JP2017104049A - 生体試料中の成分の測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】酵素を用いた前処理反応と検出反応による生体試料中の測定対象成分の測定で，測定対象成分と妨害成分の構造や性質が類似しており前処理反応で測定対象成分が消化される場合や検体の希釈倍率を高くしないで測定する必要がある場合に，測定対象成分を正確に測定する方法が求められていた。
【解決手段】生体試料中の測定対象成分を酵素Ａと反応させて検出する測定において，別の酵素Ｂにて該反応の妨害成分を除去する工程を備えており，該測定対象成分が酵素Ａ及び酵素Ｂの双方と反応する場合に，該妨害成分を除去する工程に，酵素Ｂへの基質特異性が該測定対象成分よりも高い，及び／または，酵素Ｂとの酵素反応が該測定対象成分よりも早い化合物を加えることを特徴とする生体試料中の測定対象成分の測定方法を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は前処理反応を必要とする生体試料中の測定対象成分の測定方法に関する。特に酵素を用いた前処理反応と検出反応による生体試料中の測定対象成分の測定をする際に，特定の性質を有する化合物を該測定に使用する測定方法に関する。

生体成分の測定，例えば，生化学検査の項目には，まず採取した検体に対して前処理反応を行って検出反応の妨げとなる検体中の妨害成分を除去し，その後，検出反応を行うという２段階の反応を行う項目が多くある。例えば，血清中の総ビリルビン量の測定では，界面活性剤で前処理を行った後に，ジアゾ反応により検出反応を行う。また，クレアチニンの測定では，クレアチンを前処理で除去した後に，クレアチニンの検出を行う方法が知られている。また，血中の１，５−アンヒドログルシトール（以下，１，５−ＡＧと略す），赤血球中のソルビトールや尿中のミオイノシトールなどの測定方法においては，グルコース及び／またはその誘導体などの妨害を受けるため，グルコースなどを除去する前処理反応を施した後に，測定対象成分である１，５−ＡＧ，ソルビトールやミオイノシトールの検出を行う方法が知られている。
更に，生化学検査用の汎用の自動分析装置への応用が可能な酵素による前処理反応および検出反応の利用が一般的となっている。

前処理反応および検出反応に酵素を使用する場合，妨害成分を除去する前処理反応に使用する酵素により測定対象成分が消化され，その結果，測定対象成分の正確な測定ができないことがある。

例えば，１，５−ＡＧを代表例として説明する。１，５−ＡＧは糖類であり，グルコースと類似構造を持つ環状ポリオールである。１，５−ＡＧは，健常人の血液中に一定程度の濃度で存在するが，糖尿病患者では特異的に低下し，且つその低下率が顕著であることから糖尿病の診断に用いられている。この１，５−ＡＧを，酵素を用いて測定する際には使用する検出酵素の特異性の点から血液中に多量に存在するグルコースを除去する必要がある。グルコースを除去する方法としては，例えば，特許第３４２８０７３号公報に記載のように，
（１）イオン交換樹脂（ミニカラム）で吸着する方法，
（２）塩酸で分解する方法，
（３）水素化ホウ素ナトリウムで還元する方法，
（４）グルコースオキシダーゼで酸化する方法，
（５）へキソキナーゼ（以下，ＨＫと略す）またはグルコキナーゼ（以下，ＧＫと略す）でリン酸化する方法，
が知られている。

これらの方法の内，特許文献１〜３等に記載されている酵素によるリン酸化法が頻用されている。これらのＨＫまたはＧＫを用いる方法ではその基質特異性により１，５−ＡＧも一部消化されてしまうことがあり，従来は，１，５−ＡＧが受ける消化の影響をできるだけ小さくするために検体測定の最終希釈倍率を４５倍程度以上にして前処理反応で使用する酵素の濃度を極力下げ影響を回避していた。

特開平１−３２０９９８号公報 特開平２−１０４２９８号公報 特開平３−２７２９９号公報

酵素を用いた前処理反応と検出反応による生体試料中の測定対象成分の測定で，測定対象成分と妨害成分の構造や性質が類似しており前処理反応で測定対象成分が消化されたり，検体の希釈倍率を高くしないで測定する必要がある場合に，測定対象成分を正確に測定する方法が求められていた。

