 M5A 항원(CEA)에 결합하는 것을 증명하는, FACS 분석 결과를 보여준다.
도 58은 M5A 8M 메디토프 이용가능한 항체에 결합된 5-디페닐 메디토프에 대한 표면 플라즈몬 공명(SPR) 데이타를 보여준다.
도 59는 HPLC 트레이스와 이의 질량 스펙트럼으로, 메디토프 54의 특성 규명을 설명한다.
도 60은 120:1(DOTA-NHS:MPL)의 출발 물질로부터 형성된 DOTA-NHS-MPL 접합체의 질량 스펙트럼을 설명한다.
도 61A는 Alexa 555-세툭시맙과 함께 미리 배양시킨 다음 Alexa 488-메디토프-Fc와 함께 배양시킨 MDA-MB-468 세포를 보여준다. DAPI를 카운터 스테인(counter stain)으로 사용하였다. 이미지는 Olympus AX70 Automatic Upright Microscope로 촬영하였다. 백색 화살표는 포지티브 메디토프-Fc 염색을 표시한다. 도 61B는 메디토프-Fc-포시티브 세포의 정량분석을 보여준다. 표시된 막대 그래프는 2개 필드로부터 카운팅된, 세툭시맙 전-처리 또는 비처리된 샘플로부터의 전체 세포 중 메디토프-Fc-포지티브 세포의 퍼센트를 나타낸다.
A. 정의
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "항체"는 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하거나, 면역학적으로 반응성인 면역글로불린 분자를 언급하는 것으로, 다중클론 및 단일클론 항체, 뿐만 아니라, 비제한적으로 단편 항원 결합(Fab) 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 재조합 IgG (rIgG) 단편, 단일쇄 가변 단편(scFv) 및 단일 도메인 항체 (예를 들면, sdAb, sdFv, 나노바디) 단편을 포함한 작용성 항체 단편이 있다. 상기 용어 "항체"는 면역글로불린의 유전자 조작되거나 달리 변형된 형태, 예로서 인트라바디, 펩티바디, 키메라 항체, 완전 인간 항체, 인간화된 항체, 메디토프-이용가능한 항체 및 이종접합 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체, 2중항체, 3중항체, 4중항체, 탠덤 di-scFv, 탠덤 tri-scFv)를 포함한다. 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어 "항체"는 이들의 작용성 항체 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "상보성 결정 영역", 및 "CDR"은 당해 분야에서 항원 특이성 및 결합 친화도를 부여하는, 항체 가변 영역내의 아미노산의 비-인접 서열을 언급하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역에 3개의 CDRs (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) 및 각각의 경쇄 가변 영역에 3개의 CDRs (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)이 있다. "프레임워크 영역" 및 "FR"은 당해 분야에서 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 비-CDR 부분을 언급하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역에 4개의 FRs (FR-H1, FR-H2, FR-H3, 및 FR-H4)와 각각의 경쇄 가변 영역에 4개의 FRs (FR-L1, FR-L2, FR-L3, 및 FR-L4)가 있다.
제시된 CDR 또는 FR의 정확한 아미노산 서열 경계는 Kabat 등에 의해 기재된 하기의 것들(1991)을 포함하여, 잘 알려져 있는 수많은 도식 중 하나를 사용하여 용이하게 결정될 수 있다: "Sequences of Proteins of Immunological Interest,"5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabat" 넘버링 도식), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 ("Chothia" 넘버링 도식), MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), ("antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography," J. Mol. Biol. 262, 732-745. ("Contact" 넘버링 도식), Lefranc MP et al., ("IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27(1):55-77 ("IMGT" 넘버링 도식), 및 Honegger A and Plukthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool," J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3):657-70, (AHo 넘버링 도식).
제시된 CDR 또는 FR의 경계는 확인을 위하여 사용되는 도식에 따라서 변화될 수 있다. 예를 들어, Kabat 도식은 구조적 정렬을 기본으로 하는 반면, Chotia 도식은 구조적 정보를 기본으로 한다. Kabat와 Chothia 도식 둘다 넘버링은 가장 통상적인 항체 영역 서열 길이를 기본으로 하며, 삽입 문자, 예를 들어, "30a"에 의해 삽입과 결실이 일부 항체에 출현한다. 상기 두 도식은 상이한 위치에 특정 삽입과 결실을 놓기 때문에 ("indels") 넘버링이 달라진다. Contact 도식은 복합 결정 구조의 분석을 기본으로 하며 Chothia 넘버링 도식과 많은 면에서 유사하다.
하기 표 1에는 각각, Kabat, Chothia, 및 Contact 도식에 의해 확인된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3의 부분이 게시되어 있다. CDR-H1의 경우, 잔기 넘버링은 Kabat 및 Chothia 넘버링 도식을 둘다 사용하여 부여된다. Kabat 넘버링 도식이 H35A와 H35B에 삽입을 놓기 때문에, Kabat 넘버링 전환법을 사용하여 번호가 부여되었을 때 Chothia CDR-H1 루프의 말단이 루프의 길이에 따라서, H32와 H34 사이에서 변화됨을 알아야 한다.
[표 1]
Figure pct00002
따라서, 달리 명시되지 않는 한, 제시된 항체 또는 이들의 영역, 예로서 이의 가변 영역의 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역", 또는 각각의 명시된 CDRs (예를 들면, "CDR-H1, CDR-H2)이 공지의 반응도식 중 임의의 것에 의해 정의된 바와 같은 (또는 특이적) 상보성 결정 영역을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 마찬가지로, 달리 명시되지 않는 한, 제시된 항체 또는 이들의 영역, 예로서 이의 가변 영역의 "FR" 또는 "프레임워크 영역", 또는 각각의 명시된 FRs (예를 들면, "FR-H1, FR-H2)이 공지의 반응도식 중 임의의 것에 의해 정의된 바와 같은 (또는 특이적) 상보성 결정 영역을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 경우에 있어서, Kabat, Chothia, 또는 Contact 방법에 의해 정의되는 바와 같은 CDR과 같이, 특정의 CDR, FR, 또는 FRs 또는 CDRs의 확인을 위한 도식이 명시된다. 다른 경우에는, CDR 또는 FR의 특정의 아미노산 서열이 제시된다.
용어 "메디토프-이용가능한(meditope-enabled)" 항체 및 "mMAb"는 메디토프 결합 부위를 통하여, 메디토프에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 작용성 단편을 언급한다. 메디토프-이용가능한 항체의 예로는, 비제한적으로, 세툭시맙과 본 명세서에 기재된 기타의 것들이 있다. "메디토프 결합 부위"는 결합된 메디토프와 상호반응하는 아미노산 잔기를 함유하는 메디토프-이용가능한 항체의 영역으로, 상기 아미노산 잔기는 중쇄 및 경쇄의 프레임워크 영역(FR) 잔기를 포함한다. Fab 단편 또는 항체의 Fab 부분을 언급하면, 메디토프 결합 부위가 상기 Fab 단편 또는 부분의 중앙 구멍내에 위치한다.
Fab의 3차원 구조에 대해서, "중앙 구멍(central cavity)"은 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 불변 영역의 부분에 의해 정렬되는, Fab의 내부 구멍을 언급한다. 따라서 상기 중앙 구멍은 VH, VL, CH1, 및 CL 영역의 잔기에 의해 정렬되며 항원 결합 부위는 포함하지 않는다.
일부 실시양태로, 상기 메디토프 결합 부위는 Kabat 넘버링에 따라, 메디토프-이용가능한 항체의 경쇄의 40, 41, 83, 및 85번 잔기 및/또는 Kabat 넘버링에 따라, 메디토프-이용가능한 항체의 중쇄의 39, 89, 105, 및 108번 잔기를 포함한다.
일부 실시양태로, 메디토프 결합 부위가 Kabat 넘버링에 따라, 항체 경쇄의 8, 9, 10, 38, 39, 40, 41 42, 43, 44, 45, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 142, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 및 173 번 잔기, 및 중쇄의 6, 9, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 111, 110, 147, 150, 151, 152, 173, 174, 175, 176, 177, 185, 186, 및 187번 잔기에 의해 형성된 구멍내에 위치한다.
메디토프-이용가능한 항체의 Fab 부분의 경우, 메디토프 결합 부위는 중앙 구멍내에 잔기를 포함한다. 메디토프-결합 부위는 전형적으로 불변 영역 잔기를 추가로 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "메디토프(meditope)"는 메디토프-이용가능한 항체의 메디토프-결합 부위에 결합하는 펩타이드 또는 펩타이드들을 언급하는 것으로, 여기서 상기 항체는 Kabat 넘버링에 따라, 이의 경쇄의 40번 위치에서 트레오닌, 41번 위치에서 아스파라긴, 및 85번 위치에서 아스파르테이트를 갖거나, 본 명세서에 개시된, 세툭시맙, 메디토프-이용가능한 트라스투주맙, 또는 메디토프-이용가능한 M5A의 메디토프-결합 부위내의 잔기에 상응하는 잔기를 함유하는 메디토프 결합 부위를 함유한다. 메디토프의 예로는, 비제한적으로, cQFD 및 cQYN 펩타이드와 이의 변이체 ("메디토프 변이체" 또는 "변이체 메디토프"), 뿐만 아니라 다가 및 표지화된 메디토프가 있다. 다른 분자가 또한 메디토프-이용가능한 항체의 메디토프 결합 부위에 결합할 수 있는데, 이는 메디토프의 특성과 유사한 작용성 특성을 갖는다. 그러한 분자인 메디토프 유사체로는, 비제한적으로, 소분자, 압타머(aptamers), 핵산 분자, 펩타이드 및 메디토프와 동일한 메디토프 결합 부위에 결합할 수 있는 임의의 기타 물질이 있다.
본 명세서에서 사용되는 "치료제"는 질병 또는 질환의 치료에 유용한 원자, 분자, 또는 화합물이다.
"치료학적 유효량", "치료학적으로 효과적인 농도" 또는 "치료학적으로 효과적인 용량"은 표적 질환을 예방하거나 치료하는 것, 질환과 관련된 증상을 완화하는 것, 목적하는 생리학적 효과를 생산하는 것 또는 질병 또는 질환의 치료에 이르게 하는 질병의 영상화 또는 진단을 허용하는 것과 같은 피험체에서 원하는 치료 효과를 생성하는 화합물의 양을 의미한다. 정확한 치료학적 유효량은 제시된 피험체에서 치료의 효능면에서 가장 효과적인 결과를 생성시키는 조성물의 양이다. 이 양은 (활성, 약동학, 약력한, 및 생체이용율을 포함한) 치료학적 화합물의 특성, (연령, 성별, 질병 유형 및 단계, 일반적인 신체 상태, 제시되는 용량에 대한 반응, 및 약제 유형을 포함한) 피험체의 생리학적 상태, 제형내의 약학적으로 허용되는 담체 또는 담체들의 성질 및 투여 경로를 포함한, 다양한 인자에 따라 변화될 것이다. 임상 및 약리 기술의 당업자는 일상적인 실험을 통해, 즉, 화합물의 투여에 대한 피험체의 반응을 모니터하고 따라서 용량을 조정함으로써 치료학적 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 추가적인 안래를 위하여 하기 문헌을 참조한다: Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st Edition, Univ. of Sciences in Philadelphia (USIP), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2005.
"약학적으로 허용되는 담체"는 하나의 조직, 기관 또는 신체의 일부분으로부터 다른 조직, 기관 또는 신체의 일부분으로 관심있는 화합물의 운반 또는 수송에 관여하는 약학적으로 허용되는 물질, 조성물, 또는 비히클을 언급한다. 예를 들면, 담체는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매, 또는 캡슐화 물질, 또는 몇몇 이들의 조합일 수 있다. 담체의 각각의 성분은 제형의 다른 성분과 상용성이어야 한다는 점에서 "약학적으로 허용되어야" 한다. 이는 또한 마주칠 수 있는 임의의 조직, 기관, 또는 신체의 일부분과 접촉하기에 적합해야 하고, 이는 독성, 자극, 알레르기 반응, 면역원성 또는 이의 치료 이익보다 해가 과도하게 많은 임의의 다른 합병증의 위험을 보유하지 않아야 한다는 것을 의미한다.
"투여 경로"는 비제한적으로, 에어로졸, 경장(enteral), 비강, 안내, 경우, 비경우, 직장, 경피 또는 질내를 포함하여, 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 투여 경로를 언급할 수 있다. "경피" 투여는 국소용 크림 또는 연고를 사용하거나 경피용 패치에 의해 수행될 수 있다. "비경구"는 일반적으로 안와하, 점적주사, 동맥내, 관절낭내, 심장내, 피내(intradermal), 근육내, 복강내, 폐내, 척수내, 흉골내, 척수강내, 자궁내, 정맥내, 지주막하, 피막하, 피하, 경점막 또는 경기관(transtracheal)을 포함한, 주사와 관련되는 투여 경로를 언급한다.
본 명세서에서 다수의 약제, 치료제 또는 치료의 문맥에서 사용되는 "조합된" 또는 "와 조합된"은 피험체에서 동일한 질병 또는 질환을 치료하는 과정에서 2종 이상의 약제, 약물, 치료 섭생, 치료 지침 또는 이들의 조합 (예를 들면, 메디토프 또는 다가 테더링제와 조합된 함체)을 임의의 순서로 투여하는 것을 의미한다. 이는 동시 투여 (또는 "병용 투여"), 제2 제제의 투여 전 또는 후, 뿐만 아니라 여러 일 수까지 떨어진 일시적으로 간격있는 순서의, 제1 제제의 투여를 포함한다. 이러한 병용 치료는 또한 임의의 1종 이상의 제제, 약물, 치료 섭생 또는 치료 지침의 단일 투여 이상을 포함할 수 있다. 또한, 2종 이상의 제제, 약물, 치료 섭생, 치료 지침 또는 이들의 조합의 투여는 동일하거나 상이한 투여 경로에 의할 수 있다.
"치료학적 항체"는 본 명세서에 기재된 것들과 같은 암, 자가면역 질환, 이식 거부, 심혈관 질환 또는 다른 질환 또는 질병을 치료하기 위하여 사용되는 임의의 항체 또는 이의 작용성 단편을 언급할 수 있다. 본 명세서에 기재된 실시양태에 따라서 사용될 수 있는 치료학적 항체의 예로는, 비제한적으로, 에르비툭스(Erbitux) (세툭시맙:cetuximab), 레오프로(ReoPro) (아브식시맙:abciximab), 사이물렉트(Simulect) (바실릭시맙:basiliximab), 레미케이드(Remicade) (인플릭시맙:infliximab); 오르토클론(Orthoclone) OKT3 (뮤로모납:muromonab-CD3); 리툭산(Rituxan) (리툭시맙:rituximab), 벡사(Bexxar) (토시투모맙:tositumomab), 휴미라(Humira) (아달리무맙:adalimumab), 캄파트(Campath) (알렘투주맙:alemtuzumab), 사이물렉트(Simulect) (바실릭시맙:basiliximab), 아바스틴(Avastin) (베바시주맙:bevacizumab), 심지아(Cimzia) (세트롤리주맙 페골:certolizumab pegol), 제나팍스(Zenapax) (다클리주맙:daclizumab), 솔리리스(Soliris) (에쿨리주맙:eculizumab), 라프티바(Raptiva) (에팔리주맙:efalizumab), 마일로타르그(Mylotarg) (겜투주맙:gemtuzumab), 제발린(Zevalin) (이브리투모맙 티욱세탄:ibritumomab tiuxetan), 타이사브리(Tysabri) (나탈리주맙:natalizumab), 졸라이르(Xolair) (오말리주맙:omalizumab), 시나기스(Synagis) (팔리비주맙:palivizumab), 벡티빅스(Vectibix) (파니투무맙:panitumumab), 루센티스(Lucentis) (라니비주맙:ranibizumab), 및 헤르셉틴(Herceptin) (트라스투주맙:trastuzumab)을 포함한, 뮤린 항체, 뮤린화되거나 인간화된 키메라 항체 또는 인간 항체가 있다.
질병을 "치료하는" 또는 질병의 "치료"는 질병을 예방하는 것, 질병의 개시 또는 이의 진행 속도를 느리게 하는 것, 질병을 진행시킬 위험을 감소시키는 것, 질병과 관련된 증상의 진행을 예방하거나 지연시키는 것, 질병과 관련된 증상을 감소시키거나 종결시키는 것, 질병의 완전 또는 부분 회복을 생성시키는 것, 또는 몇몇 이들의 조합을 언급할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "포함하는(including)", "함유하는", 및 "포함하는(comprising)"은 이들의 개방되고, 비-제한적인 의미로 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 단수 형태 "a", "an", 및 "the"는 문장에 명백하게 달리 서술되지 않는 한 복수 언급도 포함한다.
더욱 구체적인 설명을 제공하기 위하여, 본 명세서에 제공되는 정량적 표면 중 일부는 용어 "약"이 부여되지 않는다. 용어 "약"이 명쾌하게 사용되든 되지 않든, 본 명세서에서 제시되는 모든 양은 실제로 제시된 수치를 언급함을 의미하며, 그러한 제시된 수치에 대해 실험적 및/또는 측정 조건으로 인한 등가 및 어림값(approximation)을 포함하여, 당해 분야의 통상의 기술을 기본으로 하여 타당하게 추론되는, 그러한 제시된 수치에 대한 어림값을 또한 언급함을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "알킬"은 탄소수가 1 내지 12인 포화, 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 기를 언급한다. 대표적인 알킬 기로는 비제한적으로, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 2-메틸-1-프로필, 2-메틸-2-프로필, 2-메틸-1-부틸, 3-메틸-1-부틸, 2-메틸-3-부틸, 2,2-디메틸-1-프로필, 2-메틸-1-펜틸, 3-메틸-1-펜틸, 4-메틸-1-펜틸, 2-메틸-2-펜틸, 3-메틸-2-펜틸, 4-메틸-2-펜틸, 2,2-디메틸-1-부틸, 3,3-디메틸-1-부틸, 2-에틸-1-부틸, 부틸, 이소부틸, t-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실 등, 및 더 긴 알킬 기, 예로서 헵틸, 옥틸 등이 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "알케닐"은 이중결합을 1개 이상 가지며 탄소수가 2 내지 12인 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 기를 언급한다. 알케닐 기의 예로는, 비제한적으로, 에틸레닐, 비닐, 알릴, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐, 부타디에닐, 펜타디에닐, 헥사디에닐, 2-에틸헥세닐, 2-프로필-2-부테닐, 4-(2-메틸-3-부텐)-펜테닐 등이 있다. 용어 "Cx-y알케닐" (여기서 x와 y는 정수이다)은 x-y개의 탄소 원자를 갖는 알케닐을 언급한다.
용어 "알킬레닐" 또는 "알킬렌"은 2가 알킬 기를 언급한다. 용어 "알케닐렌" 또는 "알케닐렌"은 2가 알케닐 기를 언급한다.
본 명세서에서 사용되는 "알키닐"은 삼중결합을 1개 이상 가지며 탄소수가 2 내지 10인 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 기를 언급한다. 알키닐 기의 예로는, 비제한적으로, 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐, 헥시닐, 메틸프로피닐, 4-메틸-1-부티닐, 4-프로필-2-펜티닐, 4-부틸-2-헥시닐 등이 있다.
"아릴"은 단일환식-, 이환식-, 또는 삼환식 방향족 기를 의미하는 것으로, 여기서 상기 기의 모든 환은 방향족이다. 이환식- 또는 삼환식 시스템의 경우, 각각의 방향족 환이 서로 융합된다. 아릴 기의 예로는, 비제한적으로, 페닐, 나프탈렌, 및 안트라센이 있다.
용어 "붕산 에스테르"는 치환기 -B(OR)2를 언급하는 것으로, 여기서 각각의 R 기는 독립적으로 C1-4알킬이거나, 2개의 R 기는 함께 C2-6알킬렌을 형성한다.
용어 "아세탈"은 -CH(OR)2 기를 언급하는 것으로, 여기서 각각의 R 기는 독립적으로 C1-4알킬이거나, 2개의 R 기는 함께 C2-6알킬렌을 형성한다. 아세탈 기의 예로는 디메틸아세탈 또는 디에틸아세탈, 또는 환형 아세탈이 있다. 용어 "케탈"은 -C(OR)2- 기를 언급하는 것으로, 여기서 각각의 R 기는 독립적으로 C1-4알킬이거나, 2개의 R 기는 함께 C2-6알킬렌을 형성한다. 케탈의 예로는 디메틸케탈 또는 디에틸케탈, 또는 환형 케탈이 있다.
용어 "할로"는 클로로, 플루오로, 브로모, 또는 요오도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 할로는 클로로, 플루오로, 또는 브로모이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬, 또는 요오드를 언급한다.
용어 "오르토 에스테르"는 -C(OR)3 기를 언급하는 것으로, 여기서 각각의 R 기는 독립적으로 C1-4알킬이거나, 2개의 R 기는 함께 C2-6알킬렌을 형성한다.
용어 "옥소"는 =O 기를 의미하며 탄소 원자 또는 황 원자에 부착될 수 있다.
용어 "포스포네이트 에스테르"는 -P(O)(OR)2 기를 언급하는 것으로, 여기서 각각의 R 기는 독립적으로 C1-4알킬이거나, 2개의 R 기는 함께 C2-6알킬렌을 형성한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "사이클로알킬"은 환 탄소수가 3 내지 15인, 포화 또는 부분적으로 포화, 단환식, 융합된 다환식, 가교된 다환식, 또는 스피로 다환식 카르보사이클을 언급한다. 사이클로알킬 기의 비제한 카테고리는 탄소수가 3 내지 6인 포화 또는 부분적 포화, 단환식 카르보사이클이다. 사이클로알킬 기의 예로는, 비제한적으로, 다음과 같은 것들이 있다:
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "5-원 헤테로아릴"은 탄소, 산소, 질소, 및 황으로부터 선택되는 환 원자를 5개 갖는 단환식, 방향족 헤테로사이클을 언급한다. 5-원 헤테로아릴 기의 예로는, 비제한적으로, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 푸라닐, 티에닐, 이소가졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이소티아졸릴, 피롤릴, 및 티아디아졸릴이 있다. 5-원 헤테로아릴의 특정 예로는 아지드와 프로파르길 기 간의 Huisgen 반응과 같은 1,3-고리화첨가반응에 의해 형성될 수 있는 것들이 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "치환된"은 명시된 기 또는 잔기가 적합한 치환기를 1개 이상 포함하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "비치환된"은 명시된 기가 치환기를 포함하지 않음을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "임의로 치환된"은 명시된 기가 비치환되거나 명시된 수의 치환기로 치환됨을 의미한다. 구조 시스템을 설명하기 위하여 상기 용어 "치환된"이 사용될 경우, 상기 치환은 상기 시스템상의 임의의 원자가-허용되는 위치에서 일어남을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 표현 "1개 이상의 치환기"는 시스템상의 원자가-허용되는 임의의 위치에서 일어날 수 있는 치환(들)의 1개 내지 최대 가능한 수를 표시한다. 특정의 실시양태로, "1개 이상의 치환기"는 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 치환기를 의미한다. 다른 실시양태로, 1개 이상의 치환기는 1, 2, 또는 3개의 치환기를 의미한다.
불포화된 원자가를 갖는, 본 명세서에 표시되는 임의의 원자는 상기 원자의원자가를 만족시키기에 충분한 수의 수소 원자를 갖는 것으로 추정된다.
알킬, R3, 또는 R5와 같은 임의의 변수가 임의의 식 또는 본 명세서에서 제공되는 설명에 1개 이상의 곳에서 나타날 경우, 각 경우의 상기 변수의 정의는 모든 다른 경우의 이의 정의와는 독립적이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 수의 범위는 연속되는 전체 수를 포함토록 한다. 예를 들어, "0부터 4까지" 또는 "0-4"와 같이 표현된 범위는 0, 1, 2, 3 및 4를 포함한다.
다작용성 잔기가 표시될 경우, 코어에 대한 부착점은 선 또는 하이픈(hyphen)으로 표시된다. 예를 들어, -OH는 산소 원자가 분자의 나머지 부분에 히드록실 기의 부착점인 잔기를 의미한다.
본 명세서에 제시된 임의의 화학식은 구조식으로 묘사되는 구조를 갖는 화합물 뿐만 아니라 특정의 변화 또는 형태를 표시하는 것이다. 예를 들어, 본 명세서에 제시된 임의의 화학식의 화합물은 비대칭 또는 키랄 중심을 가질 수 있으며 따라서 상이한 입체이성체 형태로 존재할 수 있다. 제시된 화학식을 갖는 화합물의 광학 이성체, 거울상이성체, 및 부분입체이성체를 포함한, 모든 입체이성체, 및 이의 혼합물은 상기 화학식의 범주내에 속하는 것으로 간주된다. 또한, 특정의 구조가 기하학적 이성체로서 (즉, 시스 및 트랜스 이성체), 호변이성체로서, 또는 아트로프이성체(atropisomer)로서 존재할 수 있다. 그러한 모든 이성체 형태, 및 이의 혼합물은 본 발명의 일부로 본 명세서에서 고려된다. 따라서, 본 명세서에 제시되는 임의의 화학식은 라세미체, 1개 이상의 거울상이성체 형태, 1개 이상의 부분입체이성체 형태, 1개 이상의 호변이성체 또는 아스로프이성체 형태, 및 이들의 혼합물을 나타내는 것이다.
부분입체이성체 혼합물은 이들의 물리화학적 차이를 기본으로 하여 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있는 방법, 예를 들면, 크로마토그래피 및/또는 분별 결정화에 의해 이들 각각의 부분입체이성체로 분리될 수 있다. 거울상이성체는 적절한 광학 활성 화합물(예를 들면, 키랄 알코올 또는 Mosher의 산 클로라이드와 같은 키랄 보조제, 또는 부분입체이성체 염의 혼합물의 형성)과의 반응에 의해 거울상이성체 혼합물을 부분입체이성체 혼합물로 전환시키고, 상기 부분입체이성체를 분리시켜 각각의 부분입체이성체를 상응하는 순수한 거울상이성체로 전환 (예를 들면, 가수분해 또는 탈염)시킴으로써 분리될 수 있다. 거울상이성체는 또한 키랄 HPLC 컬럼을 사용하여 분리시킬 수 있다. 본 발명의 화합물의 키랄 중심은 IUPAC 1974 Recommendations에 의해 정의되는 바와 같이 "R" 또는 "S"로, 또는 펩타이드 문헌과 일치하는 "D" 또는 "L"로 표시될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 아래첨자로 도시되는, 구조식 부분의 박스는 박스내에 있는 구조 단편이 첨자에 따라 반복됨을 표시한다. 예를 들어, 하기 구조식:
Figure pct00006
(여기서, x는 0, 1, 또는 2이다)는 상기 단편이 구조로부터 부재하거나, -단편-이거나, -단편-단편-인 것을 표시한다. 예를 들어, 화학식(X)내에서, 하기 구조:
Figure pct00007
(여기서 p는 0 또는 1이다)는 박스내의 -X-NH- 기가 상기 구조로부터 부재하거나 (p=0), 한번 존재함(p=1)을 의미한다.
본 발명의 화합물은 약학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있으며, 이 또한 본 발명의 범주내에 있다. "약학적으로 허용되는 염"이란 비-독성이고, 생리학적으로 인용될 수 있으며, 조제되는 약학 조성물과 화합성이고, 달리 조제 및/또는 피험체에 대한 투여에 적합한 본 명세서에 기재된 화합물의 유리 산 또는 염기의 염을 의미한다. 본 명세서에서 화합물에 대한 언급은 달리 표시되지 않는 한 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염에 대한 언급도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
화합물 염은 무기 및/또는 유기산으로 형성된 산성 염, 뿐만 아니라 무기 및/또는 유기 염기로 형성된 염기성 염을 포함한다. 또한, 제시된 화합물이 염기성 잔기, 예로서, 비제한적으로, 피리딘 또는 이미다졸, 및 산성 잔기, 예로서, 비제한적으로, 카르복실산을 둘다 함유하는 경우, 당해 분야의 기술은 상기 화합물이 쯔비터이온 ("내부 염")으로 존재할 수 있음을 인식하게 될 것이며; 그러한 염은 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "염"에 포함된다. 본 발명의 화합물의 염은 예를 들어, 화합물을 등가량과 같은 양의 적합한 산 또는 염기와, 염이 침전되는 것과 같은 매질 또는 수성 매질에서 반응시킨 다음 동결건조시켜 제조할 수 있다.
염의 예로는, 비제한적으로, 술페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 니트레이트, 비술페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트(tannate), 판토테네이트, 비타르트레이트, 아스코르베이트, 숙시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 사칼레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄술포네이트("메실레이트"), 에탄술포네이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔술포네이트, 및 파모에이트(즉, 1,1'-메틸렌-비스(2-히드록시-3-나프토에이트))염이 있다. 약학적으로 허용되는 염은 아세테이트 이온, 술시에이트 이온 또는 다른 카운터이온과 같은 다른 분자의 포접(inclusion)을 포함할 수 있다. 상기 카운터이온은 모체 화합물상에서의 하전을 안정화시키는 임의의 유기 도는 무기 잔기일 수 있다. 또한, 약학적으로 허용되는 염은 이의 구조내에 하전된 원자를 1개 이상 가질 수 있다. 다수의 하전된 원자가 약학적으로 허용되는 염의 일부인 경우 다수의 카운터이온을 가질 수 있다. 따라서, 약학적으로 허용되는 염은 1개 이상의 하전된 원자 및/또는 1개 이상의 카운터이온을 가질 수 있다.
산 부가염의 예로는 아세테이트, 아스코르베이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, 비술페이트, 보레이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포르술포네이트, 푸마레이트, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로요오다이드, 락테이트, 말레에이트, 메탄술포네이트, 나프탈렌술포네이트, 니트레이트, 옥살레이트, 포스페이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 숙시네이트, 술페이트, 타르타레이트, 티오시아네이트, 톨루엔술포네이트(토실레이트로도 알려져 있음) 등이 있다.
염기성 염의 예로는 암모늄 염, 알칼리 금속염, 예로서 나트륨, 리튬, 및 칼륨염, 알칼리 토금속염, 예로서 칼슘 및 마그네슘염, 유기 염기 (예를 들면, 유기 아민)와의 염, 예로서 디사이클로헥실아민, t-부틸 아민, 및 아미노산, 예로서 아르기닌, 리신 등과 같은 아미노산과의 염이 있다. 염기성 질소-함유 기는 저급 알킬 할라이드 (예를 들면, 메틸, 에틸, 및 부틸 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드), 디알킬 술페이트 (예를 들면, 디메틸, 디에틸, 및 디부틸 술페이트), 장쇄 할라이드 (예를 들면, 데실, 라우릴, 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드), 아르알킬 할라이드 (예를 들면, 벤질 및 펜에틸 브로마이드), 및 기타의 것들로 4급화될 수 있다.
추가로, 약학 화합물로부터 약학적으로 유용한 염을 형성시키는데 일반적으로 적합한 것으로 인정되는 산 및 염기가 예를 들면 하기 문헌에서 논의되었다: P. Stahl et al, Camille G. (eds.) Handbook of Pharmaceutical Salts. Properties, Selection and Use. (2002) Zurich: Wiley-VCH; S. Berge et al, Journal of Pharmaceutical Sciences (1977) 66(1) 1-19; P. Gould, International J. of Pharmaceutics (1986) 33 201-217; Anderson et al, The Practice of Medicinal Chemistry (1996), Academic Press, New York; and in The Orange Book (Food & Drug Administration, MD, FDA로부터 입수가능함). 이들 개시내용은 본 명세서에서 참고로 포함된다.
추가로, 본 명세서에 기재된 임의의 화합물은 형태가 구체적으로 게시되지 않는다 하더라도 임의의 비용매화된 형태, 또는 수화물, 용매화물, 또는 그러한 화합물의 다형태, 및 이들의 혼합물을 언급하는 것이다. "용매화물"은 본 발명의 화합물과 용매 분자 1개 이상과의 물리적 회합(association)을 의미한다. 이런 물리적 회합은 수소 결합을 포함한, 이온성 및 공유결합 정도가 가변적이다. 특정 예로, 예를 들어, 용매 분자 1개 이상이 결정성 고체의 결정 격자에 용매화물에 내포되어 있을 때, 상기 용매화물은 분리될 수 있다. "용매화물"은 용액상 및 분리가능한 용매화물 둘다를 포함한다. 적합한 용매화물은 물, 에탈올 등과 같이 약학적으로 허용되는 용매와 형성되는 것들이다. 일부 실시양태로, 용매가 물이며 용매화물이 수화물이다.
본 명세서에서 제시되는 임의의 화학식은 비표지화된 형태 뿐만 아니라 동위원소 표지화된 형태의 화합물을 표시하는 것이다. 동위원소 표지화된 화합물은 1개 이상의 원자가 선택된 원자량 또는 질량수를 갖는 원자로 대체된 것을 제외하고는 본 명세서에 제시된 화학식으로 도식되는 구조를 갖는다. 본 발명의 화합물에 내포될 수 있는 동위원소의 예로는 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 불소, 염수, 및 요오드의 동위원소, 예로서 각각, 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 15N, 18O, 17O, 31P, 32P, 35S, 18F, 36Cl, 및 125I가 있다. 그러한 동위원소 표지화된 화합물은 대사 연구 (예를 들면, 14C를 사용), 반응 운동 연구 (예를 들면, 2H, 또는 3H를 사용), 약물 또는 기질 조직 분포 검정법을 포함하여 검출 또는 영상화 기술 [예로서 양전자방출단층촬영술(PET) 또는 단일광자방출단층촬영술(SPECT)], 또는 환자의 방사선 치료에 있어서 유용하다. 특히, 18F 또는 11C 표지화된 화합물은 PET 또는 SPECT 연구에 특히 적합할 수 있다. 또한, 중소수(즉, 2H)와 같이 더 무거운 동위원소로 치환시킴으로써 대사 안정성이 더 커지는 특정의 치료적 장점, 예를 들면, 증가된 생체내 반감기 또는 감소된 용량 요구조건을 얻을 수 있다. 본 발명의 동위원소 표지화된 화합물과 이들의 프로드럭은 일반적으로 동위원소로 표지되지 않은 시약을 입수가 용이한 동위원소 표지화된 시약으로 치환하여 이후 설명되는 반응도식에 또는 실시예 및 제조예에 개시되어 있는 공정을 수행함으로써 제조될 수 있다.
B. 항체 및 항체-결합 물질
단일클론 항체(mAbs)를 포함한 항체와 이의 단편, 예를 들면 작용성 단편, 및 상기 항체에 결합하는, 메디토프, 및 메디토프 유사체와 같은, 펩타이드를 포함하는, 화합물 및 조성물이 본 발명에서 제공된다. 상기 물질들, 예를 들면, 메디토프는 일반적으로 항체 및 상보성 결정 영역(CDRs)을 제외한 (예를 들면, 이로부터 별도인) 단편의 영역/결합 부위, 전형적으로 항체와 단편의 프레임워크 영역(FRs) 및/또는 불변 영역내의 잔기에 결합한다. 또한, 상기 항체와 물질, 예를 들면, 메디토프를 함유하는 복합체, 화합물, 및 조성물, 뿐만 아니라 상기 항체와 물질의 치료적, 진단적, 연구, 및 기타 용도를 포함한 방법 및 용도와 이들의 제조 방법이 제공된다.
특정의 양태로, 특정의 펩타이드, C-QFDLSTRRLK-C (cQFD; 서열 번호: 1) 및 C-QYNLSSRALK-C (cQYN; 서열 번호: 2)가 프레임워크와 불변 영역내 잔기를 포함하여, 상보성 결정 영역(CDRs) 바깥부분 잔기와의 상호작용에 의해, 뮤린-인간 키메라 항체, 세툭시맙에 비-공유결합에 의해 결합한다는, 본 명세서에 기재된 발견을 기본으로 하는 실시양태가 제공된다. 또한 본 명세서에 기재된 바와 같이, 이들 펩타이드로의 결합 능력은 세툭시맙에 특이적인 특정 양태를 기본으로 하며 본 발명에서의 연구에서는, 예를 들어, 완전 인간 항체, 뮤린 항체, 또는 기타 키메라 항체에 대한 결합은 발견되지 않았다. 본 발명에서 증명된 바와 같이, 이들 메디토프는 이의 항원과 동시에 키메라 항체에 결합할 수 있다. 도 4를 참조. 본 발명에서 증명된 바와 같이, 세툭시맙상의 이들 메디토프에 대한 결합 부위는 또한 슈퍼항원 스태필로코거스 단백질 A(Staphylococcal Protein A: SpA)와 펩토스트렙토코커스 마그누스(Peptostreptococcus magnus Protein L: PpL)과 같은 다른 프레임워크-결합 항원의 결합 부위와 구별된다 (도 7). 특정의 양태로, 상기 제공되는 실시양태는 상기 발견을 빌드업하는데, 예를 들면, 다른 mAbs가 이들 및 다른 메디토프 (즉, "메디토프-이용가능")에 결합하도록 하여 변이체 메디토프 및/또는 변경된 메디토프-이용가능한 항체, 예를 들면, 개선된 결합 친화도, 독성, PK/PD, 및/또는 pH 의존성을 포함한, 변경된 특성을 갖는 것들을 생성시킨다.
C. 메디토프-이용가능한 항체 및 복합체
메디토프-결합 부위를 통하여 메디토프 1개 이상에 결합할 수 있는 메디토프-이용가능한 항체가 제공된다. 일부 경우에 있어서, 상기 메디토프-이용가능한 항체가 서열 번호: 1 또는 2 (메디토프 1 또는 2)의 환형 펩타이드 및/또는 이들의 변이체 1개 이상, 예로서 메디토프 1, 2, 16-18, 23, 29, 31, 32, 36, 39, 42, 43, 45, 46, 51, 52, 54, 또는 55 (서열 번호: 1, 2, 16-18, 23, 29, 31, 32, 36, 39, 42, 43, 45, 46, 51, 52, 54, 또는 55에 기재된 서열을 갖는 펩타이드를 기본으로 하는 메디토프), 또는 일부 경우에는, 메디토프 1, 2 또는 15 내지 55 중 임의의 것에 결합한다. 상기 제공되는 메디토프-이용가능한 항체중에는 세툭시맙의 친화도와 유사한 친화도로 메디토프 또는 메디토프들에 결합하는 것들이 있다. 예를 들어, 특정의 양태로, 상기 항체가 약 10 μM 또는 미만, 약 5 μM 또는 미만, 또는 약 2 μM 또는 미만, 약 1 μM 또는 미만, 약 500, 400, 300, 200, 100 nM 또는 미만, 예로서 약 200 피코몰로 또는 그 미만의 해리 상수로 메디토프(들)에 결합한다. 일부 경우에는, 상기 해리 상수, 예로서 본 명세서에 게시된 것들 중 임의의 해리 상수는 표면 플라즈몬 공명(SPR), 등온 적정 열량측정법(ITC), 형광, 형광 편광, NMR, IR, 열량측정 적정법; 운동 배제법(Kinetic exclusion); 원이색법(Circular dichroism), 차동 주사 열량측정법, 또는 기타 공지의 방법과 같은 특정의 기술을 사용하여 측정된 것이다. 예를 들면, 일부 경우에 있어서, 유사체 또는 메디토프가 SPR로 측정된바 또는 ITC로 측정된바 또는 이들 방법들 중 임의의 것에 의해 측정된바, 약 10 μM 또는 미만, 약 5 μM 또는 미만, 또는 약 2 μM 또는 미만, 약 1 μM 또는 미만, 약 500, 400, 300, 200, 100 nM 또는 미만의 결합 상수를 나타낸다.
일부 예에서, 상기 메디토프-결합 부위는 EGFR-발현 전이성 결장암 및 두경부암의 치료에 사용되는 단일클론 항체인, 세툭시맙, 인간-뮤린 키메라 항체의 구조적 특징이다. 따라서, 어떤 경우에는, 상기 메디토프-결합 부위가 세툭시맙의 메디토프 결합 부위내의 잔기에 상응하는 잔기를 함유한다. 본 발명에서 보고된 연구에서는, x-선 결정학 분석으로 서열 번호: 1의 펩타이드가 중쇄 및 경쇄의 다양한 잔기에 의해 구획된 세툭시맙 Fab 단편의 중앙 구멍내의 메디토프-결합 부위에, 대략 700 nM의 결합 상수로 결합하는 것이 밝혀졌다 (도 30A-30B 참조).
세툭시맙의 메디포트 결합 부위와 cQFD (서열 번호: 1, 메디토프) 간의 수개의 상호반응은 세툭시맙, 특히 Fab 단편의 프레임워크와 중앙 구멍의 불변 영역내의 특정 구조적 특징을 기본으로 한다. 메디토프 결합 부위를 구성하는 세툭시맙의 영역은 독특하며 상기 항체의 키메라 성질의 결과인 것으로 나타났다. 구체적으로, Fab 가변 영역(Fvs)은 뮤린의 것이며 Fab 불변 영역(CH1 및 CL)은 인간의 것이다. 상기 Fab의 조작으로 뮤린과 인간의 키메라 항체의 서열 정렬에서 밝혀지지 않은 잔기의 조합이 생산되었다. 예를 들어, 본 명세서에서의 데이타는 메디토프가 완전 인간 IgG 프레임워크 (예, 트라스투주맙), 다른 키메라 항체 (예, 리툭시맙)(도 29), 또는 마우스의 항체에 결합하지 않았으며, 이는 세툭시맙 메디토프-결합 부위가 매우 특이적임을 확인시켜준다. 이러한 결과 외에, 메디토프 결합된 세툭시맙 Fab 구조상에서 트라스투주맙 (1N8Z; Cho et al., Nature, ?tructure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab, 2003 Feb 13;421(6924):756-60) 과 리툭시맙 (2OSL;Du et al., J Biol Chem, 2007 May 18;282(20):15073-80. Epub 2007 Mar 29) Fabs의 분자 구조의 중첩은 프레임워크의 유일함으로 강조되었다. 세툭시맙-환형 펩타이드(메디토프) 구조상으로의 다중 인간과 뮤린의 Fabs의 중첩은 상기 펩타이드와 뮤린-인간 Fab간의 중요한 상호반응이 이 연구에서 비교하여 인간만의- 및 뮤린만의 IgG 구조 둘다에는 부재함을 나타낸다. cQFD 환형 펩타이드(메디토프 1)내의 중요한 잔기의 점 돌연변이는 세툭시맙 Fab에 대한 이의 친화도를 감소시키며, 이는 높은 특이성과 구조적 모델임을 추가로 확인시켜준다. 따라서, 상기 상호반응은 상기 특이적인 뮤린-인간 키메라 Fab의 중앙 구멍과 선택된 메디토프에 대해 특이적인 것으로 밝혀졌다.
특정의 실시양태로, 추가적인 메디도프-이용가능한 항체를 발생시키는데 메디토프와 세툭시맙 결합 부위간의 독특한 상호반응이 이용된다. 메디토프-이용가능한 항체는 예를 들면, 항체와 세포 정제법을 향상시키는데 유용하며, mAbs의 치료적 효과를 향상시키고, 미리-표적화된 운반 및 영상화를 포함하여, 영상화제 또는 치료제의 표적화된 운반을 증진시키고, mAb-기재 영상화법을 향상시키며, 일부 양태에서는 임의의 단일클론 항체에 광범위하게 적용될 수 있다.
일부 실시양태로, 세툭시맙을 제외한 항체 (때로는 주형 항체로 언급된다), 예로서 세툭시맙의 CDR과 구별되는 하나 이상의 CDRs을 갖는 항체를 변형시켜, 서열 번호: 1 또는 2의 메디토프, 또는 이의 변이체와 같은, 제공되는 메디토프 1개 이상에 결합할 수 있는 능력을 부여함으로써 메디토프-이용가능한 항체를 발생시킨다. 상기 주형 항체는 인간 또는 인간화된 항체 또는 마우스 항체일 수 있다. 하나의 양태로, 상기 변형이 Fab 단편의 중앙 구멍내, 전형적으로는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및/또는 불변 영역의 프레임워크 영역(FRs)내의 잔기를 치환하여 주형 항체가 메디토프-이용가능하게 만드는 것을 포함한다. 예를 들면, 주형 항체가 인간 또는 인간화된 항체인 경우, 상기 변형은 일반적으로 중쇄 및 경쇄 가변 영역 FRs내의 잔기에서의 치환을 포함한다. 일부 실시양태로, 그러한 잔기가 세푹시맙에 존재하는 상응하는 잔기, 또는 필적하는 아미노산으로 대체된다. 따라서, 특정의 실시양태로, 인간 또는 인간화된 항체의 FRs내의 잔기가 상응하는 뮤린 잔기로 대체되며; 특정의 실시양태로, 이들이 메디토프와의 상호반응을 위하여 유사한 작용성 기 또는 잔기를 갖는 것들과 같은 다른 잔기로 대체된다. 전형적으로, 상응하는 뮤린 (또는 다른) 잔기로 대체된 잔기가 중앙 Fab 구멍내에서 발견되며, 따라서 면역 시스템에 노출되지 않는다. 그와 같이, 일부 실시양태에서는, 인간 피험체로의 운반의 문맥에서, 이들 아미노산 치환을 인간 또는 인간화된 항체에 도입시키면 변형된 주형 항체의 항원성을 증가시키거나 실제로 증가시키지 않는다. 또한, 항원성 예측 알고리즘을 추가로 사용하여 점 돌연변이시킨 인간 서열은 항원성이 아니어야 함을 표시할 수 있다.
일부 실시양태로, 대체되는 잔기 1개 이상은 Kabat 넘버링에 따라, 경쇄 프레임워크의 10, 39-43, 83, 85, 100 및 104번 잔기 (참조: Kabat E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242, incorporated herein by reference in its entirety) 및/또는 Kabat 넘버링에 따라, 중쇄 프레임워크의 40, 89 및 105번 잔기(도 2 참조)로부터 선택된다. 일반적으로, 달리 명시되지 않는 한, 항체의 중쇄 또는 경쇄에서의 아미노산 위치는 Kabat 넘버링에 따른다. 또한, 본 명세서에 기재된 세툭시맙의 잔기에 상응하는 다른 항체중의 잔기, 예로서 세툭시맙 메디토프-결합 부위내의 잔기가 본 발명의 개시내용안에 포함된다. 일부 실시양태로, 경쇄 잔기 9, 10, 39, 40, 41, 42, 43, 83, 85, 100, 및/또는 104번, 및/또는 중쇄 잔기 40, 89, 및/또는 105번에 상응하는 주형 항체내 잔기가 예를 들면, 세툭시맙내 이들 위치에 존재하는 아미노산으로 대체된다.
하나의 실시양태로, 상기 대체된 잔기 1개 이상은 비제한적으로, Kabat 넘버링에 따라, 40, 41, 83 및 85번을 포함한, 경쇄 프레임워크 잔기이다. 하나의 실시양태로, 경쇄 잔기 40번이 트레오닌으로 대체되고; 경쇄 잔기 41번이 아스파라긴으로 대체되며; 경쇄 잔기 83번이 이소류신 또는 발린으로 대체되고/되거나 경쇄 잔기 85번이 아스타르테이트로 대체된다. 특정의 실시예로, 경쇄 프레임워크 Pro40이 Thr (P40T) 또는 Ser (P40S)로 대체되고, 경쇄 프레임워크 Gly41이 Asn (G41N)로 대체되며, 경쇄 프레임워크 잔기 Phe83이 Ile (F83I) 또는 Val (F83V) 로 대체되고 경쇄 프레임워크 Thr85가 Asp (T85D) 또는 Asn (T85N)로 대체된다.
따라서, 상기 제공되는 메디토프-이용가능한 항체중에는 세툭시맙 또는 메디토프-이용가능한 트라스투주맙 및 메디토프-이용가능한 M5A를 포함하여, 본 명세서에 기재된 것들과 같은 다른 메디토프-이용가능한 항체의 메디토프 결합 부위내 위치에 상응하는 잔기에서의 변형, 전형적으로는 아미노산 치환,을 1개 이상 갖는 항체가 있다. 상기 항체중에는 Kabat 넘버링에 따라, 40번 위치에서 트레오닌, 세린 또는 아스타르테이트, 41번 위치에서 글리신을 제외한 잔기, 및 85번 위치에서 아스타르테이트 또는 아스파라긴이 있는 VL 영역을 갖는 것들, 예를 들면, 40번 위치에서 트레오닌, 41번 위치에서 아스파라긴, 및 85번 위치에서 아스파르테이트을 갖는 VL 영역이 있는 항체가 있다. 일부 실시양태로, 상기 항체가 Kabat 넘버링에 따라, 40번 위치에서 세린과 89번 위치에서 이소류신을 갖는 VH 영역 및/또는 40번 위치에서 세린 또는 프롤린과 89번 위치에서 이소류신, 티로신, 메티오닌, 페닐알라닌, 또는 트립토판을 갖는 VH 영역을 갖는다. 일부 실시양태로, 상기 VL 영역이 10번 위치에서 이소류신 또는 류신, 및/또는 83번 위치에서 이소류신을 갖는다. 일부 실시양태로, 상기 VL 영역이 9번 위치에서 발린 또는 이소류신 및/또는 100번 위치에서 글루타민을 제외한 잔기를 갖는다.
일부 실시예에서, 상기 VL 영역이 Kabat 넘버링에 따라, 9번 위치에서 발린 또는 이소류신, 10번 위치에서 이소류신 또는 류신, 39번 위치에서 아르기닌, 40번 위치에서 트레오닌, 41번 위치에서 아스파라긴, 42번 위치에서 글리신, 43번 위치에서 세린, 83번 위치에서 이소류신, 85번 위치에서 아스파르테이트, 및 100번 위치에서 알라닌을 가지며; VH 영역이 40번 위치에서 세린 및 89번 위치에서 이소류신을 갖는다.
일부 실시예에서, VL 영역이 Kabat 넘버링에 따라, 40번 위치에서 프롤린, 41번 위치에서 글리신, 또는 85번 위치에서 트레오닌을 함유하지 않고/않거나 VH 영역이 Kabat 넘버링에 따라, 40번 위치에서 아스파라긴 또는 알라닌 또는 89번 위치에서 발린을 함유하지 않는다. 일부 실시예에서, VL 영역이 Kabat 넘버링에 따라, 10번 위치에서 세린, 40번 위치에서 프롤린, 41번 위치에서 글리신, 83번 위치에서 페닐알라닌, 또는 85번 위치에서 트레오닌을 함유하지 않고/않거나 VH 영역이 40번 위치에서 아스파라긴 또는 알라닌 또는 89번 위치에서 발린을 함유하지 않는다.
일부 양태로, 항체가 Kabat 넘버링에 따라, P8　, V9 또는 I9, I10 또는 L10, Q38, R39, T40, N41 G42, S43, P44, R45, D82, I83, A84, D85, Y86, Y87, G99, A100, G101, T102, K103, L104, E105, R142, S162, V163, T164, E165, Q166, D167, S168, 및 Y173을 갖는 경쇄, 및/또는 Kabat 넘버링에 따라, Q6, P9, R38, Q39, S40, P41, G42, K43, G44, L45, S84, D86, T87, A88, I89, Y90, Y91, W103, G104, Q105, G106, T107, L108, V109, T110, V111, Y147, E150, P151, V152, T173, F174, P175, A176, V177, Y185, S186, 및 L187을 갖는 중쇄를 갖는다.
다른 실시양태로, CDR 그라프팅을 통하여, 전형적으로는 본 명세서에 lwo된 메디토프-이용가능한 항체 중 하나와 같은, 메디토프-이용가능한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 상보성 결정 영역(CDR) 1개 이상 (예를 들면, CDRs 1-3 중 1개 이상)을, 현존하거나 새로운 항체의 CDRs와 같은 다른 CDRs로 대체시키기 위하여 변형시킴으로써 메디토프-이용가능한 항체를 발생시킨다. CDR 그라프팅은 예를 들어, 마우스와 같은 비-인간 종에서 발생된 항체의 CDRs를 인간 항체 프레임워크상에 그라프팅시킴으로써 인간화된 단일클론 항체를 생산하기 위한 표준 실시법이다. 참조: 미국 특허 제5,558,864호 및 제8,133,982호; Kettleborough et al., "Humanization of a mouse monoclonal antibody by CDR-grafting: the importance of framework residues on loop conformation," Protein Eng., 4:773-783 (1991). 따라서, 특정 실시양태로, 메디토프-이용가능한 항체의 항원 특이성은 이미 존재하거나 새롭게 발생된 대상 항체의 CDRs를 그라프팅시킴으로써 변경된다. 또한, 제공되는 메디토프-이용가능한 항체중에 그러한 CDR-그라프팅된 메디토프-이용가능한 항체가 있다.
일부 실시양태로, 본 명세서에 기재된 항체 중 하나 (예를 들면, 세툭시맙, 메디토프-이용가능한 트라스투주맙, 또는 메디토프-이용가능한 M5A (항-CEA) 항체)를 주형 서열로 사용하여, 공지되어 있는 항체 조작벙 중 하나 이상을 수행하여 이를 변경, 예를 들면, 이의 항원-결합 특징을 변경시켜, 뚜렷한 별개의 특징을 갖는 메디토프-이용가능한 항체를 생산함으로써, 메디토프-이용가능한 항체가 생성된다. 항원 결합 및 기타 특성을 변경시키기 위하여 전형적으로 사용되는 공지의 항체 조작법으로는 실수 유발 PCR, 스파이킹 PCR, 부위-지시된 돌연변이, 파아지 표시 및 기타 선택법을 포함한, 다양한 시험관내 랜덤화, 친화도 성숙, 및 선택법이 있다. 그러한 방법을 수행하기 위한, GPI-연결된 발현 시스템을 포함하는, 작제물, 라이브러리, 및 발현 시스템이 또한 제공된다.
따라서, 특정의 실시양태로, 상기 제공되는 메디토프-이용가능한 항체는 메디토프-이용가능한 항체, 예로서 세툭시맙, 메디토프-이용가능한 트라스투주맙, 또는 메디토프-이용가능한 M5A의 프레임워크 영역 또는 영역들(FRs) (또는 그러한 항체의 FR(s)와 적어도 약 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 또는 그와 대략 동일한 FR(s))을 갖는 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역을 갖는다. 일부 양태로, 그러한 항체는 메디토프-이용가능한 항체의 CDRs와 구별되는 하나 이상의 CDRs를 갖는다.
예를 들어, 일부 실시양태로, 상기 VL 영역이 서열 번호: 71에 기재된 경쇄 서열의 경쇄 프레임워크 영역(FR) 1(FR-L1), FR-L2, FR-L3, 및/또는 FR-L4 (또는 서열 번호: 71의 경쇄의 FR-L1, FR-L2, FR-L3, 및/또는 FR-L4와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 또는 그와 대략 동일한 FR-L1, FR-L2, FR-L3, 및/또는 FR-L4)을 포함하는 아미노산 서열, 및 일부 양태로, 서열 번호: 71에 기재된 경쇄 서열의 CDRs와 구별되는 하나 이상의 CDR을 갖고; 및/또는 서열 번호: 72에 기재된 중쇄 서열의 중쇄 FR1(FR-H1), FR-H2, FR-H3, 및/또는 FR-H4 (또는 또는 서열 번호: 72의 중쇄의 FR-H1, FR-H2, FR-H3, 및/또는 FR-H4와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 또는 그와 대략 동일한 FR-H1, FR-H2, FR-H3, 및/또는 FR-H4)를 갖는 아미노산 서열, 및 일부 양태로 서열 번호: 72에 기재된 중쇄 서열의 CDRs와 구별되는 하나 이상의 CDR을 갖는 VH 영역을 갖는다.
일부 실시양태로, 상기 VL 영역이 서열 번호: 9에 기재된 경쇄 서열의 경쇄 프레임워크 영역(FR) 1(FR-L1), FR-L2, FR-L3, 및/또는 FR-L4 (또는 서열 번호: 9의 경쇄의 FR-L1, FR-L2, FR-L3, 및/또는 FR-L4와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 또는 그와 대략 동일한 FR-L1, FR-L2, FR-L3, 및/또는 FR-L4)을 포함하는 아미노산 서열, 및 일부 양태로, 서열 번호: 9에 기재된 경쇄 서열의 CDRs와 구별되는 하나 이상의 CDR을 갖고; 및/또는 서열 번호: 6에 기재된 중쇄 서열의 중쇄 FR1(FR-H1), FR-H2, FR-H3, 및/또는 FR-H4 (또는 또는 서열 번호: 6의 중쇄의 FR-H1, FR-H2, FR-H3, 및/또는 FR-H4와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 또는 그와 대략 동일한 FR-H1, FR-H2, FR-H3, 및/또는 FR-H4)를 갖는 아미노산 서열, 및 일부 양태로 서열 번호: 6에 기재된 중쇄 서열의 CDRs와 구별되는 하나 이상의 CDR을 갖는 VH 영역을 갖는다.
일부 실시양태로, 상기 VL 영역이 서열 번호: 68에 기재된 경쇄 서열의 경쇄 프레임워크 영역(FR) 1(FR-L1), FR-L2, FR-L3, 및/또는 FR-L4 (또는 서열 번호: 68의 경쇄의 FR-L1, FR-L2, FR-L3, 및/또는 FR-L4와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 또는 그와 대략 동일한 FR-L1, FR-L2, FR-L3, 및/또는 FR-L4)을 포함하는 아미노산 서열, 및 일부 양태로, 서열 번호: 68에 기재된 경쇄 서열의 CDRs와 구별되는 하나 이상의 CDR을 갖고; 및/또는 서열 번호: 70에 기재된 중쇄 서열의 중쇄 FR1(FR-H1), FR-H2, FR-H3, 및/또는 FR-H4 (또는 또는 서열 번호: 70의 중쇄의 FR-H1, FR-H2, FR-H3, 및/또는 FR-H4와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 또는 그와 대략 동일한 FR-H1, FR-H2, FR-H3, 및/또는 FR-H4)를 갖는 아미노산 서열, 및 일부 양태로 서열 번호: 70에 기재된 중쇄 서열의 CDRs와 구별되는 하나 이상의 CDR을 갖는 VH 영역을 갖는다.
일부 실시양태로, 상기 VL 영역이 서열 번호: 61에 기재된 경쇄 서열의 경쇄 프레임워크 영역(FR) 1(FR-L1), FR-L2, FR-L3, 및/또는 FR-L4 (또는 서열 번호: 61의 경쇄의 FR-L1, FR-L2, FR-L3, 및/또는 FR-L4와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 또는 그와 대략 동일한 FR-L1, FR-L2, FR-L3, 및/또는 FR-L4)을 포함하는 아미노산 서열, 및 일부 양태로, 서열 번호: 61에 기재된 경쇄 서열의 CDRs와 구별되는 하나 이상의 CDR을 갖고; 및/또는 서열 번호: 63에 기재된 중쇄 서열의 중쇄 FR1(FR-H1), FR-H2, FR-H3, 및/또는 FR-H4 (또는 또는 서열 번호: 63의 중쇄의 FR-H1, FR-H2, FR-H3, 및/또는 FR-H4와 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 또는 그와 대략 동일한 FR-H1, FR-H2, FR-H3, 및/또는 FR-H4)를 갖는 아미노산 서열, 및 일부 양태로 서열 번호: 63에 기재된 중쇄 서열의 CDRs와 구별되는 하나 이상의 CDR을 갖는 VH 영역을 갖는다.
일부 실시양태로, 메디토프-이용가능한 항체가 서열 번호: 6, 7, 9, 10, 12, 14, 61, 63, 68, 69, 70, 71, 및/또는 72에 기재된 CDRs와 구별되는 하나 이상의 CDRs를 갖는다.
일부 실시양태로, 메디토프가 세툭시맙 이외의 항체이며, EGFR에 특이적으로 결합하지 않고, EGFR 이외의 항원에 결합하고/하거나 세툭시맙에 특이적으로 결합된 EGFR 상의 에피토프에 특이적으로 결합하지 않는다.
일부 실시예로, 메디토프-이용가능한 항체가 주형 항체를 기본으로 하여 발생되는데, 주형 항체는 아바고보맙(abagovomab), 아브식시맙(abciximab), 아달리무맙(adalimumab), 아데카투무맙(adecatumumab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 알투모맙(altumomab), 알투모맙 펜테테이트, 아나투모맙(anatumomab), 아나투모맙 마페나톡스, 아르시투모맙(arcitumomab), 아틀리주맙(atlizumab), 바실릭시맙(basiliximab), 벡투모맙(bectumomab), 엑투모맙(ectumomab), 벨리무맙(belimumab), 벤랄리주맙(benralizumab), 베바시주맙(bevacizumab), 브렌툭시맙(brentuximab), 카나키누맙(canakinumab), 카프로맙(capromab), 카프로맙 펜데타이드, 카투막소맙(catumaxomab), 세르톨리주맙(certolizumab), 클리바투주맙 테트락세탄(clivatuzumab tetraxetan), 다클리주맙(daclizumab), 데노수맙(denosumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 에드레콜로맙(edrecolomab), 에팔리주맙(efalizumab), 에타라시주맙(etaracizumab), 에르투막소맙(ertumaxomab), 파놀레소맙(fanolesomab), Fbta05, 폰톨리주맙(fontolizumab), 겜투주맙(gemtuzumab), 기렌툭시맙(girentuximab), 골리무맙(golimumab), 이브리투모맙(ibritumomab), 이고보맙(igovomab), 인플릭시맙(infliximab), 이필리무맙(ipilimumab), 라베투주맙(labetuzumab), 메폴리주맙(mepolizumab), 무로모납(muromonab), 무로모맙-CD3, 나탈리주맙(natalizumab), 네시투무맙(necitumumab), 니모투주맙(nimotuzumab), 오파투모맙(ofatumumab), 오말리주맙(omalizumab), 오레고보맙(oregovomab), 팔리비주맙(palivizumab), 파니투무맙(panitumumab), 라니비주맙(ranibizumab), 리툭시맙(rituximab), 사투모맙(satumomab), 술레소맙(sulesomab), 이브리투모맙(ibritumomab), 이브리투모맙 티욱세탄, 토실리주맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, Trbs07, 우스테키누맙, 비실리주맙, 보투무맙(votumumab), 잘루투무맙(zalutumumab), 브로달루맙(brodalumab), 안루킨주맙(anrukinzumab), 바피네우주맙(bapineuzumab), 달로투주맙(dalotuzumab), 뎀시주맙(demcizumab), 가니투맙(ganitumab), 이노투주맙(inotuzumab), 마브릴리무맙(mavrilimumab), 목세투모맙 파수도톡스(moxetumomab pasudotox), 릴로투무맙(rilotumumab), 시팔리무맙(sifalimumab), 타네주맙(tanezumab), 트랄로키누맙(tralokinumab), 트레멜리무맙(tremelimumab), 하이브리도마 10B5에 의해 생산된 항체, B6H12.2, 및 우렐루맙(urelumab), 이들의 단편, CDRs를 갖는 항체 및/또는 이의 항원-결합 영역, 및/또는 그러한 항체와의 결합에 대해 경쟁하는 항체; 및/또는 서열 번호: 78-124, 및/또는 125-170 중 어느 하나에 기재된 서열을 갖는 항체, 이의 단편, CDRs를 갖는 항체 및/또는 이의 항원-결합 영역, 및/또는 그러한 항체와의 결합에 대해 경쟁하는 항체로부터 선택된다.
표 2에는 특정 항체에 대한 CAS® 등록 번호가 게시되어 있다 (참조: www.cas.org/expertise/cascontent/registry/regsys.html)
[표 2]
Figure pct00008
Figure pct00009
다른 실시예로, 주형 항체가 하기로부터 선택된다: 아바고보맙, 아브식시맙, 아달리무맙, 아데카투무맙, 알렘투주맙, 알투모맙, 알투모맙 펜테테이트, 아나투모맙, 아나투모맙 마페나톡스, 아르시투모맙, 아틀리주맙, 바실릭시맙, 벡투모맙, 엑투모맙, 벨리무맙, 벤랄리주맙, 베바시주맙, 브렌툭시맙, 카나키누맙, 카프로맙, 카프로맙 펜데타이드, 카투막소맙, 세르톨리주맙, 클리바투주맙 테트락세탄, 다클리주맙, 데노수맙, 에쿨리주맙, 에드레콜로맙, 에팔리주맙, 에타라시주맙, 에르투막소맙, 파놀레소맙, Fbta05, 폰톨리주맙, 겜투주맙, 기렌툭시맙, 골리무맙, 이브리투모맙, 이고보맙, 인플릭시맙, 이필리무맙, 라베투주맙, 메폴리주맙, 무로모납, 무로모맙-CD3, 나탈리주맙, 네시투무맙, 니모투주맙, 오파투모맙, 오말리주맙, 오레고보맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 라니비주맙, 리툭시맙, 사투모맙, 술레소맙, 이브리투모맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 토실리주맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, Trbs07, 우스테키누맙, 비실리주맙, 보투무맙, 잘루투무맙, 하이브리도마 10B5에 의해 생산된 항체, 및 브로달루맙, 또는 티우제단. 일부 그러한 실시예에서, 1개 이상의 CDRs가 이들 템플 주형에 존재하는 CDRs이고/이거나, 항체가 그러한 항체와 동일한 항원 또는 에피토프에 결합하고/하거나, 그러한 항체의 항원에 대한 결합에 그러한 항체와 경쟁한다.
따라서, 일부 경우에 있어서, 메디토프-이용가능한 항체 (이들의 단편을 포함하여)는 하기의 것들로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 특이적으로 결합한다: CA-125, 당단백질(glycoprotein: GP) IIb/IIIa 수용체, TNF-알파, CD52, TAG-72, 암배아성 항원 (CEA), 인터류킨-6 수용체 (IL-6R), IL-2, 인터류킨-2 수용체 a-쇄 (CD25), CD22, B-세포 활성화 인자, 인터류킨-5 수용체 (CD125), VEGF, VEGF-A, CD30, IL-1 베타, 전립선 특이 막 항원 (PSMA), CD3, EpCAM, EGF 수용체 (EGFR), MUC1, 인간 인터류킨-2 수용체, Tac, RANK 리간드, 보체 단백질, 예를 ㄷ들면, C5, EpCAM, CD11a, 예를 들면, 인간 CD11a, 인테그린, 예를 들면, 알파-v 베타-3 인테그린, 비트로넥틴 수용체 알파 v 베타 3 인테그린 , HER2, neu, CD3, CD15, CD20 (소루프 및/또는 대루프), 인터페론 감마, CD33, CA-IX, TNF 알파, CTLA-4, 암배아성 항원, IL-5, CD3 엡실론, CAM, 알파-4-인테그린, IgE, 예를 ㄷ들면, IgE Fc 영역, RSV 항원, 예를 들면, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)의 융합 단백질, TAG-72, NCA-90(과립구 세포 항원), IL-6, GD2, GD3, IL-12, IL-23, IL-17, CTAA16.88, IL13, 인터류킨-1 베타, 베타-아밀로이드, IGF-1 수용체 (IGF-1R), 델타-유사 리간드 4 (DLL4), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 수용체의 알파 서브유닛, 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor), IFN-알파, 신경 성장 인자, IL-13, CD326, 프로그램된 세포 사열 1 리간드 1 (PD-L1, a.k.a. CD274, B7-H1), CD47, 및 CD137. 일부 실시예에서, 메디토프-이용가능한 항원이 암 또는 기타 질병과 같은, 관심있는 질병 또는 질환에서 표적으로 확인된 다른 항원에 결합한다.
메디토프-이용가능한 항체는 일반적으로 불변 영역, 전형적으로, 인간 또는 부분적으로 인간의 불변 영역인, 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 일부 양태로, 중쇄 불변 영역이 CH1, 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 양태로, 경쇄 불변 영역이 CL, 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 실시양태로, 상기 불변 영역의 일부는 메디토프에 결합할 수 있는, 예를 들면, 필요한 결합 친화도를 갖는 항체로 만들기에 충분하다. 일부 양태로, 불변 영역이 세툭시맙 또는 트라스투주맙의 불변 영역이다. 따라서, 일부 양태로, 중쇄 불변 영역이 1개 이상의 인간 IgG1 불변 영역이고; 일부 양태로, 경쇄 불변 영역이 카파 불변 쇄 영역이다. 다른 실시예로, 불변 영역이 인간 (또는 다른 유기체, 예를 들면, 뮤린 또는 닭) IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgEs, IgA1, IgA2, IgD, 또는 IgM를 포함하는, 다른 이소타입의 것들을 포함할 수 있으며, 카파 또는 람다 불변 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 제공되는 메디토프-이용가능한 항체중에는 인간, 뮤린, 또는 닭과 같은 다른 IgGs, 또는 다른 면역글로불린중의 잔기를 돌연변이시켜 발생시킨 것들이 있다. 다시 말해서, 본 명세서에서 제공되는 메디토프-이용 방법은 IgA, IgE, IgD, 및 IgM를 포함한, 임의의 항체 및 비제한적으로 닭, 뮤린, 래트, 소, 래비트, 영장류, 및 염소를 포함하여 항체를 생산하는 임의의 유기체로부터의 항체에 대해 사용될 수 있다.
예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4의 제1 불변 영역(CH1)의 서열이 도 55A에 비교되어 있다. 도 55B에서는 세툭시맙과 cQFD 메디토프 (메디토프 1, 서열 번호: 1)의 공-결정 구조상에 맵핑된, IgG1 CH1과 비교한, IgG2-4 CH1에서의 서열차를 보여준다. 상기 도면에 나타난 바와 같이, 이들 이소타입중에서 상이한 잔기는 세툭시맙의 메디토프-결합 영역내에 존재하지 않으며, 이는 메디토프-이용가능한 기술이 세툭시맙의 IgG1을 제외한 이소타입에 적용될 수 있음을 확인시켜주는 것이다. 다른 예로, IgG1 및 IgE Fab 도메인의 서열과 구조적 정렬은 메디토프 결합 부위 근처의 IgE상의 잔기를 표시한다 (도 26).
단일클론 항체내의 Fab 구멍의 메디토프-부위 그라프팅을 위하여 제공되는 방법을 사용하여 메디토프 결합을 위한 독특한 핸들을 생성시켜 이전에 개시된 기술과 함께 새롭게-발생되는 항체에 대해 사용할 수 있다. 특정의 실시양태로, 메디토프 결합 부위가 이미 존재하며 앞으로 생성될 모든 단일클론 항체상에 생성될 수 있다.
하기 섹션 F에서 설명되는 바와 같이, 메디토프-이용가능한 항체를, 예를 들면, 항체의 친화도, 결합활성(avidity), pH-의존성을 포함한, 메디토프와의 상호반응 양태, 뿐만 아니라, 항체의 약역학(PK) 및 약동학(PD)을 포함한, 기타 양태를 포함하여, 메디토프-이용가능한 항체의 여러가지 특성을 변경시키기 위한, 메디토프-이용가능한 항체의 변형 방법이 또한 제공된다. 따라서, 제공되는 메디토프-이용가능한 항체중에는 그러한 방법들에 따라서, 예를 들면, 하기 섹션 F에 기재된 변형을 1개 이상 갖는 항체를 포함한, 약리단(pharmacophore) 결합 모델을 생성시킴으로써 생성되는 변형된 항체들이 있다.
또한, 변형된 항체 및 이의 일부 메디토프-이용가능한 항체를 발생시키기 위한 주형 항체로서 사용되는 항체중에, CovX-Body™와 같이, 변형된 항체 및 이의 일부가 있다. 따라서, 상기 제공되는 메디토프-이용가능한 항체중에 제공되는 메디토프 1개 이상에 이들이 결합하도록 변형된, 예를 들면, 본 명세서에 기재된 바와 같은 친화도를 갖는 CovX-항체가 있다.
본 명세서에 기재된 항체 중 하나와 같은, 메디토프-이용가능한 항체에 결합되어 있는 메디토프 1개 이상을 함유하는 복합체가 또한 제공된다.
메디토프-이용가능한 항체를 암호화하는, cDNA 및 RNA 분자와 같은 핵산 및 이를 함유하는 벡터 및 라이브러리, 뿐만 아니라 그러한 작제물을 사용하여 선택 및 발현시키는 방법 및 유전자전이 동물을 발생시키는 방법을 포함한, 이들의 사용 방법이 또한 제공된다.
D. 메디토프
메디토프-이용가능한 항체에 결합하는, 변이체, 변형된 메디토프, 및 다가 메디토프를 포함한, 메디토프들, 및 이를 함유하는 복합체 및 조성물과, 이들의 방법 및 용도가 또한 제공된다. 특정의 실시양태로, 상기 메디토프가 메디토프 1 및 2 (cQFD (서열 번호: 1) 및 cQYN (서열 번호: 2))를 포함하는데, 이들은 원래 문헌: Riemer, et al. (2004); J Immunol 173, 394-401; Riemer, et al. (2005); J Natl Cancer Inst 97, 1663-1670에 기재된 바와 같이, 세툭시맙의 CDR 영역에 결합시키기 위한 후보물질 펩타이드로 확인되었다. 본 명세서에서 증명되는 바와 같이, cQFD 및 cQYN 메디토프는 세툭시맙 CDRs와 구별되는 세툭시맙내의 부위에 결합하며, 따라서 백신으로 사용하기 위한 특이적인 세툭시맙-유사 항체 면역원에 대한 후보물질이 전혀 아니었다.
메디토프 변이체 및 다가 메디토프를 포함한, 메디토프를 암호화하는 핵산, 뿐만 아니라 이를 함유하는 벡터, 세포, 라이브러리, 및 기타 시스템이 또한 제공된다.
I. 변이체 메디토프
제공되는 메디토프 중에, 메디토프 1 또는 2 (서열 번호: 1 또는 2의 메디토프)와 비교하여, 변형, 예를 들면, 구조적 변형,을 1개 이상 갖는 메디토프 변이체 (변이체 메디토프로도 언급된다)가 있으며, 이들의 생산 방법도 제공된다. 일부 실시양태로, cQFD 및 cQYN 메디토프가 메디토프 변이체의 디자인중에 출발점으로 사용된다. 일부 양태로, 메디토프 변이체가 비변형된 메디토프, cQFD 및 cQYN과 비교하여, 변경된 특성, 예로서 증가되거나 변경된 친화도, 변경된 pH 의존성, 또는 상이한 생리학적 조건하에서 세툭시맙과 본 명세서에 기재된 다른 항체들을 포함한, 제공되는 메디토프-이용가능한 항체에 대한 상이한 친화도를 갖도록 디자인된다. 다양한 화학적 및 생물물리학적 방법을 사용하여 메디토프 변이체를 디자인하고 생산한다.
메디토프 변이체로는 비제한적으로, 메디토프에 대한 변형을 내포하는 변이체, 예를 들면 cQFD 및 cQYN과 본 명세서에 기재된 기타의 것들이 있다. 적합한 변형으로는 비제한적으로, 당해 분야에 공지된 임의의 펩타이드 변형, 예로서, 비제한적으로 펩타이드 고리화 방식 및/또는 위치에 대한 변형, 환형 펩타이드의 아미노산 성분 중 1개 이상에 대한 변형, 또는 환형 펩타이드로부터 아미노산 1개 이상을 첨가 또는 결실시키는 것이 있다. 특정 예로서, cQFD가 다음과 같은 변형 중 1개 이상을 갖도록 변경될 수 있다: Arg8의 변형, Phe3의 변형, Leu5의 변형, Leu10의 변형, 펩타이드 고리화 방식에 대한 변화, 및/또는 1개 이상의 위치에서 수화가능한 카르보닐 작용성의 내포, 및 아미노산 1개 이상의 결실 또는 첨가. cQYN의 경우, 적합한 변형은 다음 중 1개 이상을 포함할 수 있다: Arg8의 변형, Leu5의 변형, Leu10의 변형, 펩타이드 고리화 방식에 대한 변화, 및/또는 1개 이상의 위치에서 수화가능한 카르보닐 작용성의 내포, 및 아미노산 1개 이상의 결실 또는 첨가. 메디토프내의 특정 아미노산 위치가 결실되거나 상이한 아미노산 또는 비천연 아미노산으로 대체될 수 있거나, 메디토프가 단편과 화학적으로 접합될 수 있다. 서열 번호: 1의 Arg9가 시트룰린으로 돌연변이되어있는 메디토프가 세툭시맙에 결합하는 것이 본 명세서에 나타나 있다. 또한, 아미노 및 카르복시말단이 메디토프 변이체의 환형 부분을 넘어서 (즉, 이에 추가하여) 추가의 아미노산으로 연장되어 Fab에 추가로 접촉하도록 할 수 있다. 예를 들면, 단백질 L이 cQFD 메디토프의 C-말단에 부가되었으며 1차적인 데이타는 이것이 훨씬 더 높은 친화도로 결합함을 보여준다. 그러한 변형은 실시예 6 및 7에서 추가로 논의된다.
일부 실시양태로, 메디토프가 표 3 및 4에 게시된 것들, 뿐만 아니라 길이가 아미노산 16개 까지인 것들과 같이, 추가의 아미노산을 갖는 메디토프를 포함한다. 예를 들어, 일부 양태로, 메디토프는 첫번째 잔기 전, 즉 0번 위치에서 세린을 추가로 포함하는, 메디토프 1, 2, 또는 15-55 중 하나이다. 표 3에 게시된 메디토프는 C 및 N 말단을 연결하기 위한 디설파이드 연결기 (메디토프 31이 추가의 테일을 함유하는 것은 제외하는데, 이는 2개의 말단 잔기 사이에 디설파이드 연결기가 없음을 의미한다); 표 4의 펩타이드의 경우, 락탐 연결기, 디설파이드 연결기를 제외한 연결기 (예로서 [3+2] 고리화첨가반응)가 사용되거나, 연결기가 사용되지 않는다 (예를 들면, 비환형 또는 선형 변이체). 본 명세서에 기재된 실시양태에 따라서 사용될 수 있는 추가의 메디토프로는 세툭시맙 또는 임의의 다른 치료적 항체의 항체 프레임워크 결합 계면 (즉, Fab 경쇄와 중쇄 사이)에 결합하는 펩타이드인, 본 명세서에 정의된 바와 같은 임의의 메디토프가 있다. 예를 들면, 환형 펩타이드 cQFD와 cQYN 외에, 일부 실시양태는 cQFD와 cQYN의 변이체를 1개 이상 포함한다.
[표 3]
Figure pct00010
[표 4]
Figure pct00011

