JP2017099338A - ゲノム再編方法及びその利用 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
【解決手段】真核生物体におけるゲノム再編方法であって、真核生物体の細胞内において、DNA二本鎖切断活性を有するタンパク質を、前記細胞の増殖環境条件下で一時的に作用させて遺伝的組換えを行うゲノム再編工程を備えるようにする。
【選択図】図1
Description
真核生物体の細胞内において、DNA二本鎖切断活性を有するタンパク質を、前記細胞の増殖環境条件下で一時的に作用させて遺伝的組換えを行う1又は2以上のゲノム再編工程を備える、方法。
(2)前記タンパク質は好熱菌由来の耐熱性DNA二本鎖切断酵素である、(1)に記載の方法。
(3)前記タンパク質は、BclI、Sse9I、BstUI、TfiI、TseI、Tsp45I、TaqI及びPhoIから選択される1種又は2種以上である、(1)又は(2)に記載の方法。
(4)前記タンパク質は、Sse9I、BstUI、TfiI、TseI、Tsp45I及びTaqIから選択される1種又は2種以上である、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)前記タンパク質は、TaqIである、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6)前記ゲノム再編工程は、前記タンパク質を誘導的に発現させる工程である、(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7)前記ゲノム再編工程は、前記タンパク質を1時間以上72時間以下作用させる工程である、(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(8)前記細胞増殖環境条件は、前記細胞が十分な増殖能を発揮する温度を含む条件である、(1)〜(7)のいずれかに記載の方法。
(9)前記真核生物体は、植物体である、(1)〜(8)のいずれかに記載の方法。
(10)前記真核生物体は、微生物である、(1)〜(9)のいずれかに記載の誘発方法。
(11)前記真核生物体は、酵母である、(1)〜(10)のいずれかに記載の方法。
(12)前記真核生物体は、ホモタリズム性酵母である、(1)〜(11)のいずれかに記載の方法。
(13)前記ホモタリズム性酵母について第1の前記再編工程を実施後に、再編されたゲノムセットを有する前記ホモタリズム性酵母に第1の形質の選択圧下で選抜する胞子育種を含む選抜工程を実施し、さらに、選抜された前記ホモタリズム性酵母について第2の前記再編工程を実施する、(12)に記載の方法。
(14)再編されたゲノムセットを備える真核生物体の生産方法であって、
真核生物体の細胞内において、DNA二本鎖切断活性を有するタンパク質を、前記細胞の増殖環境条件下で一時的に作用させて遺伝的組換えを行う1又は2以上のゲノム再編工程、
を備える、方法。
(15)さらに、再編されたゲノムセットを保持する前記真核生物体の集団から、任意の指標に基づいて意図する真核生物体を選抜する1又は2以上の選抜工程、
を備える、(14)に記載の生産方法。
(16)前記真核生物体は、ホモタリズム性酵母である、(14)又は(15)に記載の生産方法。
(17)前記真核生物体は、ホモタリズム性酵母であり、
前記選抜工程は、胞子育種工程を含む、(15)に記載の生産方法。
(18)真核生物体集団の生産方法であって、
真核生物体の細胞内において、DNA二本鎖切断活性を有するタンパク質を、前記細胞の増殖環境条件下で一時的に作用させて遺伝的組換えを行う1又は2以上のゲノム再編工程、
を備える、方法。
(19)DNA二本鎖切断活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に保持する、ホモタリズム性酵母である育種材料。
(ゲノム再編工程)
本再編方法は、DNA二本鎖切断活性を有するタンパク質を、真核生物体の細胞内において、前記細胞の増殖環境条件下で一時的に作用させるゲノム再編工程(以下、単に再編工程という。)を備えることができる。再編工程は、真核生物体の細胞に適用される。再編工程は、必要に応じ1又は2回以上繰り返して実施することができる。また、再編工程後に集積培養などの各種の選抜工程を行うことができる。また、こうした再編工程と選抜工程とを繰り返して実施することもできる。
本再編方法は、任意の真核細胞生物体に適用可能である。本再編方法に適用される真核生物体としては、動物、植物、真核性微生物が挙げられる。動物としては特に限定しないで、哺乳動物及び各種の魚類などの非哺乳動物が挙げられる。また、本再編方法に適用される動物としては、動物に由来するものであればよく、細胞、組織、器官、受精卵などいずれの形態であってもよい。受精卵など、完全な動物に再生する能力を保持しているものであれば、改変した動物を得るのに都合がよい。
