JP2017093440A - 癌のための分子診断試験 - Google Patents

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Abstract

【課題】癌に対する分子診断試験の特定のための方法および組成の提供。
【解決手段】DNA損傷治療剤に対する個体の応答性の予測方法であって、a.前記個体に由来する試験試料を得ることと、b.前記試験試料における、特定のの44個の遺伝子の相対的発現レベルを測定して、個々のバイオマーカー値を得ることと、c.重み付けされ組み合わされた前記特定のの44個の遺伝子の相対的発現レベルに基づいて試験スコアを得ることと、d.DNA損傷治療剤に対する応答性について既知の転帰を有する一組の患者における、重み付けされ組み合わされた特定のの44個の遺伝子の相対的発現レベルから導出された閾値スコアを提供することと、e.前記試験スコアを前記閾値スコアと比較することを含み、ここで、前記試験スコアが前記閾値スコアを超える場合に応答性が予測される、方法。
【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本発明は、2010年9月15日に出願された米国特許仮出願第61/383,201号および2011年5月25日に出願された米国特許仮出願第61/490,039号の優先利益を主張し、これらの両方が参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、一般的なDNA損傷修復欠損サブタイプの使用を含む、異なる解剖学的部位からの癌を診断するのに有用な分子診断試験に関する。本発明は、このDNA損傷修復欠損分子サブタイプを特定するために使用される44の遺伝子の分類モデルの使用を含む。ある適用は、DNA損傷を与える剤およびDNA修復標的療法剤を含む、乳癌治療薬物クラスへの応答の層別化、およびそのための患者の選択である。別の適用は、DNA損傷を与える薬剤に応答するものおよび応答しないものへの卵巣癌患者の層別化である。本発明は、従来型療法の選択、および新規治療の臨床試験評価の際の濃縮ストラテジーのための患者群の選択を誘導することができる試験を提供する。DNA修復欠損サブタイプは、新鮮/冷凍(FF)またはホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)患者試料から特定することができる。
製薬産業は、現在投与されている薬物よりもより効果的かつより特異的であるか、または副作用の少ない新規薬物治療の選択肢を継続的に追求する。人間集団内の遺伝的変異性が多くの薬物の有効性の実質的な差をもたらすため、薬物療法の代替は、常に開発されている。したがって、多種多様の薬物療法の選択肢が現在利用可能であるが、一人の患者が応答しないという場合には、更なる療法が常に必要とされる。
伝統的に、医師によって使用される治療パラダイムは、疾患を治療するための最も高い成功率をもたらす第1選択の薬物療法を処方している。次いで、第1選択の薬物療法は効果がない場合、代替の薬物療法が処方される。このパラダイムは、明らかに、ある疾患の最良の治療法ではない。例えば、癌等の疾患において、第1の治療は、多くの場合、最も重要であり、成功した治療に対して最良の機会を提供するため、その特定の患者の疾患に対して最も効果的である初回薬物を選択する必要性の高まりがある。
今年、米国において新たに乳癌と診断される女性は207,090人、そのうちの39,840人の女性が乳癌に関連して死亡すると見られる(American Cancer Society:Cancer Facts and Figures 2010)。標準的な化学療法は、一般に、アントラサイクリンおよびアルキル化剤等の直接DNAを損傷する薬剤、ならびに代謝拮抗物質および抗微小管剤を含む。
卵巣癌は、西洋諸国においてすべての婦人科癌の中での主たる死因である。この高い死亡率は、ほとんどの患者において進行期で診断がされることによるものである。上皮性卵巣癌(EOC)は、卵巣悪性腫瘍の90%を占め、漿液、粘液、類内膜、透明細胞、移行型、混合型、および未分化のサブタイプを含む異なる組織学的カテゴリーに分類される。これらの異なった組織学は、異なる原因に起因するという証拠が蓄積している。卵巣癌の現行の標準的な治療は、減量手術および標準的な白金タキサンベースの細胞毒性化学療法である。しかしながら、すべての患者がこれに対して応答するわけではなく、そして、応答する患者の約70%が再発を経験する。組織学的または分子的分類に基づく、卵巣癌に対する特定の標的療法は、まだ市場に出回っていない。他の種類の癌と同様に、未だに適切な細胞毒性化学療法剤を選択するための正確な方法がない。
マイクロアレイおよび分子ゲノミクスの出現は、診断能力および疾患の予後分類に対する著しい影響の可能性を有し、これは画定された治療レジメンへの個々の患者の応答の予測に役立ち得る。マイクロアレイは、大量の遺伝子情報の解析を提供し、それによって個体の遺伝子指紋を提供する。この技術が、究極的には、カスタム・メイドの薬物治療レジメンのために必要なツールを提供するであろうという大いなる熱意がある。
現在、医療従事者は、化学療法剤から恩恵を受ける癌患者を特定するのに役立つ機構をほとんど有していない。どの薬物治療が特定の癌の生理学において最も効果的であるかを正確に予測するための方法が利用可能でないため、最適な第1選択の薬物の特定は困難である。この欠陥は、相対的に乏しい単一薬剤応答率ならびに癌の悪化率および死亡率の増加をもたらす。更に、患者は、しばしば、効果がなく有毒な薬物療法を必要もなく受けている。
分子マーカーは、例えば乳癌において、適切な治療を選択するために使用されてきた。「三重陰性」と称される、エストロゲンおよびプロゲステロンホルモン受容体、ならびにHER2成長因子受容体を発現しない乳房腫瘍は、PARP−1阻害剤の療法に応答すると見られる(Linn,S.C.,and Van’t Veer,L.,J.Eur J Cancer 45 Suppl 1,11−26(2009)、O’Shaughnessy,J.,N Engl J Med 364,205−214(2011)。最近の研究は、乳房腫瘍の三重陰性状態が、PARP−1阻害剤を含む併用療法に対する応答性を示し得るが、個々のPARP−1阻害剤に対する応答性を示すのに十分でない場合があることを示している(O’Shaughnessy et al.、2011)。
更に、分子サブタイプと関連する遺伝子分類子を特定し、化学療法剤に対する応答性を示させようと努める他の研究がある(Farmer et al.Nat Med 15,68−74(2009)、Konstantinopoulos,P.A.,et al.,J Clin Oncol 28,3555−3561(2010))。しかしながら、今まで、DNA損傷修復の欠損を示す分子サブタイプを正確に画定するために複数の癌疾患に渡り有効であり、DNA損傷修復を直接または間接的に標的とする薬物に対する感受性を複数の疾患に渡り予測することもできる診断試験は、存在していない。
したがって、必要とされるのは、DNAを損傷する化学療法剤に対して応答する可能性がある患者と、代替療法を受けるべきである患者とに、患者を層別化することを可能にするために、十分な正確度でDNA修復欠損腫瘍を特定する試験である。
また、必要とされるのは、異なる癌型にわたって十分な正確度で治療的応答性を予測する分子サブタイプ分類子である。
本発明は、その転写物のいくつかまたはすべてが過剰発現または過少発現であるとき、DNA損傷修復の欠損がある癌のサブタイプを特定するように、癌に発現した遺伝子産物マーカーの集合(コレクション)を使用する方法を対象とする。このサブタイプの指定は、特定の薬物に関するのではなく、スクリーニングおよび適切な癌療法の選択における有用性を有する様式において癌の生物学を記述するため、診断的試験と考えられ得る。本発明はまた、DNA損傷治療剤に対して応答性または耐性を示すための方法も提供する。異なる態様において、この遺伝子または遺伝子産物のリストは、マイクロアレイ、Q−PCR、免疫組織化学、ELISA、またはmRNAまたはタンパク質発現を定量化することができる他の技術等の当該技術分野において既知の方法を用いて送達され得る単一パラメータまたは複数パラメータの予測試験の基盤を形成し得る。
加えて、本明細書に記載される生物学的経路は、等級(グレード)および段階(ステージ)と同様に、癌そのものの特徴であり、従って、単一の癌疾患型に限定されない。したがって、この遺伝子または遺伝子産物の集合を使用して、異なる組織中の異なる癌型にわたって癌療法の応答性を予測し得る。本発明の一実施形態において、これらの遺伝子または遺伝子産物は、乳癌および卵巣癌腫瘍の両方を評価するのに有用である。
本明細書に記載される発明は、いかなる1つの薬物にも限定されず、DNA損傷および/またはDNA損傷修復に直接または間接的に影響を及ぼす一連の薬物のいずれか、例えば、FEC(5−フルオロウラシル/エピルビシン/シクロホスファミド)およびFAC(5−フルオロウラシル/アドリアマイシン/シクロホスファミド)等のネオアジュバント5−フルオロウラシル、アントラサイクリン、およびシクロホスファミドベースのレジメンに対する応答者および非応答者を特定するために使用することができる。本発明の特定の態様において、それは、乳癌においてパクリタキセル、フルオロウラシル、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、およびシクロホスファミド(T/FAC)の新補助治療を評価するために有用である。この発明の他の態様において、それは、卵巣癌において白金または白金とタクソールによる治療を評価するために有用である。
本発明は、全生存、無増悪生存率、放射線応答、RECISTによって定義されるもの、完全応答、部分的応答、安定疾患、ならびにPSA、CEA、CA125、CA15−3、およびCA19−9等であるがこれらに限定されない血清学的マーカー等の、応答の異なる分類を用いた、薬物に対する応答の予測に関する。特定の実施形態において、本発明は、FECもしくはFACにより単独でまたは標準治療の文脈において治療された乳癌における病理学的な完全応答、あるいは卵巣癌におけるRECISTおよび血清CA125レベルを評価するために使用することができる。
別の態様において、本発明は、乳癌および卵巣癌におけるDNA損傷応答欠損(DDRD)分子サブタイプの特定に関する。この分子サブタイプは、2つの異なる遺伝子分類子、即ち、40の遺伝子長であるものと44の遺伝子長であるものの使用によって検出することができる。DDRDの分類子は、まず、Almac Breast Disease Specific Array(DSA(商標))上の53個のプローブセットからなる分類子によって画定された。DNA損傷を含む化学療法レジメンに対する応答を予測する能力との関連において、この分類子の機能的関連性を検証するために、この分類子を遺伝子レベルで再定義することが必要であった。これは、Almac Breast DSA(商標)以外のマイクロアレイプラットフォーム上にプロファイル化された独立したデータセットからのマイクロアレイデータを使用したDDRDの分類子の評価を促進する。遺伝子レベルで分類子の画定を促進するために、Almac Breast DSA(商標)プローブセットがマッピングする遺伝子を画定することが必要であった。これには、Ensembl and NCBI Reference Sequence等の公的に入手可能なゲノムブラウザデータベースの利用が関わった。44遺伝子DDRD分類子モデルについてのみの結果を提供するが、それはこのモデルが40遺伝子DDRD分類子モデルを無用にするからである。これらの結果は、この分類子モデルが、DNA損傷治療物を含む化学療法レジメンに対する応答の効果的かつ有意な予測子であることを示す。
40の遺伝子の分類子モデルおよび44の遺伝子の分類子モデルの両方によるサブタイプの特定は、DNA損傷を与える薬剤およびDNA修復標的療法剤を含む標準的な乳癌および卵巣癌治療薬物クラスへの応答を予測し、そのための患者を選択するために使用することができる。
別の態様において、本発明は、qPCR、マイクロアレイ、ならびに免疫組織化学、ELISA、ウエスタンブロット法のような免疫学的検定等の、上に列挙される従来の診断用途のためのキットに関する。そのようなキットは、遺伝子または遺伝子産物の発現をアッセイし、mRNAまたはタンパク質発現を定量化するための適切な試薬および説明書を含む。
本発明はまた、DNA損傷応答欠損(DDRD)のヒト腫瘍を特定するための方法も提供する。本発明は、DNAを直接的に損傷する、DNAを間接的に損傷する、または正常なDNA損傷シグナル伝達および/もしくは修復プロセスを阻害する薬物に対して、感受性があり応答する、または耐性があり応答しない、患者を特定するために使用することができる可能性がある。
本発明はまた、患者の従来型治療を誘導することに関する。本発明はまた、DNA損傷および/またはDNA損傷修復に直接または間接的に影響を及ぼす類の新規薬物の臨床試験のために患者を選択することに関する。
本発明および方法は、本発明におけるすべての転写物のアッセイについて、保管されたホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)生検材料、ならびに新鮮/冷凍(FF)組織の使用を許容し、したがって、最も広く利用可能な種類の生検材料と適合する。発現レベルは、FFPE組織、新鮮冷凍組織、またはRNAlater(登録商標)等の溶液中に保存されている新鮮組織から得られるRNAを使用して決定され得る。
図1は、ER陰性(A)およびER陽性(B)のBRCA1/2突然変異体および散発性野生型対照乳房試料の階層解析を示すダイアグラムを提供する。プローブセットのクラスター群は、右側に注釈を付けられ、それぞれのプローブセットのクラスター群の経路解析は、それぞれの画像の左側に注釈を付けられる。それぞれの画像についての説明文は、試料の突然変異状態、および分類子生成のためにそれぞれの試料に割り当てられたシグネチャー群を示す。 図2は、(A)組み合わせた試料セット、(B)ER陰性の試料セット、および(C)ER陽性の試料セットにおける、5フォール度相互検証の10回反復下でのそれぞれの分類モデルのAUC性能を比較するボックスプロットのダイアグラムを提供する。(D)閾値を選択するために使用された、相互検証予測の感度プラス特異度プロット。最大の感度プラス特異度は1.682であり、約0.37の対応するシグネチャースコアを伴う。 図3は、相互検証によって推測される、44遺伝子分類子モデルを用いたBRCA状態の予測についての分類性能のROC曲線のダイアグラムを提供する。AUCは、分類子モデルの適用後、約0.68である。95%信頼限界は、1000回の反復を伴うブートストラップから推定された。 図4は、アントラサイクリン系化学療法に対する応答を予測するための、3つの独立したデータセット:FEC、FAC1、およびFAC2 (Bonnefoi et al.,2007、Iwamoto et al.,J Natl Cancer Inst 103,264−272(2011)、Lee,J.K.,et al.Clin Cancer Res 16,711−718(2010)の組み合わせた解析における、44遺伝子分類子モデルの分類性能のROC曲線のダイアグラムを提供する。AUCは、分類子モデルの適用後、約0.78である。95%信頼限界は、1000回の反復を伴うブートストラップから推測された。 図5は、T/FACで処理した試料中の応答において3つの独立したデータセットの組み合わせた解析における、44遺伝子分類子モデルの分類性能のROC曲線のダイアグラムを提供する(Hesset al.,J Clin Oncol 24,4236−4244(2006)、Lee et al.,2010、Tabchy,A.,et al.Clin Cancer Res 16,5351−5361(2010)。AUCはそれぞれ、分類子モデルの適用後、約0.61である。95%信頼限界は、1000回のブートストラップ反復を用いて決定された。 図6は、自社のAlmac Diagnostics卵巣データセットからの、白金およびタクソールにより処理した試料中の応答における、259個の漿液性卵巣癌試料内の44遺伝子分類子モデルの分類性能のROC曲線のダイアグラムを提供する。AUCは、分類子モデルの適用後、約0.68である。95%信頼限界は、1000回のブートストラップ反復を用いて決定された。 図7は、健常なドナーおよびファンコニ貧血突然変異を有する患者から採取した骨髄試料における、44遺伝子DDRD分類子スコアのヒストグラム表現を提供する。AUCは、分類子モデルの適用後、0.90である。95%信頼限界は、1000回のブートストラップ反復を用いて決定された。 図8は、BRCA1突然変異体および野生型細胞株において、44遺伝子分類子モデルを治療応答と相関させる図を提供する。(A)HCC1937−EV細胞と比較して、HCC1937−BR細胞におけるBRCA1の発現が増加していることを確認するウエスタンブロット解析。(B)対照のベクターのみでトランスフェクトしたHCC1937(HCC1937−EV)およびBRCA1の戻し外因性発現を有するHCC1937(HCC1937−BR)細胞株内の、平均の44遺伝子モデル(DDRD)分類子スコア(±標準誤差)。一連の濃度のPARP阻害剤KU0058948(C)およびシスプラチン(D)への定常的曝露下における、HCC1937親細胞およびHCC1937−BR細胞の、細胞生存率のヒストグラム表示。
特に定義されない限り、本明細書に使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解される同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または等価な任意の方法、デバイス、および材料が本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法、デバイス、および材料は本明細書に記載されている。
