KR20190015461A - 융합 단백질 작제물 - Google Patents

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KR20190015461A
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밀란 므르크시크
저스틴 에이. 모디카
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노쓰웨스턴유니버시티
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Abstract

본 개시내용은, 제1 융합 단백질, 제2 융합 단백질, 및 링커를 포함하며, 여기서 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질은 각각 친화성 시약 및 반응성 효소를 포함하고, 링커는 제1 및 제2 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 제1 및 제2 작용기를 포함하는 것인 작제물을 제공한다. 본 개시내용은 또한, (a) 친화성 시약 및 반응성 효소를 포함하는 제1 융합 단백질을, 제1 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 작용기를 포함하는 링커와 접촉시킴으로써, 제1 융합 단백질 및 링커를 커플링하고, (b) 친화성 시약 및 반응성 효소를 포함하는 제2 융합 단백질을, 제2 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 작용기를 포함하는 링커와 접촉시킴으로써, 제2 융합 단백질 및 링커를 커플링하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

Description

융합 단백질 작제물
본 개시내용은 일반적으로 융합 단백질 작제물 및 그의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 모듈 합성에 의해 제조된 적어도 제1 융합 단백질 및 링커에 의해 커플링된 제2 융합 단백질을 포함하는 정확하게 정의된 융합 단백질 작제물에 관한 것이다.
생물학적 약물, 특히 모노클론 항체 (mAb)와 항체 단편을 포함하는 약물은 순환에서 또는 세포 표면 상에서의 질병 관련 단백질을 특이적으로 표적화할 수 있는 능력 때문에 제약 산업에서 중요하다. 강화된 치료 잠재력을 나타내는 차세대 항체 치료제는, 항체 결합가를 증가시키고, 세포독성과 반감기를 증가시키는 이펙터 분자를 부착하고, 면역계를 표적 제거를 향해 지향시키는 포맷을 사용하여 생성되었다. 그러나, 이들 분자는 원하는 기능을 체계적으로 최적화할 수 있게 하는 합성 유연성을 가지며 고수율로 생성하기 어려운 경우가 많다.
예를 들어, 확장된 기능성을 갖는 현재 항체 포맷은, 동시에 발현되어야 하는 다수의 도메인을 특징으로 하기 때문에 안정성 또는 기능을 위해 성공적으로 최적화되어야한다. 현재의 화학적 방법은 반응성 아미노산의 엔지니어링 또는 항체 스캐폴드에 페이로드를 부착하기 위한 기존의 반응성 아미노산 측쇄의 사용을 필요로 한다. 많은 경우, 이들 반응의 생성물은 이종의 생성물 집단을 생성한다. 이러한 직접적 아미노산 변형은 또한 안정하지 않을 수 있거나 모(parent) 분자의 약리학적 특성 (예를 들어, 증가된 소수성, 응집성, 면역원성 등)에 해로운 영향을 미칠 수 있으므로, 페이로드 부착에 있어 적합한 위치 선택에 많은 노력을 기울여야 한다.
추가로, 현재의 항체 기술은 기하구조 (예를 들어, 시클릭 분자, 도메인 사이의 거리가 가변적인 분자 등), 배향, 화학량론 및 결합가가 전형적인 폴리펩티드 엔지니어링에 의해 가능해지는 것의 경우를 넘어서 체계적으로 제어될 수 있는 스캐폴드의 생성물을 가능하게 하지 않는다. 생성 기술의 이러한 제약은 현재의 포맷이 조사할 수 있는 치료 공간에 엄청난 제약을 부여한다. 현재의 단백질 엔지니어링 방법은, 천연 폴리펩티드 폴드/펩티드 링커의 내재적 레파토리로 원하는 작제물을 달성하는 것으로 제한된다. 따라서 보다 큰 효능을 나타낼 수 있는 비-천연 포맷은 종래의 엔지니어링 방법을 사용하여 제조할 수 없다. 또한, 발현 숙주의 대사 프로파일 또는 독성 제약으로 인해, 일부 이펙터 분자는 하나의 배양 시스템에서 함께 효과적으로 생성될 수 없다. 추가로, 분자의 복잡성이 증가함에 따라 보다 큰 분자의 정확한 폴딩, 조립 및 정제가 보다 어려워져서, 수율이 감소하고 비용이 증가한다.
또한, 항체 분자의 산업적 생성은, 일반적으로 원핵 숙주보다 덜 강건하고 원핵 숙주에 비해 생성 수율이 감소된, 진핵 숙주에서의 항체 또는 항체-유사 단편의 발현을 필요로 하여, 원핵 생물에서 발현될 수 있는 항체 또는 항체-유사 단편에 비해 더 높은 운영 비용을 초래한다.
따라서, 단순히 비교적 작은 수의 빌딩 블록의 조합에 의해 변경된 결합가, 기하구조, 이펙터 기능 및 화학량론을 갖는 항체-유사 약물의 다양한 라이브러리의 생성을 허용하는 고분자량을 갖는 차세대 항체 치료제의 비용 효과적 제조 방법에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명의 한 측면은, 제1 융합 단백질, 제2 융합 단백질, 및 링커를 포함하며, 여기서 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질은 각각 친화성 시약 및 반응성 효소를 포함하고, 링커는 제1 말단에 제1 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 제1 작용기, 및 제2 말단에 제2 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 제2 작용기를 포함하는 것인 작제물을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 양태는, (a) 친화성 시약 및 반응성 효소를 포함하는 제1 융합 단백질을, 제1 말단에 제1 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 작용기를 포함하는 링커와 접촉시킴으로써, 제1 융합 단백질 및 링커를 제1 말단에서 커플링하고, (b) 친화성 시약 및 반응성 효소를 포함하는 제2 융합 단백질을, 제2 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 작용기를 포함하는 링커의 제2 말단과 접촉시킴으로써, 제2 융합 단백질 및 링커를 제2 말단에서 커플링하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 본 개시내용의 방법에 의해 제조된 작제물을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 양태는, 본 개시내용의 작제물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 본 개시내용의 다른 양태는 본 개시내용의 작제물의 약제로서 및/또는 진단제로서의 용도를 제공한다.
하기 상세한 설명의 재검토로부터 추가의 양상들 및 이점들이 당업자에게 명백할 것이다. 작제물 및 그의 제조 방법 및 용도는 다양한 형태의 구현예가 가능하지만, 이하의 설명은, 본 개시내용이 예시적이고, 본 발명을 본원에 기재된 구체적 구현예로 제한하도록 의도되지는 않는다는 이해와 함께 구체적 구현예를 포함한다.
도 1은 트라스투주맙 F(ab) (TFab) 융합 유전자/단백질 작제물을 나타낸다.
도 2는 정제된 TFab-큐티나제 및 TFab-SnapTag 융합체의 SDS-PAGE 겔을 나타낸다.
도 3은 2가 작제물의 SDS-PAGE 겔을 나타낸다.
도 4는 트라스투주맙 및 융합 단백질 작제물, B-13의 세포 생존율 분석 데이터를 나타낸다.
도 5는 시간 경과에 따른 마우스에서의 B-13 작제물의 혈청 농도의 플롯이다.
도 6은 BT474 종양 이식편을 갖는 마우스에 대한 B-13 투여의 효과 결과를 나타낸다. A) 2.5 및 5 mg/kg으로 매일 비히클, B13으로, 또한 2.5 mg/kg으로 주2회 독소루비신 (dox)으로 4주에 걸쳐 치료된 동물의 종양 부피 진행. 28일째, 비히클 vs. 독소루비신 (p = .0002)과 비히클 vs. 2개의 B13 치료군 (p = .0001) 사이의 종양 부피에는 유의한 차이가 있다. B) 4개의 치료 코호트에서 동물의 총 체중 측정. 비히클과 독소루비신 (p = .0116) 사이에는 총 체중의 유의한 차이가 있지만, 비히클과 2.5 mg/kg (p = .2237) 또는 5 mg/kg (p = .4297)으로의 B13 치료 사이에는 유의한 차이가 없다. C) 4개의 치료 코호트에서 동물의 기관 중량. 각 군 사이에 기관 중량의 유의한 차이는 없다 (p = 0.9493). P-값은 그래프 패드(Graph Pad) 7.0에서 이원 아노바(ANOVA)를 사용하여 계산되었다.
본원에는 작제물 및 작제물의 제조 및 사용 방법이 제공된다. 작제물은 제1 융합 단백질, 제2 융합 단백질, 및 링커를 포함하며, 여기서 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질은 각각 친화성 시약 및 반응성 효소를 포함하고, 링커는 제1 말단에 제1 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 제1 작용기, 및 제2 말단에 제2 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 제2 작용기를 포함한다. 구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소 및 제2 융합 단백질 반응성 효소는 상이하다. 구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소 및 제2 융합 단백질 반응성 효소는 동일하다. 구현예에서, 제1 융합 단백질 친화성 시약 및 제2 융합 단백질 친화성 시약은 상이하다. 구현예에서, 제1 융합 단백질 친화성 시약 및 제2 융합 단백질 친화성 시약은 동일하다. 선택적으로, 구현예에서, 각각의 친화성 시약은, 항체 또는 그의 단편, 소분자, 단일체(monobody), 단백질, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
친화성 시약 및 반응성 효소의 융합 단백질의 작제물
개시된 작제물은 링커를 통해 연결된 친화성 시약 및 반응성 효소의 융합 단백질을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 또한 달리 특정되지 않는 한, "친화성 시약"은, 원하는 표적에 대한 친화성, 예를 들어 치료 시스템에서 표적 에피토프에 결합하는 능력 및/또는 바이오센서 시스템에서 분석물을 결합 또는 인식하는 능력을 나타내는 모이어티를 지칭한다. 친화성 시약의 예는, 항체 또는 그의 단편, 소분자, 단일체 및 단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 또한 달리 특정되지 않는 한, "반응성 효소"는, 활성-부위 잔기를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 작용기에 커플링할 수 있는 활성-부위 잔기를 포함하는 효소를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 또한 달리 특정되지 않는 한, "단백질"은, 천연 발생 폴리펩티드, 천연 및/또는 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 파지 내의 단백질, 치료 단백질, 및 합성 또는 천연 유래 항체 도메인을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "폴리펩티드"는 아미노산 잔기로 구성된 중합체를 지칭한다. 폴리펩티드는 당업계에서 이해되며, 항체, 효소, 구조적 폴리펩티드 및 호르몬을 비-제한적으로 포함한다. 본 개시내용의 폴리펩티드는 천연 발생 또는 비-천연 발생의 것일 수 있다.
천연 발생 폴리펩티드는 본질적으로 존재하거나, 예를 들어 화학적 합성 또는 재조합 발현 기술에 의해 자연에서 발견되는 형태로 생성될 수 있는 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 (항체를 포함함)를 비-제한적으로 포함한다. 천연 발생 폴리펩티드는 또한, 예를 들어, 그러나 비-제한적으로 글리코실화된 단백질과 같은 번역 후 변형된 단백질 및 지질단백질을 포함한다.
본 개시내용의 방법 및 조성물에서 사용하기 위해 고려되는 항체는 생체내에서 또는 시험관내에서 표적 분자를 인식하고 그와 회합하는 항체를 비-제한적으로 포함한다.
본 개시내용에 의해 고려되는 구조적 폴리펩티드는 액틴, 튜불린, 콜라겐, 엘라스틴, 미오신, 키네신 및 다이네인을 비-제한적으로 포함한다.
본 개시내용에서 고려되는 비-천연 발생 폴리펩티드는 합성 폴리펩티드뿐만 아니라 본원에서 정의된 바와 같은 천연 발생 또는 비-천연 발생 폴리펩티드의 단편, 유사체 및 변종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 비-천연 발생 폴리펩티드는 또한, D-아미노산, D- 또는 L- 배열의 변형된, 유도체화된, 또는 비-천연 발생 아미노산 및/또는 그의 구조의 일부로서 펩티드 유사체 단위를 갖는 단백질 또는 단백질 물질을 포함한다. 용어 "단백질"은 전형적으로 대형 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "펩티드"는 전형적으로 짧은 폴리펩티드를 지칭한다.
비-천연 발생 폴리펩티드는, 예를 들어, 자동화된 폴리펩티드 합성기를 사용하여, 또는 대안으로, 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 변형된 폴리뉴클레오티드를 사용하는 재조합 발현 기술을 사용하여 제조된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드의 "단편"은 전장 폴리펩티드 또는 단백질 발현 생성물보다 작은 폴리펩티드 또는 단백질의 임의의 부분을 지칭하도록 의도된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유사체"는, 구조가 유사하고 동일한 생물학적 활성을 갖지만, 전체 분자 또는 그의 단편에 대해 다양한 정도의 활성을 가질 수 있는 둘 이상의 폴리펩티드 중 임의의 것을 지칭한다. 유사체는 다른 아미노산에 대한 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 하나 이상의 변이에 기초하여 그의 아미노산 서열의 조성이 상이하다. 치환은 대체되는 아미노산 및 이를 대체하는 아미노산의 물리-화학적 또는 기능적 관련성에 기초하여 보존적이거나 비-보존적일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "변종"은, 통상적으로 분자의 일부가 아닌 추가적인 화학적 모이어티를 포함하도록 변형된 폴리펩티드, 단백질 또는 그의 유사체를 지칭한다. 이러한 모이어티는, 예를 들어, 또한 비-제한적으로, 분자의 용해도, 흡수 및/또는 생물학적 반감기를 조절할 수 있다. 이러한 효과를 매개할 수 있는 모이어티는 [Remington's Pharmaceutical Sciences (1980)]에 개시되어 있다. 이러한 모이어티를 분자에 커플링하기 위한 절차는 당업계에 잘 알려져 있다.
Fab'단편, F(ab)2 단편, Fv 단편, Fc 단편, 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 개개의 중쇄, 개개의 경쇄, 이량체 중쇄 및 경쇄 (무손상(inact) 항체, 단일 사슬 항체 (scAb), 인간화 항체 (뿐만 아니라 인간화 항체의 방식으로 변형된, 그러나 생성된 항체가 비-인간 종에서의 항체와 더 가깝게 유사한 항체)에서 발견되는 헤테로테트라머 중쇄 및 경쇄와는 대조적임), 킬레이팅 재조합 항체 (CRAB), 이중 특이성 항체 및 다중 특이성 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 항체 및 그의 단편 또는 유도체, 및 당업계에 공지된 다른 항체 유도체 또는 단편이 고려된다.
상기 양태의 구현예에서, 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편은 트라스투주맙 또는 그의 단편, 락시바카맙 또는 그의 단편, 토실리주맙 또는 그의 단편, 브렌툭시맙 또는 그의 단편, 오파투무맙 또는 그의 단편, 벨리무맙 또는 그의 단편, 라무시루맙 또는 그의 단편, 베돌리주맙 또는 그의 단편, 오비누투주맙 또는 그의 단편, 펨브롤리주맙 또는 그의 단편, 라니비주맙 또는 그의 단편, 페르투주맙 또는 그의 단편, 데노수맙 또는 그의 단편, 카투막소맙 또는 그의 단편, 골리무맙 또는 그의 단편, 실툭시맙 또는 그의 단편, 나탈리주맙 또는 그의 단편, 파니투무맙 또는 그의 단편, 데노수맙 또는 그의 단편, 및 이들의 조합을 포함한다.
구현예에서, 링커는 폴리옥사졸린, 폴리아크릴로모르폴린, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말레산 무수물, 폴리(1-히드록시메틸에틸렌 히드록시메틸 포르말) ("PHF"), 폴리히드록시알킬아크릴레이트, 2-메티아크릴로일옥시-2'-에틸트리메틸암모늄 포스페이트 ("MPC"), 또는 하기로부터 선택된 구조이다:
Figure pct00001
또는
Figure pct00002
;
여기서, m은 0 내지 10이고; n은 1 내지 100이고; 각각의 p는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이고; q는 0, 1 또는 2이고; r은 1 또는 2이고; E는 NH 또는 CHR10이고; G는 O, CH2, CHOH, CHNH2, CHCOOH 또는 CHSO3H이고; R10은 OH, NH2 또는 COOH이고; 각각의 R11은 독립적으로 H, OH, NH2, 또는 COOH이다.