메디토프 변이체는 전형적으로 5개에서 16개 사이의 아미노산 서열 길이, 예를 들면, 8개 내지 13개 사이의 아미노산 길이 (예, 9개 내지 12개의 아미노산 길이)와 같이, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개의 아미노산 길이를 갖는다. 메디토프는 추가로 링커 또는 약제를 포함한, 다른 펩타이드와 같은 다른 분자에 접합되거나 이와 회합 (예를 들면, 융합 단백질 또는 펩타이드의 일부로)될 수 있다. 따라서, 이런 경우, 메디토프를 함유하는 화합물은 이 패러그래프에 기재된 길이를 넘어서 추가의 아미노산 잔기를 함유할 수 있으며, 이때 메디토프 부분은 5 내지 16개의 아미노산을 함유하며 복합체 또는 화합물은 추가의 아미노산을 함유한다. 예를 들어, 상기 서열 번호: 31이 본 명세서에 기재되어 있다.
일부 실시양태로, 변이체 메디토프가 환형 펩타이드이다. 다른 실시양태로, 이들이 직쇄 또는 비환형 펩타이드이다.
메디토프는 펩타이드, 또는 그러한 펩타이드로부터 유래된 환형 펩타이드, 예를 들면, 펩타이드가 하기 화학식(I):
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12 (화학식 I)
(예를 들어, 여기서,
X1는 Cys, Gly, β-알라닌, 디아미노프로피온산, β-아지도알라닌이거나, 존재하지 않으며;
X2는 Gln이거나 존재하지 않고;
X3은 Phe, Tyr, β-β'-디페닐-Ala, His, Asp, 2-브로모-L-페닐알라닌, 3-브로모-L-페닐알라닌, 또는 4-브로모-L-페닐알라닌, Asn, Gln, 변형된 Phe, 수화가능한 카르보닐-함유 잔기; 또는 붕산-함유 잔기이며;
X4는 Asp 또는 Asn이고;
X5는 Leu; β-β'-디페닐-Ala; Phe; 페닐알라닌, 트립토판, 또는 티로신의 비-천연 유사체; 수화가능한 카르보닐-함유 잔기; 또는 붕산-함유 잔기이며;
X6는 Ser이고;
X7은 Thr 또는 Ser이며;
X8은 Arg, 변형된 Arg, 또는 수화가능한 카르보닐 또는 붕산-함유 잔기이고;
X9은 Arg, Ala이며;
X10은 Leu, Gln, Glu, β-β'-디페닐-Ala; Phe; 페닐알라닌, 트립토판, 또는 티로신의 비-천연 유사체; 수화가능한 카르보닐-함유 잔기; 또는 붕산-함유 잔기이고;
X11은 Lys이며;
X12는 Cys, Gly, 7-아미노헵타노산, β-알라닌, 디아미노프로피온산, 프로파르길글리신, 이소아스파르트산이거나 존재하지 않는다)를 갖는 펩타이드를 포함할 수 있다.
일부 양태로, 상기 변형된 Arg가 도 34에 나타낸 화학식의 구조를 갖는다. 일부 양태로, 상기 변형된 Phe는 페닐 환으로 내포된 할로겐을 1개 이상 갖는 Phe이다. 일부 양태로, 화학식 I은 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2가 아니다.
일부 양태로, 상기 메디토프가 화학식(X)의 구조를 갖는 펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다:
Figure pct00012
상기 식에서,
"*"로 표시된 중심은 "R" 또는 "S" 배열로 존재하고;
R3 및 R3'는 서로 독립적으로, H이거나 C1-4 알킬, -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된, 페닐이며;
R5는
(A) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CO2C1-4 알킬, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CONH2 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬이거나;
(B) a) 1개 또는 2개의 페닐 기 (여기서 각각의 페닐은 -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된다); 또는
b) 나프틸, 이미다졸, 또는 인돌 기
로 치환된 C1-4 알킬이고;
R6는 -C1-4 알킬-OH 또는 -C1-4 알킬-SH이며;
R7은 -C1-4 알킬-OH 또는 -C1-4 알킬-SH이고;
m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이며;
R8은
(a) -OH, -NRaRb, -N(Rc)C(O)Re, 또는 -N(Rc)C(=NRd)Re; 또는
(여기서,
Ra는 H이고;
Rb는 H이거나, 옥소, 아세탈, 및 케탈, -B(OH)2, -SH, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 또는 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬이며;
Rc는 H, C1-8 알킬, C3-8 사이클로알킬, 분지된 알킬, 또는 아릴이고;
Rd는 H이거나, 각각 -N3, -NH2, -OH, -SH, 할로겐, 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 치\환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬, C2-8 알케닐, C2-8 알키닐, C3-8 사이클로알킬, 분지된 알킬, 또는 아릴 기이며;
Re는 H; -NHRd; 또는 각각 -N3, -NH2, -OH, -SH, 옥소, C2-4아세탈, C2-4케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, 및 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-12알킬, C3-8사이클로알킬, C2-12알케닐, C2-8알키닐, 또는 아릴 기이다)
(b) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, -SH, -OH, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, 또는 -CO2C1-4알킬 기로 치환된 C1-12 알킬이고;
R9는 C1-4알킬 또는-C1-2알킬렌-Rx이며, 여기서 Rx는 -CO2H, -CONH2, -CH2NHC(O)NH2, 또는 -CH2NHC(=NH)NH2이고;
R10은
(1) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CONH2 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬; 또는
(2) 1개 또는 2개의 페닐 기, 또는 1개의 나프틸, 이미다졸, 또는 인돌 기로 치환된 C1-4 알킬 기 (여기서, 각각의 페닐은 -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개, 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된다)이고;
n은 0 또는 1이며;
p는 0 또는 1이고;
X는 각각의 탄소가 -CO2H, -NH2, 또는 -NHC(O)Ry로 임의로 치환된, C1-8 알킬렌 또는 C2-8 알케닐렌이며,여기서 상기 알킬렌의 탄소 1개는 -C(O)NH-, 5-원 헤테로아릴 환, 또는 -S-S-로 임의로 치환되며;
Ry는 -C1-4알킬 또는-CH(Rz)CO2H이고, 여기서 Rz는 -H이거나 -OH, -SH, 또는 -NH2로 임의로 치환된, -C1-4알킬이다.
어떤 경우에는, 그러한 메디토프가 서열 번호: 1 또는 2가 아니거나, 그러한 서열로부터 유래된 환형 펩타이드가 아니고/아니거나, 메디토프 1 또는 2가 아니다.
화학식(X)의 메디토프의 일부 실시양태로, m이 0, 1, 또는 2이다. 다른 실시양태로, R3이 H 또는 페닐이고 R3'가 페닐, 2-브로모페닐, 3-브로모페닐, 또는 4-브로모페닐이다. 추가의 실시양태로, R5가 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, 또는 tert-부틸로, 이들은 각각 옥소, -B(OH)2, -CO2H, 또는 -CONH2 기로, 또는 브로모 또는 클로로 치환기로 각각 임의로 치환된 1개 또는 2개의 페닐 기로 임의로 치환된다. 추가의 실시양태로, R8이 -OH, -NH2, -N(Rc)C(O)Re, 또는 -N(Rc)C(=NRd)Re이다. 또 다른 실시양태로, Rc가 H 또는 메틸이고, Rd가 H 또는 C1-4알킬이며, Re가 C1-4알킬, 또는 -NH(C1-4알킬)이다. 다른 실시양태로, R9가 -CO2H, -CONH2, -CH2NHC(O)NH2, 또는 -CH2NHC(=NH)NH2로 임의로 치환된 메틸 또는 에틸이다. 또 다른 실시양태로, R10이 각각 옥소, -B(OH)2, -CO2H, 또는 -CONH2 기로 임의로 치환된 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, 또는 tert-부틸이다. 또 다른 실시양태로, -X-NH가 -Cys-Cys-, -Gly-Gly-, -C(O)(CH2)6-NH-, -β-Ala-β-Ala-, -C(O)CH(NH2)CH2CH=CHCH2CH(CO2H)-NH-,
-C(O)CH(NH2)CH2NHC(O)CH2CH(CO2H)-NH-, -β-Ala-C(O)CH2CH(CO2H)-NH-, 또는 -C(O)CH(NH2)CH2-트리아지닐-CH2-CH(CO2H)-NH-이다.
변형
구조적 및 열역학적 데이타를 기본으로 하여, 본 명세서에 기재된 메디토프 1 및 2 내의 다수의 위치가 전체적인 결합 친화도를 증진시키고/시키거나 본 명세서에 기재된 바와 같은 다른 특성을 변경시키기 위한 변형용 표적 부위, 예를 들면 상이한 천연 또는 비-천연 아미노산을 갖는 표적 부위로 확인되었다. 그러한 변형로는, 비제한적으로, 헤드-투-테일(head-to-tail) 환형 락탐 펩타이드를 발생시키기 위한 cQFD 또는 cQYN의 변형, Arg8의 변형, 3번 위치 (예를 들면, cQFD 또는 이의 변이체의 Phe3)의 변형, Leu5의 변형, Leu10의 변형, 및/또는 수화가능한 카르보닐 작용성의 내포 (도 31 참조)가 있다. 본 명세서에서 증명되는 바와 같이, cQFD의 원래 메디토프에서 Phe3, Leu5, 및 Arg8 각각을 알라닌으로 돌연변이시키면 생성되는 화합물의 메디토프-이용가능한 결합 계면에 대한 친화도가 10배 내지 140배까지 감소되었다. 일부 양태로, 변이체 메디토프는 서열 번호: 1 또는 2의 메디토프, 또는 표 3 또는 4에 게시된 다른 메디토프의 1, 3, 5, 8, 10, 및 12번 위치 중 1개 이상에서 변형을 갖는 것들을 포함한다.
8번 위치
일부 실시양태로, 메디토프 변이체는 메디토프 1 또는 2의 8번 위치(Arg8)에 상응하는 위치에서 변형을 포함한다. 변형되지 않은 메디토프 (cQFD; 서열 번호: 1)에서, Arg8은 연장되어, 메디토프-이용가능한 항체 중쇄의 Q05의 중쇄 카르보닐과 수소결합한다. 상기 잔기에 잇닿은 지역(immediate area)은 소수성이지만 용매 노출되어 있다 (도 33A). 일부 양태로, 메디토프가 이 위치에서 변형된 잔기를 함유한다 (예를 들면, 변형된 Arg8). 일부 예로, 상기 변형된 잔기가 메디토프-이용가능한 항체 H-결합에 대해 유용한 Arg8 잔기의 면역 작용성을 유지하며, 치환되거나 비치환된 수소성 암(arm)을 도입시켜 구멍을 채운다. 그러한 변형은 리간드 도킹 계산에 의해 지지되는 바와 같이, 엔트로피 증가로 인하여, 결합을 현격하게 증가시킨다. 그러한 변형은 N-알킬 구아니디늄 기, 또는 알킬-아미딘 작용성을 사용하여 내포될 수 있다. 다른 경우에서는, 말단 N-원자의 치환된 기가 알킬 또는 아릴일 수 있으며, 여기서 알킬 또는 아릴 기의 각각의 위치는 말단 위치를 포함하는 상기 기 내에서 추가의 작용성으로 임의로 치환될 수 있다. 하나의 예로, 도 34에 나타낸 바와 같은 구조를 갖는, 변형된 아르기닌 (변형된 Arg8)이 메디토프, 예를 들면 NH2 상에 부틸 기를 갖는 서열 번호: 1 또는 2 (도 34에서 NHR로 나타냄)의 Arg8 대신 치환된다. 일부 양태로, 변이체 메디토프가 8번 위치에서 n-부틸 아르기닌 또는 부틸아미딘 변형을 함유한다.
3번 위치
일부 실시양태로, 메디토프 변이체가 메디토프 1의 Phe3과 같이, 3번 위치에 상응하는 위치에서 변형을 함유한다. 구조적 데이타로 본 명세서에서 나타낸 바와 같이, 메디토프 변이체 Phe3Tyr cQYN (서열 번호: 2)의 히드록실 기는 cQFD (서열 번호: 1)와 비교하여 Arg8 측쇄의 연장된 구조가 변경되어 있다 (도 30C 및 35 참조). 본 명세서의 데이타는 Fab와 결합된 물을 갖는, 유리한 수소결합 네트워크의 형성을 제시한다. 엔탈피-구동된 최적화는 약물 디자인에 있어서 수많은 소분자 접근방식에서 성공적인 것으로 입증되었으며 제공되는 메디토프에는 엔트로피 증가를 조작하기 위한 기회가 있다. 일부 실시양태로, 접근방식은 메디토프 디자인에 엔탈피 및/또는 엔트로피를 증가시켜 변이체 메디토프를 발생, 예를 들어, 결합을 최적화시키는데 사용된다.
예를 들어, 메디토프-이용가능한 항체게 결합된 경우, Phe3의 소수성 페닐 환이 메디토프-이용가능한 항체 Fab의 측쇄 잔기의 극성이 강항 배열(array)로 둘러싸이게 된다(도 35). 일부 실시양태로, 1개 이상의 할로겐이 상기 잔기의 페닐 환에 도입되어, 극성 측쇄 잔기와 할로겐 결합 상호결합하도록 한다. 할로겐 결합은 수소 결합과 유사하지만, 산소 원자와, 브롬 또는 염소 (또는 다른 할로겐)와 같은 할로겐의 상호반응에 관여하는, 상대적으로 강력한 비-공유결합이다. 일부 양태로, 상기 위치의 잔기가 할로겐 치환기를 내포하도록 변형된다. 일부 양태로, Phe3이 2-브로모-, 3-브로모-, 또는 4-브로모페닐알라닌으로 대체되어, 메디토프-이용가능한 항체와의 할로겐 결합에 적합한 위치, 예를 들면, 각각, 메디토프-이용가능한 항체의 Tyr87(경쇄), Gln38, 및/또는 Tyr91(중쇄) 위치에 브롬 원자가 위치하도록 한다. 그러한 페닐알라닌 유도체는 상업적으로 입수가능하며 일부 양태로 고체상 펩타이드 합성법(SPPS)에 의해 환형 펩타이드 메디토프 변이체에 내포된다. 변이체 메디토프의 예로 메디토프 1의 Phe3에 대응하는 위치에 2-브로모-L-페닐알라닌, 3-브로모-L-페닐알라닌, 또는 4-브로모-L-페닐알라닌을 함유하는 것들이 있다.
다른 예로, 메디토프가 예를 들어, Phe3을 β,β'-디페닐알라닌으로 대체시킴으로써, 상기 위치에 추가의 페닐 기를 내포한다.
5번 및 10번 위치 (예를 들면, 메디토프 1 또는 2의 Leu5, Leu10)
일부 실시양태로, 메디토프 변이체가 메디토프 1 또는 2의 5번 또는 10번 위치(Leu5 또는 Leu10)에 대응하는 위치에 변형을 함유한다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이, 메디토프 1의 Leu5 및 Leu10의 측쇄는 메디토프-이용가능한 Fab, 세툭시맙에 소수성 접촉시킨다 (도 36의 오른쪽 패널; Leu10 참조). 특정의 실시양태로, 메디토프의 특성 중 1개 이상, 예를 들면, 친화도는 이들 위치중 하나 또는 둘다에 다른 천연 아미노산, 또는 비-천연 아미노산을 내포시킴으로써, 예를 들면, 연장될 수 있는 표면 영역의 양을 변화시킴으로써 변경된다. 하나의 실시양태로, 천연 아미노산(Phe/Tyr/Trp) 및 비-천연 유사체 (예를 들면, β,β'-디페닐-L-알라닌, 또는 분지된 알킬, 나프틸과 같은 연장된 방향족, 또는 다른 소수성 기를 포함하는 측쇄를 내포하고 있는 아미노산)가 상기 위치중 하나 또는 둘다에 SPPS를 통하여 대칭적으로 도입된다.
"수화가능한" 작용성
특정의 실시양태로, 메디토프-이용가능한 항체의 메디토프-결합 부위를 둘러싸고 있는 Fab 히드록실-포함 측쇄 1개 이상이 선택적 트랩핑(selective trapping)을 통하여, 수화가능한 작용성을 내포시키는 메디포트와 공유결합을 형성시킴으로써 활용된다. 따라서, 일부 실시양태로, 메디토프가 예를 들어 매우 선택적이지만 메디토프-이용가능한 항체 또는 다른 물질과 비가역적 반응을 생성시키기 위하여, 수화가능한 치환기를 갖는 잔기 1개 이상을 함유한다. 예를 들어, 메디토프 1의 Arg8은 Kabat 넘버링에 따라, 메디토프-이용가능한 항체 경쇄의 Ser43(3.5Å)와 중쇄의 Tyr91(3.8Å) 근처까지 연장된다 (도 36, 왼쪽 패널). 메디토프의 Arg8 또는 Leu10의 말단에 수화가능한 작용성은 내포시킴으로써 세린 또는 티로신 헤미-아세탈이 선택적으로 형성되도록 한다. 그러한 공유결합 부가물은 비가역적 결합을 필수적으로 수반한다. 추가로, 붕산을 함유하는 잔기가 또한 수화가능한 기로 메디토프중으로 통합될 수 있다. 붕산은 보르테자밉(bortezamib; Velcade®)의 구조적 활성에 있어서 중요한 역할을 하며, 보르테자밉은 다발성 골수종을 치료하는데 사용된다. 수화가능한 잔기의 추가적인 대표적인 예가 도 34에 나타나 있으며, 여기서 R = -CH2CHO 또는 -CH2B(OH)2. 일부 예로, 그러한 변이체는 SPPS를 사용하여 그러한 기를 함유하는 잔기를 내포시킴으로써 제조된다.
그러한 수화가능한 전략은 항체 Fab-메디토프 결합 부위내에 새로운 아미노산 잔기를 조작하고 메디토프의 다른 위치내에 요구되는 상보적인 "수화가능한" 작용성을 도입시키는데 적용할 수 있다. Fab 영역내로 시스테인 잔기를 도입시킴으로써 유사한 전략을 적용시킬 수 있으며 메디토프내에 포함된 친전자성 카르보닐 기 또는 이의 유도체와 같은 "수화가능한" 작용성에 대한 친핵성 공격을 위하여 또는 Fab 영역과 요구되는 티올 또는 티올 등가 작용성을 함유하는 메디토프 사이에 선택적인 디설파이드 결합 (-S-S-)을 만들기 위하여 상기 작용성을 사용할 수 있다. 이런 개념의 다른 실시양태로 α,β-불포화 카르보닐 작용성과 같이 메디토프에 포함된 Michael 수용체의 도입이 있다. 이들 작용성은 티올과 선택적으로 반응하여 안정한 공유결합성 탄소-황 결합을 형성시키는 것으로 잘 알려져 있다.
대안적 고리화 방법 및 디설파이드 가교의 대체
특정의 실시양태로, 변이체 메디토프는 cQFD 및 cQYN에서와 같이, 디설파이드 가교를 포함한다. 디설파이드 가교는 2개의 시스테인 잔기의 측쇄의 반응에 의해 형성될 수 있다. 특정의 실시양태로, 메디토프, 예를 들면, 메디토프 1 또는 2중의 디설파이드 가교가 대안적 연결기로 대체되거나 제거된다. 따라서, 변이체 메디토프중에는 대안적 연결기를 갖거나 원래의 메디토프의 디설파이드 가교가 결여되어 있는 것들이 있다.
일부 양태로, 아미노산 쇄내의 비천연 아미노산 1개 이상 사이가 연결된다. 비천연 아미노산으로 만들어질 수 있는 연결기의 예로, (i) 알데히드 또는 케톤을 포함하는 잔기와 아민 기를 포함하는 잔기 (여기서 아민 질소가 -NH2 또는 알킬옥시 기로 치환된다)의 반응 (예를 들면, p-아세틸페닐알라닌, m-아세틸페닐알라닌, 또는 p-(3-옥소부타노일)-L-페닐알라닌 잔기와 p-(2-아미노-3-히드록시에틸)-페닐알라닌 잔기의 반응)으로 만들어지는 안정한 하이드라존 또는 옥심-기본 연결기, (ii) 페닐셀레니딜알라닌을 도입시킴으로써 티올 반응성, (iii) p-벤조일-L-페닐알라닌을 내포시킴으로써 벤조페논을 함유하는 UV 가교결합제, (iv) p-이소프로필티오카르보닐-페닐알라닌 또는 p-에틸티오카르보닐-페닐알라닌을 내포시킴으로써 아민 반응성, (v) 예를 들어, 아지드 기를 함유하는 잔기를 알킨 기를 함유하는 잔기와 Huisgen 고리화첨가반응을 통하여 반응시킴으로써 (예를 들면, p-프로파르길옥시페닐알라닌 잔기와 p-아지도페닐알라닌 잔기의 반응) 만들어지는, 트리아진, 티아졸, 티아졸리딘, 또는 옥사졸 연결기와 같은 헤테로환형 연결기; (v) 하나의 잔기중의 산 기와 다른 잔기중의 아민 기의 반응에 의해 만들어지는 아미드 결합; (vi) 하나의 잔기중의 산 기와 다른 잔기, 예로서 세린, 중의 알코올과의 반응에 의해 만들어지는 에스테르 결합; (vii) 각각 말단 올레핀을 함유하는 잔기 2개의 반응, 예를 들면, 올레핀 복분해반응에 의해 만들어지는 이중결합, 또는 (viii) 당해 분야에 공지된 적합한 잔기간의 임의의 쌍의 반응에 의해 만들어지는 것을 포함하는 연결기를 포함한다. 리뷰를 위하여, 예를 들어 하기 문헌을 참고한다: Davies, J.S., "The Cyclization of Peptides and Depsipeptides," J. Peptide Sci. 2003, 9, 471-501. 하나의 실시양태로, 메디토프가 반응성 기가 Fab중에 내포된 비천연 아미노산, 예로서 p-아세틸페닐알라닌으로 향하도록 한다.
다양한 메디토프의 고리화 방법을 사용하여, 예를 들어, 생체내 안정성에 맞추고 후소되는 접합 화학에 대해 화학선택적 제어가 가능토록할 수 있다. 일부 실시양태로, 고리화 전략이 락탐 고리화 전략으로, 헤드-투-테일(head-tail) 락탐 고리화 (비환형 펩타이드의 말단 잔기간) 및/또는 다른 잔기 사이의 락탐 연결기를 포함한다. 락탐 형성은 또한 글리신, β-Ala, 7-아미노헵타노산 등과 같은 잔기를 비환형 메디토프 고리화 전구체에 내포시켜 상이한 락탐 환 크기와 연결 방식을 생성시킬 수 있다. "클릭(click)" 화학 및 올레핀 복분해와 같은 추가적인 고리화 전략이 또한 사용될 수 있다 (도 31의 오른쪽 박스 참조). 그러한 펩타이드와 펩티드미메틱(peptidemimetic) 고리화 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다.
일부 실시양태로, 락탐 연결기를 함유하는 메디토프가 생체내에서 더욱 안정한데, 예를 들면, 다른 연결기를 갖고 있는 메디토프와 비교하여 락탐 연결기를 갖는 메디토프가 생체내에서 더욱 안정하다.
일부 실시양태로, 비환형 펩타이드의 말단 잔기가 반응하여 환형 메디토프, 예를 들면, 환형 메디토프 변이체를 형성한다. 다른 실시양태로, 다른 위치에서, 예를 들면 3번과 11번 잔기 및 4번과 11번 잔기 사이를 포함한, 위치에서 고리화가 일어나기 쉽다. 따라서, 일부 양태로, 메디토프가 예를 들어, 12개-아미노산 펩타이드의 3번과 11번 잔기 사이 및/또는 4번과 11번 잔기 사이와 같이, N-말단 및 C-말단을 제외한 잔기 사이에서 형성된 연결기를 함유한다.
일부 실시양태로, 메디토프, 예를 들어, 변이체 메디토프가 반응성 아민 작용성 (예를 들면, Lys11)을 함유하는데, 이는 후속되는 메디토프 변이체의 접합, 예를 들어, 스캐폴드 또는 링커 또는 진단제와 같은 약제, 예를 들면, 본 명세서에 기재된 바와 같은 영상화제 또는 치료제로의 접합에 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 13에는 FACS 분석을 위한 플루오레세인을 메디토프 변이체에 접합시키기 위한 공정이 제시되어 있으며; 이 전략은 생체내 PET 영상화를 위한 DOTA를 포함한, 다른 영상화제 및 기타 약제에 적용시킬 수 있다.
일부 실시양태로, 티올 작용성을 메디토프 상의 임의의 적합한 위치에 도입시킬 수 있으며 영상화제, 다른 단백질 및 펩타이드, 금속 킬레이터, siRNAs, 나노입자, 및 세포독성 약물을 함유하는 수많은 외부 시약을 사용하여 선택적으로 변형시킬 수 있다.
메디토프의 특성화
일부 실시양태로, 변이체 메디토프와 같은 메디토프가 예를 들면, ITC, SPR 및/또는 회절 및/또는 실시예 부분에서 설명되는 것들과 같은 기타 방법으로 특성화된다. 일례로, 메디토프의 합성 및 이들의 특성화는 예를 들어, 가장 목표로 하는 특성, 예를 들면, 1개 이상의 메디토프-이용가능한 항체에 대한 최고의 친화도 또는 다른 목적하는 특성, 예로서 pH 의존성을 갖는 메디토프 변이체가 후속해서 변형되어 목적하는 특성을 향상시키는 것과 같은 반복적 방식으로 수행된다.
일례로, 메디토프-이용가능한 항체에 대한 메디토프의 결합의 특성화를 위하여, 메디토프를 >95% 동질성으로 정제하고 질량 스펙트럼에 의해 구조적으로 특성을 규명한다. 펩타이드를 수중에서 투석하여, 이들의 농도를 UV-Vis로 측정하고 원소 분석에 의해 보정하여, 적절한 완충액에 희석시킨다(>100x). 메디토프-이용가능한 항체에 대한 결합은 ITC, SPR, X-선 회절, 또는 이들의 조합에 의해 엄격하게 특성화한다. ITC 측정법은 TA Instruments nanoITC 상에서 수행할 수 있으며, 측정당 1 내지 2 mg의 펩타이드만 사용한다. 일례로, SPR 측정을 위하여, 저밀도 및 고밀도 칩을 메디토프-이용가능한 항체, 예를 들면, Fab 또는 전장 IgG와 접합시킨다. 어떤 경우에는, 상기 칩을 먼저, 세툭시맙의 경우 EGFR의 전체 세포회 도메인 (잔기 1 내지 621) 중의 가용성 단편과 같은, 항원을 사용하여 특성화한다. 본 명세서에 보고된 연구에서, 메디토프는 완전히 온전한 세툭시맙 IgG와 비교하여, 예를 들어 SPR 및 ITC로 측정한 바, 세툭시맙 Fab 단편에 세툭시맙 IgG와 유사한 엔탈피 및 엔트로피로 결합하였다. 따라서, 결합 측정은 세툭시맙 또는 다른 메디토프-이용가능한 항체의 완전 IgG 또는 Fab 단편을 사용하여 수행할 수 있다. 일례로, 회절의 경우, 세툭시맙 Fab 단편과 서열 번호: 1의 메디토프의 공-결정화 조건은 잘 정립되어 있으며 회절 품질 결정은 전형적으로 1 내지 3일, 전형적으로는 1일내 수득된다. 완전한 데이타 세트는 내부 공급원 (Rigaku 007-HF 및 R-AxisIV++)을 사용하여 8 내지 12시간내 수집하며 Stanford Synchrotron Radiation Lightsource에서 10분내 수집하는데, 이는 메디토프 변이체가 메디토프-이용가능한 항체와 상호반응의 신속한 특성화가 가능하도록 한다.
일부 양태로, ITC, SPR 및 X-선 회절은 예를 들면, 집합적으로, 원자에 대한 세부사항을 제공하여 후속되는 화학적 개실을 안내하고 궁극적으로는 메디토프의 친화도를 증진시키고/시키거나 메디토프에 대한 다른 변경을 가능케 한다. ? = -RT ln Ka 를 기본으로한 계산은 세툭시맙에 대한 마이크로몰과 나노몰 친화도 간의 차가 대략 4kCal/mol인 300K에서의 자유 에너지에서의 변화로 인하여 발생하며, 이는 강력한 수소 결합 순이다. 따라서, 단백질 결합 포켓으로부터 정돈된 물 분자의 소실 또는 아미노산 잔기-쇄의 재배향은 크기 순서로 결합을 변경시키기에 충분할 수 있다.
일부 예로, 다른 방식을 사용하여 메디토프의 특성을 변경, 예를 들면, 메디토프-Fab 상호반응의 친화도를 증진시킨다. 일례로, 상기 설명된 연구에서 수득한 데이타와 같은 구조적 데이타를 사용하여 돌연변이유발에 의해, Fab중의 잔기를 대체, 예를 들면, 추가의 수소 결합을 첨가하거나, 아미노산을 비천연 아미노산으로 치환시켜 대체하거나 수소성 계면을, 예를 들면, 보체 메디토프 결합이 더 우수할 수 있는 방식으로 변경시킬 수 있다. 일부 예로, 형광 편광 검정법을 사용하여 서열 번호: 1에서와 같이, 제시된 메디토프를 대신할 수 있는 메디토프 변이체를 확인한다. 다른 예로, 동일한 기술을 사용하여 메디토프를 대신할 수 있는 소분자를 확인하고 이후 메디토프의 결합 친화도를 추가로 증진시키기 위하여 주형으로 이들 소분자를 사용한다.
일부 예로, pH 의존성을 기본으로 하여, 예를 들면, 상이한 pH 조건에서 변화되는 친화도를 갖도록 메디토프 변이체를 디자인한다. 따라서, 특정의 실시양태로, meMAb-메디토프 상호반응을 pH에 대해 재단한다. 그러한 메디토프의 예가 본 명세서에 기재되어 있다. 일부 양태로, 메디토프 변이체의 결합 친화도를 완충 pH의 함수로 측정한다. 예를 들면, 변이체 메디토프가 리소좀 pH 수준에서 감소하거나 저산소 환경에서 증가하는 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편 1개 이상에 대한 결합 친화도를 갖는 메디토프를 포함한다. 예를 들면, 중성 pH (예를 들면, pH 7-8, 예로서, pH 7.3-7.5)에서 메디토프-이용가능한 항체에 대해 더 높은 결합 친화도를 나타내며 약 4 내지 6.5 사이의 pH, 예를 들면, 엔도좀(endosomal) pH (예를 들어, 약 5 및 약 6.5 사이의 pH) 또는 리소좀 pH (예를 들어, 약 4.5 내지 약 5 사이의 pH)에서와 같이 더욱 산성이 pH에서 항체에 대해 상대적으로 더 낮은 결합 친화도를 나타내는 변이체 메디토프가 제공된다. 여러개의 실시예를 보여주는 도 27을 참조한다. 다른 예로, 메디토프가 예를 들어, 혈액과 같은 생리학적 조건항서 관찰되는 친화도와 비교하여, 종양 환경과 같은 저산소 환경에서 항체에 대한 결합친화도가 증가되었다. 일부 실시양태로, 낮은 pH들에서 특이적 방출을 위한 (예를 들면, 약물 전달을 위한 리소좀에서) 메디토프 변이체 또는 메디토프 "유사체"의 변형이 제공되며, 이들이 저산소 환경(예를 들면, 종양 간질(tumor stroma) pH는 흔히 정상 조식보다 더 낮다)에서 더 높은 친화도로 결합하도록 메디토프를 변형시킨다. 또한, 그러한 메디토프 변이체를 발생시키는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에 따라서, 메디토프-이용가능한 항체 및 이의 작용성 단편의 결합, 정제, 및/또는 영상화 또는 기타 사용 방법을 향상시키기 위하여 메디토프 결합 부위를 활용하거나 최적화시킬 수 있다. 별개의 실시양태로, 메디토프가 메디토프 결합 부위 (예를 들면,ThioMAbs)에서 Fab중 조작된 시스테인 1개 이상에 결합하는 시스테인 잔기를 1개 이상 함유할 수 있다. 이에 의해 메디토프가 임의의 진단 및/또는 치료 물질, 분자 또는 화합물에 접합된다. 예를 들어, 상기 물질은 마커와 같은, 소분자 진단 분자일 수 있다. 상기 "Cys 메디토프"는 접합체가 항체를 향하도록 하고 공유결합 연결기를 통하여 결합한다. 달리, 메디토프는 메디토프 결합 부위에 내포되어 있는 1종 이상의 비천연 아미노산으로 Fab에 접합될 수 있다.
II. 다가 메디토프(multivalent meditopes)
제공되는 메디토프 중에는 다가 메디토프가 있다. 특정의 양태로, 메디토프가 링커 또는 스캐폴드 (예를 들면, 다가 테더링체(tethering entity))에 접합하게 되면 항원, 예를 들어, 종양-관련 항원에 결합되어 있는 메디토프-이용가능한 mAb에 대한 전체적인 치환도를 이에 대한 표적화가 상당히 개선된다.
전장(full-length) 단일클론 항체 (mAbs) 및 F(Ab)'2 단편은 2개의 Fab 도메인 (전장 mAbs의경우, 이합체 Fc에 커플링되어 있음)을 포함한다. 그러한 2가 항체 (예를 들면, IgGs)는 높은 밀도로 항원을 발현시키는 세포에 우선적으로 결합한다. 동일한 항원상에서 독특한 에피토프를 인식하는 단일클론 항체(mAbs)를 조합하면 여러가지 항체 이펙터(effector) 기능 (예를 들면, ADCC, 보체-의존성 용균작용, 신호화 억제)의 증진, 세포 사멸의 증진, 및 암-표적화 항체의 경우, 종양 성장 억제의 증진을 포함한, 상승 효과가 생산될 수 있다. 예를 들면, 하기 문헌을 참조한다: Dechant M et al., "Complement-dependent tumor cell lysis triggered by combinations of epidermal growth factor receptor antibodies,"Cancer Res, 2008 Jul 1;68(13):4998-5003; Scheuer W et al., "Strongly enhanced antitumor activity of trastuzumab and pertuzumab combination treatment on HER2-positive human xenograft tumor models,"Cancer Res, 2009 Dec 15;69(24):9330-6; Cardarelli PM et al., "Binding to CD20 by anti-B1 antibody or F(ab')(2) is sufficient for induction of apoptosis in B-cell lines," Cancer Immunol Immunother, 2002 Mar;51(1):15-24. Epub 2001 Dec 18. 상기 증진된 세포 사멸에 대한 정확한 메카니즘에 대해서는 논쟁의 여지가 있지만, 연구결과는 mAb 둘다 효과를 증시키기기 위해서는 다가 (예를 들면, 완전 항체 또는 F(Ab)'2)이어야 함을 표시하는데, 이는 제2의 2가 mAb (이는 동일한 항원상에서 독특한 에피토프에 결합한다)가 세포 표면 항원을 클러스터하여 더욱 효과적으로 작용할 수 있는, 예를 들어, 더욱 효과적으로 종양 세포를 사멸시킬 수 있음을 제시한다. 도 8과 16을 참조한다.
본 발명에서 일부 실시양태로, 그러한 클러스터링(clustering)은 다가 메디토프를 사용하여 다시 바로 잡힌다. 일부 양태로, 다가 메디토프가 제2 항체 대신 사용되는데, 일부 양태에서는 메디토프-이용가능한 항체와의 시너지(synergy)를 성취하기 위하여 사용된다. 일부 양태로, 다가 메디토프는 별개의 에피토프를 인식하는 제2 항체를 사용하는 것과 비교하여 잇점을 제공한다. 예를 들어, 다가 메디토프를 생산하는 것이 제2 항체와 비교하여 더욱 효율적이며, 비용-효과적이다. 예를 들어, 수많은 임상전/임상시험이 2개의 단일클론 항체의 동시-투여에 투자되고 있지만, 그러한 치료제를 생산하고 마케팅하는 비용은 아마도 엄두를 못낼 정도로 높을 것이다. 일부 양태로, 다가 메디토프는 또한 종양과 같은 질병 부위에 비교적 더욱 용이하게 표적화된다. 메디토프 결합 부위 (메디토프 결합 부위내에, 항체 CDRs와는 별개인)의 특성, 및 선택할 수 있는 메디토프-잉용하는 임의의 항체에 대해 본 명세서에 제공되는 광법위하게 적용가능한 방법이 제시되지만, 다가 메디토프는 또한 치료학적으로 허용될 수 있는 특성을 갖는 제2 항체 또는 에피토프를 확인할 필요없이, 넓은 범위의 치료적 항체에 용이하게 적용할 수 있는 잇점을 갖는다. 따럿, 일부 양태로, 다가 메디토프를 사용하게 되면 허용될 수 있는 특성을 갖는 제2 mAb를 확인할 필요가 없으며, 이와 관련된 엄청남 개발 비용을 피할 수 있다.
특이성 및 친화도는 흔히 다가(multivalency)를 통하여 성취된다. 링커가 있는 2가 리간드의 경우, 이는 ΔG전체 = ΔG1 + ΔG2 -ΔG링커로 표현될 수 있다. 다시 말해서, K전체 = K1*K2/K링커. 링커가 자유 에너지에 기여하지 않을 경우 (K링커 ~ 1), 겉보기 친화도의 2가 표적에 대한 2가 링커는 모노머 결합 상수를 갖는 제품이다. 따라서, 친화도가 상당하게 증가되는 것은 일반적으로 다가를 통하여 성취될 수 있다 (예를 들면, KD = 1 μM인 메디토프의 경우, '치료학적' 2가 메디토프의 친화도는 1 pM이다). 그러한 큰 상승은 일반적으로 거의 보이지 않지만 (주로 2가/3가/다가 수용체의 기하학으로 인하여), 시너지는 관찰된다. 세포 표면-발현된 항원의 기하학은 다가 메디토프의 링커상에서 엄격한 규제를 받을 수 있지만, 특이성이 보장될 수 있으며, 이는 예를 들어, 표적 이탈 효과의 위험을 최소화시킴으로써 표적화된 운반을 위해서와 같이 일부 문장에서 중요한 목표일 수 있다.
일례로, 다가 메디토프가 항체의 Fc 영역 또는 이의 일부, 예로서 실질적으로 모든 Fc 영역을 함유한다. 리간드를 '이량화'하기 위하여 Fc 영역을 사용하는 것은 확립되어 있으며, 예를 들어 하기 문헌에 설명되어 있다: Jazayeri JA & Carroll GJ., "Fc-based cytokines: prospects for engineering superior therapeutics," BioDrugs, 22(1):11-26 (2008) . 일부 예로, 2가 메디토프를 발생시키기 위하여 메디토프를 링커, 전형적으로 펩타이드 링커, 예를 들어, 가요성 펩타이드 링커를 통하여 Fc 영역 (예를 드련, IgG의 Fc 영역의 N-말단)에 융합시킨다. 하나의 예로, 링커의 길이는 IgG의 Fabs 간의 거리에 대략적으로 매치되도록 선택되는데, 예로서 길이가 17개 아미노산이다. 일부 양태로, 링커가 글리신, 세린, 및/또는 이들의 조합을 함유한다. 일례의 "메디토프-Fc" 융합체가 도 15 (각각, 서열 번호: 3 및 4)에 나타나 있다. 도 16을 또한 참조한다.
일부 실시양태로, 링커 및/또는 Fc와 메디토프 사이의 거리의 조합은 예를 들어 친화도 및 특이성을 최적화시키기 위하여 조직적으로 변경된다. 하나의 실시양태로, 각각의 천연 또는 비천연 잔기가 최적화를 위하여 링커내의 임의의 위치에서 치환될 수 있다. 일부 양태로, 링커의 길이가 약 2 내지 100개의 잔기 또는 그 사이, 예를 들면, 길이가 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 또는 200 개 잔기(아미노산) 또는 그 이상이다. 일례로, 그러한 링커는 현재 및 미래의 DNA 합성기를 사용하여 발생시키며, 메디토프와 Fc 영역 사이에 삽입된다. 링커는 또한 회전반경을 제한하고 Fc-메디토프의 친화도와 특이성을 증진시키기 위하여 '경질화'될 수 있다. 예를 들어, 코일형 코일 도메인이 메디토프와 Fc 사이에 위치할 수 있다 (도 18). 다른 예로, 비활성 단백질 도메인 (예를 들면, 면역글로불린 폴드)이 링커로 대체된다. 다중 면역글로불린 폴드는 메디토프와 Fc 도메인 사이에 위치할 수 있다. 특정의 실시양태로, 링커의 조성이 인간 기원의 것이어서 잠재적 항원성을 완화시킨다.
일부 예로, 제공되는 메디토프가 다가 메디토프를 생성시키기 위하여, 예를 들면 증진된 선택도 및 결합 친화도를 위하여 스캐폴드에 테더링된다. 일부 실시양태로, 다가 메디토프 스캐폴드를 사용하여 종양 회합 항원에 결합된 메디토프-이용가능한 mAbs를 스캐폴드하거나 "데이지-체인"시켜 리간드 길항작용을 증진시키고, 수용체 내포작용을 변경시키고/시키거나 ADCC/CDC를 통하여 면역 반응을 향상시킨다 (도 8 참조). 따라서, 일부 실시양태로, 2개 이상의 항체 또는 이들의 작용성 단편을 테더링시키기 위하여 메디토프를 사용한다. 그러한 메디토프는 예를 들어, 암 또는 종양 치료 및 영상화를 증진시키기 위하여, 다가 테더링제(tethering agent)의 일부일 수 있다. 다가 테더일제는 다가 테더링체를 생성하기 위해, 예로서 긴 깅커와 같은 링커(들) 및 비오틴 통하여 스트렙트아비딘에 커플링되어 있는 메디토프를 2개 이상 포함한다.
하나의 실시양태로, 다가 메디토프 테더링체가 4가 메디토프 테더링제이다. 하나의 양태로, 4합체 테더링체는 1가 펩타이드와 비교하여 항체에 대한 결합이 증진된 표면 플라즈몬 공명으로 나타나는데, 이는 다가 상호작용과 일치한다. 일례로, 그러한 다가 메디토프 (예를 들면, 4가 메디토프)를 사용함으로써 항체 단독 또는 1가 메디토프를 단독으로 사용하는 경우와 비교하여, 항원에 대한 메디토프-이용가능항 항체의 결합친화도 (세툭시맙의 경우, EGFR 포지티브 세포에 대한 결합 친화도)가 증진된다. 그러한 결합 친화도는 잘 알려져 있는 방법, 예를 들면, FACS 분석법을 사용하여 결정될 수 있다. 도 12를 참조한다.
일부 실시양태로, 링커상에서의 수용체 제한에 맞추어, 변형되거나 변형되지 않은, 예를 들면, 변이체, 예를 들어, 실시예 6에 기재된 바와 같이 수득된 것들과 같은 최적화된 메디토프를 링커를 최적화시키는 것과 같이, 다가 스캐폴드에 커플링시킨다. 일부 양태로, 다가 메디토프가 인접한 항체, 예를 들면, IgGs에 "래치-온(latch-on)"되어, "데이지-체인"-유사 배열(도 8 참조)을 형성할 수 있으며, 이는 예를 들면, 높은 항원 밀도를 갖는 종양 세포가 제시되었을 때, 종양 항원을 표적화하는 항체에 사용될 수 있다. 2가 메디토프와 항체의 분자내 회합이 가능한 반면, 항체, 예를 들어, IgG의 C2 대칭이 그러한 상호작용을 위하여 링커상에 심각한 기하학적 제한을 줄 수 있다. 따라서, 일부 양태로, 메디토프가 3가 또는 그 이상의 원자가를 갖는 스캐폴드를 기본으로 하여, 1개 이상의 항체가 "데이지-체인"을 이룰 수 있도록 한다. 제3의 메디토프 암(arm)을 포함시킴으로써, 3가 메디토프가 항원-결합된 항체에 처음 접하게되는 수명이 연장될 수 있다. 이는 또한, 추가의 암이 이웃하고 있는 항원-결합된 항체에 결합하게될 가능성을 증가시켜, 결과적으로 전체적인 복합체를 안정화시킬 수 있다. 다른 실시양태로, memab와 다른 표적, 예로서 T 세포 수용체 및 공동자극(costimulatory) 분자와 같은 다른 B 및 T-세포 표면 단백질에 동시에 결합하도록 다가 메디토프를 작제할 수 있다. 일부 실시양태로, 상이한 메디토프에 대한 특이성을 갖는 다중 메디토프-이용가능한 항체들 (예를 들면, 1종 이상의 변형된 메디토프-이용가능한 항체들을 포함)을 그러한 다가 실시양태에 그러한 상이한 메디토프와 함께 사용한다.
다양한 링커와 스캐폴드가 당해 분야에 알려져 있으며 이들 실시양태와 관련하여 사용될 수 있다. 일례의 스캐폴드 합성 도식이 도 13에 나타나 있으며 본 명세서의 실시예에서 논의된다. 일부 양태로, 도 13에 나타낸 주형 4와 5를 사용하여 각각 2가 및 3가 메디토프를 형성시킨다. 일부 실시양태로, 예를 들어, 결합 또는다른 특성을 개선하거나 변경시키기 위하여 길이가 다른 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및/또는 다른 링커를 사용한다. 일부 양태로, PEG 길이는 약 10A 내지 약 1000A 사이이다. 상기 합성 방식은 또한 방사성핵종(radionuclide) 영상화를 위하여 DOTA를 내포시킬 수 있다. 예를 들어, 30Å PEG 2작용성 암을 FITC-표지화된 2가 메디토프, 즉 화합물 13의 합성에 포함시킨다 (도 13). IgG내의 CDR 영역간 거리는 대략 130Å이다. PEG 링커의 길이는 상기 방식이 최적이 되도록 조직적으로 변화될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 PEGs의 말단 대 말단(end-to-end) 거리는 90Å까지 (Pierce) 확장되는데, 이는 IgG 거리를 초과하는 것이다.
다른 실시양태로, 예를 들어, 친화도가 높은 다가 메디토프를 발생시키고/시키거나 시너지를 생성시키기 위하여 다른 스캐폴드 및/또는 링커가 사용된다. 예를 들어, DNA가 더욱 경질인 스캐폴드를 생성시키기 위하여 메디토프에 대한 스캐폴드로 사용될 수 있다. 예를 들어, 다가(multivalency)를 성취하기 위하여 생물학적 및 화학적 기원이 다른 스캐폴드가 또한 사용될 수 있다. 이는 비제학적으로, 스트렙트아비딘 또는 (유럽 출원 공보 EP 2065402 A1 참조), 독특한 스캐폴드인, 4가 스캐폴드로서 스트렙트아비딘 (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022283611000283), Origami DNA (see Gu et al., Nature Nanotechnology 4, 245 - 248 (2009) ) 등을 포함한, 분자들을 사용하여 2가 또는 3가 스캐폴드를 작제하는 것을 포함한다. 비제한적으로, DNA (단일사, 이중체, 홀리데이 정션(Holliday junctions), 압타머 등), RNA (단일사, 헤어핀, 스템 루프, 압타머 등), PNA (펩타이드 핵산), 경질성을 위한 DNA/PNA 이중체 및 삼중체, 유기 및/또는 무기 나노입자 (직접 커플링되거나 PEG와 같은 유기 폴리머를 통하여 커플링된다), 자체적으로 및/또는 DNA 또는 PNA와 이중체를 형성할 수 있는 유기 폴리머을 포함한, 분자를 사용하여 화학적 스캐폴드도 생성시킬 수 있다.
다가 메디토프의 특성화
메디토프-이용가능한 항체에 대한 다가 메디토프의 결합 특성은 SPR 및 ITC를 포함한, 수많은 공지의 방법 중 하나에 의해, 예를 들어, 다가 스캐폴리로의 접합이 메디토프-Ig 상호작용에 영향을 주지 않도록, 특성화될 수 있다. 어떤 경우에는, 그러한 측정이 일반적으로 세포 표면상에 존재하는 항원 (예로서, 종양 세포의 표면상에 존재하는 항원)을 포함하지 않음을 고려할 때, 이들 방식은 이들의 다가 및 시너지 효과 측정 능력으로 제한될 수 있다. 따라서, 일부 양태로, 메디토프-이용가능한 항체에 의해 인식되는 항원을 발현시키는 세포 (예를 들면, 세툭시맙과 관련하여 EGFR을 과발현시키는 세포)상에서 다가 메디토프의 효과를 직접 정량하기 위하여 FACS 분석법 및/또는 세포 생존성 검정을 사용한다. 일례의 프로토콜이 실시예 7에서 설명된다. 일반적으로, 메디토프-이용가능한 항체에 의해 인식되는 항원을 발현시키는 (예를 들어, 과발현시키는) 세포주를 항체가 세포상에서 발현된 항원에 결합하는 조건하에서 메디토프-이용가능한 항체와 함께 배양시킨다. 일부 경우에는, 항체의 농도를 변화시켜 사용한다. 동시에 또는 후속해서, 세포를 다가 메디토프와 함께, 일부 경우에는 농도를 변화시켜 배양시킨다. 적절한 배양시간과 세척을 수행한다. 제2 항체와 1가 메디토프를 각각 포지티브 및 네가티브 대조군으로 사용할 수 있다. 상기 항체들과 메디토프는 유세포분석기 또는 현미경검사로 검출가능한 약제로 표지될 수 있으며, 이들 기술은 잘 알려져 있다. 일부 예로, 1가 메디토프와 비교하여, 다가 메디토프의 존재하에서의 이동(FACS의 경우) 도는 증가된 신호는 시너지성 또는 부가적인 효과를 나타낸다. 다른 예로, 다가 메디토프의 부가적인 효과를 추가로 확인하기 위하여, 항원-결합된 메디토프-이용가능한 항체에 대해 표지화된 다가 메디토프와 경질할 수 있는지 측정하기 위한 경쟁 검정에 비-표지화된 1가 메디토프를 사용한다.
다른 예로, 세포 생존성 검정법을 사용하여 다가 메디토프의, 메디토프-이용가능한 항체의 세포-사멸 효과를 증진시키는 능력을 측정한다. 예를 들어, 관심있는 항원을 발현시키는 세포를 농도를 변화시키면서 메디토프-이용가능한 항체 및/또는 다가 메디토프와 함게 배양시킬 수 있다. 1가 메디토프와 제2 항체는 또한 대조군으로 유용하다. 일부 예로, MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드)를 사용하여 생존가능한 세포의 수 또는 퍼센트를 정량한다. 세포 생존성, 증식 및/또는 사멸을 측정하기 위한 다른 방식이 당해 분야에 알려져 있으며 사용될 수 있다.
다른 예로, 그러한 검정법에서 활성을 증명하는 다가 메디토프에 대해, 웨스턴 블롯 분석법 또는 다른 생화학적 또는 신호화 방식을 수행하여 세포 표면 수용체와 같은, 특정의 항원과 관련있는 신호화의 억제를 조사한다 (예를 들어, 세툭시맙의 경우, EGFR, EGFR 신호화 경로의 일부인 AKT, MAP의 포스포릴화 상태에 따른다). 그러한 연구로부터의 데이타를 메디토프-이용가능한 항체로만 처리한 세포 (즉, 메디토프 없이), 1가 메디토프로 처리한 세포, 및/또는 티로신 키나제 또는 기타 공지의 억제제 (AG1478 등)로 처리한 세포로부터의 데이타와 비교할 수 있다. 일부 예에서, 다가 메디토프 농도의 함수로서 세포 사멸에 있어서의 증가가 관찰되며, 이는 다가 메디토프의 시너지성 세포 사멸 효과를 증명하는 것이다.
III. 융합 단백질
메디토프를 1개 이상 함유하는 융합 단백질이 또한 제공된다. cQFD 메디토프 (메디토프 1)에 결합된 메디토프-이용가능한 Fab 단편에 대한 회절에 의해 본 발명에서 증명된 바와 같이, 상기 항체-결합된 메디토프의 N- 및 C-말단은 IgMs, IgDs, IgGs, IgEs, 및 IgAs를 포함한, 인간 항체에 결합하는 세균성 단백질인, 결합된 단백질 L의 위치에 나란히 놓여 있는 것으로 밝혀졌다. 일부 실시양태로, 메디토프-단백질 L 융합 단백질(MPLs)가 제공된다. 일부 양태로, 상기 단백질 L-메디토프 융합체는 예를 들면 에너지 가성성(additivity)을 통하여, 메디토프 단독 및/또는 단백질 단독에 필적하는, 더 큰 친화도로 메디토프-이용가능한 항체에 결합하는 것으로 나타났다. 상기 MPLs는 또한 단백질 L 단독 및 단백질 L의 기타 다가 접합체, 단백질 A, 및/또는 유사한 항체-결합 단백질과 비교하여 유리할 수 있는데, 여기서 이들은 메디토프-이용가능한 항체에 대한 특이성을 제공하며 치료적으로 투여시 내재성 면역글로불린 분자를 표적화하지 않는다.
세균 펩토스트렙토코커스 마그누스(Peptostreptococcus magnus)로부터 원래부터 분리된 단백질 L은 사람의 카파 경쇄와 다른 항체에 결합한다. 메디토프-단백질 L(MPL) 융합 단백질의 예로는 제공되는 메디토프가 야생형 단백질 L일 수 있는, 단백질 L에 커플링되어 있는 것들, 예로서 당해 분야에 알려져 있는 수 종의 변이체, 또는 예를 들어 항원성이 감소되도록 변형시킨 것과 같이, 1개 이상의 특성을 개선하기 위하여 변형시킨 변이체가 있다. 항원성 또는 면역원성을 감소시기키 위하여, 또는 "면역 내성"을 개선하기 위하여 변형시키는 것과 같이, 유사한 단백질을 변형시키는 방법은 당해 분야에 알려져 있으며 예를 들어, 하기 문헌에 설명되어 있다: Ahlgren et al., J Nucl Med, 2010; 51:1131-1138; Feldwisch J et al., J Mol Biol, 2010 Apr 30;398(2):232-47. Epub 2010 Mar 10. 예를 들어, 반복적인 공정으로, 랜덤하게 또는 구조적 모델링을 기본으로 하여 아미노산 치환시킨 다음, 목적하는 특성, 예를 들면, 항원성을 분석할 수 있다. 다른 예로, 돌연변이를 도입시켜 특이성을 개선한다. 다른 실시양태로, 메디토프를 다른 항체-결합 단백질, 예를 들면, 단백질 A 또는 단백질 G와 같은, 다른 항체-결합 물질과 융합시킨다.
MPLs는 일반적으로, 메디토프 부분을 단백질 L 부분에 연결하는, 링커를 포함한다. 상기 링커는 전형적으로 적어도 2개, 더욱 전형적으로는 적어도 3개, 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기 (예를 들면, 4개의 글리신)를 포함한다. 일부 양태로, 그러한 잔기는 메디토프의 C-말단과 단백질 L의 N-말단을 연결한다. 일례로, 메디토프-단백질 L 융합 단백질은 서열 번호: 58에 기재된 서열 (S C Q F D L S T R R L K C G G G G S E V T I K V N L I F A D G K I Q T A E F K G T F E E A T A E A Y R Y A A L L A K V N G E Y T A D L E D G G N H M N I K F A G)을 갖는다.
일부 실시양태로, MPLs를 메디토프를 치료제 또는 진단제와 같은 약제, 예로서 세포독소, 방사성핵종, DOTA, 예를 들어, 질병을 표적화하고/하거나 질병 부위를 영상화하기 위한 단백질 또는 기타 생물학적 분자에 접합시키는 것을 포함하는 것들을 포함한, 본 명세서에 기재된 방법 및 용도에서 메디토프-이용가능한 항체와 함께 사용한다. 일부 양태로, 그러한 접합이 용이하도록, 단백질 L 융합체중 리신 1개 이상이 예를 들면, 아르기닌 또는 아스파라긴으로 돌연변이되어, 예를 들면, 접합에 이용될 수 있는 N-말단 아민과 엡실론 아민을 남김으로써, 다른 분자에 특이적으로 접합될 수 있는 단백질 L 융합 단백질을 발생시키는데, 후자는 용매 노출되어 더욱 반응성이 된다. 일례의 융합 단백질이 서열 번호: 59에 기재된 서열 (S C Q F D L S T R R L R C G G G G S E V T I R V N L I F A D G N I Q T A E F R G T F E E A T A E A Y R Y A A L L A R V N G E Y T A D L E D G G N H M N I K F A G)을 가지는데, 여기서는 모든 리신 중 1개가 제거되었다.
일례의 메디토프-단백질 L 융합 단백질의 암호화 서열이 서열 번호: 56에 기재되어 있다. 일례의 메디토프-단백질 L 융합 단백질의 서열은 서열 번호: 57 (His6-Smt3-메디토프-단백질 L) 및 서열 번호: 58 (진하게 표시된, 시스테인 2개를 함유하며, 이는 일부 양태에서, 예를 들어, 과산화물에 의해 또는 공기중에서 일야 방치시킴으로써 MPL을 고리화시키는데 사용된다)에 기재되어 있다:
S C QFDLSTRRLK C GGGGSEVTIKVNLIFADGKIQTAEFKGTFEEATAEAYRYAALLAKVNGEYTADLEDGGNHMNIKFAG (서열 번호: 58).
일부 실시양태로, 메디토프-단백질 L(MPL) 작제물이 메디토프 단독인 것과 비교하여 메디토프-이용가능한 항체에 대해 개선된 결합 친화도를 나타낸다. 예를 들어, 이런 개선은 친화도에 있어서, 예를 들면, 해리 상수에서, 상응하는 메디토프 단독 및/또는 단백질 L 단독인 경우와 비교하여 메디토프-이용하능한 항체의 경우, 적어도 또는 약 10,000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 또는 10-배의 개선일 수 있다. 일례로, 단백질 L과 메디토프 만과의 상호반응 및 메디토프-이용가능한 항체에 대한 결합 상수는 각각 0.5 μM 및 1 μM인 반면, 항체로의 MPL에 대한 결합 상수는 대략 165 pM이다.
IV. 메디토프-약제 접합체
특정의 실시양태로, 메디토프 1종 이상, 메디토프 변이체, 다가 메디토프, 메디토프-단백질 L 융합체(MPLs), 다가 테더링제 또는 다가 메디토프 변이체 테더링제를 포함한, 메디토프들을 1종 이상의 치료제 또는 진단제, 예를 들면, 영상화제, 치료적으로 효과적인 약제 또는 치료적으로 유효한 양의 화합물 또는 둘다에 접합시킨다. 메디토프와 약제 1종 이상을 함유하는 그러한 복합체가 제공된다.
일부 양태로, 체료제 또는 진단제 (예를 들면, 영상화제) 또는 화합물에 접합된 메디토프-이용가능한 항체 1개 이상에 메디토프 또는 이들의 변이체가 결합하는 것을 이용하여 질병 또는 질환을 치료, 예방, 진단 또는 모니터할 수 있다. 하나의 양태로, 그러한 메디토프, 예로서 다가 메디토프가 약제에 접합한 것을 메디토프-이용가능한 단일클론 항체와 함께 사용할 때, 고도로 다재다능한 플랫폼 기술(platform technology)을 제공하는데 이는 질병을 치료하고 검출하기 위한 치료제 및 영상화법을 기본으로하는 mAb를 크게 개선시킨다 (도 8 참조).
진단제 및 치료제로는 관련 분야에 잘 알려져 있는, 임의의 그러한 약제가 있다. 영상화제 중에는 비제한적으로, 통상적으로 "염료", "표지물", 또는 "표시자"로 칭하는 다양한 유기 또는 무기 소분자를 포함한, 형광 및 발광 물질이 있다. 예로는 플루오레세인, 로다민, 아크리딘 염료, Alexa 염료, 및 시아닌 염료가 있다. 본 개시내용의 실시양태에 따라 영상화제로서 사용될 수 있는 효소로는 비제한적으로, 겨자무 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 산 포스파타제, 글루코오스 옥시다제, β-갈락토시다제, β-글루코로니다제 또는 β-락타마제가 있다. 이러한 효소는 검출가능한 신호를 생성하는 발색체, 형광성 화합물 또는 발광성 화합물과 함께 사용될 수 있다.
본 개시내용의 실시양태에 따라 영상화제로서 사용될 수 있는 방사성 물질로는 비제한적으로, 18F, 32P, 33P, 45Ti, 47Sc, 52Fe, 59Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 77As, 86Y, 90Y. 89Sr, 89Zr, 94Tc, 94Tc, 99mTc, 99Mo, 105Pd, 105Rh, 111Ag, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 142Pr, 143Pr, 149Pm, 153Sm, 154-1581Gd, 161Tb, 166Dy, 166Ho, 169Er, 175Lu, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 194Ir, 198Au, 199Au, 211At, 211Pb, 212Bi, 212Pb, 213Bi, 223Ra 및 225Ac가 있다. 본 개시내용의 실시양태에 따라 추가의 영상화제로 사용될 수 있는 상자성 이온으로는 비제한적으로, 전이 금속 및 란탄족 금속 (예를 들면 원자가가 21-29, 42, 43, 44, 또는 57-71인 금속)의 이온이 있다. 이들 금속으로는 Cr, V, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb 및 Lu의 이온이 있다.
영상화제가 방사성 금속 또는 상자성 이온일 때, 상기 약제는 이러한 이온을 결합시키기 위한 긴 꼬리(tail)에 부착된 킬레이트화 기가 1개 이상 있는 긴 꼬리를 갖는 다른 긴 꼬리 시약과 반응할 수 있다. 긴 고리는 폴리리신, 폴리사카라이드, 또는 금속 또는 이온에 결합시키기 위해 첨가될 수 있는 펜던트 기를 갖는 다른 유도된 또는 유도차화 쇄와 같은 폴리머일 수 있다. 본 개시내용에 따라서 사용될 수 있는 킬레이트화 기의 예로는 비제한적으로, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), DOTA, NOTA, NETA, TETA, 포르피린, 폴리아민, 크라운 에테르, 비스-티오세미카르바존, 폴리옥심 및 유사한 기가 있다. 킬레이트는 면역반응성의 최소 소실 및 최소 응집으로 분자에 대한 결합 형성 및/또는 내부 가교결합이 가능하게 하는 기에 의해 PSMA 항체 또는 작용성 항체 단편에 통상적으로 연결된다. 망간, 철 및 가돌리늄과 같은 비-방산성 금속과 복합체화될 때, 동일한 킬레이트는 본 명세서에 기재된 항체 및 담체와 함께 사용될 때, MRI에 유용하다. NOTA, DOTA, 및 TETA와 같은 거대환형 킬레이트는 각각, 비제한적으로, 갈륨, 이트륨 및 구리의 방산성핵종을 포함한, 여러가지 금속과 방사성금속과 함께 사용된다.RAIT에 대한 223Ra와 같은 안정하게 결합하는 핵종에 있어서 중요한, 거대환형 폴리에테르와 같은 다른 환-타입 킬레이트가 사용될 수 있다. 특정의 실시양택로, 킬레이트화 잔기를 사용하여 Al-18F 착화물과 같은 PET 영상화제를 PET 분석에 사용하기 위하여 표적화 분자에 부착시킬 수 있다.
치료제의 예로는, 비제한적으로, 약물, 화학요법제, 치료적 항체 및 항체 단편, 독소, 방사성동위원소, 효소 (예를 들먼, 종양의 부위에서 세포독성제로 프로드럭을 분해시키기 위한 효소), 뉴클레아제, 호르몬, 면역조절제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, RNAi 분자 (예를 들면, siRNA 또는 shRNA), 킬레이터, 붕소 화합물, 광활성제 및 염료가 있다. 치료제는 또한표적된 세포가 js강한 세포와 비교하여 반사선 치료에 더욱 민감하게 되도록 방사선증감제로서 작용하는 킬레이터에 결합된 금속, 금속 합금, 금속간 화합물 또는 코어-쉘 나노입자를 포함할 수 있다. 추가로, 치료제는 MRI 조영제를 위한 상자성 나노입자 (예를 들면, 자철석 또는 Fe3O4)를 포함할 수 있으며, 다른 타입의 치료 (예를 들면, 광역학 및 고열발생 치료 및 영상화 (예를 들면, 형광 영상화(Au 및 CdSe))와 함께 사용될 수 있다.
화학요법제는 흔히 성질상 세포독성 또는 세포증식억제성(cytostatic)이고, 알킬화제, 대사길항제(antimetabolites), 항-종양 항생제, 토포이소머라제(topoisomerase) 억제제, 핵분열 억제제 호르몬 용법, 표적화된 치료제 및 면역치료제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태로 본 개시내용의 실시양태에 따라 치료제로서 사용될 수 있는 화학요법제로는 비제한적으로, 13-시스-레티노산, 2-클로로데옥시아데노신, 5-아자시티딘, 5-플루오로우라실, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 악티노마이신-D, 아드리아마이신, 알데스류킨, 알렘투주맙, 알리트레티노인, 올-트랜스레티노산, 알파 인터페론, 알트레타민, 아메톱테린, 아미포스틴, 아나그렐리드, 아나스트로졸, 아라비노실시토신, 삼산화비소, 암사크린, 아미노캄프토테신, 아미노글루테티미드, 아스파라기나제, 아자시티딘, 바실루스 칼메트-게렝(BCG), 벤다무스틴, 베바시주맙, 벡사로텐, 비칼루타미드, 보르테조밉, 블레오마이신, 부술판, 칼슘 류코보린, 시트로보룸 인자, 카페시타빈, 카네르티닙, 카르보플라틴, 카르무스틴, 세툭시맙, 글로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 코르티손, 시클로포스파미드, 시타라빈, 다르베포에틴 알파, 다사티닙, 다우노마이신, 데시타빈, 데닐류킨 디프티톡스, 덱사메타손, 덱사손, 덱스라족산, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데카르바진, 도세탁셀, 독소루비신, 독시플루리딘, 에닐우라실, 에피루비신, 에포에틴 알파, 에를로티닙, 에베롤리무스, 엑세메스탄, 에스트라무스틴, 에토포사이드, 필그라스팀, 플루옥시메스테론, 풀베스트란트, 플라보피리돌, 플록수리딘, 플루다라빈, 플루오로우라실, 플루타미드, 게피티닙, 겜시타빈, 겜투주맙 오조가미신, 고세렐린, 과립구-콜로니 자극 인자, 과립구 대식세포-콜로니 자극 인사, 헥사메틸멜라민, 히드로코르티손 히드록시우레아, 이브리투모맙, 인터페론 알파, 인터류킨-2, 인터류킨-11, 이소트레티노인, 익사베필론, 이다루비신, 이마티닙 메실레이트, 이포스파미드, 이리노테칸, 라파티닙, 레날리도마이드, 레트로졸, 류코보린, 류프롤라이드, 리포좀 Ara-C, 로무스틴, 메클로레타민, 메게스트롤, 멜팔란, 머캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 메틸프레드니솔론, 미토마이신 C, 미토탄, 미톡산트론, 넬라라빈, 닐루타미드, 옥트레오타이드, 오프렐베킨, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파미드로네이트, 페메트렉세드, 파니투무맙, PEG 인터페론, 페가스파르가제, 페그필그라스팀, PEG-L-아스파라기나제, 펜토스타틴, 플리카마이신, 프레드니솔론, 프레드니손, 프로카르바진, 랄록시펜, 리툭시맙, 로미플로스팀, 랄리트렉세드, 사파시타빈, 사르그라모스팀, 사트라플라틴, 소라페닙, 수니티닙, 세무ㅡ틴 스트렙토조신, 타목시펜, 테가푸르, 테가푸르-우라실, 템시롤리무스, 테모졸라미드, 테니포사이드, 탈리도마이드, 티오구아닌, 티오테파, 토포테칸, 토레미펜, 토시투모맙, 트라스투주맙, 트레티노인, 트리미트렉세이트, 알루비신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데스틴, 비노렐빈, 보리노스타트, 또는 졸레드론산이 있다.
본 개시내용의 실시양태에 따라서 치료제로서 사용될 수 있는 치료적 항체 및 이들의 작용성 단편으로는 비제한적으로, 알렘투주맙, 베바시주맙, 세툭시맙, 에드레콜로맙, 겜투주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 파니투무맙, 리툭시맙, 토시투모맙, 및 트라스투주맙과 본 명세서에 게시된 특정 질병과 관련한 기타 항체가 있다.
본 개시내용의 실시양태에 따라서 치료제로서 사용될 수 있는 독소로는 비제한적으로, 리신, 아브린, 리보뉴클레아제(RNase), DNase I, 스태필로코커스 장내독소-A, 미국자리공 항바이러스 단백질, 젤로닌, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소, 및 슈도모나스 내독소가 있다.
본 개시내용의 실시양태에 따라서 치료제로서 사용될 수 있는 방사성 동위원소로는 비제한적으로, 32P, 89Sr, 90Y. 99mTc, 99Mo, 131I, 153Sm, 177Lu, 186Re, 213Bi, 223Ra 및 225Ac가 있다.
E. 사용 방법 및 조성물
치료적 및 진단적 용도, 뿐만 아니라 항체 정제를 포함한 다른 용도를 포함하여, 메디토프, 메디토프-이용가능한 항체, 및 이를 함유하는 복합체의 방법 및 용도가 또한 제공된다. 또한, 그러한 진단 및 치료 방법에서 사용하기 위한 메디토프 (변이체 및 다가 메디토프와 메디토프 융합 단백질을 포함)를 함유하는 약학 조성물이 제공된다.
I. 치료적 및 진단적 용도와 약학 조성물
하나의 실시양태로, 메디토프, 메디토프 변이체, 다가 메디토프, MPLs, 다가 메디토프 테더링제 및 다가 메디토프 변이체 테더링제 등의 특이성 및 결합성을 사용하여 전형적으로 1종 이상의 메디토프-이용가능한 단일클론 항체와 함께 (동시에 또는 따로) 투여시, 질병 또는 질환의 치료, 진단 (예를 들면, 영상화)을 위하여 치료제, 진단제 (예를 들면, 영상화제), 또는 이들의 조합을 운반한다.
일례로, 이후 추가로 설명되는 바와 같이, 메디토프, 메디토프 변이체, 다가 메디토프 테더링제 또는 다가 메디토프 변이체 테더링제 투여전에 메디토프-이용가능한 단일클론 항체를 투여함으로써, 미리-표적화한 치료 또는 미리-표적화한 영상화를 위하여 메디토프, 예를 들면, 다가 메디토프를 사용한다. 또한, 다가 메디토프를 사용하면 조작된 scFvs 또는 화학적으로 접합된 mAbsdp 대해 증명된 바와 같이 선택도를 증진시키고 종양 검출을 개선할 수 있지만, 이들 비-인간 작제물에 있어서 고유한 잠재적 면역원성을 피한다.
따라서, 본 명세서에 기재된 플랫폼 기술은 mAb 운반 분야에 지대한 영향을 주며 항체의 용도가 표시되는 것들과 같은 암을 포함한, 다양한 질병 및 질환의 치료 및 진단에 유용한 방법을 제공한다. 예를 들어, 결장 및 편평 세포 암종, 두경부암을 포함한 EGFR 포지티브 암에 에 대해 지시된 메디토프-이용가능한 항체는 세툭시맙과 메디토프의 사용으로부터 이득을 얻게 된다. 추가로, 그러한 항체의 메디토프-이용가능 형태를 발생시키기 위하여 다른 치료적 항체를 변형시킴으로써 상기 플랫폼 기술이 수 종의 다른 암, 질병 및 기타 질환의 치료 및 진단용 방법에 사용될 수 있도록 한다.
그러한 방법에 메디토프를 사용하는 것은, 예를 들어, 항체에 대한 결합 또는 접합을 위한 다른 수단과 비교하여, 예를 들어, 특이성 면에서 유리하다. 예를 들어, PpL (단백질 L) 및 SpA (단백질 A)는 뮤린-특이적이거나 키메라 항체-특이지이지 않다. PpL은 대략 66%의 뮤린 및 대략 50%의 인간 IgG 카파 경쇄에 결합하며 SpA는 12%의 뮤랜 및 50%의 인간 가변 중쇄에 결합한다 (Graille et al., 2002). 대조적으로, 본 명세서에서 증명되는 바와 같이, 메디토프와 메디토프-이용가능한 항체의 상호반응은 매우 특이적이어서, 예를 들어, 치료적 화합물이 피험체에 대해 내인성인 면역글로불린에 결합하는 것을 피하는 것과 같이, 표적 이탈 효과를 포함한 부작용을 피할 수 있다.
일부 실시양태로, 메디토프 이용가능한 항체와 함께 투여되는 메디토르, 항체-메디토프 복합체, 메디토프 이용가능한 항체와 함께 투여되는 다가 테더링제, 또는 이들의 조합은 영상화제 1종 이상과 접합될 수 있다. 하나의 양태로, 영상화제는, 비제한적으로, 형광, 발광, 자성 단백질, 또는 방사성핵종 단백질, 펩타이드 또는 이들의 유도체 (예를 들면, 유전자 조작된 변이체)를 포함할 수 있다. mRNA 성분에 의해 발현될 수 있는 형광 단백질로는 그린 형광 단백질 (GFP), 증진된 GFP (EGFP), 적색, 청색, 황색, 시안, 및 사파이어 형광 단백질, 및 초산호 형광 단백질이 있다. mRNA 성분에 의해 발현될 수 있는 발광 단백질로는 루시퍼라제, 에쿼린 및 이들의 유도체가 있다. 수많은 형광 및 발광 염료와 단백질이 당해 분야에 알려져 있다 (예를 들면, 미국 특허 출원 공보 제2004/0067503호; Valeur, B., "Molecular Fluorescence: Principles and Applications," John Wiley and Sons, 2002; Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Molecular Probes, 9.sup.th edition, 2002; and The Handbook--A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Invitrogen, 10th edition 참조, Invitrogen 웹 사이트에서 입수가능; 이들 둘 다 본원에 완전히 기재된 것처럼 본원에 참조문헌으로 포함됨).
다른 양태로, 메디토프 이용가능한 항체와 함께 투여된 메디토프, 항체-메디토프 복합체, 메디토프 이용가능한 항체와 함께 투여된 다가 테더링제, 또는 이들의 조합은 추가로 접합될 수 있거나 그렇지 않으며 비-단백질 영상화제 또는 전달 비히클, 예를 들면 나노입자, 방사성 물질 (예를 들어, 방사성 동위원소, 방사성핵종, 방사능표지물 또는 방사성트레이서), 염료, 조영제, 형광 화합물 또는 분자, 생물발광 화합물 또는 분자, 효소 및 성능 향상제 (예를 들어, 상자성 이온)와 회합될 수 있다. 또한, 일부 나노입자, 예를 들면 양자점 및 금속 나노입자(하기 기재됨)가 또한 (예를 들면, 고열발생 및 광역한 요법 뿐만 아니라 형광 및 MRI 조영을 통한 영상화제를 사용하여) 영상화제 또는 치료제로서 사용하기에 적합할 수 있음에 유의해야 한다.
메디토프-mAb 기술은 시스템이 항체-메디토프 복합체를 발생시키는데 사용될 수 있도록 하며, 이들 복합체는 1종 이상의 메디토프-이용가능한 항체, 치료제, 영상화제 또는 이들의 조합에 추가로 접합될 수 있다. 따라서, 독특한 세포독성제 또는 영상화제에 각각 접합된 일련의 메디토프 또는 고친화도 메디토프 변이체는 치료를 위하여 원하는 메디토프 접합체와 메디토프-이용가능한 mAb의 병용-투여를 허용하게 될 것이다. 메디토프 접합체는 화학적 변형 또는 페이로드(payload) 방출로 인하여 특이성이 감소되는 것과 같은 단점을 갖는 현재의 항체-약물 접합체에 대한 개선품이다. 치료적 항체 또는 이의 작용성 단편의 결합 친화도를 향상시키기 위한 방법이 본원에서 제공된다. 그러한 방법은 피험체에게 치료적으로 유효한 양의 약학 조성물을 임의의 적합한 투여 경로를 통하여 투여하는 것을 포함할 수 있다. 약학 조성물은 메디토프 이용가능한 항체와 조합된 메디토프 또는 메디토프 변이체, 메디토프-이용가능한 치료적 항체 또는 이의 작용성 단편, 약학적으로 허용되는 담체, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 다가 메디토프의 결합 친화도 증대는 세포 표면에 결합된 IgG의 다가 가교결합에 기인한 것일 수 있다. IgGs를 가교결합하는 것 (부모 뮤린 M425 항체를 통하거나 항-IgG IgM을 사용하여)은 신호전달, 수용체 내포작용(endocytosis) 및 재생, 및 세포 사멸에 상당히 영향을 준다. 따라서, 다가 펩타이드는 이의 치료적 효능을 증대시키기 위해 치료적 단일클론 항체와 시너지적으로 작용할 수 있다.
일부 실시양태로, 메디토프는 단독으로, 또는 테더링체의 일부로서, 시스테인 또는 결합 부위에서 Fab 시스테임에 결합하여, 시스테인-시스테인 상호작용을 생성하는 다른 적합한 알킬화제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 메디토프는 비천연 아미노산 (예를 들면, p-아세틸페닐알라닌)에서 Fab에 결합할 수 있다. Cys 메디토프는 임의의 물질에 접합되고 접합체가 IgG를 향하게 한다.
또한, 항체-메디토프 복합체를 치료적 항체에 의해 표적화될 수 있는 질병 또는 질환에서의 특정 타입의 세포 또는 세포 집단에 치료를 지시하는 방법에 사용될 수 있다. 이러한 치료 방법은 임의의 적합한 투여 경로를 통해 질병 또는 질환을 앓고 있는 피험체에 치료적 유효량의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 약학 조성물은 메디토프 이용가능한 항체와 함께 메디토프 또는 메디토프 변이체, 메디토프 이용가능한 항체와 함께 다가 메디토프 또는 메디토프 변이체 테더링체, 메디토프 이용가능한 치료적 항체 또는 이의 작용성 단편을 포함할 수 있다.
다른 실시양태로, 종양 또는 다른 조직을 영상화하는 방법이 제공된다. 이러한 방법에서, 상응하는 항원을 과발현시키는 종양 또는 다른 조직을 표적화하기 위하여 비변형 치료적 항체가 투여될 수 있다. 이후, 영상화제로 표지화된 다가 메디토프 테더링체는 임의의 적합한 투여 경로를 통해 투여되고, 표적 종양 또는 조직에 결합하는 치료적 항체에 결합하게 된다. 도 8을 참조한다. 영상화제의 예로 방사성표지물 (예를 들면, 3H, 14C, 35S, 90Y, 99mTc, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 및 153Sm), 금속 또는 자기성 표지물 (예를 들면, 금, 철, 가돌리늄), 비오틴, 킬레이트화제 (예를 들면, 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N'"-테트라아세트산 ("DOTA")) 또는 상기 기재된 임의의 약제가 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
상기 기재된 영상화 또는 치료 방법에는 공지의 방법에 비해 여러가지 장점이 있다. 첫째로, 치료적 단일클론 항체의 2가 특성은 종양에 대한 선택도를 증대시킨다. 하기에서 추가로 논의되는 바와 같이, 이렇게 증대된 선택도는 scFv를 사용함로써 소실되며 증대된 친화도에 의해 전부 보상되지는 않는다. 둘째로, 표지화된 다가 메디토프 테더링체의 질량은 여과에 대한 신역치(renal threshold) 보다 낮을 수 있어 (60 kDa 미만, 대략 10 kDa 만큼 낮을 수 있다), 체내로부터 용이하게 여과되도록 한다. 반대로, 영상화제 또는 다른 치료제로 치료적 항체를 직접 표지시키는 것은 연장된 기간 동안(수일 내지 수주) 체내에서 순환하게 되기 때문에 통상적으로 피한다. 따라서, 종양 또는 다른 질병에 걸린 조직의 영상화는 흔히 선택성이 낮은 scFvs를 사용하여 수행된다.
추가적인 실시양태로, 메디토프가 암, 자가면역 질환 또는 기타 질환의 치료를 위하여 피험체에게 치료적으로 유효한 양으로, 약학 조성물의 일부로 투여될 수 있는 약학 화합물을 형성하기 위한 치료적 분자 2개 이상을 연결하는데 사용될 수 있다. 2종 이상의 치료적 분자로는 비제한적으로, 상기 기재된 바와 같은 종양 또는 질병-특이적 수용체를 표적화할 수 있는 작용성 항체 단편 (예를 들면, F(ab)2 또는 Fab 단편), 펩타이드 또는 다른 소분자를 포함할 수 있다. 상기 치료적 분자는 동일한 치료적 분자 2개 이상일 수 있거나 대안적으로, 동일한 종양 또는 질병에 걸린 조직을 표적화하는 상이한 분자 2개 이상일 수 있다.
일부 실시양태로, 약학 화합물 또는 조성물은 CovX-BodyTM와 같은, 독점적 항체, 또는 이의 부분을 포함할 수 있다. 일례로, 메디토프가 특수하게 디자인된 CovX 항체에 치료적 분자 2개 이상을 연결시키기 위한 링커로 사용된다. 일례로, 그러한 메디토프와 회합된 소분자, 펩타이드 또는 scFv는 CovX 항체의 메디토프-결합 부위 (예를 들면, 프레임워크 결합 계면)에 의해 인식된다. 이들 성분이 조합될 때, 생성되는 2가 CovX-BodyTM는 소분자, 펩타이드 또는 scFv의 생물학적 작용을 보유하면서 동시에 항체의 반감기를 유지하게 된다.
일부 실시양태로, 제공되는 메디토프, 메디토프-이용가능한 항체, 및 이들의 복합체가 암, 치료적 항체를 사용하여 치료하거나 표적화할 수 있는 질병 또는 질환을 포함한, 질병 또는 질환의 치료, 진단 또는 영상화에 사용된다. 암은 면역 시스템을 적극적으로 억제함으로써 면역감시를 피하게 된다. 이런 면역억제에 대응하기 위하여 구상중인 방법 중 하나가 종양 세포에 의해 독특하게 발현되거나 과발현되는 항원의 에피토프를 사용하여 백신화시키는 것이다. 예를 들어, 신호전달 경로를 차단하여, 성장 인자를 격리시키고/시기너가 면역 반응을 유발하는 단일클론 항체(mAbs)가 암 및 기타 질병의 치료하기 위한 임상에서 성공적으로 시행되었다.
따라서, 그러한 질병 및 질환으로 비제한적으로, 백혈병 및 림프종 (이는 예를 들면, 알렘투주맙, 벡투모맙, 겜투주맙, FBTA05, 이브리투모맙 티우제탄, 오파투무맙, 리툭시맙, 토시투모맙의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다), 유방암 (이는 예를 들면, 트라스투주맙, 아데카투무맙, 에르투막소맙의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다), 전립선암 (이는 예를 들면, 아데카투무맙, 카프로맙 펜데타이드, 에타라시주맙의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다), 결장암 (이는 예를 들면, 라베투주맙, 파니투무맙, 알투무맙 펜테테이트, 보투무맙의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다), 위장관암 (이는 예를 들면, 아르시투무맙, 카투막소맙의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다), 난소암 (이는 예를 들면, 아바고보맙, 카투막소맙, 에타라시투맙, 이고보맙, 오레고보맙의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다), 폐암 (이는 예를 들면, 아나투무맙 마페나톡스의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다), 췌장암 (이는 예를 들면, 클리바투주맙 테트락세탄의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다), 신장암 (이는 예를 들면, 기렌툭시맙의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다), 흑색종 암 (이는 예를 들면, 에타라시주맙, 이필리무맙, TRBS07의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다), 신경교종 (이는 예를 들면, 니모투주맙의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다), 골 전이 (이는 예를 들면, 데노수맙의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다), 두경부암 (이는 예를 들면, 잘루투무맙의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다), 심혈관 질환 (이는 예를 들면, 아브식시맙의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다), 자가면역 질환 (이는 예를 들면, 아달리무맙, 인플릭시맙의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다), 류마티스성 관절염 (이는 예를 들면, 아틀리주맙, 골리무맙, 인플릭시맙의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다), 이식 거부 (이는 예를 들면, 바실릭시맙, 다클리주맙, 무로모납-CD3의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다), 크론씨병 (이는 예를 들면, 세르톨리주맙, 폰톨리주맙, 나탈리주맙, 인플릭시맙, 비실리주맙의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다), 헤모글로빈뇨증 (이는 예를 들면, 에쿨리주맙의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다), 건선 (이는 예를 들면, 에팔리주맙, 인플릭시맙, 우스테키누맙의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다), 다발성 경화증 (이는 예를 들면, 나탈리주맙, 우스테키누맙의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다), 천식 (이는 예를 들면, 벤랄리주맙, 메폴리주맙, 오말리주맙의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다), 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) (이는 예를 들면, 팔리비주맙의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다), 황반 변성 (이는 예를 들면, 라니비주맙의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다), 충수염 (이는 예를 들면, 파놀레소맙의 메디토프-이용가능한 버젼을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있다) 및항체로 표적화되거나 치료될 수 있는 임의의 기타 질환을 포함하여, 치료적 mAbs를 사용하여 표적화되는 것들과 같은, 임의의 암 뿐만 아니라 기타 질병 및 질환이 있다. 상기 게시된 항체 및 관련 질병 또는 질환은 단지 예일뿐, 플랫폼을 제한하지 않는다.
특정의 실시양태로, 1종 이상의 메디토프, 메디토프 변이체, 다가 메디토프 테더링제 또는 다가 메디토프 변이체 테더링제가 1종 이상의 영상화제, 치료적 유효량의 치료적으로 효과적인 물질 또는 화합물 또는 둘 다에 접합될 수 있어, 치료적으로 효과적인 화합물과 1종 이상의 메디토프 이용가능한 항체에 대한 메디토프 또는 이의 변이체의 결합은 질병 또는 질환을 치료하거나, 예방하거나, 진단하거나 모니터할 수 있다. 메디토프-이용가능한 mAbs에 커플링되는 친화도가 높고/높거나 다가 메디토프의 접합은 질병을 치료하고 검출하기 위한 치료 및 영상화 방법을 기본으로 하여 mAb를 상당히 개선하는 매우 다양한 플랫폼 기술을 제공한다 (도 8 참조).
III. 기타 용도 및 조성물
scFv (단일쇄 Fab 가변) 단편를 안정화시키는 방법 및 조성물이 또한 제공된다. 일반적으로, scFv 단편 (예를 들면, 주어진 Fab의 scFv 포맷)은 전장 mAbs 및 Fab 자체와 같은 다른 단편보다 실질적으로 더 낮은 친화도로 항원에 결합한다. 그러한 감소된 친화도는 적어도 부분적으로, Fv 도메인의 배양, 형태적 변동에 직접 영향을 주는 Fab 불변 도메인의 부재, 및 가능하게는 불량한 링커 디자인에 기인한다. 한편, scFv와 다른 더 작은 단편은 예를 들어, 종양 침투와 같은 더욱 양호한 조직을 포함한 다른 장점을 가질 수 있다.
일부 실시양태로, scFv 단편의 안정성과 친화도를 개선하는 방법이 제공된다. 하나의 양태로, 그러한 방법은 예를 들어, scFV와 메디토프 사이에 링커를 도입시켜 scFv를 안정화시킴으로써, scFv 단편에 메디토프를 내포시켜 상응하는 Fab 또는 전체 항체의 메디토프 결합 부위내 잔기에 상응하는 VH 및 VL 영역중의 잔기와의 상호반응이 용이하도록 함으로써 수행된다. 1개 이상의 메디토프에 결합된 scFv를 함유하는 복합체, 및 이를 함유하는 조성물, 및 제공되는 방법에 있어서 이들의 용도가 또한 제공된다. 일부 양태로, 그러한 방법은 가변 도메인이 적절하게 배향하도록 하여 친화도를 증진시키는데 도움이 된다 (도 9).
메디토프-이용가능한 항체 및 이의 단편, 및/또는 그러한 항체를 발현시키는 세포를 정제하는 방법을 포함하여, 메디토프를 사용하여 분리 및 정제하는 방법, 및 여기에서 사용하기 위한 조성물 및 키트가 쪼한 제공된다. 하나의 실시양태로, 그러한 방법은 메디토프 (예를 들면, 상기 제공되는 메디토프 중 임의의 것)를 비드, 예를 들면, 자성 비드, 플레이트, 컬럼, 또는 기타 고체 지지체와 같은, 고체 지지체에 커플링시킴으로써 수행된다. 도 10 참조. 다른 예로, 서열 CQFDLSTRRLRCGGGSK를 갖는 메디토프가 고체 지지체에 커플링시키는 아민을 통하여 성공적으로 연결되었으며, 예를 들면, 비아코어(biacore)/표면 플라즈몬 공명 연구에 유용하다. 도 29 참조. 특정의 실시양태로 그러한 비아코어 연구는 아민 커플링된 긴 메디토프 칩상에 항체를 유동시켜 수행하였다.
단백질을 고체 지지체에 커플링시키는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있으며 이 실시양태와 관련하여 사용될 수 있다. 이어서, 메디토프-이용가능한 항체 또는 이를 발현시키는 세포를 상기 고체 지지체에 노출시킴으로써 이들이 분리되고 정제된다.
그러한 정제 방법은 다른 입수가능한 방법과 비교하여 몇가지 장점이 있다. 예를 들면, 제공되는 메디토프가 용이하게 합성되어 통상의 고체 지지체 (자성 미드 포함)에 즉시 첨가될 수 있다. 둘째로, 메디토프의 친화도가 점 돌연변이에 의해 쉽게 조절되는데, 점 돌연변이는 정제 공정의 미세-조절을 가능케 하여 단백질 A 또는 단백질 L로부터 항체를 용출시키는데 통상적으로 사용되는 낮은 pH와 같은 가혹한 상황을 피할 수 있다. 일부 실시양태로, 이들 단백질 A 또는 단백질 L 수지는 통상적으로 전장 (예를 들면, 야생형) 서열을 함유하며 이 서열에는 도메인이 5개까지 존재한다. 이들 도메인 중 1개 이상은 본 발명에서 사용되는 단백질 L 및 단백질 A와 동일하다. 일부 예로, 온전한 메디토프-이용가능한 항체와 같은 메디토프-이용가능한 항체를 추출하는데 사용하기 위하여 메디토프를 2가 또는 다가 (하기 실시예 7에 설명되는 바와 같은 것)로 만든다.
일부 양태로, 상기 제공되는 정제 및 분리 방법은 단백질 A 또는 단백질 L의 생산과 관련한 높은 비용에서의 감소, 이들 단백질의 제한된 수명주기와 비교되는 개선, 및 단백질 L 또는 A의 사용과 관련한, 세균성 병원체와 같은 외인성 생물학적 물질의 도입 위험의 회피를 포함하여, 단백질 A 또는 단백질 L을 사용하는 다른 정제 방법보다 추가적인 잇점을 갖는다.
F. 메디토프 및 메디토프-이용가능한 항체의 변형 및 선별
I. 메디토프-이용가능한 항체의 변형
메디토프에 대한 결합 친화도 또는 특이성, 및/또는 다른 특성과 같은, 항체의 특성 1개 이상을 변경시키기 위하여 메디토프-이용가능한 항체를 변형시키는 방법이 또한 제공된다. 또한, 상기 방법에 의해 생산된 변형된 항체 및 이를 생산하기 위한 라이브러리가 제공된다. 하나의 양태로, 메디토프-이용가능한 항체의 메디토프-결합 부위를 이루고 있고/있거나 달리 그러한 항체의 메디토프로의 결합에 있어서 중요한 잔기를 조직적으로 또는 랜덤하게 변경시켜 (예를 들면, 퇴행성 라이브러리 및 선택법을 사용하여), 예를 들면, 메디토프 또는 메디토프 유사체의 특이성을 증대시키고/시키거나 변화시킨다 (예를 들어, 하기 문헌을 참조: Sheedy et al. 2007 and Akamatsu et al. 2007, 이는 본 명세서에서 변경시키는 방법에 대한 참고로 포함된다). 일부 양태로, 상기 잔기가 천연 또는 비천연 아미노산, 또는 둘 다로 치환되어, 메디토프 상호반응의 친화도를 개선하고/하거나 메디토프-항체 상호반응의 다른 특성을 변경시킨다. 이중-특이적 항체를 발생시키기 위하여 항체에 비-천연 아미노산을 도입시키는 것은 Hutchins 등(2011)에 의해 설명되었다.
메디토프와 접촉하게되고/되거나 달리, 구멍을 메우고 있는 메디토프-이용가능한 항체의 잔기들, 예를 들여, 수소결합, 이온, 정전기 또는 입체적 상호작용을 통하여 메디토프 친화도를 개선하기 위하여 조직적으로 또는 랜덤하게 변화시킬 수 있는, 결합된 메디토프의 임의의 원자의 8Å 내의 잔기들로는, 비제한적으로, 1개 이상의 경쇄 잔기 (예를 들면, Kabat 넘버링을 기준으로 하고 세툭시맙, 메디토프-이용가능한 트라스투주맙, 또는 메디토프-이용가능한 M5A에 대해, 경쇄의 P8　, V9 or I9, I10 or L10, S14, E17, Q38, R39, T40, N41 G42, S43, P44, R45, D82, I83, A84, D85, Y86, Y87, G99, A100, G101, T102, K103, L104, E105,　 K107, R142, S162, V163, T164, E165, Q166, D167, S168, 또는 Y173, 또는 다른 메디토프-이용가능한 항체중 유사한 잔기들), 및/또는 1개 이상의 중쇄 잔기들 (예를 들면, Kabat 넘버링을 기준으로 하고 세툭시맙, 메디토프-이용가능한 트라스투주맙, 또는 메디토프-이용가능한 M5A에 대해, 중쇄의 Q6, P9, R38, Q39, S40, P41, G42, K43, G44, L45, S84, D86, T87, A88, I89, Y90, Y91, W103, G104, Q105, G106, T107, L108, V109, T110, V111, Y147, E150, P151, V152, T173, F174, P175, A176, V177, Y185, S186, 또는 L187, 또는 다른 메디토프-이용가능한 항체중 유사한 잔기들), 또는 이들의 조합이 있다.
예를 들어, 일부 양태로, 경쇄의 P8　, V9 또는 I9, I10 또는 L10, Q38, R39, T40, N41 G42, S43, P44, R45, D82, I83, A84, D85, Y86, Y87, G99, A100, G101, T102, K103, L104, E105, R142, S162, V163, T164, E165, Q166, D167, S168, 및 Y173 중 1개 이상, 및/또는 중쇄의 Q6, P9, R38, Q39, S40, P41, G42, K43, G44, L45, S84, D86, T87, A88, I89, Y90, Y91, W103, G104, Q105, G106, T107, L108, V109, T110, V111, Y147, E150, P151, V152, T173, F174, P175, A176, V177, Y185, S186, 및 L187 중 1개 이상 (세툭시맙에 대해, 또는 다른 메디토프-이용가능한 항체중의 유사한 잔기들)이 돌연변이된다.
메디토프 결합 부위내의 또는 근처의 다른 잔기들을 돌연변이시켜 메디토프 기가 이를 수화시켜 높은 친화도로 결합하도록 할 수 있다. 예를 들면, 경쇄 잔기인 Tyr87, 중쇄 잔기인 Tyr91, 또는 둘 다를 사용하여 메디토프 유사체로부터 기원하는 알데히드 또는 붕소 함유 화합물을 갖는 수화물을 형성시킬 수 있다. 일부 양태로, 본 명세서의 실시예에 나타낸 바와 같이, 메디토프는 항원 결합에 영향을 주지 않으며 약물을 운반, 항체의 데이지 체인/가교결합, 치료적 항체의 효율 및/또는 효능의 증가시키기 위해서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 다른 용도 중, 표적화된 진단, 예를 들면, 영상화, 방법에서 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태로, 제공되는 메디토프-이용가능한 항체의 메디토프 결합 부위가 예를 들면, 메디토프에 더 높은 친화도로 결합할 수 있고/있거나 1종 이상의 변이체 메디토프, 메디토프 유사체, 및/또는 소분자, 예로서, DOTA 또는 DOTA 유도체 (방사성 운반 및/또는 미리-표적화된 영상화를 위하여)와 결합할 수 있도록 변경된다.
일부 실시양태로, 메디토프 결합 부위의 잔기의 변경은 조직적 변경에 의한다. 일부 양태로, 모든 부위를 돌연변이시키는 것은 >206개, 잠재적으로는 >2016개의 돌연변이 조합을 수반하게 된다. 따라서, 일부 양태로, 목적하는 돌연변이가 항체중의 돌연변이가 DNA 수준으로 발생되어 있는, 라이브러리를 사용하여 효율적으로 확인된다. 하나의 양태로, 상기 라이브러리가 각각 개별적 천연 아미노산을 돌연변이용으로 표적된 위치 1개 이상에서 집합적으로 발현시키는 각 멤버를 함유한다. 일례로, 당해 부위 (본 명세서에 기재된 임의의 부위 중 1개 이상, 예를 들면, 중쇄의 Ile89, Thr87, Leu108 및 Thr110 및 경쇄의 Lys103 및 Glu165)에서 퇴행성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여, 이들 부위에서 20종의 천연 아미노산을 모두 집합적으로 암호화하는 멤버로 이루어진 라이브러리를 생산하여 cDNA 라이브러리를 생성시킨다.
일부 양태로, 다른, 예를 들면, GPI 도메인을 상기 라이브러리의 항체 멤버에, 예로서 항체 (예를 들면, IgG) 중쇄의 C-말단에 커플링시켜 발현된 항체의 선택이 편이하도록 한다. 상기 라이브러리는 표준 방법 및 상기 발현된 라이브러리의 멤버를 사용하여 형질감염시킬 수 있다.
이후, 목적하는 특성을 1개 이상 갖는 라이브러리의 돌연변이 항체를 선택할 수 있다. 일부 양태로, 상기 라이브러리의 멤버를 이들의 항원에 대한 결합 능력, 예를 들면, 항원 결합에 영향을 주지않는 돌연변이에 대한 선택 능력에 대해 선택한다. 일례로, 형광 표지화된 항원 (예를 들면, HER2, EGFR, IGFR, CLTA-4 등)에 결합하는 라이브러리의 항체를 발현시키는 세포는 예를 들면, FACS (도 20)로 선택한다. 일부 양태 (항원-결합 선택 후 또는 대신)로, 상기 라이브러리의 항체를 발현시키는 세포를 특이적 메디토프, 메디토프 유사체, 또는 관심있는 다른 분자 (예를 들면, DOTA)에 대한 결합과 같은 다른 특징에 대해 선택한다. 다른 예로, 2개 이상의 특징에 대해 동시에 선택한다.
라이브러리의 선택된 멤버, 예를 들어, 항체를 발현시키는 세포를 예를 들면, 특정의 특성을 성취하는데 있어서 목적하는 돌연변이 또는 돌연변이들의 조합을 결정하기 위하여 평가하고 특성을 규명한다. 하나의 양태로, 분류된 세포를 PCR로 특성을 규명하여 생성된 돌연변이가 메디토프/유사체/소분자 결합을 도모하거나 증대시키는지 확인한다.
일부 양태로, 결합 또는 다른 목적하는 특징(들)을 "발달/최적화"하기 위하여, 상기 방법을 반복적 방식으로, 예를 들면, 돌연변이, 선택, 및 특성화 과정을 예를 들면 복수회 반복하여 수행한다.
II. 메디토프 유사체 및 단편
메디토프 유사체, 및 그러한 유사체를 확인, 생산 및 선별하는 방법이 또한 제공된다. 따라서, 일부 실시양태로, 다른 분자가 또한 메디토프-이용가능한 항체의 메디토프 결합 부위에, 메디토프의 작용성 특징과 유사한 특징으로 결합한다. 그러한 분자를 메디토프 유사체로 부르며, 비제한적으로, 소분자, 압타머(aptamers), 핵산 분자, 펩티바디 및 메디토프와 동일한 계면에 결합할 수 있는 임의의 기타 물질이 있다. 일례로, 유사체가 DOTA 유도체이다.
하나의 실시양태로, 메디토프를 모방하는 소분자 유사체를 포함한, 유사체를 확인하기 위한 선별법이 제공된다. 그러한 방법으로 형광 편광 검정법, 회절 기본 및 NMR 기본 단편 선별법, 및 테더링 동적 조합법이 있다.
다른 실시양태로, 단편-기본 약물 발견 방식을 사용하여 메디토프, 메디토프 결합 부위, 및/또는 메디토프 결합 부위 부근의 메디토프-이용가능한 항체에 결합하는, 화학 기와 같은, 단편, 소분자를 확인한다. 예를 들면, 다음 문헌: Erlanson, Top Curr Chem (2012) 317:1-32을 참고한다. 일부 예로, 확인된 단편을 메디토프에 커플링시켜, 예를 들면, 이들의 친화도 또는 메디토프 결합 부위와의 상호작용의 다른 특성을 증대시킨다. 다른 예로, 이들을 확장시키고/시키거나 함계 연결하여 메디토프 또는 메디토프-이용가능한 항체에 커플링시키기 위한, 또는 메디토프 유사체로 사용하기 위한 화합물을 발생시킨다. 단편 및/또는 메디토프 유사체 발견을 위한 방법으로는, 비제한적으로, 다음과 같은 것들이 있다. 일부 예로, 단편이 약 또는 100 Da와 약 또는 1000 Da 사이에 있다.
형광 편광 검정법
일부 양태로, 이 방법으로 형광 편광 검정법 및/또는 기타 경쟁-기본 검정법이 있다. 일례로, 메디토프 부위에 결합할 수 있으며 유사한 작용을 위하여 사용할 수 있는 대체 분자를 확인하기 위하여, 형광 마커 (예를 들면, Alexafluor, 로다민, 플루오레세인)를 예를 들면, 적합한 방법 (예를 들면, 아민, 술프히드릴, 카르복실레이트, 당류 또는 기타 공지의 방법)을 사용하여 메디토프에 접합시킨 다음, 메디토프-이용가능한 항체와 상호반응하도록 한다. 일반적으로, 표지시킨 메디토프와 메디토프-이용가능한 항체간의 상호반응은 형광 태그(tag)의 형광 편광/강도에 있어서 변화를 일으킨다. 일단 확립되면, 시험 화합물 (잠재적인 유사체), 예로서 소분자 화합물(MW < 1000 Da)을 가하고 예를 들면, 형광 태그된 메디토프-항체 복합체로 평형시킨 다음, 형광 편관을 모니터한다. 메디토프-항체 상호반응을 차단하는 시험 화합물은 형광 편광 특성을 변경시킬 것이다. 따라서, 다른 실시양태는 최적화될 수 있으며 표적 운반용으로 사용될 수 있는 화합물을 확인하는 방법이다. 유사체 또는 잠재적 유사체를 선별하여 예를 들면, 결정학 또는 메디토프의 특성화를 위해 본 명세서에 기술된 다른 방법으로 추가로 특성화한다.
회절법
선두 화합물을 확인하기 위한 회절 기본법이 잘 정립되어 있다 (Shuker et al. 1996; Erlanson et al. 2001; Hughes et al. 2011). 세툭시맙 및 다른 메디토프-이용가능한 Fabs는 2.5Å 이상에서 회절하기 때문에, 이 방식은 메디토프에 커플링되거나 유사체로 사용될 수 있는 선두 화합물 또는 소분자 단편을 확인하기 위한 특정의 실시양태에 사용된다. 예를 들어, 그러한 화합물은 함께 연결된 다음 합성 메디토프 유사체를 형성하는 단편을 포함한다. 일례로, 세툭시맙 또는 다른 메디토프-이용가능한 항체의 결정에 흡수시키기(soaking) 위한 화합물 라이브러리를 개발한다. 이들 흡수체(soaks)로부터의 회절 데이타를 수집하여 데이타 세트를 분석한다. 그러한 방법은 단편 성장 및 최적화에 이용할 수 있는 메디토프-이용가능한 항체상의 추가적인 부위를 확인할 수 있다.
상기 단편은 성장시켜 (화학적으로 유도체화하여) 이들의 결합 및 특이성을 증진시킬 수 있다. 상기 단편은 또한 메디토프에 화학적으로 테더링될 수 있다. 상기 화학적 커플링의 최적화는 메디토프 결합 부위에 대한 메디토프의 전체적인 결합 친화도를 상당히 증진시킬 수 있다. 추가로, 회절법으로 발견된 유사체는 최적화되어 약물 운반, 다가 스캐폴딩 및 기타 작용에 있어서 메디토프 대신 사용될 수 있다. 또한, 리간드(메디토프)의 특이성을 변화시키기 위하여 경쇄 및 중쇄에서의 돌연변이를 일으킬 수 있으며 이들 회절법 (형광 편광, NMR 선별법, 및 파아지 표시 방법을 포함)을 사용하여 대안적 리간드를 최적화시킬 수 있다.
NMR 선별법
본 명세서에 설명된 바와 같이 최적화되고 사용될 수 있는 유사체 및 단편 (예를 들면, 펩타이드 단편, 비-펩타이드 기본 소분자)을 확인하기 위하여 NMR이 또한 사용될 수 있다. 일례로, 그러한 선두 화합물을 확인하기 위하여, 예를 들여 15 내지 20개의 단편을 함유하는 풀(pools)의 1차원(1D) 스펙트럼을 수집한다. 하나의 실시양태로, 사용되는 단편이 비-펩타이드 기본 소분자이다. 다음, 메디토프-이용가능한 항체를 각각의 풀에 가하고 2차 1D 스펙트럼을 수집한다. 메디토프-이용가능한 항체에 (일시적으로) 결합하는 화합물은 신속한 자기화 전이를 수행하여, 강도를 소실하게 된다. 따라서, 일부 양태로, 메디토프-이용가능한 항체 결합 전 및 후의 스펙트럼을 비교하고 변경된 피크를 확인하여 상호반응을 표시한다. 이들 피크는 특이적 화합물로 미리-할당될 수 있으며 따라서 즉시 알려질 수 있거나 풀을 나누어 스펙트럼을 다시 수집할 수 있다. 수회전 후, 화합물의 정확한 정체성이 알려진다. 이들 실험에서, 상호반응의 정확한 위치는 알려지지 않는다. 결합 부위는 NMR 또는 형광 편광 검정법에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로, Fab 단편을 NMR 활성 및 불활성 핵 (예를 들면, 13C, 15N 및 2H)으로 표시시킬 수 있으며, NMR 실험을 여러번 수행하여 스펙트럼을 할당한 다음, 결합 위치를 확인하기 위하여 단편 라이브러리와 함께 사용할 수 있다.
가상의 리간드 선별법
가상의 리간드 선별법은 선두 메디토프 유사체, 단편, 및 기타 화합물을 확인하기 위하여 사용할 수 있는 다른 방법이다. 결정 구조를 사용하여, 표준 프로그램 (예를 들면, Schroerdinger Glide)은 거대분자 부위 근처 (메디토프 결합 부위)에 '박스(box)'와 이 부위에 대해 알려진 도크(dock)를 구획할 수 있다. 잠재적 선두 화합물은 선택 에너지 함수로 점수를 매기며 상위 50 내지 200위의 화합물들은 구입한 것일 수 있다. 본 발명자들의 초기 연구에서는, 대략 100종의 선두 화합물들이 메디토프 부위에 결합하는 것으로 증명되었다.
하나의 실시양태로, 본 발명에서 메디토프 또는 메디토프 유사체의 선별 방법이 제공된다. 그러한 방법은, 비제한적으로, 추정되는 메디토프 또는 소분자의 라이브러리를 메디토프-이용가능한 항체와 접촉시키는 단계; 소분자의 추정되는 메디토프가 메디토프-이용가능한 항체와 프레임워크 결합 계면에서 결합하는지 측정하는 단계; 후보 메디토프 또는 메디토프 유사체 1종 이상을 확인하는 단계; 후보물질 1종 이상의 결합 친화도를 측정하는 단계; 및 결합 해리 상수가 0.70 μM 미만일 때 1종 이상의 후보물질을 메디토프 또는 메디토프 유사체로 확인하는 단계를 포함한다. 다른 한편으로, 친화도가 낮은 메디토프, 예를 들면, 최소 해리 상수가 예를 들면, 0.70 μM로 명시되는 것과 같은 메디토프가 바람직하다. 일부 예로, 후보물질이 약 10 μM 이하, 약 5 μM 이하, 또는 약 2 μM 이하, 약 1 μM 이하, 약 500, 400, 300, 200, 100 nm 또는 그 미만의 해리상수를 나타낼 경우 이를 메디토프 또는 이의 유사체로 확인한다. 어떤 경우에는, 본 명세서에 게시된 것들 중 임의의 것들과 같은 해리상수는 SPR, 등온 적정 열량측정법(ITC), 형광, 형광 편광, NMR, IR, 열량측정 적정법; 운동 배제법; 원이색법, 차동 주사 열량측정법, 또는 기타 공지의 방법과 같은, 특정의 기술을 사용하여 측정한 것이다. 예를 들어, 어떤 경우에는, 상기 유사체 또는 메디토프가 SPR로 측정한 바 또는 ITC로 측정한 바 또는 이들 방법 중 임의의 방법으로 측정한 바, 약 10 μM 이하, 약 5 μM 이하, 또는 약 2 μM 이하, 약 1 μM 이하, 약 500, 400, 300, 200, 100 nm 또는 그 미만의 결합상수를 나타낸다.
추가로, 신규한 프레임워크 결합 계면의 선별 방법이 또한 제공되며, 하기 실시예에서 추가로 설명된다.
다른 실시양태로, 메디토프 유사체의 빌딩 및/또는 메디토프 유사체의 기능을 증대시키기 위하여 메디토프에 커플링시키는 것과 같이, 메디토프와 관련하여 유용한 단편을 확인하고 최적화하는 방법에 제공된다. 그러한 유사체 및 단편과 화합물이 또한 제공된다.
본 발명이 실시양태와 실례가 되는 실시예를 참고로 하여 설명되지만, 당업자들은 설명되고 예시되는 바와 같은 발명에 대해 본 명세서에 개시되는 바와 같은 본 발명의 정신과 범주로부터 벗어나지 않는 개량을 알 수 있다. 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 기재되는 것일 뿐 이에 제한하는 것이 아니며, 어떠한 방식으로도 이의 범주를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 실시예는 통상의 방법의 상세한 설명을 포함하지 않는다. 그러한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며 수많은 간행물에 기재되어 있다. 또한, 상기 및 하기 실시예에서 인용되는 모든 참고문헌은 본원에 완전히 기재된 것처럼, 그 전문이 참조문헌으로 포함된다.
실시예 1: 메디토프-항체 FAB 결정 구조의 측정
메디토프는 세툭시맙의 Fab 영역 및 Fab 단편의 중앙 구멍내에서 높은 특이성과 친화도를 갖고 결합하는 것으로 밝혀졌다. 이들 메디토프는 세툭시맙 Fabs와 결정학으로 결정된 구조물에 결합하였다.
재료 및 방법
시약. 세툭시맙의 항원 결합 단편(Fab)을 고정화된 파파인(Pierce)으로 세툭시맙 IgG를 소화시켜 수득하고, 이어서 단백질 A에 의해 역 정제하고 Superdex 75 컬럼 (GE Healthcare) 상에서 크기 배제 크로마토그라피(SEC)하였다. 세툭시맙의 단쇄 가변 단편 (scFvC225)을 경쇄와 중쇄 사이의 20개의 아미노산 링커로 합성하였다. scFvC225 및 가용성 상피 성장 인자 수용체 도메인 III (sEGFRdIII)을 Sf9 세포에서 발현시키고 상기 기재된 바와 같이 정제하였다 (Donaldson, J.M., Kari, C., Fragoso, R.C., Rodeck, U. & Williams, J.C. Design and development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects: Application to anti-EGFR antibodies. Cancer Biol Ther 8 (2009)).
문헌 (Riemer, A.B. et al., Vaccination with cetuximab mimotopes and biological properties of induced anti-epidermal growth factor receptor antibodies, J Natl Cancer Inst 97, 1663-70 (2005))에 기재된 바와 같이 파아지 디스플레이 바이오패닝 실험으로부터 분리된, 메디토프 CQFDLSTRRLKC (cQFD; 서열 번호: 1) 및 CQYNLSSRALKC (cQYN; 서열 번호:2)를 City of Hope Synthetic and Polymer Chemistry Core Facility에서 합성하고, 산화시키고, 정제하였다.
결정화 및 회절 데이타. 세툭시맙 Fabs (5 mg/㎖)을 1:10의 몰비로 cQFD 및 cQYN 메디토프와 혼합하고, 20℃에서 Qiagen JCSG Core Suites (IIV) 를 사용하여 결정 형성에 대해 선별하였다. 2.2Å를 넘어 회절된 공결정을 100 mM 인산/시트르산 나트륨, pH 4.5, 2.5M 인산 나트륨/칼륨 및 1.6% w/v 메조에리트리톨 중에서 성장시켰다. 상기 결정을 14% w/v 메조에리트리톨을 통해 위킹(wicking)시키고 액체 질소중에 급속 냉동시켰다. 결정화 시험 및 초기 선별 연구를 City of Hope의 X-선 시설에서 수행하였다. 회절 데이타를 Stanford Synchrotron Radiation Lab, beam lines 9.1 및 11.1에서 수집하였다. 초기의 상(phases)은 세툭시맙의 리간드화되지 않은 구조(pdb:1YY8 - 쇄 A 및 B)로 프로그램 Phaser (McCoy, A.J. et al. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr 40, 658-674 (2007)) 를 사용하여 분자 대체에 의해 결정하였다 (Li, S. et al. Structural basis for inhibition of the epidermal growth factor receptor by cetuximab. Cancer Cell 7, 301-11 (2005)). 2개의 Fab를 3.26의 매튜(Mattews) 계수 및 62.4%의 용매 함량을 갖는 비대칭 유니트에 배치시켰다. Z 점수 (평균에 대한 용액의 표준 편차)는 회전 조사의 경우 27 및 25이고, 병진 조사(translational search)의 경우 38 및 71이었다. 제3의 Fab 단편은 배치되지 않을 수 있다 (비대칭 유니트 셀에서의 3개의 Fab는 43% 용매에서 2.18의 합당한 매튜 계수를 생성시킨다). cQFD 및 cQYN 메디토프를 Coot(Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60, 2126-32 (2004)) 및 Phenix (Adams, P.D. et al. PHENIX: building new software for automated crystallographic structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 58, 1948-54 (2002))를 사용하여 여러번 반복함으로써 수동으로 밀도를 구축하였다.
결정화 및 구조 측정
상기 기재된 바와 같이, 세툭시맙 Fabs를 생성시키고 정제하여 cQFD 메디토프 (서열 번호: 1의 환형 펩타이드)와 1:10의 비로 혼합하여; 결정 형성에 대해 선별하기 위하여 상업용 시설을 사용하였다. 20℃에서 1일 후 결정이 형성되었다. 이들 결정의 초기 회절 분석은 단위 셀 치수와 공간 군이 Protein Data Bank (1YY8.pdb) 에 이미 배치되어 있는 세툭시맙 Fab에 대한 것들과 유사한 것으로 나타났다 (Li, S. et al. Structural basis for inhibition of the epidermal growth factor receptor by cetuximab. Cancer Cell 7, 301-11 (2005)). 상기 배치되어 있는 구조중의 CDR 루프는 결정 접촉이 신장되도록하는 것으로 관찰되었는데 이는 cQFD 메디토프가 상기 결정에는 존재하지 않음을 제시하는 것일 수 있다. 그럼에도 불구하고, 그 구조는 분자 대체에 의해 해결되었으며 모델링되지 않은, 메디토프와 일치하는 전자 밀도를 확인하기 위하여 실험 맵(maps)이 조사되었다. 초기 Fo-Fc 맵은 잠재적 결합 부위로서의 Fab 단편의 중간에서의 영역을 명확하게 나타낸다 (도 1). Fab 모델만 사용한 초기 정제 실행 후, 메디토프와 일치하는 모델링되지 않은 밀도의 연속적인 신장이 관찰되었다. 메디토프는 밀도로 구축되었고 R 및 RFree가 이에 따라 하강하였다. 물 분자를 Phenix를 사용한 정제 기간 동안 첨가하였다 (Adams, P.D. et al. PHENIX: building new software for automated crystallographic structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 58, 1948-54 (2002)). 회절 데이타 및 정제 통계가 하기 표 5에 기재되어 있다.
[표 5]
메디토프 cQFD, cQYN에 대한, 메디토프-항체 공결정에 대한 회절 데이타 및 정제 통계
Figure pct00013
이들 관찰에 기초하여 그리고 비교의 관점으로서, 메디토르 cQYN (서열 번호: 2)에 결합된 세툭시맙 Fab의 결정이 생성되었다. 서열 번호: 1의 메디토프에 대해서와 같이, 명확한 모델링되지 않은 전자 밀도가 Fab의 중앙에서 관찰되었다. 제1 구조를 사용하여, 서열 차이를 이에 따라 모델링하고, 정제 과정을 여러번 수행하였다. 두 메디토프의 대표적인 전자 밀도 맵이 도 1B에 나타나 있다. cQYN-Fab 복합체에 대한 회절 데이타 및 정제 통계가 또한 상기 표 5에 제시되어 있다.
실시예 2: 세툭시맙 Fab의 메디토프 결합 부위의 특성화
세툭시맙의 메디토프 결합 부위가 하기에서 논의되는 바와 같이 특성화하였다. 상기 메디토프 결합 부위는 독특한 것으로 증명되었며 지금까지 조사된 면역글로불린에 존재하지 않는 것으로 밝혀졌다.
재료 및 방법
상기 실시예 1에 기재된 것들 외에, 다음과 같은 재료와 방법이 사용되었다.
메디토프 및 점 돌연변이. 실시예 1에 기재된 바와 같이, CQFDLSTRRLKC (cQFD; 서열 번호:1) 및 CQYNLSSRALKC (cQYN; 서열 번호:2)를 City of Hope Synthetic and Polymer Chemistry Core Facility에서 합성하고, 산화시키고 정제하였다. cQFD 메디토프 중에서 알라닌 점 돌연변이를 3번 (Phe3 to Ala), 5번 (Leu5 to Ala), 8번 (Arg8 to Ala) 및 10번 (Leu10 to Ala) 잔기에서 발생시키고 SMT3의 C-말단에서 상기 펩타이드를 암호화함으로써 세균식으로 돌연변이체가 생산되었다 (Mossessova, E. & Lima, C.D. Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast. Mol Cell 5, 865-76 (2000)).상기 펩타이드를 DTT가 없는 완충액중에 투석시킴으로써 산화시키고 SEC로 정제하여 모노머를 수득하였다. 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석 전에, 유비퀴틴-유사 프로테아제(Ulp1)을 상기 샘플에 가하여 펩타이드를 qkdcnftlzT다 각각의 생물합성된 돌연변이 펩타이드는 ULP1 절단 부위로 인하여 N-말단에서 추가의 세린 잔기를 함유하였다. Ulp1과 SMT3을 대조군으로 수행하였는데 세툭시맙 Fab와는 상호반응하지 않았다.
메디토프-Fab 계면의 특성화. SPR에 의한 친화도 분석을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다 (Donaldson et al., 2009; Li et al., 2005, supra). 간단히 설명하면, 아민 화학을 사용하여 scFvC225 또는 FabC225 (세툭시맙 Fab)를 CM5 칩에 고정화시켰다. 펩타이드 또는 sEGFRdIII 친화도는 20℃에서 평형 방법으로 평가하여 방정식 RU = {Rmax * [L]}/{[L] * Kd} + Roffset 에 핏팅하였다. Superdex 200 10/300 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하여 SEC를 수행하였다. 단백질을 혼합하고, 실온에서 20분간 배양시켜 4℃에서 상기 컬럼에 인가하였다.
펩타이드 메디토프의 존재하에서 세툭시맙 결합을 시험하기 위하여 EGFR-발현 MDA-MB-468 세포주를 사용하였다. 표지화된 세툭시맙 (AF488, Invitrogen)을 4℃에서 60 μM의 cQFD 펩타이드의 존재 또는 부재하에서 20분 동안 첨가하였다. 표지화된 MOPS-21을 이소타입 대조군으로 사용하였다. FACS Calibur 장치 (BD Biosciences)를 사용하여 세포 형광을 측정하였다.
메디토프/Fab 계면의 분석
메디토프 (서열 번호: 1)와 세툭시맙 Fab 사이의 결합 부위의 계면은 IgG Fab의 4개의 도메인 모두 (예를 들면, 중쇄 및 경쇄 도메인의 가변 영역, 경쇄 불변 영역, 및 중쇄 CH1)에 의해 형성되는 것으로 밝혀졌다. PISA 서버를 사용하여, cQFD 또는 cQYN 메디토프-Fab 계면에서 매립되어 있는 표면 면적은 각각 904 (±28)Å2 및 787 (±42) Å2였으며, 경쇄 및 중쇄 사이에 대략적으로 대등하게 분포되었다. 도 2, 35, 및 36에는 메디토프와 접촉하는 것으로 밝혀진 Fab로부터의 잔기와 루프가 제시되어 있다.
두 메디토프 (서열 번호: 1 및 2) 모두 세툭시맙 Fab와 복수의 수소 결합 및 소수성 접촉을 만드는 것으로 밝혀졌다. 세툭시맙 (뮤린 키메라 IgG)의 아미노산 서열을 파아지 디스플레이 실험에서 이소타입 대조군으로 사용되는 키메라 단일클론 IgG (ch14.18)와 정렬시켰는데, 상기 파아지 디스플레이 실험은 원래 서열 번호: 1 및 2의 메디토프, 및 트라스투주맙 (ErbB2에 결합하는 인간화된 단일클론 항체)을 확인한 것이다 (도 2A 참조). 트라스투주맙 Fab의 구조는 또한 서열 번호: 1의 메디토프에 결합된 세툭시맙 Fab의 구조상에 중첩되었다. 도 2A는 세툭시맙 Fab (뮤린 키메라 IgG)와 ch14.18의 중앙 구멍 메디토프-결합 계면내의 잔기와 트라스투주맙간의 아미노산 차이를 보여준다.
세툭시맙 Fab 상의 인간화된 트라스투주맙 Fab (1NZA8.bdb)의 중첩은 cQFD 메디토프의 Arg9가 뮤린 가변 경쇄에 의해 생성된 독특한 구벙에 결합함을 나타낸다. 구체적으로, Kabat 넘버링을 기준으로 하여, 세툭시맙의 뮤린 가변 경쇄의 Asp85, Ile83 및 Thr40는 cQFD 메디토프의 Arg9 잔기로의 결합에 있어서 중요한 것으로 나타났다 (도 2B). 가변 경쇄의 뮤린 프레임워크 영역중의 Asp85는 cQFD 메디토르의 Arg9의 구아니디늄 기에 염 가교(dNE …OD1 = 2.7 및 2.9 Å & dNH2…OD2 = 3.0 및 3.1 Å)를 만드는 것으로 나타났다. Asp85의 카르복실 기는 또한 cQFD 메디토프의 Leu10의 골격 아미드 질소에 수소 결합(dOD2…HN = 2.7 및 2.8 Å)을 만드는 것으로 나타났다. 경쇄로부터의 Thr40의 히드록실 기도 메디토프 Arg9의 구아니디늄 기에 수소 결합(두 경우 모두 dOG1…NH1 = 3.2 Å)을 만드는 것으로 나타났다. 상기 구조의 중첩은 인간의 가변 경쇄 서열에서 발견되는 Phe83 중의 페닐 환과 Pro40 중의 피롤리딘 환(각각, 세툭시맙중의 Ile와 Thr에 대응한다)이 cQFD 메디토프 중 Arg9의 측쇄를 입체적으로 폐쇄하도록 위치함을 나타낸다.
cQFD 메디토프중 Arg9 측쇄가 뮤린과 인간 Fab 서열간의 차이에 맵핑되지만, cQYN 메디토프는 cQFD 메디토프중의 Arg9와 동일한 위치에서 알라닌을 암호화하며, 따라서 잠재적으로는 인간 Fab에 결합할 수 있다. cQFD 메디토프의 Arg9의 구아니디늄 기 및 경쇄의 Asp85에 대한 수소 결합이 cQYN 메디토프에 대해서는 존재하지 않았지만, 경쇄의 Asp85의 카르복실 기는 cQYN 메디토프의 Leu10의 골격 아미드 질소에 대한 이의 수소 결합을 보유하는 것으로 나타났다. cQFD과 cQYN 메디토프 간의 차이와 이들의 세툭시맙 Fab와의 상호반응이 결정되었다. 세툭시맙 Fab에 결합된 2개의 메디토프 (cQFD와 cQYN)의 구조의 중첩 (구체적으로는 중쇄 Fab와 경쇄 Fab의 Cα 원자의 중첩)은 각 메디토프의 잔기 Phe/Tyr3, Leu5 및 Leu10의 소수성 측쇄가 동일하게 근처에 위치한다는 것을 보여주는 것이며, 이는 이들 잔기와 항체의 상호반응이 결합에 있어서 중요하다는 것을 나타내는 것이다 (도 2B). 페닐 환은 중쇄 가변 영역의 보존된 Gln39 (Kabat 넘버링)에 대해 패킹하는 것으로 나타났으며; Leu5 측쇄는 중쇄 가변 영역의 Ile89 및 Leu108 (Kabat 넘버링), 뿐만 아니라 메디토프의 Phe3/Tyr3으로부터의 페닐 환에 대해 패킹하는 것으로 나타났다. 메디토프의 Leu10은 가변 경쇄상에 위치하는 노출된 포켓에 결합하는 것으로 나타났다.
그러나, cQFD 및 cQYN 펩타이드의 골격 트레이스는 일탈하였다. 구체적으로, cQFD 메디토프의 Arg8 측쇄 구조는 확장되어 Fab 중쇄의 Gln105의 골격 카르보닐에 대해 강력한 골격 수소 결합을 만든다 (dNH1 …O=C = 2.6 및 2.8; dNH2 …O=C = 2.8 및 2.9Å). 그러나, cQYN 펩타이드 중 Tyr3의 히드록실 기는 Arg8 측쇄를 입체적으로 간섭하고 cQYN 메디토프의 Arg8과 중쇄의 Gln105 간의 상호반응을 차단한다. 이러한 관찰과 일치하게, cQYN 복합체중 Arg8 측쇄 둘 다 전자 밀도 맵에서 약하게 한정되고 적어도 2개의 상이한 회전이성질체(rotamers)를 취했다. (비대칭 유니트내에 2개의 Fab-메디토프 복합체가 있다). 이런 변화와 수반하여, 골격 수소 결합 패턴에서의 이동이 관찰되었다. cQFD 메디토프중 Thr7의 아미드 카르보닐은 세툭시맙 Fab 경쇄중 아미드 Asn41에 수소 결합 (dN-H…O=C = 2.7 및 2.8Å )을 만든다. 이 수소 결합은 cQYN 펩타이드중 Asn41의 골격의 아미드에서 Arg8 골격의 카르보닐로 이동한다 (dC=O…C-N = 3.0 및 3.1Å ).
중첩은 인간 경쇄 서열 중의 Pro40 및 Gly41로부터 세툭시맙 경쇄중 Thr 및 Asn으로의 변화가 입체적 제한을 완화시켜 메디토프에 대한 수소 결합을 형성하기 위한 2개의 추가점이 제공됨을 나타낸다. cQFD 메디토프-세툭시맙 Fab 구조에서, Fab Asn41의 아미드 질소는 메디토프의 Thr7의 카르보닐과 상호반응하는 것으로 나타났으며 (dN-H…O=C = 2.7 및 2.8Å), Fab Asn41의 측쇄 아미드는 메디토프의 Ser6의 카르보닐과 상호반응하는 것으로 나타났다 (dND2…O=C = 3.2 및 3.2Å ). cQYN 메디토프-세툭시맙 Fab 구조에서, 골격의 이동으로 수소 결합 패턴이 이동한다. Fab Asn41의 아미드 질소는 cQYN의 Arg8의 카르보닐과 상호반응하지만 (dN-H…O=C = 3.0 및 3.1 ), Fab Asn41과 측쇄의 상호반응은 소실된다.
이러한 결과 외에, 세툭시맙 Fab 구조에 결합된 메디토프에 트라스투주맙 (1N8Z; Cho et al., Nature, "Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab,"2003 Feb 13;421(6924):756-60)과 리툭수맙 (2OSL;Du et al., J Biol Chem, 2007 May 18;282(20):15073-80. Epub 2007 Mar 29)의 분자 구조의 중첩은 프레임워크의 유일함을 추가로 강조하였다.
총체적으로, 이러한 결과는 세툭시맙과 대조군 IgG의 프레임워크 영역에서의 차이 (CDRs에서의 차이와는 반대)는 Fab의 중앙 구멍에 대한 메디토프의 선택을 설명함을 제시한다 (즉, 세툭시맙과 파아지 디스플레이 대조군 항체는 CDRs 이외의 영역에서 구별이 되었다).
메디토프는 Fab에서 큰 형태적 변화를 유발하지 않는다
메디토프-세툭시맙 Fab 계면의 위치에 기초하여, 메디토프가 결찰되지 않고/않거나 결찰된 구조에 대한 IgG 도메인의 상대적 배향을 혼란시키는지 측정하였다. 먼저, 두 메디토프 복합체의 비대칭 유니트 셀내 경쇄 및 중쇄를 비교한 다음 각 쇄를 비결찰 및 EGFR-결찰된 구조와 비교하였다. 각각의 메디토프에 결합된 경쇄의 가변 도메인은 세툭시맙의 비결찰 구조와 필수적으로 동일하였다 (r.m.s.d. 평균 : cQFD, 0.231 ±0.014Å cQYN, 0.18 ±0.01 Å). 그러나, 중쇄의 가변 도메인은 더 큰 차이를 나타냈다 (r.m.s.d. 평균: cQFD, 0.85 ± 0.01 Å, cQYN, 0.88 ± 0.01Å). 이런 차이는 주로 프레임워크 영역 2 에서의 잔기가 결실되어 r.m.s.d.이 다시 계산됨으로써 값: cQFD, 0.18 ± 0.01 Å, cQYN, 0.31 ± 0.01Å이 훨씬 더 낮아지기 때문에, 이 영역의 위치(잔기 39-46)로부터 유리된 것이다 (도 6). 또한, 이 영역은 Fab C225-EGFR (세툭시맙 Fab-항원) 공결정 구조에서 대체되는 것으로 나타났으며, 이의 상대적인 B-인자는 가요성임을 제시한다 (도 6). 마지막으로, 메디토프의 존재는 EGFR 결합 또는 비결합 구조에 비해 CDR 구조에 대한 현저한 변화를 일으키지 않는다. EGFR-결찰된 구조의 중쇄 CDR 루프 3에서 Tyr98의 골격이 각각의 메디토프에 결합된 Fab 구조와 비교하여 플립된 것으로 나타났지만, 이런 플립은 비결찰된 세툭시맙 Fab 구조에서도 관찰된다 (Li et al., 2005, supra).
항체 결합에 대한 메디토프 잔기의 기여
cQFD 메디토프-Fab 복합체의 구조 뿐만 아니라 cQFD에 대한 cQYN의 서열 유사성에 기초하여, cQFD 메디토프에 여러개의 점 돌연변이를 발생시켜 (Phe3→Ala, Leu5→Ala, Arg8→Ala 및 Leu10→Ala) 메디토프의 전체적인 결합 친화도에 대한 이들 잔기의 역할을 규명하였다. 결합 친화도를 평가하기 위하여, 세툭시맙 Fab 단편을 표준 아민 화학을 이용하여 CM5 칩에 커플링시키고 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하여 다양한 메디토프의 결합 특성을 측정하였다. 세툭시맙 Fab에 대한 합성 cQFD 및 cQYN 메디토프의 친화도는 각각(n=3), 950±30 nM 및 3.5±0.1 μM로 측정되었다. 결합 동역학을 또한 측정하였다 (도 3). cQFD 및 cQYN에 대한, 이분자 상호작용으로서 모델링된 회합 상수는 각각, 4.2 (±0.1) x 104 M-1s-1 및 1.8 (±0.1) x 104 M-1s-1 였다. cQFD 및 cQYN에 대한 해리 상수는 각각 2.5 (±0.1) x 10-2 s-1 및 8.6 (±0.1) x 10-2 s-1 였다. cQFD의 경우 439 (±30) nM이고 cQYN의 경우 3.5 (±0.1) μM인, 이들 측정치에 기초한 KD 값은 평형 측정치와 매우 일치하였다.
다음, 각각의 돌연변이된 cQFD 메디토프의 친화도를 측정하였다. 점 돌연변이 및 야생형 cQFD 메디토프를 SMT3에 대한 C-말단 융합으로 생성시키고 분석전에 Ulp1으로 절단하였다. 생물학적으로 생성된 야생형 cQFD 메디토프는 합성으로 생성된 cQFD와 유사하게 770 nM의 친화도로 결합하는 반면, Phe3→Ala, Leu5→Ala, Arg8→Ala 및 Leu10→Ala의 돌연변이는 세툭시맙 Fab에 대한 친화도를 크기 감소시켰다 (하기 표 6). 특히, Arg8→Ala 돌연변이는 결합 친화도에 있어서 대략 183배 소실시켰다.
[표 6]
"WT"(cQFD) 및 돌연변이 메디토프에 대한 해리 상수와 cQFD 미모토프 돌연변이체의 해리 상수
Figure pct00014
마지막으로, 트라스투주맙의 Fab, 인간화된 치료적 단일클론 항체를 CM5 칩에 커플링시켜 인간 프레임워크에 대한 cQFD 및 cQYN 메디토프의 친화도를 규명하였다. 평형 측정에 의하면 두 메디토프에 대한 해리 상수는 150 μM을 초과하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 3: CDRs 이외의 영역에 대한 메디토프의 결합
재료 및 방법
메디토프-이용가능한 항체 (세툭시맙)에 대한, 메디토프 cQFD와 cQYN, 및 기타의 것들의 결합이 항원에 결합하는 항체의 능력에 영향을 주지않는 것으로 증명되었는데, 이는 메디토프-이용가능한 항체는 항원과 메디토프에 동시에 결합할 수 있음을 의미한다.
상기 실시예 1 및 2에 기재된 것 외에, 다음과 같은 재료와 방법이 사용되었다.
시약. 상기 기재된 바와 같이, 세툭시맙의 단일쇄 가변 단편(scFvC225)을 경쇄와 중쇄 사이에 20개의 아미노산 링커를 사용하여 합성하였다. scFvC225 및 k용성 상피 성장 인자 수용체 도메인 III (sEGFRdIII)을 Sf9 세포에서 발현시키고 상기 기재된 바와 같이 정제하였다 (Donaldson et al., 2009).
메디토프 및 점 돌연변이. 상기 기재된 바와 같이, 시스테인의 산화를 통하여 CQFDLSTRRLKC (cQFD; 서열 번호:1) 및 CQYNLSSRALKC (cQYN; 서열 번호:2)를 고리화시켜 디설파이드 결합을 생성시키고 City of Hope Synthetic and Polymer Chemistry Core Facility에서 정제하였다. cQFD 메디토프에서의 알라닌 점 돌연변이는 3번 (Phe3을 Ala로), 5번 (Leu5를 Ala로), 8번 (Arg8을 Ala로) 및 10번 (Leu10을 Ala로) 잔기에서 생성되었고 SMT3의 C-말단에서 펩타이드를 암호화함으로써 세균에 의해 생산되었다 (Mossessova et al., 2000). 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석 전에, 유비퀴틴-유사 프로테아제(Ulp1)을 샘플에 가하여 펩타이드를 방출시켰다. N-말단 세린 잔기는 프로테아제 절단 부위의 잔유물로 남아있었다.
Fab에 대한 EGFR 및 메디토프의 동시적 결합
세툭시맙 Fab를 sEGFRdIII 및 cQFD와 함께 배양시켜 분석용 SEC 컬럼에 인가하였다. 13.9 mL에서 피크가 관찰되었는데, 이는 이들 3종의 성분간에 이종삼합체 복합체가 형성되었음을 나타내는 것이다. 상기 피크의 비-환원 SDS-PAGE는 3종 성분이 모두 존재하는 것으로 나타났다 (도 4B). 비교해보면, 각각의 성분들은 15.2 mL (Fab C225), 15.6 mL (sEGFRdIII) 및 16.3 mL (SMT-CQFDLSTRRLKC; 서열 번호: 1)에서 용출되었다. 이 결과는 메디토프와 EGFR이 세툭시맙에 동시에 결합할 수 있음을 보여주며, 이는 메디토프 결합이 세툭시맙에 의한 항원 결합을 차폐시키지 않았음을 나타낸다.
또한, Forster 공명 에너지 전달(FRET) 측정법을 사용하여 메디토프가 세툭시맙에 의한 항원 결합에 영향을 주지 않았음을 확인하였다. Alexafluor 488-표지화된 세툭시맙 Fab로부터 방출된 형광은 Alexafluor 555-표지화된 sEGFRdIII의 결합시 꺼진다. 표지화된 세툭시맙을 표지화된 sEGFRdIII으로 적정함으로써 20 nM의 결합 상수가 수득되는데, 이는 SPR (데이타는 나타나 있지 않음)을 사용하여 관찰되는 것과 필수적으로 동일한 값이다. 알로스테리(allostery)에 대해 시험하기 위하여, 표지화된 세툭시맙 Fab를 sEGFRdIII와 함께 cQFD 메디토프 (66 μM)의 존재하에서 5 내지 1000 nM의 농도 범위로 배양시켰다. 이 실험은 3중으로 수행하였다. SEC 연구와 유사하게 Fab-sEGFRdIII 상호반응의 결합 상수에서의 변화가 실질적으로 없는 것으로 관측되었다.
합하여 생각하면, 이들 생화학적 연구는 메디토프-Fab 상호반응이 항원 결합에 실제적으로 영향을 주지 않음을 나타낸다. 이러한 관찰은 Fab에 대한 항원 결합에 영향을 주지 않고 Fab 프레임워크에 결합하는, 단백질 L 및 단백질 A에 대한 결과들과 유사하다.
cQFD 메디토프는 세툭시맙의 CDR 루프에 결합하지 않는다
메디토프가 CDRs에 결합하지 않았음을 추가로 확인하기 위하여, cQFD 메디토프와 세툭시맙의 scFv 단편간의 결합을 평가하였다. scFv에서, CDR 루프는 그대로 유지되지만, Fab 가변 도메인은 짧은 펩타이드 링커를 통하여 직접 연결되어, Fab 불변 도메인을 제거하게 된다. 다시 말해서, 상당 부분의 메디토프 결합 포켓이 scFv에서 제거되는 반면, CDRs는 최소로 영향을 받는다. SPR은 EGFR 도메인 III과 세툭시맙 Fab에 결합된 cQFD 메디토프는 CM5 칩에 테더링되어있음을 증명한다 (도 4D 참조). 또한, scFv에 결합된 EGFR 도메인 III은 제2의 CM5 칩에 테터링되었는데, 친화도는 최소로 소실하였다. 그러나, Fab 결합에 비해, cQFD 메디토프는 100 μM 만큼 높은 메디토프의 농도에서 scFv를 포화시키지 않았다. 이는 결정한 연구와 일치하는 CDRs에 대한 메디토프의, 존재할 경우, 친화도가 최소임을 나타낸다.
cQFD 메디토프는 EGFR-발현 세포에 대한 세툭시맙 결합에 영향을 주지 않는다
상기 기재된 바와 같이, 세툭시맙 Fab는 cQFD 메디토프와 EGFR 도메인에 동시에 결합할 수 있다. 이런 메디토프는 EGFR-발현 세포에 대한 세툭시맙 (완전 IgG)에 영향을 주지 않았음을 다시 한번 보여준 것이다. 메디토프 농도의 함수로서, EGFR을 과발현시키는, MDA MB-468 세포에 대한 IgG의 결합에 이어서 FACS 분석을 이용하였다. 세포를 증가하는 농도의 cQFD 메디토프의 존재하에서 세툭시맙과 배양시켰다. 메디토프의 농도가 60 μM보다 높더라도, 세포에 대한 세툭시맙 결합에 있어서 상당한 변화가 관찰되지 않았다. 이러한 관찰은 상기 기재된 SEC 연구와 일치하며, 메디토프가 항원 결합의 알로스테릭 조절자로서 작용하지 않는다는 것을 나타낸다.
EGFR 도메인 III과 메디토프에 동시에 결합하는 것은 메디토프의 KD 보다 훨씬 더 높은 농도에서 나타난다. cQFD 및 cQYN 메디토프와 같이, 슈퍼항원 SpA 및 PpL은 Fab 프레임워크 영역에 결합하며 항원 결합에 영향을 주지 않는다 (참조: Graille, M. et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus Protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 5399-404 (2000)); Graille, M. et al. Complex between Peptostreptococcus magnus Protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure 9, 679-87 (2001); Young, W.W., Jr., Tamura, Y., Wolock, D.M. & Fox, J.W. Staphylococcal Protein A binding to the Fab fragments of mouse monoclonal antibodies. J Immunol 133, 3163-6 (1984); Graille, M. et al. Evidence for plasticity and structural mimicry at the immunoglobulin light chain-Protein L interface. J Biol Chem 277, 47500-6 (2002)).
다른 Fab-결합 단백질과 관련한 메디토프 결합
Fab 상의 메디토프 결합 부위는 Fab의 프레임워크 영역에 결합하는 다른 단백질의 결합 부위와 구별된다. 예를 들어, 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터 분리된, 단백질 A의 도메인 D는 인간 IgG의 중쇄(VH)의 프레임워크에 결합하고; 펩토스트렙토코커스 마그너스(Peptostreptococcus magnus)로부터 단래된 단백질 L의 B1 도메인은 인간 IgG의 카파 경쇄(VL)의 프레임워크에 결합하며; 스트렙토코커스 균주로부터 단래된, 단백질 G의 도메인 II는 인간 IgG의 중쇄(VC)의 프레임워크에 결합한다. 계면이, 용매에 노출되는 단일 Fab 도메인에 주로 국한되는, 이들 상호반응과는 달리, 메디토프-Fab 계면은 4개의 도메인 (예를 들면, 중쇄 및 경쇄의 가변 및 불변 도메인) 모두에 의해 형성되는 것으로 나타났다.
cQFD 및 cQYN 메디토프-세툭시맙 Fab 계면에서 매립된 표면은 각각 904 (±28) Å2 및 787 (±42) Å2인 것으로 나타났으며, 일반적으로 경쇄와 중쇄 사이에서 대등하게 분포되어 있었다. 이들 값은 단백질 A, L 및 G의 Fab 도메인에 결합된 이들의 도메인의 계면에 대한 것들: 각각, 580 Å2 (1DEE.pdb), 714 Å2 (1HEZ.pdb), 및 518 Å2 (1QKZ.pdb)과 대략적으로 유사하다. Fab와 단백질 L의 가변 영역 사이에는 2개의 독특한 계면 (이는 646 Å2을 매립한다)과, Fab와 단백질 G의 불변 영역 사이에 작은 상호작용 (이는 184 Å2을 매립한다)이 있다.
입체 마스크
메디토프는 가요성 링커를 통하여 뮤린 키메라 또는 메디토프-이용가능한 인간 mAb에 테더링될 수 있다(도 11). mAb IgGs의 N-말단은 항원 결합 부위에 병치되고, 가요성 링커를 통하여 N-말단으로부터의 확장은 항원 결합을 입체적으로 방해한다. 상기 링커에서 종양 특이적 프로테아제 부위 (예를 들면, MMP9, MMP14, 프로테아제-특이 항원(PSA) 세린 프로테아제 또는 다른 적합한 부위)를 암호화함으로써, 분자내 "차폐된" IgG 작제물의 입체적 제약은 종양 부위에 제공될 것이며 항체 결합을 허용할 것이다. 이 디자인 원리는 분자내적으로 '차폐된' IgG가 건강한 조직에 결합하는 것을 피하고 표적이탈 결합으로 인한 부작용을 피하는 것이다. 세툭시맙 상의 아비딘-펩타이드 마스크에 대한 오프-레이트 측정(off-rate determination)는 다가 메디토프가 1가 메디토프보다 더 높은 친화도로 결합하였으나, 차폐시키지 않았음을 보여준다.
실시예 4: 메디토프-이용가능한 항체의 생성
구조적 정보를 기초로, 추가의 메디토프-이용가능한 항체를 생성시켰다.
A. 돌연변이에 의한 메디토프-이용가능한 트라스투맙의 생성
트라스투주맙을 돌연변이시켜 메디토프-이용가능한 HER2-결합 항체를 생성시켰다. 세툭시맙의 서열과 비교한, 인간 IgG(트라스투주맙 - 1N8Z.pdb)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 영역간의 서열 차이가 cQFD 메디토프에 결합된 세툭시맙 Fab의 결정 구조상에 맵핑시켰다. 세툭시맙의 메디토프 결합 부위에 줄지어있는 잔기에 대응하는 인간 프레임워크중의 잔기를 돌연변이시켜 세툭시맙에 존재하는 상응하는 잔기를 함유하도록 하고; 추가로, Kabat 넘버링에 따라, 경쇄의 S9와 S10을 각각 이소류신과 류신으로 돌연변이시켰다. 도 23A와 23C에는 각각, 상기 돌연변이체 (메디토프-이용가능한) 트라스투주맙의, 중쇄 부분의 핵산 서열 (서열 번호: 5)과 경쇄 부분의 핵산 서열 (서열 번호: 8)이 제시되어 있다. 도 23B 및 23D에는 각각, 메디토프-이용가능한 트라스투주맙의 중쇄 부분의 아미노산 서열(서열 번호: 6)과 경쇄 부분의 것(서열 번호: 9)이 제시되어 있다. 도면 23B와 23D에는 또한, 이들 아미노산 서열과 야생형 트라스투주맙의 중쇄 및 경쇄 부분의 아미노산 서열(각각, 서열 번호: 7 및 서열 번호: 10)의 비교가 제시되어 있다.
상기 돌연변이체, 메디토프-이용가능한 트라스투주맙의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산을 표준 방법을 사용하여 합성하여 포유동물 발현을 위한 표준 벡터로 서브클로닝시킨다. 표준 방법을 사용하여 메디토프-이용가능한 트라스투주맙 IgG를 정제하고 HER2 및 cQFD 메디토프에 결합하는 능력에 대해 특성을 규명하였다.
메디토프-이용가능한 트라스투주맙은 항원과 메디토프에 결합하며 야생형 트라스투주맙과 구분이 안될 정도의 PK/PD 특성을 갖는다.
한 연구에서는, 항원 결합 특성화를 위하여, 표준 프로토콜을 사용하여 야생형 트라스투주맙과 메디토프-이용가능한 트라스투주맙을 Alexa 647로 표지시켰다. cQFD (서열 번호: 1) 메디토프-Fc 융합 단백질 (실시예 7에 기재된 바와 같이 생산된 것으로 도 15 및 16에 나타나 있음)도 동일한 프로토콜을 사용하여 Alexa 488로 표지시켰다. 메디토프-Fc가 메디토프-이용가능한 트라스투주맙에 결합하고 양생형 트라스투주맙에는 결합하지 않음을 보여주기 위하여, HER2를 과발현시키는, SKBR3 세포 (0.5x106)를 표지시킨 야생형 및 메디토프-이용가능한 트라스투주맙과 30분간 배양시켰다. 미결합 항체를 세척해내고 세포를 메디토프-Fc 작제물과 함께 30분간 배양시켰다. 항체 결합 및 메디토프 결합을 FACS 분석법으로 분석하였다. FACS 데이타는 메디토프-이용가능한 트라스투주맙은 SKBR3 세포상에서 발현된 HER2에 결합하며 (예를 들면, 메디토프 부위는 항원 특이성의 소실없이 항체상에 그라프팅될 수 있다)(도 22A), 메디토프-Fc는 메디토프-이용가능한 트라스투주맙에 결합하지만, 야생형 트라스투주맙에는 결합하지 않음(도 22B)을 증명한다.
다른 연구에서는, 야생형 및 메디토프-이용가능한 트라스투주맙을 표준 프로토콜을 사용하여 Alexa 488로 표지시켰다. SKBR3 세포 (0.5x106)를 트립신처리하여 0.1% BSA로 1회 세척하고, 1, 10, 또는 100 nM 야생형 또는 메디토프-이용가능한 트라스투주맙과 함께, 30분간 배양시켰다. 미결합 항체를 2회 세척하여 유세포분석법으로 분석하였다. 결과가 도 43에 제시되어 있는데, 이는 메디토프-이용가능한 트라스투주맙은 야생형 트라스투주맙과 유사한 항원-발현 세포에 대한 친화도를 갖고 있음을 증명한다.
다른 연구에서는, cQFD (서열 번호: 1) 메디토프-단백질 L 융합 단백질(MPL)을 상기와 동일한 표준 프로토콜을 사용하여 Alexafluor 647로 표지시켰다. SKBR3 세포를 트립신처리하고 0.1% BSA로 1회 세척한 다음, 야생형 트라스투주맙(WT T) 또는 메디토프-이용가능한 트라스투주맙(TM)에 미리-결합시켰다 (30분간 배양시킴으로써). 이후, 세포를 세척한 다음, 0.1 μM 또는 1 μM MPL과 함께 다시 30분간 배양시켰다 (오른쪽). 세포를 2회 세척하고 유세포분석법(FACS)로 분석하였다. 항체에 미리-결합시키지 않은 세포(MPL(WT)만)를 네가티브 대조군으로 사용하였다. 결과가 도 44에 제시되어 있다. 히스토그램은 메디토프-이용가능한 트라스투주맙에 결합된 세포는 메디토프-단백질 L 융합 단백질에 결합하였으나, 비결합 세포 또는 야생형 트라스투주맙에 결합된 세포는 결합하지 않음을 증명한다. 도트 플롯은 MPL 만의 대조군에 대한 각각의 사분면에서 세포의 퍼센트를 보여준다.
도 45에 나타낸 바와 같이, 단백질 L중의 모두가 아니라 1개의 리신을 Arg/Asn 잔기로 돌연변이시킨 메디토프-단백질 L (MPL-5K)를 사용하여 동일한 결과가 수득되었다.
이들 데이타는 메디토프-이용가능한 트라스투주맙은 야생형 항체와 동일한 정도로 항원에 결합할 수 있으며, 메디토프-이용가능한 트라스투주맙 (야생형 트라스투주맙은 아님)은 메디토프에 결합함을 증명한다. 따라서, 이들 데이타는 상기 항체의 메디토프 결합 부위에 대한 메디토프의 결합은 본 연구에서 항원 결합에 영향을 주지 않음을 확인시켜주며, 이는 3성분 상호반응을 증명하는 것이다.
도 50(상부 패널)에는 세툭시맙에 결합된 메디토프 18(서열 번호: 18, 표 3에 나타나 있음, 5번 위치에서 β,β'-디페닐알라닌을 갖고 있음)(진한 회색 막대), 메디토프-이용가능한 트라스투주맙에 결합된 동일한 메디토프(18)(흰색 막대), 및 야생형 트라스투주맙(외곽선)의 구조가 중첩되어 있음이 나타나 있다. 하부 패널에는 야생형과 메디토프-이용가능한 트라스투주맙을 비교하는 리본 카툰이 나타나 있다. 상기 결과는 메디토프와의 결합에 있어서 중요한 잔기의 위치가 세툭시맙과 메디토프-이용가능한 트라스투주맙에서 거의 동일한 위치에 있음을 증명한다. 도 50의 오른쪽 패널에는 야생형 및 메디토프-이용가능한 트라스투주맙의 리본 카툰이 나타나 있으며, 이는 구조에 있어서 거의 차이가 없음을 증명한다.
마찬가지로, 도 51의 상부-왼쪽 패널에는 막대로 표시되는 메디토프-이용가능한 항체에서의 메디토프-결합에 연관되는 특정의 잔기를 갖는 트라스투주맙과 트라스투주맙 memAb (표지화된 "메디토프-이용가능한 Memab")의 구조의 중첩(superposition)이 나타나 있다. 상부 오른쪽 패널은 표지화된 동일한 잔기를 갖는, 메디토프-이용가능한 트라스투주맙(memAb)과 세툭시맙 구조의 중첩이 나타나 있다. 나타낸 바와 같이, Ile83은 각 구조에서 2개의 회전이성체를 취하며, 이는 문제되지 않는 것으로 결정되었으나, 메디토프 결합된 메디토프-이용가능한 트라스투주맙 결정 구조에서는, 세툭시맙에서 관찰된 것과 동일한 회전이성체일 것으로 추정한다. 하부 패널은 중첩된 3개의 구조 모두의 '카툰/리본 다이아그램'도면이며, 이는 전체적으로 유의할만한 차이가 없음을 증명한다. 예측한 바와 같이 (이들 항체의 상이한 항원의 결합을 고려해볼 때), CDR 루프에서의 약간의 차이가 관찰되었다.
추가로, 동물 연구는 메디토프-이용가능한 트라스투주맙과 야생형 트라스투주맙의 생물분포가 분명하지 않은 것으로 나타났다.
이들 데이타는 잔기를 세툭시맙의 메디토프-결합 계면중의 잔기에 상응하도록 돌연변이시킴으로써, 다른 기능을 보유하면서, 항체가 효과적으로 메디토프-이용가능할 수 있음을 증명한다.
메디토프-이용가능한 트라스투주맙은, 순차적으로 접촉되거나 예비 혼합되는 지에 따라, 메디토프 닢 항원에 결합한다
다른 연구에서는 세포를 항체와 미리-결합시키든(연속적으로) 미리-형성된 메디토르-항체 복합체(미리-혼합된)를 세포에 인가하든 메디토프는 유사한 효율로 메디토프-이용가능한 트라스투주맙에 결합하는 것이 증명되었다. 결과는 도 46에 제시되어 있다. 이 연구에서는, SKBR3 세포를 트립신처리하여 0.1% BSA로 1회 세척하고, 10 nM 메디토프-이용가능한 트라스투주맙(TM)과 함께, 30분간 배양시키고, 세척한 다음, 4, 20, 또는 100 nM의 MPL과 함께 다시 30분간 배양시켰다 (왼쪽 패널). 달리, 10 nM의 TM을 4, 20, 또는 100 nM의 MPL과 함께 빙상에서 30분간 미리 혼합한 다음, 이어서 세포에 상기 혼합물을 1시간 동안 인가하였다 (오른쪽 패널). 세포를 2회 세척하고 FACS로 분석하였다. 비-처리 대조군에 대한 MPL-포지티브 세포의 퍼센트가 범례에 나타나 있다.
B. CDR-그라프팅에 의한 메디토프-이용가능한 HER2-결합 항체의 생성
트라스투주맙의 CDRs를 세툭시맙에 그라프팅시켜 메디토프-이용가능한 HER2-결합 항체를 생성시켰다.
트라스투주맙 중쇄의 핵산 및 아미노산 서열이 도 25A(각각, 서열 번호: 11 및 12)에, 시그날 서열 및 다른 서열과 함께 제시되어 있다. 트라스투주맙 경쇄의 핵산 및 아미노산 서열이 도 25B(각각, 서열 번호: 13 및 14)에, 시그날 서열 및 다른 서열과 함께 제시되어 있다.
mAbs의 CDR 루프의 "경계"는 일반적으로 서열 동족성 구조 방법에 의해 명확하게 구획된 반면, 트라스투주맙의 결정 구조는 세툭시맙에 중첩되고 각 잔기의 위치는 CDR 루프의 구조에 대해 2차적인 효과를 가질 수 있는, CDR 루프 외부의 잠재적 차이에 맞춘 것으로 조사되었으며; 이런 정보를 기초로, 추가의 변형은 CDRs를 변형시키는 것을 넘어선다. 세툭시맙-유사 프레임워크상에 트라스투주맙-유사 CDRs를 함유하도록 디자인된 항체의 경쇄와 중쇄의 아미노산 서열을 DNA 서열로 해독하고 각각을 암호화하는 유전자를 합성하였다. 생성된, 세툭시맙-유사 프레임워크상에 그라프팅되어 있는 트라스투주맙-유사 CDRs를 함유하는 항체의 중쇄 및 경쇄의 아미노산과 핵산 서열이 도 47에 나타나 있다. 구체적으로, 도 47A에는 CDR-그라프팅된 메디토프-이용가능한 트라스투주맙 (세툭시맙-유사 프레임워크상에 그라프팅되어 있는 트라스투주맙-유사 CDRs를 갖고 있는)의 경쇄 핵산(서열 번호: 60) 및 경쇄 아미노산(서열 번호: 61)의 서열이, 시그날 서열 및 숨겨져 있는 다른 서열과 함께 나타나 있다. 도 47B에는 상기 항체의 중쇄 핵산(서열 번호: 62) 및 중쇄 아미노산(서열 번호: 63)이 나타나 있다.
이어서, 유전자를 나머지 IgG DAN 서열중에 프레임으로 서브클로닝시켜, DNA 서열화로 확인하고 각각의 발현 벡터에 위치시켰다. 생성된 발현 벡터를 중쇄와 경쇄의 동시-발현을 위하여 NS0 세포로 형질감염시켰다. 발현된 전장 CDR-그라프팅된 IgG가 분비됨에 따라, 원심분리시켜 상등액을 등명화시키고, 농축시켜, 단백질 A 컬럼에 통과시켰다. IgG는 낮은 pH 용액을 사용하여 용출시킨 다음, 즉시 중화시켰다. SDS-PAGE (폴리 아크릴아미드 겔 전기영동법)를 전장 CDR-그라프팅된 IgG에 대해 환원 조건하에서 수행하였다. 결과는 경쇄 및 중쇄와 일치하는 명확한 질량을 갖는 2개의 단백질 밴드를 표시하였다. 밴드의 위치는 야생형 세툭시맙과 비교하여 유사한 위치에서 이동하였다.
항원 결합을 규명하기 위하여, 야생형 트라스투주맙과 트라스투주맙 CDR-그라프팅된, 메디토프-이용가능한 mAb(memAb)를 Alexafluor 647로 표준 프로토콜을 사용하여 표지시켰다. 상기 기재된 바와 같이, cQFD (서열 번호: 1) 메디토프-Fc (실시예 7에 설명된 바와 같이 생산되었으며 도 15 및 16에 나타나 있음); 메디토프-Fc를 Alexafluor 488로 동일한 프로토콜을 사용하여 표지시켰다. 메디토프-Fc가 트라스투주맙 CDR-그라프팅된, 메디토프-이용가능한 mAb에는 결합하지만 야생형 트라스트주맙에는 결합하지 않음을 보여주기 위하여, HER2를 과발현시키는 SKBR3 세포 (0.5x106)를 표지화된 야생형 또는 본 실시예에서 생산된 바와 같은, CDR-그라프팅된 메디토프-이용가능한 트라스투주맙과 함께 30분간 배양시켰다. 미결합 항체를 세척하고 세포를 메디토프-Fc 작제물과 30분간 배양시켰다. 항체 결합 및 메디토프 결합을 FACS 분석법으로 분석하였다. "CDR-그라프팅"의 중요한 성분으로서. 상기 결과는 도 24에 나타나 있다. FACS 데이타는 트라스투주맙 CDR-그라프팅된, 메디토프-이용가능한 mAb는 SKGR3 세포에서 발현된 HER2에 결합하였음을 나타내는데, 이는 메디토프-이용가능한 항체(세툭시맙) 프레임워크상에 그라프팅된 항체(트라스투주맙)의 CDR 루프가 항원(HER2)에 대한 결합 능력을 보유하고 있음을 증명한다 (도 24A). FACS 데이타는 또한 메디토프-Fc가 트라스투주맙 CDR-그라프팅된, 메디토프-이용가능한 mAb에는 결합하지만, 야생형 트라스투주맙에는 결합하지 않음을 보여주며 (도 24B), 이는 CDR-그라프팅된 메디토프-이용가능한 항체가 메디토프에 결합함을 증명한다.
CDR-그라프팅된 메디토프-이용가능한 트라스투주맙의 생산을 최적화하면 더욱 엄격한/정량적 특성화용 물질이 더 많이 생산됨을 알 수 있다. 본 연구에서 더 적은 양의 물질과 이에 따른 덜 엄격한/정량적 특성화 (예를 들면, 메디토프-이용가능한 트라스투주맙의 최종 농도 및 Alexafluor 647을 사용한 이의 표지화에서의 불활실성)도 분명한 친화도의 감소를 그럴듯하게 설명한다. 항원 결합을 최적화시키기 위한 방법이 당해 분야에 알려져 있다. 상기 데이타는 CDR-그라프팅된 메디토프-이용가능한 트라스투주맙은 트라스투주맙 항원에 결합하고 (즉, HER2를 과발현시키는 SKBR3 세포에 결합) 서열 번호: 1의 메디토프에 결합한다는 것(즉, CDR-그라프팅된 메디토프-이용가능한 트라스투주맙으로 미리 처리된 항원-발현 세포는 메디토프에 결합)을 보여준다.
C. 돌연변이에 의한 메디토프-이용가능한 CEA-결합 항체(메디토프-이용가능한 M5A)의 생성
추가로, 잔기를 세툭시맙의 잔기에 상응하도록 돌연변이시킴으로써 항-CEA 항체(M5A)를 메디토프-이용가능하게 만든다. 구체적으로, 도 56에서 음영으로 나타낸 바와 같이, 8개의 점 돌연변이를 M5A 항체의 경쇄에 도입시켜, 메디토프에 결합하도록 한다. 야생형 중쇄 서열과 메디토프-이용가능한 경쇄 서열을 Lonza 글루타민 선택 발현 벡터중으로 클로닝시키고 NS0 세포에 형질감염시켰다. 2개의 안정한 라인이 수득되며, 이는 대략 5 mg/L에서 메디토프-이용가능한 mAb를 발현시킨다.
M5A 항원(CEA)에 대한 메디토프-이용가능한 M5A의 결합은 FACS에 의해 LS174T 세포를 사용하여 증명하였다. 500 nM의 Alexa Fluor 488 표지화된 야생형 또는 메디토프-이용가능한 M5A를 트립신처리된 세포 및 9 μM의 Alexa Fluor 647 표지화된 메디토프-단백질 L (실시예 10 참조)과 함께 30분간 실온에서 배양시켰다. 세포를 0.1% BSA로 2회 세척하고 FACS 분석을 수행하였다. 결과는 도 57에 나타나 있다. M5A가 트라스투주맙과 동일한 골격을 갖는 인간화된 항체라는 것을 고려할 때, 상기 결과는 메디토프-단백질 L이 야생형 M5A에 용이하게 결합하는 것으로 나타났다. 그러나, 증대된 결합은 메디토프-이용가능한 M5A (M5A 8M)에 대해서 관찰되었는데, 이는 메디토프와 단백질 L 둘다의 동시 결합으로부터 얻어지는 결합활성으로 인한 것이다.
추가로, 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 SPR 측정을 본 명세서에 기재된 바와 같이 수행하여, 상기 메디토프-이용가능한 항체에 대한, CQA(디페닐)DLSTRRLKC, CQFDA(디페닐)STRRLKC, 메디토프 31,, 및 cQYN 메디토프를 포함한, 다양한 메디토프 변이체의 결합을 확인하였다 (도 58).
실시예 5: 메디토프 결합 부위의 변형
세툭시맙과 같이, 제공되는 메디토프-이용가능한 항체 중 1종 이상의 메디토프-결합 부위에 늘어서 있는 잔기를 조직적으로 또는 랜덤하게, 예를 들면, 메디토프 또는 메디토프 유사체의 특이성을 증대시키고/시키거나 변화시키기 위하여, 퇴화 라이브러리 및 선택법을 사용하여 변경시켰다 (참조: Sheedy et al. 2007 and Akamatsu et al. 2007, for methods of making alterations). 이들 위치에서의 잔기를 천연 또는 비-천연 아미노산 또는 둘다로 치환시켜, 예를 들면, 메디토프 상호반응의 친화도를 증대시키고/시키거나 메디토프-항체 상호반응의 다른 특성을 변경시킨다.
메디토프와 접촉하며, 구멍에 늘어서 있고/있으며 달리 중요한, 메디토프-이용가능한 항체의 잔기 (본 명세서에서 변형용으로 기재된 잔기와 같이)를 돌연변이시킨다. 일례로, 상기 기재된 연구에서 수득되는 것들과 같은, 구조적 데이타를 사용하여 Fab중의 잔기를 돌연변이시켜, 예를 들면, 추가의 수소결합을 첨가하거나, 아미노산을 비천연 아미노산으로 치환시키거나 소수성 계면을 예를 들면, 메디토프 결합을 더욱 양호하게 보완할 수 있는 방법으로 변경시켰다 (도 21 참조).
일례로, 각각의 잔기를 조직적으로 변경시킨 다음, 돌연변이체 항체를 생산하여 특성화시킨다. 다른 예로는, IgGs의 라이브러리를 DNA 수준에서 퇴화 올리고를 사용하여 당해 부위에서 생성시켜 당해 부위 또는 부위에서 모두 20개의 천연 아미노산을 집합적으로 암호화하는 멤버를 생산하여, 상기 라이브러리가 1개 이상 제시된 부위에서 치환된 각 아미노산을 갖는 라이브러리의 개별적 멤버를 생산하도록 한다.
GPI 도메인을 상기 라이브러리중의 항체의, 예를 들면, Ig 중쇄의 C-말단에 첨가하였다. 일례로, 상기 라이브러리를 표준 방법을 사용하여 형질감염시키고; 상기 라이브러리로부터 항체 (예를 들면, IgGs)가 발현된다.
이들 방법에 따라서 GPI-연결된 메디토프-이용가능한 항체에 대한 결합을 증명하기 위하여, GPI-연결된 메디토프-이용가능한 트라스투주맙을 생산하였다. 도 54에는 상기 GPI-연결된 메디토프-이용가능한 트라스투주맙이 메디토프-단백질 L(MPL)에 결합하고, 하기 실시예 10에 기재되는 바와 같이 생산되었음이 나타나 있다. 이 연구에서는, 1 x 10^6개의 세포/샘플이 사용되었다. 부드럽게 피펫팅하여 세포를 플레이트로부터 제거하고 PBS 중 0.1% BSA(w/v)로 1회 세척하였다. AF647 MPL을 세척용 완충액중에 10 nM로 희석시키고 세포와 함께 30분간 실온에서 배양시켰다. 세포를 2회 세척한 다음 FACS로 분석하였다.
상기 라이브러리로부터 생산된 항체를 1개 이상의 목적하는 특성(traits)에 대해 선별한다. 일례로, 항원 결합에 영향을 주지 않는 돌연변이를 선택하기 위하여, 상기 항체에 특이적으로 결합하는, 형광 표지화된 항원에 결합하는 상기 라이브러리(예를 들면, 상기 항체를 발현시키는 세포)로부터의 항체를 예를 들면, FACS(도 20)로 선택한다. 일례로, 항체의 항원-결합 역량에 대해 선택된 항체를 예를 들면, 특이적 메디토프, 메디토프 유사체, 또는 다른 관심있는 분자에 결합하는 돌연변이체 항체에 대해 선택하기 위한 다른 선택 단계를 수행한다.
선택한 다음, 상기 선택된 항체를 목적하는 조합의 돌연변이를 결정하도록 특성화한다. 일례로, 세포 분류한 다음, PCR을 사용하여 메디토프/유사체/소분자 결합을 도모하거나 증대시키는 돌연변이를 확인한다. 일례로, 이 공정을 여러회 반복하여 목적하는 특성, 예를 들면, 결합, pH 의존성, PK, 및/또는 PD을 발달/최적화시킨다.
실시예 6: 변이체 메디토프
여러개의 변이체 메디토프를 생성시켰다. 예를 들면, 표 3 및 4(상기)중의, 세툭시맙에 대한 증명된 결합 친화도를 갖는 특정의 메디토프 변이체를 합성하였다. 표 3의 펩타이드의 경우, 디설파이드 연결기를 사용하여 에 함유되어 있는 C 및 N 말단을 연결하였다 (메이토프 31이 포함되어 있는 추가적인 테일(tail)은 제외하는데, 이는 디설파이드 연결기가 상기 2개이 말단 잔기 사이에 없음을 의미한다). 메디토프 26, 27, 28, 및 29를 생합성하였으며, 따라서 본 실시예에서는, 첫번째 시스테인 앞, 즉, 0번 위치에 추가적인 세린을 포함하였다. 또한, 일부 실시양태에서는, 메디토프 31이 GGSK 링커를 임의로 포함할 수 있다. 표 4의 펩타이드의 경우, 락탐 연결기, 디설파이드([3+2] 고리화첨가반응)을 제외한 연결기, 또는 연결기 없이 코넥터(connectors)로 사용되었다. 예를 들어, 메디토프 55는 메디토프-결합 부위내에서 결합하는 직쇄 펩타이드이다. 이들 표에서의 각각의 메디토프가 하기에서 논의된다.
상기한 바와 같이, 환형 펩타이드 cQFD(서열 번호: 1)과 cQYN(서열 번호: 2)을 확인하여 세툭시맙 Fab와 공-결정화시킨 다음, 생물물리학 및 생화학적 방법을 사용하여 상기 상호반응의 특성을 규명하였다. 구체적으로, Phe3, Leu5, 및 Arg8을 알라닌으로 돌연변이시키면 결합 계면에 대한 메디토프의 친화도가 44 내지 183배까지 감소되었다. 표 6과 7을 참조한다.
메디토프 변형 및 화학 디자인
구조 및 열역학적 데이타를 기초로, 제공되는 메디토프내 여러개의 위치가 예를 들어, 전체적인 결합 친화도를 증진시키고/시키거나 다른 특성을 변경시키기 위한, 변형용 표적으로, 예를 들면, 치환 및/또는 비-천연 아미노산을 사용한 변형용 표적으로 확인되었다. 변형에는 헤드-투-테일 환형 락탐 펩타이드의 발생, Arg8의 변형, Phe3의 변형, Leu5의 변형, Leu10의 변형, 및 수화가능한 카르보닐 작용성의 내포가 포함된다 (도 31 참조).
Arg8의 변형
Arg8을 변형시켰다. 구조적 데이타를 기초로, 비변형된 메디토프(cQFD; 서열 번호: 1)의 Arg8이 연장되면, 메디토프-이용가능한 항체 중쇄의 Q105의 중쇄 카르보닐과 수소결합을 만드는 것으로 측정되었다. 이 잔기 바로 옆의 영역을 소수성이지만, 여전히 용매-노출되어 있다 (도 33A).
구조적 데이타는 메디토프-이용가능한 항체 H-결합에 대한 구아니디늄 작용성을 유지하면서, 동시에 구멍을 부분적으로 충진시키기 위하여 소수성인 암(arm)을 도입시키는, 변형된 Arg8을 내포시키면, 리간드 도킹 계산에 의해 지지되는 바와 같이, 엔트로피 증가로 인하여, 결합에 있어서 상당한 증가가 성취될 수 있음을 나타낸다.
8번 위치에서 n-부틸-아르기닌을 함유하는 변이체 메디토프인, 메디토프 54 (서열 번호: 54, 표 4에 나타낸 바와 같음)를 다음과 같이 생성시켰다:
Fmoc-N-부틸 Arg 유도체 3 (메디토프 54)의 합성
Figure pct00015
CH2Cl2 (0.6 mL)중 상기 15 (23 mg, 0.03 밀리몰)의 교반시킨 용액에, EDCl (12 mg, 0.06 밀리몰, 2 당량)과 n-부틸아민 (4.4 mg, 0.06 밀리몰, 2 당량)을 가하였다. 실온(rt)에서 5분 후, 용매를 진공하에서 제거하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(40-50% EtOAc/Hex)로 정제하여 상기 생성물 16 (23 mg, 95%)을 수득하였다. [0001] 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.78-7.70 (m, 2H), 7.60-7.54 (m, 2H), 7.42-7.37 (m, 2H), 7.35-7.27 (m, 2H), 5.95-5.83 (m, 1H), 5.52-5.42 (m, 1H), 5.36-5.22 (m, 2H), 4.61(d, J = 5.4 Hz, 2H), 4.44-4.30 (m, 3H), 4.16 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 3.30-3.02 (m, 4H), 2.92 (s, 2H), 2.54 (s, 3H), 2.48 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 1.98-1.80 (m, 1H), 1.76-1.50 (m, 3H), 1.45 (s, 6H), 1.36-1.26 (m, 4H), 0.85 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ171.9, 158.7, 156.4, 155.0, 144.0, 143.8, 141.5, 138.5, 133.8, 132.4, 131.5, 128.0, 127.3, 125.2, 124.6, 120.3, 119.6, 117.6, 86.5, 67.4, 66.5, 53.3, 47.3, 43.5, 41.5, 41.0, 30.9, 30.7, 28.8, 25.4, 20.2, 19.5, 18.2, 13.9, 12.7; HRMS C41H52N4O7S [M+Na]+ 계산치 767.3449, 실측치 767.3455.
Figure pct00016
THF (0.8 mL)중, 상기 16 (23 mg, 0.03 밀리몰)의 교반시킨 용액에 N-메틸아닐린 (10 mg, 0.09 밀리몰, 3 당량)과 Pd(PPh3)4 (2 mg, 0.0015 밀리몰, 0.05 당량)을 가하였다. rt에서 45분 후, 용매를 진공하에서 제거하였다. 잔사를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (MeOH:CH2Cl2:HOAc=25:1:0.1)로 정제하여 상기 생성물 17 (20 mg, 90%)을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.78-7.70 (m, 2H), 7.60-7.54 (m, 2H), 7.40-7.34 (m, 2H), 7.30-7.24 (m, 2H), 5.95-5.83 (m, 1H), 4.48-4.10 (m, 5H), 3.30-3.02 (m, 4H), 2.90 (s, 2H), 2.58 (s, 3H), 2.50 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.00-1.86 (m, 1H), 1.86-1.74 (m, 1H), 1.72-1.60 (m, 2H), 1.45 (s, 6H), 1.30-1.22 (m, 4H), 0.82 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ174.9, 158.9, 156.6, 155.2, 144.0, 143.8, 141.5, 138.5, 133.3, 132.4, 129.3, 128.5, 128.0, 127.3, 125.3, 124.8, 120.2, 117.7, 86.6, 67.4, 53.4, 47.4, 43.4, 41.6, 41.1, 31.4, 29.9, 28.8, 25.2, 20.1, 19.5, 18.2, 13.9, 12.7;HRMS C38H48N4O7S [M+Na]+ 계산치 727.3136, 실측치 727.3144.
다음 문헌을 참조한다: Martin, N. I., and Liskamp, R. M. J. Org. Chem. 2008, 73, 7849-7851.
Arg-부틸 메디토프 54의 합성
Figure pct00017
추가로, 메디토프 54(서열 번호: 54, 상기 구조에서)를, Fmoc-N-부틸 Arg 유도체 17을 사용하여 고체상 Fmoc 합성 프로토콜에 따라서 제조하였다. 도 59에는 메디토프 54의 HPLC 트레이스와 질량 스펙트럼이 나타나 있다.
세툭시맙 Fab 단편에 결합되어 있는 메디토프 54의 구조(후면 뷰)가 중첩되어 있는, 5번 위치 β,β'-디페닐알라닌 메디토프(서열 번호: 18, 메디토프 18)와 cQFD (메디토프 1, 서열 번호: 1)의 구조와 함께, 도 48에 나타나 있다. 하기 표 7에 나타낸 바와 같이, 메디토프 54를 SPR로 측정하였더니 세툭시맙에 평균 745.2 nM의 KD로 결합하였다.
일부 예로, 이들 연구에서 확인된 상기 메디토프-이용가능한 항체 결합 포켓은 메디토프-메디토프-이용가능한 항체 상호반응의 친화도를 증가시킬 수 있는 새로운 콘택트(메디토프 또는 유사체)용으로 본 명세서에 설명된 바와 같이 조사한다.
Phe3의 변형
cQFD의 Phe3에 대해 다양하게 변형시켰다. 구조적 데이타는 메디토프 변이체 Phe3Tyr cQYN (서열 번호: 2)의 히드록실 기가 cQFD (메디토프 1)과 비교할 때 Arg8 측쇄의 연장된 구조에서 변경을 갖는 것으로 증명되었다 (도 30C 및 35 참조). SPR은 세툭시맙 Fab에 대한 상기 변이체의 전체적인 친화도가 감소되었음을 증명한다. ITC 측정은 비변형된 메디토프(서열 번호: 1)과 비교하여 엔탈피에 있어서 유리한 증가에 의해 상쇄되는 결합시 상기 Phe3Tyr cQYN 변이체에 대한 엔트로피에서의 현저한 감소 (2.1 kCal/mol에서 7.9 kCal/mol로 [n=3])를 표시한다 (도 30D). 구조적 데이타는 Fab에 결합된 물에 의해, 유리한 수소 결합 네트워크의 형성을 제시한다.
메디토프-이용가능한 항체에 결합되었을 때, Phe3의 소수성 페닐 환은 메디토프-이용가능한 항체(세툭시맙) Fab의 측쇄 잔기의 극성이 큰 어레이로 둘러싸여 있다 (도 35). 페닐환에 할로겐 원자를 1개 이상 도입시키는 것이 바람직한데, 이 할로겐 원자는 각각, 메디토프-이용가능한 항체의 Tyr87(경쇄), Gln39, 및/또는 Tyr91(중쇄)와의 할로겐 결합을 위한 브롬 원자를 유리하게 배치시키기 위하여 오르토-, 메타- 및/또는 파라-브로코 페닐 치환기를 내포시키는 것과 같이, 할로겐 결합(상대적으로 강력한 비-공유결합, 수소결합과 유사하지만, 브롬 또는 염소와 같은 할로겐 원자가 산소 원자와의 상호반응에 관련됨)에 참여할 수 있다. 3번 위치에서 Phe 대신, 각각, 2-브로모-L-페닐알라닌, 3-브로모-L-페닐알라닌, 및 4-브로모-L-페닐알라닌을 함유하는, 메디토프 36(서열 번호: 36), 37(서열 번호: 37), 및 38(서열 번호: 38)을 생성시켰다. 이들 메디토프는 세툭시맙 Fab와 공-결정화되었다. 이들 상업적으로 입수가능한 유도체를 SPPS에 의해 내포시켰다. 구조는 도 39에 나타나 있다. 회절 데이타는 도 40에 나타나 있다. 이들 메디토프 중 일부의, 세툭시맙 Fab에 대한 친화도 (평균 KD 값)를 SPO로 측정하였으며 하기 표 7에 게시되어 있다.
추가로, Phe3His 돌연변이를 함유하는 메디토프(메디토프 33, 서열 번호: 33)에 대한 구조적 정보를 기초로, 3번 위치에서 β,β'-디페닐알라닌을 갖는 메디토프(메디토프 17, 서열 번호: 17)를 합성하였다. 도 41에 나타낸 바와 같이, 세툭시맙에 대한 결합 친화도에서의 현저한 개선이 SPR에 의해 관찰되었으며, 이는 cQFD와 비교하여 대략 4배 증가하였음을 나타낸다 (대략 4 내지 5의 인수로 친화도가 증가 (대략 200 nM)).
Leu5 및 Leu10의 변형
Leu5 및 Leu10에 대해 변형시켰다. Leu5와 Leu10 측쇄는 메디토프-이용가능한 Fab에 대해 소수성 콘택트를 만드는 것으로 결정되었다 (도 36, 오른쪽 패널; Leu10). 일례로, 천연 아미노산(Phe/Tyr/Trp) 및/또는 비-천연 유사체(예를 들면, β,β'-디페닐알라닌, 분지된 알킬, 나프틸과 같은 연장된 방향족 등)가 SPPS를 통하여 이들 위치중 하나 또는 둘다에서 조직적으로 도입되었다. 3개의 위치에 β,β'-디페닐알라닌을 도입시키면 세툭시맙 Fab에 대한 전체적인 친화도가 상승했다는, 상기 관찰은 메디토프에 그러한 비-천연 아미노산을 도입시킴에 따른 성공을 증명한다. 따라서, β,β'-디페닐알라닌을 5번 위치에 도입시키면 생성된 메디토프(메디토프 18, 서열 번호: 18)의 평균 친화도는 SPR에 의해 687 nM인 것으로 측정되었다(하기, 표 7 참조). 이들 데이타는 잔기의 변경 및 돌연변이용 영역을 확인하기 위한 구조적 생물학을 이용하는 것이 메디토프의 결합 운동역학을 개선시키는 것과 같이, 메디토프의 특성을 변경시키는데 유용하다는 것을 확인시켜준다. 다른 실시양태로, Leu10에 대해서 동일한 변형을 수행할 수 있다.
대안적인 고리화 방법 및 디설파이드 가교의 대체
대안적인 고리화 전략을 사용하여 cQFD 및 다른 메디ㅌ프에 디설파이드 가교를 대체시켰다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 글리신, β-Ala, 7-아미노헵타노산, 디아미노프로피온산, 및 이소아스파르트산을 포함한, 상이한 출발 물질을 기본으로 발생된, 천연 및 비-천연 아미노산을 수반하는 것들을 포함한, 다양한 락탐 고리화 전략을 사용하여 상이한 락탐 환 크기를 생산하였다 (도 31의 왼쪽 및 중앙 박스 참조).
일례로, 원래의 cQFD 메디토프의 디설파이드 가교를 대체시키기 위하여 7-아미노헵타노산을 사용하였으며, 생성된 메디토프의 세툭시맙 Fab 단편에 대한 친화도를 SPR로 측정하였다 (메디토프 42, 서열 번호: 42). SPR 데이타가 도 41의 하부 패널에 제시되어 있다. cQFD와 비교하여 결합 친화도가 감소하였지만, 이들 데이타는 동물 및 인간 연구에서 약동학, 약력학 및 독성과 관련한 잠재적 문제점에 맞추어 메디토프를 변형시킬 수 있음을 나타낸다. 대안적 링커가 메디토프내의 다른 위치에서 비천연 아미노산과 조합될 수 있음을 알아야 한다.
글리신, 7-아미노헵타노산, 이소-아스파르트산, β-알라닌, 및 디아미노프로피온산을 사용하여 락탐 연결기를 갖는 다른 변이체 메디토프를 발생시켰다 (표 4 및 기타의 것에 게시된 메디토프 42, 43, 44, 45, 46, 49, 51, 52, 53, 및 54 참조). 이들 메디토프중 일부의 세툭시맙 Fab에 대한 친화도가 표 7에 게시되어 있다.
아지드 알킨 Huisgen 고리화첨가반응을 사용하여 12번 위치에 프로파르길글리신과 1번 위치에 베타-아지도알라민을 내포시켜 이들 말단 사이에서 고리화를 수행함으로써, 메디토프 50에 연결기로서 트리아졸을 생성시켰다.
'클릭' 화학 및 올레핀 복분해와 같은, 추가적인 고리화 전량이 또한 사용되었다 (도 31, 오른쪽 박스). 예를 들어, 헤드-투-테일 락탐 펩타이드를 디자인하여 Fmoc-Asp (Wang 수지 LL)-Oall로부터 출발하는 고체상 펩타이드 합성법(SPPS)으로 합성하였다 (도 31, 하단 왼족 박스와 도 32). 그러한 변이체중 하나인, FITC 접합부를 갖는 메디토프 32(서열 번호: 32)는 서열 번호: 1의 비변형 메디토프(메디토프 1)와 유사한 방식으로 세툭시맙에 결합하지만, 이와 비교하여 약간 감소된 친화도를 갖는 것으로 나타났다. 생산된 다른 헤드-투-테일 락탐 변이체 메디토프로는 메디토프 33-47, 및 50-54가 있다 (표 4와 7을 참조). 표 4에서 메디토프 48은 디설파이드 연결기와 4:11 락탐 연결기를 갖도록 조작되었다.
FACS 분석을 위하여 메디토프 32에 플루오레세인을 접합시켰다. 다른 예로, 생체내 PET 영상화를 위하여 이 전략을 적용시켜 메디토프와 DOTA를 접합시킨다.
구조적 데이타는 추가의 위치는 잔기 3과 11 또는 4와 11 사이에서의 고리화와 같이, 고리화되기 쉽다는 것을 증명한다.
선형 펩타이드인 메디토프 55를 생산하고 메디토프-이용가능한 항체인 세툭시맙에, 비록 친화도는 감소되었지만, 결합한다는 것을 증명하였다.
수화가능한 카르보닐 작용성
다른 예로, 고도로 선택적이지만 비가역적인 상호반응을 생성시키기 위하여 수화가능한 카르보닐 능력을 갖는 메디토프를 개발한다. 수화가능한-이용가능 메디토프를 사용하여, 상응하는 헤미-아세탈 또는 케탈을 형성시킴으로써, 메디토프 구멍을 둘러싸고 있는 메디토프-이용가능한 항체중 수개의 Fab 히드록실-포함 측쇄를 선택적 트랩핑을 통하여 이용한다. 예를 들어, 메디토프의 Arg8은 Kabat 넘버링에 따라, 메디토프-이용가능한 항체 경쇄(3.5Å)의 Ser43 및 중쇄(3.8 및 4.0Å)의 Tyr91 부근에서 연장된다 (도 36, 왼쪽 패널). 일례로, 메디토프의 Arg8 또는 Leu10의 말단에 수화가능한 카르보닐 작용성을 내포시키면 비가역적 결합을 수득하는데 있어서 필수적인, 세린 또는 티로신 헤미-아세탈이 선택적으로 형성되도록 한다. 다른 예로, 붕산을 함유하는 잔기가 메디토프중으로 수화가능한 카르보닐 기에 대한 대안으로서 통합된다. 붕산은 보르테자밉(Velcade®)의 구조적 활성에 있어서 중요한 역할을 하며, 보르테자밉은 다발성 골수종을 치료하기 위하여 사용된다. 그러한 수화가능한 잔기의 대표적인 예가 도 36 또는 34에 나타나 있으며, 여기서 R = -CH2CHO 또는 -CH2B(OH)2이다. 일부 예에서, 그러한 유사체는 SPPS를 사용하여 변형시킨다(Duggan, P. J. and D. A. Offermann (2007). ?he Preparation of Solid-Supported Peptide Boronic Acids Derived from 4-Borono-L-phenylalanine and their Affinity for Alizarin," Australian Journal of Chemistry, 60(11): 829-834).
다른 방법
일부 예로, 형광 편광 검정법을 사용하여 서열 번호: 1과 같이 제시된 메디토프를 대신할 수 있는 메디토프 변이체를 확인한다. 다른 예로, 동일한 기술을 사용하여 메디토프를 대신할 수 있는 소분자를 확인한 다음 이들 소분자를 주형으로 사용하여 메디토프의 결합 친화도를 추가로 개선한다.
메디토프의 특성화
특성화를 위하여, 변이체 메디토프 펩타이드 동결건조된 분말을 500 ㎕의 10 mM Tris pH 8.0 완충액에 현탁시키고 매회 1ℓ의 H2O로 3회 투석하였다. 투석후 최종 용적을 조심스럽게 측정하고 농도를 평가하기 위하여 흡광도를 측정하여다 (전형적으로 1-10 mM). 이들 스톡 용액을 사용하여 SPR 측정을 위하여 HBS-EP 완충액(10 mM Hepes pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.05% v/v 계면활성제 P20)중에 희석액을 만들었다. SPR 측정은 아민 커플링 화학을 이용하여 고정화시킨 세툭시맙 IgG 또는 세툭시맙 Fab 리간드를 갖는 CM5 칩을 사용하여 GE Biacore T100 장치에서 수행하였다. 리간드는 운동 데이타에 적합한 낮은 수준으로 고정화시켰다. 전형적인 운동 SPR 실험은 수행 및 재생 완충액으로서 HBS-EP를 사용하여 30㎕/분의 유속에서 수행하였다. Biacore T100 평가 소프트웨어 버젼 2.0.1을 사용하여 운동 변수를 계산하였다.
등온 적정 열량측정법 실험을 Nano ITC 열량측정기(TA Instruments)를 사용하여 100 mM Hepes, pH 7.4, 25℃에서 수행하였다. 전형적인 실험에서는, 0.03-0.06 mM의 단백질 (Fab 또는 IgG) 250 ㎕를 열량측정기 셀에 부하하고 (163 ㎕ 또는 185 ㎕), 적정제(메디토프, 0.3-0.8 mM)를 50 ㎕ 시린지에 부하하였다. 셀 용액을 250 rpm에서 교반시키고 평형화 시 적정제를 2-2.5 ㎕ 증분으로 첨가하였다. 반응열을 측정하고 데이타는 NanoAnalize 소프트웨어 (TA Instruments)를 사용하여 프로세싱하였다. 마지막 4회 측정치를 평균화하거나 단백질을 함유하지 않는 완충액중으로 동일한 농도에서의 메디토프의 적정시킴으로써 수득한 열을 뺌으로써 배경열(background heat)을 뺐다.
수많은 메디토프 변이체를 세툭시맙 Fab 단편과 공-결정화시켰다. 메디토프를 >95% 균질성으로 정제하고 질량 분광분석법으로 구조적으로 특성을 규명하였다. 펩타이드를 물에서 투석시켰다. 이들의 농도를 측정하는데, 예를 들어, 어떤 경우에는, UV-Vis로 측정하여 원소 분석에 의해 보정하고, 적절한 완충액으레 희석시켰다 (>100x). 서열 번호: 15-18, 22-25 및 31-40에 상응하는, 이들 메디토프 변이체중 일부의 구조가 도 39에 제시되어 있다.
여러가지 메디토프와 메디토프-이용가능한 항체 세툭시맙과의 상호반응을 X-선 회절법으로 특성화하였다. 세툭시맙 Fab 단편과 서열 번호: 1의 공-결정화 조건이 잘 확립되어 있기 때문에, 회절 품질 결정은 전형적으로 1 내지 3일내, 전형적으로 1일내 수득되었다. 완전한 데이타 세트가 내부 공급원(Rigaku 007-HF 및 R-Axis IV++)을 사용할 경우 8 내지 12시간내에, 그리고 Stanford Synchrotron Radiation Lightsource (이는 메디토프 변이체와 세툭시맙의 상호반응의 신속한 특성화가 가능하도록 한다)에서는 10분 미만으로 수집되었다.
cQFD(서열 번호: 1) 및 cQYN(서열 번호: 2) 메디토프 및 변형된 메디토프를 함유하는 복합체를 포함한, 여러가지 상이한 메디토프-Fab(세툭시맙) 복합체에 대한 회절 데이타를 수집하였다. 수종의 메디토프에 대한 X-선 회절 데이타가 도 40에 제시되어 있다. 대부분의 이들 공-결정 구조는 2.4Å를 넘어서 회절되고 각각 20 및 24% 미만의 R 및 RFree를 갖도록 잘 정제되는 것으로 나타났다. 이들 메디토프 변이체는 모두 매우 양호한 입체화학적 값을 갖는다 (Molprobity scores above 89th percentile).
SPR 측정을 위하여, 저밀도 및 고밀도 칩을 세툭시맙 Fab 또는 전장 IgG와 접합시켰다. EGFR의 전체 세포외 도메인의 가용성 단편(잔기 1-621)을 사용하여 각 칩에 대해 먼저 특성을 규명하였다. 상기 보고된 바와 유사한 운동학 및 결합 친화도가 관찰되었다. 저밀도 칩을 사용하여, 비변형된 메디토프에 대한 온 및 오프-레이트를 측정하였으며 각각, kon = 9.2x10-4 M-1s-1 및 koff = 9.9x10-3 s-1인 것으로 결정되었다. ITC와 일치하는, 서열 번호: 1 및 2의 메디토프의 경우, Fab-접합된 칩과 IgG-접합된 칩에 대한 유사한 값이 수득되었으며, 이는 이들이 결합 평가에 사용될 수 있음을 입증하는 것이다.
하기 표 7에는 평균 해리 상수(KDs)에 대한 정보가 게시되어 있는데, 이는 표 3 및 4에 게시된 수종의 메디토프에 대해 SPR로 측정한 것이다.
[표 7]
SPR로 측정한 해리 상수
Figure pct00018