本出願で言及されるすべての刊行物、公開された特許文献、および特許出願は、本出願が関連する当該技術分野において技術のレベルを示す。本明細書で言及されるすべての刊行物、公開された特許文献、および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、公開された特許文献、または特許出願が、具体的かつ個別に示されるように、参照によって組み込まれるのと同じ程度まで参照によって組み込まれる。
冠詞「a」および「an」は、冠詞の文法上の対象の1つまたは1つを超えて(即ち、少なくとも1つ)を指すように本明細書に使用される。例として、「ある要素」は、特にそれとは反対に明確に示されない限り、1つの要素または1つを超える要素を意味する。
本研究の主要な目的は、分子的パラメータを臨床治療的決定に組み込むことによって、患者における周術期全身療法の有効性を増加させることである。薬理遺伝学/ゲノミクスは、異物または薬物に対する個体の応答に関与する遺伝子/ゲノム因子の研究である。本発明のマーカーの発現に対して促進性または阻害性作用を有する剤(エージェント)またはモジュレータは、患者において癌を(予防的または治療的に)処置するために個体に投与することができる。また、そのような治療と併せて個体の薬理ゲノミクスも考慮することが理想である。治療物の代謝の差は、薬理学的に活性な薬物の用量と血液濃度との間の関係を変化させることにより、激しい毒性または治療の失敗を引き起こし得る。したがって、個体の薬理ゲノミクスの理解が、予防的または治療的処置のための有効なエージェント(例えば薬物)の選択を可能にする。そのような薬理ゲノミクスは、適切な投薬量および治療レジメンを決定するために更に使用することができる。したがって、個体における本発明のマーカーの発現レベルを決定して、それによって個体の治療的または予防的処置のための適切なエージェント(複数可)を選択することができる。
本発明は、癌組織中に発現される遺伝子または遺伝子産物マーカー(以下、「バイオマーカー」とも称される)の独自の集合を対象とする。異なる態様において、このバイオマーカーのリストは、マイクロアレイ、Q−PCR、免疫組織化学、ELISA、またはmRNAまたはタンパク質発現を定量化することができる他の技術等の当該技術分野において既知の方法を用いて送達され得る、単一パラメータまたは複数パラメータの予測試験の基盤を形成し得る。
本発明はまた、細胞毒性化学療法後の予後または癌に対する特異的治療法の選択に有用であるキットおよび方法に関する。その転写物のいくつかまたはすべてが過剰または過少発現であるとき、その発現プロファイルがDNA損傷治療剤に対する応答性または耐性を示すような、方法が提供される。これらのキットおよび方法は、癌に罹患している患者の腫瘍において差次的に発現される遺伝子または遺伝子産物を利用する。本発明の一実施形態において、これらのバイオマーカーの発現プロファイルが、統計学的方法または相関モデル下で、アーカイブ組織試料における臨床的転帰(応答または生存)と相関され、発現プロファイルを1つ以上のDNA損傷治療剤に対する応答性と相関させるデータベースまたはモデルを生成する。次いで、この予測モデルを使用して、DNA損傷治療剤に対する応答性が未知である患者において応答性を予測し得る。多くの他の実施形態において、患者集団は、患者の臨床的転帰、予後、またはDNA損傷治療剤に対する応答性に基づいて少なくとも2つのクラスに分類され得、上記バイオマーカーが、患者のこれらのクラス間におけるクラス区別と実質的に相関される。本明細書に記載される生物学的経路は、等級および段階と同様に、疾患としての癌に共通しており、従って、当該分類子および方法は、単一の癌疾患型に限定されない。
予測マーカーパネル/発現分類子
癌を治療するために使用されるDNA損傷治療剤等の治療剤(治療エージェント)に対する応答性または耐性を判定するのに有用である、癌組織中に発現する遺伝子分類子としてバイオマーカーの独特の集合が提供される。そのような集合は、「マーカーパネル」、「発現分類子」、または「分類子」と称され得る。
本方法に有用なバイオマーカーが表1に特定される。これらのバイオマーカーは、治療剤に対する患者の応答またはその欠如を判定するための予測的意義を有するものとして特定される。それらの発現は、薬剤(エージェント)、より具体的には、DNA損傷治療剤に対する応答と相関する。腫瘍におけるこれら特定されたバイオマーカーの集合の発現を調べることによって、どの治療剤またはその組合せが、癌、およびいくつかの実施形態においては乳癌または卵巣癌の細胞の増殖率を低下させる可能性が最も高いかを判定することが可能となる。特定された転写遺伝子または遺伝子産物マーカーの集合を調べることによって、どの治療剤またはその組合せが癌の増殖率を低下させる可能性が最も低いかを判定することも可能となる。したがって、バイオマーカーの集合の発現を調べることによって、効果のないまたは不適切な治療剤を排除することが可能である。重要なことには、ある実施形態において、これらの判定は、患者ごとに基づいてまたはエージェントごとに基づいて行うことができる。したがって、特定の治療レジメンが特定の患者または特定の患者タイプに利益を与える可能性が高いか否か、および/または特定のレジメンを継続すべきか否かを判定することができる。
表1に列挙されるバイオマーカーのすべてまたはその一部が、予測バイオマーカーパネルにおいて使用され得る。例えば、表1のバイオマーカーから選択されるバイオマーカーパネルは、本明細書に提供される方法を使用して生成することができ、表1に記載されるバイオマーカーのうちの1つから全てまでの間、およびそれらの間のあらゆる組合せ(例えば、4個の選択されたバイオマーカー、16個の選択されたバイオマーカー、74個の選択されたバイオマーカー等)を含むことができる。いくつかの実施形態において、予測バイオマーカーセットは、少なくとも5、10、20、40、60、100、150、200、もしくは300またはそれ以上のバイオマーカーを含む。他の実施形態において、予測バイオマーカーセットは、5、10、20、40、60、100、150、200、300、400、500、600、または700以下のバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態において、予測バイオマーカーセットは、表1に記載されるバイオマーカーの複数を含む。いくつかの実施形態において、予測バイオマーカーセットは、表1に記載される少なくとも約1%、約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%のバイオマーカーを含む。選択される予測バイオマーカーセットは、本明細書に記載される方法および当該技術分野において既知の同様の方法を用いて提供される予測バイオマーカーから構築され得る。一実施形態において、バイオマーカーパネルは、表1の203個すべてのバイオマーカーを含む。別の実施形態において、バイオマーカーパネルは、表1または2の40個または44個のバイオマーカーを含む。
予測バイオマーカーセットは、様々な規模を有する現実スケール上で対応するスカラー重みと組み合わされて画定され得、これらは線形もしくは非線形の代数的、三角法的、または相関的手段によって、代数的、統計学習、ベイジアン、回帰、または同様のアルゴリズムを介して単一のスカラー値に更に組み合わされ、これが、そのスカラー値について数学的に導出された決定関数とともに、特定の薬物または薬物クラスに対して応答者または非応答者、耐性または非耐性の別個のクラスに試料からの発現プロファイルが分離され得る予測モデルを提供する。バイオマーカーメンバーシップを含むそのような予測モデルは、既知の薬物応答性および/または薬物耐性を有する歴史的患者試料からの一組の代表的な発現プロファイルから、相互検証、ブートストラップ法または同様のサンプリング技法の下、感度、特異度、負および正の予測値、ハザード比、またはそれらの任意の組み合わせについて最適化された重みおよび決定閾値を学習することにより開発される。
一実施形態において、バイオマーカーを使用して、それらの信号の加重和を形成し、そこでは個々の重みが正または負であり得る。結果として生じる加重和(「決定関数」)は、所定の参照点または参照値と比較される。参照点または参照値との比較を使用して、臨床的な状態または転帰を診断または予測することができる。
上述のように、当業者は、表1に提供される分類子に含まれるバイオマーカーが、治療剤に対する応答性または耐性に関する分類子において、等しくない重みを有することを理解するであろう。したがって、治療剤に対する応答性等の転帰を診断または予測するために、わずか1つの配列が使用され得るが、その特異度および感度または診断もしくは予測正確度は、より多くの配列を用いると増加し得る。
本明細書に使用される「重み」という用語は、統計学的計算における項目の相対的重要度を表す。遺伝子発現分類子におけるそれぞれのバイオマーカーの重みは、当該技術分野において既知の解析方法を使用して患者試料のデータセットにおいて決定され得る。
一実施形態において、バイオマーカーパネルは、表中に詳述される対応する順位もしくは重み、または、例えば疾患設定に依存する代替の順位付けおよび重み付けを有する、表2Aに詳述される40個のバイオマーカーを対象とする。別の実施形態において、バイオマーカーパネルは、表中に詳述される対応する順位もしくは重み、または、例えば疾患設定に依存する代替の順位付けおよび重み付けを有する、表2Bに詳述される44個のバイオマーカーを対象とする。表2Aおよび2Bは、分類子における重みが減少する順序でバイオマーカーを順位付けしており、これは相互検証下で測定された複合的決定スコア関数における平均重みの順位付けとして定義される。表2Cは、それらの配列ID番号を参照して表2Aおよび2Bの遺伝子を示すプローブセットを示す。表2Dは、シグネチャーにおける遺伝子について、アレイ上に存在していたアンチセンスプローブ配列を示す。
異なる実施形態において、表2Aおよび表2Bに記載されるバイオマーカーのサブセットが、本明細書に記載される方法において使用され得る。これらのサブセットとしては、表2Aまたは表2Bの1〜2、1〜3、1〜4、1〜5、1〜10、1〜20、1〜30、1〜40、1〜44、6〜10、11〜15、16〜20、21〜25、26〜30、31〜35、36〜40、36〜44、11〜20、21〜30、31〜40、および31〜44位に入るバイオマーカーが挙げられるが、これらに限定されない。一態様において、個体からの生体試料に対してアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーGBP5、CXCL10、IDO1、およびMX1のうちの少なくとも1つならびに表2Bのバイオマーカーのリストから選択される少なくともN個(Nは2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、または36である)の更なるバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において治療応答性が予測される。本明細書に使用される、「バイオマーカー」という用語は、遺伝子発現レベルあるいはタンパク質産生レベルのいずれかを示す、遺伝子、mRNA、cDNA、アンチセンス転写物、miRNA、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質フラグメント、または任意の他の核酸配列もしくはポリペプチド配列を指すことができる。いくつかの実施形態において、CXCL10、IDO1、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2I1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A、またはAL137218.1のバイオマーカーに言及するとき、そのバイオマーカーはそれぞれ、CXCL10、IDO1、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2I1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A、またはAL137218.1のmRNAを含む。更なるまたは他の実施形態において、MX1、GBP5、IFI44L、BIRC3、IGJ、IQGAP3、LOC100294459、SIX1、SLC9A3R1、STAT1、TOB1、UBD、C1QC、C2orf14、EPSTI、GALNT6、HIST1H4H、HIST2H4B、KIAA1244、LOC100287927、LOC100291682、またはLOC100293679のバイオマーカーに言及するとき、そのバイオマーカーはそれぞれ、MX1、IFI44L、GBP5、BIRC3、IGJ、IQGAP3、LOC100294459、SIX1、SLC9A3R1、STAT1、TOB1、UBD、C1QC、C2orf14、EPSTI、GALNT6、HIST1H4H、HIST2H4B、KIAA1244、LOC100287927、LOC100291682、またはLOC100293679のアンチセンス転写物を含む。
更なる態様において、個体からの生体試料に対してアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーGBP5、CXCL10、IDO1、およびMX1、ならびに表2Bのバイオマーカーのリストから選択される少なくともN個の更なるバイオマーカーのうちの1つ(Nは2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、または36である)に対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において、治療応答性が予測されるか、または癌診断が示される。更なる態様において、個体からの生体試料に対してアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーGBP5および表2Bのバイオマーカーのリストから選択される少なくともN個(Nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、または39である)の更なるバイオマーカーのうちの1つに対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において、治療応答性が予測されるか、または癌診断が示される。更なる態様において、個体からの生体試料に対してアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーCXCL10および表2Bのバイオマーカーのリストから選択される少なくともN個(Nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、または39である)の更なるバイオマーカーのうちの1つに対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において、治療応答性が予測されるか、または癌診断が示される。更なる態様において、個体からの生体試料に対してアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーIDO1および表2Bのバイオマーカーのリストから選択される少なくともN個(Nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、または39である)の更なるバイオマーカーのうちの1つに対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において、治療応答性が予測されるか、または癌診断が示される。更なる態様において、個体からの生体試料に対してアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーMX−1および表2Bのバイオマーカーのリストから選択される少なくともN個(Nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、または39である)の更なるバイオマーカーのうちの1つに対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において、治療応答性が予測されるか、または癌診断が示される。
更なる態様において、個体からの生体試料に対してアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーCXCL10、MX1、IDO1、およびIFI44L、ならびに表2Bのバイオマーカーのリストから選択される少なくともN個(Nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40である)の更なるバイオマーカーのうちの2つに対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において、治療応答性が予測されるか、または癌診断が示される。更なる態様において、個体からの生体試料に対してアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーCXCL10、MX1、IDO1、およびIFI44L、ならびに表2Bのバイオマーカーのリストから選択される少なくともN個(Nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40である)の更なるバイオマーカーのうちの1つに対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において、治療応答性が予測されるか、または癌診断が示される。更なる態様において、個体からの生体試料に対してアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーCXCL10および表2Bのバイオマーカーのリストから選択される少なくともN個(Nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、または43である)の更なるバイオマーカーのうちの1つに対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において、治療応答性が予測されるか、または癌診断が示される。更なる態様において、個体からの生体試料に対してアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーMX−1および表2Bのバイオマーカーのリストから選択される少なくともN個(Nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、または43である)の更なるバイオマーカーのうちの1つに対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において、治療応答性が予測されるか、または癌診断が示される。更なる態様において、個体からの生体試料に対してアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーIDO1および表2Bのバイオマーカーのリストから選択される少なくともN個(Nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、または43である)の更なるバイオマーカーのうちの1つに対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において、治療応答性が予測されるか、または癌診断が示される。更なる態様において、個体からの生体試料に対してアッセイを行い、それぞれがバイオマーカーIFI44Lおよび表2Bのバイオマーカーのリストから選択される少なくともN個(Nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、または43である)の更なるバイオマーカーのうちの1つに対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において、治療応答性が予測されるか、または癌診断が示される。