구현예에서, 각각의 반응성 효소는, 큐티나제, SnapTag, HaloTag, 타입 I DNA 토포이소머라제의 릴렉사제(relaxase) 도메인, 베타-락타마제, 글리코시다제, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 세포질 단백질 티로신 키나제 도메인, 알칼리 포스파타제, 단백질-티로신-포스파타제, 23S rRNA(아네닌(2503)-C(2))-메틸트랜스퍼라제의 변이체, 글루코시다제, N-6 아데닌-특이적 DNA 메틸라제, N(4)-시토신-특이적 DNA 메틸라제, DNA (시토신-5-)메틸트랜스퍼라제, 할로알칸 데할로게나제의 변이체, HNH 엔도뉴클레아제, 닉킹 엔도뉴클레아제, 젤라티나제 B, 젤라티나제 A, 스트로멜리신, 지방산 아미드 히드롤라제, 에스테라제, 사이토크롬 P450, 메티오닌 아미노펩티다제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 구현예에서, 각각의 반응성 효소는 큐티나제, 할로알칸 데히드로게나제 HaloTag, 변이체 O6-알킬구아닌 DNA 알킬트랜스퍼라제, SnapTag, 타입 I DNA 토포이소머라제의 릴렉사제 도메인, 베타락타마제, 글리코시다제, 매트릭스 메탈로프로네이나제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 구현예에서, 각각의 반응성 효소는 큐티나제, 할로알칸 데히드로게나제 HaloTag, 변이체 O6-알킬구아닌 DNA 알킬트랜스퍼라제, SnapTag, 및 이들의 조합으로부터 독립적으로 선택된다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소 및 제2 융합 단백질 반응성 효소는 상이하다. 구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소 및 제2 융합 단백질 반응성 효소는 동일하다. 구현예에서, 제1 융합 단백질 친화성 시약 및 제2 융합 단백질 친화성 시약은 상이하다. 구현예에서, 제1 융합 단백질 친화성 시약 및 제2 융합 단백질 친화성 시약은 동일하다. 선택적으로, 구현예에서, 각각의 친화성 시약은, 항체 또는 그의 단편, 소분자, 단일체, 단백질, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
구현예에서, 친화성 시약 및 반응성 효소의 융합 단백질은, 반응성 효소를 친화성 시약에 부착시키기 위한 통상적 합성 화학 기술에 의해 형성된다. 친화성 시약이 단백질 또는 항체를 포함하는 일부 경우에, 융합 단백질은, 친화성 시약 및 반응성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현시킴으로써 생성된다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 추가의 양태에서, 본 개시내용은 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포이다. 추가의 구현예에서, 숙주 세포는 포유 동물 세포이다. 관련된 구현예에서, 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 효모 세포이다. 추가의 양태에서는, 폴리펩티드의 발현을 유도하기에 적절한 조건 하에 본 개시내용의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본원에 개시된 융합 단백질의 제조 방법이 제공된다. 관련된 구현예에서, 폴리펩티드는 단리된다.
친화성 시약
본 발명의 작제물은 융합 단백질에 기능성을 제공하는 친화성 시약을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 따라서, 정확하게 정의된 구조 및 기능을 갖는 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질을 포함하는 작제물을 조립할 수 있다. 친화성 시약을 통해 융합 단백질에 부여된 기능성의 예는, 순환에서 또는 세포 표면 상에서의 질병 관련 단백질의 강화된 표적화, 증가된 세포독성, 면역조절, 약물 전달, 조영제로서의 사용, 진단제로서의 사용, 또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
제1 친화성 시약 및 제2 친화성 시약은 동일하거나 상이할 수 있다. 각각의 친화성 시약은 항체 또는 그의 단편, 소분자, 단일체, 단백질, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
구현예에서, 친화성 시약은 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 항체 또는 그의 단편은 경쇄 가변 도메인 (VL), 경쇄 불변 도메인 (CL), 중쇄 가변 도메인 (VH), 중쇄 불변 도메인 (CH1), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 항체 또는 그의 단편은 키메라 항체, 인간 항체, 및 인간화 항체일 수 있다. 항체 또는 그의 단편의 예는, 트라스투주맙 또는 그의 단편, 락시바카맙 또는 그의 단편, 토실리주맙 또는 그의 단편, 브렌툭시맙 또는 그의 단편, 오파투무맙 또는 그의 단편, 벨리무맙 또는 그의 단편, 라무시루맙 또는 그의 단편, 베돌리주맙 또는 그의 단편, 오비누투주맙 또는 그의 단편, 펨브롤리주맙 또는 그의 단편, 라니비주맙 또는 그의 단편, 페르투주맙 또는 그의 단편, 데노수맙 또는 그의 단편, 카투막소맙 또는 그의 단편, 골리무맙 또는 그의 단편, 실툭시맙 또는 그의 단편, 나탈리주맙 또는 그의 단편, 파니투무맙 또는 그의 단편, 및 데노수맙 또는 그의 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
구현예에서, 친화성 시약은 소분자를 포함한다. 소분자는 약물일 수 있다. 소분자 약물의 예는, 알데스류킨, 알렌드론산, 알파페론, 알리트레티노인, 알로푸리놀, 알로프림, 알록시, 알트레타민, 아미노글루테티미드, L-아스파라기나제, 아미포스틴, 암루비신, 암사크린, 아나스트로졸, 안즈메트, 아라네스프, 아르글라빈, 아르세닉 트리옥시드, 아로마신, 5-아자시티딘, 아자티오프린, BCG 또는 타이스(tice)-BCG, 베스타틴, 베타메타손 아세테이트, 베타메타손 나트륨 포스페이트, 벡사로텐, 블레오마이신 설페이트, 브록수리딘, 보르테조밉, 블레오마이신, 부술판, 칼시토닌, 캄파쓰, 카페시타빈, 카보플라틴, 카르무스틴, 카소덱스, 세페손, 셀몰류킨, 세루비딘, 클로람부실, 시스플라틴, 콜라스파제, 클라드리빈, 클로드론산, 시클로포스파미드, 시타라빈, 다카르바진, 닥티노마이신, 다우녹솜, 데카드론, 데카드론 포스페이트, 델레스트로겐, 데닐류킨 디프티톡스, 데포메드롤, 데슬로렐린, 덱스라족산, 다우노루비신, 디에틸스틸베스트롤, 2',2'-디플루오로데옥시시티딘, 디플루칸, 도세탁셀, 독시플루리딘, 독소루비신, 드로나비돌, DW-166HC, 엘리가르드, 엘리테크, 엘렌스, 에멘드, 에피루비신, 에포에틴-알파, 에포겐, 에프타플라틴, 에르가미솔, 에스트라세, 에스트라디올, 에스트라무스틴 나트륨 포스페이트, 에티닐에스트라디올, 에티올, 에티드론산, 에토포포스, 에토포시드, 파드로졸, 파르스톤, 필그라스팀, 피나스테리드, 플리그라스팀, 플록수리딘, 플루코나졸, 플루다라빈, 플루다라빈 포스페이트, 5-플루오로데옥시우리딘, 5-플루오로데옥시우리딘 모노포스페이트, 5-플루오로우라실 (5-FU), 플루옥시메스테론, 플루타미드, 헥사메틸멜라민, 포르메스탄, 포스테아빈, 포테무스틴, 풀베스트란트, 감마가르드, 젬시타빈, 젬투주맙, 글리벡, 글리아델, 고세렐린, 그라니세트론 히드로클로라이드, 히스트렐린, 히캄틴, 히드로코르톤, 에리트로-히드록시노닐아데닌, 히드록시우레아, 히드록시프로게스테론 카프로에이트, 이브리투모맙 티욱세탄, 이다루비신, 이포스파미드, 인터페론-알파, 인터페론-알파-2, 인터페론-알파-2α, 인터페론-알파-2β, 인터페론-알파-n1, 인터페론-알파-n3, 인터페론-베타, 인터페론-감마-1α, 인터류킨-2, 인트론 A, 이레사, 이리노테칸, 키트릴, 렌티난 설페이트, 레트로졸, 류코보린, 류프롤리드, 류프롤리드 아세테이트, 레바미솔, 레보폴산 칼슘 염, 레보트로이드, 레복실, 로무스틴, 로니다민, 마리놀, 메클로레타민, 메코발라민, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트, 멜팔란, 메네스트, 6-메르캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 메트빅스, 밀테포신, 미노사이클린, 미토마이신 C, 미토탄, 미톡산트론, 모드레날, 미오세트, 네다플라틴, 뉼라스타, 뉴메가, 뉴포겐, 닐루타미드, 놀바덱스, NSC-631570, OCT-43, 옥트레오티드, 온단세트론 히드로클로라이드, 오파프레드, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 페디아프레드, 페파스파르가세, 페가시스, 펜토스타틴, N-포스포노아세틸 L-아스파르테이트 (PALA), 피시바닐, 필로카르핀 히드로클로라이드, 피라루비신, 플리카마이신, 포르피메르 나트륨, 프레드니무스틴, 프레드니솔론, 프레드니손, 프레마린, 프로카바진, 프로크리트, 랄티트렉세드, 레비프, 레늄-186 에티드로네이트, 리툭시맙, 로페론-A, 로무르티드, 살라겐, 산도스타틴, 사르그라모스팀, 세무스틴, 시조피란, 소부족산, 솔루-메드롤, 스트렙토조신, 스트론튬-89 클로라이드, 신트로이드, 타목시펜, 탐술로신, 타소네르민, 타스톨락톤, 탁소테르, 테셀류킨, 테모졸로미드, 테니포시드, 테스토스테론 프로피오네이트, 테스트레드, 티오구아닌, 티오테파, 티로트로핀, 틸루드론산, 토포테칸, 토레미펜, 토시투모맙, 타스투주맙, 테오술판, 트레티노인, 트렉살, 트리메틸멜라민, 트리메트렉세이트, 트리프토렐린 아세테이트, 트리프토렐린 파모에이트, UFT, 우리딘, 발루비신, 베스나리논, 빈블라스틴, 빈크리틴, 빈데신, 비노렐빈, 비룰리진, 지네카르드, 지노스타틴-스티말라메르, 조프란; ABI-007, 아콜비펜, 악티뮨, 아피니탁, 아미노프테린, 아르족시펜, 아소프리스닐, 아타메스탄, 아트라센탄, 아바스틴, BAY 43-9006 (소라페닙), CCI-779, CDC-501, 셀레브렉스, 세툭시맙, 크리스나톨, 시프로테론 아세테이트, 데시타빈, DN-101, 독소루비신-MTC, dSLIM, 두타스테리드, 에도테카린, 에플로르니틴, 엑사테칸, 펜레티니드, 히스타민 디히드로클로라이드, 히스트렐린 히드로겔 임플란트, 홀뮴-166 DOTMP, 이반드론산, 인터페론-감마, 인트론-PEG, 익사베필론, 키홀 림펫 헤모시아닌, L-651582, 란레오티드, 라소폭시펜, 리브라, 로나파르닙, 미프록시펜, 미노드로네이트, MS-209, 리포좀 MTP-PE, MX-6, 나파렐린, 네모루비신, 네오바스타트, 놀라트렉세드, 오블리메르센, 온코-TCS, 오시뎀, 파클리탁셀 폴리글루타메이트, 파미드로네이트 이나트륨, PN-401, QS-21, 쿠아제팜, R-1549, 랄록시펜, 란피르나스, 13-시스-레트산, 사트라플라틴, 세오칼시톨, T-138067, 타르세바, 탁소프렉신, 티모신-알파-1, 티아조푸린, 티피파르닙, 티라파자민, TLK-286, 토레미펜, 트랜스MID-107R, 발스포다르, 바프레오티드, 바탈라닙, 베르테포르핀, 빈플루닌, Z-100, 졸레드론산, 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
구현예에서, 친화성 시약은 단백질을 포함한다. 구현예에서, 단백질은 천연 단백질, 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 파지 내의 단백질, 치료 단백질, 합성 항체 도메인, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 구현예에서, 단백질은 비-천연 아미노산, 파지 내의 단백질, 치료 단백질, 합성 항체 도메인, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구현예에서, 친화성 시약은 디자인된 안키린 반복 단백질 (DARPin), HEL4 Vh 도메인 (프레더터(Predator)), 포도상구균 단백질 A의 Z-도메인 (아피바디(Affibody)), 아르케알(archeal) "7 kDa DNA 결합제" 단백질 패밀리 (아피틴(Affitin)), 탄수화물-결합 모듈 (CBD 도메인), 시스틴-노트(knot) 미니단백질 (노틴(knottin)), 피브로넥틴 III 타입 도메인 (단일체, 아드넥틴(Adnectin)), γ-B-크리스탈린 (아필린(Affilin)), 시스타틴 (아피머(Affimer)), 3중 나선 2중 코일 도메인 (알파바디(Alphabody)), 리포칼린 도메인 (안티칼린(Anticalin)), 다양한 멤브레인 수용체의 A 도메인 (아비머(Avimer)), Fyn의 SH3 도메인 (피노머(Fynomer)), 쿠니츠(Kunitz) 도메인 펩티드, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
반응성 효소
본 개시내용의 융합 단백질은 링커 상에 존재하는 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 작용기에 커플링할 수 있는 반응성 효소를 포함한다. 따라서, 정확하게 정의된 구조를 갖는 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질을 포함하는 작제물은, 융합 단백질 반응성 효소 내의 활성-부위 잔기에 선택적으로 커플링하는 합성 링커를 사용하는 모듈 접근을 사용하여 조립될 수 있다.
제1 융합 단백질 반응성 효소 및 제2 융합 단백질 반응성 효소는 동일하거나 상이할 수 있다. 각각의 반응성 효소는 큐티나제, SnapTag, HaloTag, 타입 I DNA 토포이소머라제의 릴렉사제 도메인, 베타-락타마제, 글리코시다제, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 세포질 단백질 티로신 키나제 도메인, 알칼리 포스파타제, 단백질-티로신-포스파타제, 23S rRNA (아데닌(2503)-C(2))-메틸트랜스퍼라제의 변이체, 글루코시다제, N-6 아데닌-특이적 DNA 메틸라제, N(4)-시토신-특이적 DNA 메틸라제, DNA (시토신-5-)-메틸트랜스퍼라제, 할로알칸 데할로게나제의 변이체, HNH 엔도뉴클레아제, 닉킹 엔도뉴클레아제, 젤라티나제 B, 젤라티나제 A, 스트로멜리신, 지방산 아미드 히드롤라제, 에스테라제, 사이토크롬 P450, 메티오닌 아미노펩티다제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
구현예에서, 각각의 반응성 효소는 큐티나제, HaloTag, SnapTag, 타입 I DNA 토포이소머라제의 릴렉사제 도메인, 베타락타마제, 글리코시다제, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 구현예에서, 각각의 반응성 효소는 큐티나제, HaloTag, SnapTag, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
구현예에서, 반응성 효소는 타입 I DNA 토포이소머라제의 이동성 클래스 (MOB) 릴렉사제 도메인이다. 타입-I DNA 토포이소머라제의 MOB 릴렉사제 도메인은 릴렉사제 단백질을 또한 코딩하는 이동성 플라스미드 내에 위치하는 작은 동족 전이 근원 (oriT) DNA 서열에 공유 결합하는 효소이다. 이러한 효소는 특정 뉴클레오티드 잔기에서 oriT DNA 서열을 절단하고, 절단점에서 oriT DNA 서열에 공유 결합한다. 타입 I DNA 토포이소머라제의 MOB 릴렉사제 도메인은 패밀리에 의해 특성화될 수 있는데, 여기서 각각의 패밀리 구성원은 유사한 구조 및 메커니즘을 갖는다. 타입-I DNA 토포이소머라제 패밀리의 공지된 MOB 릴렉사제 도메인의 예는, MOBF, MOBH, MOBQ, MOBC, MOBP 및 MOBV를 포함한다. 각각의 릴렉사제 패밀리의 구성원에 대한 OriT 서열은 각각의 릴렉사제 단백질 서열이 유래된 이동성 플라스미드에 대해 특이적이다. 릴렉사제 패밀리의 공지된 예 및 이들의 관련 플라스미드는, MOBF 패밀리: pF, pR100, pR388, pWWO, pMFLV02, pREB5, pREC1, 및 pNAC3; MOBH 패밀리: pR27, pCAR1, pSXT, pIP1202, pMOL28, 및 pPNAP01; MOBC 패밀리: pCloDF13, p23023, pCRY, pAD1, pSKU146.2, pLM7, 및 pSt0; MOBQ 패밀리: pRSF1010, pPRO2, pTi, pAt, pGOX3, pWCFS103, pBM300, pCAUL01, pTB3, pKJ50, 및 pRF; MOBP 패밀리: pRP4, pEST4011, pBI1063, pR64, pET46, pACRY04, pRAS3, pVirD2pTi, pColE1, pRA3, pVT745, pCP13, pFMC, pRP4, pR64, pK, pRAY, pCH4, pET35, pNP40, pCF10, pVir, pBOT3502, pMD136, pCIZ2, pS194, pSK639, 및 pRJ9; 및 MOBV 패밀리: pMV158, pE194, pUB110, pBBR1, pTn5520, pTn4555, pIncU, 및 pIncX를 포함하나, 이에 제한되지는 않으며, 여기서 첨자 "p"는 플라스미드를 나타낸다.
