CN108379584B - RSAD2通过wnt通路影响肿瘤细胞替莫唑胺耐药性 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，本发明经过广泛而深入的研究发现，一种新的肿瘤耐药标记物基因‑RSAD2，此基因与肿瘤化疗替莫唑胺（TMZ）药物的耐药产生有密切的关系。与原代细胞U87，U251相比，RSAD2在替莫唑胺耐受细胞U87R，U251R中的表达水平显著升高，且wnt通路被激活。降低RSAD2基因的表达可增强细胞株对替莫唑胺药物的敏感性，抑制肿瘤细胞的增殖能力。本发明不仅为恶性胶质瘤耐药机制提供了新的资料，而且为抗肿瘤耐药药物的设计提供了新的靶点。

Description

RSAD2通过wnt通路影响肿瘤细胞替莫唑胺耐药性
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及RSAD2通过wnt通路影响肿瘤细胞替莫唑胺耐药性。
背景技术
胶质瘤是指起源于神经胶质细胞的肿瘤，是最常见的原发性颅内肿瘤。脑胶质瘤根据其肿瘤细胞形态学与正常脑胶质细胞的相似程度，分为星型细胞瘤、少枝细胞瘤、室管膜瘤和混合胶质瘤。根据世界卫生组织(WHO)制定的分级系统可以将脑胶质瘤分为1级(恶性程度最低、预后最好)到4级(恶性程度最高、预后最差)。其中，传统细胞病理学所谓的间变胶质瘤与WHO的3级相对应，胶质母细胞瘤与WHO的4级相对应。根据此分级系统，脑胶质瘤按肿瘤细胞在病理学上的恶性程度，可以进一步分为低级别胶质瘤(WHO1～2级)和高级别胶质瘤(WHO3～4级)。美国脑肿瘤注册中心(CBTRUS)的统计结果显示,胶质瘤约占所有中枢神经系统肿瘤的27％,占恶性肿瘤的80％。手术往往是胶质瘤治疗的第一步，对于一些低级别胶质瘤，如毛细胞星形细胞瘤，手术的完整切除，可以使患者得到根治以及长期存活。但对于高级别胶质瘤患者，往往需要进一步的化疗。替莫唑胺(TMZ)是一种口服烷化剂，能穿过血脑屏障直达病灶，是临床上化疗脑胶质瘤的一线常用药物之一。胶质瘤很难根治，往往会复发。有研究表明，用TMZ治疗人脑胶质瘤的有效率约为45％，其中，脑胶质瘤对TMZ产生耐药性是导致化疗失败的最主要原因。所以，我们迫切需要寻找针对胶质瘤的可行治疗策略。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供基于“RSAD2通过wnt通路影响肿瘤细胞替莫唑胺耐药性”新发现所带来的针对胶质瘤的新的治疗靶点以及治疗手段。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供了RSAD2抑制剂在制备胶质瘤治疗药物中的用途。
进一步地，所述胶质瘤治疗药物至少具有以下功用之一：
降低胶质瘤细胞增殖能力、提高胶质瘤细胞凋亡率、降低胶质瘤细胞存活力、降低胶质瘤细胞存活率。
进一步地，所述RSAD2抑制剂是指对RSAD2具有抑制效果的分子。
对RSAD2具有抑制效果包括但不限于：抑制RSAD2活性，或者抑制RSAD2基因转录或表达、抑制RSAD2蛋白水平。
所述RSAD2抑制剂可以为siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。
如本发明实施例列举的，所述RSAD2抑制剂可以为siRNA。
所述胶质瘤治疗药物必然包括RSAD2抑制剂，并以RSAD2抑制剂作为前述功用的有效成分。
所述胶质瘤治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为RSAD2抑制剂，亦可包含其他可起到类似功用的分子。
亦即，RSAD2抑制剂为所述胶质瘤治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。
所述胶质瘤治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。
所述胶质瘤治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述胶质瘤治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。
本发明的第二方面，提供一种治疗胶质瘤的方法，为向对象施用RSAD2抑制剂。
所述RSAD2抑制剂同本发明第一方面前所述。
所述的对象可以为哺乳动物或哺乳动物的胶质瘤细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。所述胶质瘤细胞可以为离体胶质瘤细胞。
所述对象可以是罹患胶质瘤的患者或者期待治疗的胶质瘤的个体。或者所述对象为胶质瘤患者或者期待治疗胶质瘤的个体的胶质瘤细胞。
RSAD2抑制剂可以在接受胶质瘤治疗前、中、后向对象施用。
本发明的第三方面，提供一种胶质瘤治疗药物，包括有效剂量的RSAD2抑制剂。