他の実施形態において、表2Cに記載されるプローブ(配列番号83〜202)、またはそれらのサブセットが、本明細書に記載される方法において使用されてもよい。これらのサブセットとしては、GBP5、CXCL10、IDO1、MX1、IF144l、CD2、PRAME、ITGAL、LRP4、およびAPOL3のうちの1つ以上に対応する配列番号のサブセットが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、これらのプローブは、バイオマーカーCXCL10、MX1、IDO1、IF144L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A、およびAL137218.1のすべてに対応する。それぞれのサブセットは、同じバイオマーカーを対象とする複数のプローブを含むことができるが理解されるべきである。例えば、配列番号135、140、142、および195によって示されるプローブはすべて、GBP5を対象とする。したがって、GBP5を対象とするまたはそれに対応するプローブを含むサブセットは、配列番号135、140、142、および195のうちの1つ以上を含む。CXCL10を対象とするまたはそれに対応するプローブを含むサブセットは、配列番号131および160のうちの1つ以上を含む。
分類子モデルを用いた遺伝子発現の測定
様々な方法が、バイオマーカーを同定し、疾患を診断する試みにおいて利用されている。タンパク質系マーカーについては、これらには、二次元電気泳動法、質量解析法、および免疫測定法が含まれる。核酸マーカーについては、これらには、mRNA発現プロファイル、マイクロRNAプロファイル、FISH、遺伝子発現の連続解析(SAGE)、メチル化プロファイル、および大規模な遺伝子発現アレイが含まれる。
バイオマーカーが、個体において、異常なプロセス、疾患、または他の状態の兆候を示すか、またはその兆候であるとき、そのバイオマーカーは一般に、個体における正常なプロセス、疾患もしくは他の状態の欠如の兆候を示すか、またはその兆候である発現レベルまたはバイオマーカー値と比較して、過剰発現されているか、あるいは過少発現されていると説明される。「上方調節」、「上方調節された」、「過剰発現」、「過剰発現された」、およびそれらのあらゆる変形は、健常または正常な個体からの同様の生体試料中に通常検出されるバイオマーカーの値またはレベル(あるいは値またはレベルの範囲)よりも大きい、生体試料中のバイオマーカーの値またはレベルを指すために互換的にに使用される。これらの用語はまた、特定の疾患の異なる段階で検出され得るバイオマーカーの値またはレベル(あるいは値またはレベルの範囲)よりも大きい、生体試料中のバイオマーカーの値またはレベルを指してもよい。
「下方調節」、「下方調節された」、「過少発現」、「過少発現された」、およびそれらのあらゆる変形は、健常または正常な個体からの同様の生体試料中に通常検出されるバイオマーカーの値またはレベル(あるいは値またはレベルの範囲)よりも小さい、生体試料中のバイオマーカーの値またはレベルを指すために互換的に使用される。これらの用語はまた、特定の疾患の異なる段階で検出され得るバイオマーカーの値またはレベル(あるいは値またはレベルの範囲)よりも小さい、生体試料中のバイオマーカーの値またはレベルを指してもよい。
更に、過剰発現されたあるいは過少発現されたバイオマーカーはまた、個体において、正常なプロセス、または疾患もしくは他の状態の欠如の兆候を示す、またはその兆候であるバイオマーカーの「正常な」発現レベルまたは値と比較して、「差次的に発現される」、「差次的なレベル」または「差次的な値」を有すると称され得る。したがって、バイオマーカーの「差次的発現」もまた、バイオマーカーの「正常な」発現レベルからの変動として言及され得る。
「差次的なバイオマーカー発現」および「差次的発現」という用語は、正常な対象におけるその発現と比較して、あるいは特定の療法に対して異なって応答するか、または異なる予後を有する患者におけるその発現と比較して、その発現が、特定の疾患を患っている対象においては、より高いまたは低いレベルに活性化されているバイオマーカーを指すために、互換的にに使用される。これらの用語はまた、その発現が同じ疾患の異なる段階でより高いまたは低いレベルに活性化されるバイオマーカーも含む。差次的に発現されたバイオマーカーは、核酸レベルもしくはタンパク質レベルで活性化または抑制され得、あるいは代替的スプライシングに供され異なるポリペプチド産物をもたらし得ることも理解されよう。そのような違いは、ポリペプチドのmRNAレベル、miRNAレベル、アンチセンス転写物レベル、またはタンパク質表面発現、または分泌もしくは他の分配を含む、様々な変化によって証明され得る。差次的なバイオマーカー発現は、2つ以上の遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物間の発現の比較、2つ以上の遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物間の発現比率の比較、または、正常な対象と疾患を患っている対象との間で異なるか、もしくは同じ疾患の様々な段階の間で異なる同じ遺伝子の2つの異なるプロセシングが行われた産物の比較さえ含み得る。差次的発現には、例えば、正常な細胞および罹患細胞の間での、あるいは異なる疾患事象もしくは疾患段階を経た細胞の間でのバイオマーカーにおける時間的または細胞発現パターンにおける量的な差および質的な差の両方が含まれる。
ある実施形態において、得られた発現プロファイルは、試料中の1つ以上の核酸の量またはレベルが決定される、ゲノムまたは核酸発現プロファイルであるものである。これらの実施形態において、診断または予後方法において利用される発現プロファイルを生成するためにアッセイされる試料は、核酸試料である。核酸試料には、解析される細胞または組織の表現型を決定するバイオマーカーの発現情報を含む核酸集団が含まれる。いくつかの実施形態において、核酸には、試料が、それが得られる宿主細胞または組織の発現情報を保有する限り、例えば、mRNA、cRNA、cDNA等のRNAまたはDNA核酸を含み得る。試料は、当該技術分野において既知の多くの異なる方法において、例えば、細胞からのmRNAの単離によって調製され得、単離されたmRNAは、差次的遺伝子発現の分野において既知のcDNA、cRNA等を調製するために単離、増幅、または利用されるとき使用される。したがって、試料中のmRNAのレベルの決定は、mRNAからcDNAまたはcRNAを調製し、続いて、cDNAまたはcRNAを測定することを含む。試料は、一般に、治療を必要とする対象から、例えば、標準プロトコルを用いた組織生検によって採取された細胞または組織から調製され、そのような核酸が生成され得る細胞型または組織としては、罹患細胞または組織、体液等が挙げられるが、これらに限定されない、表現型を決定するための発現パターンが存在している任意の組織が含まれる。
発現プロファイルは、任意の簡便なプロトコルを用いて初期の核酸試料から生成してもよい。差次的遺伝子発現/バイオマーカー解析の分野において用いられているもののような、発現プロファイルを作成する様々な異なる様式が知られているが、発現プロファイルを作成するための代表的かつ簡便な型の1つは、アレイに基づく遺伝子発現プロファイル作成プロトコルである。そのような適用は、作成されるべきプロファイルにおいてアッセイ/プロファイリングされるべき遺伝子のそれぞれについて「プローブ」核酸を表示する核酸アレイが用いられるハイブリダイゼーションアッセイである。これらのアッセイにおいて、標的核酸の試料は、最初に、アッセイされるべき初期の核酸試料から調製され、調製は、例えば、シグナル発生系のメンバー等の標識を用いた標的核酸の標識化を含み得る。標的核酸試料調製後、試料は、ハイブリダイゼーション条件下でアレイと接触させられ、それによって、複合体が、アレイ表面に付着したプローブ配列と相補的である標的核酸の間で形成される。次いで、ハイブリダイズした複合体の存在は、定性的かまたは定量的のいずれかで検出される。本方法に用いられる発現プロファイルを作成するために実施され得る特異的ハイブリダイゼーション技術は、米国特許第5,143,854号、第5,288,644号、第5,324,633号、第5,432,049号、第5,470,710号、第5,492,806号、第5,503,980号、第5,510,270号、第5,525,464号、第5,547,839号、第5,580,732号、第5,661,028号、第5,800,992号(これらの開示は参照によって本明細書に組み込まれる)、ならびに国際公開第95/21265号、第96/31622号、第97/10365号、第97/27317号、欧州特許第373 203号および第785 280号に記載される技術を含む。これらの方法において、上述のように、発現がアッセイされるバイオマーカーのそれぞれについてのプローブを含む「プローブ」核酸のアレイが、標的核酸と接触させられる。接触は、上述のように、ハイブリダイゼーション条件(例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件)の下で行われ、次いで、結合していない核酸は除去される。ハイブリダイズした核酸の結果として生じたパターンは、探索された遺伝子のそれぞれについての発現に関する情報を提供し、発現情報は、遺伝子が発現しているかどうか、および典型的には、どれほどのレベルで発現しているかに関してであり、発現データ、即ち、発現プロファイルが定性的および定量的の両方であり得る。
バイオマーカー発現分類子の作成
一実施形態において、癌組織中のバイオマーカーの相対的発現レベルが、遺伝子発現プロファイルを作成するために測定される。患者組織試料からの一組のバイオマーカーの遺伝子発現プロファイルが、複合決定スコアの形態で要約され、患者データのトレーニングセットから数学的に導出されるスコア閾値と比較される。スコア閾値は、例えば治療に対する応答性/非応答性等であるがこれに限定されない異なる特徴に基づいて、患者群を分類する。患者のトレーニングセットデータは、予後、再発の可能性、長期生存、臨床転帰、治療応答、診断、癌分類、または個別ゲノミクスプロファイルによって特徴付けられた癌組織試料から導出されるのが好ましい。患者試料からの発現プロファイルおよび対応する決定スコアは、数学的に導出されたスコア決定閾値の同じ側にある、トレーニングセットにおける患者試料の特徴と相関され得る。線形分類子スカラー出力の閾値は、トレーニングデータセット内で観察されたように、相互検証下で感度および特異度の和を最大化するようにに最適化される。
与えられた試料についての全発現データは、出発材料の異なる量、抽出および増幅反応の効率の変動等について補正するために当業者に既知の方法を用いて正規化する。診断または予後判定(例えば治療剤に対する応答性または耐性)を行うために正規化データに対して線形分類子を使用することは、事実上、データ空間、即ち、分類子中のすべての遺伝子についての発現値のすべての可能な組み合わせを、分離する超平面によって2つの別個な半分に分割することを意味する。この分割は、大量のトレーニング例のセットについて、例えば治療剤に対して応答性または耐性を示す患者群からから、経験的に導出される。一般性の喪失なく、1つのバイオマーカーを除いたすべてについて固定されたある一組の値を推定することができ、これが、この残りのバイオマーカーについて、例えば治療剤に対する応答性または耐性から決定が変化するところの閾値を自動的に定義する。そうすると、この動的閾値を超える発現値は、治療剤に対する耐性(負の重みを持つバイオマーカーについて)または応答性(正の重みを持つバイオマーカーについて)のいずれかを示す。この閾値の正確な値は、分類子内のすべての他のバイオマーカーの実際に測定された発現プロファイルによって異なるが、あるバイオマーカーが一般的に示すことは固定されたままである、即ち、高い値または「相対的過剰発現」は常に、応答性(正の重みを持つ遺伝子)または耐性(負の重みを持つ遺伝子)のいずれかに貢献する。したがって、全遺伝子発現分類子において、あるバイオマーカーの上方調節または下方調節が治療剤に対する応答性または耐性を示すかどうかを相対的発現は示すことができる。
一実施形態において、患者組織試料のバイオマーカー発現プロファイルは、線形分類子によって評価される。本明細書に使用される、線形分類子とは、複合決定スコア(「決定関数」)への個別のバイオマーカー強度の加重和を指す。次いで、その決定スコアが、所定のカットオフスコア閾値と比較され、そのカットオフスコア閾値は、試料がスコア閾値を超える(決定関数が正)か下回る(決定関数が負)かを示す、感度および特異度に関するあるセットポイントに対応する。
事実上、これは、データ空間、即ち、バイオマーカー発現値のすべての可能な組合せのセットが、異なる臨床的分類または予測に対応する、互いに排反する2つの半分(例えば、治療剤への応答性に対応する片方と耐性に対応する他方)に分割されることを意味する。全体的分類子の文脈において、あるバイオマーカーの相対的な過剰発現は、決定スコアを増加させる(正の重み)か、あるいはそれを減少させる(負の重み)ことができ、そのようにして、(例えば治療剤に対する応答性または耐性の)全体的決定に寄与する。
「曲線下面積」または「AUC」という用語は、受信者動作特性(ROC)曲線の曲線下の面積を指し、これらの両方は当該技術分野においてよく知られている。AUC測定は、完全データ範囲にわたる分類子の正確度を比較するのに有用である。より大きなAUCを有する分類子は、対象となる2つの群(例えば卵巣癌試料と正常または対照の試料)間で未知物を正確に分類する能力がより大きい。ROC曲線は、2つの集団(例えば治療剤に対して応答する個体および応答しない個体)を区別する際、特定の特徴(feature)(例えば本明細書に記載されるバイオマーカーのいずれかおよび/または更なる生物医学的情報のいずれかの項目)の性能をプロットするために有用である。典型的には、全集団(例えば症例および対照)にわたる特徴データを、単一の特徴の値に基づいて、昇順で仕分ける。次いで、その特徴に対するそれぞれの値に対して、データに関して真の陽性または偽陽性率を計算する。真の陽性率は、その特徴に関してその値を超える症例の数を計数して、次いで、症例の総数によって割ることによって決定する。偽陽性率は、その特徴に関してその値を超える対照の数を計数して、次いで、対照の総数によって割ることによって決定する。この定義は、対照と比較して症例において特徴が上昇するシナリオを記述しているが、この定義はまた、対照と比較して症例において特徴が抑制されるシナリオにも適用される(そのようなシナリオでは、その特徴に関してその値を下回る試料が計数される)。ROC曲線は、単一の特徴について、ならびに他の単一出力について産出可能であり、例えば、2つ以上の特徴の組合せが数学的に組み合わされて(例えば加えられる、引かれる、乗じられる等)、単一の合計値が提供され、この単一合計値をROC曲線中でプロットすることができる。更に、組合せが単一出力値を誘導する、複数の特徴のあらゆる組合せが、ROC曲線中でプロット可能である。特徴のこれらの組合せは試験を含み得る。ROC曲線は、試験の偽陽性率(1−特異度)に対する試験の真の陽性率(感度)のプロットである。
この量の解釈、即ち、治療剤に対するカットオフ閾値応答性または耐性は、既知の転帰を有する一組の患者からの開発フェーズ(「トレーニング」)で得られる。決定スコアについての対応する重みおよび応答性/耐性のカットオフ閾値は、当業者に既知の方法によってトレーニングデータから先験的(アプリオリ)に固定される。本方法の好ましい実施形態においては、部分最小二乗法判別解析(PLS−DA)が、重みを決定するために使用される(L.Stahle,S.Wold,J.Chemom.1(1987)185−196、D.V.Nguyen,D.M.Rocke,Bioinformatics 18(2002)39−50)。当業者に既知の分類を行うための他の方法もまた、癌分類子の転写物に適用される場合に本明細書に記載される方法に伴われ得る。