링커
링커는 적어도 제1 말단 및 제2 말단을 포함한다. 링커는 또한, 제1 말단에 융합 단백질을 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 제1 작용기를 포함한다. 링커는 또한, 제2 말단에 융합 단백질을 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 제2 작용기를 포함한다.
구현예에서, 링커는 또한, 질소-함유 C3-7 헤테로사이클, 폴리옥사졸린, 폴리아크릴로모르폴린, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말레산 무수물, 폴리(1-히드록시메틸에틸렌 히드록시메틸 포르말) ("PHF"), 폴리히드록시알킬아크릴레이트 (예를 들어, 2-히드록시에틸메타크릴레이트), 2-메티아크릴로일옥시-2'-에틸트리메틸암모늄 포스페이트 ("MPC"), 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 링커는 폴리옥사졸린, 폴리아크릴로모르폴린, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말레산 무수물, PHF, 폴리히드록시알킬아크릴레이트, 또는 MPC를 포함할 수 있다.
구현예에서, 링커는
Figure pct00003
,
Figure pct00004
또는
Figure pct00005
으로부터 선택된 기를 포함하고;
여기서,
m은 0 내지 10이고;
n은 1 내지 100이고;
각각의 p는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이고;
q는 0, 1 또는 2이고;
r은 1 또는 2이고;
E는 O, NH 또는 CHR10이고;
G는 O, CH2, CHOH, CHNH2, CHCOOH, 또는 CHSO3H이고;
R10은 OH, NH2, 또는 COOH이고;
각각의 R11은 독립적으로 H, OH, NH2, 또는 COOH이다.
구현예에서, 링커는
Figure pct00006
를 포함한다. 일부 구현예에서, E는 O이다. 다양한 구현예에서, E는 NH이다. 일부 구현예에서, E는 CHR10이다. 예를 들어, E는 CHOH, CHNH2, CHCOOH, 또는 CHSO3H를 포함할 수 있다. 이들 구현예에서, m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다. 예를 들어, m은 1, 2, 3, 4 또는 5일 수 있다. 일부 구현예에서, m은 1, 2 또는 3이다. 다양한 구현예에서, n은 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 25, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 또는 1 내지 5일 수 있다.
구현예에서, 링커는
Figure pct00007
를 포함한다. 일부 경우에, p는 1, 2 또는 3 (예를 들어, 1 또는 2)이다. 예를 들어, 링커는 아스파르트산, 글루탐산 또는 감마-글루탐산을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, n은 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 25, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 또는 1 내지 5일 수 있다.
구현예에서, 링커는
Figure pct00008
를 포함한다. 일부 경우에, p는 1, 2 또는 3 (예를 들어, 1 또는 2)이다. 다양한 구현예에서, n은 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 25, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 또는 1 내지 5일 수 있다.
구현예에서, 링커는
Figure pct00009
를 포함한다. 구현예에서, G는 O이다. G가 O인 구현예에서, 각각의 R11은 독립적으로 H 또는 OH일 수 있다. 구현예에서, G는 CH2이다. 구현예에서, G는 CH2이고, 각각의 R11은 독립적으로 H 또는 OH일 수 있되, 단 적어도 하나의 R11은 OH이다. 구현예에서, 각각의 R11은 OH이다. G가 CH2인 다양한 구현예에서, 각각의 R11은 독립적으로 H 또는 NH2일 수 있되, 단 적어도 하나의 R11은 NH2이다. G가 CH2인 다양한 구현예에서, 각각의 R11은 독립적으로 H 또는 COOH일 수 있되, 단 적어도 하나의 R11은 COOH이다. 구현예에서, G는 CHOH이다. G가 CHOH인 구현예에서, 각각의 R11은 독립적으로 H 또는 OH일 수 있다. 구현예에서, 각각의 R11은 OH이다. 구현예에서, G는 CHNH2이다. G가 CHNH2인 구현예에서, 각각의 R11은 H 또는 NH2일 수 있다. 구현예에서, G는 CHCOOH이다. G가 CHCOOH인 구현예에서, 각각의 R11은 독립적으로 H 또는 COOH일 수 있되, 단 적어도 하나의 R11은 COOH이다. 이들 구현예에서, n은 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 25, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 또는 1 내지 5일 수 있다.
구현예에서 링커는 질소-함유 C3-7헤테로사이클 (예를 들어, 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진), 폴리알킬렌 디아민 (예를 들어, 폴리에틸렌 디아민, 폴리프로필렌 디아민, 폴리부틸렌 디아민), 음전하를 띤 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산, 감마-글루탐산), 또는 당류 (예를 들어, 단당류, 다당류, 이노시톨 또는 폴리시알산)를 포함한다.
구현예에서, 링커는 폴리알킬렌 옥시드를 포함한다. 폴리알킬렌 옥시드는 선형 또는 분지형일 수 있다. 예를 들어, 링커는 폴리에틸렌 글리콜 (예를 들어, PEG 40, PEG 100, PEG 150, PEG 200, PEG 300, PEG 2000), 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리부틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 폴리알킬렌 옥시드는 약 30 내지 약 5000 (예를 들어, 약 30 내지 4500, 약 30 내지 4000, 약 30 내지 3500, 약 30 내지 3000, 약 30 내지 2500, 약 30 내지 2000, 약 30 내지 1500, 약 30 내지 1000, 약 46 내지 1000, 약 46 내지 750, 약 46 내지 500, 약 46 내지 250, 또는 약 46 내지 100)의 분자량을 가질 수 있다. 이들의 말단 중 하나 또는 둘 다에서 반응성 작용기를 갖거나 갖지 않는 폴리에틸렌 옥시드 스페이서가 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 쿠안타 바이오디자인(Quanta Biodesign), 피어스넷(PierceNet) 및 시그마알드리치(SigmaAldrich)를 통해 상업적으로 입수할 수 있다.
제1 및 제2 말단의 작용기를 통해, 링커는 온화한 조건 하에 신속한 동력학으로 고수율로 부위-특이적으로 융합 단백질 반응성 효소와 반응하여 적어도 2가 항체 작제물을 제공한다. 링커 말단의 작용기는 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 임의의 작용기일 수 있다.
작용기의 예는, p-니트로페닐 포스포네이트, O6-벤질구아닌, α-할로알칸 또는 그의 유도체, 할로방향족 화합물 또는 그의 유도체, 베타-락탐 또는 그의 유도체, 예컨대 클라불란산 또는 그의 유도체, 아글리콘 또는 그의 유도체, 히드록삼산-벤조페논 또는 그의 유도체, 동족 oriT 올리고뉴클레오티드 서열, 시스테인-반응성 ATP-결합 부위 억제제, 퀴논 메티드 또는 그의 유도체, α-할로 포스폰산 또는 그의 전구체 또는 유도체, 포르밀크로몬 또는 그의 유도체, 동족 RNA 서열, 아데노신 또는 그의 유도체, 시토신 또는 그의 유도체, 동족 DNA 닉킹 부위, 티이란 또는 그의 유도체, 히드록삼산 또는 그의 유도체, α-케톡사졸 억제제 또는 그의 유도체, 친전자성 스테로이드, 포스포네이트, 카르바메이트, 방향족 알킨, 벨로라닙 또는 그의 유도체, 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
구현예에서, 작용기는 p-니트로페닐 포스포네이트, O6-벤질구아닌, α-할로칸 또는 그의 유도체, 할로방향족 화합물 또는 그의 유도체, 베타-락탐 또는 그의 유도체, 예컨대 클라불란산 또는 그의 유도체, 아글리콘 또는 그의 유도체, 히드록삼산-벤조페논 또는 그의 유도체, 동족 oriT 올리고뉴클레오티드 서열, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 구현예에서, 작용기는 p-니트로페닐 포스포네이트, O6-벤질구아닌, α-할로알칸 또는 그의 유도체, 할로방향족 화합물 또는 그의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구현예에서, 작용기는 동족 oriT 올리고뉴클레오티드 서열이다. 상기 구현예의 개량에서, 동족 oriT 올리고뉴클레오티드 서열은 5'-TTTGCGTAGTGTGTGGTGCTTT-3' (서열 번호: 1); 5'-TTTGCGTGGGGTGTGGTGCTTT-3' (서열 번호 2); 5'-TTTGCGTAGGGTGTGGTGCTTT-3' (서열 번호: 3); 5'-CGCGCACCGAAAGGTGCGTATTGTCTATAGCCCAGATTTAAGGA-3' (서열 번호: 4); 5'-CCATTTCTCGAAGAGAAACCGGTAAATGCGCCCT-3' (서열 번호 5); 5'-CACACACTTTATGAATATAAAGTATAGTGTTATACTTTA-3' (서열 번호 6); 5'ACGTTTCTGAACGAAGTGAAGAAACGTCTAAGTGCGCCCT-3' (서열 번호 7), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구현예에서, 융합 단백질 반응성 효소는 타입 I DNA 토포이소머라제의 릴렉사제 도메인이고, 작용기는 동족 oriT 올리고뉴클레오티드 서열이다. 구현예에서, 타입 I DNA 토포이소머라제의 릴렉사제 도메인 (각각의 릴렉사제 단백질 서열에 대한 이동성 플라스미드에 의해 확인됨)/동족 oriT 올리고뉴클레오티드 서열 쌍은 pR100/5'-TTTGCGTAGTGTGTGGTGCTTT-3' (서열 번호 1); pF/5'-TTTGCGTGGGGTGTGGTGCTTT-3' (서열 번호 2); TraIP307/5' TTTGCGTAGGGTGTGGTGCTTT-3' (서열 번호: 3); pR388/5'-CGCGCACCGAAAGGTGCGTATTGTCTATAGCCCAGATTTAAGGA-3' (서열 번호 4); pR1162/5'-CCATTTCTCGAAGAGAAACCGGTAAATGCGCCCT-3' (서열 번호 5); pMobMN199/5'-CACACACTTTATGAATATAAAGTATAGTGTTATACTTTA-3' (서열 번호 6); pSC101/5'-ACGTTTCTGAACGAAGTGAAGAAACGTCTAAGTGCGCCCT-3' (서열 번호 7), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 큐티나제를 포함하고, 제1 말단의 작용기는 p-니트로페닐 포스포네이트를 포함한다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 SnapTag를 포함하고, 제1 말단의 작용기는 O6-벤질구아닌을 포함한다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 HaloTag를 포함하고, 제1 말단의 작용기는 α-클로로알칸을 포함한다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 베타-락타마제를 포함하고, 제1 말단의 작용기는 베타-락탐 또는 그의 유도체를 포함한다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 글리코시다제를 포함하고, 제1 말단의 작용기는 아글리콘 또는 그의 유도체를 포함한다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 매트릭스 메탈로프로테이나제를 포함하고, 제1 말단의 작용기는 히드록삼산-벤조페논 또는 그의 유도체를 포함한다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 타입 I DNA 토포이소머라제의 릴렉사제 도메인을 포함하고, 제1 말단의 작용기는 동족 oriT 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 세포질 단백질 티로신 키나제 도메인을 포함하고, 제1 말단의 작용기는 시스테인-반응성 ATP-결합 부위 억제제를 포함한다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 알칼리 포스파타제를 포함하고, 제1 말단의 작용기는 퀴논 메티드, α-할로 포스폰산, 이들의 전구체, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함한다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 단백질-티로신-포스파타제를 포함하고, 제1 말단의 작용기는 포르밀크로몬, α-할로 포스폰산, 이들의 전구체, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함한다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 23S rRNA (아데닌(2503)-C(2))-메틸트랜스퍼라제의 변이체를 포함하고, 제1 말단의 작용기는 동족 RNA 서열을 포함한다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 글루코시다제를 포함하고, 제1 말단의 작용기는 아글리콘 또는 그의 유도체를 포함한다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 N-6 아데닌-특이적 DNA 메틸라제를 포함하고, 제1 말단의 작용기는 아데노신 또는 그의 유도체를 포함한다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 N(4)-시토신-특이적 DNA 메틸라제를 포함하고, 제1 말단의 작용기는 시토신 또는 그의 유도체를 포함한다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 DNA (시토신-5-)-메틸트랜스퍼라제를 포함하고, 제1 말단의 작용기는 시토신 또는 그의 유도체를 포함한다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 할로알칸 데할로게나제의 변이체를 포함하고, 제1 말단의 작용기는 할로알칸, 할로방향족 화합물 또는 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함한다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 HNH 엔도뉴클레아제를 포함하고, 제1 말단의 작용기는 동족 DNA 닉킹 부위를 포함한다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 닉킹 엔도뉴클레아제를 포함하고, 제1 말단의 작용기는 동족 DNA 닉킹 부위를 포함한다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 젤라티나제 B를 포함하고, 제1 말단의 작용기는 티이란, 히드록삼산, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함한다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 젤라티나제 A를 포함하고, 제1 말단의 작용기는 티이란, 히드록삼산, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함한다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 스트로멜리신을 포함하고, 제1 말단의 작용기는 티이란, 히드록삼산, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함한다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 지방산 아미드 히드롤라제를 포함하고, 제1 말단의 작용기는 α-케톡사졸 억제제 또는 그의 유도체를 포함한다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 에스테라제를 포함하고, 제1 말단의 작용기는 포스포네이트, 카르바메이트, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함한다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 시토크롬 P450을 포함하고, 제1 말단의 작용기는 친전자성 스테로이드, 방향족 알킨, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함한다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소는 메티오닌 아미노펩티다제를 포함하고, 제1 말단의 작용기는 벨로라닙 또는 그의 유도체를 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 큐티나제를 포함하고, 제2 말단의 작용기는 p-니트로페닐 포스포네이트를 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 SnapTag를 포함하고, 제2 말단의 작용기는 O6-벤질구아닌을 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 HaloTag를 포함하고, 제2 말단의 작용기는 α-클로로알칸을 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 베타-락타마제를 포함하고, 제2 말단의 작용기는 베타-락탐 또는 그의 유도체를 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 글리코시다제를 포함하고, 제2 말단의 작용기는 아글리콘 또는 그의 유도체를 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 매트릭스 메탈로프로테이나제를 포함하고, 제2 말단의 작용기는 히드록삼산-벤조페논 또는 이들의 유도체를 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 타입 I DNA 분해 효소 도메인을 포함하고, 제2 말단의 작용기는 동족 oriT 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 세포질 단백질 티로신 키나제 도메인을 포함하고, 제2 말단의 작용기는 시스테인-반응성 ATP-결합 부위 억제제를 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 알칼리 포스파타제를 포함하고, 제2 말단의 작용기는 퀴논 메티드, α-할로 포스폰산, 이들의 전구체, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 단백질-티로신-포스파타제를 포함하고, 제2 말단의 작용기는 포르밀크로몬, α-할로 포스폰산, 이들의 전구체, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 23S rRNA (아데닌(2503)-C(2))-메틸트랜스퍼라제의 변이체를 포함하고, 제2 말단의 작용기는 동족 RNA 서열을 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 글루코시다제를 포함하고, 제2 말단의 작용기는 아글리콘 또는 그의 유도체를 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 N-6 아데닌-특이적 DNA 메틸라제를 포함하고, 제2 말단의 작용기는 아데노신 또는 그의 유도체를 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 N(4)-시토신-특이적 DNA 메틸라제를 포함하고, 제2 말단의 작용기는 시토신 또는 그의 유도체를 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 DNA (시토신-5-)-메틸트랜스퍼라제를 포함하고, 제2 말단의 작용기는 시토신 또는 그의 유도체를 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 할로알칸 데할로게나제의 변이체를 포함하고, 제2 말단의 작용기는 할로알칸, 할로방향족 화합물 또는 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 HNH 엔도뉴클레아제를 포함하고, 제2 말단의 작용기는 동족 DNA 닉킹 부위를 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 닉킹 엔도뉴클레아제를 포함하고, 제2 말단의 작용기는 동족 DNA 닉킹 부위를 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 젤라티나제 B를 포함하고, 제2 말단의 작용기는 티이란, 히드록삼산, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 젤라티나제 A를 포함하고, 제2 말단의 작용기는 티이란, 히드록삼산, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 스트로멜리신을 포함하고, 제2 말단의 작용기는 티이란, 히드록삼산, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 지방산 아미드 히드롤라제를 포함하고, 제2 말단의 작용기는 α-케톡사졸 억제제 또는 그의 유도체를 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 에스테라제를 포함하고, 제2 말단의 작용기는 포스포네이트, 카르바메이트, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 시토크롬 P450을 포함하고, 제2 말단의 작용기는 친전자성 스테로이드, 방향족 알킨, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함한다.