ナス科:タバコ(Nicotiana tabacum)、ナス(Solanum melongena)、ジャガイモ(Solaneum tuberosum)、トマト(Lycopersicon lycopersicum)、トウガラシ(Capsicum annuum)、ペチュニア(Petunia)など。
マメ科:ダイズ(Glycine max)、エンドウ(Pisum sativum)、ソラマメ(Vicia faba)、フジ(Wisteria floribunda)、ラッカセイ(Arachis. hypogaea)、ミヤコグサ(Lotus corniculatus var. japonicus)、インゲンマメ(Phaseolus vulgaris)、アズキ(Vigna angularis)、アカシア(Acacia)など。
キク科:キク(Chrysanthemum morifolium)、ヒマワリ(Helianthus annuus)など。
ヤシ科:アブラヤシ(Elaeis guineensis、Elaeis oleifera)、ココヤシ(Cocos nucifera)、ナツメヤシ(Phoenix dactylifera)、ロウヤシ(Copernicia)など。
ウルシ科:ハゼノキ(Rhus succedanea)、カシューナットノキ(Anacardium occidentale)、ウルシ(Toxicodendron vernicifluum)、マンゴー(Mangifera indica)、ピスタチオ(Pistacia vera)など。
ウリ科:カボチャ(Cucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbita pepo)、キュウリ(Cucumis sativus)、カラスウリ(Trichosanthes cucumeroides)、ヒョウタン(Lagenaria siceraria var. gourda)など。
バラ科:アーモンド(Amygdalus communis)、バラ(Rosa)、イチゴ(Fragaria)、サクラ(Prunus)、リンゴ(Malus pumila var. domestica)など。
ナデシコ科:カーネーション(Dianthus caryophyllus)など。
ヤナギ科:ポプラ(Populus trichocarpa、Populus nigra、Populus tremula)など。
イネ科:トウモロコシ(Zea mays)、イネ(Oryza sativa)、オオムギ(Hordeum vulgare)、コムギ(Triticum aestivum)、タケ(Phyllostachys)、サトウキビ(Saccharum officinarum)、ネピアグラス(Pennisetum pupureum)、エリアンサス(Erianthus ravenae)、ミスキャンタス(ススキ)(Miscanthus virgatum)、ソルガム(Sorghum)スイッチグラス(Panicum)など。
ユリ科:チューリップ(Tulipa)、ユリ(Lilium)など。
フトモモ科:ユーカリ(Eucalyptus camaldulensis、Eucalyptus grandis)など。
本タンパク質としては、特に限定しないが、例えば、公知のDNA二本鎖切断酵素を用いることができる。本再編方法では、細胞増殖環境条件の下、細胞が有するDNA修復活性を作用させつつDNA二本鎖切断活性を作用させるものであり、これらを容易に制御できるため、結果として本タンパク質が備えるDNA二本鎖切断活性については特に限定されない。したがって、公知の制限酵素等から任意の制限酵素等を選択して本タンパク質として使用することができる。
次いで、真核生物体の細胞内において本タンパク質を作用させる態様について説明する。以下の説明において、真核生物体の細胞内というときには、真核生物体の態様は特に限定するものではない。例えば、真核生物体が植物体の場合には、植物体の態様は問わないで、植物個体の一部としての細胞、組織、器官のほか、種子、幼苗、あるいはその後の成長した植物個体のほか、カルスにおける細胞内を意味している。また、真核生物体が、酵母など微生物の場合には、その細胞内で本タンパク質を作用させることを意味する。
細胞増殖環境条件とは、真核生物体の細胞が十分な増殖能を発揮する温度(細胞増殖温度)を含む条件をいう。より具体的には、真核生物体の細胞の増殖に好適な温度又は一般的に用いられる温度を少なくとも含む条件をいう。細胞増殖温度は、用いる真核生物体又はその個体によって異なりうる。例えば、Saccharomyces cerevisiaeなどの酵母の場合には、概して約20℃から約40℃である。したがって、酵母における細胞増殖温度(範囲)としては、20℃以上40℃以下とすることができる。また、例えば、用いる真核生物体が植物体あるいはその一部の器官、組織又は細胞等であるときには、これらに適用される通常の生育又は培養温度が細胞増殖温度(範囲)に相当する。