메디토프-이용가능한 항체 세툭시맙에 대한 수종의 메디토프의 결합을 ITC, SPR, X-선 회절 및 이들의 조합에 의해 엄격하게 특성화하였다. ITC 측정은 측정당 1-2 mg 정도로 적은 양의 펩타이드를 사용하여 TA Instruments nanoITC상에서 수행되었다. ITC, SPR 및 X-선 회절 데이타는 예를 들어, 집합적으로, 후속되는 화학적 변형을 안내하기 위한 원자의 세부사항을 제공하며 궁극적으로 메디토프의 친화도를 개선하고/하거나 메디토프을 달리 변경시킨다. ΔG = -RT ln Ka를 기본으로 한 계산은 세툭시맙에 대한 메디토프의 마이크로몰 및 나노몰 친화도간의 차는 대략 4 kCal/mol인 300K에서의 자유 에너지에서의 변화로부터 발생함을 나타내며, 상기 자유 에너지는 강력한 수소 결합의 순이다. 따라서, 단백질 결합 포켓으로부터 정돈된 물이 소실되거나 아미노산 잔기-쇄의 재배향이 크기 순으로 결합을 변경시키기에 충분할 수 있다.
본 실시예에서의 데이타는 수많은 메디토프 치환이 조직적이고 효율적으로 도입될 수 있으며, 이는 수많은 메디토프 변이체 치환이 발생되면, 예를 들면, 변경된 메디토프-메디토프 이용가능한 항체 결합 친화도, 약동학(PK), 약력한(PD), 독소, 및/또는 pH와 같이 변화되는 조건하에서의 결합 능력 또는 결합 강도, 예를 들어, pH 의존성이 변경되어, 친화도가 높은 메디토프가 생산될 수 있음을 나타낸다.
일례로, ITC, SPR 및 회절 방법에 의한 특성화 후, 최고의 친화도를 갖는 (또는 다른 바람직한 특성, 예를 들면, pH 의존성을 갖는) 메디토프를 후속해서 변형시켜, 예를 들어, 목적하는 특성 (예를 들면, 전체적인 친화도 또는 pH 의존성)을 추가로 개선한다.
실시예 7: 다가 메디토프의 생성
예를 들어, 항원을 발현시키는 세포의 표면에 메디토프-이용가능한 항체를 "가교-결합"시킴으로써 선택도 및/또는 결합 친화도를 증대시키는데 사용하기 위한 2가 및 다른 다가 메디토프를 생성시켰다.
2가 메디토프-Fc
리간드를 '이량화'시키기 위하여 Fc 영역을 사용하는 것은 정립되어 있으며 예를 들면, 하기 문헌: Jazayeri JA & Carroll GJ., ?c-based cytokines: prospects for engineering superior therapeutics,"BioDrugs, 22(1):11-26 (2008)에 기재되어 있다. 2가 메디토프를 발생시키기 위하여, 메디토프 cQFD (서열 번호: 1)를 길이가 17개 아미노산이며, 글리신과 세린으로 이루어져 있는, 가요성 펩타이드 링커를 통하여 IgG의 Fc 영역의 N-말단에 융합시켰다. 상기 링커의 길이는 IgG의 Fabs 사이의 거리에 대략적으로 매치되도록 선택하였다. 생성된 "메디토프-Fc"의 핵산 및 아미노산 서열이 도 15에 나타나 있다 (각각, 서열 번호: 3 및 4). 메디토프-Fc의 구조는 도 16에 나타나 있다.
다가의 메디토프-Fc에 의해 수득되는 항원에 대해 증대된 결합을 증명하기 위하여, 0.5 x 106 개의 MDA-MB-468 세포를 10 nM 세툭시맙으로 30분간 실온에서 표지시키고, 세척한 다음, 0.1, 0.3, 1 및 3 μM의 2가 메디토프-Fc 또는 단합체 메디토프와 함께 30분간 실온에서 배양시켜, 세척하고, 이어서 FACS로 분석하였다. 도 17에 나타낸 바와 같이, FACS 분석은 메디토프-Fc가 화학양론에 대해 수정되고, 세툭시맙으로 미리-처리된 세포에 메디토프 모노머와 비교하여 더 높은 친화도로 결합되어 있음을 증명한다. 상호반응은 메디토프-이용가능한 mAb(세툭시맙)에 대해 특이적인 것으로 증명되었다. 이들 데이타는 메디토프 이용가능한 mAb와 조합하여, 메디토프-Fc를 사용함에 따른 시너지(synergy)를 증명하며, 따라서, 제2의 항체 대신 2가 메디토프로 치환시켜 시너지 효과를 생산할 수 있음을 증명한다.
다른 연구에서는, 메디토프-Fc 융합 단백질을 상기한 바와 같이 Alexa488로 표지시켰다. MDA-MB-468 세포를 세툭시맙 또는 M425 (뮤린 항-EGFR 항체)로 30분간 표지시켰다. 미결합 항체는 세척하고 세포를 메디토프-Fc (600 nM, 180 nM, 또는 60 nM)와 함께 30분간 배양시켰다. 항체 결합과 메디토프 결합을 FACS 분석법으로 분석하였다. 도 49에 나타낸 FACS 데이타는 메디토프-Fc가 더 높은 농도의 메디토프-Fc에서 시그날이 증가하면서, 세툭시맙과 배양시킨 세포에 결합하지만, M425와 배양시킨 세포 또는 임의의 항체와 배양시키지 않은 것들에는 결합하지 않음을 증명한다.
상기 기재된 FACS 실험과 유사하게, MDA-MB-468 세포를 Alexa 555-표지화된 세툭시맙으로 처리하고, 세척하여, Alexa 488-표지화된 메디토프-Fc와 함께 배양시키고, 세척하였다. 이어서, 세포를 20Xby 현미경에서 영상화하였다 (도 61A). 세툭시맙의 강력한 표면-관련 염색이 관찰되었다. 메디토프-FC가 또한 세포 표면에 편재되었으며 세툭시맙과 공-편재화(co-localize)되는 것으로 나타났다 (도 61A). 상기 염색과 부수적으로, 본 발명자들은 표지화된 메디토프-Fc의 공-편재화를 관찰하였다 (도 61A, 흰색 화살표). 그러나, 이런 공-평재화가 세툭시맙으로 미리-처리되지 않은 세포에는 없었다 (도 61B).
함께 고려할 때, 이들 실험은 메디토프가 세툭시맙으로 미리-처리한 EGFR-발현 세포에 결합하며, 다가 스캐폴드를 사용함으로써 세툭시맙 미리-처리된 세포에 대해 더 높은 분명한 친화도가 생성되며, 본 연구에서, 상기 분명한 결합 친화도는 더욱 민감하였다.
메디토프-이용가능한 항체와 함께 세포 사멸을 유발하는 2가 메디토프-Fc의 능력을 MTT 검정법을 사용하여 확인하였다. 4000개의 MDA-MB-468 세포를 96개 웰 플레이트의 각 웰의 80 ㎕의 배지에 넣었다. 1 μM 세툭시맙 10 ㎕를 0.1, 1 또는 10 μM의 1가 메디토프(cQFD-(대조군)) 또는 2가 메디토프-Fc(2개의 cQFDs) 10 ㎕와 함께 0.1 μM 세툭시맙 및 0.01, 0.1 및 1 μM 메디토프 또는 메디토프-Fc의 최종 농도로 첨가하였다. 각 성분을 또한 단독으로 대조군으로서 PBS와 함께 첨가하였다. 48-시간 배양시킨 후, 10 ㎕의 MTT 시약을 첨가하고 다시 4시간 동안 배양시켰다. 이어서 컬쳐 상등액을 제거하고, 100 ㎕의 MTT 결정 용해 시약을 가하여, 플레이트를 630 nm에서 판독하였다. 1가 메디토프(단독 또는 세툭시맙과 함께), 또는 메디토프-Fc 단독 첨가 어느것도 세포 성장을 유의적으로 변경시키지 못했다. 그러나, 도 28A에 나타낸 바와 같이, 메디토프-Fc를 세툭시맙과 함께 첨가할 때 세포 성장이 억제되었다.
제2의 항-EGFR 항체에 필적할 정도로 세툭시맙에 의한 세포 사멸을 증대시키는, 다가 메디토프-Fc의 능력은 MTT 검정법에 의해 증명되었다. 상기 검정을 메디토프-Fc 및 M425 (마우스 항-EGFR 항체)에 의한 항원-발현 종양 세포 정장의 세툭시맙-매개된 억제의 증대와 비교하였다. 4000개의 MDA-MB-468 세포를 96개 웰 플레이트의 각 웰의 80 ㎕의 배지에 넣었다. 1 μM 세툭시맙 10 ㎕를 2, 4 또는 8 μM의 메디토프-Fc 또는 M425 10 ㎕와 함께, 0.1 μM 세툭시맙 및 0.2, 0.4 및 0.8 μM 메디토프-Fc 또는 M425의 최종 농도로 첨가하였다. PBS와 함께 단독으로 첨가되는 세툭시맙이 대조군으로 사용되었다. 48-시간 배양 기간 후, 10 ㎕의 MTT 시약을 첨가하고 추가로 4시간 동안 배양시켰다. 이어서 컬쳐 상등액을 제거하고, 100 ㎕의 MTT 결정 용해 시약을 가하여, 플레이트를 630 nm에서 판독하였다. 도 28B에 나타낸 바와 같이, 메디토프-Fc와 425는 유사한 정도로 세툭시맙의 세포-사멸 능력을 증대시켰다.
일부 예로, Fc와 메디토프의 조성 및 이들간의 거리는 친화도와 특이성을 최적화시키기 위하여 체계적으로 탐구한다. 일례로, 각각의 천연 또는 비천연 잔기를 링커내의 임의의 잔기에서 최적화를 위하여 치환시킨다. 다른 예로, 링커를 '경질화'시켜 회전 반경을 제한하고 Fc-메디토프의 친화도와 특이성을 증대시킨다. 일례에서, 코일형 코일 도메인을 메디토프와 Fc 사이에 배치한다 (도 18). 다른 예에서는, 불활성 단백질 도메인 (예를 들면, 면역글로불린 폴드)을 링커 대신 치환시킨다. 일례에서, 다수의 면역글로불린 폴드를 메디토프와 Fc 도메인 사이에 배치한다. 특정 예에서는, 예를 들어, 잠재적 항원성을 완화시키기 위하여 링커의 조성이 인간 기원의 것이다.
다가 스캐폴드
링커상의 수용체 제약에 맞추어, 메디토프를 다가 스캐폴드에 커플링시켰다.
다가 메디토프를 인접하고 있는 IgGs에 "래치-온(latch-on)"되도록 디자인하여 "데이지-체인" 유사 배열을 형성시켰다 (도 8 참조). FITC-표지화된 2가 메디토프의 합성법은 화합물 2(서열 번호: 32)를 사용하는, "클릭(Click)" 화학을 이용하여 개발되었다. 도 13의 주형 4와 5를 사용하여 각각 2가- 및 3가 메디토프를 형성시켰다. 30Å PEG 2작용성 암(arm)을 서열 번호: 32의 메디토프(메디토프 32), 즉, 도 13에 나타낸 화합물 13을 함유하는 FITC-표지화된 2가 메디토프의 합성에 포함시켰다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 3가 메디토프(화합물 14)도 성공적으로 합성되었다. 도 14는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-표지화된 메디토프 화합물 13의 특성화를 설명한다.
다른 예에서는, 예를 들어, 결합을 최적화하기 위하여, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(및 기타) 링커의 길이를 달리 하면서 사용한다. 다른 예에서는, 상기 합성 방식을 사용하여 방사성핵종 영상화를 위하여 DOTA를 내포시킨다. IgG내의 CDR 영역간의 거리는 대략 130Å이다. 상업적으로 입수가능한 PEGs의 말단-대-말단 거리는 90Å(Pierce)로 확장되며, 이는 IgG 거리를 초과할 것이다. 일례로, PEG 링커의 길이는 이런 제약을 염두에 두고 체계적으로 변화시킨다.
일부 예로, 3가 또는 더 높은 원자가의 스캐폴드를 사용하는데, "데이지 체인된" 항체를 1개 이상 갖도록 하는 것이 목표이다. 일부 예에서는, 상이한 스캐폴드와 링커를 사용하여 친화도가 높은 다가 메디토프를 발생시킨다. 일례로, DNA가 더욱 경질인 스캐폴드로 사용된다.
다가를 성취하기 위하여 생물학적 및 화학적 기원이 다른 스캐폴드가 또한 사용된다. 이는, 비제한적으로, 스트렙트아비딘 또는 콜라겐(http://ip.com/patapp/EP2065402A1), 4가 스캐폴드로서 스트레파비딘, 독특한 스캐폴드(http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022283611000283), Origami DNA(http://www.nature.com/nnano/journal/v4/n4/abs/nnano.2009.5.html) 등을 사용하여, 2가 또는 3가 스캐폴드를 작제하는 것을 포함한다. 비제한적으로, DNA(단일사, 이중체, 홀리데이 정션(Holliday junctions), 압타머 등), RNA (단일사, 헤어핀, 스템 루프, 압타머 등), PNA (펩타이드 핵산), 경질성을 위한 DNA/PNA 이중체 및 삼중체, 무기 또는 유기 나노입자 (직접 커플링되거나 PEG와 같은 유기 폴리머를 통하여 커플링된다), 자체적으로 및/또는 DNA 또는 PNA와 이중체를 형성할 수 있는 유기 폴리머을 포함한, 분자를 사용하여 화학적 스캐폴드도 생성시킬 수 있다.
다가 메디토프 특성화
일례로, SPR 및 ITC에 의해 다가 메디토프의 특성을 규명하여 다가 스캐폴드에 접합시키는 것이 메디토프-IgG 상호반응에 영향을 주지 않음을 증명한다.
다른 예로, FACS 분석, 세포 생존성 검정법, 및 기타 검정법을 사용한다. 예를 들어, 메디토프-이용가능한 항체가 세툭시맙일 때 EGFR과 같이 선택된 메디토프-이용가능한 항체에 의해 인식되는 항원을 과발현시키는 세포에 대한 다가 메디토프의 직접적인 효과를 정량하기 위하여 세포 생존성 검정법을 메디토프-Fc에 대해 상기 설명된 바와 같이 사용한다. 예를 들어, MTT, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드를 사용하여 생존성 세포의 수 또는 퍼센트를 정량한다. 일부 예에서는, 상응하는 1가 메디토프에 대해 관찰된 것보다 훨씬 더 낮은 농도에서 이동 및/또는 이동하는 세포의 퍼세트에서의 상대적 증가가 관찰된다.
일부 예에서, 그러한 검정에서 활성이 증명된 다가 메디토프에 대해, 웨스턴 블롯(Western blot) 분석을 수행하여 세툭시맙과 같이, EGFR 신호전달 경로를 표적으로 하는 항체의 경우 EGFR, AKT, 및 MAPK의 포스포릴화 상태와 같은, 다른 변수를 추적한다. 일례로, 상기 데이타를 항체 (예를 들면, 세툭시맙)-만으로 처리된 세포 및 억제제 (예를 들면, 티로신 키나제 억제제(AG1478))로 처리된 세포로부터의 데이타와 비교한다. 다가 메디토프 농도의 함수로서 세포 사멸에서의 증가가 관찰된다.
일례로, 다가 메디토프의 부가적 효과를 추가로 확인하기 위하여, 비-표지화된, 1가 메디토프를 사용하여 항원-결합된 세툭시맙에 대해 표지화된 다가 메디토프와 경쟁시킨다.
실시예 8: pH의 함수로서 메디토프 결합 친화도
pH의 함수로서 결합 친화도에 영향을 주도록 메디토프의 조성을 변경시켰다. 도 27에 나타낸 바와 같이, 3종의 상이한 메디토프 변이체의 결합 친화도를 완충액 pH의 함수로 측정하였다. 결과는 cQYD (서열 번호: 16, 메디토프 16) 메디토프 변이체가 더 낮은 pH에서 메디토프-이용가능한 항체 세툭시맙에 대한 친화도에서 현저한 감소가 나타났다. cQYN 변이체에서 아스파르테이트를 아스파라긴으로 치환시키면 편평한 pH 의존성이 생성되었다. cQFD 메디토프 (서열 번호: 1)의 친화도는 더 높은 pHs에서 약간 더 커지는 것으로 측정되었다. 총체적으로, 이들 데이타는 메디토프-memAb 상호반응의 친화도가 pH에 조절될 수 있음을 증명하며, 이를 이용하여, 예를 들면, 약물 전달용 라이조자임에서와 같이 낮은 pH에서의 특이적 방출을 위한 메디토프 변이체를 생성시키고/시키거나 저산소 환경, 예를 들어, 종양 간질에서 더 높은 친화도로 결합할 수 있도록 한다.
실시예 9: 메디토프 유사체, 단편, 및 기타 화합물
메디토프 유사체와, 소분자, 단편, 압타머, 핵산 분자, 펩티바디 및/또는 메디토프-이용가능한 항체 부근 메디토프-결합 부위에 결합하며 일부 양태에서 메디토프에 연결되어, 예를 들어 메디토프-결합 부위에 대한 이들의 친화도를 증진시킬 수 있는 기타 물질을 확인하기 위한 선별법을 수행하였다.
형광 편광 검정법: 메디토프-이용가능한 항체의 메디토프 결합 부위에 결합할 수 있어 유사한 기능을 위하여 사용될 수 있는 대안적 분자를 포함한, 화합물을 확인하기 위하여, 대체 검정법(displacement assay)을 확립하였다. 환형 메디토프를 합성하고 플루오레세인에 화학적으로 부착시켜, 다음과 같은 서열을 갖는 플루오레세인-표지화된 메디토프: AcCQFDLSTRRLRCGGGSK (서열 번호: 31, 디설파이드 연결기로부터의 시스테인)-플루오레세인을 생성시켰다. 이어서 상기 플루오레세인으로 표지화된 펩타이드를 세툭시맙으로 적정하고 형광 편광을 측정하였다. 표지화된 메디토프와 mAb 사이의 상호반응은 형광 tag의 형광 편광/강도에 변화를 일으킨다. 해리 상수 1 μM은 표면 플라즈몬 공명 및 등온 적정 열량측정법으로부터 수득한 값과 밀접하게 매치되었다. 비-표지화된 메디토프, AcCQFDLSTRRLRCGGGSK (서열 번호: 31)를 사용하여 세툭시맙에 미리-결합된 플루오레세인-표지 펩타이드를 대체시켰다. 형광 편광을 모니터하였다. 메디토프-항체 상호반응을 차단했던 화합물은 형광 편광 특성이 변경되었다. 도 37에 나타낸 바와 같이, 경쟁 반응의 시그모이드형 곡선 지표가 관찰되었다. 따라서, 이 방법은 메디토프 유사체를 확인하는데 유용하다.
이들 데이타를 기초로 하여, 메디토프를 대체할 수 있는 소분자를 확인하기 위한 초기 선별을 수행하였다. 이 연구에서는, 30,000개의 소분자 화합물의 라이브러리로부터 50 μM의 농도에서 42개의 선두 화합물이 확인되었다. 도 38에는 그러한 선두 화합물 5종이 나타나 있다.
다른 실시예에서는, 이들 화합물을 예를 들면, 결정학에 의해 추가로 특성화한다.
회절법. 세툭시맙 Fab는 상기 나타낸 바와 같이, 2.5Å을 넘어서 회절되는 것으로 나타났다. 확립되어 있는 회절-기본 방법(선두 화합물을 확인하기 위하여 잘-확립되어 있음(Shuker et al. 1996; Erlanson et al. 2001; Hughes et al. 2011))을 이용하여 메디토프에 커플링되어, 예를 들면, 메디토프 결합 부위에 대한 친화도를 증진시킬 수 있는 화합물을 포함한, 후보 화합물을 확인하였다. 소분자의 라이브러리를 개발하여 세툭시맙의 결정에 흡수(soaking)시켰다. 이들 흡수체(soaks)로부터의 회절 데이타를 수집하고 수개의 데이타 세트를 분석하였다. 이들 초기 연구에서, 단편 성장 및 최적화에 잘맞는 2개의 추가 부위가 세툭시맙상에서 확인되었다.
다른 실시예에서, 그러한 단편(더 큰 것에 대한 빌딩 블럭으로 제공될 수 있는 소분자), 그러한 화학 기, 예를 들면, 이미다졸 또는 기타 화학 기를 성장시켜(화학적으로 유도체화하여) 이들의 결합 및 특이성을 증진시키고/시키거나 메디토프에 화학적으로 테더링시킨다. 이런 화학적 커플링의 최적화는 전체적인 결합 친화도를 크게 증진시킬 수 있다.
NMR 선별법: NMR을 이용하여 예를 들어, 메디토프에 대한 연결기에 의해서, 메디토프의 최적화용 및/또는 메디토프 대신 사용되는 (즉, 메디토프 유사체로서) 단편을 확인하였다. 이들 선두 화합물을 확인하기 위하여, 15 내지 20개의 단편을 함유하는 풀(pools)의 1차원(1D) 스펙트럼을 수집하였다. 세툭시맙을 각각의 풀에 첨가하고 제2의 1D 스펙트럼을 수집하였다. 세툭시맙과 (일시적으로) 결합한 화합물은 신속한 자화 전이(magnetization transfer)를 수행하여 강도를 소실하였다. 세툭시맙의 첨가전 및 후의 상기 스펙트럼을 비교하였더니 변경된 피크가 확인되었으며, 이는 상호반응을 표시하는 것이다.
하나의 실시예에서, 이들 피크를 특정 화합물에 미리-부여하고, 이에 따라 즉시 공지된다. 달리, 풀을 나누고 스펙트럼을 다시 수집한다. 몇회 수행 후, 화합물의 정확한 정체성이 알려진다. 이들 실험에서, 상호반응의 정확한 위치는 알려지지 않는다. NMR 또는 형광 편광 검정법으로 결합 부위가 결정된다. 달리, Fab 단편은 NMR 활성 및 불활성 핵종(예를 들면, 13C, 15N 및 2H)로 표지시킨 다음, NMR 실험을 여러번 수행하여 스펙트럼을 부여하고, 단편 라이브러리를 사용하여 결합 위치를 확인한다. 이 공정을 사용하여, 초기의 선두 화합물 세트가 확인되었다 (도 19, 하단).
가상 리간드 선별법: 가상 리간드 선별법을 이용하여 메디토프로 작용하는 선두 화합물을 확인하였다. 결정 구조를 이용하여, 거대분자의 "박스" 근처 부위(메디토프 결합 부위)를 구획하기 위하여 표준 프로그램 (예를 들면, Schroerdinger Glide)을 사용하였다; 공지의 리간드는 상기 부위에 도킹된다. 선택 에너지 함수에 의해 잠재적 선두 화합물에 점수를 매겼다. 이 연구에서는, 대략 100종의 선두 화합물이 확인되었다.
다른 실시예에서는, 회절법에 의해 밝혀진 추가적인 유사체를 최적화하여 약물 운반, 다가 스캐폴딩 및 다른 기능을 위하여 메디토프 대신 사용한다.
다른 실시예에서는, 경쇄 및 중쇄에서 돌연변이를 일으켜 리간드(메디토프)의 특이성을 변화시키며 상기 기재된 모든 방법 (형광 편광, NMR 선별법, 파아지 디스플레이, 및 회절법을 포함)을 사용하여 대안적인 리간드를 최적화한다.
실시예 10: 메디토프-단백질 L 융합체
메디토프에 결합된 cQFD 메디토프-이용가능한 Fab 단편의 회절에 의한 특성화로 메디토프의 N- 및 C-말단이 인간 IgGs에 결합하는 세균 단백질인, 결합된 단백질 L의 위치 바로 옆에 위치하는 것이 증명되었다. 메디토프 18(5-β,β'-디페닐), 단백질 L(왼쪽), 단백질 A(오른쪽) 및 Fab(회색 카툰) 및 메디토프-이용가능한 트라스투주맙 Fab의 결정 구조를 보여주는 도 52를 참조한다.
에너지 가성성(additivity)을 통하여 더 큰 친화도를 갖고 메디토프-이용가능한 항체에 결합하는 메디토프를 발생시키기 위하여, 메디토프-단백질 L 융합 폴리펩타이드를 생산하였다. 구조적 데이타 정보를 기초로, 4개의 글리신을 도입시켜 cQFD 메디토프의 C-말단과 단백질 L의 N-말단을 연결하였다. 메디토프-단백질 L 융합 단백질의 암호화 서열이 서열 번호: 56에 기재되어 있다.
His6-Smt3 tag(플레인 텍스트), 메디토프(밑줄친 것), 및 단백질 L(진한색)을 포함한, 암호화된 단백질의 아미노산 서열이 하기 서열 번호: 57에 기재되어 있다:
HHHHHHSSGLVPRGSHMASMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGSCQFDLSTRRLKCGGGGSEVTIKVNLIFADGKIQTAEFKGTFEEATAEAYRYAALLAKVNGEYTADLEDGGNHMNIKFAG (서열 번호: 57)
tag를 절단한 후의, 메디토프-단백질 L 융합 단백질의 아미노산 서열이 하기 서열 번호: 58에 기재되어 있다 (밑줄친 메디토프; 진한 글씨로 기재되는 (예를 들어, 과산화물에 의해 또는 공기와 함께 일야(overnight)시켜)고리화되는 2개의 시스테인):
S C QFDLSTRRLK C GGGGSEVTIKVNLIFADGKIQTAEFKGTFEEATAEAYRYAALLAKVNGEYTADLEDGGNHMNIKFAG (서열 번호: 58).
상기 융합 단백질과 메디토프-이용가능한 항체 트라스투주맙과의 상호반응 (및 별도로, 각각의 개별적 성분의 상호반응)에 대한 결합 상수는 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정하였다. 단백질 L과 메디토프-이용가능한 트라스투주맙 간의 상호반응에 대한 결합 상수는 대략 0.5 μM이었다. 메디토프와 메디토프-이용가능한 트라스투주맙 Fab 단편간의 상호반응의 경우, 대략 1 μM이었다. 그러나, 메디토프-단백질 L 융합 단백질과 IgG간의 상호반응에 대한 결합 상수는 165 pM이었다. 도 53에는 메디토프-단백질 L 융합체(MPL)에 대한 표면 플라즈몬 공명(SPR) 데이타가 제시되어 있다: 상부 패널은 10 nM 까지의 농도로 메디토프-이용가능한 트라스투주맙에 첨가되는 MPL의 트레이스를 보여준다. 핏(fit) 데이타는 165 pM의 결합 친화도를 표시한다. 하부 패널은 동일한 농도로 메디토프-이용가능한 트라스투맙에 첨가된 단백질 L(단독)의 트레이스를 보여주는데, 이 연구에서 상기 농도에서는 결합이 없음을 나타낸다. 이 결과는 개별적 상호반응과 비교하여 융합 단백질과 메디토프-이용가능한 항체간에 훨씬 더 강한 결합을 증명하며, 이는 가성성을 통하여 개선된 친화도를 표시한다.
특이성을 확실히 하기 위하여 단백질 L과 메디토프에 점 돌연변이를 생성시켰다. 기대했던 대로, 결합 상수가 감소되었다.
치료 및 진단제, 예를 들면, 세포독소, 방사성핵종, 예로서, DOTA, 단백질, 고체 지지체, 및 예를 들어, 약물 운반, 영상화, 또는 정제를 위한 기타 분자와 같은, 다양한 분자의 접합이 용이하도록, 단백질 L-메디토프 융합 단백질중의 모든 리신 중 하나를 아르기닌 또는 다른 잔기로 돌연변이시켰다. 도 52에 나타낸 결정 구조를 이용하여 단백질 L 및 접합되었을 경우, 메디토프-단백질 L/메디토프-이용가능한 항체 상호반응을 입체적으로 배제시키는 메디토프상의 모든 리신을 확인하였다. 이런 정보를 기초로 하여, 서열 번호: 59
(SCQFDLSTRRLRCGGGGSEVTIRVNLIFADGNIQTAEFRGTFEEATAEAYRYAALLARVNGEYTADLEDGGNHMNIKFAG)
에 기재된 서열을 갖는 메디토프-단백질 L 융합체(MPL)를 생산하였으며, 여기서 단백질 L/메디토프상의 특정 리신(도 52에서 검정색으로 나타낸 것 - 모두가 아니라 1개의 리신)이 Arg 또는 Asn으로 돌연변이되어 있다. 상기 나타낸 서열에서, 리신으로부터 아르기닌/아스파라긴으로 돌연변이된 잔기를 진한 글씰 나타낸다. 돌연변이되지 않은 리신(상기 밑줄친 것)은 용매로 향하게 된다. 따라서, 생성된 메디토프-단백질 L 융합 단백질에서, N-말단 아민과 엡실론 아민은 접합용으로 남겨지며, 엡실론 아민은 용매에 노출되어 더욱 반응성이 될 것같다.
다른 실시예에서는, 상기 돌연변이체중의 독특한 리신 잔기를 사용하여 예를 들면, 잠재적 항원성에 맞추기 위한, 상기 MPL을 PEG화시킨다.
MPL-DOTA-NHS 접합체
서열 번호: 59에 기재된 서열을 갖는 MPL은 다양한 비율 (0.5:1, 2:1, 10:1, 30:1, 60:1, 120:1, 240:1)의 출발 물질(DOTA-NHS:MPL)로 인산염 완충액(80 mM)중에서 10분간 pH=10 (이는 N-말단 접합과 비교하여 리신으로의 접합에 유리하다)에서 수행되는 반응에서 DOTA-NHS에 접합시켰다. DOTA-NHS가 증가함에 따라 모노-DOTA-접합체 생성물이 증가한다. 60:1 비율에서 현저한 양의 MPL-모노-DOTA-MPL이 형성되었으며, 120:1 비율에서 MPL-모노-DOTA와 MPL-디-DOTA 둘다 현저항 양으로 형성되었다 (도 60).
전술한 본 발명의 실시예 및 방법은 오직 예시적이며 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하고자 함이 아니다. 당해 분야의 당업자는 상기의 다양한 변형이 본 발명의 의도된 범주내에 있음을 인지할 것이다.
참고문헌:
하기 및 상기 본 명세서에서 인용되는 모든 참고문헌은 본 명세서에서 전부 기재되는 것과 같이, 이들 전문이 참고문헌으로 본 발명에 포함된다.
Figure pct00019

Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
SEQUENCE LISTING <110> CITY OF HOPE WILLIAMS, John C. HORNE, David A. MA, Yuelong CHANG, Heng Wei DONALDSON, Joshua Michael ZER, Cindy BZYMEK, Krzysztof AVERY, Kendra Nicole XIE, Jun <120> MEDITOPES AND MEDITOPE-BINDING ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 54435.8081.WO01 <140> Not Yet Assigned <141> 2012-04-10 <150> US 13/270,207 <151> 2011-10-10 <150> PCT/US11/55656 <151> 2011-10-10 <150> US 61/597,708 <151> 2012-02-10 <160> 170 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed peptide <400> 1 Cys Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys Cys 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed peptide <400> 2 Cys Gln Tyr Asn Leu Ser Ser Arg Ala Leu Lys Cys 1 5 10 <210> 3 <211> 747 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed peptide-Fc fusion protein <400> 3 gggggctccg gttcaggctc gggcggttca tcgggaggag ggggagggga acctaagtca 60 tgcgataaga cgcacacctg tcctccatgc ccagcccccg agttgcttgg tgggccctca 120 gtattcctct 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Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 35 40 45 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 50 55 60 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 65 70 75 80 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 85 90 95 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 100 105 110 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 115 120 125 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 130 135 140 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 145 150 155 160 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 165 170 175 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 180 185 190 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 195 200 205 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 210 215 220 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 225 230 235 240 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 245 250 255 Leu Ser Pro Gly Lys 260 <210> 5 <211> 1410 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atgaaatgct cgtgggtgat ctttttcctt atggcggtag taaccggagt aaactccgag 60 gtccagctcg tcgaatccgg tggcggcttg gtgcagccgg gtgggtcgtt gcgactgtcg 120 tgcgcagcgt cggggtttaa catcaaagac acctatatcc actgggtgag gcaatcgccc 180 ggaaaggggc tcgaatgggt agccagaatc taccctacga atggttatac tcgatatgcg 240 gactccgtga aaggaagatt caccatcagc gcagatacgt ccaaaaacac tgcatacctc 300 cagatgaata gccttcgggc ggaggacacg gcgatctact actgtagccg gtggggtggg 360 gacgggttct atgcgatgga ctactgggga caggggacgc ttgtaacggt cagctcggcg 420 tcaacaaagg gacctagcgt gtttcccttg gctccctcat cgaaatcaac gtccggtggg 480 acggcggcat tggggtgtct tgtcaaggac tatttccccg agcccgtgac agtctcgtgg 540 aactcgggtg cccttacaag cggcgtacat acgtttcccg ccgtgctcca atcatccgga 600 ctgtattccc tttcatccgt cgtgactgtg ccgtcctcgt cactcggaac gcaaacttac 660 atttgcaatg tcaaccacaa accgtcaaat acaaaggtcg ataagaaggt cgagccaaag 720 tcgtgtgata agacccacac 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Ile His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 180 <210> 7 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 180 <210> 8 <211> 705 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 atggagacag acacgctttt gctttgggtg ttgttgttgt gggtccccgg ttcgacgggg 60 gatattcaga tgacccagtc accgatcctt ctctcggcga gcgtggggga tagagtaacg 120 atcacgtgta gagcgtccca agacgtcaac acagctgtcg cgtggtatca gcagcggaca 180 aatggatcgc cgaggctcct gatctacagc gcatcatttc tctattcggg agtcccctcc 240 cgattttccg gatcgcgcag cggtactgac ttcaccctca cgatttcctc ccttcaaccg 300 gaagatatcg ctgattacta ctgtcagcag cactatacaa cacctcccac tttcggagca 360 gggacaaaag tggagattaa gcgcactgta gcagccccct cggtctttat cttccctcct 420 agcgacgaac aattgaagtc agggaccgcc tcggtggtat gcctgcttaa caacttttac 480 ccacgggaag ccaaagtaca gtggaaggtg gataatgcgc tccagagcgg aaactcccaa 540 gagagcgtga cagaacagga ctcgaaggat tcgacgtact cactcagctc aacgctgacc 600 ctgtcgaaag cggactatga gaaacacaag gtctacgcgt gcgaggtgac ccatcagggc 660 ctgagctccc ccgtaactaa gtcattcaac cggggtgaat gctaa 705 <210> 9 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ile Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 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aaagggcaac cccgcgagcc gcaagtatac 1140 accctcccac cctcgcgcga tgaactgacc aagaaccagg tgtcattgac gtgtctcgtc 1200 aagggcttct atccgagcga cattgcagta gaatgggaaa gcaacggaca gccggaaaac 1260 aactacaaga ctacaccgcc tgtccttgat tcggatggtt ccttctttct ttactcaaaa 1320 cttacagtcg acaaatcgag gtggcagcag ggaaatgtgt tttcgtgcag cgtgatgcac 1380 gaggccttgc ataatcacta tacacagaag tcgttgtcac tgtcgccggg aaagtaatga 1440 <210> 12 <211> 477 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ser Leu Gly Lys Leu Ala Ala Thr Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe 1 5 10 15 Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Val 20 25 30 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 35 40 45 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val 50 55 60 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro 65 70 75 80 Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 85 90 95 Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 100 105 110 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 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cagcagaagc caggaaaagc gccgaagctc ctgatctaca gcgcatcatt 240 tctctattcg ggagtcccct cccgattttc cggatcgcgc agcggtactg acttcaccct 300 cacgatttcc tcccttcaac cggaagattt tgctacttac tactgtcagc agcactatac 360 aacacctccc actttcggac aggggacaaa agtggagatt aagcggaccg tagcagcccc 420 ctcggtcttt atcttccctc ctagcgacga acaattgaag tcagggaccg cctcggtggt 480 atgcctgctt aacaactttt acccacggga agccaaagta cagtggaagg tggataatgc 540 gctccagagc ggaaactccc aagagagcgt gacagaacag gactcgaagg attcgacgta 600 ctcactcagc tcaacgctga ccctgtcgaa agcggactat gagaaacaca aggtctacgc 660 gtgcgaggtg acccatcagg gcctgagctc ccccgtaact aagtcattca accggggtga 720 atgctaatga 730 <210> 14 <211> 240 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gly Lys Leu Ala Ala Thr Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val 1 5 10 15 Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln 20 25 30 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 35 40 45 Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Lys 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synthetically constructed peptide <220> <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = 7-aminoheptanoic acid <400> 42 Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys Xaa 1 5 10 <210> 43 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed peptide <220> <221> VARIANT <222> 1, 12 <223> Xaa = beta-alanine <400> 43 Xaa Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys Xaa 1 5 10 <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed peptide <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = diaminopropionic acid <220> <221> VARIANT <222> 12 <223> Xaa = iso-aspartic acid <400> 44 Xaa Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys Xaa 1 5 10 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed peptide <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = beta-alanine <220> <221> VARIANT <222> 12 <223> Xaa = iso-aspartic acid <400> 45 Xaa Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys Xaa 1 5 10 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed peptide <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = diaminoproprionic acid <220> <221> VARIANT <222> 12 <223> Xaa = beta-alanine <400> 46 Xaa Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys Xaa 1 5 10 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed peptide <400> 47 Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys 1 5 <210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed peptide <400> 48 Cys Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys Cys 1 5 10 <210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed peptide <220> <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = 7-aminoheptanoic acid <400> 49 Gln Tyr Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys Xaa 1 5 10 <210> 50 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed peptide <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = beta-Azidoalanine <220> <221> VARIANT <222> 12 <223> Xaa = propargylglycine <400> 50 Xaa Gln Phe Asp Leu 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VARIANT <222> 7 <223> Xaa = n-butyl-arginine <220> <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa = 7-aminoheptanoic acid <400> 54 Gln Phe Asp Leu Ser Thr Xaa Arg Leu Lys Xaa 1 5 10 <210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed peptide <400> 55 Ser Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys Ser 1 5 10 <210> 56 <211> 594 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed SMT3-peptide-Protein L fusion <400> 56 catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgcg gcagccatat ggctagcatg 60 tcggactcag aagtcaatca agaagctaag ccagaggtca agccagaagt caagcctgag 120 actcacatca atttaaaggt gtccgatgga tcttcagaga tcttcttcaa gatcaaaaag 180 accactcctt taagaaggct gatggaagcg ttcgctaaaa gacagggtaa ggaaatggac 240 tccttaagat tcttgtacga cggtattaga attcaagctg atcagacccc tgaagatttg 300 gacatggagg ataacgatat tattgaggct cacagagaac agattggtgg atcctgccag 360 tttgatctga gcacccgccg tctgaaatgc ggtggcggtg gatccgaagt taccatcaaa 420 gtcaacctga ttttcgcaga cggcaaaatc cagacggctg aatttaaagg cacgttcgaa 480 gaagctacgg cggaagcata tcgttacgcg gccctgctgg cgaaagtgaa cggcgaatac 540 acggcagacc tggaagacgg cggcaatcac atgaacatca aattcgctgg ctaa 594 <210> 57 <211> 197 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed His6-SMT3-peptide-Protein L fusion <400> 57 His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His 1 5 10 15 Met Ala Ser Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu 20 25 30 Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser 35 40 45 Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu 50 55 60 Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp 65 70 75 80 Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr 85 90 95 Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg 100 105 110 Glu Gln Ile Gly Gly Ser Cys Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu 115 120 125 Lys Cys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Thr Ile Lys Val Asn Leu Ile 130 135 140 Phe Ala Asp Gly Lys Ile Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu 145 150 155 160 Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Ala Leu Leu Ala Lys Val 165 170 175 Asn Gly Glu Tyr Thr Ala Asp Leu Glu Asp Gly Gly Asn His Met Asn 180 185 190 Ile Lys Phe Ala Gly 195 <210> 58 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed peptide-Protein L fusion <400> 58 Ser Cys Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys Cys Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Glu Val Thr Ile Lys Val Asn Leu Ile Phe Ala Asp Gly Lys 20 25 30 Ile Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu 35 40 45 Ala Tyr Arg Tyr Ala Ala Leu Leu Ala Lys Val Asn Gly Glu Tyr Thr 50 55 60 Ala Asp Leu Glu Asp Gly Gly Asn His Met Asn Ile Lys Phe Ala Gly 65 70 75 80 <210> 59 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically constructed peptide-Protein L fusion <400> 59 Ser Cys Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Arg Cys Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Glu Val Thr Ile Arg Val Asn Leu Ile Phe Ala Asp Gly Asn 20 25 30 Ile Gln 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ttcgacgtac 600 tcactcagct caacgctgac cctgtcgaaa gcggactatg agaaacacaa ggtctacgcg 660 tgcgaggtga cccatcaggg cctgagctcc cccgtaacta agtcattcaa ccggggtgaa 720 tgctaa 726 <210> 61 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic light chain <400> 61 Lys Leu Ala Ala Thr Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu 1 5 10 15 Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Thr Gly Asp Ile Leu Leu Thr 20 25 30 Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe 35 40 45 Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Ala Ile Ala Trp Tyr Gln 50 55 60 Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe 65 70 75 80 Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr 85 90 95 Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp 100 105 110 Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly 115 120 125 Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile 130 135 140 Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 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acagtaagct ccgctagcac aaagggacct agcgtgtttc ccttggctcc ctcatcgaaa 480 tcaacgtccg gtgggacggc ggcattgggg tgtcttgtca aggactattt ccccgagccc 540 gtgacagtct cgtggaactc gggtgccctt acaagcggcg tacatacgtt tcccgccgtg 600 ctccaatcat ccggactgta ttccctttca tccgtcgtga ctgtgccgtc ctcgtcactc 660 ggaacgcaaa cttacatttg caatgtcaac cacaaaccgt caaatacaaa ggtcgataag 720 aaggtcgagc caaagtcgtg tgataagacc cacacatgcc ctccctgtcc agcgccggag 780 ctgttgggag ggccttcagt gttcctcttc ccgcccaaac ccaaggacac cctgatgatt 840 agccgcacac ccgaggtgac gtgtgtcgtc gtcgatgtct cacatgagga cccggaggta 900 aagttcaact ggtacgtgga tggagtcgaa gtgcacaacg caaaaacaaa acctcgggaa 960 gagcagtaca atagcacgta cagagtagtc agcgtgctca ccgtgctgca ccaggattgg 1020 ctcaatggaa aggagtacaa gtgtaaagtg tcgaataagg cgctgcctgc ccccatcgaa 1080 aagacaattt ccaaagctaa agggcaaccc cgcgagccgc aagtatacac cctcccaccc 1140 tcgcgcgatg aactgaccaa gaaccaggtg tcattgacgt gtctcgtcaa gggcttctat 1200 ccgagcgaca ttgcagtaga atgggaaagc aacggacagc cggaaaacaa ctacaagact 1260 acaccgcctg tccttgattc ggatggttcc ttctttcttt actcaaaact tacagtcgac 1320 aaatcgaggt ggcagcaggg aaatgtgttt tcgtgcagcg tgatgcacga ggccttgcat 1380 aatcactata cacagaagtc gttgtcactg tcgccgggaa agtaa 1425 <210> 63 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic heavy chain <400> 63 Lys Leu Ala Ala Thr Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met 1 5 10 15 Ala Val Val Thr Gly Val Asn Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly 20 25 30 Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val 35 40 45 Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ser 50 55 60 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly 65 70 75 80 Tyr Thr Arg Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Ala 85 90 95 Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser 100 105 110 Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe 115 120 125 Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 145 150 155 160 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 165 170 175 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 185 190 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 210 215 220 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 225 230 235 240 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 245 250 255 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 260 265 270 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 275 280 285 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 290 295 300 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 305 310 315 320 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 325 330 335 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 340 345 350 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 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Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 169 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 169 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 115 120 125 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 130 135 140 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 145 150 155 160 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 180 185 190 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 195 200 205 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 170 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 170 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Ala Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (115)