구현예에서, 제2 융합 단백질 반응성 효소는 메티오닌 아미노펩티다제를 포함하고, 제2 말단의 작용기는 벨로라닙 또는 그의 유도체를 포함한다.
작제물의 제조 방법
본 개시내용의 또 다른 양태는, (a) 친화성 시약 및 반응성 효소를 포함하는 제1 융합 단백질을, 제1 말단에 제1 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 작용기를 포함하는 링커와 접촉시킴으로써, 제1 융합 단백질 및 링커를 제1 말단에서 커플링하고, (b) 친화성 시약 및 반응성 효소를 포함하는 제2 융합 단백질을, 제2 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 작용기를 포함하는 링커의 제2 말단과 접촉시킴으로써, 제2 융합 단백질 및 링커를 제2 말단에서 커플링하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 또한 달리 특정되지 않는 한, "커플링된", "커플" 또는 "커플링"은, 예를 들어, 융합 단백질이 링커 말단의 작용기와 비가역적으로 회합할 수 있는 공유 결합 형성을 포함한다.
본원에 개시된 방법은, 온화한 반응 조건 하에 신속한 동력학으로 고수율로 반응성 효소와 부위-특이적으로 반응하는 말단의 작용기를 갖는 소분자 링커를 사용하여 모듈 방식으로 친화성 시약 및 반응성 효소를 포함하는 융합 단백질을 연결한다.
본원에 개시된 방법은 하나 이상의 이점을 제공하는데, 이는, 예를 들어, 매우 다양한 치료 작제물의 집단이 모듈 방식으로 생성될 수 있는 수단을 제공하는 것이다. 추가로, 반응성 아미노산을 항체 스캐폴드 상에 직접 엔지니어링/관능화할 필요가 없기 때문에, 확장된 기능성을 갖는 항체 포맷의 제조가 본 개시내용의 작제물 사용시 간단하다. 또한, 융합 단백질 및 링커의 커플링의 온화하고, 신속하며, 부위-특이적인 성질은, 다양한 이펙터 분자가 항체-유사 단편을 떠나 고수율로 정확한 화학량론으로 항체 단편에 부착될 수 있게 한다. 또한, 독소 또는 글리코실화된 단백질과 같은 항체 단편을 갖는 상동성 숙주에서 발현될 수 없는 분자가 다양한 유기체에서 발현되고, 작제물에 모듈 방식으로 부착될 수 있다. 모듈 합성은 표준 단백질 엔지니어링/발현을 사용 (이러한 방법은 폴리펩티드가 배양에서 하나 이상의 사슬로서 발현될 것을 요구함)하여 준비하기에는 너무 크거나 복잡한 분자의 생성을 가능하게 한다.
화학 연결 모듈 접근법은 다양한 화학량론, 배향 및 기하구조의 정확히 정의된 단백질 작제물을 생성하는 효율적인 방법을 가능하게 한다. 이들 속성은 링커 내로의 다양성의 인코딩 및/또는 링커에 대한 융합 단백질의 부착 순서 변경에 의해 체계적으로 변경될 수 있다. 현재의 단백질 엔지니어링 방법은, 천연 폴리펩티드 폴드/펩티드 링커의 내재적 레파토리로 원하는 작제물을 달성하는 것으로 제한된다. 따라서 보다 큰 효능을 나타낼 수 있는 비-천연 포맷은 통상의 엔지니어링 방법을 사용하여 제조할 수 없다.
마지막으로, 보다 작은 항체-유사 단편의 발현은 항체 분자의 산업적 생성에서 전형적으로 사용되는 진핵 숙주에 추가로 원핵 숙주에서의 발현을 가능하게 한다. 종종 진핵 세포 발현 시스템의 5배인 생성 수율에 추가로, 원핵 생물의 강건성은, 저비용 제조 플랫폼을 가능하게 한다는 것이 잘 알려져 있다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 본 발명의 방법에 의해 제조된 작제물을 제공한다.
구현예에서, 단계 (a) 및 (b)는 순차적으로 (즉, 단계적으로) 수행된다. 구현예에서, 단계 (a) 및 (b)는 동시에 (즉, 원 포트(one pot)) 수행된다. 각각의 친화성 시약 및 반응성 효소는 본원에 개시된 임의의 친화성 시약 및 반응성 효소로부터 선택될 수 있다. 제1 말단의 작용기 및 제2 말단의 작용기를 포함하는 링커는 본원에 개시된 임의의 링커 및 작용기로부터 선택될 수 있다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소 및 제2 융합 단백질 반응성 효소는 동일하고, 링커의 제1 말단의 제1 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 작용기는, 링커의 제2 말단의 제2 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 작용기와 동일하고, 단계 (a) 및 (b)는 동시에 수행된다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소 및 제2 융합 단백질 반응성 효소는 동일하고, 링커의 제1 말단의 제1 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 작용기는, 링커의 제2 말단의 제2 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 작용기와 상이하고, 단계 (a) 및 (b)는 동시에 수행된다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소 및 제2 융합 단백질 반응성 효소는 상이하고, 링커의 제1 말단의 제1 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 작용기는, 링커의 제2 말단의 제2 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 작용기와 동일하고, 단계 (a) 및 (b)는 순차적으로 수행된다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소 및 제2 융합 단백질 반응성 효소는 상이하고, 링커의 제1 말단의 제1 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 작용기는, 링커의 제2 말단의 제2 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 작용기와 동일하고, 단계 (a) 및 (b)는 동시에 수행된다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소 및 제2 융합 단백질 반응성 효소는 상이하고, 링커의 제1 말단의 제1 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 작용기는, 링커의 제2 말단의 제2 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 작용기와 상이하고, 단계 (a) 및 (b)는 동시에 수행된다.
구현예에서, 제1 융합 단백질 반응성 효소 및 제2 융합 단백질 반응성 효소는 상이하고, 링커의 제1 말단의 제1 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 작용기는, 링커의 제2 말단의 제2 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 작용기와 상이하고, 단계 (a) 및 (b)는 순차적으로 수행된다.
본원에 개시된 방법은, 분자량이 약 100 kDa, 약 150 kDa, 약 200 kDa, 약 250 kDa 및/또는 약 300 kDa 초과인 분자의 스케일링가능한 제조 및/또는 단순히 비교적 적은 수의 빌딩 블록의 조합에 의한 결합가, 기하구조, 이펙터 기능, 및 화학량론이 변경된 항체-유사 약물의 다양한 라이브러리의 생성을 허용하는 것과 같은 하나 이상의 이점을 제공한다.
단계 (a) 및 (b)는 예를 들어 pH 7.4의 인산염 완충 식염수 (PBS)와 같은 생리적 pH로 완충된 임의의 수용액에서 수행될 수 있다. 제1 융합 단백질, 제2 융합 단백질 및 링커의 농도는 일반적으로 임의의 농도일 수 있다. 농도는 전형적으로 제1 융합 단백질, 제2 융합 단백질 및 링커가 포화 용액을 형성하지 않으면서 선택된 용매에서 완전히 용해되도록 선택된다. 링커가 제1 말단 및 제2 말단에서 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 작용기만을 포함하는 경우, 제1 융합 단백질 대 링커 대 제2 융합 단백질의 상대적 농도는 적어도 약 1:1:1 이어서, 하나의 융합 단백질 당 링커 말단의 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 하나의 작용기를 제공한다.
구현예에서, 단계 (a) 및 (b)는 주변 온도에서 수행된다. 온도는 융합 단백질에 존재하는 임의의 단백질을 변성시킬 정도로 높지 않아야 한다.
구현예에서, 작제물은 고체 지지체 상에서 제조될 수 있다. 구현예에서, 단계 (a) 및/또는 (b)의 하나 이상의 성분이 고체 지지체 상에서 제공될 수 있다. 적합한 고체 지지체는 당업계에 잘 알려져 있이다.
작제물의 사용 방법
본 개시내용의 또 다른 양태는, 본 발명의 작제물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 본 개시내용의 또 다른 양태는, 본 개시내용의 작제물의, 이를 필요로 하는 환자를 위한 약제로서의 용도를 제공한다. 본 개시내용의 또 다른 양태는, 본 개시내용의 작제물의 진단제로서의 용도를 제공한다.
구현예에서, 환자는 유방암, 흡입 탄저병, 류마티스성 관절염, 전신성 소아 특발성 관절염, 호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 여포성 비-호지킨 림프종, 미만성 대 B 세포 림프종, 재발-완화성 다발성 경화증, 전신성 홍반성 루푸스, 위 또는 위-식도 접합부 선암종, 전이성 비-소세포 폐암종, 궤양성 대장염, 크론병, 흑색종, 황반 변성, 골다공증, 치료-유도된 뼈 손실, 뼈로의 전이, 뼈의 거대 세포 종양, 악성 복수, 건선 관절염, 강직성 척추염, 전이성 신장 세포 암, 전립선암, 난소암, 다발성 골수종, 캐슬만병, 결장직장암, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 장애 또는 질환을 앓고 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 또한 달리 특정되지 않는 한, "질환" 및 "장애"는 상호교환가능하게 사용된다.
구현예에서, 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편은 트라스투주맙 또는 그의 단편, 락시바카맙 또는 그의 단편, 토실리주맙 또는 그의 단편, 브렌툭시맙 또는 그의 단편, 오파투무맙 또는 그의 단편, 벨리무맙 또는 그의 단편, 라무시루맙 또는 그의 단편, 베돌리주맙 또는 그의 단편, 오비누투주맙 또는 그의 단편, 펨브롤리주맙 또는 그의 단편, 라니비주맙 또는 그의 단편, 페르투주맙 또는 그의 단편, 데노수맙 또는 그의 단편, 카투막소맙 또는 그의 단편, 골리무맙 또는 그의 단편, 실툭시맙 또는 그의 단편, 나탈리주맙 또는 그의 단편, 파니투무맙 또는 그의 단편, 데노수맙 또는 그의 단편, 및 이들의 조합을 포함한다.
구현예에서, 환자는 유방암을 앓고 있고, 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편은 트라스투주맙 또는 그의 단편을 포함한다.
구현예에서, 환자는 흡입 탄저병을 앓고 있고, 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편은 락시바쿠맙 또는 그의 단편을 포함한다.
구현예에서, 환자는 류마티스성 관절염 또는 전신성 소아 특발성 관절염을 앓고 있고, 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편은 토실리주맙 또는 그의 단편을 포함한다.
구현예에서, 환자는 호지킨 림프종 또는 전신성 역형성 대세포 림프종을 앓고 있고, 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편은 브렌툭시맙 또는 그의 단편을 포함한다.
구현예에서, 환자는 만성 림프구성 백혈병, 여포성 비-호지킨 림프종, 미만성 대 B 세포 림프종, 류마티스성 관절염 및 재발-완화성 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택된 병태를 앓고 있고, 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편은 오파투무맙 또는 그의 단편을 포함한다.
구현예에서, 환자는 전신성 홍반성 루푸스를 앓고 있고, 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편은 벨리무맙 또는 그의 단편을 포함한다.
구현예에서, 환자는 위 또는 위-식도 접합부 선암종 또는 전이성 비-소세포 폐암종을 앓고 있고, 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편은 라무시루맙 또는 그의 단편을 포함한다.
구현예에서, 환자는 궤양성 대장염 또는 크론병을 앓고 있고, 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편은 베돌리주맙 또는 그의 단편을 포함한다.
구현예에서, 환자는 만성 림프구성 백혈병 또는 여포성 림프종을 앓고 있고, 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편은 오비누투주맙 또는 그의 단편을 포함한다.
구현예에서, 환자는 흑색종 또는 전이성 비-소세포 폐암을 앓고 있고, 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편은 펨브롤리주맙 또는 그의 단편을 포함한다.
구현예에서, 환자는 황반 변성을 앓고 있고, 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편은 라니비주맙 또는 그의 단편을 포함한다.
구현예에서, 환자는 유방암을 앓고 있고, 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편은 페르투주맙 또는 그의 단편을 포함한다.
구현예에서, 환자는 골다공증, 치료-유도된 뼈 손실, 뼈로의 전이 및 뼈의 거대 세포 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 병태를 앓고 있고, 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편은 데노수맙 또는 그의 단편을 포함한다.
구현예에서, 환자는 악성 복수를 앓고 있고, 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편은 카투막소맙 또는 그의 단편을 포함한다.
구현예에서, 환자는 류마티스성 관절염, 건선 관절염, 강직성 척추염 및 궤양성 결장염으로 이루어진 군으로부터 선택된 병태를 앓고 있고, 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편은 골리무맙 또는 그의 단편을 포함한다.
구현예에서, 환자는 전이성 신장 세포 암, 전립선암, 난소암, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종 및 캐슬만병으로 이루어진 군으로부터 선택된 병태를 앓고 있고, 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편은 실툭시맙 또는 그의 단편을 포함한다.
구현예에서, 환자는 다발성 경화증 또는 크론병을 앓고 있고, 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편은 나탈리주맙 또는 그의 단편을 포함한다.
구현예에서, 환자는 결장직장암을 앓고 있고, 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편은 파니투무맙 또는 그의 단편을 포함한다.
구현예에서, 환자는 골다공증, 치료-유도된 뼈 손실, 뼈로의 전이 및 뼈의 거대 세포 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 병태를 앓고 있고, 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편은 데노수맙 또는 그의 단편을 포함한다.