前記の１，５−ＡＧを例として更に説明する。
糖尿病患者の合併症発症を予防するために，患者自身が自宅で測定する自己血糖測定装置が普及しているが，血糖は食事により変動するため頻回に測定する必要があり，患者の負担が大きく知識の乏しい患者自身では測定値の的確な解釈が難しく，血糖値を厳密に管理することは容易でない。
一方，１，５−ＡＧは食事の影響を受けず，糖尿病患者の過去１週間の血糖コントロール状態を反映するので自宅で週一回測定するだけで糖尿病患者は自分の血糖コントロール状態を正確に把握できる。そのため近年，自宅で簡易に測定できるＰｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ（以下，ＰＯＣＴと略す）やホームユース用の測定機器の開発が要望されているところ，ＰＯＣＴやホームユース用の測定機器では使い易さから患者の血液を直接採取して測定することが多く，検体を希釈しないで測定できる必要がある。この場合，検体の希釈ができないため前処理反応時の負荷が大きくなり前処理試薬中の酵素濃度も高くなる。そして，前処理反応に用いる酵素による１，５−ＡＧの消化が進み，検体中の１，５−ＡＧの測定値が正確に求められなくなる。
したがって，１，５−ＡＧの測定の妨害をするグルコースの除去を阻害せずに検体中の１，５−ＡＧを消化しない測定方法が望まれていた。

本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意研究の結果，妨害成分を除去する前処理反応の試薬中に前処理反応に使用する酵素への基質特異性が該測定対象成分よりも高く，酵素反応速度が該測定対象成分よりも早い化合物を加えることにより，該測定対象成分の正確な測定が可能になることを見出し，本発明を完成させるに至った。
即ち，本発明は以下の（１）〜（１５）に関する。
（１）生体試料中の測定対象成分を酵素Ａと反応させて検出する測定で，別の酵素Ｂにて該反応の妨害成分を除去する工程を備えており，該測定対象成分が酵素Ａ及び酵素Ｂの双方と反応する測定において，該妨害成分を除去する工程に，酵素Ｂへの基質特異性が該測定対象成分よりも高い，及び／または，酵素Ｂとの酵素反応が該測定対象成分よりも早い化合物を加えることを特徴とする生体試料中の測定対象成分の測定方法。

（２）測定対象成分が糖類である前記（１）に記載の測定方法。
（３）妨害成分が糖類である前記（１）または（２）に記載の測定方法。
（４）妨害成分を除去する工程に加える化合物が糖類である前記（２）または（３）に記載の測定方法。

（５）酵素Ａが酸化還元酵素である前記（１）〜（４）のいずれか一項に記載の測定方法。
（６）酵素Ｂが加水分解酵素である前記（１）〜（５）のいずれか一項に記載の測定方法。

（７）妨害成分を除去する工程に加える糖類が１，５−アンヒドログルシトール，ミオイノシトール，カイロイノシトール，キシロース，グルコース−６−リン酸，リボース，グルコノラクトン，トレハロース，アセチルグルコサミン，キシリトール，ガラクトース，リビトール，リキソース，ソルビトール，タガトース，デオキシグルコース，グルクロノラクトン及びグルコサミン塩酸塩からなる群から選ばれる１種以上の化合物である前記（４）に記載の測定方法。
（８）妨害成分がグルコースまたはマルトースである前記（３）に記載の測定方法。

（９）酵素Ａがピラノースオキシダーゼ，Ｌ−ソルボースオキシダーゼまたは１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼである前記（５）に記載の測定方法。
（１０）酵素Ｂがグルコキナーゼまたはヘキソキナーゼである前記（６）に記載の測定方法。
（１１）測定対象成分が１，５−アンヒドログルシトール，ミオイノシトール，ソルビトール，Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミンである前記（１）〜（１０）のいずれか一項に記載の測定方法。
（１２）測定対象成分が１，５−アンヒドログルシトールであり，妨害成分がグルコースであり，妨害成分を除去する工程に加える化合物がミオイノシトールである前記（１）に記載の測定方法。

（１３）妨害成分を除去する工程に加える糖類の濃度が１００〜１００００ｍｇ／ｄＬである前記（４）に記載の測定方法。
（１４）生体試料中の測定対象成分を測定する際の最終希釈倍率が１倍から４０倍である前記（１）に記載の測定方法。
（１５）全血中の測定対象成分を測定する方法において，該測定が電気化学的測定方法または比色測定方法である前記（１１）または（１２）に記載の測定方法。