  1. 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는, 분리된 메디토프-이용가능한(meditope-enabled) 항체 또는 이의 단편으로서,
    상기 VL 영역은, Kabat 넘버링에 따라, 40번 위치에서 트레오닌, 세린, 또는 아스파르테이트, 41번 위치에서 글리신을 제외한 잔기, 및 85번 위치에서 아스파르테이트 또는 아스파라긴을 포함하는 아미노산 서열을 가지며;
    상기 항체 또는 이의 단편은 세툭시맙에 의해 특이적으로 결합되는 EGFR의 에피토프에 특이적으로 결합하지 않고;
    상기 항체 또는 이의 단편은 메디토프에 결합하며, 이 메디토프는 서열 번호: 1, 2, 16-18, 23, 29, 31, 32, 36, 39, 42, 43, 45, 46, 51, 52, 54, 또는 55에 기재된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 이로부터 유래된 환형 펩타이드인 것인, 분리된 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 VH 영역은, Kabat 넘버링에 따라, 40번 위치에서 세린 또는 프롤린 및 89번 위치에서 이소류신, 티로신, 메티오닌, 페닐알라닌, 또는 트립토판을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 것인, 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편.
  3. 제1항 또는 2항에 있어서, 상기 VL 영역의 아미노산 서열은, Kabat 넘버링에 따라, 10번 위치에서 이소류신 또는 류신 및 83번 위치에서 이소류신을 추가로 포함하는 것인, 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편.
  4. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VL 영역의 아미노산 서열은, Kabat 넘버링에 따라, 9번 위치에서 발린 또는 이소류신 및 100번 위치에서 글루타민을 제외한 잔기를 추가로 포함하는 것인, 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편.
  5. 제1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VL 영역의 아미노산 서열은, Kabat 넘버링에 따라, 40번 위치에서 트레오닌, 41번 위치에서 아스파라긴, 및 85번 위치에서 아스파르테이트를 갖는 것인, 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편.
  6. 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH 영역의 아미노산 서열은, Kabat 넘버링에 따라, 40번 위치에서 세린 및 89번 위치에서 이소류신을 갖는 것인, 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편.
  7. 제1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 VL 영역의 아미노산 서열은, Kabat 넘버링에 따라, 9번 위치에서 발린 또는 이소류신, 10번 위치에서 이소류신 또는 류신, 39번 위치에서 아르기닌, 40번 위치에서 트레오닌, 41번 위치에서 아스파라긴, 42번 위치에서 글리신, 43번 위치에서 세린, 83번 위치에서 이소류신, 85번 위치에서 아스파르테이트, 및 100번 위치에서 알라닌을 가지며;
    상기 VH 영역의 아미노산 서열은, Kabat 넘버링에 따라, 40번 위치에서 세린 및 89번 위치에서 이소류신을 갖는 것인, 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편.
  8. 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는, 분리된 항체 또는 이의 단편으로서,
    상기 VL 영역은 서열 번호: 71 또는 서열 번호: 61에 기재된 경쇄 서열의 경쇄 프레임워크 영역(FR)1(FR-L1), FR-L2, FR-L3, 및 FR-L4와, 서열 번호: 71에 기재된 경쇄 서열의 CDRs와 구별되는 하나 이상의 CDR을 가지며;
    상기 VH 영역은 서열 번호: 72 또는 서열 번호: 63에 기재된 중쇄 서열의 중쇄 FR1(FR-H1), FR-H2, FR-H3, 및 FR-H4와, 서열 번호: 72에 기재된 중쇄 서열의 CDRs와 구별되는 하나 이상의 CDR을 갖는 것인, 분리된 항체 또는 이의 단편.
  9. 제8항에 있어서,
    서열 번호: 71에 기재된 경쇄 서열의 CDRs와 구별되는 하나 이상의 CDR은 서열 번호: 61에 기재된 경쇄 서열의 CDR을 포함하며;
    서열 번호: 72에 기재된 중쇄 서열의 CDRs와 구별되는 하나 이상의 CDR은 서열 번호: 63에 기재된 중쇄 서열의 CDR을 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  10. 제8항에 있어서, 상기 VL은 서열 번호: 76의 아미노산 서열을 포함하고 상기 VH는 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  11. 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는, 분리된 항체 또는 이의 단편으로서,
    상기 VL 영역은 서열 번호: 9에 기재된 경쇄 서열의 경쇄 프레임워크 영역(FR)1(FR-L1), FR-L2, FR-L3, 및 FR-L4를 포함하는 아미노산 서열을 가지며;
    상기 VH 영역은 서열 번호: 6에 기재된 중쇄 서열의 중쇄 FR1(FR-H1), FR-H2, FR-H3, 및 FR-H4를 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인, 분리된 항체 또는 이의 단편.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 VL 영역은 서열 번호: 9에 기재된 VL 서열의 CDRs와 구별되는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하며;
    상기 VH 영역은 서열 번호: 6에 기재된 VH 서열의 CDRs와 구별되는 하나 이상의 CDR을 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 VL 영역은 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하며;
    상기 VH 영역은 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  14. 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는, 분리된 항체 또는 이의 단편으로서,
    상기 VL 영역은 서열 번호: 68에 기재된 경쇄 서열의 경쇄 프레임워크 영역(FR)1(FR-L1), FR-L2, FR-L3, 및 FR-L4를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 것인, 분리된 항체 또는 이의 단편.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 VL 영역은 서열 번호: 69에 기재된 경쇄 서열의 CDRs와 구별되는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하며;
    상기 VH 영역은 서열 번호: 70에 기재된 중쇄 서열의 CDRs와 구별되는 하나 이상의 CDR을 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  16. 제14항에 있어서, 상기 VL 영역은 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  17. 제8항 내지 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 1, 2, 16-18, 23, 29, 31, 32, 36, 39, 42, 43, 45, 46, 51, 52, 54, 또는 55에 기재된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 이로부터 유래된 환형 펩타이드를 갖는 메디토프에 결합하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  18. 제1항 내지 7항 및 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은, 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정될 때, 10 μM 미만의 해리 상수로 메디토프에 결합하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  19. 제18항에 있어서, 상기 해리 상수가 5 μM 미만인 항체 또는 이의 단편.
  20. 제19항에 있어서, 상기 해리 상수가 2 μM 미만인 항체 또는 이의 단편.
  21. 제1항 내지 7항 및 제17항 내지 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메디토프가 서열 번호: 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로부터 유래된 환형 펩타이드인 항체 또는 이의 단편.
  22. 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는, 분리된 항체 또는 이의 단편으로서,
    상기 항체는, SPR로 측정될 때, 10 μM 미만인 해리 상수로 메디토프에 결합하며, 여기서 상기 메디토프는 서열 번호: 1 또는 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로부터 유래된 환형 펩타이드이고;
    상기 항체는 세툭시맙에 의해 특이적으로 결합되는 EGFR의 에피토프에 특이적으로 결합하지 않는 것인, 분리된 항체 또는 이의 단편.
  23. 제22항에 있어서, 상기 VL 영역은, Kabat 넘버링에 따라, 40번 위치에서 P, 41번 위치에서 G, 또는 85번 위치에서 T를 함유하지 않으며, 상기 VH 영역은, Kabat 넘버링에 따라, 40번 위치에서 N 또는 A 또는 89번 위치에서 V를 함유하지 않는 것인 항체 또는 이의 단편.
  24. 제22항 또는 23항에 있어서, 상기 VL 영역은, Kabat 넘버링에 따라, 10번 위치에서 S, 40번 위치에서 P, 41번 위치에서 G, 83번 위치에서 F, 또는 85번 위치에서 T를 함유하지 않으며, 상기 VH 영역은, Kabat 넘버링에 따라, 40번 위치에서 N 또는 A 또는 89번 위치에서 V를 함유하지 않는 것인 항체 또는 이의 단편.
  25. 제1항 내지 24항 중 어느 한 항에 있어서, 인간의 불변 영역을 추가로 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  26. 제1항 내지 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은, 아바고보맙(abagovomab), 아브식시맙(abciximab), 아달리무맙(adalimumab), 아데카투무맙(adecatumumab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 알투모맙(altumomab), 알투모맙 펜테테이트(altumomab pentetate), 아나투모맙(anatumomab), 아나투모맙 마페나톡스(anatumomab mafenatox), 아르시투모맙(arcitumomab), 아틀리주맙(atlizumab), 바실릭시맙(basiliximab), 벡투모맙(bectumomab), 엑투모맙(ectumomab), 벨리무맙(belimumab), 벤랄리주맙(benralizumab), 베바시주맙(bevacizumab), 브렌툭시맙(brentuximab), 카나키누맙(canakinumab), 카프로맙(capromab), 카프로맙 펜데타이드(capromab pendetide), 카투막소맙(catumaxomab), 세르톨리주맙(certolizumab), 클리바투주맙 테트락세탄(clivatuzumab tetraxetan), 다클리주맙(daclizumab), 데노수맙(denosumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 에드레콜로맙(edrecolomab), 에팔리주맙(efalizumab), 에타라시주맙(etaracizumab), 에르투막소맙(ertumaxomab), 파놀레소맙(fanolesomab), Fbta05, 폰톨리주맙(fontolizumab), 겜투주맙(gemtuzumab), 기렌툭시맙(girentuximab), 골리무맙(golimumab), 이브리투모맙(ibritumomab), 이고보맙(igovomab), 인플릭시맙(infliximab), 이필리무맙(ipilimumab), 라베투주맙(labetuzumab), 메폴리주맙(mepolizumab), 무로모납(muromonab), 무로모납-CD3, 나탈리주맙(natalizumab), 네시투무맙(necitumumab), 니모투주맙(nimotuzumab), 오파투무맙(ofatumumab), 오말리주맙(omalizumab), 오레고보맙(oregovomab), 팔리비주맙(palivizumab), 파니투무맙(panitumumab), 라니비주맙(ranibizumab), 리툭시맙(rituximab), 사투모맙( satumomab), 술레소맙(sulesomab), 이브리투모맙(ibritumomab), 이브리투모맙 티욱세탄(ibritumomab tiuxetan), 토실리주맙(tocilizumab), 토시투모맙(tositumomab), 트라스투주맙(trastuzumab), Trbs07, 우스테키누맙(ustekinumab), 비실리주맙(visilizumab), 보투무맙(votumumab), 잘루투무맙(zalutumumab), 브로달루맙(brodalumab), 안루킨주맙(anrukinzumab), 바피네우주맙(bapineuzumab), 달로투주맙(dalotuzumab), 뎀시주맙(demcizumab), 가니투맙(ganitumab), 이노투주맙(inotuzumab), 마브릴리무맙(mavrilimumab), 목세투모맙 파수도톡스(moxetumomab pasudotox), 릴로투무맙(rilotumumab), 사이팔리무맙(sifalimumab), 타네주맙(tanezumab), 트랄로키누맙(tralokinumab), 트레멜리무맙(tremelimumab), 하이브리도마 10B5에 의해 생산된 항체 및 우렐루맙(urelumab)로부터 선택되는 항체 또는 항체 단편과 동일한 에피토프와 결합하는 항원에 대해 경쟁하거나 상기 동일한 에피토프에 결합하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  27. 제1항 내지 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은, 아바고보맙, 아브식시맙, 아달리무맙, 아데카투무맙, 알렘투주맙, 알투모맙, 알투모맙 펜테테이트, 아나투모맙, 아나투모맙 마페나톡스, 아르시투모맙, 아틀리주맙, 바실릭시맙, 벡투모맙, 엑투모맙, 벨리무맙, 벤랄리주맙, 베바시주맙, 브렌툭시맙, 카나키누맙, 카프로맙, 카프로맙 펜데타이드, 카투막소맙, 세르톨리주맙, 클리바투주맙 테트락세탄, 다클리주맙, 데노수맙, 에쿨리주맙, 에드레콜로맙, 에팔리주맙, 에타라시주맙, 에르투막소맙, 파놀레소맙, Fbta05, 폰톨리주맙, 겜투주맙, 기렌툭시맙, 골리무맙, 이브리투모맙, 이고보맙, 인플릭시맙, 이필리무맙, 라베투주맙, 메폴리주맙, 무로모납, 무로모납-CD3, 나탈리주맙, 네시투무맙, 니모투주맙, 오파투무맙, 오말리주맙, 오레고보맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 라니비주맙, 리툭시맙, 사투모맙, 술레소맙, 이브리투모맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 토실리주맙, 토시투모맙, Trbs07, 우스테키누맙, 비실리주맙, 보투무맙, 잘루투무맙, 브로달루맙, 안루킨주맙, 바피네우주맙, 달로투주맙, 뎀시주맙, 가니투맙, 이노투주맙, 마브릴리무맙, 목세투모맙 파수도톡스, 릴로투무맙, 사이팔리무맙, 타네주맙, 트랄로키누맙, 트레멜리무맙, 하이브리도마 10B5에 의해 생산된 항체 및 우렐루맙로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 또는 항체 단편의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 함유하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  28. 제27항에 있어서, 상기 하나 이상의 CDR은 중쇄 CDR1, 2, 및 3과 경쇄 CDR1, 2, 및 3을 포함하는 것인 항체 또는 이의 단편.
  29. 제1항 내지 28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은, CA-125, 당단백질 (GP) IIb/IIIa 수용체, TNF-알파, CD52, TAG-72, 암배아성 항원 (CEA), 인터류킨-6 수용체 (IL-6R), IL-2, 인터류킨-2 수용체 a-쇄 (CD25), CD22, B-세포 활성화 인자, 인터류킨-5 수용체 (CD125), VEGF, VEGF-A, CD30, IL-1베타, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), CD3, EpCAM, EGF 수용체 (EGFR), MUC1, 인간 인터류킨-2 수용체, Tac, RANK 리간드, C5 또는 기타 보체 단백질, EpCAM, CD11a, 알파-v 베타-3 인테그린(integrin), 비트로넥틴(vitronectin) 수용체 알파 v 베타 3 인테그린, HER2, neu, CD3, CD15, CD20, 인터페론 감마, CD33, CA-IX, TNF 알파, CTLA-4, 암배아성 항원, IL-5, CD3 엡실론, CAM, 알파-4-인테그린, IgE, IgE Fc 영역, RSV 항원, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)의 F(또는 융합) 단백질, TAG-72, NCA-90(과립구 세포 항원), IL-6, GD2, GD3, IL-12, IL-23, IL-17, CTAA16.88, IL13, 인터류킨-1 베타, 베타-아밀로이드, IGF-1 수용체 (IGF-1R), 델타-유사 리간드 4 (DLL4), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 수용체의 알파 서브유닛, 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor), IFN-알파, 신경 성장 인자, IL-13, CD326, PD-L1, CD47, 및 CD137로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 특이적으로 결합하는 것인 항체 또는 이의 단편:
  30. 제1항 내지 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는, Kabat 넘버링에 따라, P8, V9 또는 I9, I10 또는 L10, Q38, R39, T40, N41 G42, S43, P44, R45, D82, I83, A84, D85, Y86, Y87, G99, A100, G101, T102, K103, L104, E105, R142, S162, V163, T164, E165, Q166, D167, S168, 및 Y173을 갖는 경쇄와, Kabat 넘버링에 따라, Q6, P9, R38, Q39, S40, P41, G42, K43, G44, L45, S84, D86, T87, A88, I89, Y90, Y91, W103, G104, Q105, G106, T107, L108, V111, T110, Y147, E150, P151, V152, T173, F174, P175, A176, V177, Y185, S186, 및 L187을 갖는 중쇄를 갖는 것인 항체 또는 이의 단편.
  31. 메디토프에 결합되어 있는, 제1항 내지 30항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 복합체(complex).
  32. 메디토프-이용가능한 항체의 메디토프 결합 부위에 결합하는 펩타이드를 포함하는 분리된 메디토프로서,
    상기 펩타이드는 서열 번호: 1 또는 2의 펩타이드 또는 이로부터 유래된 환형 펩타이드가 아닌 것인, 분리된 메디토프.
  33. 제32항에 있어서, 상기 펩타이드는, 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정될 때, 10 μM 미만의 해리 상수로 메디토프 결합 부위에 결합하는 것인 메디토프.
  34. 제32항 또는 33항에 있어서, 상기 메디토프 결합 부위는, Kabat 넘버링에 따라, 메디토프-이용가능한 항체의 경쇄의 40번, 41번, 83번, 및 85번 잔기와, Kabat 넘버링에 따라, 메디토프-이용가능한 항체의 중쇄의 39번, 89번, 105번, 및 108번 잔기를 포함하는 것인 메디토프.
  35. 제31항 내지 34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메디토프는,
    서열 번호: 71에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄와 서열 번호: 72에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
    서열 번호: 9에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄와 서열 번호: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 또는
    서열 번호: 68에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄와 서열 번호: 70에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄
    를 갖는 메디토프-이용가능한 항체에 결합하는 것인 메디토프.
  36. 제32항 내지 35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가 길이상 5 내지 16개의 아미노산인 메디토프.
  37. 제32항 내지 36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 하기 화학식 (I)을 갖는 것인 메디토프:
    X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12 (화학식 I)
    상기 식에서,
    X1는 Cys, Gly, β-알라닌, 디아미노프로피온산, β-아지도알라닌이거나, 존재하지 않으며;
    X2는 Gln이거나 존재하지 않고;
    X3은 Phe, Tyr, β-β'-디페닐-Ala, His, Asp, 2-브로모-L-페닐알라닌, 3-브로모-L-페닐알라닌, 또는 4-브로모-L-페닐알라닌, Asn, Gln, 변형된 Phe, 수화가능한 카르보닐-함유 잔기; 또는 붕산-함유 잔기이며;
    X4는 Asp 또는 Asn이고;
    X5는 Leu; β-β'-디페닐-Ala; Phe; 페닐알라닌, 트립토판, 또는 티로신의 비-천연 유사체; 수화가능한 카르보닐-함유 잔기; 또는 붕산-함유 잔기이며;
    X6는 Ser 또는 Cys이고;
    X7은 Thr 또는 Ser 또는 Cys이며;
    X8은 Arg, 변형된 Arg, 또는 수화가능한 카르보닐 또는 붕산-함유 잔기이고;
    X9은 Arg, Ala이며;
    X10은 Leu, Gln, Glu, β-β'-디페닐-Ala; Phe; 페닐알라닌, 트립토판, 또는 티로신의 비-천연 유사체; 수화가능한 카르보닐-함유 잔기; 또는 붕산-함유 잔기이고;
    X11은 Lys이며;
    X12는 Cys, Gly, 7-아미노헵타노산, β-알라닌, 디아미노프로피온산, 프로파르길글리신, 이소아스파르트산이거나 존재하지 않고;
    여기서,
    상기 변형된 Arg는 도 34에 나타낸 화학식의 구조를 가지며,
    상기 변형된 Phe는 하나 이상의 할로겐이 페닐 환으로 혼입되어 있는 Phe이고,
    화학식 I은 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2 또는 이로부터 유래된 환형 펩타이드가 아니다.
  38. 제32항 내지 37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가 환형 펩타이드인 메디토프.
  39. 제38항에 있어서, 상기 고리화(cyclization)는 디설파이드 가교, 티오에테르 가교, 락탐 연결, 고리화첨가반응(cycloaddition)에 의한 것인 메디토프.
  40. 제38항 또는 39항에 있어서, 상기 펩타이드는 화학식 (I)의 펩타이드이고, 상기 고리화는 X1과 X12, X1과 X11, X3과 X11, X4와 X11, 또는 X2와 X12 사이의 연결기를 통한 것인 메디토프.
  41. 제37항 내지 40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가 화학식 I의 펩타이드이고 상기 비-천연 아미노산이 β-β'-디페닐-Ala, 분지된 알킬, 또는 연장된(extended) 방향족인 메디토프.
  42. 제37항 내지 40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가 화학식 (I)의 펩타이드이고 1개 이상의 할로겐 각각이 오르토-, 메타-, 또는 파라-브로모 페닐 치환기인 메디토프.
  43. 제32항 내지 42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가 서열 번호: 16-18, 23, 29, 31, 32, 36, 39, 42, 43, 45, 46, 51, 52, 54, 또는 55에 기재된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 갖는 펩타이드, 또는 이로부터 유래된 환형 펩타이드인 메디토프.
  44. 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 2의 화합물이 아닌 하기 화학식 (X)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 분리된 메디토프:
    Figure pct00027