본 개시내용에 따른 작제물, 방법, 및 용도는 하기의 실시예에 비추어 보다 잘 이해될 수 있으며, 이는 단지 작제물을 설명하도록 의도되는 것이며, 어떠한 방식으로도 그 범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 트라스투주맙으로부터의 F(ab) 도메인의 유전자/단백질 발현 벡터 구성
모노클로날 항체 트라스투주맙으로부터의 F(ab) 도메인 (경쇄 가변 VL - 경쇄 불변 카파 사슬 CK, 및 중쇄 가변 도메인 VH - 중쇄 불변 도메인 CH1) (이하, "TFab(들)"라 지칭함)를 코딩하는 유전자를 젠스크립트(Genscript)에 의한 이.콜라이(E. coli)에 대한 코돈 최적화로 합성하였다. 무제한 PCR을 사용하여 pASK-IBA32 (아이비에이 바이오사이언시즈(IBA Biosciences))에 기초한 테트라사이클린-유도성 발현 벡터에서 하기 8가지 디시스트로닉 융합 단백질을 조립하였다:
1. "N-말단 큐티나제-VL 융합체" -5'-RBS1-ATG-큐티나제-(EAAAK)2-VLCK-**-RBS2-ATG-VHCH1-LVPRGS-HHHHHH-**-3' (서열 번호: 8 & 9)
2. "N-말단 SnapTag-VL 융합체" -5'-RBS1-ATG-SnapTag-(EAAAK)2-VLCK-**-RBS2-ATG-VHCH1-LVPRGS-HHHHHH-**-3' (서열 번호: 10 & 11)
3. "C-말단 큐티나제-CK 융합체" -5'-RBS1-ATG-VLCK-(EAAAK)2-큐티나제-**-RBS2-ATG-VHCH1-LVPRGS-HHHHHH-**-3' (서열 번호: 12 & 13)
4. "C-말단 SnapTag-CK 융합체" -5'-RBS1-ATG-VLCK-(EAAAK)2-SnapTag-**-RBS2-ATG-VHCH1-LVPRGS-HHHHHH-**-3' (서열 번호: 14 & 15)
5. "N-말단 큐티나제-VH 융합체" -5'-RBS1-ATG-VLCK-**-RBS2-ATG-큐티나제-(EAAAK)2-VHCH1-LVPRGS-HHHHHH-**-3' (서열 번호: 16 & 17)
6. "N-말단 SnapTag-VH 융합체" -5'-RBS1-ATG-VLCK-**-RBS2-ATG-SnapTag-(EAAAK)2-VHCH1-LVPRGS-HHHHHH-**-3' (서열 번호: 18 & 19)
7. "C-말단 큐티나제-CH1 융합체" -5'-RBS1-ATG-VLCK-**-RBS2-ATG-VHCH1-(EAAAK)2-큐티나제- LVPRGS-HHHHHH-**-3' (서열 번호: 20 & 21)
8. "C-말단 SnapTag-CH1 융합체" -5'-RBS1-ATG-VLCK-**-RBS2-ATG-VHCH1-(EAAAK)2-SnapTag- LVPRGS-HHHHHH-**-3' (서열 번호: 22 & 23)
도 1은 트라스투주맙 F(ab) (TFab) 융합 유전자/단백질 작제물을 나타낸다. A) C-말단 중쇄 융합체. B) N-말단 중쇄 융합체. C) C-말단 경쇄 융합체. D) N-말단 경쇄 융합체.
실시예 2: 단백질 발현/정제
실시예 1의 8가지 TFab 융합 단백질을 코딩하는 벡터를 셔플 (Shuffle) 이. 콜라이 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))로 형질 전환시켰다. 성장 배지 (500 ㎖ 2xYT), 카르베니실린 (200 ㎍/㎖) 및 스펙티노마이신 (50 ㎍/㎖)을 포함하는 발현 배양물에 적절한 발현 카세트가 있는 세포주의 하룻밤 배양물 (5 ㎖)을 접종하였다. 배양물을 약 0.8의 광학 분산 (OD)에 도달할 때까지 250 rpm으로 진탕시키며 30℃에서 성장시켰다. 이 시점에, 안히드로테트라사이클린 (aTc)을 200 ng/㎖의 최종 농도로 배양물에 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 배양물을 발현 단계 동안 14시간 동안 250 rpm에서 진탕시키며 24℃에서 유지하였다.
발현 후, 세포를 원심분리를 통해 수확하고, DNAse I, 및 무EDTA 프로테아제 억제제(로슈(Roche))를 함유하는 35 ㎖ 셀라이틱(CelLytic) B (시그마 알드리치)를 사용하여 화학적 파쇄를 통해 용해시켰다. 세포 용해물을 원심분리에 의해 잔해 제거하고, 코발트 IMAC 수지를 함유하는 컬럼 (3 ㎖ 층 부피)에 첨가하였다. 용해물을 4℃에서 교반하며 비드 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이 기간 후, 비드를 인산염 완충 식염수 (PBS)로 광범위 세척한 후, 생성물을 이미다졸 함유 완충액 (20 ㎖)으로 용출시켰다. 그 후 단백질 용출액을 먼저 단백질 L 컬럼 (지이 헬스케어(GE Healthcare))에서 정제한 후 고속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC) 장비를 통해 수퍼덱스(Superdex) 200 컬럼 (지이 헬스케어) 상에서 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)하였다. FPLC를 통한 모든 컬럼 정제는 제조업체의 제안된 프로토콜에 따라 수행하였다. 순수 단백질 생성물을 함유하는 분획을 모으고, 연결 반응 전에 원심분리 농축기에서 농축시켰다.
도 2는 정제된 TFab-큐티나제 및 TFab-SnapTag 융합체의 나트륨 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 (SDS-PAGE) 겔을 나타낸다. 레인 1 & 2는 각각 큐티나제 (72 kDa) 및 SnapTag (69 kDa)의 N-말단 VH 융합에 대해 계산된 분자량 근처의 밴드를 나타낸다. 레인 3 & 4는 C-말단 VH 융합체로부터의 밴드를 나타낸다. 레인 5 & 6 및 7 & 8은 각각 C-말단 CK 및 CH1 융합체로부터의 밴드를 나타낸다.
따라서, 실시예 1 및 2는 친화성 시약 (TFab) 및 반응성 효소 (큐티나제 및/또는 SnapTag)를 포함하는 본 개시내용의 융합 단백질의 제조를 나타낸다.
실시예 3: 큐티나제 - TFab 융합 단백질과 SnapTag - TFab 융합 단백질을 연결시키기 위한 링커의 제조
Figure pct00010
제1 말단에 p-니트로페닐 포스포네이트, 제2 말단에 O6-벤질구아닌, 및 에틸렌 글리콜 및 아미드 단위를 포함하는 본 개시내용에 따른 링커를 하기에 나타낸 합성 방식에 따라 제조하였다.
1-아미노- N -(4-(((2- 아미노-9 H -퓨린-6-일) 옥시 ) 메틸 ) 벤질 )-3,6,9,12,15,18-헥사옥사헤니코산-21-아미드(1)의 제조. Fmoc-21-아미노-4,7,10,13,16,19-헥사옥사헤네이코산 산 (567 ㎎, 0.99 mmol)을 THF 5 ㎖ 중에 용해시켰다. 이 용액에 DIC (149 ㎎, 183 ㎕, 1.18 mmol), 그 후 NHS (136 ㎎, 1.18 mmol)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 회전 증발기 상에서 제거하고, 생성된 황색 오일을 DMF 5 ㎖ 중에 재현탁시켰다. 이 용액에 (4-아미노 메틸)-O6-벤질구아닌 (266 ㎎, 0.99 mmol)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 2일간 교반하였다. 이 기간 후, DMF를 N2 스트림 하에 밤새 반응으로부터 스트리핑하였다. 그 후, 생성된 오렌지색 오일을 MeOH 중의 20% 피페리딘 5 ㎖로 처리하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 회전 증발기를 사용하여 제거하고, 생성된 오렌지색 오일을 H2O 10 ㎖ 중에 재현탁시켰다. 그 후, 이 용액을 원심분리하여 불용성 물질을 펠렛화하고, 정화된 상청액을 워터스 델타(Waters Delta) 400 HPLC를 통해 역상 C18 컬럼에 5 개의 별도 부분으로 적용하였다. 용출을 10 ㎖/분의 유속으로 이동상으로서 탈이온화된 한외여과수 (DIUF) + 0.01% TFA를 사용하여 60분에 걸쳐 DIUF + 0.01% TFA 중의 75% ACN의 선형 구배를 사용하여 수행하였다. 20 내지 35분으로부터의 분획을 MALDI-MS로 분석하였다. 순수한 분획을 모으고, 동결건조시켜 호박색 오일을 수득하였다. (424 ㎎, 71%)
1-(4-4-(((2-아미노-9 H -퓨린-6-일) 옥시 ) 메틸 )페닐)-3,25- 디옥소 -6,9,12,15,18,21-헥사옥사-2,24-디아자옥타코산-28-오익산) ( 2)의 제조. 화합물 1 (50 mg, 83 μmol)을 2.5 ㎖ MeOH 중에 용해시키고, 이 용액에 숙신산 무수물 (8.3 mg, 83 μmol)을 첨가하였다. 반응이 완료되면 (MALDI-MS에 의해 모니터링시 ~ 30분), 용매를 회전 증발기 상에서 제거하였다. 그 후, 생성된 호박색 오일을 먼저 10:1 CH2Cl2 : MeOH를 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피를 통해 정제하여 불순물을 제거하고, 이어서 MeOH로 용출시켜 고무질 호박색 고체를 수득하였다. (42 mg, 72%)
중간체 (3), 17-(에톡시(4-니트로페녹시)포스포릴)-3,6,9,12,15-펜타 옥시아헵타데칸-1-아미늄 클로라이드의 제조는 [Modica, J.A. et al., Chembiochem. 2012 Nov 5;13(16): 2331-4]에 기재되어 있고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 도입된다.
에틸 (4- 니트로페닐 )(1-(4-(((2-아미노-9 H -퓨린-6-일) 옥시 ) 메틸 )페닐)- -3,25,28-트리옥소-6,9,12,15,18,21,32,35,38,41,44-운데카옥사-2,24,29-트리아자헥사테트라콘탄-46-일)포스포네이트 ( 4)의 제조. 화합물 2 (39 mg, 55 μmol)를 DMF 1 ㎖ 중에 용해시켰다. 이 용액에 PyBOP (34 ㎎, 58 μmol), 그 후 N-메틸모르폴린 (5.6 ㎎, 6.1 ㎕, 55 μmol)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 이 기간 후, 250 ㎕ DMF 중에 용해된 화합물 3 (29.3 ㎎, 55 μmol)을 혼합물에 첨가한 후, N-메틸모르폴린 (11.2 ㎎, 12.2 ㎕, 110 μmol)을 첨가하고, 반응물을 밤새 (~16시간) 교반하였다. 이 기간 후, 혼합물을 DIUF를 사용하여 5 ㎖로 희석하고, 혼합물을 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 그 후, 정화된 상청액을 워터스 델타 4000 HPLC를 통해 C18 반-정제 스케일 컬럼 상에 주입하고, 10 ㎖/분의 유속으로 이동상으로서 DIUF + 0.1% TFA를 사용하여 70분에 걸쳐 75% 수성 ACN + 0.1% TFA의 선형 구배를 사용하여 정제하였다. 분획을 1/분의 속도로 수집하였다. 그 후, 25 내지 40분으로부터의 분획을 MALDI로 분석하였다. 순수한 생성물을 함유하는 것들을 모으고, -80℃에서 동결시키고, 동결건조시켜 황색 오일을 수득하였다. 그 후, 이 오일을 상기에 언급된 절차를 사용하여 추가로 1회 HPLC 정제하였다. 이 실행으로부터의 순수한 분획을 모으고, 동결시키고, 동결건조시켜 담황색 오일을 수득하였다 (11 mg, 17%).
따라서, 실시예 3은 제1 말단에 제1 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 제1 작용기 및 제2 말단에 제2 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 제2 작용기를 포함하는 본 개시내용의 링커의 제조를 나타낸다.
실시예 4: Di-TFab 작제물 조립
PBS pH 7.4 중의 동일한 부피의 실시예 2로부터의 큐티나제-TFab 융합체 (5 μM) 및 SnapTag-TFab 융합체 (5 μM) 및 실시예 3으로부터의 큐티나제-SnapTag 링커 (5 μM)를 혼합하고, 4시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 생성물을 크기-배제 크로마토그래피를 통해 정제하였다.
도 5는 제조된 작제물의 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. 8가지 TFab 및 1가지 링커의 수집물로부터 16가지 2가 유사 작제물이 생성될 수 있다.
따라서, 실시예 4는 제1 융합 단백질, 제2 융합 단백질, 및 링커를 포함하는 본 개시내용의 작제물의 라이브러리의 제조를 나타내며, 여기서 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질은 각각 친화성 시약 및 반응성 효소를 포함하고; 링커는 제1 말단에 제1 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 제1 작용기, 및 제2 말단에 제2 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 제2 작용기를 포함한다.
실시예 5: 세포 성장 억제 분석
트라스투주맙은 HER2+ 유방암의 치료에 사용된다. 두가지 HER2 (+++) 세포주 (BT474, SKBR3), 하나의 HER2 (++) 세포주 (MDA-MB-VII-135) 및 하나의 대조군 세포주 AT-431 (HER2-)를 확립된 프로토콜에 따라 배양하고, 실시예 4에서 제조된 2가 트라스투주맙 유사체 중 하나 또는 트라스투주맙의 용량으로 96시간 동안 4 pM 내지 4 μM 범위의 농도로 치료하였다. 이 기간 후의 생존율을 알라마르 블루 분석(Alamar blue assay) (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))을 사용하여 측정하였다. 생존율은 치료되지 않은 대조군에 대한 백분율 값으로서 계산하였다.
이들 실험으로부터, B-13으로 지칭된 하나의 작제물은, 트라스투주맙에 비해 가장 유리한 세포 성장 억제 및 EC50 값을 나타내었다. 세포 생존율 실험을 B-13 vs. 트라스투주맙으로 다시 수행하였다. 도 4는 다양한 세포주에서 트라스투주맙 및 B-13에 의한 비교가능한 세포 성장 억제를 나타내는 세포 생존율 분석 데이터를 나타낸다. A) BT474 세포의 성장 억제. B) SKBR3 세포의 성장 억제. C) MDA-MB-135-VII 세포의 성장 억제. D) 트라스투주맙 또는 B-13에 대한 성장 억제를 나타내지 않는 HER2(-) AT-431 세포를 사용한 대조 실험.
따라서, 실시예 5는, 본 개시내용의 작제물의 라이브러리가 생물학적 용도, 예를 들어 세포 성장 억제에 대해 어떻게 분석될 수 있는지를 나타낸다. 또한, 실시예 5는 시험관내 암 세포 생존율 분석에서 작제물의 세포독성을 나타낸다. 실시예 3의 융합 단백질 작제물 조립 방법은 다기능 항체-유사 치료 분자를 원 포트 방식으로 제조할 수 있게 한다.
실시예 6: Di-TFab 작제물의 생체내 약동학
B-13 작제물 (2 mg/㎖)을 SCID-베이지 마우스에 IV 볼루스로서 10 mg/kg의 총 용량으로 투여하였다. 혈액 샘플 (~ 200 ㎕)을 투여 후 다양한 시점에 꼬리 정맥으로부터 추출하였다. 총 3 마리의 마우스 (n = 3)를 각 시점에 치료하고 샘플링하였다. 표준 곡선 비교를 통해 혈청 내 B13의 농도를 측정하기 위해 ELISA 방법을 사용하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 이들 데이터를 플롯팅하고, 2 구획 (이중 지수) 약동학 모델에 핏팅하여 0.22시간-1의 제거 속도 상수 및 3.1시간의 반감기를 산출하였다.
따라서, 실시예 6은 본 개시내용의 융합 단백질 작제물의 생체내 사용 및 본 개시내용의 작제물의 약동학 데이터를 나타낸다.