本発明によって，採取した生体試料（検体）に対して酵素を用いて前処理反応を行って妨害成分を除去し，その後，別の酵素を用いて該検体中の測定対象成分の検出反応を行う生体成分の測定で前処理反応の酵素により測定対象成分が消化を受ける場合，前処理反応の試薬中に前処理反応に使用する酵素への基質特異性が該測定対象成分よりも高い，及び／または，酵素反応速度が該測定対象成分よりも早い化合物を加えることにより，検体の希釈倍率が低いままで該測定対象成分の正確な測定が可能となった。特に，全血中の１，５−ＡＧを電極法により電気化学的に測定する測定法では検体希釈倍率を低くする必要があるため，前処理反応に使用する試薬の酵素濃度が高くなり１，５−ＡＧの消化が進みやすいため本発明は有用である。

本発明の参考例３に係るグルコース濃度と１，５−ＡＧ測定値の関係図である。（１，５−ＡＧ濃度 ４．５μｇ／ｍＬ） 本発明の参考例３に係るグルコース濃度と１，５−ＡＧ測定値の関係図である。（１，５−ＡＧ濃度 ９．０μｇ／ｍＬ） 本発明の参考例３に係るグルコース濃度と１，５−ＡＧ測定値の関係図である。（１，５−ＡＧ濃度 １８．０μｇ／ｍＬ） 本発明の参考例３に係るグルコース濃度と１，５−ＡＧ測定値の関係図である。（１，５−ＡＧ濃度 ４５．０μｇ／ｍＬ） 本発明の実施例１に係るミオイノシトールの有無での１，５−ＡＧ測定値とグルコース濃度の関係図である。（１，５−ＡＧ濃度 ４．５μｇ／ｍＬ） 本発明の実施例１に係るミオイノシトールの有無での１，５−ＡＧ測定値とグルコース濃度の関係図である。（１，５−ＡＧ濃度 ９．０μｇ／ｍＬ） 本発明の実施例１に係るミオイノシトールの有無での１，５−ＡＧ測定値とグルコース濃度の関係図である。（１，５−ＡＧ濃度 １８．０μｇ／ｍＬ） 本発明の実施例１に係るミオイノシトールの有無での１，５−ＡＧ測定値とグルコース濃度の関係図である。（１，５−ＡＧ濃度 ４５．０μｇ／ｍＬ）

本発明は，生体試料中の測定対象成分を酵素Ａと反応させて検出する測定において，別の酵素Ｂにて該反応の妨害成分を除去する工程を備えており，該測定対象成分が酵素Ａ及び酵素Ｂの双方と反応する場合に，該妨害成分を除去する工程に，酵素Ｂへの基質特異性が該測定対象成分よりも高い，及び／または，酵素Ｂとの酵素反応が該測定対象成分よりも早い化合物を加えることを特徴とする生体試料中の測定対象成分の測定方法である。

本発明において明らかであるが，測定対象成分と妨害成分と特定の性質を有する添加化合物は異なった化合物である。
本発明において生体試料とは血液（全血），血漿，血清，尿，髄液，汗，乳汁，涙等が挙げられ，好ましくは生化学検査に一般に使用される血液（全血），血漿，血清，尿等が挙げられる。
本発明における測定対象成分とは，酵素（便宜的に酵素Ａと記載する）と反応させて検出する生体試料中の成分であり，例えば，１，５−ＡＧ，ミオイノシトール，ソルビトール，Ｎ−アセチルグルコサミン，Ｎ−アセチルガラクトサミン，乳酸，ピルビン酸，エタノール，アセトアルデヒド，グルタミン酸，α−ケトグルタル酸，グルコース，グルコノラクトン，ガラクトース及びガラクトノラクトン等が挙げられ，好ましくは生化学検査の検査項目であって糖類である１，５−ＡＧ，ミオイノシトール，ソルビトール，Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン等が挙げられる。中でも，血中の１，５−ＡＧ，赤血球中のソルビトール，尿中のミオイノシトールが挙げられる。
本発明において糖類とは単糖類，二糖類，三糖類，多糖類，糖アルコール，アミノ糖，及び，そのアシル化化合物等である。アシル化とは，アセチル基やベンゾイル基等が糖類の水酸基の酸素原子またはアミノ基の窒素原子にエステル結合，アミド結合していることを意味する。