    상기 식에서,
    "*"로 표시된 중심은 "R" 또는 "S" 배열로 존재하고;
    R3 및 R3'는, 각각 독립적으로, H이거나, C1-4 알킬, -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된, 페닐이며;
    R5는
    (A) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CO2C1-4 알킬, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CONH2 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬이거나;
    (B) a) 1개 또는 2개의 페닐 기 (여기서 각각의 페닐은 -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된다); 또는
    b) 나프틸, 이미다졸, 또는 인돌 기
    로 치환된 C1-4 알킬이고;
    R6는 -C1-4 알킬-OH 또는 -C1-4 알킬-SH이며;
    R7은 -C1-4 알킬-OH 또는 -C1-4 알킬-SH이고;
    m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이며;
    R8은
    (a) -OH, -NRaRb, -N(Rc)C(O)Re, 또는 -N(Rc)C(=NRd)Re; 또는
    (여기서,
    Ra는 H이고;
    Rb는 H이거나, 옥소, 아세탈, 및 케탈, -B(OH)2, -SH, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 또는 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬이며;
    Rc는 H, C1-8 알킬, C3-8 사이클로알킬, 분지된 알킬, 또는 아릴이고;
    Rd는 H이거나, 각각 -N3, -NH2, -OH, -SH, 할로겐, 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬, C2-8 알케닐, C2-8 알키닐, C3-8 사이클로알킬, 분지된 알킬, 또는 아릴 기기며;
    Re는 H; -NHRd; 또는 각각 -N3, -NH2, -OH, -SH, 옥소, C2-4아세탈, C2-4케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, 및 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-12알킬, C3-8사이클로알킬, C2-12알케닐, C2-8알키닐, 또는 아릴 기이다)
    (b) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, -SH, -OH, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, 또는 -CO2C1-4알킬 기로 치환된 C1-12 알킬이고;
    R9는 C1-4알킬 또는-C1-2알킬렌-Rx이며, 여기서 Rx는 -CO2H, -CONH2, -CH2NHC(O)NH2, 또는 -CH2NHC(=NH)NH2이고;
    R10은
    (1) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CONH2 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬; 또는
    (2) 1개 또는 2개의 페닐 기, 또는 1개의 나프틸, 이미다졸, 또는 인돌 기로 치환된 C1-4 알킬 기 (여기서, 각각의 페닐은 -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개, 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된다)이고;
    n은 0 또는 1이며;
    p는 0 또는 1이고;
    X는 각각의 탄소가 -CO2H, -NH2, 또는 -NHC(O)Ry로 임의로 치환된, C1-8 알킬렌 또는 C2-8 알케닐렌이며, 상기 알킬렌의 탄소 1개는 -C(O)NH-, 5-원 헤테로아릴 환, 또는 -S-S-로 임의로 치환되며;
    Ry는 -C1-4알킬 또는-CH(Rz)CO2H이고;
    여기서 Rz는 -H이거나, -OH, -SH, 또는 -NH2로 임의로 치환된, -C1-4알킬이다.
  45. 제44항에 있어서, m이 0 또는 1인 메디토프.
  46. 제44항에 있어서, R3이 H 또는 페닐이고 R3'가 페닐, 2-브로모페닐, 3-브로모페닐, 또는 4-브로모페닐인 메디토프.
  47. 제44항에 있어서, R5는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, 또는 3급-부틸이고, 이들 각각은 옥소, -B(OH)2, -CO2H, 또는 -CONH2 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로, 또는 각각 브로모 또는 클로로 치환기로 임의로 치환된 1개 또는 2개의 페닐 기로 임의로 치환되는 것인 메디토프.
  48. 제44항에 있어서, R8이 -OH, -NH2, -N(Rc)C(O)Re, 또는 -N(Rc)C(=NRd)Re인 메디토프.
  49. 제48항에 있어서, Rc가 H 또는 메틸이고, Rd가 H 또는 C1-4알킬이며, Re가 C1-4알킬, 또는 -NH(C1-4알킬)인 메디토프.
  50. 제44항에 있어서, R9가 -CO2H, -CONH2, -CH2NHC(O)NH2, 또는 -CH2NHC(=NH)NH2로 임의로 치환된 메틸 또는 에틸인 메디토프.
  51. 제44항에 있어서, R10이 각각 옥소, -B(OH)2, -CO2H, 및 -CONH2 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, 또는 tert-부틸인 메디토프.
  52. 제44항에 있어서, -X-NH가 -Cys-Cys-, -Gly-Gly-, -C(O)(CH2)6-NH-, -β-Ala-β-Ala-, -C(O)CH(NH2)CH2CH=CHCH2CH(CO2H)-NH-,
    -C(O)CH(NH2)CH2NHC(O)CH2CH(CO2H)-NH-, -β-Ala-C(O)CH2CH(CO2H)-NH-, 또는 -C(O)CH(NH2)CH2-트리아지닐-CH2-CH(CO2H)-NH-인 메디토프.
  53. 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편, 또는 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편을 발현시키는 세포의 정제 방법으로서,
    (a) 메디토프-이용가능한 항체, 단편, 또는 세포를 함유하는 조성물을 메디토프와, 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편이 펩타이드에 결합하는 조건하에 접촉시키는 단계; 및
    (b) 항체 또는 이의 단편, 또는 세포를 분리시키는 단계
    를 포함하고, 상기 메디토프는 메디토프-이용가능한 항체의 메디토프 결합 부위에 결합하는 펩타이드인 것인 정제 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 펩타이드는, 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정될 때, 10 μM 미만의 해리 상수로 메디토프 결합 부위에 결합하는 것인 정제 방법.
  55. 제53항 또는 54항에 있어서, 상기 펩타이드가 길이상 5 내지 16개의 아미노산인 정제 방법.
  56. 제53항 내지 55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가 하기 화학식(X)의 펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인 정제 방법:
    Figure pct00028