所述RSAD2抑制剂同本发明第一方面所述。
所述胶质瘤治疗药物必然包括RSAD2抑制剂，并以RSAD2抑制剂作为前述功用的有效成分。
所述胶质瘤治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为RSAD2抑制剂，亦可包含其他可起到类似功用的分子。
亦即，RSAD2抑制剂为所述胶质瘤治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。
所述胶质瘤治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。
所述胶质瘤治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述胶质瘤治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。
本发明的第四方面，提供RSAD2抑制剂用于制备胶质瘤化疗药物敏感性促进剂的用途。
所述RSAD2抑制剂同本发明第一方面所述。
进一步地，所述RSAD2抑制剂用于提高胶质瘤细胞或肿瘤对胶质瘤化疗药物的敏感性。
所述提高是指与未施用RSAD2抑制剂、而只施用胶质瘤化疗药物相比。
进一步地，所述胶质瘤化疗药选自替莫唑胺(temozolomide,TMZ)。
本发明的第五方面，提供RSAD2抑制剂在制备胶质瘤化疗药物耐药性逆转剂中的用途。
所述RSAD2抑制剂同本发明第一方面所述。
进一步地，所述RSAD2抑制剂用于降低胶质瘤细胞或肿瘤对胶质瘤化疗药物的耐药性。
所述降低是指与未施用RSAD2抑制剂、而只施用胶质瘤化疗药物相比。
进一步地，所述胶质瘤化疗药选自替莫唑胺(temozolomide,TMZ)。
本发明第六方面，提供RSAD2抑制剂与胶质瘤化疗药物联合用于制备胶质瘤治疗药物的用途。
所述RSAD2抑制剂同本发明第一方面所述。
进一步地，所述RSAD2抑制剂用于提高胶质瘤细胞或肿瘤对胶质瘤化疗药物的敏感性。
所述提高是指与未施用RSAD2抑制剂、而只施用胶质瘤化疗药物相比。
进一步地，所述RSAD2抑制剂用于降低胶质瘤细胞或肿瘤对胶质瘤化疗药物的耐药性。
所述降低是指与未施用RSAD2抑制剂、而只施用胶质瘤化疗药物相比。
进一步地，所述胶质瘤化疗药选自替莫唑胺(temozolomide,TMZ)。
本发明的第七方面，提供一种胶质瘤治疗药物组合，包括有效量的RSAD2抑制剂和至少一种其他胶质瘤治疗药物。
所述RSAD2抑制剂同本发明第一方面所述。
所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：
一)将RSAD2抑制剂和其他胶质瘤治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。
当其他胶质瘤治疗药物为抗体时，一般采用胃肠外给药型。当其他胶质瘤治疗药物为化学药物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各化学药物的已知给药途径给药。当其他胶质瘤治疗药物为化学药物时，所述胶质瘤化疗药可以是替莫唑胺(temozolomide,TMZ)。
进一步地，所述RSAD2抑制剂用于提高胶质瘤细胞或肿瘤对胶质瘤化疗药物的敏感性。
所述提高是指与未施用RSAD2抑制剂、而只施用胶质瘤化疗药物相比。
进一步地，所述RSAD2抑制剂用于降低胶质瘤细胞或肿瘤对胶质瘤化疗药物的耐药性。
所述降低是指与未施用RSAD2抑制剂、而只施用胶质瘤化疗药物相比。
二)将RSAD2抑制剂和其他胶质瘤治疗药物配置成复方制剂，在将RSAD2抑制剂和其他胶质瘤治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。
本发明的第八方面，提供一种治疗胶质瘤的方法，为向对象施用有效量的RSAD2抑制剂以及向对象施用有效量的其他胶质瘤治疗药物和/或向对象实施其他胶质瘤治疗手段。
所述RSAD2抑制剂同本发明第一方面所述。
可以同步地或顺序地给予有效量的RSAD2抑制剂和至少一种有效量的其他胶质瘤治疗药物。
基于RSAD2为本发明首次发现的胶质瘤治疗靶点，在与RSAD2抑制剂以外的其他胶质瘤治疗药物联合用药中，至少可以起到疗效相加的效果，进一步增强对于胶质瘤的治疗作用。
其他的胶质瘤治疗药物包括但不限制于：抗体药物、化学药物或靶向型药物等。
所述胶质瘤抑制剂可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。所述其他胶质瘤治疗药物可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。对于抗体药物，一般采用胃肠外给药。
当其他胶质瘤治疗药物为化疗药物时，所述化疗药物可以是替莫唑胺(temozolomide,TMZ)。