本発明における妨害成分とは，生体試料中の測定対象成分を酵素Ａと反応させて測定する際に測定値に影響を与える生体試料中に存在する化合物であり，該測定対象成分の測定に使用する酵素Ａと反応する化合物である。そして，該妨害成分は測定に使用する酵素Ａとは異なる酵素（便宜的に酵素Ｂと記載する）を使用して除去する。ここで，除去するとは該妨害成分を測定に使用する酵素Ａと反応しない化合物に変換することも含む。

また，測定対象成分が妨害成分の除去に使用する酵素Ｂとも反応する場合に，妨害成分を除去しようとすると測定対象成分も除去され正確な測定値が得られない。本発明ではそのような場合に酵素Ｂへの基質特異性が該測定対象成分よりも高い化合物，及び／または，酵素Ｂとの酵素反応が該測定対象成分よりも早い化合物を該妨害成分除去工程に添加し，測定対象成分の酵素Ｂとの反応を抑制し測定対象成分の正確な測定をするものである。該添加化合物は，酵素Ａで消化されない化合物または酵素Ｂとの反応で酵素Ａの消化を受けない化合物に変換される化合物である。そのような特定の性質を有する化合物は，測定対象成分，妨害成分，酵素Ａ，酵素Ｂの組合せから規定されるものであり，測定対象成分や妨害成分が糖類であれば該化合物も糖類であることが好ましい。

該化合物として添加する糖類としては，例えば，１，５−アンヒドログルシトール，ミオイノシトール，カイロイノシトール，キシロース，グルコース−６−リン酸，リボース，グルコノラクトン，トレハロース，アセチルグルコサミン，キシリトール，ガラクトース，リビトール，リキソース，ソルビトール，タガトース，デオキシグルコース，グルクロノラクトン及びグルコサミン塩酸塩からなる群から選ばれる１種以上の化合物が挙げられる。該糖類の添加濃度は妨害成分の除去と測定対象成分の測定に影響を与えなければ特に限定されないが，１００〜１００００ｍｇ／ｄＬ程度が好ましく，５００〜５０００ｍｇ／ｄＬ程度が特に好ましく，４０００ｍｇ／ｄＬ程度が殊更好ましい。

本発明において酵素Ａとしては，酸化還元酵素や，グルコサミン−６−リン酸デアミナーゼ，，Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼ，Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸デアセチラーゼ，グルコサミン−６−リン酸デアミーゼ及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼから選ばれる１乃至複数の酵素が好ましく，該酸化還元酵素としては，例えば、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの命名法で、ピラノースオキシダーゼ：ＥＣ１．１．３．１０、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ：ＥＣ１．１．３．１１，Ｎ−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ：ＥＣ１．１．１．２４０，ソルビトールデヒドロゲナーゼ：ＥＣ１．１．９９．２１，Ｎ−アセチルグルコサミンデヒドロゲナーゼ：ＥＣ１．１．１．１３６，グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ：ＥＣ１．１．１．４９，ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ：ＥＣ１．１．１．１８と分類される酵素等や，例えば，特許第５６２２３２１号に記載の１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ（以下，ＡＧＤＨと略す）が挙げられる。これらの酵素は自体文献公知または文献公知の方法により入手可能であるが，市販のものを使用してもよい。

本発明において酵素Ｂとしては加水分解酵素やグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが好ましく，該加水分解酵素としては，例えば，ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの命名法で、ＨＫ：ＥＣ２．７．１．１、ＧＫ：ＥＣ２．７．１．２と分類される酵素等が挙げられる。より選択性の高いＮＡＤやＦＡＤ等の補酵素依存型またはヌクレオシドモノリン酸、ヌクレオシドジリン酸、ヌクレオシドトリリン酸等の基質依存型であってもよい。これらの酵素は自体文献公知または文献公知の方法により入手可能であるが，市販のものを使用してもよい。

これらの酵素を使用する１，５−ＡＧ，ミオイノシトール，ソルビトール，Ｎ−アセチルグルコサミン及びＮ−アセチルガラクトサミンの測定における妨害成分としては糖類であるグルコースやマルトースが挙げられる。