    상기 식에서,
    "*"로 표시된 중심은 "R" 또는 "S" 배열로 존재하고;
    R3 및 R3'는, 각각 독립적으로, H이거나, C1-4 알킬, -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된, 페닐이며;
    R5는
    (A) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CO2C1-4 알킬, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CONH2 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬이거나;
    (B) a) 1개 또는 2개의 페닐 기 (여기서 각각의 페닐은 -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된다); 또는
    b) 나프틸, 이미다졸, 또는 인돌 기
    로 치환된 C1-4 알킬이고;
    R6는 -C1-4 알킬-OH 또는 -C1-4 알킬-SH이며;
    R7은 -C1-4 알킬-OH 또는 -C1-4 알킬-SH이고;
    m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이며;
    R8은
    (a) -OH, -NRaRb, -N(Rc)C(O)Re, 또는 -N(Rc)C(=NRd)Re; 또는
    (여기서,
    Ra는 H이고;
    Rb는 H이거나, 옥소, 아세탈, 및 케탈, -B(OH)2, -SH, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 또는 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬이며;
    Rc는 H, C1-8 알킬, C3-8 사이클로알킬, 분지된 알킬, 또는 아릴이고;
    Rd는 H이거나, 각각 -N3, -NH2, -OH, -SH, 할로겐, 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬, C2-8 알케닐, C2-8 알키닐, C3-8 사이클로알킬, 분지된 알킬, 또는 아릴 기이며;
    Re는 H; -NHRd; 또는 각각 -N3, -NH2, -OH, -SH, 옥소, C2-4아세탈, C2-4케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, 및 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-12알킬, C3-8사이클로알킬, C2-12알케닐, C2-8알키닐, 또는 아릴 기이다)
    (b) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, -SH, -OH, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, 또는 -CO2C1-4알킬 기로 치환된 C1-12 알킬이고;
    R9는 C1-4알킬 또는-C1-2알킬렌-Rx이며, 여기서 Rx는 -CO2H, -CONH2, -CH2NHC(O)NH2, 또는 -CH2NHC(=NH)NH2이고;
    R10은
    (1) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CONH2 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬; 또는
    (2) 1개 또는 2개의 페닐 기, 또는 1개의 나프틸, 이미다졸, 또는 인돌 기로 치환된 C1-4 알킬 기 (여기서, 각각의 페닐은 -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개, 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된다)이고;
    n은 0 또는 1이며;
    p는 0 또는 1이고;
    X는 각각의 탄소가 -CO2H, -NH2, 또는 -NHC(O)Ry로 임의로 치환된, C1-8 알킬렌 또는 C2-8 알케닐렌이며, 여기서 상기 알킬렌의 탄소 1개는 -C(O)NH-, 5-원 헤테로아릴 환, 또는 -S-S-로 임의로 치환되며;
    Ry는 -C1-4알킬 또는-CH(Rz)CO2H이고, 여기서 Rz는 -H이거나, -OH, -SH, 또는 -NH2로 임의로 치환된, -C1-4알킬이다.
  57. 제53항 내지 56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메디토프는 고체 지지체에 커플링되는 것인 정제 방법.
  58. 제53항 내지 57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리는 pH에서의 변화에 의해 수행하는 것인 정제 방법.
  59. 표지화된 메디토프로서,
    메디토프-이용가능한 항체의 메디토프 결합 부위에 결합하는 펩타이드를 포함하는 메디토프; 및
    치료제 또는 진단제
    를 포함하는 표지화된 메디토프.
  60. 제59항에 있어서, 상기 치료제 또는 진단제는 금속 이온에 결합된 금속 킬레이터, 소분자, 화학요법제, 치료적 항체 또는 작용성 단편, 독소, 방사성동위원소, 효소, 뉴클레아제, 호르몬, 면역조절제, 올리고뉴클레오타이드, 유기 또는 무기 나노입자, RNAi 분자, siRNA, 킬레이터, 붕소 화합물, 광활성제, 염료, 형광 또는 발광 물질, 효소, 증진제, 방사성 물질, 및 킬레이터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 표지화된 메디토프.
  61. 2종 이상의 메디토프와 1종 이상의 링커를 포함하는 다가 메디토프(multivalent meditope)로서,
    상기 2종 이상의 메디토프 각각은 메디토프-이용가능한 항체의 메디토프 결합 부위에 결합하는 펩타이드인 것인 다가 메디토프.
  62. 제61항에 있어서, 상기 2종 이상의 메디토프는 3종 이상의 메디토프를 포함하는 것인 다가 메디토프.
  63. 제61항 또는 62항에 있어서, 상기 1종 이상의 링커는 펩타이드, 작은 화학적 스캐폴드(scaffold), 바이오틴-스트렙트아비딘, 유기 또는 무기 나노입자, 폴리뉴클레오타이드 서열, 펩타이드 핵산, 유기 폴리머, 또는 면역글로불린 Fc 도메인을 포함하는 것인 다가 메디토프.
  64. 메디토프에 결합된, 제1항 내지 30항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편을 포함하는, 분리된 메디토프-이용가능한 항체-메디토프 복합체로서,
    상기 메디토프는 상기 항체 또는 이의 단편의 메디토프 결합 부위에 결합하는 펩타이드를 포함하는 것인, 분리된 메디토프-이용가능한 항체-메디토프 복합체.
  65. 제64항에 있어서, 상기 펩타이드는, 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정될 때, 10 μM 미만의 해리 상수로 메디토프 결합 부위에 결합하는 것인 복합체.
  66. 제64항 또는 65항에 있어서, 상기 펩타이드가 길이상 5 내지 16개의 아미노산인 복합체.
  67. 제64항 내지 66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가 하기 화학식(X)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인 복합체:
    Figure pct00029