異なる方法を使用して、これらのバイオマーカーについて測定された定量的データを予後または他の予測用途に変換することができる。これらの方法としては、パターン認識(Duda et al.Pattern Classification,2nd ed.,John Wiley,New York 2001)、機械学習(Scholkopf et al.Learning with Kernels,MIT Press,Cambridge 2002,Bishop,Neural Networks for Pattern Recognition,Clarendon Press,Oxford 1995)、統計学(Hastie et al.The Elements of Statistical Learning,Springer,New York 2001)、バイオインフォマティクス(Dudoit et al.,2002,J.Am.Statist.Assoc.97:77−87、Tibshirani et al.,2002,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:6567−6572)、またはケモメトリックス(Vandeginste,et al.,Handbook of Chemometrics and Qualimetrics,Part B,Elsevier,Amsterdam 1998)の分野からの方法が挙げられるが、これらに限定されない。
トレーニングステップでは、応答性/耐性の両方の事例についての一連の患者試料が測定され、本予測方法は、このトレーニングデータからの固有情報を用いて、トレーニングセットまたは未来の試料セットを最適に予測するように最適化される。このトレーニングステップにおいて、この使用される方法は、特定の強度パターンから特定の予測判定へと予測するためにトレーニングされ、あるいはパラメータ化される。予後方法またはアルゴリズムに供される前に、測定されたデータを用いて好適な変換または前処理ステップが行われ得る。
本発明の好ましい実施形態において、それぞれの転写物について前処理強度値の加重和が形成され、トレーニングセットにおいて最適化された閾値と比較される(Duda et al.Pattern Classification,2nd ed.,John Wiley,New York 2001)。重みは、部分最小二乗法(PLS,(Nguyen et al.,2002,Bioinformatics 18(2002)39−50))またはサポートベクターマシン(SVM,(Scholkopf et al.Learning with Kernels,MIT Press,Cambridge2002))が挙げられるがこれらに限定されない多数の線形分類子法によって導出され得る。
本発明の別の実施形態において、データは、上述のように加重和を適用する前に、非線形的に変換される。この非線形変換は、データの次元を増加させることを含み得る。また、非線形的変換および加重合計は、例えばカーネル関数の使用を通じて、暗黙的に行われ得る (Scholkopf et al.Learning with Kernels,MIT Press,Cambridge 2002)。
本発明の別の実施形態において、新しいデータ試料が、実際に測定されたトレーニング試料または人工的に生成されたプロトタイプのいずれかである、2つ以上の分類プロトタイプと比較される。この比較は、例えば、ユークリッド距離(Duda et al.Pattern Classification,2nd ed.,John Wiley,New York 2001)、相関係数(Van’t Veer,et al.2002,Nature 415:530)等があるがこれらに限定されない好適な同様の手段を用いて行われる。次いで、新しい試料は、近隣に最も近いプロトタイプまたは最高数のプロトタイプを有する予後群に割り当てられる。
本発明の別の実施形態において、決定ツリー(Hastie et al.,The Elements of Statistical Learning,Springer,New York 2001)またはランダムフォレスト(Breiman,Random Forests,Machine Learning 45:5 2001)を使用して、転写物セットまたはそれらの産物に対して測定された強度データから予後判定を作成する。
本発明の別の実施形態において、ニューラルネットワーク(Bishop,Neural Networks for Pattern Recognition,Clarendon Press,Oxford 1995)を使用して、転写物セットまたはそれらの産物に対して測定された強度データから予後判定を作成する。
本発明の別の実施形態において、線形、対角線の線形、二次およびロジスティック判別解析が含まれるが、これらに限定されない、判別解析(Duda et al.,Pattern Classification, 2nd ed.,John Wiley,New York 2001)を使用して、転写物セットまたはそれらの産物に対して測定された強度データから予後判定を作成する。
本発明の別の実施形態において、マイクロアレイについての予測解析(PAM,(Tibshirani et al.,2002,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:6567−6572))を使用して、転写物セットまたはそれらの産物に対して測定された強度データから予後判定を作成する。
本発明の別の実施形態において、階級類推のソフト非依存モデリング(Soft Independent Modelling of Class Analogy(SIMCA)、Wold,1976,Pattern Recogn.8:127−139))を使用して、転写物セットまたはそれらの産物に対して測定された強度データから予後判定を作成する。
治療剤
上述のように、本明細書に記載される方法は、異常なDNA修復を有する腫瘍を標的とする治療剤(以下、「DNA損傷治療剤」と称される)に対して応答するものまたは応答しないものとして患者の分類を可能にする。本明細書に使用される「DNA損傷治療剤」には、直接的にDNAを損傷することが知られている剤、DNA損傷修復を妨害する剤、DNA損傷シグナリングを阻害する剤、DNA損傷誘導性の細胞周期停止を阻害する剤、および諸プロセスを阻害してDNA損傷を間接的にもたらす剤が含まれる。癌を治療するために使用されるいくつかの現行のそのような治療物としては、以下のDNA損傷治療剤が挙げられるが、これらに限定されない。
1)DNA損傷剤:
a.アルキル化剤(シスプラチン、カルボプラチン、およびオキサリプラチン等の白金含有薬剤、シクロホスファミド、ブスルファン)
b.トポイソメラーゼI阻害剤(イリノテカン、トポテカン)
c.トピソメラーゼII阻害剤(エトポシド;ドキソルビシンおよびエピルビシン等のアントラサイクリン)
d.電離放射線
2)DNA修復標的療法剤
a.非相同末端結合阻害剤(DNA−PK阻害剤、Nu7441、NU7026)
b.相同組み換え阻害剤
c.ヌクレオチド除去修復阻害剤
d.塩基除去修復阻害剤(PARP阻害剤、AG014699、AZD2281、ABT−888、MK4827、BSI−201、INO−1001、TRC−102、APEX1阻害剤、APEX2阻害剤、リガーゼIII阻害剤
e.ファンコニ貧血経路阻害剤
3)DNA損傷シグナル伝達阻害剤
a.ATM阻害剤(CP466722、KU−55933)
b.CHK1阻害剤(XL−844、UCN−01、AZD7762、PF00477736)
c.CHK2阻害剤(XL−844、AZD7762、PF00477736)
4)DNA損傷誘導性の細胞周期停止阻害剤
a.Wee1キナーゼ阻害剤
b.CDC25a、b、またはc阻害剤
5)DNA損傷を間接的にもたらすプロセスの阻害
a.ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤
b.熱ショックタンパク質阻害剤(ゲルダナマイシン、AUY922)
疾患および組織起源
本明細書に記載される予測分類子は、癌を治療するための治療剤に対する応答性または耐性を決定するのに有用である。本明細書に記載される生物学的経路は、等級および段階と同様に、それ自体、癌の特徴であり、従って、単一の癌疾患型に限定されない。したがって、遺伝子または遺伝子産物の該集合は、異なる組織中の異なる癌型にわたって癌療法の応答性を予測するために使用され得る。一実施形態において、遺伝子または遺伝子産物の該集合は、乳癌および卵巣癌の腫瘍の両方を評価するのに有用である。
本明細書に使用される、癌としては、白血病、脳癌、前立腺癌、肝癌、卵巣癌、胃癌、結腸直腸癌、咽喉癌、乳癌、皮膚癌、メラノーマ、肺癌、肉腫、子宮頸癌、精巣癌、膀胱癌、内分泌癌、子宮内膜癌、食道癌、神経膠腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、膵癌、下垂体癌、腎癌等が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、本明細書に記載される方法は、DNA損傷剤、DNA修復標的療法剤、DNA損傷シグナリングの阻害剤、DNA損傷誘導性の細胞周期停止の阻害剤、およびDNA損傷を間接的にもたらすプロセスの阻害等のクラスであるが、これらのクラスに限定されない、化学療法剤により治療される癌を指す。これらの化学療法剤のそれぞれは、これらの用語が本明細書に使用されるように、「DNA損傷治療剤」と見なされる。
「生体試料」、「試料」、および「試験試料」は、個体より入手さるか、またはそうでなければ個体に由来する任意の材料、生体液、組織、もしくは細胞を指すために本明細書で相互交換可能に使用される。これには、血液(全血、白血球、末梢血単核球、バフィーコート、血漿、および血清が含まれる)、喀痰、涙液、粘液、鼻洗浄液、鼻吸引液、呼気、尿、精液、唾液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、滑液、関節吸引液、細胞、細胞抽出物、および脳脊髄液が含まれる。これには、先述のすべての実験的に分離した画分も含まれる。例えば、血液試料は、血清へ、または赤血球細胞または白血球細胞(白血球)のような特別な種類の血液細胞を含有する画分へ分画することができる。所望されるならば、試料は、組織と体液試料の組み合わせのように、個体からの試料の組み合わせであり得る。「生体試料」という用語は、例えば、大便試料、組織試料、または組織生検に由来するような、均質化した固体材料を含有する材料も含まれる。また、「生体試料」という用語には、組織培養物または細胞培養物に由来する材料も含まれる。生体試料を得るために任意の好適な方法を使用してもよく、例示的な方法には、例えば、瀉血、スワブ(例、頬内スワブ)、および微細針吸引生検法が含まれる。試料はまた、例えば、顕微解剖(例えばレーザー捕捉顕微解剖(LCM)またはレーザー顕微解剖(LMD))、膀胱洗浄、塗抹標本(例えばPAP塗抹標本)、または乳管洗浄によって採取することもできる。個体より入手されるか、またはそれに由来する「生体試料」には、個体から入手した後で任意の好適な様式で処理されたような、任意のそのような試料も含まれる。
そのような場合には、標的細胞は、腫瘍細胞、例えば、結腸癌細胞または胃癌細胞であり得る。標的細胞は、新たに入手した試料、冷凍試料、生検試料、体液試料、血液試料、パラフィン包埋した固定組織試料(即ち、組織ブロック)等の保存組織、または細胞培養物等であるが、これらに限定されない、ヒトおよび動物組織を含む任意の組織起源に由来する。
方法およびキット
遺伝子発現解析のためのキット
本明細書に記載される方法を行うための試薬、ツール、および/または指示書がキット中に提供され得る。例えば、キットは、癌患者に対する適切な療法を決定するための試薬、ツール、および指示書を含有することができる。そのようなキットは、患者から例えば生検等によって組織試料を収集するための試薬および組織を処理するための試薬を含むことができる。また、キットは、患者の試料中のバイオマーカーの発現レベルを決定するためにRT−PCR、qPCR、ノーザンブロット、プロテオーム解析、または免疫組織化学を行うための試薬等のバイオマーカー発現解析を行うための1つ以上の試薬も含むことができる。例えば、RT−PCRを行うためのプライマー、ノーザンブロットを行うためのプローブ、ならびに/またはウエスタンブロット、免疫組織化学、およびELISA解析等のプロテオーム解析を行うための抗体がそのようなキットに含まれ得る。アッセイに適切な緩衝液も含めることができる。これらのアッセイのいずれかに必要とされる検出試薬も含めることができる。適切な試薬および方法は、以下に更に詳細に説明される。
本明細書に特徴付けられるキットはまた、バイオマーカー発現を測定するためのアッセイを行う方法を説明する指示シートを含むこともできる。指示シートはまた、参照コホートのバイオマーカーの発現レベルの決定方法、および試験患者と比較するための参照を確立するための発現データの収集方法を含む、参照コホートの決定方法のための指示書を含むこともできる。指示シートはまた、試験患者においてバイオマーカー発現をアッセイすることと、発現レベルを参照コホートの発現と比較し、試験患者に対して適切な化学療法を決定することに関する指示書を含むこともできる。適切な化学療法を決定するための方法が上述され、指示シート中に詳細に説明することができる。
キットに含まれる情報材料は、本明細書に記載される方法および/または本明細書に記載される方法のための試薬の使用に関する説明、指示、マーケティング、または他の材料であり得る。例えば、キットの情報材料は、例えば、キットのユーザが遺伝子発現解析の実施および結果の解釈、特に、特定の治療剤に対して陽性応答を有するヒトの可能性に応用するときに関する実質的な情報を得ることができる、住所、電子メールアドレス、ウェブサイト、または電話番号等の連絡先を含むことができる。
本明細書に特徴付けられるキットはまた、バイオマーカー発現から特定の治療剤に対して陽性応答を有する患者の可能性を推測するのに必要なソフトウェアを含むこともできる。
a)遺伝子発現プロファイリング法
生体試料中のmRNAの測定は、生体試料中の対応するタンパク質のレベルの検出の代用として使用され得る。したがって、本明細書に記載されるバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルのいずれかはまた、適切なRNAを検出することによって検出することもできる。遺伝子発現プロファイリングの方法としては、マイクロアレイ、RT−PCT、qPCR、ノーザンブロット、SAGE、質量解析法が挙げられるが、これらに限定されない。
mRNA発現レベルは、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR、続いて、qPCR)によって測定される。RT−PCRを使用して、mRNAからcDNAを創出する。cDNAをqPCRアッセイに使用して、DNA増幅プロセスが進行するにつれて蛍光を産生することができる。標準曲線への比較によって、qPCRは、細胞当たりのmRNAのコピー数等の絶対測定値を測定することができる。ノーザンブロット、マイクロアレイ、インベーダーアッセイ、およびキャピラリー電気泳動法と組み合わせたRT−PCRはすべて、試料中のmRNAの発現レベルを測定するために使用されている。Gene Expression Profiling:Methods and Protocols,Richard A.Shimkets,editor,Humana Press,2004を参照のこと。
miRNA分子は、非翻訳領域であるが、遺伝子発現を調節する可能性がある低分子RNAである。mRNA発現レベルの測定に適した方法のいずれも、対応するmiRNAに使用することができる。最近、多くの研究室が、疾患のバイオマーカーとしてのmiRNAの使用を検討している。多くの疾患は広範囲の転写調節を伴うので、miRNAがバイオマーカーとしての役割を見出すことは驚きではない。miRNA濃度と疾患の間の関連は、タンパク質レベルと疾患の間の関連よりずっと明らかでないことが多いが、それでもmiRNAバイオマーカーの価値は、実質的であるかもしれない。当然ながら、疾患の間に差次的に発現されるいかなるRNAとも同様に、インビトロ診断製品の開発が直面する課題には、miRNAが疾患細胞においても存続して、解析のために容易に抽出される、またはmiRNAが血液または他のマトリックス中へ放出されて、そこで測定されるのに十分長く存続しなければならないという必要条件が含まれるものである。タンパク質バイオマーカーにも同様の必要条件があるが、多くの潜在的なタンパク質バイオマーカーは、疾患の間に、病態および機能の部位で、傍分泌の形式で意図的に分泌される。多くの潜在的なタンパク質バイオマーカーは、その内部でそのタンパク質が合成される細胞の外側で機能するように設計されている。
遺伝子発現はまた、質量分析法を用いて評価され得る。多様な配置の質量分析計を使用して、バイオマーカー値を検出することができる。数種の質量分析計が利用可能であるか、または様々な配置で製作することができる。一般に、質量分析計は、以下の主要な構成要素を有する:試料注入口、イオン発生源、質量分析計、検出器、真空システム、および機器制御システム、およびデータシステム。一般に、試料注入口、イオン発生源、および質量分析計の違いにより、機器の種類とその能力を明確にする。例えば、注入口は、毛細管−カラム液体クロマトグラフィー源であり得るか、またはマトリックス支援レーザー脱離に使用されるような直接プローブまたはステージであり得る。一般的なイオン発生源は、例えば、ナノスプレーおよびマイクロスプレーが含まれるエレクトロスプレー、またはマトリックス支援レーザー脱離である。一般的な質量分析計には、四重極質量フィルタ、イオントラップ質量分析計、および飛行時間型質量分析計が含まれる。当該技術分野では、追加の質量分析法の方法が公知である(Burlingame et al.,Anal.Chem.70:647R−716R(1998)、Kinter and Sherman,New York(2000)を参照)。