本明細書に開示される再編されたゲノムセットを有する真核生物体の生産方法は、上記した1又は2以上の再編工程と、再編されたゲノムセットを保持する前記真核生物体の集団から、任意の指標に基づいて意図する真核生物体を選抜する1又は2以上の工程と、を備えることができる。本方法によれば、多様性に優れる真核生物体の集団から意図した1又は2以上の真核生物体又はその集団を選抜するため、効率的に意図した真核生物体を得ることができる。また、本方法によれば、選抜した真核生物体を利用して効率的な育種が可能である。したがって、本生産方法は、植物体や酵母などの真核生物体の育種方法としても実施することができる。なお、有用な植物や酵母などが得られた後のさらに後代の育種については、従来公知の育種技術を適用することができる。
TaqI遺伝子酵母発現用ベクターとして、図1に示すように、ガラクトース誘導型プロモーター(pGAL1)の下流に酵母コドンに最適化したTaqI遺伝子(TtTaqI opt)、Saccharomyces cerevisiae由来DIT1タンパク質の3’UTR(tDIT1)を配置したpORF-pGAL1-TtTaqI-tDIT1(AUR)を用いた。
図2に示すように、ゲノム再編効率を評価するGF-FPレポーター遺伝子は、緑色蛍光蛋白質(GFP)のN末端側約600 bpとC末端側600 bpで抗生物質Nourseothricin耐性マーカー(nat1)を挟むようにデザインされている。このカセットを用いることで、TaqIによる二本鎖DNA切断により、GF-FP間で相同組換えが起こり、完全長のGFP遺伝子が再構築された場合、酵母が緑色蛍光を発するため、フローサイトメーター等を用いる事でゲノム再編を検出することが出来る(図3参照)。
実施例1で作製したTaqI遺伝子酵母発現用ベクター、pORF-pGAL1-TtTaqIopt-tDIT1(AUR)を実施例2で作製したBY4741+GFP(HIS)株へ形質転換した(BY4741+GFP(HIS)+TaqI)。グルコースを糖源とするYPD培地(10 g/L Yeast extract、20 g/L Peptone、20 g/L Glucose)+0.5 mg/L オーレオバシジンA(AbA)を用いて、30℃で終夜培養後、ガラクトースを糖源とするYPG(10 g/L Yeast extract、20 g/L Peptone、20 g/L Galactose)+0.5 mg/L AbA培地に培地交換し、20、22.5、25、27.5、30℃で終夜培養することで、TaqIの発現誘導を行った。各温度でのTaqI発現量を測定するために、菌体量を揃えてSDS-PAGEを行い、抗TaqI抗体を用いて、ウエスタンブロッティングを行った。結果を図4に示す。
BY4741+GFP(HIS)+TaqI株を用いて、実施例3と同様に20℃でTaqIの発現誘導を行った。42℃で30分間、または60分間熱処理する事で、一過的にTaqIの活性化を促した後、フローサイトメーターで1×105細胞中のGFP蛍光を持つ細胞の割合を測定することでゲノム再編効率を算出した。結果を図5Aに示す。その結果、ゲノム再編効率は0.03〜0.04%だった。一方、図5Bに示すように、熱処理後にYPD培地に培地交換し、回復培養を18時間行った場合、ゲノム再編効率は0.06〜0.07%に上昇した。
BY4741+GFP(HIS)+TaqI株を用いて、実施例3と同様にYPG+0.5 mg/L AbA培地に培地交換した後、20、25、30、35℃でTaqIを発現誘導しながら、穏やかにTaqIの活性化を行った。5、23、46時間後に酵母を回収し、実施例4と同様にフローサイトメーターでゲノム再編効率を測定した。結果を図6に示す。
BY4741+GFP(LEU)株とBY4742+GFP(LEU)株、BY4741+GFP(HIS)株とBY4742+GFP(HIS)株を定法に従いそれぞれ接合し、SD-Met-Lys寒天プレートで30℃、5日間培養した。生育したコロニーをシングル化後、フローサイトメーターでゲノムDNA量を測定し、2倍体であることを確認した株をBY4743+GFP(LEU)株、BY4743+GFP(HIS)株とした。
実施例1で作製したTaqI遺伝子酵母発現用ベクター、pORF-pGAL1-TtTaqIopt-tDIT1(AUR)を実施例2、6で作製した各倍加酵母へ形質転換した。形質転換体を用いて、実施例3と同様にYPG+0.5 mg/L AbA培地に培地交換した後、35℃でTaqIを発現誘導しながら、細胞増殖温度でTaqIの活性化を行った。22時間後に酵母を回収し、実施例4と同様にフローサイトメーターでゲノム再編効率を測定した。結果を図7に示す。
実施例7と同様に、各倍加酵母を用いて35℃でTaqIを発現誘導しながら、細胞増殖温度でTaqIの活性化を行った。0、16、46時間後に酵母を回収し、70%エタノールで固定後、DAPI染色によりゲノムDNAを蛍光染色した。蛍光染色した各倍加酵母を用いてフローサイトメーターで核相解析を行った。結果を図8に示す。図8に示すように、倍加酵母では、倍数性が増加または減少した個体の出現頻度の上昇が認められた。