실시예 7 - BT474 종양 이종이식편을 갖는 마우스에 대한 B-13 투여의 효과
8주령의 암컷 SCID 베이지 마우스를 샤를레스 리버 래보래토리즈(Charles River Laboratories)로부터 입수하고, 여기에 0.025-mg, 90-일 방출, 17β-에스트라디올 펠렛 (이노베이티브 리서치 오브 아메리카(Innovative Research of America))을 이식하였다. 2일 후, 2 × 106개의 BT474 세포를 100 ㎕의 PBS 중에 재현탁시키고, 마트리겔(Matrigel)과의 1:1 혼합물을 유선 지방 패드 내로 동위접종하였다. 일단 종양이 ~ 150 mm3의 부피에 도달하면, 20마리의 동물을 동일한 평균 종양 부피를 갖는 4개의 치료 코호트 (n = 5)로 무작위 배정하였다. 한 코호트에서는, B13을 4주에 걸쳐 주5회 (월요일 - 금요일) 복강내 (IP) 주사에 의해 5 mgkg-1의 총 20회 용량으로 투여하였고; 제2 코호트에서는, B13을 동일한 경로 및 빈도로 2.5 mg/kg의 용량으로 투여하였다. 제3 코호트에서는, 독소루비신 (dox)을 2.5 mg/kg으로 4주에 걸쳐 총 8회 용량으로 주2회 IP 주사를 통해 투여하였다. 대조군 코호트에는, 비히클 (PBS + .004% (w/w) 폴리소르베이트 20)을 주5회 주사하였다. B13 및 dox 용액은 둘 다 동일한 비히클에서 배합하였다. B13 샘플을 리물루스 아메바성 세포 용해물(limulus amebocyte lysate; LAL) 분석에 의해 측정시 < 1.0의 내독소 단위 (EU)/㎖를 함유하였다. 종양 치수를 연속적으로 2일마다 측정하고, 부피를 식 V=(L　×　W2)/2 (여기서, V = 부피, L = 길이, W = 폭)을 사용하여 계산하였다. 결과를 도 6에 나타내었다.
B13은, BT474 마우스 이종이식 모델에서 유의한 항-종양 활성을 나타낸다. 또한, B13은, 본 연구에서 사용된 두 가지 용량에서, 독성의 외향 징후를 나타내지 않는다. 이는 치료 코호트가 유의한 체중 감소를 나타낸 dox와 대조적이다.
상기 설명은 단지 이해의 명료화를 위해 제공된 것이며, 본 발명의 범위 내의 변형이 당업자에게 자명할 수 있음에 따라, 이로부터의 불필요한 제한으로 이해되어서는 안된다.
<110> Northwestern University <120> FUSION PROTEIN CONSTRUCT <130> 30938/2016-048 <150> US 62/346,369 <151> 2016-06-06 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 1 tttgcgtagt gtgtggtgct tt 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 2 tttgcgtggg gtgtggtgct tt 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 3 tttgcgtagg gtgtggtgct tt 22 <210> 4 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 4 cgcgcaccga aaggtgcgta ttgtctatag cccagattta agga 44 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 5 ccatttctcg aagagaaacc ggtaaatgcg ccct 34 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 6 cacacacttt atgaatataa agtatagtgt tatacttta 39 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> 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Polypeptide <400> 19 Met Asp Lys Asp Cys Glu Met Lys Arg Thr Thr Leu Asp Ser Pro Leu 1 5 10 15 Gly Lys Leu Glu Leu Ser Gly Cys Glu Gln Gly Leu His Glu Ile Ile 20 25 30 Phe Leu Gly Lys Gly Thr Ser Ala Ala Asp Ala Val Glu Val Pro Ala 35 40 45 Pro Ala Ala Val Leu Gly Gly Pro Glu Pro Leu Met Gln Ala Thr Ala 50 55 60 Trp Leu Asn Ala Tyr Phe His Gln Pro Glu Ala Ile Glu Glu Phe Pro 65 70 75 80 Val Pro Ala Leu His His Pro Val Phe Gln Gln Glu Ser Phe Thr Arg 85 90 95 Gln Val Leu Trp Lys Leu Leu Lys Val Val Lys Phe Gly Glu Val Ile 100 105 110 Ser Tyr Ser His Leu Ala Ala Leu Ala Gly Asn Pro Ala Ala Thr Ala 115 120 125 Ala Val Lys Thr Ala Leu Ser Gly Asn Pro Val Pro Ile Leu Ile Pro 130 135 140 Cys His Arg Val Val Gln Gly Asp Leu Asp Val Gly Gly Tyr Glu Gly 145 150 155 160 Gly Leu Ala Val Lys Glu Trp Leu Leu Ala His Glu Gly His Arg Leu 165 170 175 Gly Lys Pro Gly Leu Gly Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 180 185 190 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 195 200 205 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 210 215 220 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 225 230 235 240 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 245 250 255 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 260 265 270 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 275 280 285 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 290 295 300 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 305 310 315 320 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 325 330 335 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 340 345 350 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 355 360 365 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 370 375 380 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 385 390 395 400 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Leu 405 410 415 Val Pro Arg Gly Ser His His His His His His 420 425 <210> 20 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 20 Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 21 <211> 461 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 21 Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp 20 25 30 Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Gly Leu Pro Thr Ser Asn 225 230 235 240 Pro Ala Gln Glu Leu Glu Ala Arg Gln Leu Gly Arg Thr Thr Arg Asp 245 250 255 Asp Leu Ile Asn Gly Asn Ser Ala Ser Cys Ala Asp Val Ile Phe Ile 260 265 270 Tyr Ala Arg Gly Ser Thr Glu Thr Gly Asn Leu Gly Thr Leu Gly Pro 275 280 285 Ser Ile Ala Ser Asn Leu Glu Ser Ala Phe Gly Lys Asp Gly Val Trp 290 295 300 Ile Gln Gly Val Gly Gly Ala Tyr Arg Ala Thr Leu Gly Asp Asn Ala 305 310 315 320 Leu Pro Arg Gly Thr Ser Ser Ala Ala Ile Arg Glu Met Leu Gly Leu 325 330 335 Phe Gln Gln Ala Asn Thr Lys Cys Pro Asp Ala Thr Leu Ile Ala Gly 340 345 350 Gly Tyr Ser Gln Gly Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ser Ile Glu Asp Leu 355 360 365 Asp Ser Ala Ile Arg Asp Lys Ile Ala Gly Thr Val Leu Phe Gly Tyr 370 375 380 Thr Lys Asn Leu Gln Asn Arg Gly Arg Ile Pro Asn Tyr Pro Ala Asp 385 390 395 400 Arg Thr Lys Val Phe Cys Asn Thr Gly Asp Leu Val Cys Thr Gly Ser 405 410 415 Leu Ile Val Ala Ala Pro His Leu Ala Tyr Gly Pro Asp Ala Arg Gly 420 425 430 Pro Ala Pro Glu Phe Leu Ile Glu Lys Val Arg Ala Val Arg Gly Ser 435 440 445 Ala Leu Val Pro Arg Gly Ser His His His His His His 450 455 460 <210> 22 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 22 Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr 20 25 30 Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 23 <211> 427 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 23 Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp 20 25 30 Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Asp Lys Asp Cys Glu Met 225 230 235 240 Lys Arg Thr Thr Leu Asp Ser Pro Leu Gly Lys Leu Glu Leu Ser Gly 245 250 255 Cys Glu Gln Gly Leu His Glu Ile Ile Phe Leu Gly Lys Gly Thr Ser 260 265 270 Ala Ala Asp Ala Val Glu Val Pro Ala Pro Ala Ala Val Leu Gly Gly 275 280 285 Pro Glu Pro Leu Met Gln Ala Thr Ala Trp Leu Asn Ala Tyr Phe His 290 295 300 Gln Pro Glu Ala Ile Glu Glu Phe Pro Val Pro Ala Leu His His Pro 305 310 315 320 Val Phe Gln Gln Glu Ser Phe Thr Arg Gln Val Leu Trp Lys Leu Leu 325 330 335 Lys Val Val Lys Phe Gly Glu Val Ile Ser Tyr Ser His Leu Ala Ala 340 345 350 Leu Ala Gly Asn Pro Ala Ala Thr Ala Ala Val Lys Thr Ala Leu Ser 355 360 365 Gly Asn Pro Val Pro Ile Leu Ile Pro Cys His Arg Val Val Gln Gly 370 375 380 Asp Leu Asp Val Gly Gly Tyr Glu Gly Gly Leu Ala Val Lys Glu Trp 385 390 395 400 Leu Leu Ala His Glu Gly His Arg Leu Gly Lys Pro Gly Leu Gly Leu 405 410 415 Val Pro Arg Gly Ser His His His His His His 420 425

Claims (171)

  1. 제1 융합 단백질, 제2 융합 단백질, 및 링커를 포함하며,
    상기 제1 융합 단백질 및 상기 제2 융합 단백질은 각각 친화성 시약 및 반응성 효소를 포함하고;
    상기 링커는 제1 말단에 제1 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 제1 작용기, 및 제2 말단에 제2 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 제2 작용기를 포함하는 것인 작제물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소 및 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 상이한 것인 작제물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소 및 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 동일한 것인 작제물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 친화성 시약 및 상기 제2 융합 단백질 친화성 시약이 상이한 것인 작제물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 친화성 시약 및 상기 제2 융합 단백질 친화성 시약이 동일한 것인 작제물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 친화성 시약이 항체 또는 그의 단편, 소분자, 단일체, 단백질, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것인 작제물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 친화성 시약이 항체 또는 그의 단편인 작제물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편이 경쇄 가변 도메인 (VL), 경쇄 불변 도메인 (CL), 중쇄 가변 도메인 (VH), 중쇄 불변 도메인 (CH1), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 작제물.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 항체 또는 그의 단편이 키메라 항체, 인간 항체 및 인간화 항체인 작제물.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편이 트라스투주맙 또는 그의 단편을 포함하는 것인 작제물.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편이 아달리무맙, 알렘투주맙, 아르시투모맙, 세툭시맙, 트라스투주맙, 임시로맙, 카프로맙, 인플릭시맙, 압식시맙, 리툭시맙, 바실릭시맙, 팔리비주맙, 노페투모맙, 오말리주맙, 다클리주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 무로모납, 에드레콜로맙 젬투주맙 오조가마이신, 골리무맙, 세르톨리주맙, 에쿨리주맙, 우스테키누맙, 파니투무맙, 토시투모맙, 베바시주맙, 락시바쿠맙, 토실리주맙, 브렌툭시맙, 오파투무맙, 벨리무맙, 라무시루맙, 베돌리주맙, 오비누투주맙, 펨브롤리주맙, 라니비주맙, 페르투주맙, 데노수맙, 카투막소맙, 골리무맙, 실툭시맙, 나탈리주맙, 파니투무맙, 및 데노수맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 작제물.
  12. 제6항에 있어서, 상기 친화성 시약이 소분자인 작제물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 소분자가 약물인 작제물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 소분자가 알데스류킨, 알렌드론산, 알파페론, 알리트레티노인, 알로푸리놀, 알로프림, 알록시, 알트레타민, 아미노글루테티미드, L-아스파라기나제, 아미포스틴, 암루비신, 암사크린, 아나스트로졸, 안즈메트, 아라네스프, 아르글라빈, 아르세닉 트리옥시드, 아로마신, 5-아자시티딘, 아자티오프린, BCG 또는 타이스-BCG, 베스타틴, 베타메타손 아세테이트, 베타메타손 나트륨 포스페이트, 벡사로텐, 블레오마이신 설페이트, 브록수리딘, 보르테조밉, 블레오마이신, 부술판, 칼시토닌, 캄파쓰, 카페시타빈, 카보플라틴, 카르무스틴, 카소덱스, 세페손, 셀몰류킨, 세루비딘, 클로람부실, 시스플라틴, 콜라스파제, 클라드리빈, 클로드론산, 시클로포스파미드, 시타라빈, 다카르바진, 닥티노마이신, 다우녹솜, 데카드론, 데카드론 포스페이트, 델레스트로겐, 데닐류킨 디프티톡스, 데포메드롤, 데슬로렐린, 덱스라족산, 다우노루비신, 디에틸스틸베스트롤, 2',2'-디플루오로데옥시시티딘, 디플루칸, 도세탁셀, 독시플루리딘, 독소루비신, 드로나비돌, DW-166HC, 엘리가르드, 엘리테크, 엘렌스, 에멘드, 에피루비신, 에포에틴-알파, 에포겐, 에프타플라틴, 에르가미솔, 에스트라세, 에스트라디올, 에스트라무스틴 나트륨 포스페이트, 에티닐에스트라디올, 에티올, 에티드론산, 에토포포스, 에토포시드, 파드로졸, 파르스톤, 필그라스팀, 피나스테리드, 플리그라스팀, 플록수리딘, 플루코나졸, 플루다라빈, 플루다라빈 포스페이트, 5-플루오로데옥시우리딘, 5-플루오로데옥시우리딘 모노포스페이트, 5-플루오로우라실 (5-FU), 플루옥시메스테론, 플루타미드, 헥사메틸멜라민, 포르메스탄, 포스테아빈, 포테무스틴, 풀베스트란트, 감마가르드, 젬시타빈, 젬투주맙, 글리벡, 글리아델, 고세렐린, 그라니세트론 히드로클로라이드, 히스트렐린, 히캄틴, 히드로코르톤, 에리트로-히드록시노닐아데닌, 히드록시우레아, 히드록시프로게스테론 카프로에이트, 이브리투모맙 티욱세탄, 이다루비신, 이포스파미드, 인터페론-알파, 인터페론-알파-2, 인터페론-알파-2α, 인터페론-알파-2β, 인터페론-알파-n1, 인터페론-알파-n3, 인터페론-베타, 인터페론-감마-1α, 인터류킨-2, 인트론 A, 이레사, 이리노테칸, 키트릴, 렌티난 설페이트, 레트로졸, 류코보린, 류프롤리드, 류프롤리드 아세테이트, 레바미솔, 레보폴산 칼슘 염, 레보트로이드, 레복실, 로무스틴, 로니다민, 마리놀, 메클로레타민, 메코발라민, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트, 멜팔란, 메네스트, 6-메르캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 메트빅스, 밀테포신, 미노사이클린, 미토마이신 C, 미토탄, 미톡산트론, 모드레날, 미오세트, 네다플라틴, 뉼라스타, 뉴메가, 뉴포겐, 닐루타미드, 놀바덱스, NSC-631570, OCT-43, 옥트레오티드, 온단세트론 히드로클로라이드, 오파프레드, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 페디아프레드, 페파스파르가세, 페가시스, 펜토스타틴, N-포스포노아세틸 L-아스파르테이트 (PALA), 피시바닐, 필로카르핀 히드로클로라이드, 피라루비신, 플리카마이신, 포르피메르 나트륨, 프레드니무스틴, 프레드니솔론, 프레드니손, 프레마린, 프로카바진, 프로크리트, 랄티트렉세드, 레비프, 레늄-186 에티드로네이트, 리툭시맙, 로페론-A, 로무르티드, 살라겐, 산도스타틴, 사르그라모스팀, 세무스틴, 시조피란, 소부족산, 솔루-메드롤, 스트렙토조신, 스트론튬-89 클로라이드, 신트로이드, 타목시펜, 탐술로신, 타소네르민, 타스톨락톤, 탁소테르, 테셀류킨, 테모졸로미드, 테니포시드, 테스토스테론 프로피오네이트, 테스트레드, 티오구아닌, 티오테파, 티로트로핀, 틸루드론산, 토포테칸, 토레미펜, 토시투모맙, 타스투주맙, 테오술판, 트레티노인, 트렉살, 트리메틸멜라민, 트리메트렉세이트, 트리프토렐린 아세테이트, 트리프토렐린 파모에이트, UFT, 우리딘, 발루비신, 베스나리논, 빈블라스틴, 빈크리틴, 빈데신, 비노렐빈, 비룰리진, 지네카르드, 지노스타틴-스티말라메르, 조프란; ABI-007, 아콜비펜, 악티뮨, 아피니탁, 아미노프테린, 아르족시펜, 아소프리스닐, 아타메스탄, 아트라센탄, 아바스틴, BAY 43-9006 (소라페닙), CCI-779, CDC-501, 셀레브렉스, 세툭시맙, 크리스나톨, 시프로테론 아세테이트, 데시타빈, DN-101, 독소루비신-MTC, dSLIM, 두타스테리드, 에도테카린, 에플로르니틴, 엑사테칸, 펜레티니드, 히스타민 디히드로클로라이드, 히스트렐린 히드로겔 임플란트, 홀뮴-166 DOTMP, 이반드론산, 인터페론-감마, 인트론-PEG, 익사베필론, 키홀 림펫 헤모시아닌, L-651582, 란레오티드, 라소폭시펜, 리브라, 로나파르닙, 미프록시펜, 미노드로네이트, MS-209, 리포좀 MTP-PE, MX-6, 나파렐린, 네모루비신, 네오바스타트, 놀라트렉세드, 오블리메르센, 온코-TCS, 오시뎀, 파클리탁셀 폴리글루타메이트, 파미드로네이트 이나트륨, PN-401, QS-21, 쿠아제팜, R-1549, 랄록시펜, 란피르나스, 13-시스-레트산, 사트라플라틴, 세오칼시톨, T-138067, 타르세바, 탁소프렉신, 티모신-알파-1, 티아조푸린, 티피파르닙, 티라파자민, TLK-286, 토레미펜, 트랜스MID-107R, 발스포다르, 바프레오티드, 바탈라닙, 베르테포르핀, 빈플루닌, Z-100, 졸레드론산, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 작제물.