进一步地，所述RSAD2抑制剂用于提高胶质瘤细胞或肿瘤对胶质瘤化疗药物的敏感性。
所述提高是指与未施用RSAD2抑制剂、而只施用胶质瘤化疗药物相比。
进一步地，所述RSAD2抑制剂用于降低胶质瘤细胞或肿瘤对胶质瘤化疗药物的耐药性。
所述降低是指与未施用RSAD2抑制剂、而只施用胶质瘤化疗药物相比。
进一步地，所述其他胶质瘤治疗手段为化疗。
本发明的第九方面，提供RSAD2抑制剂在制备wnt通路抑制剂中的用途。
所述RSAD2抑制剂同本发明第一方面所述。
所述RSAD2抑制剂用于降低p-β-catenin和p-Smad2的表达。
所述降低是与未施用RSAD2抑制剂，而只施用胶质瘤化疗药物相比。
所述化疗药物可以是替莫唑胺(temozolomide,TMZ)。
本发明的第十方面，提供RSAD2抑制剂在制备具有以下任一项或多项作用的药物中的用途：
降低胶质瘤细胞增殖能力、提高胶质瘤细胞凋亡率、降低胶质瘤细胞存活力、降低胶质瘤细胞存活率。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明经过广泛而深入的研究发现，一种新的肿瘤耐药标记物基因-RSAD2，此基因与肿瘤化疗替莫唑胺(TMZ)药物的耐药产生有密切的关系。与原代细胞U87，U251相比，RSAD2在替莫唑胺耐受细胞U87R，U251R中的表达水平显著升高，且wnt通路被激活。降低RSAD2基因的表达可增强细胞株对替莫唑胺药物的敏感性，抑制肿瘤细胞的增殖能力。本发明不仅为恶性胶质瘤耐药机制提供了新的资料，而且为抗肿瘤耐药药物的设计提供了新的靶点。
附图说明
图1A：人恶性胶质瘤TMZ药物耐药株的培养和筛选，显示人恶性胶质瘤原代细胞株U87和TMZ耐药细胞株U87R对替莫唑胺的药物敏感性，表明U87R细胞的耐药性较高。
图1B：人恶性胶质瘤TMZ药物耐药株的培养和筛选，显示人恶性胶质瘤原代细胞株U251和TMZ耐药细胞株U251R对替莫唑胺的药物敏感性，表明U87R细胞的耐药性较高。
图2A：RSAD2在耐药株和敏感株的表达量，实时定量PCR检测图，显示耐药细胞株U87R中RSAD2在mRNA水平上的表达显著高于原代敏感细胞株U87。
图2B：RSAD2在耐药株和敏感株的表达量，Western Blot检测图，显示耐药细胞株U87R中RSAD2在蛋白水平上的表达显著高于原代敏感细胞株U87。
图2C：RSAD2在耐药株和敏感株的表达量，实时定量PCR检测图，显示耐药细胞株U251R中RSAD2在mRNA水平上的表达显著高于原代敏感细胞株U251。
图2D：RSAD2在耐药株和敏感株的表达量，Western Blot检测图，显示耐药细胞株U251R中RSAD2在蛋白水平上的表达显著高于原代敏感细胞株U251。
图3：si-RSAD2干扰及TMZ处理对RSAD2表达水平的影响，其中，A：实时定量PCR检测图，检测耐药细胞株U87R中RSAD2在mRNA水平上的表达，与NC组相比，TMZ处理组中RSAD2的表达无显著差异，si-RSAD2干扰组中RSAD2的表达显著降低，si-RSAD2+TMZ组中RSAD2的表达进一步降低；B：Western Blot检测图，检测耐药细胞株U87R中RSAD2在蛋白水平上的表达，与NC组相比，TMZ处理组中RSAD2的表达无显著差异，si-RSAD2干扰组中RSAD2的表达显著降低，si-RSAD2+TMZ组中RSAD2的表达进一步降低；C：实时定量PCR检测图，检测耐药细胞株U251R中RSAD2在mRNA水平上的表达，与NC组相比，TMZ处理组中RSAD2的表达无显著差异，si-RSAD2干扰组中RSAD2的表达显著降低，si-RSAD2+TMZ组中RSAD2的表达进一步降低；D：Western Blot检测图，检测耐药细胞株U251R中RSAD2在蛋白水平上的表达，与NC组相比，TMZ处理组中RSAD2的表达无显著差异，si-RSAD2干扰组中RSAD2的表达显著降低，si-RSAD2+TMZ组中RSAD2的表达进一步降低。
图4A：si-RSAD2干扰可逆转恶性胶质瘤细胞株对TMZ的耐药性，克隆形成实验图，检测耐药细胞株U87R的细胞增殖能力，与NC组相比，TMZ处理组的细胞增殖能力无显著差异，si-RSAD2干扰组中细胞增殖能力显著降低，si-RSAD2+TMZ组中细胞增殖能力进一步降低。
图4B：si-RSAD2干扰可逆转恶性胶质瘤细胞株对TMZ的耐药性，克隆形成实验图，检测耐药细胞株U251R的细胞增殖能力，与NC组相比，TMZ处理组的细胞增殖能力无显著差异，si-RSAD2干扰组中细胞增殖能力显著降低，si-RSAD2+TMZ组中细胞增殖能力进一步降低。
图4C：si-RSAD2干扰可逆转恶性胶质瘤细胞株对TMZ的耐药性，流式细胞术实验图，检测耐药细胞株U87R的细胞凋亡率，与NC组相比，TMZ处理组的细胞凋亡率无显著差异，si-RSAD2干扰组中细胞凋亡率显著升高，si-RSAD2+TMZ组中细胞凋亡率进一步上升。