実施例2で作製したpRS436(NAT)のGF-nat1領域をPCRで増幅した後、オーバーラッピングPCRを用いて両末端にδ配列を付加した。増幅したPCR産物でBY4741株を形質転換し、δインテグレーション法によりゲノムの複数個所にGF-nat1をランダム導入した酵母ライブラリーを作製した。同様に、nat1-FP領域をBY4742株にδインテグレーションした酵母ライブラリーを作製し、両ライブラリーをランダム接合することで染色体間でのゲノム再編評価酵母ライブラリーを作製した(図9A)。図9Bに示すように、この評価系では染色体間のGF、FP領域で相同組換えが生じ、完全長のGFP遺伝子が再構成された場合に酵母が緑色蛍光を発するため、フローサイトメーター等を用いる事でゲノム再編を検出することが出来る。
(OC2−A(CF)株の取得)
ワイン酵母OC-2株にキシロース資化遺伝子を導入したOC2-A株を作製した。すなわち、ワイン酵母OC-2株にキシロース資化遺伝子を導入したOC700株(特開2014-193152)をベースに、ADH2遺伝子を破壊するとともにADH1遺伝子を増強し、mhpF遺伝子(E.coli由来)を導入したOC2-A株を取得した。
OC2−A株を用いて、以下のとおり、ゲノム再編によるキシロース資化能力の進化育種を行った。OC2-A株にKluyveromyces lactis由来のURA3遺伝子を導入したOC2-A(KlURA3)株と、Kluyveromyces marxianus由来のTRP1遺伝子を導入したOC2-A(KmTRP1)株を作製した。両株を用いてプロトプラスト-PEG法による細胞融合を行い、細胞融合株OC2-A(CF)株を作製した。
キシロースを主な糖源とする培地で培養、植え継ぎを繰り返すことで集積培養(35℃)を行った。集積培養を開始後、約300時間までは僅かにグルコースを加えたYPX培地(10g/L Yeast extract、20 g/L Peptone、1 g/L Glucose、20 g/L Xylose)で培養した。その後、キシロースのみを糖源とするYPX培地(10 g/L Yeast extract、20 g/L Peptone、20 g/L Xylose)に変更し、さらに集積培養を約200時間行った。これらの培養工程における菌体量の推移を図11に示す。集積培養後の培養液をYPD寒天プレートにストリークし、シングル化した株をOC2A-C5株とした。
OC2A-C5株のキシロース資化能力を発酵試験により評価した。5%キシロース発酵培地(10 g/L Yeast extract、50 g/L Xylose)にOC2-A株、OC2-A(CF)株、OC2A-C5株をそれぞれOD600 = 1.0で植菌し、32℃で発酵試験を行った。0、16、24、48、72時間でサンプリングを行い、HPLCでキシロース及びエタノールを測定した。結果を図12に示す。
実施例10で作製したOC2A-C5株を用いて、実施例10と同様にしてTaqI処理を行ってさらにゲノム再編工程を実施し、ゲノム再編酵母ライブラリーを作製した。次に、YPX培地(10 g/L Yeast extract、20 g/L Peptone、20 g/L Xylose)、39〜41℃で培養、植え継ぎを繰り返すことで集積培養を約500時間行った。集積培養後の培養液をYPD寒天プレートにストリークし、シングル化した株をOC2A-TT株とした。
ワイン酵母OC-2株にキシロース資化遺伝子を導入したOC700株(特開2014-193152)をベースに、ADH2遺伝子を破壊、ADH1遺伝子を強化、mhpF遺伝子(E.coli由来)を導入後、馴化培養によりキシロース資化能力が向上したOC2-B株を用いて、ゲノム再編と胞子育種による耐熱性の進化育種を行った。OC2-B株をTaqI遺伝子酵母発現用ベクター、実施例1で作製したpORF-pGAL1-TtTaqIopt-tDIT1(AUR)で形質転換しOC2-B+TaqI株を取得した。OC2-B+TaqI株を用いて、実施例3と同様にYPG+0.5 mg/L AbA培地に培地交換した後、20℃で終夜培養する事でTaqIを発現誘導した。その後、35℃で8〜24時間、TaqIの活性化を行った後、YPD培地+0.5 mg/L AbA培地で回復培養を行ったサンプルをゲノム再編酵母ライブラリーとした(1st-TAQing)。YPX培地(10 g/L Yeast extract、20 g/L Peptone、20 g/L Xylose)、40〜42℃で培養、植え継ぎを繰り返すことで集積培養を行った。途中、再度TaqI処理を行い(2nd-TAQing)、42〜43℃でさらに集積培養を行った。集積培養後の培養液をYPD寒天プレートにストリークし、シングル化した株をOC2B-TT1株とした。