本発明の生体試料中の測定対象成分の検出方法は，生体試料を４０倍以下の最終希釈倍率で行うことができ，１倍であってもよい。
本発明の生体試料中の測定対象成分の検出に使用する測定方法は，該成分または該成分量と相関して生成される物質を検出できれば特に限定されないが，例えば，電気化学的測定方法や比色測定方法等が挙げられる。

以下，１，５−ＡＧを例に本発明の測定方法について説明する。
即ち，グルコースを除去する前処理工程において特定の糖類を添加し，ＧＫあるいはＨＫによる１，５−ＡＧの消化を防止する正確な１，５−ＡＧの測定方法である。

１，５−ＡＧを前記のピラノースオキシダーゼ，Ｌ−ソルボースオキシダーゼあるいは１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼを用いて測定するには，これらの酵素の基質特異性から生体試料中のグルコースを除去する工程が必須である。一方，グルコースを除去するために使用するＧＫあるいはＨＫは１，５−ＡＧとも若干反応してしまう。このため，前処理反応時にグルコースとともに１，５−ＡＧも消化してしまい，その後の１，５−ＡＧの測定が不正確になる。

この前処理反応中にＧＫあるいはＨＫに対する基質特異性が１，５−ＡＧよりも高く，ＧＫあるいはＨＫによる酵素反応が１，５−ＡＧより早いという特性を有する化合物，例えば，ミオイノシトールを添加することにより前処理反応中でグルコースとともに１，５−ＡＧが消化されることがなくなり，生体試料中の１，５−ＡＧを正確に測定できる。
後記の参考例に示すように，該化合物としては前記のミオイノシトール，カイロイノシトール，キシロース，グルコース−６−リン酸，リボース，グルコノラクトン，トレハロース，アセチルグルコサミン，キシリトール，ガラクトース，リビトール，リキソース，ソルビトール，タガトース，デオキシグルコース，グルクロノラクトン，グルコサミン塩酸塩が挙げられ，これらの混合物でもよい。
測定の詳細については後記の実施例に記載する。

本発明の測定方法が適用可能となる測定対象成分の他の例として，赤血球中のソルビトールや尿中のミオイノシトール等が挙げられる。
赤血球中のソルビトールの場合，酵素Ａは酸化還元酵素であるソルビトールデヒドロゲナーゼ，妨害成分はグルコース，酵素ＢはＨＫであり，特定の性質を有する添加化合物はミオイノシトールが好ましい。

尿中のミオイノシトールの場合，酵素Ａは酸化還元酵素であるミオイノシトールデヒドロゲナーゼ，妨害成分はグルコース，酵素ＢはＨＫであり，特定の性質を有する添加化合物は１，５−ＡＧが好ましい。

以下，本発明を１，５−ＡＧ測定について実施例等により更に具体的に説明するが，本発明がこれらに限定されるものではない。なお，国際公開ＷＯ２０１１／１０８５７６パンフレット記載の装置を参考に測定装置を作成し使用した。

［１，５−ＡＧ測定法］
（１）グルコース除去用前処理試薬
水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．５に調整した後の組成が，１７．６ｍＭのＭｇＣｌ_２，１７．６ｍＭのＫＣｌ，１２０ｍＭのホスホエノールピルビン酸，１７．６ｍＭのアデノシン３リン酸（ＡＴＰ），１２３Ｕ／ｍＬのピルビン酸キナーゼ（東洋紡社製），７５Ｕ／ｍＬのＧＫ（ユニチカ社製），０．１％ＮａＮ_３，１０重量％のスクロースとなるように１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に各成分を加え，グルコース除去用前処理試薬とした。

（２）電極試薬溶液
６００μＭのチオニン，９Ｕ／ｍＬのＡＧＤＨ，５０ｍＭのオルトスルホ安息香酸（ｐＨ７．０；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製），２％スクロースの組成となるように各成分を５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解して電極試薬溶液を調製した。