    상기 식에서,
    "*"로 표시된 중심은 "R" 또는 "S" 배열로 존재하고;
    R3 및 R3'는, 각각 독립적으로, H이거나, C1-4 알킬, -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된, 페닐이며;
    R5는
    (A) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CO2C1-4 알킬, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CONH2 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬이거나;
    (B) a) 1개 또는 2개의 페닐 기 (여기서 각각의 페닐은 -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된다); 또는
    b) 나프틸, 이미다졸, 또는 인돌 기
    로 치환된 C1-4 알킬이고;
    R6는 -C1-4 알킬-OH 또는 -C1-4 알킬-SH이며;
    R7은 -C1-4 알킬-OH 또는 -C1-4 알킬-SH이고;
    m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이며;
    R8은
    (a) -OH, -NRaRb, -N(Rc)C(O)Re, 또는 -N(Rc)C(=NRd)Re; 또는
    (여기서,
    Ra는 H이고;
    Rb는 H이거나, 옥소, 아세탈, 및 케탈, -B(OH)2, -SH, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 또는 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기기로 임의로 치환된, C1-8 알킬이며;
    Rc는 H, C1-8 알킬, C3-8 사이클로알킬, 분지된 알킬, 또는 아릴이고;
    Rd는 H이거나, 각각 -N3, -NH2, -OH, -SH, 할로겐, 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬, C2-8 알케닐, C2-8 알키닐, C3-8 사이클로알킬, 분지된 알킬, 또는 아릴 기이며;
    Re는 H; -NHRd; 또는 각각 -N3, -NH2, -OH, -SH, 옥소, C2-4아세탈, C2-4케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, 및 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-12알킬, C3-8사이클로알킬, C2-12알케닐, C2-8알키닐, 또는 아릴 기이다)
    (b) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, -SH, -OH, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, 또는 -CO2C1-4알킬 기로 치환된 C1-12 알킬이고;
    R9는 C1-4알킬 또는-C1-2알킬렌-Rx이며, 여기서 Rx는 -CO2H, -CONH2, -CH2NHC(O)NH2, 또는 -CH2NHC(=NH)NH2이고;
    R10은
    (1) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CONH2 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬; 또는
    (2) 1개 또는 2개의 페닐 기, 또는 1개의 나프틸, 이미다졸, 또는 인돌 기로 치환된 C1-4 알킬 기 (여기서, 각각의 페닐은 -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개, 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된다)이고;
    n은 0 또는 1이며;
    p는 0 또는 1이고;
    X는 각각의 탄소가 -CO2H, -NH2, 또는 -NHC(O)Ry로 임의로 치환된, C1-8 알킬렌 또는 C2-8 알케닐렌이며, 여기서 상기 알킬렌의 탄소 1개는 -C(O)NH-, 5-원 헤테로아릴 환, 또는 -S-S-로 임의로 치환되며;
    Ry는 -C1-4알킬 또는-CH(Rz)CO2H이고, 여기서 Rz는 -H이거나, -OH, -SH, 또는 -NH2로 임의로 치환된, -C1-4알킬이다.
  68. 제64항 내지 67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메디토프가 다가 메디토프인 복합체.
  69. 제31항 내지 50항 중 어느 한 항의 메디토프에 결합된 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편, 제59항 또는 60항의 표지화된 메디토프, 또는 제61항 내지 63항 중 어느 한 항의 다가 메디토프를 포함하는, 분리된 항체-메디토프 복합체.
  70. 제64항 내지 69항 중 어느 한 항의 복합체; 및
    약학적으로 허용되는 담체
    를 포함하는 약학 조성물.
  71. 제70항의 약학 조성물을 피험체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
  72. (a) 피험체에게 제64항 내지 69항 중 어느 한 항에 따르는 항체-메디토프 복합체를 투여하는 단계; 및
    (b) 피험체에서 항원에 대한 항체-메디토프 복합체의 결합을 검출하는 단계
    를 포함하는 진단 방법.
  73. 제1항 내지 30항 중 어느 한 항에 따르는 항체 또는 이의 단편을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
  74. 피험체에게 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편을 투여하는 단계, 및
    피험체에게 1종 이상의 메디토프를 투여하는 단계
    를 포함하는 치료 방법으로서,
    상기 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편 및 1종 이상의 메디토프는 순차적으로 또는 동시적으로 투여하고 상기 1종 이상의 메디토프는 상기 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편의 메디토프 결합 부위에 결합하는 펩타이드를 포함하는 것인 치료 방법.
  75. 제71항에 있어서, 상기 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하고, 상기 VL 영역은, Kabat 넘버링에 따라, 40번 위치에서 트레오닌, 세린, 또는 아스파르테이트, 41번 위치에서 글리신을 제외한 잔기, 및 85번 위치에서 아스파르테이트 또는 아스파라긴을 포함하는 것인 치료 방법.
  76. 제74항 또는 75항에 있어서, 상기 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편은, 상기 메디토프-이용가능한 항체와 1종 이상의 메디토프의 투여가 메디토프-이용가능한 항체와 메디토프의 복합체의 투여를 포함하도록, 상기 1종 이상의 메디토프에 결합하는 것인 치료 방법.
  77. 제74항 또는 75항에 있어서, 상기 메디토프-이용가능한 항체는 상기 1종 이상의 메디토프의 투여 전에 투여하는 것인 치료 방법.
  78. 제74항 내지 77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가 하기 화학식(X)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인 치료 방법:
    Figure pct00030

    상기 식에서,
    "*"로 표시된 중심은 "R" 또는 "S" 배열로 존재하고;
    R3 및 R3'는, 각각 독립적으로, H이거나, C1-4 알킬, -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된, 페닐이며;
    R5는
    (A) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CO2C1-4 알킬, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CONH2 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬이거나;
    (B) a) 1개 또는 2개의 페닐 기 (여기서 각각의 페닐은 -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된다); 또는
    b) 나프틸, 이미다졸, 또는 인돌 기
    로 치환된 C1-4 알킬이고;
    R6는 -C1-4 알킬-OH 또는 -C1-4 알킬-SH이며;
    R7은 -C1-4 알킬-OH 또는 -C1-4 알킬-SH이고;
    m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이며;
    R8은
    (a) -OH, -NRaRb, -N(Rc)C(O)Re, 또는 -N(Rc)C(=NRd)Re; 또는
    (여기서,
    Ra는 H이고;
    Rb는 H이거나, 옥소, 아세탈, 및 케탈, -B(OH)2, -SH, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 또는 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬이며;
    Rc는 H, C1-8 알킬, C3-8 사이클로알킬, 분지된 알킬, 또는 아릴이고;
    Rd는 H이거나, 각각 -N3, -NH2, -OH, -SH, 할로겐, 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬, C2-8 알케닐, C2-8 알키닐, C3-8 사이클로알킬, 분지된 알킬, 또는 아릴 기이며;
    Re는 H; -NHRd; 또는 각각 -N3, -NH2, -OH, -SH, 옥소, C2-4아세탈, C2-4케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, 및 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-12알킬, C3-8사이클로알킬, C2-12알케닐, C2-8알키닐, 또는 아릴 기이다)
    (b) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, -SH, -OH, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, 또는 -CO2C1-4알킬 기로 치환된 C1-12 알킬이고;
    R9는 C1-4알킬 또는-C1-2알킬렌-Rx이며, 여기서 Rx는 -CO2H, -CONH2, -CH2NHC(O)NH2, 또는 -CH2NHC(=NH)NH2이고;
    R10은
    (1) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CONH2 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬; 또는
    (2) 1개 또는 2개의 페닐 기, 또는 1개의 나프틸, 이미다졸, 또는 인돌 기로 치환된 C1-4 알킬 기 (여기서, 각각의 페닐은 -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개, 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된다)이고;
    n은 0 또는 1이며;
    p는 0 또는 1이고;
    X는 각각의 탄소가 -CO2H, -NH2, 또는 -NHC(O)Ry로 임의로 치환된, C1-8 알킬렌 또는 C2-8 알케닐렌이며, 여기서 상기 알킬렌의 탄소 1개는 -C(O)NH-, 5-원 헤테로아릴 환, 또는 -S-S-로 임의로 치환되며;
    Ry는 -C1-4알킬 또는-CH(Rz)CO2H이고, 여기서 Rz는 -H이거나, -OH, -SH, 또는 -NH2로 임의로 치환된, -C1-4알킬이다.
  79. 제73항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 상기 1종 이상의 메디토프에 결합하고, 상기 1종 이상의 메디토프는 하기 화학식(X)의 펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 것인 치료 방법:
    Figure pct00031

    상기 식에서,
    "*"로 표시된 중심은 "R" 또는 "S" 배열로 존재하고;
    R3 및 R3'는, 각각 독립적으로, H이거나, C1-4 알킬, -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된, 페닐이며;
    R5는
    (A) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CO2C1-4 알킬, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CONH2 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬이거나;
    (B) a) 1개 또는 2개의 페닐 기 (여기서 각각의 페닐은 -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된다); 또는
    b) 나프틸, 이미다졸, 또는 인돌 기
    로 치환된 C1-4 알킬이고;
    R6는 -C1-4 알킬-OH 또는 -C1-4 알킬-SH이며;
    R7은 -C1-4 알킬-OH 또는 -C1-4 알킬-SH이고;
    m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이며;
    R8은
    (a) -OH, -NRaRb, -N(Rc)C(O)Re, 또는 -N(Rc)C(=NRd)Re; 또는
    (여기서,
    Ra는 H이고;
    Rb는 H이거나, 옥소, 아세탈, 및 케탈, -B(OH)2, -SH, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 또는 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬이며;
    Rc는 H, C1-8 알킬, C3-8 사이클로알킬, 분지된 알킬, 또는 아릴이고;
    Rd는 H이거나, 각각 -N3, -NH2, -OH, -SH, 할로겐, 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬, C2-8 알케닐, C2-8 알키닐, C3-8 사이클로알킬, 분지된 알킬, 또는 아릴 기이며;
    Re는 H; -NHRd; 또는 각각 -N3, -NH2, -OH, -SH, 옥소, C2-4아세탈, C2-4케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, 및 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-12알킬, C3-8사이클로알킬, C2-12알케닐, C2-8알키닐, 또는 아릴 기이다)
    (b) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, -SH, -OH, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, 또는 -CO2C1-4알킬 기로 치환된 C1-12 알킬이고;
    R9는 C1-4알킬 또는-C1-2알킬렌-Rx이며, 여기서 Rx는 -CO2H, -CONH2, -CH2NHC(O)NH2, 또는 -CH2NHC(=NH)NH2이고;
    R10은
    (1) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CONH2 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬; 또는
    (2) 1개 또는 2개의 페닐 기, 또는 1개의 나프틸, 이미다졸, 또는 인돌 기로 치환된 C1-4 알킬 기 (여기서, 각각의 페닐은 -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개, 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된다)이고;
    n은 0 또는 1이며;
    p는 0 또는 1이고;
    X는 각각의 탄소가 -CO2H, -NH2, 또는 -NHC(O)Ry로 임의로 치환된, C1-8 알킬렌 또는 C2-8 알케닐렌이며, 여기서 기 알킬렌의 탄소 1개는 -C(O)NH-, 5-원 헤테로아릴 환, 또는 -S-S-로 임의로 치환되며;
    Ry는 -C1-4알킬 또는-CH(Rz)CO2H이고, 여기서 Rz는 -H이거나, -OH, -SH, 또는 -NH2로 임의로 치환된, -C1-4알킬이다.
  80. 제73항에 있어서, 피험체에게 1종 이상의 메디토프를 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 1종 이상의 메디토프는 하기 화학식(X)의 펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 것인 치료 방법:
    Figure pct00032

    상기 식에서,
    "*"로 표시된 중심은 "R" 또는 "S" 배열로 존재하고;
    R3 및 R3'는, 각각 독립적으로, H이거나, C1-4 알킬, -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된, 페닐이며;
    R5는
    (A) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CO2C1-4 알킬, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CONH2 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬이거나;
    (B) a) 1개 또는 2개의 페닐 기 (여기서 각각의 페닐은 -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된다); 또는
    b) 나프틸, 이미다졸, 또는 인돌 기
    로 치환된 C1-4 알킬이고;
    R6는 -C1-4 알킬-OH 또는 -C1-4 알킬-SH이며;
    R7은 -C1-4 알킬-OH 또는 -C1-4 알킬-SH이고;
    m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이며;
    R8은
    (a) -OH, -NRaRb, -N(Rc)C(O)Re, 또는 -N(Rc)C(=NRd)Re; 또는
    (여기서,
    Ra는 H이고;
    Rb는 H이거나, 옥소, 아세탈, 및 케탈, -B(OH)2, -SH, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 또는 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬이며;
    Rc는 H, C1-8 알킬, C3-8 사이클로알킬, 분지된 알킬, 또는 아릴이고;
    Rd는 H이거나, 각각 -N3, -NH2, -OH, -SH, 할로겐, 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬, C2-8 알케닐, C2-8 알키닐, C3-8 사이클로알킬, 분지된 알킬, 또는 아릴 기이며;
    Re는 H; -NHRd; 또는 각각 -N3, -NH2, -OH, -SH, 옥소, C2-4아세탈, C2-4케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, 및 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-12알킬, C3-8사이클로알킬, C2-12알케닐, C2-8알키닐, 또는 아릴 기이다)
    (b) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, -SH, -OH, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, 또는 -CO2C1-4알킬 기로 치환된 C1-12 알킬이고;
    R9는 C1-4알킬 또는-C1-2알킬렌-Rx이며, 여기서 Rx는 -CO2H, -CONH2, -CH2NHC(O)NH2, 또는 -CH2NHC(=NH)NH2이고;
    R10은
    (1) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CONH2 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬; 또는
    (2) 1개 또는 2개의 페닐 기, 또는 1개의 나프틸, 이미다졸, 또는 인돌 기로 치환된 C1-4 알킬 기 (여기서, 각각의 페닐은 -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개, 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된다)이고;
    n은 0 또는 1이며;
    p는 0 또는 1이고;
    X는 각각의 탄소가 -CO2H, -NH2, 또는 -NHC(O)Ry로 임의로 치환된, C1-8 알킬렌 또는 C2-8 알케닐렌이며, 상기 알킬렌의 탄소 1개는 -C(O)NH-, 5-원 헤테로아릴 환, 또는 -S-S-로 임의로 치환되며;
    Ry는 -C1-4알킬 또는-CH(Rz)CO2H이고, 여기서 Rz는 -H이거나, -OH, -SH, 또는 -NH2로 임의로 치환된, -C1-4알킬이다.
  81. 제74항 내지 80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 메디토프는 다가 메디토프를 포함하는 것인 치료 방법.
  82. 제74항 내지 81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 메디토프는 치료제에 커플링되는 것인 치료 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 치료제는 약물, 화학요법제, 치료적 항체, 독소, 방사성동위원소, 효소, 킬레이터, 붕소 화합물, 광활성제, 염료, 금속, 금속 합금, 및 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
  84. (a) 피험체에게 제1항 내지 30항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편을 투여하는 단계; 및
    (b) 피험체에서 항원에 대한 상기 항체 또는 이의 단편의 결합을 검출하는 단계
    를 포함하는 진단 방법.
  85. 피험체에게 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편 및 메디토프 1종 이상을 투여하는 단계, 및
    피험체에서 항원에 대한 상기 항체 또는 이의 단편의 결합을 검출하는 단계
    를 포함하는 진단 방법으로서,
    상기 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편 및 1종 이상의 메디토프는 순차적으로 또는 동시적으로 투여하고;
    상기 1종 이상의 메디토프는 상기 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편의 메디토프 결합 부위에 결합하는 펩타이드를 포함하는 것인 진단 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하고, 상기 VL 영역은, Kabat 넘버링에 따라, 40번 위치에서 트레오닌, 세린, 또는 아스파르테이트, 41번 위치에서 글리신을 제외한 잔기, 및 85번 위치에서 아스파르테이트 또는 아스파라긴을 포함하는 것인 진단 방법.
  87. 제85항 또는 86항에 있어서, 상기 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편은, 상기 메디토프-이용가능한 항체와 1종 이상의 메디토프의 투여가 메디토프-이용가능한 항체와 메디토프의 복합체의 투여를 포함하도록, 상기 1종 이상의 메디토프에 결합하는 것인 진단 방법.
  88. 제85항 또는 86항에 있어서, 상기 메디토프-이용가능한 항체는 상기 1종 이상의 메디토프의 투여 전에 투여하는 것인 진단 방법.
  89. 제85항 내지 88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가 하기 화학식(X)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인 진단 방법:
    Figure pct00033

    상기 식에서,
    "*"로 표시된 중심은 "R" 또는 "S" 배열로 존재하고;
    R3 및 R3'는, 각각 독립적으로, H이거나, C1-4 알킬, -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된, 페닐이며;
    R5는
    (A) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CO2C1-4 알킬, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CONH2 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬이거나;
    (B) a) 1개 또는 2개의 페닐 기 (여기서 각각의 페닐은 -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된다); 또는
    b) 나프틸, 이미다졸, 또는 인돌 기
    로 치환된 C1-4 알킬이고;
    R6는 -C1-4 알킬-OH 또는 -C1-4 알킬-SH이며;
    R7은 -C1-4 알킬-OH 또는 -C1-4 알킬-SH이고;
    m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이며;
    R8은
    (a) -OH, -NRaRb, -N(Rc)C(O)Re, 또는 -N(Rc)C(=NRd)Re; 또는
    (여기서,
    Ra는 H이고;
    Rb는 H이거나, 옥소, 아세탈, 및 케탈, -B(OH)2, -SH, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 또는 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬이며;
    Rc는 H, C1-8 알킬, C3-8 사이클로알킬, 분지된 알킬, 또는 아릴이고;
    Rd는 H이거나, 각각 -N3, -NH2, -OH, -SH, 할로겐, 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬, C2-8 알케닐, C2-8 알키닐, C3-8 사이클로알킬, 분지된 알킬, 또는 아릴 기이며;
    Re는 H; -NHRd; 또는 각각 -N3, -NH2, -OH, -SH, 옥소, C2-4아세탈, C2-4케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, 및 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-12알킬, C3-8사이클로알킬, C2-12알케닐, C2-8알키닐, 또는 아릴 기이다)
    (b) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, -SH, -OH, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, 또는 -CO2C1-4알킬 기로 치환된 C1-12 알킬이고;
    R9는 C1-4알킬 또는-C1-2알킬렌-Rx이며, 여기서 Rx는 -CO2H, -CONH2, -CH2NHC(O)NH2, 또는 -CH2NHC(=NH)NH2이고;
    R10은
    (1) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CONH2 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬; 또는
    (2) 1개 또는 2개의 페닐 기, 또는 1개의 나프틸, 이미다졸, 또는 인돌 기로 치환된 C1-4 알킬 기 (여기서, 각각의 페닐은 -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개, 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된다)이고;
    n은 0 또는 1이며;
    p는 0 또는 1이고;
    X는 각각의 탄소가 -CO2H, -NH2, 또는 -NHC(O)Ry로 임의로 치환된, C1-8 알킬렌 또는 C2-8 알케닐렌이며, 여기서 기 알킬렌의 탄소 1개는 -C(O)NH-, 5-원 헤테로아릴 환, 또는 -S-S-로 임의로 치환되며;
    Ry는 -C1-4알킬 또는-CH(Rz)CO2H이고, 여기서 Rz는 -H이거나, -OH, -SH, 또는 -NH2로 임의로 치환된, -C1-4알킬이다.
  90. 제84항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 상기 1종 이상의 메디토프에 결합하고, 상기 1종 이상의 메디토프는 하기 화학식(X)의 펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 것인 진단 방법:
    Figure pct00034

    상기 식에서,
    "*"로 표시된 중심은 "R" 또는 "S" 배열로 존재하고;
    R3 및 R3'는, 각각 독립적으로, H이거나, C1-4 알킬, -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된, 페닐이며;
    R5는
    (A) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CO2C1-4 알킬, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CONH2 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬이거나;
    (B) a) 1개 또는 2개의 페닐 기 (여기서 각각의 페닐은 -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된다); 또는
    b) 나프틸, 이미다졸, 또는 인돌 기
    로 치환된 C1-4 알킬이고;
    R6는 -C1-4 알킬-OH 또는 -C1-4 알킬-SH이며;
    R7은 -C1-4 알킬-OH 또는 -C1-4 알킬-SH이고;
    m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이며;
    R8은
    (a) -OH, -NRaRb, -N(Rc)C(O)Re, 또는 -N(Rc)C(=NRd)Re; 또는
    (여기서,
    Ra는 H이고;
    Rb는 H이거나, 옥소, 아세탈, 및 케탈, -B(OH)2, -SH, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 또는 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬이며;
    Rc는 H, C1-8 알킬, C3-8 사이클로알킬, 분지된 알킬, 또는 아릴이고;
    Rd는 H이거나, 각각 -N3, -NH2, -OH, -SH, 할로겐, 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬, C2-8 알케닐, C2-8 알키닐, C3-8 사이클로알킬, 분지된 알킬, 또는 아릴 기이며;
    Re는 H; -NHRd; 또는 각각 -N3, -NH2, -OH, -SH, 옥소, C2-4아세탈, C2-4케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, 및 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-12알킬, C3-8사이클로알킬, C2-12알케닐, C2-8알키닐, 또는 아릴 기이다)
    (b) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, -SH, -OH, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, 또는 -CO2C1-4알킬 기로 치환된 C1-12 알킬이고;
    R9는 C1-4알킬 또는-C1-2알킬렌-Rx이며, 여기서 Rx는 -CO2H, -CONH2, -CH2NHC(O)NH2, 또는 -CH2NHC(=NH)NH2이고;
    R10은
    (1) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CONH2 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬; 또는
    (2) 1개 또는 2개의 페닐 기, 또는 1개의 나프틸, 이미다졸, 또는 인돌 기로 치환된 C1-4 알킬 기 (여기서, 각각의 페닐은 -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개, 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된다)이고;
    n은 0 또는 1이며;
    p는 0 또는 1이고;
    X는 각각의 탄소가 -CO2H, -NH2, 또는 -NHC(O)Ry로 임의로 치환된, C1-8 알킬렌 또는 C2-8 알케닐렌이며, 여기서 상기 알킬렌의 탄소 1개는 -C(O)NH-, 5-원 헤테로아릴 환, 또는 -S-S-로 임의로 치환되며;
    Ry는 -C1-4알킬 또는-CH(Rz)CO2H이이고, 여기서 Rz는 -H이거나, -OH, -SH, 또는 -NH2로 임의로 치환된, -C1-4알킬이다.
  91. 제84항에 있어서, 피험체에게 1종 이상의 메디토프를 투여하는 단계 (c)를 추가로 포함하고, 상기 1종 이상의 메디토프는 하기 화학식(X)의 펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 것인 진단 방법:
    Figure pct00035

    상기 식에서,
    "*"로 표시된 중심은 "R" 또는 "S" 배열로 존재하고;
    R3 및 R3'는, 각각 독립적으로, H이거나, C1-4 알킬, -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된, 페닐이며;
    R5는
    (A) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CO2C1-4 알킬, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CONH2 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬이거나;
    (B) a) 1개 또는 2개의 페닐 기 (여기서 각각의 페닐은 -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된다); 또는
    b) 나프틸, 이미다졸, 또는 인돌 기
    로 치환된 C1-4 알킬이고;
    R6는 -C1-4 알킬-OH 또는 -C1-4 알킬-SH이며;
    R7은 -C1-4 알킬-OH 또는 -C1-4 알킬-SH이고;
    m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이며;
    R8은
    (a) -OH, -NRaRb, -N(Rc)C(O)Re, 또는 -N(Rc)C(=NRd)Re; 또는
    (여기서,
    Ra는 H이고;
    Rb는 H이거나, 옥소, 아세탈, 및 케탈, -B(OH)2, -SH, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 또는 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬이며;
    Rc는 H, C1-8 알킬, C3-8 사이클로알킬, 분지된 알킬, 또는 아릴이고;
    Rd는 H이거나, 각각 -N3, -NH2, -OH, -SH, 할로겐, 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬, C2-8 알케닐, C2-8 알키닐, C3-8 사이클로알킬, 분지된 알킬, 또는 아릴 기이며;
    Re는 H; -NHRd; 또는 각각 -N3, -NH2, -OH, -SH, 옥소, C2-4아세탈, C2-4케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, 및 -CO2C1-4알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-12알킬, C3-8사이클로알킬, C2-12알케닐, C2-8알키닐, 또는 아릴 기이다)
    (b) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, -SH, -OH, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, 또는 -CO2C1-4알킬 기로 치환된 C1-12 알킬이고;
    R9는 C1-4알킬 또는-C1-2알킬렌-Rx이며, 여기서 Rx는 -CO2H, -CONH2, -CH2NHC(O)NH2, 또는 -CH2NHC(=NH)NH2이고;
    R10은
    (1) 옥소, 아세탈, 케탈, -B(OH)2, 붕산 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 오르토 에스테르, -CH=CH-CHO, -CH=CH-C(O)C1-4알킬, -CH=CH-CO2C1-4알킬, -CO2C1-4알킬, -CO2H, 및 -CONH2 기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된, C1-8 알킬; 또는
    (2) 1개 또는 2개의 페닐 기, 또는 1개의 나프틸, 이미다졸, 또는 인돌 기로 치환된 C1-4 알킬 기 (여기서, 각각의 페닐은 -OH, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개, 또는 3개의 치환기로 임의로 치환된다)이고;
    n은 0 또는 1이며;
    p는 0 또는 1이고;
    X는 각각의 탄소가 -CO2H, -NH2, 또는 -NHC(O)Ry로 임의로 치환된, C1-8 알킬렌 또는 C2-8 알케닐렌이며, 여기서 상기 알킬렌의 탄소 1개는 -C(O)NH-, 5-원 헤테로아릴 환, 또는 -S-S-로 임의로 치환되며;
    Ry는 -C1-4알킬 또는-CH(Rz)CO2H이고, 여기서 Rz는 -H이거나, -OH, -SH, 또는 -NH2로 임의로 치환된, -C1-4알킬이다.
  92. 제85항 내지 91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 메디토프가 다가 메디토프인 진단 방법.
  93. 제85항 내지 92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메디토프가 진단제에 커플링되는 것인 진단 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 진단제가 영상화제인 진단 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 영상화제는 형광 물질, 발광 물질, 염료, 표시제(indicators), 및 방사성 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 진단 방법.
  96. 제95항에 있어서, 상기 영상화제가 DOTA인 진단 방법.
  97. 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편의 생성 방법으로서,
    주형 항체 또는 이의 단편에서 하나 이상의 아미노산의 치환을 수행하는 단계로서, 상기 치환은, Kabat 넘버링에 따라, VL 영역의 40번, 41번, 또는 85번 위치, 또는 VH 영역의 40번 또는 89번 위치에서의 치환을 포함하는 것인 단계, 및
    이어서, 서열 번호: 1, 2, 16-18, 23, 29, 31, 32, 36, 39, 42, 43, 45, 46, 51, 52, 54, 및 55에 기재된 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 이로부터 유래된 환형 펩타이드인 메디토프에 결합하는 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편을 생성시키는 단계
    를 포함하는 생성 방법.
  98. 제97항에 있어서, 상기 주형 항체 또는 이의 단편은 아바고보맙, 아브식시맙, 아달리무맙, 아데카투무맙, 알렘투주맙, 알투모맙, 알투모맙 펜테테이트, 아나투모맙, 아나투모맙 마페노톡스, 아르시투모맙, 아틀리주맙, 바실릭시맙, 벡투모맙, 엑투모맙, 벨리무맙, 벤랄리주맙, 베바시주맙, 브렌툭시맙, 카나키누맙, 카프로맙, 카프로맙 펜데타이드, 카투막소맙, 세트롤리주맙, 클리바투주맙 테트락세탄, 다클리주맙, 데노수맙, 에쿨리주맙, 에드레콜로맙, 에팔리주맙, 에타라시주맙, 에르투막소맙, 파놀레소맙, Fbta05, 폰톨리주맙, 겜투주맙, 기렌툭시맙, 골리무맙, 이브리투모맙, 이고보맙, 인플릭시맙, 이필리무맙, 라베투주맙, 메폴리주맙, 무로모납. 무로모납-CD3, 나탈리주맙, 네시투무맙, 니모투주맙, 오파투무맙, 오말리주맙, 오레고보맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 라니비주맙, 리툭시맙, 사투모맙, 술레소맙, 이브리투모맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 토실리주맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, Trbs07, 우스테키누맙, 비실리주맙, 보투무맙, 잘루투무맙, 브로달루맙, 안루킨주맙, 바피네우주맙, 달로투주맙, 뎀시주맙, 가니투맙, 이노투주맙, 마브릴리무맙, 목세투모맙 파수도톡스, 릴로투무맙, 사이팔리무맙, 타네주맙, 트랄로키누맙, 트레멜리무맙, 우렐루맙, B6H12.2, 및 하이브리도마 10B5에 의해 생산된 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 생성 방법,
  99. 제97항 또는 98항에 있어서, 상기 메디토프-이용가능한 항체는, SPR로 측정될 때, 10 μM 미만의 해리 상수로 메디토프에 결합하는 것인 생성 방법.
  100. 제99항에 있어서, 상기 해리 상수가 5 μM 미만인 생성 방법.
  101. 제100항에 있어서, 상기 해리 상수가 2 μM 미만인 생성 방법.
  102. 제97항 내지 101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 메디토프가 서열 번호: 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이로부터 유래된 환형 펩타이드인 생성 방법.
  103. 제97항 내지 102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환 각각은, Kabat 넘버링에 따라, 경쇄의 8　, 9, 10, 38, 39, 40, 41 42, 43, 44, 45, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 142, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 및 173번 위치, 또는 중쇄의 6, 9, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 147, 150, 151, 152, 173, 174, 175, 176, 177, 185, 186, 및 187 번 위치로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에서 일어나는 것인 생성 방법.
  104. 제103항에 있어서, 상기 메디토프-이용가능한 항체는, Kabat 넘버링에 따라, P8　, V9 또는 I9, I10 또는 L10, Q38, R39, T40, N41 G42, S43, P44, R45, D82, I83, A84, D85, Y86, Y87, G99, A100, G101, T102, K103, L104, E105, R142, S162, V163, T164, E165, Q166, D167, S168, 및 Y173를 갖는 경쇄와 Kabat 넘버링에 따라, Q6, P9, R38, Q39, S40, P41, G42, K43, G44, L45, S84, D86, T87, A88, I89, Y90, Y91, W103, G104, Q105, G106, T107, L108, V111, T110, Y147, E150, P151, V152, T173, F174, P175, A176, V177, Y185, S186, 및 L187을 갖는 중쇄를 함유하는 것인 생성 방법.
  105. 제1항 내지 30항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  106. 제105항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  107. 제106항의 벡터를 포함하는 라이브러리.
  108. (a) 제107항의 라이브러리로부터 항체 또는 이의 단편을 발현시키는 단계; 및
    (b) 상기 발현된 항체 또는 이의 단편 중에서 항체 또는 이의 단편을 선택하는 단계
    를 포함하는 선별 방법.
  109. 제108항에 있어서, 상기 선택은 선택된 항체 또는 이의 단편의 결합 친화도, pH 내성(tolerance), pH 의존성, 독성, PK, 또는 PD를 기초로 하는 것인 선별 방법.
  110. 제108항 또는 109항에 있어서, 상기 선택은 항체 또는 이의 단편을 메디토프와 접촉시키고 메디토프에 대한 1종 이상의 항체 또는 이의 단편의 결합을 검출함으로써 수행하는 것인 선별 방법.
  111. 메디토프 유사체 또는 메디토프 변이체의 선택 방법으로서,
    (a) 메디토프를 메디토프-이용가능한 항체 또는 이의 단편과 합하여, 메디토프가 항체 또는 이의 단편에 비공유결합으로 결합하도록 하는 단계;
    (b) 후보 메디토프 변이체 또는 유사체를 첨가하는 단계; 및
    (c) 후보 메디토프 변이체 또는 유사체에 의한 상기 메디토프의 치환(displacement)을 측정하는 단계로서, 후보 변이체 또는 유사체에 의한 메디토프의 치환은 그것을 메디토프 변이체 또는 유사체로서 확인하는 것인 단계
    를 포함하는 선택 방법.
  112. 메디토프의 변형 방법으로서,
    서열 번호: 1, 2, 16-18, 23, 29, 31, 32, 36, 39, 42, 43, 45, 46, 51, 52, 54, 및 55 중 하나에 기재된 서열을 갖는 펩타이드, 또는 이로부터 유래된 환형 펩타이드에 대한 하나 이상 아미노산의 치환, 삽입, 또는 결실을 수행하여, 제1항 내지 30항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편에 대한 펩타이드의 결합 친화도의 pH-의존성을 변경시키는 단계
    를 포함하는 변형 방법.
  113. 제112항에 있어서, 상기 방법은 리소좀 pH 수준에서 항체 또는 이의 단편에 대한 펩타이드의 결합 친화도를 감소시키는 것인 변형 방법.
  114. 제112항 또는 113항에 있어서, 상기 방법은 저산소 환경에서 결합 친화도를 증가시키는 것인 변형 방법.
  115. 메디토프-이용가능한 항체의 변형 방법으로서,
    Kabat 넘버링에 따라, 메디토프-이용가능한 항체의, 경쇄의 8　, 9, 10, 38, 39, 40, 41 42, 43, 44, 45, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 142, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 및/또는 173번 위치, 또는 중쇄의 6, 9, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 147, 150, 151, 152, 173, 174, 175, 176, 177, 185, 186, 및/또는 187번 위치에서 하나 이상의 변형을 수행하는 단계
    를 포함하는 변형 방법.
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Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8962804B2 (en) 2010-10-08 2015-02-24 City Of Hope Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof
US20170275367A1 (en) 2012-11-21 2017-09-28 Janssen Biotech, Inc. Bispecific EGFR/C-Met Antibodies
SMT201800624T1 (it) * 2012-11-21 2019-01-11 Janssen Biotech Inc Anticorpi egfr/c-met bispecifici
SI2981822T1 (sl) 2013-05-06 2021-08-31 Scholar Rock, Inc. Sestavki in postopki za modulacijo rastnega dejavnika
EP3019533B1 (en) 2013-07-11 2020-01-08 The Scripps Research Institute Coiled coil immunoglobulin fusion proteins and compositions thereof
AU2015327824B2 (en) * 2014-10-02 2021-01-07 City Of Hope Multivalent meditopes, meditope-binding antibodies and uses thereof
JP6951973B2 (ja) 2014-11-12 2021-10-20 シージェン インコーポレイテッド グリカン相互作用化合物及び使用方法
US9879087B2 (en) 2014-11-12 2018-01-30 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
DK3250604T3 (da) * 2015-01-26 2021-07-12 Cellectis MAb-drevne kimæriske antigenreceptorsystemer til sortering/depletering af manipulerede immunceller
US9809625B2 (en) * 2015-03-18 2017-11-07 Bristol-Myers Squibb Company Immunomodulators
WO2016161018A1 (en) * 2015-03-30 2016-10-06 City Of Hope Mechanically interlocking complexes
EP3842448A1 (en) * 2015-05-15 2021-06-30 City of Hope Chimeric antigen receptor compositions
WO2017044866A2 (en) * 2015-09-11 2017-03-16 Nascent Biotech, Inc. Enhanced delivery of drugs to the brain
WO2017069158A1 (ja) * 2015-10-22 2017-04-27 プロテノバ株式会社 イムノグロブリン結合ポリペプチド
US11028181B2 (en) 2015-11-12 2021-06-08 Seagen Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
WO2017120599A1 (en) * 2016-01-08 2017-07-13 Meditope Biosciences, Inc. Self-crosslinking antibodies
WO2017136581A1 (en) * 2016-02-02 2017-08-10 Meditope Biosciences, Inc. Anti-egfr antibody drug conjugate
CN111363041B (zh) * 2016-03-23 2022-02-22 苏州创胜医药集团有限公司 新型抗-pd-l1抗体
KR20190015461A (ko) * 2016-06-06 2019-02-13 노쓰웨스턴유니버시티 융합 단백질 작제물
US11116834B2 (en) 2016-10-19 2021-09-14 City Of Hope Use of endogenous viral vaccine in chimeric antigen receptor T cell therapy
US11401330B2 (en) 2016-11-17 2022-08-02 Seagen Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
WO2018106842A1 (en) * 2016-12-06 2018-06-14 City Of Hope Cysteine peptide-enabled antibodies
JP2020510671A (ja) 2017-03-03 2020-04-09 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド グリカン相互作用化合物および使用の方法
JP2021508468A (ja) * 2017-12-29 2021-03-11 シティ・オブ・ホープＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ メディトープ対応ｔ細胞
WO2020027237A1 (ja) * 2018-08-01 2020-02-06 国立大学法人鹿児島大学 ペプチド融合タンパク質
US20220096653A1 (en) * 2019-01-07 2022-03-31 Astellas Pharma Inc. Conjugate comprising ligand and ceacam5 antibody fab fragment
CN110379467B (zh) * 2019-07-17 2022-08-19 成都火石创造科技有限公司 一种化学分子式切分方法
CN110669108A (zh) * 2019-09-06 2020-01-10 中国药科大学 一种多肽及其应用
WO2021118156A2 (ko) * 2019-12-09 2021-06-17 (주)옵토레인 스위칭 결합제, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 약학 조성물, 검사 키트 및 항원과 항체의 분석 방법
US11492394B1 (en) 2021-10-29 2022-11-08 Nascent Biotech, Inc. Kits and containers for treating vimentin expressing tumors
CN117187189B (zh) * 2023-11-02 2024-02-27 北京丹大生物技术有限公司 一种用于检测乌司奴单抗的杂交瘤细胞株组合和抗体组合及其应用

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2204890T3 (es) 1991-03-06 2004-05-01 Merck Patent Gmbh Anticuerpos monoclonales humanizados.
JP4460302B2 (ja) 2002-02-05 2010-05-12 ジェネンテック インコーポレイテッド タンパク質精製法
JP4381826B2 (ja) 2002-04-22 2009-12-09 ユニヴァーシティ オヴ フロリダ 機能化されたナノ粒子及びその使用方法
WO2005056606A2 (en) * 2003-12-03 2005-06-23 Xencor, Inc Optimized antibodies that target the epidermal growth factor receptor
JP4889493B2 (ja) * 2003-05-14 2012-03-07 ドマンティス リミテッド ポリペプチドレパートリーから可逆的にアンフォールドするポリペプチドを回収するための方法
EP1660534A2 (en) * 2003-08-22 2006-05-31 MedImmune, Inc. Humanization of antibodies
HUE039803T2 (hu) * 2004-01-07 2019-02-28 Novartis Vaccines & Diagnostics Inc M-CSF-specifikus monoklonális ellenanyag és alkalmazásai
MXPA06012601A (es) 2004-05-10 2007-05-10 Macrogenics Inc Anticuerpos especificos de fcy riib humanizados y metodos de uso de los mismos.
US8642330B2 (en) * 2005-08-08 2014-02-04 Onconon, Llc Antibody compositions, methods for treating neoplastic disease and methods for regulating fertility
US10183986B2 (en) 2005-12-15 2019-01-22 Industrial Technology Research Institute Trimeric collagen scaffold antibodies
MX2008009494A (es) 2006-01-23 2009-01-07 Joseph P Errico Metodos y composiciones de desarrollo dirigido de farmacos.
EP2041180B8 (en) * 2006-06-19 2014-03-05 Liquidating Trust Ilt3 binding molecules and uses therefor
EP2468770B1 (en) * 2006-07-14 2017-12-20 AC Immune S.A. Humanized antibody against amyloid beta.
US9382327B2 (en) * 2006-10-10 2016-07-05 Vaccinex, Inc. Anti-CD20 antibodies and methods of use
MX2009013328A (es) * 2007-06-25 2010-06-02 Esbatech An Alcon Biomedical R Metodos para modificar anticuerpos, y anticuerpos modificados con propiedades funcionales mejoradas.
US8092804B2 (en) * 2007-12-21 2012-01-10 Medimmune Limited Binding members for interleukin-4 receptor alpha (IL-4Rα)-173
ES2518415T3 (es) * 2007-12-21 2014-11-05 Medimmune Limited Elementos de unión para receptor alfa de interleucina-4 (IL-4Ralfa)
US9029508B2 (en) * 2008-04-29 2015-05-12 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CA2814040C (en) * 2010-10-08 2021-03-23 Joshua Michael Donaldson A monoclonal antibody framework binding interface for meditopes, meditope delivery systems and methods for their use

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