タンパク質バイオマーカーとバイオマーカー値は、以下のいずれによって検出および測定することができる:エレクトロスプレーイオン化質量分析法(ESI−MS)、ESI−MS/MS、ESI−MS/(MS)n、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法(MALDI−TOF−MS)、表面増強レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析法(SELDI−TOF−MS)、シリコン上の脱離/イオン化(DIOS)、二次イオン質量分析法(SIMS)、四重極飛行時間型(Q−TOF)、ウルトラフレックスIII TOF/TOFと呼ばれるタンデム飛行時間型(TOF/TOF)技術、大気圧光イオン化質量分析法(APCI−MS)、APCI−MS/MS、APCI−(MS)、大気圧光イオン化質量分析法(APPI−MS)、APPI−MS/MS、およびAPPI−(MS)、四重極質量分析法、フーリエ変換質量分析法(FTMS)、定量的な質量分析法、およびイオントラップ質量分析法。
タンパク質バイオマーカーの特徴付けとバイオマーカー値の測定の前に、試料調製ストラテジーを使用して試料を標識して濃縮する。標識法としては、相対および絶対定量用等圧タグ(iTRAQ)と細胞培養中のアミノ酸の安定同位体標識(SILAC)が含まれるが、これらに限定されない。質量分光分析に先立って、候補バイオマーカータンパク質のために試料を選択的に濃縮するために使用される捕捉試薬としては、アプタマー、抗体、核酸プローブ、キメラ、低分子、F(ab’)断片、単鎖抗体断片、Fv断片、単鎖Fv断片、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、アフィボディ、ナノボディ、アンキリン、ドメイン抗体、代替抗体スカフォールド(例えばダイアボディ等)、印字ポリマー、アビマー、ペプチド模倣体、ペプトイド、ペプチド核酸、トレオース核酸、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、および合成受容体、ならびにこれらの修飾物および断片が含まれるが、これらに限定されない。
上述のアッセイは、癌治療剤の応答性を予測するための方法において有用であるバイオマーカー値の検出を可能にし、本方法は、個体からの生体試料において、表1または2に提供されるバイオマーカーからなる群から選択されるバイオマーカーにそれぞれ対応する少なくともN個のバイオマーカー値を検出することを含み、以下に詳しく記載するような分類が、そのバイオマーカー値を使用して、その個体が治療剤に対して応答性であるか否かを示す。ある種の記載される予測バイオマーカーは、治療剤に対する応答性を予測するために単独で有用であるが、2つ以上のバイオマーカーのパネルとしてそれぞれ有用であるバイオマーカーの複合サブセットの群分けのための方法も本明細書に記載される。したがって、本出願の様々な実施形態は、N個(Nが少なくとも3つのバイオマーカーである)のバイオマーカーを含む組合せを提供する。Nは、上記の範囲のいずれかからだけでなく、同様の、しかしより高い次数の範囲からの任意の数であるように選択され得ることが理解されよう。本明細書に記載される方法のいずれかに従って、バイオマーカー値を個別に検出して分類することができ、あるいは、例えばマルチプレックスアッセイフォーマットにおけるように、それらを集合的に検出して分類することができる。
b)マイクロアレイ法
一実施形態において、本発明は、「オリゴヌクレオチドアレイ」(本明細書では「マイクロアレイ」とも称される)を使用する。マイクロアレイは、細胞中のバイオマーカーの発現を分析する、特に癌組織のバイオマーカーの発現を測定するために使用され得る。
一実施形態において、バイオマーカーアレイは、マイクロアレイに、細胞中に存在するmRNA転写物(例えば、全細胞mRNAまたは標識cRNAから合成された蛍光標識cDNA)を示す検出可能に標識されるポリヌクレオチドをハイブリダイズすることによって製作される。マイクロアレイは、細胞または生物のゲノム中の多くの遺伝子、好ましくはほとんどまたはほぼすべての遺伝子の産物のための結合(例えば、ハイブリダイゼーション)部位の順序付けられたアレイを有する表面である。マイクロアレイは、当該技術分野において既知の多くの方法において作製され得る。しかしながら、製作されたマイクロアレイは、ある特定の特徴付けを共有する。本アレイは、再生可能であり、これにより、特定のアレイの多数のコピーを製作し、互いに容易に比較することを可能にする。好ましくは、マイクロアレイは、小さい、通常5cmより小さく、それらは結合(例えば、核酸ハイブリダイゼーション)条件下で安定している材料から作製される。マイクロアレイ中の特定の結合部位または結合部位の特有のセットが、細胞中の単一細胞の産物を特異的に結合する。特定の実施形態において、それぞれの位置で既知の配列の付加された核酸を含有する位置を指定可能なアレイが使用される。
細胞のRNAに相補的なcDNAが作製され、好適なハイブリダイゼーション条件下でマイクロアレイにハイブリダイズされるとき、任意の特定の遺伝子に対応するアレイ中の部位に対するハイブリダイゼーションのレベルがその遺伝子/バイオマーカーから転写されたmRNAの細胞における出現率に反映することが理解されるだろう。例えば、全細胞mRNAに相補的な検出可能に標識された(例えば、フルオロフォアを用いて)cDNAまたはcRNAがマイクロアレイにハイブリダイズされるとき、細胞において転写されない遺伝子に対応するアレイ上の部位(即ち、遺伝子の産物を特異的に結合可能である)は、シグナル(例えば蛍光シグナル)をほとんどまたは全くなく、コードされたmRNAがまん延している遺伝子は、比較的強いシグナルを有する。核酸ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、プローブが特定のアレイ部位に対して「特異的に結合する」または「特異的にハイブリダイズする」ように、即ち、プローブが相補的核酸配列を有する配列アレイ部位に対してハイブリダイズする、二重鎖を形成するか、または結合するが、非相補的核酸配列を有する部位とはハイブリダイズしないように選択される。本明細書に使用される1つのポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチドのうちの短い方が25塩基と等しいかそれ未満であれば、標準的な塩基対合則を用いてミスマッチがない場合、またはポリヌクレオチドのうち短い方が25塩基より長ければ、ミスマッチが5%を上回らない場合には、別のポリヌクレオチド配列に対して相補的であるとみなされる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、完全に相補的である(ミスマッチがない)。特異的なハイブリダイゼーション条件は、日常の実験を用いて、陰性対照を含むハイブリダイゼーションアッセイを行うことによって特異的なハイブリダイゼーションをもたらすことを示すことができる。
最適なハイブリダイゼーション条件は、標識プローブおよび固定化されたポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの長さ(例えば、オリゴマー対200塩基を上回るポリヌクレオチド)および種類(例えば、RNA、DNA、PNA)によって異なる。核酸に関する特異的(即ち、ストリンジェントな)ハイブリダイゼーション条件のための一般的なパラメータは、Sambrook et al.、上記およびAusubel et al.,“Current Protocols in Molecular Biology”,Greene Publishing and Wiley−interscience,NY(1987)(これはすべての目的においてその全体が組み込まれる)に記載されている。cDNAマイクロアレイが使用されるとき、典型的なハイブリダイゼーション条件は、0.2% SDSを加えた5×SSC中、65℃で4時間のハイブリダイゼーション、続いて、低ストリンジェンシー洗浄緩衝液(0.2% SDSを加えた1×SSC)中、25℃で、続いて、高ストリンジェンシー洗浄緩衝液(0.2% SDSを加えた0.1SSC)中、25℃で10分間である(Shena et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.93,p.10614(1996)を参照)。有用なハイブリダイゼーション条件はまた、例えば、Tijessen,“Hybridization With Nucleic Acid Probes”,Elsevier Science Publishers B.V.(1993)およびKricka,“Nonisotopic DNA Probe Techniques”,Academic Press,San Diego,Calif.(1992)にも提供されている。
c)免疫学的検定法
イムノアッセイ法は、その対応する標的または分析物に対する抗体の反応に基づいており、特定のアッセイフォーマットによって異なる試料中の分析物を検出することができる。免疫反応性に基づいたアッセイ法の特異性および感受性を改善するために、モノクローナル抗体が、しばしば、それらの特異的なエピトープ認識のため使用される。ポリクローナル抗体はまた、モノクローナル抗体と比較して、標的に対する親和性の増加のため様々なイムノアッセイにおいて首尾よく使用されている。イムノアッセイは、広範囲の生体試料マトリックスと一緒の使用のために設計されている。イムノアッセイフォーマットは、定性的、半定量的、および定量的な結果をもたらすように設計されている。
検出される特異的な分析物の既知濃度で創出される標準曲線の使用により、定量的な結果が得られ得る。未知の試料からの応答またはシグナルを標準曲線上にプロットして、未知の試料中の標的に対応する量または値が確定される。
多くのイムノアッセイフォーマットが設計されている。ELISAまたはEIAは、分析物/バイオマーカーの検出について定量的であり得る。この方法は、分析物または抗体のいずれかへの標識の付着に依存して、標識成分は、間接的または直接的に酵素を含む。ELISA検定は、分析物の直接的、間接的、競合的、またはサンドイッチ検出用にフォーマット化され得る。他の方法は、例えば、放射性核種(I125)または蛍光等の標識に依存する。更なる技術には、例えば、凝集、ネフェロメトリー、比濁法、ウエスタンブロット、免疫沈降、免疫細胞化学、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ルミネックスアッセイ、その他が含まれる(ImmunoAssay:A Practical Guide,edited by Brian Law,published by Taylor & Francis,Ltd.,2005 edition)。
例示のアッセイフォーマットには、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ、蛍光、化学発光、および蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、または時間分解FRET(TR−FRET)イムノアッセイが含まれる。バイオマーカーを検出するための手順の例には、バイオマーカーの免疫沈降、続いて、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、平面電気クロマトグラフィー等のサイズおよびペプチドレベルの区別を可能にする定量的な方法が含まれる。
検出可能な標識またはシグナル発生材料を検出する、および/または定量する方法は、標識の性質に依存する。適切な酵素によって触媒される反応の産物(検出可能な標識は、酵素である、上記参照)は、蛍光性、発光性、または放射活性であるが、これらに限定され得ず、それらは、可視光線または紫外線を吸収してもよい。そのような検出可能な標識を検出するのに適している検出器の例としては、X線フィルム、放射活性カウンター、シンチレーションカウンター、分光光度計、比色計、蛍光光度計、照度計、および濃度計が含まれるが、これらに限定されない。
検出方法のいずれも、反応物の任意の好適な調製、処理、および分析を可能にする任意のフォーマットにおいて実施することができる。これは、例えば、マルチウェルアッセイプレート(例えば96ウェルまたは384ウェル)中であっても、または任意の好適なアレイもしくはマイクロアレイを使用してもよい。様々な薬剤のストック溶液を手動またはロボットで作製することができ、そしてすべてのピペット操作、希釈、混合、分配、洗浄、インキュベーション、試料の読出し、データ採取、および分析は、検出可能な標識を検出することが可能な市販の分析ソフトウェア、ロボット工学、および検出機器を使用して、ロボットで行うことができる。
臨床用途
いくつかの実施形態において、治療レジメンに対して応答する癌患者を特定および/または選択するための方法が提供される。特に、本方法は、DNAを直接的または間接的に損傷する薬物を投与することを含む治療レジメンに対して応答する癌患者を特定および/または選択することを対象とする。また、治療レジメンに対して応答しない患者を特定するための方法も提供される。これらの方法には、一般に、患者の腫瘍(一次、転移性、または、例えば血液、もしくは血液成分、尿、唾液、および他の体液を含むがこれらに限定されない腫瘍由来のその他の派生物)(例えば患者の癌細胞)において予測マーカーの集合の発現レベルを決定することと、発現レベルを参照発現レベルと比較することと、試料中の発現が、治療剤に対する応答性または非応答性に対応する選択された予測バイオマーカーもしくはバイオマーカーセットの発現パターンもしくは発現プロファイルを含むか否かを特定することと、が含まれる。
いくつかの実施形態において、DNA損傷治療剤への個体の応答性の予測方法には、個体からの試験試料を得るステップと、試験試料中の1つ以上のバイオマーカーであって、CXCL10、MX1、IDO1、IF144L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、およびAPOL3からなる群から選択される、1つ以上のバイオマーカーの発現レベルを測定するステップと、発現レベルを捕捉する試験スコアを導出するステップと、試験スコアと応答性とを相互に関連付ける情報を含む閾値スコアを提供するステップと、試験スコアを閾値スコアと比較するステップであって、試験スコアが閾値スコアを超えるとき、応答性が予測される、比較するステップと、を含む。当業者は、実施例1の教示を含む本明細書に提供される教示を用いて、適切な閾値スコア、および適切なバイオマーカーの重み付けを決定することができる。
他の実施形態において、DNA損傷治療剤に対する個体の応答性の予測方法は、試験試料中の1つ以上のバイオマーカーの発現レベルを測定することを含み、1つ以上のバイオマーカーは、CXCL10、MX1、IDO1、IF144L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A、およびAL137218.1からなる群から選択される。表2Aおよび2Bは、例示的な遺伝子シグネチャー(または遺伝子分類子)を提供し、それらバイオマーカーはそれぞれ、その中に記載される40または44個の遺伝子産物からなり、閾値スコアは、その中に記載される個々の遺伝子産物重み付けに由来する。バイオマーカーが表2Bに記載される44個の遺伝子産物からなるこれらの実施形態のうちの1つにおいて、バイオマーカーは、表2Bに提供される重み付けと関連し、0.3681の閾値スコアを超える試験スコアが、個体がDNA損傷治療剤に対して応答性である可能性を示す。
癌は、治療剤との接触がない状態でのその成長と比較して、治療剤との接触の結果としてその成長速度が抑制される場合に、治療剤に対して「応答性」である。癌の成長は、様々な方法で測定することができ、例えば、腫瘍のサイズまたはその腫瘍型に適切な腫瘍マーカーの発現が測定され得る。
癌は、治療剤との接触がない状態でのその成長と比較して、その成長速度が治療剤との接触の結果として抑制されない、または非常に低い程度で抑制される場合、治療剤に対して「非応答性」である。上述のように、癌の成長は、様々な方法で測定することができ、例えば、腫瘍のサイズまたはその腫瘍型に適切な腫瘍マーカーの発現が測定され得る。異なる癌は異なる条件下で特定の治療剤に対して異なるレベルの「非応答性」を示し、治療剤に対して非応答性であるという性質は極めて変わりやすいものである。更に、非応答性の測定は、患者の生活の質、転移の程度等を含む、腫瘍の成長サイズを超えた更なる判定基準を用いて評価することができる。
この試験の適用は、全生存、無増悪生存率、放射線応答、RECISTによって定義されるもの、完全応答、部分的応答、安定疾患、ならびにPSA、CEA、CA125、CA15−3、およびCA19−9等であるがこれらに限定されない血清学的マーカー等の、評価項目を予測する。
代替として、RNA、DNA、もしくは1つ以上の核酸の試料内のタンパク質、またはコードされたタンパク質等のそれらの生物学的誘導体の検出、定量化、および適格性のための非アレイベースの方法が使用され得、これには定量的PCR(QPCR)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、または免疫組織化学(IHC)等が含まれる。
アッセイされる試料から発現プロファイルを得た後、発現プロファイルは、参照または対照プロファイルと比較され、試料を得た元の細胞または組織、そしてひいては宿主の、療法応答性表現型に関する診断を行う。発現プロファイルに関して本明細書に使用される「参照」および「対照」という用語は、所与の患者の発現分類子を解釈し、予後または予測クラスを割り当てるために使用される、遺伝子もしくは遺伝子産物発現の標準化されたパターンまたはある種のバイオマーカーの発現レベルを意味する。参照または対照発現プロファイルは、所望の表現型、例えば応答表現型を有することが知られている試料から得られるプロファイルであり得、それ故に、陽性の参照または対照プロファイルであり得る。加えて、参照プロファイルは、所望の表現型を有さないことが知られている試料からのものであり得、それ故に、陰性の参照プロファイルであり得る。
定量的PCRが1つ以上の核酸のレベルを定量化する方法として使用される場合、この方法は、二重標識した蛍光性プローブ(即ち、TaqMan(登録商標)プローブ)によって放出された蛍光の測定によってPCR産物の蓄積を定量化する。