BY4741+GFP(HIS)+TaqI株を用いて、実施例3と同様にYPG+0.5 mg/L AbA培地に培地交換した後、20、25、30、35、37、38、39、40℃でTaqIを発現誘導しながら、長時間TaqIの活性化を行った。0、5、24、48、72、147時間後に酵母を回収し、生死判別をするためにPI染色を行った。生細胞は細胞膜によりPIが細胞内に浸透しないが、死細胞は細胞膜が破壊されているため、PIが細胞内に入りこみ、核酸が染色されることで生死判別が可能になる。染色後の酵母を実施例4と同様にフローサイトメーターで解析し、ゲノム再編効率を測定した。結果を図16及び図17に示す。
Claims (19)
- 真核生物体におけるゲノム再編方法であって、
真核生物体の細胞内において、DNA二本鎖切断活性を有するタンパク質を、前記細胞の増殖環境条件下で一時的に作用させて遺伝的組換えを行う1又は2以上のゲノム再編工程を備える、方法。 - 前記タンパク質は好熱菌由来の耐熱性DNA二本鎖切断酵素である、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質は、BclI、Sse9I、BstUI、TfiI、TseI、Tsp45I、TaqI及びPhoIから選択される1種又は2種以上である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記タンパク質は、Sse9I、BstUI、TfiI、TseI、Tsp45I及びTaqIから選択される1種又は2種以上である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記タンパク質は、TaqIである、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記ゲノム再編工程は、前記タンパク質を誘導的に発現させる工程である、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記ゲノム再編工程は、前記タンパク質を1時間以上72時間以下作用させる工程である、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞増殖環境条件は、前記細胞が十分な増殖能を発揮する温度を含む条件である、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記真核生物体は、植物体である、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記真核生物体は、微生物である、請求項1〜9のいずれかに記載の誘発方法。
- 前記真核生物体は、酵母である、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 前記真核生物体は、ホモタリズム性酵母である、請求項1〜11のいずれかに記載の方
法。 - 前記ホモタリズム性酵母について第1の前記再編工程を実施後に、再編されたゲノムセットを有する前記ホモタリズム性酵母に第1の形質の選択圧下で選抜する胞子育種を含む選抜工程を実施し、さらに、選抜された前記ホモタリズム性酵母について第2の前記再編工程を実施する、請求項12に記載の方法。
- 再編されたゲノムセットを備える真核生物体の生産方法であって、
真核生物体の細胞内において、DNA二本鎖切断活性を有するタンパク質を、前記細胞の増殖環境条件下で一時的に作用させて遺伝的組換えを行う1又は2以上のゲノム再編工程、
を備える、方法。 - さらに、再編されたゲノムセットを保持する前記真核生物体の集団から、任意の指標に基づいて意図する真核生物体を選抜する1又は2以上の選抜工程、
を備える、請求項14に記載の生産方法。 - 前記真核生物体は、ホモタリズム性酵母である、請求項14又は15に記載の生産方法。
- 前記真核生物体は、ホモタリズム性酵母であり、
前記選抜工程は、胞子育種工程を含む、請求項15に記載の生産方法。 - 真核生物体集団の生産方法であって、
真核生物体の細胞内において、DNA二本鎖切断活性を有するタンパク質を、前記細胞の増殖環境条件下で一時的に作用させて遺伝的組換えを行う1又は2以上のゲノム再編工程、
を備える、方法。 - DNA二本鎖切断活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に保持する、ホモタリズム性酵母である育種材料。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019110890A (ja) * | 2017-12-21 | 2019-07-11 | 株式会社豊田中央研究所 | 細胞質ゲノムを改変するための化合物及びその利用 |