  15. 제6항에 있어서, 상기 친화성 시약이 단일체인 작제물.
  16. 제6항에 있어서, 상기 친화성 시약이 단백질인 작제물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 단백질이 적어도 하나의 비-천연 아미노산을 포함하는 것인 작제물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 단백질이 파지 내의 단백질인 작제물.
  19. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 단백질이 치료 단백질인 작제물.
  20. 제6항에 있어서, 상기 친화성 시약이 합성 항체 도메인인 작제물.
  21. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친화성 시약이 디자인된 안키린 반복 단백질 (DARPin), HEL4 Vh 도메인 (프레더터), 포도상구균 단백질 A의 Z-도메인 (아피바디), 아르케알 "7 kDa DNA 결합제" 단백질 패밀리 (아피틴), 탄수화물-결합 모듈 (CBD 도메인), 시스틴-노트 미니단백질 (노틴), 피브로넥틴 III 타입 도메인 (단일체, 아드넥틴), γ-B-크리스탈린 (아필린), 시스타틴 (아피머), 3중 나선 2중 코일 도메인 (알파바디), 리포칼린 도메인 (안티칼린), 다양한 멤브레인 수용체의 A 도메인 (아비머), Fyn의 SH3 도메인 (피노머), 쿠니츠 도메인 펩티드, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 작제물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 폴리옥사졸린, 폴리아크릴로모르폴린, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말레산 무수물, 폴리(1-히드록시메틸에틸렌 히드록시메틸 포르말) ("PHF"), 폴리히드록시알킬아크릴레이트, 2-메티아크릴로일옥시-2'-에틸트리메틸암모늄 포스페이트 ("MPC"), 또는 하기로부터 선택된 구조인 작제물:
    Figure pct00011
    또는
    Figure pct00012
    ;
    여기서,
    m은 0 내지 10이고;
    n은 1 내지 100이고;
    각각의 p는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이고;
    q는 0, 1 또는 2이고;
    r은 1 또는 2이고;
    E는 NH 또는 CHR10이고;
    G는 O, CH2, CHOH, CHNH2, CHCOOH 또는 CHSO3H이고;
    R10은 OH, NH2 또는 COOH이고;
    각각의 R11은 독립적으로 H, OH, NH2, 또는 COOH이다.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 반응성 효소가 큐티나제, SnapTag, HaloTag, 타입 I DNA 토포이소머라제의 릴렉사제 도메인, 베타-락타마제, 글리코시다제, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 세포질 단백질 티로신 키나제 도메인, 알칼리 포스파타제, 단백질-티로신-포스파타제, 23S rRNA (아데닌(2503)-C(2))-메틸트랜스퍼라제의 변이체, 글루코시다제, N-6 아데닌-특이적 DNA 메틸라제, N(4)-시토신-특이적 DNA 메틸라제, DNA (시토신-5-)-메틸트랜스퍼라제, 할로알칸 데할로게나제의 변이체, HNH 엔도뉴클레아제, 닉킹 엔도뉴클레아제, 젤라티나제 B, 젤라티나제 A, 스트로멜리신, 지방산 아미드 히드롤라제, 에스테라제, 사이토크롬 P450, 메티오닌 아미노펩티다제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것인 작제물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 큐티나제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 p-니트로페닐 포스포네이트를 포함하는 것인 작제물.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 SnapTag을 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 O6-벤질구아닌을 포함하는 것인 작제물.
  26. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 HaloTag를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 α-클로로알칸을 포함하는 것인 작제물.
  27. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 베타-락타마제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 클라불란산 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 작제물.
  28. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 글리코시다제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 아글리콘 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 작제물.
  29. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 매트릭스 메탈로프로테이나제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 히드록삼산-벤조페논 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 작제물.
  30. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 타입 I DNA 토포이소머라제의 릴렉사제 도메인을 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 동족 oriT 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 작제물.
  31. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 세포질 단백질 티로신 키나제 도메인을 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 시스테인-반응성 ATP-결합 부위 억제제를 포함하는 것인 작제물.
  32. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 알칼리 포스파타제를 포함하고, 제1 말단의 작용기가 퀴논 메티드, α-할로 포스폰산, 이들의 전구체, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 작제물.
  33. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 단백질-티로신-포스파타제를 포함하고, 제1 말단의 작용기가 포르밀크로몬, α-할로 포스폰산, 이들의 전구체, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 작제물.
  34. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 23S rRNA (아데닌(2503)-C(2))-메틸트랜스퍼라제의 변이체를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 동족 RNA 서열을 포함하는 것인 작제물.
  35. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 글루코시다제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 아글리콘 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 작제물.
  36. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 N-6 아데닌-특이적 DNA 메틸라제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 아데노신 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 작제물.
  37. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 N(4)-시토신-특이적 DNA 메틸라제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 시토신 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 작제물.
  38. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 DNA (시토신-5-)-메틸트랜스퍼라제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 시토신 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 작제물.
  39. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 할로알칸 데할로게나제의 변이체를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 할로알칸, 할로방향족 화합물 또는 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 작제물.
  40. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 융합 단백질 반응성 효소가 HNH 엔도뉴클레아제를 포함하고, 제1 말단의 작용기가 동족 DNA 닉킹 부위를 포함하는 것인 작제물.
  41. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 닉킹 엔도뉴클레아제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 동족 DNA 닉킹 부위를 포함하는 것인 작제물.
  42. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 젤라티나제 B를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 티이란, 히드록삼산, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 작제물.
  43. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 젤라티나제 A를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 티이란, 히드록삼산, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 작제물.
  44. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 스트로멜리신을 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 티이란, 히드록삼산, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 작제물.
  45. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 지방산 아미드 히드롤라제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 α-케톡사졸 억제제 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 작제물.
  46. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 에스테라제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 포스포네이트, 카르바메이트, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 작제물.
  47. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 시토크롬 P450을 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 친전자성 스테로이드, 방향족 알킨, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 작제물.
  48. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 메티오닌 아미노펩티다제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 벨로라닙 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 작제물.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 큐티나제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 p-니트로페닐 포스포네이트를 포함하는 것인 작제물.
  50. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 SnapTag를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 O6-벤질구아닌을 포함하는 것인 작제물.
  51. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 HaloTag를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 α-클로로알칸을 포함하는 것인 작제물.
  52. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 베타-락타마제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 클라불란산 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 작제물.
  53. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 글리코시다제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 아글리콘 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 작제물.
  54. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 매트릭스 메탈로프로테이나제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 히드록삼산-벤조페논 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 작제물.
  55. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 타입 I DNA 토포이소머라제의 릴렉사제 도메인을 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 동족 oriT 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 작제물.
  56. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 세포질 단백질 티로신 키나제 도메인을 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 시스테인-반응성 ATP-결합 부위 억제제를 포함하는 것인 작제물.
  57. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 알칼리 포스파타제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 퀴논 메티드, α-할로 포스폰산, 이들의 전구체, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 작제물.
  58. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 단백질-티로신-포스파타제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 포르밀크로몬, α-할로 포스폰산, 이들의 전구체, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 작제물.
  59. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 23S rRNA (아데닌(2503)-C(2))-메틸트랜스퍼라제의 변이체를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 동족 RNA 서열을 포함하는 것인 작제물.
  60. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 글루코시다제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 아글리콘 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 작제물.
  61. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 N-6 아데닌-특이적 DNA 메틸라제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 아데노신 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 작제물.
  62. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 N(4)-시토신-특이적 DNA 메틸라제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 시토신 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 작제물.
  63. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 DNA (시토신-5-)-메틸트랜스퍼라제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 시토신 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 작제물.
  64. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 할로알칸 데할로게나제의 변이체를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 할로알칸, 할로방향족 화합물 또는 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 작제물.
  65. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 HNH 엔도뉴클레아제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 동족 DNA 닉킹 부위를 포함하는 것인 작제물.
  66. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 닉킹 엔도뉴클레아제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 동족 DNA 닉킹 부위를 포함하는 것인 작제물.
  67. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 젤라티나제 B를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 티이란, 히드록삼산, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 작제물.
  68. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 젤라티나제 A를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 티이란, 히드록삼산, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 작제물.
  69. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 스트로멜리신을 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 티이란, 히드록삼산, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 작제물.
  70. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 지방산 아미드 히드롤라제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 α-케톡사졸 억제제 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 작제물.
  71. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 에스테라제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 포스포네이트, 카르바메이트, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 작제물.
  72. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 시토크롬 P450을 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 친전자성 스테로이드, 방향족 알킨, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 작제물.
  73. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 메티오닌 아미노펩티다제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 벨로라닙 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 작제물.
  74. (a) 친화성 시약 및 반응성 효소를 포함하는 제1 융합 단백질을, 제1 말단에 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 작용기를 포함하는 링커와 접촉시킴으로써, 상기 제1 융합 단백질 및 링커를 제1 말단에서 커플링하고,
    (b) 친화성 시약 및 반응성 효소를 포함하는 제2 융합 단백질을, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소를 비가역적으로 억제하는 것에 대해 특이적인 작용기를 포함하는 링커의 제2 말단과 접촉시킴으로써, 상기 제2 융합 단백질 및 링커를 제2 말단에서 커플링하는 것
    을 포함하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)가 순차적으로 수행되는 것인 방법.
  76. 제74항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)가 동시에 수행되는 것인 방법.
  77. 제74항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소 및 제2 융합 단백질 반응성 효소가 상이한 것인 방법.
  78. 제74항에 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소 및 제2 융합 단백질 반응성 효소가 동일한 것인 방법.
  79. 제74항에 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 친화성 시약 및 제2 융합 단백질 친화성 시약이 상이한 것인 방법.
  80. 제74항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 친화성 시약 및 제2 융합 단백질 친화성 시약이 동일한 것인 방법.
  81. 제74항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 친화성 시약이 항체 또는 그의 단편, 소분자, 단일체, 단백질, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것인 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 친화성 시약이 항체 또는 그의 단편인 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편이 경쇄 가변 도메인 (VL), 경쇄 불변 도메인 (CL), 중쇄 가변 도메인 (VH), 중쇄 불변 도메인 (CH1), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  84. 제82항 또는 제83항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 항체 또는 그의 단편이 키메라 항체, 인간 항체 및 인간화 항체인 방법.
  85. 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 트라스투주맙 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법.
  86. 제82항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편이 아달리무맙, 알렘투주맙, 아르시투모맙, 세툭시맙, 트라스투주맙, 임시로맙, 카프로맙, 인플릭시맙, 압식시맙, 리툭시맙, 바실릭시맙, 팔리비주맙, 노페투모맙, 오말리주맙, 다클리주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 무로모납, 에드레콜로맙 젬투주맙 오조가마이신, 골리무맙, 세르톨리주맙, 에쿨리주맙, 우스테키누맙, 파니투무맙, 토시투모맙, 베바시주맙, 락시바쿠맙, 토실리주맙, 브렌툭시맙, 오파투무맙, 벨리무맙, 라무시루맙, 베돌리주맙, 오비누투주맙, 펨브롤리주맙, 라니비주맙, 페르투주맙, 데노수맙, 카투막소맙, 골리무맙, 실툭시맙, 나탈리주맙, 파니투무맙, 및 데노수맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  87. 제81항에 있어서, 상기 친화성 시약이 소분자인 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 소분자가 약물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 소분자가 알데스류킨, 알렌드론산, 알파페론, 알리트레티노인, 알로푸리놀, 알로프림, 알록시, 알트레타민, 아미노글루테티미드, L-아스파라기나제, 아미포스틴, 암루비신, 암사크린, 아나스트로졸, 안즈메트, 아라네스프, 아르글라빈, 아르세닉 트리옥시드, 아로마신, 5-아자시티딘, 아자티오프린, BCG 또는 타이스-BCG, 베스타틴, 베타메타손 아세테이트, 베타메타손 나트륨 포스페이트, 벡사로텐, 블레오마이신 설페이트, 브록수리딘, 보르테조밉, 블레오마이신, 부술판, 칼시토닌, 캄파쓰, 카페시타빈, 카보플라틴, 카르무스틴, 카소덱스, 세페손, 셀몰류킨, 세루비딘, 클로람부실, 시스플라틴, 콜라스파제, 클라드리빈, 클로드론산, 시클로포스파미드, 시타라빈, 다카르바진, 닥티노마이신, 다우녹솜, 데카드론, 데카드론 포스페이트, 델레스트로겐, 데닐류킨 디프티톡스, 데포메드롤, 데슬로렐린, 덱스라족산, 다우노루비신, 디에틸스틸베스트롤, 2',2'-디플루오로데옥시시티딘, 디플루칸, 도세탁셀, 독시플루리딘, 독소루비신, 드로나비돌, DW-166HC, 엘리가르드, 엘리테크, 엘렌스, 에멘드, 에피루비신, 에포에틴-알파, 에포겐, 에프타플라틴, 에르가미솔, 에스트라세, 에스트라디올, 에스트라무스틴 나트륨 포스페이트, 에티닐에스트라디올, 에티올, 에티드론산, 에토포포스, 에토포시드, 파드로졸, 파르스톤, 필그라스팀, 피나스테리드, 플리그라스팀, 플록수리딘, 플루코나졸, 플루다라빈, 플루다라빈 포스페이트, 5-플루오로데옥시우리딘, 5-플루오로데옥시우리딘 모노포스페이트, 5-플루오로우라실 (5-FU), 플루옥시메스테론, 플루타미드, 헥사메틸멜라민, 포르메스탄, 포스테아빈, 포테무스틴, 풀베스트란트, 감마가르드, 젬시타빈, 젬투주맙, 글리벡, 글리아델, 고세렐린, 그라니세트론 히드로클로라이드, 히스트렐린, 히캄틴, 히드로코르톤, 에리트로-히드록시노닐아데닌, 히드록시우레아, 히드록시프로게스테론 카프로에이트, 이브리투모맙 티욱세탄, 이다루비신, 이포스파미드, 인터페론-알파, 인터페론-알파-2, 인터페론-알파-2α, 인터페론-알파-2β, 인터페론-알파-n1, 인터페론-알파-n3, 인터페론-베타, 인터페론-감마-1α, 인터류킨-2, 인트론 A, 이레사, 이리노테칸, 키트릴, 렌티난 설페이트, 레트로졸, 류코보린, 류프롤리드, 류프롤리드 아세테이트, 레바미솔, 레보폴산 칼슘 염, 레보트로이드, 레복실, 로무스틴, 로니다민, 마리놀, 메클로레타민, 메코발라민, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트, 멜팔란, 메네스트, 6-메르캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 메트빅스, 밀테포신, 미노사이클린, 미토마이신 C, 미토탄, 미톡산트론, 모드레날, 미오세트, 네다플라틴, 뉼라스타, 뉴메가, 뉴포겐, 닐루타미드, 놀바덱스, NSC-631570, OCT-43, 옥트레오티드, 온단세트론 히드로클로라이드, 오파프레드, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 페디아프레드, 페파스파르가세, 페가시스, 펜토스타틴, N-포스포노아세틸 L-아스파르테이트 (PALA), 피시바닐, 필로카르핀 히드로클로라이드, 피라루비신, 플리카마이신, 포르피메르 나트륨, 프레드니무스틴, 프레드니솔론, 프레드니손, 프레마린, 프로카바진, 프로크리트, 랄티트렉세드, 레비프, 레늄-186 에티드로네이트, 리툭시맙, 로페론-A, 로무르티드, 살라겐, 산도스타틴, 사르그라모스팀, 세무스틴, 시조피란, 소부족산, 솔루-메드롤, 스트렙토조신, 스트론튬-89 클로라이드, 신트로이드, 타목시펜, 탐술로신, 타소네르민, 타스톨락톤, 탁소테르, 테셀류킨, 테모졸로미드, 테니포시드, 테스토스테론 프로피오네이트, 테스트레드, 티오구아닌, 티오테파, 티로트로핀, 틸루드론산, 토포테칸, 토레미펜, 토시투모맙, 타스투주맙, 테오술판, 트레티노인, 트렉살, 트리메틸멜라민, 트리메트렉세이트, 트리프토렐린 아세테이트, 트리프토렐린 파모에이트, UFT, 우리딘, 발루비신, 베스나리논, 빈블라스틴, 빈크리틴, 빈데신, 비노렐빈, 비룰리진, 지네카르드, 지노스타틴-스티말라메르, 조프란; ABI-007, 아콜비펜, 악티뮨, 아피니탁, 아미노프테린, 아르족시펜, 아소프리스닐, 아타메스탄, 아트라센탄, 아바스틴, BAY 43-9006 (소라페닙), CCI-779, CDC-501, 셀레브렉스, 세툭시맙, 크리스나톨, 시프로테론 아세테이트, 데시타빈, DN-101, 독소루비신-MTC, dSLIM, 두타스테리드, 에도테카린, 에플로르니틴, 엑사테칸, 펜레티니드, 히스타민 디히드로클로라이드, 히스트렐린 히드로겔 임플란트, 홀뮴-166 DOTMP, 이반드론산, 인터페론-감마, 인트론-PEG, 익사베필론, 키홀 림펫 헤모시아닌, L-651582, 란레오티드, 라소폭시펜, 리브라, 로나파르닙, 미프록시펜, 미노드로네이트, MS-209, 리포좀 MTP-PE, MX-6, 나파렐린, 네모루비신, 네오바스타트, 놀라트렉세드, 오블리메르센, 온코-TCS, 오시뎀, 파클리탁셀 폴리글루타메이트, 파미드로네이트 이나트륨, PN-401, QS-21, 쿠아제팜, R-1549, 랄록시펜, 란피르나스, 13-시스-레트산, 사트라플라틴, 세오칼시톨, T-138067, 타르세바, 탁소프렉신, 티모신-알파-1, 티아조푸린, 티피파르닙, 티라파자민, TLK-286, 토레미펜, 트랜스MID-107R, 발스포다르, 바프레오티드, 바탈라닙, 베르테포르핀, 빈플루닌, Z-100, 졸레드론산, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  90. 제81항에 있어서, 상기 친화성 시약이 단일체인 방법.