（３）センサチップ
ポリエチレンテレフタレート基盤上に作用極とリード部，対極とリード部をカーボンインク（（株）アサヒ化学研究所製，製品名カーボンペーストＴＵ１，５ＳＴ）で，厚さ１０μｍでスクリーン印刷し，５０℃で４０分焼き入れして電極を製造した。
前記（１）のグルコース除去用前処理試薬３μＬを電極の検体前処理部に塗布し，５０℃で３０分間乾燥し，前記（２）の電極試薬溶液２μＬを電極の作用極および対極に塗布し，５０℃で５分間乾燥した。
前記（１）のグルコース除去用前処理試薬２μＬを検体移動用部材先端に塗布し，５０℃で３０分間乾燥した。
試薬塗布済み電極と検体移動用部材とをガイドで固定しセンサチップを作製した。

（４）検体測定
検体吸い込み部で検体を吸い込み３７℃で３分間前処理反応を行い，前処理反応後，検体移動用部材にて前処理済み検体を作用極へ移動する。その後，０Ｖで印加して５秒後の電流値を電気化学検出器（ＧＰＩＢ ＲＳ２３２Ｃ付き８ＣＨ マルチポテンショスタット ＭＯＤＥＬ ＰＳ−０８；（株）東方技研）で測定した。
検体中の１，５−ＡＧ濃度については，０および５０μｇ／ｍＬの１，５−ＡＧ濃度標準液をそれぞれ２回測定し，その平均値を用いて一次回帰式より検量線を作成して，そこから算出した。

［参考例１］糖類添加グルコース前処理試薬を用いた１，５−ＡＧ測定
前記１，５−ＡＧ測定法の（１）グルコース除去用前処理試薬に，表１に記載の濃度の糖類を添加して前処理試薬を調製した。該前処理試薬を用いた前記１，５−ＡＧ測定法により検体１，５−ＡＧ標準液５０．０μｇ／ｍＬを測定し，糖類無添加の電流値を１００％として各糖類添加の電流値を相対％で表１に示す。

［表１］
糖類濃度（ｍｇ／ｄＬ） ％
糖類無添加 ０ １００．０
キシロース １０００ １１３．７
ミオイノシトール １０００ １１３．２
グルコース−６−リン酸 １００ １０４．４
リボース １０００ １０９．１
グルコノラクトン １００ １１７．０
トレハロース １０００ １０８．２
アセチルグルコサミン １０００ １１０．３
キシリトール １００ １１０．８
ガラクトース １００ １１５．９
リビトール １００ １０５．４
リキソース １００ １０４．９
ソルビトール １００ １０８．４
タガトース １００ １０６．１
デオキシグルコース １００ １０８．８
グルクロノラクトン １００ １１７．０
グルコサミン塩酸塩 １００ １０６．８

［参考例２］前処理反応せずにミオイノシトールを添加した１，５−ＡＧの測定
前記１，５−ＡＧ測定法で前処理反応をしないで直接作用極へ検体を添加して測定した。検体は１，５−ＡＧ標準液９．０，１８．０，４５．０μｇ／ｍＬにそれぞれミオイノシトールを０，１００，１０００ｍｇ／ｄＬ添加して使用した。ミオイノシトール０ｍｇ／ｄＬの時の各１，５−ＡＧ標準液で得られた電流値をそれぞれ１００％として相対％表記とし結果を表２に示す。

［表２］
ミオイノシトール添加濃度（ｍｇ／ｄＬ）
１，５−ＡＧ濃度（μｇ／ｍＬ） ０ １００ １０００
９．０ １００．０ １００．５ １０２．５
１８．０ １００．０ ９６．２ １００．８
４５．０ １００．０ ９６．６ １００．７

検体の電流値はミオイノシトール存在下でも非存在下でも差がなく，前処理反応を介さなければ測定電流値に変化は見られない。

これらの結果から参考例１において添加した種々の糖類による電流値の上昇は，ＧＫ（前処理反応に使用する酵素）による１，５−ＡＧの消化（電流値の低下）を糖類が抑制したことを示す。

［参考例３］
糖類無添加の前記１，５−ＡＧ測定法（電気化学的測定方法）と汎用の自動分析装置用試薬であるラナ１，５−ＡＧオートリキッド（日本化薬（株）製）を用いた比色測定方法による１，５−ＡＧ測定値を比較した。検体として１，５−ＡＧ標準液４．５，９．０，１８．０，４５．０μｇ／ｍＬにそれぞれ０，５０，１００，２５０，５００，７５０，１０００ｍｇ／ｄＬのグルコースを添加して使用した。各測定方法，各１，５−ＡＧ濃度についてグルコース無添加の１，５−ＡＧ濃度を１００．０％としてグラフを作成し，図１ａ，図１ｂ，図１ｃ，図１ｄに示す。