ある実施形態において、得られた発現プロファイルは、単一の参照プロファイルと比較され、アッセイされる試料の表現型に関する情報を得る。なお他の実施形態において、得られた発現プロファイルは、2つ以上の異なる参照プロファイルと比較され、アッセイされた試料の表現型に関するより詳細な情報を得る。例えば、得られた発現プロファイルは、陽性および陰性参照プロファイルと比較され、試料が対象となる表現型を有するかどうかに関する確認された情報を得ることができる。
得られた発現プロファイルと1つ以上の参照プロファイルの比較は、任意の便利な手法を用いて行われ得、例えば、発現プロファイルのデジタル画像を比較することによる、発現データのデータベースを比較すること等による様々な手法が当業者に知られている。発現プロファイルの比較方法を説明する特許としては、米国特許第6,308,170号および第6,228,575号が挙げられるが、これらに限定されず、これらの開示は参照によって本明細書に組み込まれる。また、発現プロファイルの比較方法も上述される。
比較ステップは、得られた発現プロファイルが1つ以上の参照プロファイルとどれほど類似しまたは類似していないかに関する情報をもたらし、この類似性情報を使用して、アッセイされる試料の表現型を決定する。例えば、陽性対照との類似は、アッセイした試料が、応答性参照試料と同様の応答性表現型を有することを示す。同様に、陰性対照との類似は、アッセイした試料が、非応答性参照試料と同様の非応答性表現型を有することを示す。
バイオマーカーの発現レベルは、異なる参照発現レベルと更に比較することができる。例えば、参照発現レベルは、バイオマーカーまたはバイオマーカーセットの発現が情報を提供するかどうかを評価し、患者が応答性であるかそれとも非応答性であるかを判定するための評価を行うために、既定の標準的な参照発現レベルであり得る。更に、バイオマーカーの発現レベルの決定を、そのバイオマーカーと同時に測定される内部参照マーカーの発現レベルと比較し、患者が応答性であるかそれとも非応答性であるかの判定するための評価を行うことができる。例えば、本発明のバイオマーカーは含まれないが、一定の発現レベルを示すことが知られている異なるマーカーパネルの発現を、内部参照マーカーレベルとして評価することができ、バイオマーカー発現レベルはこの参照物と比較して判定される。代替の例において、非腫瘍試料である組織試料中の選択されたバイオマーカーの発現を、内部参照マーカーレベルとして評価することができる。ある態様では、バイオマーカーの発現レベルは増加した発現を有するとして決定され得る。他の態様では、バイオマーカーの発現レベルは、減少した発現を有するとして決定され得る。発現レベルは、参照レベルと比較して、情報を与える発現変化ではないとして決定され得る。なお他の態様において、発現レベルは、本明細書に提供される方法によって決定される既定の標準的発現レベルに対して決定される。
本発明はまた、患者の従来型治療を誘導することに関するものである。診断試験がDNA損傷および/またはDNA損傷修復に直接的または間接的に影響を及ぼすクラスの薬物への応答者であることを示す患者には、その療法が施行され得、患者および癌科医師の両方が、その患者が利益を得ることを確信し得る。診断試験によって非応答者であることを示される患者は、利益を与える可能性がより高い代替の療法に向いていると特定され得る。
本発明は更に、DNA損傷および/またはDNA損傷修復に直接的または間接的に影響を及ぼすクラスの新規薬物の臨床試験のために患者を選択することに関する。潜在的な応答者で試験集団を富ませることは、関連判定基準下でのその薬物のより完全な評価を促進する。
本発明は、なお更に、DNA損傷応答欠損(DDRD)に関連する癌に罹患している、またはその癌を発症しやすい患者の診断方法に関する。DDRDは、患者の1つまたは複数の細胞がDNA損傷を修復する能力の低下を有する状態として本明細書に定義され、この能力の低下が腫瘍の発症または成長において原因因子となる。DDRDの診断は、ファンコニ貧血/BRCA経路における突然変異と関連があり得る。DDRDの診断はまた、乳癌または卵巣癌とも関連し得る。これらの診断方法は、個体から試験試料を得るステップと、試験試料中の1つ以上のバイオマーカーであって、CXCL10、MX1、IDO1、IF144L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、およびAPOL3からなる群から選択される、1つ以上のバイオマーカーの発現レベルを測定するステップと、発現レベルを捕捉する試験スコアを導出するステップと、試験スコアと癌の診断とを相互に関連付ける情報を含む閾値スコアを提供するステップと、試験スコアを閾値スコアと比較するステップと、を含み、試験スコアが閾値スコアを超えるとき、個体は、上記癌に罹患しているか、または上記癌を発症しやすいと判定される。当業者は、実施例1の教示を含む本明細書に提供される教示を用いて好適な閾値スコア、および好適なバイオマーカーの重み付けを決定することができる。
他の実施形態において、DDRDと関連する癌に罹患している、またはその癌を発症しやすい患者の診断方法は、試験試料中の1つ以上のバイオマーカーであって、CXCL10、MX1、IDO1、IF144L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、APOL3、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A、およびAL137218.1からなる群から選択される、1つ以上のバイオマーカーの発現レベルを測定することを含む。表2Aおよび2Bは、例示的な遺伝子シグネチャー(または遺伝子分類子)を提供し、バイオマーカーはそれぞれ、その中に記載される40または44個の遺伝子産物からなり、閾値スコアは、その中に記載される個々の遺伝子産物重み付けに由来する。バイオマーカーが表2Bに記載される44個の遺伝子産物からなるこれらの実施形態のうちの1つにおいて、バイオマーカーは、表2Bに提供される重み付けと関連し、0.3681の閾値スコアを超える試験スコアは、癌の診断または癌を発症しやすいという診断を示す。
以下の実施例は、限定のためではなく、例解のために提供される。
[実施例1]
組織処理、階層クラスター分析、サブタイプの特定、および分類子の開発
腫瘍材料
本方法において有用であると決定された遺伝子(表2)は、Mayo Clinic Rochesterから供給された107個のマクロ摘出された乳房腫瘍FFPE組織試料のコホートの遺伝子発現分析から特定された。本研究に対する倫理的承認は、施設内治験審査委員会(Institutional Review Board)およびOffice of Research Ethics Northern Irelandから得られた。
この試料のコホートは、以下の通りに更に説明することができる:
○47個の試料は、BRCA1およびBRCA2について野生型であった、即ち、生物学的に機能的なBRCA1およびBRCA2タンパク質を発現した。これらの試料は、以下、散発性対照と呼ぶ。
○31個の試料は、BRCA1突然変異体であった、即ち、生物学的に機能的なBRCA1タンパク質を発現しなかった。
○29個の試料は、BRCA2突然変異体であった、即ち、生物学的に機能的なBRCA2タンパク質を発現しなかった。
遺伝子発現プロファイリング
全RNAを、Roche High Pure RNA Paraffin Kit(Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany)を用いて、マクロ摘出されたFFPE腫瘍試料から抽出した。全RNAを、NuGEN WT−Ovation(商標)FFPE System(NuGEN Technologies Inc.,San Carlos,CA,USA)を用いて増幅した。次いで、増幅された一本鎖cDNAを断片化し、FL−Ovation(商標)cDNA Biotin Module V2(NuGEN Technologies Inc.)を用いてビオチン標識した。次いで、それをAlmac Breast Cancer DSA(商標)にハイブリダイズさせた。AlmacのBreast Cancer DSA(商標)研究ツールは、FFPE組織試料の分析のために最適化され、有益なアーカイブ組織バンクの使用を可能にする。Almac Breast Cancer DSA(商標)研究ツールは、正常および癌性乳房組織の両方におけるトランスクリプトームを示す革新的なマイクロアレイプラットフォームである。それ故に、Breast Cancer DSA(商標)は、一般的なマイクロアレイプラットフォームを用いた場合には利用できない、乳房の疾患および組織設定内のトランスクリプトームの包括的な表示を提供する。アレイは、Affymentrix Genechip(登録商標)Scanner 7G(Affymetrix Inc.,Santa Clara,CA)を用いて走査した。
データの調製
プロファイル化した試料の品質管理(QC)は、MAS5前処理アルゴリズムを用いて実行された。異なる技術的側面が対処された:平均ノイズおよびバックグラウンドの均質性、存在判定のパーセンテージ(アレイ品質)、シグナル品質、RNA品質、およびハイブリダイゼーション品質。対応するパラメータの分散および中央値絶対偏差を分析し、可能な異常値を特定することに使用した。
Almacの卵巣癌DSA(商標)は、ポリヌクレオチドの3’末端から300ヌクレオチド内の領域を主に標的とするプローブを含む。したがって、標準的なAffymetrix RNAの品質測定を適応させた。つまり、ハウスキーピング遺伝子については、3’末端プローブセットの強度と共に、通常の3’/5’比に加えて、平均バックグラウンド強度に対する3’末端プローブセット強度の比を使用した。ハイブリダイゼーション対照をチェックして、それらの強度および存在判定がAffymetrixによって特定された要件に適合することを確認した。
BRCA1/2突然変異および散発性対照のトレーニングセットからの腫瘍試料を、ESR1(エストロゲン受容体1)の転写レベルに基づいて2つのデータセットに分割した。それぞれの試料についてのmRNA発現レベルE平均は、すべてのESR1プローブセット(BRAD.15436_s_at、BRAD.19080_s_at、BREM.1048_at、BRIH.10647C1n2_at、BRIH.5650C1n2_at、BRPD.10690C1n5_at、BRRS.81_at、およびBRRS.81−22_at)の平均発現によって決定した。mRNA中央値発現(Eすべての中央値)を、すべての試料について計算した。試料は、E平均−Eすべての中央値が0.5を超えるとき、ER陽性であり、E平均−Eすべての中央値が0.5を下回るとき、ER陰性であると見なされた。
前処理は、Robust Multi−array Analysis(RMA)(Irizarry et al.,2003)を用いて発現コンソールv1.1において行われ、それぞれ、56個のおよび51個の試料からなるER陽性およびER陰性試料の2つのデータマトリックスをもたらした。アレイ品質と関連する分散を除去するために、Alterによって記述されたように更なる変換を行った(Alter et al.,2000)。
特徴(feature)選択
複合型バックグラウンド&分散フィルタをそれぞれのデータマトリックスに適用して、最も変動しているプローブセットを特定した。バックグラウンドフィルタは、バックグラウンド標準偏差σBg(Expression Consoleソフトウェアより)によって定義された閾値を超える発現Eおよび発現分散varを有するプローブセットの選択に基づき、特定された有意性aでの標準正規分布の変位値zを有するプローブセットが、以下である場合維持された。

E>log((zσBg))、log((var)>2[log(σBg)−E−log(log(2))]

式中、有意閾値はa=6.3.10−5であり、選択されたプローブセットおよびそれらの遺伝子注釈の一覧については表1を参照されたい。
階層クラスター分析
階層クラスター分析法を、卵巣癌DSA(商標)(疾患特異的アレイ)プラットフォームを用いて分析された199個の上皮性漿液卵巣腫瘍からのマイクロアレイデータに適用した(図1)。生の発現データは、標準的なRobust Multichip Algorithm(RMA)手順を用いて前処理された。データセット中の非生物学的系統的分散が特定され、除去された。発現レベルが腫瘍ごとに有意に変化したプローブセットが特定された。これらのプローブセットが固有リストを形成した。
2次元クラスター分析(腫瘍、プローブセット)を行い、固有リストに基づく腫瘍関係性を確立した。階層凝集型クラスタリングを適用した(ピアソン相関距離およびWard連結)。GAP指数(Tibshirani et al.,2002,J.R.Stat.Soc.,63:411−423)を用いて最適な分割数が選択された。サブクラスターにおいて利用可能なすべてのプローブセットが、遺伝子名に対してマッピングされた。
遺伝子クラスターの機能分析
プローブセットのクラスターの機能的意義を確立するために、プローブセットを、遺伝子(Entrez gene ID)に対してマッピングし、超幾何関数(False Discovery Rate適用(Benjamini and Hochberg,1995,J.R.Stat.Soc.57:289:300))に基づいた濃縮分析を行った。生物学的なプロセスおよび経路の過剰出現は、GeneGo(登録商標)からのMetacore(商標)単一実験分析ワークフローを用いて、ER陽性およびER陰性の試料の両方についての階層クラスタリングによって生成されたそれぞれの遺伝子群に対して分析された。アンチセンスプローブセットはこの分析から除外された。それぞれの濃縮された機能エンティティクラスについて超幾何学的p値が評価された。最大p値を有する機能エンティティクラスが群の代表として選択され、これらの機能エンティティを示す一般的機能カテゴリーが、出現の有意性(即ち、p値)に基づいて遺伝子クラスターに割り当てられた。
IFN/DDの一般的な機能項目に関して濃縮されたクラスター中の遺伝子は、DNA損傷応答欠損(DDRD)試料群にグループ化され、分類子生成のために使用された。IFN/DDの一般的な機能項目によって示されるER陽性およびER陰性のデータセットからの試料クラスターは、分類のために選択され、DDRDと呼ばれた。これらの機能項目によって示されないものは、非DDRDと呼ばれた。
プローブセットレベルでの分類子の開発
DDRDのサブグループを形成する腫瘍のクラスを特定した後、機能的なDDRD遺伝子のリスト(表1)を参照して、これらの腫瘍対腫瘍コホート中のその他すべて(非DDRD)の計算的分類を行い、DDRDサブグループを分類する詳細な遺伝子分類モデルを特定した。これは、以下の選択肢のすべての組合せ(合計18)を用いて評価された:
●3つの試料セット
○ER陰性とER陽性試料の組み合わせた試料セット(組み合わせた試料セット)
○ER陰性試料のみ
○ER陽性試料のみ
●2つの特徴(feature)セット
○75%の分散/強度のフィルタリングおよびDDRDリストの強制的含有を伴う、全特徴リスト。ここで、両方の平均順位に基づいて、分散および強度の最も低い組合せを有するプローブセットの75%が除去された。使用される「VarInt」という用語は、この選択肢を指す。
○DDRDリストのみ。使用される「リストのみ」という用語は、この選択肢を指す。
●3つの分類アルゴリズム
○PLS(部分最小二乗法)(de Jong,1993)
○SDA(Shrinkage Discriminate Analysis)(Ahdesmaki and Strimmer,2010)
○DSDA(対角線SDA)(Ahdesmaki and Strimmer,2010)
AUCを使用して、異なるモデルの性能を評価した。反復的特徴除去(IFE)がそれぞれのモデルの開発を通して実行され、最大AUCが相互検証にわたって最適な数の特徴(feature)を選択する際の主な判定基準であった。複数の特徴にわたって明白なAUCの差異がない場合、最小特徴長が選択された。
遺伝子レベルでの分類子の開発
複数のアレイプラットフォームにわたる分類子の検証を促進するために、選択されたプローブセットの分類子を、遺伝子レベルで再生成した。遺伝子レベルでのプローブセット分類子の再開発は、2つの別個のステップを必要とした:
1.プローブセット分類子における固有の遺伝子の発現強度を、アンチセンスのプローブセットを除き、それぞれの遺伝子にマッピングされたプローブセットの中央値から推定した。
2.分類のために使用される分類子パラメータを再推定した。
閾値は、すべての相互検証の予測にわたる最大の感度および特異度に基づいて選択された。
同様に、上位10個の遺伝子(または現在の44遺伝子シグネチャーに存在する任意の数の特徴(feature))についての遺伝子レベルの定義された発現強度を使用して、トレーニングデータセット中の相互検証において分類パラメータを再推定することによって、これらの10個の遺伝子(または現在の44遺伝子シグネチャーに存在する任意の数の特徴)のみに基づく分類子を再開発し、ならびに、すべての相互検証の予測から得られた感度および特異度を評価し、最大化することによって閾値を再構築し得た。この手法は、特徴選択が関与しないことを除いては、より大きな特徴セット(上述)からの作業時に使用される方法と同様である:特徴は同じままであるが、新しい重みが割り当てられる。
検証データセットのための分類子スコアの計算
公的データセット
本分析のために使用されたデータセットは、即ち、FAC1[GEO受入番号GSE20271、(Tabchy et al.,2010)]、FAC2[GEO受入番号GSE22093、(Iwamoto et al.,2011)]、FEC[GEO受入番号GSE6861、(Bonnefoi et al.,2007)]、T/FAC1[http://bioinformatics.mdanderson.org/pubdata.html、(Hess et al.,2006)]、T/FAC2[GEO受入番号GSE16716、(Lee et al.,2010)]、およびT/FAC3[GEO受入番号GSE20271、(Tabchy et al.,2010)]である。FAC1データセットとFAC2データセットとの間では31個の試料において重複があることに留意しなけれならない。これらの試料は、FAC2データセットから除去され、したがって、FAC1、FAC2、およびFECデータセットの組み合わされた分析において、一度だけ含まれた。加えて、試料GSM508092は、転移性リンパ節試料であるため、FAC1から除去された。