  91. 제81항에 있어서, 상기 친화성 시약이 단백질인 방법.
  92. 제91항에 있어서, 상기 단백질이 적어도 하나의 비-천연 아미노산을 포함하는 것인 방법.
  93. 제91항 또는 제92항에 있어서, 상기 단백질이 파지 내의 단백질인 방법.
  94. 제91항 또는 제92항에 있어서, 상기 단백질이 치료 단백질인 방법.
  95. 제81항에 있어서, 상기 친화성 시약이 합성 항체 도메인인 방법.
  96. 제74항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친화성 시약이 디자인된 안키린 반복 단백질 (DARPin), HEL4 Vh 도메인 (프레더터), 포도상구균 단백질 A의 Z-도메인 (아피바디), 아르케알 "7 kDa DNA 결합제" 단백질 패밀리 (아피틴), 탄수화물-결합 모듈 (CBD 도메인), 시스틴-노트 미니단백질 (노틴), 피브로넥틴 III 타입 도메인 (단일체, 아드넥틴), γ-B-크리스탈린 (아필린), 시스타틴 (아피머), 3중 나선 2중 코일 도메인 (알파바디), 리포칼린 도메인 (안티칼린), 다양한 멤브레인 수용체의 A 도메인 (아비머), Fyn의 SH3 도메인 (피노머), 쿠니츠 도메인 펩티드, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  97. 제74항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 폴리옥사졸린, 폴리아크릴로모르폴린, 폴리비닐피롤리돈, 폴리포스파젠, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말레산 무수물, 폴리(1-히드록시메틸에틸렌 히드록시메틸 포르말) ("PHF"), 폴리히드록시알킬아크릴레이트, 2-메티아크릴로일옥시-2'-에틸트리메틸암모늄 포스페이트 ("MPC"), 또는 하기로부터 선택된 구조인 방법:
    Figure pct00013
    또는
    Figure pct00014
    ;
    여기서,
    m은 0 내지 10이고;
    n은 1 내지 100이고;
    각각의 p는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이고;
    q는 0, 1 또는 2이고;
    r은 1 또는 2이고;
    E는 NH 또는 CHR10이고;
    G는 O, CH2, CHOH, CHNH2, CHCOOH 또는 CHSO3H이고;
    R10은 OH, NH2 또는 COOH이고;
    각각의 R11은 독립적으로 H, OH, NH2, 또는 COOH이다.
  98. 제74항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 반응성 효소가 큐티나제, SnapTag, HaloTag, 타입 I DNA 토포이소머라제의 릴렉사제 도메인, 베타-락타마제, 글리코시다제, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 세포질 단백질 티로신 키나제 도메인, 알칼리 포스파타제, 단백질-티로신-포스파타제, 23S rRNA (아데닌(2503)-C(2))-메틸트랜스퍼라제의 변이체, 글루코시다제, N-6 아데닌-특이적 DNA 메틸라제, N(4)-시토신-특이적 DNA 메틸라제, DNA (시토신-5-)-메틸트랜스퍼라제, 할로알칸 데할로게나제의 변이체, HNH 엔도뉴클레아제, 닉킹 엔도뉴클레아제, 젤라티나제 B, 젤라티나제 A, 스트로멜리신, 지방산 아미드 히드롤라제, 에스테라제, 사이토크롬 P450, 메티오닌 아미노펩티다제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것인 방법.
  99. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 큐티나제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 p-니트로페닐 포스포네이트를 포함하는 것인 방법.
  100. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 SnapTag을 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 O6-벤질구아닌을 포함하는 것인 방법.
  101. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 융합 단백질 반응성 효소가 HaloTag를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 α-클로로알칸을 포함하는 것인 방법.
  102. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 베타-락타마제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 클라불란산 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 방법.
  103. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 글리코시다제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 아글리콘 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 방법.
  104. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 매트릭스 메탈로프로테이나제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 히드록삼산-벤조페논 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 방법.
  105. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 타입 I DNA 토포이소머라제의 릴렉사제 도메인을 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 동족 oriT 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  106. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 세포질 단백질 티로신 키나제 도메인을 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 시스테인-반응성 ATP-결합 부위 억제제를 포함하는 것인 방법.
  107. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 알칼리 포스파타제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 퀴논 메티드, α-할로 포스폰산, 이들의 전구체, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 방법.
  108. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 단백질-티로신-포스파타제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 포르밀크로몬, α-할로 포스폰산, 이들의 전구체, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 방법.
  109. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 23S rRNA (아데닌(2503)-C(2))-메틸트랜스퍼라제의 변이체를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 동족 RNA 서열을 포함하는 것인 방법.
  110. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 글루코시다제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 아글리콘 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 방법.
  111. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 N-6 아데닌-특이적 DNA 메틸라제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 아데노신 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 방법.
  112. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 N(4)-시토신-특이적 DNA 메틸라제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 시토신 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 방법.
  113. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 DNA (시토신-5-)-메틸트랜스퍼라제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 시토신 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 방법.
  114. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 할로알칸 데할로게나제의 변이체를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 할로알칸, 할로방향족 화합물 또는 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 방법.
  115. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 HNH 엔도뉴클레아제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 동족 DNA 닉킹 부위를 포함하는 것인 방법.
  116. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 닉킹 엔도뉴클레아제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 동족 DNA 닉킹 부위를 포함하는 것인 방법.
  117. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 젤라티나제 B를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 티이란, 히드록삼산, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 방법.
  118. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 젤라티나제 A를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 티이란, 히드록삼산, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 방법.
  119. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 스트로멜리신을 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 티이란, 히드록삼산, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 방법.
  120. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 지방산 아미드 히드롤라제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 α-케톡사졸 억제제 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 방법.
  121. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 에스테라제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 포스포네이트, 카르바메이트, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 방법.
  122. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 시토크롬 P450을 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 친전자성 스테로이드, 방향족 알킨, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 방법.
  123. 제74항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질 반응성 효소가 메티오닌 아미노펩티다제를 포함하고, 상기 제1 말단의 작용기가 벨로라닙 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 방법.
  124. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 큐티나제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 p-니트로페닐 포스포네이트를 포함하는 것인 방법.
  125. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 SnapTag를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 O6-벤질구아닌을 포함하는 것인 방법.
  126. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 HaloTag를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 α-클로로알칸을 포함하는 것인 방법.
  127. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 베타-락타마제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 클라불란산 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 방법.
  128. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 글리코시다제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 아글리콘 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 방법.
  129. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 매트릭스 메탈로프로테이나제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 히드록삼산-벤조페논 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 방법.
  130. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 타입 I DNA 토포이소머라제의 릴렉사제 도메인을 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 동족 oriT 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  131. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 세포질 단백질 티로신 키나제 도메인을 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 시스테인-반응성 ATP-결합 부위 억제제를 포함하는 것인 방법.
  132. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 알칼리 포스파타제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 퀴논 메티드, α-할로 포스폰산, 이들의 전구체, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 방법.
  133. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 단백질-티로신-포스파타제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 포르밀크로몬, α-할로 포스폰산, 이들의 전구체, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 방법.
  134. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 23S rRNA (아데닌(2503)-C(2))-메틸트랜스퍼라제의 변이체를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 동족 RNA 서열을 포함하는 것인 방법.
  135. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 글루코시다제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 아글리콘 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 방법.
  136. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 N-6 아데닌-특이적 DNA 메틸라제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 아데노신 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 방법.
  137. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 N(4)-시토신-특이적 DNA 메틸라제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 시토신 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 방법.
  138. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 DNA (시토신-5-)-메틸트랜스퍼라제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 시토신 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 방법.
  139. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 할로알칸 데할로게나제의 변이체를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 할로알칸, 할로방향족 화합물 또는 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 방법.
  140. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 HNH 엔도뉴클레아제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 동족 DNA 닉킹 부위를 포함하는 것인 방법.
  141. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 닉킹 엔도뉴클레아제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 동족 DNA 닉킹 부위를 포함하는 것인 방법.
  142. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 젤라티나제 B를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 티이란, 히드록삼산, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 방법.
  143. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 젤라티나제 A를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 티이란, 히드록삼산, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 방법.
  144. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 스트로멜리신을 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 티이란, 히드록삼산, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 방법.
  145. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 지방산 아미드 히드롤라제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 α-케톡사졸 억제제 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 방법.
  146. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 에스테라제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 포스포네이트, 카르바메이트, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 방법.
  147. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 시토크롬 P450을 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 친전자성 스테로이드, 방향족 알킨, 이들의 유도체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는 것인 방법.
  148. 제74항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 융합 단백질 반응성 효소가 메티오닌 아미노펩티다제를 포함하고, 상기 제2 말단의 작용기가 벨로라닙 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 방법.
  149. 제74항 내지 제148항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 작제물.
  150. 제1항 내지 제73항 또는 제149항 중 어느 한 항의 작제물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  151. 제1항 내지 제73항 또는 제149항 중 어느 한 항의 작제물의, 이를 필요로 하는 환자를 위한 약제로서의 용도.
  152. 제150항 또는 제151항에 있어서, 상기 환자가 유방암을 앓고 있고, 상기 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편이 트라스투주맙 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  153. 제150항 또는 제151항에 있어서, 상기 환자가 흡입 탄저병을 앓고 있고, 상기 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편이 락시바쿠맙 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  154. 제150항 또는 제151항에 있어서, 상기 환자가 류마티스성 관절염 또는 전신성 소아 특발성 관절염을 앓고 있고, 상기 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편이 토실리주맙 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  155. 제150항 또는 제151항에 있어서, 상기 환자가 호지킨 림프종 또는 전신성 역형성 대세포 림프종을 앓고 있고, 상기 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편이 브렌툭시맙 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  156. 제150항 또는 제151항에 있어서, 상기 환자가 만성 림프구성 백혈병, 여포성 비-호지킨 림프종, 미만성 대 B 세포 림프종, 류마티스성 관절염 및 재발-완화성 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택된 병태를 앓고 있고, 상기 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편이 오파투무맙 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  157. 제150항 또는 제151항에 있어서, 상기 환자가 전신성 홍반성 루푸스를 앓고 있고, 상기 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편이 벨리무맙 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  158. 제150항 또는 제151항에 있어서, 상기 환자가 위 또는 위-식도 접합부 선암종 또는 전이성 비-소세포 폐암종을 앓고 있고, 상기 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편이 라무시루맙 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  159. 제150항 또는 제151항에 있어서, 상기 환자가 궤양성 대장염 또는 크론병을 앓고 있고, 상기 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편이 베돌리주맙 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  160. 제150항 또는 제151항에 있어서, 상기 환자가 만성 림프구성 백혈병 또는 여포성 림프종을 앓고 있고, 상기 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편이 오비누투주맙 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  161. 제150항 또는 제151항에 있어서, 상기 환자가 흑색종 또는 전이성 비-소세포 폐암을 앓고 있고, 상기 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편이 펨브롤리주맙 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  162. 제150항 또는 제151항에 있어서, 상기 환자가 황반 변성을 앓고 있고, 상기 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편이 라니비주맙 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  163. 제150항 또는 제151항에 있어서, 상기 환자가 유방암을 앓고 있고, 상기 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편이 페르투주맙 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  164. 제150항 또는 제151항에 있어서, 상기 환자가 골다공증, 치료-유도된 뼈 손실, 뼈로의 전이 및 뼈의 거대 세포 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 병태를 앓고 있고, 상기 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편이 데노수맙 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  165. 제150항 또는 제151항에 있어서, 상기 환자가 악성 복수를 앓고 있고, 상기 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편이 카투막소맙 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  166. 제150항 또는 제151항에 있어서, 상기 환자가 류마티스성 관절염, 건선 관절염, 강직성 척추염 및 궤양성 결장염으로 이루어진 군으로부터 선택된 병태를 앓고 있고, 상기 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편이 골리무맙 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  167. 제150항 또는 제151항에 있어서, 상기 환자가 전이성 신장 세포 암, 전립선암, 난소암, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종 및 캐슬만병으로 이루어진 군으로부터 선택된 병태를 앓고 있고, 상기 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편이 실툭시맙 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  168. 제150항 또는 제151항에 있어서, 상기 환자가 다발성 경화증 또는 크론병을 앓고 있고, 상기 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편이 나탈리주맙 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  169. 제150항 또는 제151항에 있어서, 상기 환자가 결장직장암을 앓고 있고, 상기 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편이 파니투무맙 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  170. 제150항 또는 제151항에 있어서, 상기 환자가 골다공증, 치료-유도된 뼈 손실, 뼈로의 전이 및 뼈의 거대 세포 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 병태를 앓고 있고, 상기 작제물의 적어도 하나의 항체 또는 그의 단편이 데노수맙 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  171. 제1항 내지 제73항 또는 제149항 중 어느 한 항의 작제물의 진단제로서의 용도.
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