この結果から，検体の最終希釈倍率が４６倍と高い比色測定方法ではグルコースの有無に拘わらず１，５−ＡＧの消化の影響はほぼ見られないが，検体の最終希釈倍率が１倍と低い電気化学的測定方法では１，５−ＡＧの消化が顕著である。

［実施例１］
ミオイノシトール１０００ｍｇ／ｄＬを添加したグルコース除去用前処理試薬を使用した前記１，５−ＡＧ測定法で，１，５−ＡＧ標準液４．５，９．０，１８．０，４５．０μｇ／ｍＬにそれぞれ０，５０，１００，２５０，５００，７５０，１０００ｍｇ／ｄＬのグルコースを添加した検体を測定した。ミオイノシトール無添加のグルコース前処理試薬を使用した前記１，５−ＡＧ測定法の測定値と比較する。結果を表３と図２ａ，図２ｂ，図２ｃ，図２ｄに示す。各測定方法，各１，５−ＡＧ濃度についてグルコース無添加の１，５−ＡＧ濃度を１００．０％として作成したグラフである。

［表３］

ミオイノシトールを添加しないとグルコース非存在下及び低濃度においては電流値が低くなり１，５−ＡＧの消化が起こっている。特に糖尿病患者に相当する１，５−ＡＧ濃度が低いところでその影響は顕著である。しかしながら，前処理試薬中にミオイノシトールを添加すると１，５−ＡＧの消化は抑制され，その値の変動が少なくなり正確に測定できていることは明らかである。

Claims (15)

1. 生体試料中の測定対象成分を酵素Ａと反応させて検出する測定において，別の酵素Ｂにて該反応の妨害成分を除去する工程を備えており，該測定対象成分が酵素Ａ及び酵素Ｂの双方と反応する場合に，該妨害成分を除去する工程に，酵素Ｂへの基質特異性が該測定対象成分よりも高い，及び／または，酵素Ｂとの酵素反応が該測定対象成分よりも早い化合物を加えることを特徴とする生体試料中の測定対象成分の測定方法。
2. 測定対象成分が糖類である請求項１に記載の測定方法。
3. 妨害成分が糖類である請求項１または２に記載の測定方法。
4. 妨害成分を除去する工程に加える化合物が糖類である請求項２または３に記載の測定方法。
5. 酵素Ａが酸化還元酵素である請求項１〜４のいずれか一項に記載の測定方法。
6. 酵素Ｂが加水分解酵素である請求項１〜５のいずれか一項に記載の測定方法。
7. 妨害成分を除去する工程に加える糖類が１，５−アンヒドログルシトール，ミオイノシトール，カイロイノシトール，キシロース，グルコース−６−リン酸，リボース，グルコノラクトン，トレハロース，アセチルグルコサミン，キシリトール，ガラクトース，リビトール，リキソース，ソルビトール，タガトース，デオキシグルコース，グルクロノラクトン及びグルコサミン塩酸塩からなる群から選ばれる１種以上の化合物である請求項４に記載の測定方法。
8. 妨害成分がグルコースまたはマルトースである請求項３に記載の測定方法。
9. 酵素Ａがピラノースオキシダーゼ，Ｌ−ソルボースオキシダーゼまたは１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼである請求項５に記載の測定方法。
10. 酵素Ｂがグルコキナーゼまたはヘキソキナーゼである請求項６に記載の測定方法。
11. 測定対象成分が１，５−アンヒドログルシトール，ミオイノシトール，ソルビトール，Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミンである請求項１〜１０のいずれか一項に記載の測定方法。
12. 測定対象成分が１，５−アンヒドログルシトールであり，妨害成分がグルコースであり，妨害成分を除去する工程に加える化合物がミオイノシトールである請求項１に記載の測定方法。
13. 妨害成分を除去する工程に加える糖類の濃度が１００〜１００００ｍｇ／ｄＬである請求項４に記載の測定方法。
14. 生体試料中の測定対象成分を測定する際の最終希釈倍率が１倍から４０倍である請求項１に記載の測定方法。
15. 全血中の測定対象成分を測定する方法において，該測定が電気化学的測定方法または比色測定方法である請求項１１または１２に記載の測定方法。

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