すべてのデータセットは、RMA(Irizarry et al.,2003)を用いて前処理された。それぞれの検証セットについて、アンチセンスのプローブセットを除き(該当する場合)、分類子遺伝子にマッピングされるプローブセットが決定された。Affymetrix X3PおよびU133Aアレイについてのアノテーションは、Affymetrixウェブサイトから利用可能である。分類子における各遺伝子にマッピングするすべてのプローブセットにわたる中央値の強度が計算され、遺伝子強度マトリックスがもたらされた。次いで、分類子をこのデータマトリックスに適用し、それぞれの試料についての分類子スコア/予測を産生した。
性能測定基準の計算
NPVおよびPPVを計算するために、それぞれの評価項目(BRCA状態/応答)の出現率が、対応するデータセットにおける各クラスの割合を用いて推定された。
単変量および多変量解析
単変量解析および多変量解析をそれぞれ行い、DDRDの分類子と応答との間の関連性を評価し、関連性がもしあれば、既知の臨床的な予測因子から独立しているかどうか決定した。単変量解析のために表4に示されたp値は、MATLABにおいてロジスティック回帰を使用して計算された。多変量解析については、p値が変数の対数尤度を示す段階的ロジスティック回帰(Dupont、2009)を使用した。対数尤度は、変数のモデルに対するフィットの重要性の尺度であり、故に、他の予測子と比較した予測子としての独立性を強調する。単変量解析および多変量解析の両方において、p値<0.05が、有意性についての判定基準として使用された。更に、臨床的因子が未知である試料は、この評価において除外された。
結果
分類子生成のための試料の選択
本研究の目的は、DNA損傷治療剤に対する病原性細胞の応答性または耐性を判定することが可能な一組の遺伝子をトランスクリプトームレベルで特徴付けることであった。この点を考慮して、Almac乳癌データセット内でこの生物学を最も表した試料が選択され、分類子生成のために残りの試料と比較された(次の項を参照のこと)。ER−ve試料セット内の試料クラスター2からの試料は、BRCA突然変異試料の最大の割合(64%)を示し、最も優性な生物学(IFN/免疫応答)を示したことから、この選択について最も関連性のある試料であることが決定された。ER+ve試料セットの中からは、それぞれ73%および67%のBRCA突然変異腫瘍を有していたことから、試料クラスター2および3からの試料が選択された。加えて、これらのクラスター内で最も優性な生物学は、細胞周期、DNA損傷応答、およびIFN/免疫応答に関連するものであった。免疫シグナリングおよび細胞周期経路は、DNA損傷に応答して変調されると報告されており(Jackson,S.P.,and Bartek,J.,Nature 461,1071−1078(2009)、Rodier,F.,et al.,Nat Cell Biol 11,973−979(2009)、Xu,Y.,Nat Rev Immunol6,261−270(2006))、これらのサブグループを組み合わせて、推定上のDDRDサブグループを形成した。ER−ve試料セットのクラスター2(下述)ならびにER+ve試料セットのクラスター2および3(下述)内の試料は、DDRD(DNA損傷応答欠損)にクラス分類され(図1Aを参照)、一方、ER−ve試料セットの試料クラスター1および3ならびにER+ve試料セットの試料クラスター1、4、5、および6内の試料は、非DDRDにクラス分類された(図1Bを参照)。
ER−ve試料セット:ER−ve試料セット内で、階層クラスター分析は、3つの試料クラスターおよび6つのプローブセットのクラスター群を定義した。プローブセットのクラスター3は、ER−ve試料セット内で最も有意な生物学として特定され、インターフェロンおよび免疫応答シグナリングについて濃縮されていた。
ER+ve試料セット:ER+ve試料セット内で、階層分析は、6つの試料群および6つのプローブセットのクラスター群を定義した。プローブセットのクラスター5は、ER+ve試料セット内で最も有意な生物学として特定され、細胞外マトリックスリモデリングについて濃縮されていた。ER+ve試料セット内の次に最も有意なプローブセットのクラスターは、プローブセットのクラスター6であり、やはりインターフェロンおよび免疫応答シグナリングについて濃縮されていた。
DDRDの分類子モデルの開発および検証
DDRDのサブグループを形成する腫瘍のクラスの同定後、機能的なDDRD(IFN/DNA損傷)の遺伝子のリストを参照して、これらの腫瘍対腫瘍コホート中の他のすべての計算的分類を行い、DDRDのサブグループを分類する詳細な遺伝子分類モデルを特定した。
分類パイプラインを使用して、組み合わされたER−veおよびER+ve乳癌試料のセットを用いてモデルを導出した。この分類パイプラインは、一般に受け入れられた良好な慣例(good practice)に従って開発されたものである[MAQC Consortium,Nat Biotechnol 2010]。このプロセスは、1)経験的データから遺伝子分類モデルの導出、および2)モデルの分類性能の評価を、両方とも相互検証下で、並行して行う。分類子生成の性能および成功は、例えば、分類法またはプローブセットのフィルタリングの選択のような、変化させ得る多くのパラメータに依存する。これを考慮して、(i)75%の分散/強度のフィルタリングを伴う全特徴のリスト(DDRD(IFN/DNA損傷)のリスト(表1)の強制された含有を伴う)、および(ii)DDRD(IFN/DNA損傷)のリストのみという、2つの特徴セットを評価し、3つの分類アルゴリズム、即ち、PLS(部分最小二乗法)、SDA(Shrinkage Discriminate Analysis)、およびDSDA(対角線SDA)を評価した。反復的特徴除去(IFE)は、モデルの開発の全体を通じて使用され、これは、それぞれの反復で最悪の順位付けがされた特徴の画分を除去し、最小数の特性のみが残るときに停止する、反復手順である。この尺度は群間のカットオフおよびデータ中の出現率から独立しているため、AUCと称される受信者動作特性曲線下面積(AUC−ROC)を使用して、分類性能を評価した。それはまた、分類性能に関して選ばれる公認の尺度の1つでもある。したがって、それぞれのモデルについて最適数の特徴が、相互検証下で、平均AUCに基づいて選択された。
まず、最高平均AUCに基づいてそれぞれのモデルについて最適数の特徴を選択し、次いで、ボックスプロットを使用してそれぞれのモデルについて性能を視覚化することによって、モデルの相互比較が行われた。これを図2に示す。左から右に、初めの3つのプロットはそれぞれ、最も低い平均分散および強度を有する75%を除去するプローブセットの初期フィルタリング(遺伝子のリストの含有を強制する)を用いて開発された、PLS、SDA、およびDSDA分類子を示す。次の3つのプロットはそれぞれ、DDRD(IFN/DNA損傷)のリストのみを用いて開発されたPLS、SDA、およびDSDAの分類子を示す。
図2から、53個のプローブセットを含む「PLS VarInt」分類モデルが、他の5つのモデルの大部分よりも著しく高いAUCを有する最高性能モデルであることは明白である。次いで、このモデルは、応答および予後について患者を層別化するDDRD分類スコアの能力を評価するために、独立した外部データセットにおける検証のための次のフェーズに進められた。
検証データセットが異なるアレイプラットフォームを有する公的または内部データのいずれかであるという事実により、分類モデルを検証するための非正統派アプローチが採用された。一般に使用されるアプローチは、代替的なアレイプラットフォームに適用されるようには設計されておらず、したがって、分類モデルの開発および独立した検証のための段階的アプローチがとられた:
1.第Iフェーズ −プローブセットレベルでのモデル生成、DDRDのサブグループを分類するために相互検証下での最善モデルの選択(前述)
2.第IIフェーズ −プローブセットレベルの分類モデルから、遺伝子レベルの分類モデルへの変換
3.第IIIフェーズ −外部データセットを用いた、再開発された遺伝子分類モデルの検証
検証段階に進む候補モデルを選択した後、このモデルは遺伝子レベルで再構築される必要があった(第IIフェーズ)。これには、分類モデルにおけるプローブセットを遺伝子レベルにマッピングすることと、それぞれの遺伝子について重みを再計算することが含まれた。選択されたモデルにおける53個のプローブセットは、表2Aに記載される40個の遺伝子に対してマッピングされ、続いて、アノテーションパイプラインの正確度が更なる解析を通じて改善されたとき、表2Bに記載される44個の遺伝子にマッピングされた。
遺伝子分類モデルの再開発において、遺伝子に関するすべての情報が使用されることを確実にするために、それぞれの遺伝子(表2C)と関連するすべてのプローブセットの中央値強度が遺伝子発現値として使用される。これは、すべての試料に関して計算され、モデルの開発および選択について第Iフェーズにおいて使用されたプローブセット発現データマトリックスと対比される、遺伝子発現データマトリックスをもたらした。異なるバッチにわたる強度を安定させるために、それぞれの試料についてすべてのプローブセットの中央値を、その試料についてのそれぞれの遺伝子の対応する強度から減算した。
PLS回帰を用いて、それぞれの遺伝子について新しい重みが計算され、異なるアレイプラットフォームからの外部データセットにおける検証のために使用され得る最終遺伝子の分類子モデル(40の遺伝子および44の遺伝子の分類子モデル)をもたらした(第IIIフェーズ)。
第IIIフェーズ、すなわち、他のアレイプラットフォームからのものであり得るデータセットを用いた分類子の検証において、以下のステップが行われた:
1.アンチセンスのプローブセットを除き(該当する場合)、分類子における遺伝子にマッピングされるプローブセットが決定される
2.分類子におけるそれぞれの遺伝子に関するすべてのプローブセットにわたる中央値強度が計算され、還元(reduced)遺伝子強度マトリックスを得る。
a.その特定のアレイプラットフォーム上にその遺伝子についてのプローブセットが存在しない場合、トレーニングデータから観察された平均値が代用として使用される。
3.それぞれの試料についてすべてのプローブセットの中央値が計算され、還元遺伝子強度マトリックスから減算される。
4.それぞれの遺伝子についての値を、シグネチャーにおけるその遺伝子の「重み」で乗じる。
5.第4番でシグネチャーにおける各遺伝子について得られた値を一緒に加算して、その試料についてのシグネチャースコアを得る。
6.この分類子は、それぞれの試料についてスコアを産生し、それが、例えば応答する可能性がより高いものから応答する可能性がより低いものまでに患者を層別化するために使用され得る。
[実施例2]
44遺伝子のDDRD分類子モデルのインシリコ(in silico)での検証
44遺伝子のDDRDの分類子モデルの性能を、元のAlmac乳房データセットおよび3つの独立したデータセット内でROC(受信者動作特性)曲線下面積(AUC)によって立証した。AUCは、観察された疾患スケールに関して計算される統計値であり、分類子モデルを用いた表現型の予測の有効性の尺度である(Wray et. al.,PLoS Genetics Vol 6,1−9)。0.5のAUCは、ランダムな分類子を典型的に示し、1.0のAUCは、クラスの完璧な分離を示す。したがって、44遺伝子のDDRDの分類子モデルが、DNA損傷を与える薬剤およびDNA修復標的療法剤を含む標準的な乳癌および卵巣癌の治療薬物クラスへの応答の予測、およびそのための患者の選択をする能力を有するか否かを判定するために、これらのデータセット内での適用後のAUCが0.5を超え、また、最低信頼間隔も0.5を超えるべきであるというのが仮説である。
BRCA突然変異を散発性腫瘍から分離する44遺伝子の分類子モデルの能力の評価
DDRDの状態を予測するための分類子スコアを使用して、BRCA突然変異の試料を散発性試料から分離することにおけるモデルの能力を評価した。本解析は、分類子モデルとBRCA突然変異状態との間の関係を評価するために行った。BRCA突然変異腫瘍は、機能的BRCA1/2の欠如によるDNA損傷応答の欠損のために、高度なゲノム不安定性を示す。したがって、DDRD分類子モデルはBRCA突然変異試料をBRCA野生型散発性試料から分離することができるべきであるということが仮説である。
図3は、44遺伝子の分類子モデルが、BRCA突然変異体を約0.68のAUCにおいて散発性試料から分離することを示し、ここで、最低信頼間隔は両方のモデルにおいて約0.56であり(表3A)、その性能がランダムな分類子よりも著しく良好であることを示している。したがって、本解析は、44遺伝子のDDRDの分類子モデルが、DNA損傷を修復することができないために高度なゲノム不安定性を有する試料を特定することができることを確証している。
独立したマイクロアレイ臨床的データセットへの分類子モデルの適用
独立の乳房マイクロアレイ臨床的データセット
(1)DNA損傷化学療法に対する44遺伝子DDRDの分類子モデルの予測力の評価
DNA損傷化学療法に対する応答を予測するための44遺伝子DDRD分類子モデルの能力を評価するために、それを3つの公的に入手可能なデータセットから組み合わせたデータに適用した。それぞれの研究において、乳癌患者は、DNAを直接的に損傷する薬物であるネオアジュバント5−フルオロウラシル、アントラサイクリン、およびシクロホスファミドベースのレジメンによって処置されていた。第1のデータセット(Tabchy et al.,2010)および第2のデータセット(Iwamoto et al.,2011)はそれぞれ、フルオロウラシル、ドキソルビシン、およびシクロホスファミド(FAC)によるネオアジュバント治療後の、それぞれ87個および50個のER陽性およびER陰性の原発性乳癌試料についての応答性データを有していた。第3のデータセット(Bonnefoi et al.,Lancet Oncol 8,1071−1078(2007))は、ネオアジュバント5−フルオロウラシル、エピルビシン、およびシクロホスファミド(FEC)処置後の、66個のER陰性の原発性乳癌試料についての応答性データを有していた。それぞれの研究は、終点として、病理学的完全応答(pCR)または余病(RD)を使用した。それぞれのデータセットは比較的小さいため、このデータを組み合わせて、解析の力を増大させた。
解析は、44遺伝子のDDRD分類子モデルが、アントラサイクリンベースの化学療法に対する応答と有意に関連したことを示した(相対リスク(RR)=4.13、CI=1.94−9.87、AUC=0.78、CI=0.70−0.85、P=0.001、表3B、図4)。分類子の陰性予測値(NPV)は、陽性予測値(PPV)よりも相当高く(0.90対0.44、表3B)、DDRD陰性腫瘍はDNA損傷化学療法に対して応答する可能性が低いことが示された。
臨床的変数に対して調節した場合に、組み合わされたデータセットにおける応答を予測する44遺伝子DDRD分類子モデルの能力を判定するために、段階的ロジスティック回帰を使用した(表4)。44遺伝子DDRD分類子モデルは、単変量解析において、最も有意な臨床的変数であることが判定された。多変量解析は、44遺伝子DDRD分類子モデルの予測的意義が、段階、等級、およびとりわけER状態から独立していることを確認した。
エストロゲン、プロゲステロン、およびHER2受容体についての陰性は、異常なDDRのバイオマーカーとして、ひいては、DNA損傷およびDNA修復標的療法剤に対する応答のバイオマーカーとして、示唆されてきた(Foulkes et al.,2010)。しかしながら、このアプローチは、ER陽性であることが報告されているBRCA1突然変異腫瘍の20%およびBRCA2突然変異腫瘍の40%を除外する(Foulkes et al.,2004、Tung et al.,2010)。対照的に、本発明者らが採用した解析アプローチによれば、FECおよびFACのデータセットを組み合わせた解析内での44遺伝子DDRD分類子の予測的意義の多変量解析によって立証されるているように、44遺伝子DDRD分類子はER陽性およびER陰性の両方の腫瘍においてDDRDサブグループを検出し、それがER状態に依存しないことが実証されている。臨床的には、このことは、DNA損傷治療に対する患者の予測された応答性を判定するために、ER状態に関係なくすべての乳癌患者にそれが適用され得ることを示唆するため、DDRDの分類子の翻訳的適用の重要な側面である。
(2)タキサン含有化学療法レジメンに対する44遺伝子DDRD分類子モデルの予測力の評価
タキサン等の非DNA損傷剤を含有する化学療法レジメンに対する応答を予測するうえでの、44遺伝子DDRD分類子モデルの能力が評価された。321人の原発性乳癌患者についての、パクリタキセルおよびFAC(T/FAC)によるネオアジュバント治療後の応答性データを有する3つのデータセットからのデータが組み合わせられ、応答はpCRとして定義した(Hess et al.,2006、Lee et al.,2010、Tabchy et al.,2010)。44遺伝子DDRD分類子モデルは、両方とも応答と関連したが(AUC=0.61、CI=約0.52〜0.69、表3B、図5)、この性能は、FAC/FECのみで治療した試料内のものと比較して著しく減少した。加えて、多変量解析は、T/FACに対する応答を予測する能力において、DDRD分類子は他の臨床的パラメータから独立しなかったこと(P=0.21)を示した(表4)。これは、DDRD分類子によって検出されるサブグループは、抗微小管剤も含有するレジメンよりもむしろDNA損傷のみのレジメンに対してより敏感であることを示唆している。
独立した卵巣マイクロアレイ臨床的データセット