US11091755B2 (en) | 2016-12-27 | 2021-08-17 | Kabushiki Kaisha Toyota Chuo Kenkyusho | Method of breeding eukaryote using protein having double-stranded DNA cleavage activity |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0767664A (ja) * | 1993-07-07 | 1995-03-14 | Kirin Brewery Co Ltd | 新規なho遺伝子、及びかかるho遺伝子を不活化させた酵母を用いる接合型酵母の育種方法 |
JP2006141322A (ja) * | 2004-11-22 | 2006-06-08 | Institute Of Physical & Chemical Research | 耐熱性多頻度dna切断酵素の細胞内活性化によるゲノム再編成の誘発方法 |
JP2009235042A (ja) * | 2008-03-28 | 2009-10-15 | Institute Of Physical & Chemical Research | DNA結合能をもつ高等植物のSpo11類縁タンパク質の調製法 |
JP2011160798A (ja) * | 2010-01-15 | 2011-08-25 | Toyota Motor Corp | 変異体植物、その製造方法及び遺伝的組換え頻度を上昇させる方法 |
JP2012044883A (ja) * | 2010-08-24 | 2012-03-08 | Toyota Central R&D Labs Inc | 特性が改変された細胞の生産方法 |
JP2013034448A (ja) * | 2011-08-10 | 2013-02-21 | Toyota Motor Corp | 酢酸耐性付与方法、酢酸耐性酵母の製造方法、酢酸耐性酵母を用いたエタノールの製造方法 |
JP2014193152A (ja) * | 2013-02-27 | 2014-10-09 | Toyota Motor Corp | 組換え酵母を用いたエタノールの製造方法 |
-
2015
- 2015-12-02 JP JP2015236019A patent/JP6697250B2/ja active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0767664A (ja) * | 1993-07-07 | 1995-03-14 | Kirin Brewery Co Ltd | 新規なho遺伝子、及びかかるho遺伝子を不活化させた酵母を用いる接合型酵母の育種方法 |
JP2006141322A (ja) * | 2004-11-22 | 2006-06-08 | Institute Of Physical & Chemical Research | 耐熱性多頻度dna切断酵素の細胞内活性化によるゲノム再編成の誘発方法 |
JP2009235042A (ja) * | 2008-03-28 | 2009-10-15 | Institute Of Physical & Chemical Research | DNA結合能をもつ高等植物のSpo11類縁タンパク質の調製法 |
JP2011160798A (ja) * | 2010-01-15 | 2011-08-25 | Toyota Motor Corp | 変異体植物、その製造方法及び遺伝的組換え頻度を上昇させる方法 |
JP2012044883A (ja) * | 2010-08-24 | 2012-03-08 | Toyota Central R&D Labs Inc | 特性が改変された細胞の生産方法 |
JP2013034448A (ja) * | 2011-08-10 | 2013-02-21 | Toyota Motor Corp | 酢酸耐性付与方法、酢酸耐性酵母の製造方法、酢酸耐性酵母を用いたエタノールの製造方法 |
JP2014193152A (ja) * | 2013-02-27 | 2014-10-09 | Toyota Motor Corp | 組換え酵母を用いたエタノールの製造方法 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11091755B2 (en) | 2016-12-27 | 2021-08-17 | Kabushiki Kaisha Toyota Chuo Kenkyusho | Method of breeding eukaryote using protein having double-stranded DNA cleavage activity |
JP2019110890A (ja) * | 2017-12-21 | 2019-07-11 | 株式会社豊田中央研究所 | 細胞質ゲノムを改変するための化合物及びその利用 |
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