別の疾患領域における44遺伝子DDRD分類子モデルの性能を研究することが決定された。したがって、分類子モデルの性能を、漿液性組織学を有する一組の259個のFFPE原発性卵巣癌試料内で評価した。これらの試料は、アジュバント白金治療あるいはアジュバント白金およびタキサンの治療のいずれかを受けた患者からのものであり、卵巣癌DSA(商標)においてプロファイル化された。応答データは、RESISTおよび/または血清マーカーCA125レベルによって判定された。これらの試料への44遺伝子DDRD分類子モデルの適用により、約0.68のAUCおよび約0.59の低側信頼限界を伴って、非応答者と応答者とが有意に区別されることが証明された(図6)。44遺伝子DDRD分類子モデルは、ファンコニ貧血/BRCA経路の機能障害を検出する。
BRCA1およびBRCA2を含む、ファンコニ貧血/BRCA(FA/BRCA)経路は、DNA修復において不可欠な役割を果たし、乳癌においては突然変異またはエピジェネティックなサイレンシングのいずれかにより消失され得る(Kennedy and D’Andrea,2006)。したがって、44遺伝子DDRD分類子モデルがBRCA1およびBRCA2に加えてこの経路のメンバーの異常を検出し得るかどうかが判定された。FA/BRCA経路において一連の突然変異を保有する21人のFA患者および機能的なFA/BRCA経路を有する11人の健常な対照の骨髄から生成されたマイクロアレイデータを有する公的データセットが同定された(Vanderwerf,S.M.,et al.,Blood 114,5290−5298(2009)。44遺伝子DDRD分類子モデルは、FA/BRCA突然変異試料と正常な試料とを、0.90のAUCをもって有意に区別し(CI=0.76〜1.00、P<0.001、図7)、これにより、複数の機序を通じて、DDRD分類子とFA/BRCA経路の機能障害との間の強い相関関係が実証された。
44遺伝子DDRD分類子モデルのインシリコでの検証の要約
44遺伝子のDDRD分類子モデルのインシリコでの検証は、以下のことを示した:
(a)44遺伝子のDDRDの分類子モデルは、野生型BRCA(散発性)乳房腫瘍試料とBRCA突然変異乳房腫瘍試料とを有意に区別することができる。これは、DDRD分類子モデルが、BRCA突然変異腫瘍等の高レベルのゲノムの不安定性を有する腫瘍に関連する生物学を検出する能力を有することを意味する。これらの腫瘍は、通常、DNA損傷化学療法レジメンに対してより良好に応答する。
(b)44遺伝子DDRD分類子モデルは、FACおよびFEC(Bonnefoi et al.,2007、Iwamoto et al.,2011、Tabchy et al.,2010)ならびにT/FAC(Hess et al.,2006、Lee et al.,2010、Tabchy et al.,2010)によるネオアジュバント治療後の3つの独立した乳房データセットの組合せにおいて、非応答者(pCRを示さなかったもの)から、定義された応答者(pCRを示したもの)を有意に区別することができる。44遺伝子のDDRDの分類子モデルは、他の臨床的因子から独立しており、FAC/FECを組み合わせた解析において最も有意な独立した応答の予測子であることが見いだされた。これらの研究は、新鮮な冷凍(FF)試料を用い、2つの異なるマイクロアレイプラットフォーム、即ち、Affymetrix X3PマイクロアレイおよびAffymetrix U133Aマイクロアレイを用いて実行された。これらの結果は、異なる試料材料(FFPEの代わりにFF)を利用し、および2つの異なるマイクロアレイのプラットフォームからのマイクロアレイデータを利用する、独立した乳房データセット内での44遺伝子DDRDの分類子モデルの性能を確証するものである。
(c)44遺伝子DDRD分類子モデルは、白金または白金/タキサンベースの療法による補助治療後の独立したAlmac卵巣のデータセット内の非応答者と応答者とを有意に区別することができる。このデータは、Almac Ovarian DSA(商標)においてプロファイル化されたFFPE試料を用いて生成された。
(d)44遺伝子DDRD分類子モデルは、骨髄組織試料を用いて、FA/BRCA突然変異試料と正常試料とを有意に区別することができ、これにより、複数の機序を通じてDDRD分類子とFA/BRCA経路の機能障害との強い相関関係が実証される。
要約すると、DDRDの分類子モデルは、独立して検証され、3つの異なる疾患領域(乳房、卵巣、およびFA)にわたる性能のロバスト性を示し、これは、4つの異なるマイクロアレイプラットフォーム(Almac Breast DSA(商標)およびAlmac Ovarian DSA(商標)、Affymetrix X3PマイクロアレイおよびAffymetrix U133Aマイクロアレイ)からのデータを利用して2つの異なる試料型(FFPEおよびFF)において、4つの異なる化学療法レジメン(FAC、FEC、T/FAC、および白金/タキサン)に対する応答者と非応答者を区別する能力を示した。DDRDは、DNA損傷治療剤に対する応答性の独立した予測子であり、FA/BRCA経路における突然変異を予測することができることが実証された。この性能の柔軟性および再現性は、44遺伝子分類子モデルによって特定されるDDRDのサブグループ内で特定される生物学が、DNA損傷を与える剤に対する応答性の予測に有意かつ堅牢に関連し、したがって、DNAを直接的に損傷する薬物、DNAを間接的に損傷する薬物、または正常なDNA損傷シグナリングおよび/または修復プロセスを阻害する薬物を含む標準的な乳癌および卵巣癌の治療薬物クラスに対する応答を予測し、その薬物のための患者を選択するために使用することができるサブタイプを同定するという本発明の特許請求を支持することを意味する。
[実施例3]
44遺伝子DDRD分類子モデルのインビトロ検証
44遺伝子分類子モデル内に含まれた遺伝子の根底にある生物学を評価するために、乳房細胞株のパネルを用いてインビトロで多くの研究を行った。
方法
細胞株の維持
HCC1937親株、HCC1937−EV、およびHCC1937−BR細胞株は、Queen’s University College Belfast(QUB)のPaul Harkin教授により快く寄付された。細胞株は、50Uのペニシリン/mL、50μgのストレプトマイシン/mL、2mMのグルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、および20%(v/v)ウシ胎仔血清(FBS)を添加したRPMI−1640培地中でルーチン的に維持された。HCC1937−EVおよびHCC937−BR細胞株はまた、0.2mL/mgのジェネティシンも必要とした。細胞株は、5%COの加湿環境で、37℃で培養された。
クローン形成アッセイ−PARP−1阻害剤感受性の判定
PARP−1阻害剤(KU0058948)に対する感受性の測定については、指数関数的に成長している細胞を、6ウェルプレートに播種した。播種してから24時間後、漸増用量の薬物を含む培地に細胞を晒した。細胞培地は4〜5日おきに補充した。12〜14日後、細胞をメタノール中で固定し、クリスタルバイオレット溶液で染色し、計数した。所定の用量についての対照の生存率は、その用量についてのプレート効率を、ビヒクル処理した細胞のプレート効率で割ったものとして計算された。生存曲線および半数阻害濃度(IC50)値は、GraphPad Prismを用いて計算された。
細胞生存アッセイ−シスプラチン感受性の判定
シスプラチンに対する感受性の測定については、指数関数的に成長している細胞を、96ウェルプレートに播種した。播種してから24時間後、漸増用量のシスプラチンを含む培地に細胞を晒した。細胞を、薬物の存在下で、96時間インキュベートし、その後、細胞の生存率をPromega CellTitre−Glo発光細胞生死判別アッセイを用いて評価した。細胞の感受性は、ビヒクル(DMSO)対照のパーセンテージとして計算された。生存曲線および半数阻害濃度(IC50)値は、GraphPad Prismを用いて計算された。
結果
DDRDのサブグループは、乳癌細胞株モデル内で特定され得る。
前臨床モデルシステムを使用して、44遺伝子DDRD分類子が異常DDRの評価基準であることを確認した。HCC1937乳癌細胞株は、BRCA1突然変異のためにDDRDである(Tomlinson et al.,1998)。44遺伝子分類子を、HCC1937空ベクター対照細胞(HCC1937−EV)、およびBRCA1機能性が修正されたHCC1937細胞(HCC1937−BR)に適用した(図7A)。DDRDの44遺伝子分類子スコアは、それぞれ、0.5111および0.1516の平均スコアであり、HCC1937−BR細胞と比較してHCC1937−EV内でより高いことが見出された(図7B)。DDRDの44遺伝子分類子スコアと一致して、HCC1937 BRCA1突然変異細胞株は、BRCA1を修正した細胞株と比較して、PARP−1阻害剤KU0058948(図7C)およびシスプラチン(図7D)に対してより感受性があった。これらの前臨床データは、DDRDの44の遺伝子の分類子が、DDRD陽性腫瘍細胞において免疫シグナリングを測定し、DNA損傷剤(シスプラチン)およびDNA修復標的薬剤(PARP−1阻害剤)の両方に対する応答性と相関させることを示唆している。
DDRDの44の遺伝子の分類子は、ファンコニ貧血/BRCA経路の機能障害を検出する。
BRCA1およびBRCA2を含む、ファンコニ貧血/BRCA(FA/BRCA)経路は、DNA修復において不可欠な役割を果たし、乳癌においては突然変異またはエピジェネティックなサイレンシングのいずれかにより消失され得る(Kennedy,R.D.,and D’Andrea,A.D.,J Clin Oncol 24,3799−3808(2006))。DDRDの44の遺伝子の分類子がBRCA1およびBRCA2に加えてこの経路のメンバーの異常を検出し得るかどうかが判定された。FA/BRCA経路において一連の突然変異を保有する21人のFA患者および機能的なFA/BRCA経路を有する11人の健常な対照の骨髄から生成されたマイクロアレイデータを有する公的データセットが特定された(Vanderwerf et al.,2009)。DDRDの44の遺伝子の分類子は、FA/BRCA突然変異試料と正常試料とを、0.90のAUCをもって有意に区別し(CI=0.76〜1.00、P<0.001)、これにより、複数の機序を通じてDDRD分類子とFA/BRCA経路の機能障害との間の強い相関関係が実証された。
結論
DDRDの44の遺伝子の分類子スコアは、BRCA1突然変異体において有意に高く、ひいては、同系のBRCA1を修正した細胞株と比較して、DDRDのHCC1937乳癌細胞株において有意に高かった。44の遺伝子の分類子スコアは、これらの細胞内のDDRの機能障害と相関するため、DDRDの分類子によって検出された免疫シグナリングはその細胞に内在するのであってリンパ球浸潤の作用ではないことが実証されている。BRCA1およびBRCA2は、FA/BRCA DDRネットワークの一部を現わし、これ、は乳癌の約33%において突然変異であるかまたは過少発現であることが報告されている多くの他のタンパク質を含む(Kennedy,R.D.,and D’Andrea,A.D.,J Clin Oncol 24,3799−3808(2006)。前述のように、DDRDの44の遺伝子の分類子は、FA突然変異を有する患者からの骨髄試料を、正常対照から有意に分離した。これは、DDRDの分類子が、特にBRCA1またはBRCA2の機能障害というわけではなく、むしろ、経路内の任意の異常性を検出する能力を有することを示唆している。DDRDの44の遺伝子の分類子は、PTEN欠損、細胞周期チェックポイントの機能障害、または代謝障害による活性酸素種の増加等、その他の機序によるDDR欠損を有する腫瘍を特定し得ることが可能である。構成的なDNA損傷のために、これらの腫瘍は、PARP−1またはCHK1/2阻害剤等のDNA修復標的療法剤に対して応答性がある可能性が高い。

Claims (20)

  1. DNA損傷治療剤に対する個体の応答性の予測方法であって、
    a.前記個体から試験試料を得ることと、
    b.前記試験試料中の1つ以上のバイオマーカーであって、CXCL10、MX1、IDO1、IF144L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、およびAPOL3からなる群から選択される、1つ以上のバイオマーカーの発現レベルを測定することと、
    c.前記発現レベルを捕捉する試験スコアを導出することと、
    d.前記試験スコアと応答性とを相互に関連付ける情報を含む閾値スコアを提供することと、
    e.前記試験スコアを前記閾値スコアと比較することを含み、ここで、前記試験スコアが前記閾値スコアを超える場合に応答性が予測される、方法。
  2. 前記試験試料中の1つ以上の更なるバイオマーカーの発現レベルを測定することを含み、前記1つ以上の更なるバイオマーカーは、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A、およびAL137218.1からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
  3. 前記試験スコアが、前記バイオマーカーのすべての発現レベルを捕捉し、前記試験スコアが0.3681の値の閾値スコアを超える場合に、応答性が予測される、請求項2に記載の方法。
  4. 前記DNA損傷治療剤が、DNA損傷剤、DNA修復標的療法剤、DNA損傷シグナリングの阻害剤、DNA損傷誘導性の細胞周期停止の阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、および熱ショックタンパク質阻害剤からなる群から選択される1つ以上の物質を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
  5. 前記DNA損傷治療剤が、アントラサイクリン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、オキサリプラチン、ブスルファン、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、ドキソルビシン、エピルビシン、および電離放射線のうちの1つ以上を含む、請求項4に記載の方法。
  6. 前記DNA損傷治療剤が、DNA−PK阻害剤、Nu7441、Nu7026、相同組み換え阻害剤、ヌクレオチド除去修復阻害剤、PARP阻害剤、AG014699、AZD2281、ABT−888、MK4827、BSI−201、INO−1001、TRC−102、APEX1阻害剤、APEX2阻害剤、リガーゼIII阻害剤、およびファンコニ貧血経路の阻害剤のうちの1つ以上を含む、請求項4に記載の方法。
  7. 前記個体が癌に罹患している疑いがあるか、または癌に罹患していると診断されている、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
  8. 前記癌が、乳癌および卵巣癌からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
  9. 前記癌が乳癌であり、前記DNA損傷治療剤が、5−フルオロウラシル、アントラサイクリン、およびシクロホスファミドの組み合わせを含む、請求項8に記載の方法。
  10. 前記アントラサイクリンがエピルビシンである、請求項9に記載の方法。
  11. 前記アントラサイクリンがドキソルビシンである、請求項9に記載の方法。
  12. タキサンが前記DNA損傷治療剤と併用投与される、請求項9に記載の方法。
  13. 前記癌が卵巣癌であり、前記DNA損傷治療剤が白金含有薬剤を含む、請求項8に記載の方法。
  14. 前記DNA損傷薬剤が、タキサンと併用投与される、請求項13に記載の方法。
  15. 前記癌がファンコニ貧血/BRCA経路における1つ以上の突然変異と関連する、請求項7〜14のいずれか1項に記載の方法。
  16. DNA損傷応答欠損(DDRD)と関連する癌に罹患しているか、または前記癌を発症しやすい個体の診断方法であって、
    a.前記個体から試験試料を得ることと、
    b.前記試験試料中の1つ以上のバイオマーカーであって、CXCL10、MX1、IDO1、IF144L、CD2、GBP5、PRAME、ITGAL、LRP4、およびAPOL3からなる群から選択される、1つ以上のバイオマーカーの発現レベルを測定することと、
    c.前記発現レベルを捕捉する試験スコアを導出することと、
    d.前記試験スコアと前記癌の診断とを相互に関連付ける情報を含む閾値スコアを提供することと、
    e.前記試験スコアを前記閾値スコアと比較することを含み、ここで、前記試験スコアが前記閾値スコアを超える場合に、前記個体が前記癌に罹患しているか、または前記癌を発症しやすいと診断される、方法。
  17. 前記試験試料中の1つ以上の更なるバイオマーカーの発現レベルを測定することを含み、前記更なるバイオマーカーが、CDR1、FYB、TSPAN7、RAC2、KLHDC7B、GRB14、AC138128.1、KIF26A、CD274、CD109、ETV7、MFAP5、OLFM4、PI15、FOSB、FAM19A5、NLRC5、PRICKLE1、EGR1、CLDN10、ADAMTS4、SP140L、ANXA1、RSAD2、ESR1、IKZF3、OR2l1P、EGFR、NAT1、LATS2、CYP2B6、PTPRC、PPP1R1A、およびAL137218.1からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
  18. 前記試験スコアが、前記バイオマーカーのすべての発現レベルを捕捉し、前記個体が、前記試験スコアが0.3681の値の閾値スコアを超える場合に、前記癌に罹患しているか、または前記癌を発症しやすいと診断される、請求項17に記載の方法。
  19. 前記癌が、乳癌および卵巣癌から選択される、請求項16〜18のいずれか1項に記載の方法。
  20. 前記癌が、ファンコニ貧血/BRCA経路における1つ以上の突然変異と関連する、請求項19に記載の方法。
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