图4D：si-RSAD2干扰可逆转恶性胶质瘤细胞株对TMZ的耐药性，流式细胞术实验图，检测耐药细胞株U251R的细胞凋亡率，与NC组相比，TMZ处理组的细胞凋亡率无显著差异，si-RSAD2干扰组中细胞凋亡率显著升高，si-RSAD2+TMZ组中细胞凋亡率进一步上升。
图5：si-RSAD2干扰及TMZ处理对wnt信号通路的影响，Western Blot检测图，分别检测耐药细胞株U87R和U251R中wnt通路的相关蛋白p-β-catenin,β-catenin,p-Smad2和Smad2的表达，与NC组相比，TMZ处理组中p-β-catenin和p-Smad2的表达无显著差异，si-RSAD2干扰组中p-β-catenin和p-Smad2的表达显著降低，si-RSAD2+TMZ组中p-β-catenin和p-Smad2的表达进一步降低，各组中β-catenin和Smad2的表达水平无显著差异。
具体实施方式
本发明提供了RSAD2基因作为恶性胶质瘤细胞TMZ耐药逆转剂的新的应用，为抗肿瘤耐药药物的设计和筛选提供新的靶点。
具体的讲，本发明利用实时定量PCR和Western Blot发现RSAD2在恶性胶质瘤TMZ耐药细胞株(U87R和U251R)中的表达相对于其亲本敏感细胞株升高。进一步，本发明发现利用siRNA干扰技术，通过降低RSAD2的表达水平可以部分逆转U87R和U251R细胞株对TMZ的耐药性。因此首次提出RSAD2基因是恶性胶质瘤细胞TMZ耐药相关基因。另外，抑制RSAD2表达之后，wnt通路的激活水平也显著下降，说明RSAD2基因可能通过影响下游wnt通路的表达发挥作用。
RSAD2
RSAD2(sadical S-adenosyl methionine domain containing 1,RSAD2)是I型干扰素诱导产生的细胞质抗病毒蛋白，RSAD2的Genebank号为NM_080657。
RSAD2抑制剂
指对于RSAD2具有抑制效果的分子。对于RSAD2具有抑制效果包括但不限于：抑制RSAD2活性，或者抑制RSAD2基因转录或表达、抑制RSAD2蛋白水平。所述RSAD2抑制剂包括但不限于siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。
抑制RSAD2活性是指使RSAD2活力下降。优选地，相比抑制前，RSAD2活力下降至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，更佳的降低至少80％，最佳的降低至少90％。
抑制RSAD2基因转录或表达是指：使RSAD2的基因不转录，或降低RSAD2的基因的转录活性，或者使RSAD2的基因不表达，或降低RSAD2的基因的表达活性。
本领域技术人员可以使用常规方法对RSAD2的基因转录或表达进行调节，如基因敲除、同源重组，干扰RNA等。
RSAD2的基因转录或表达的抑制可以通过PCR及Western Blot检测表达量验证。
优选地，与野生型相比，RSAD2基因转录或表达降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地RSAD2基因完全没有表达。
小分子化合物
本发明中指由几个或几十个原子组成，分子质量在1000以下的化合物。
RSAD2抑制剂制备胶质瘤治疗药物
以RSAD2抑制剂为主要活性成分或主要活性成分之一制备胶质瘤治疗药物。通常，药物中除了有效成分外，根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。
“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
“药学上可接受的载体或辅料”应当与RSAD2抑制剂相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。
联合治疗药物组合和施用方法
所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：
一)将RSAD2抑制剂和其他胶质瘤治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。使用时，可几种药同时使用，也可几种药先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对机体有效的期间内向机体施加其他药物。
二)将RSAD2抑制剂和其他胶质瘤治疗药物配置成复方制剂，在将RSAD2抑制剂和其他胶质瘤治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。
抗体常用的用药方法为静脉注射、静脉滴注或动脉灌注。其用法用量可参考现有技术。
小分子化合物常用的用药方法可以是胃肠道给药或者是胃肠外给药。siRNA、shRNA、抗体则一般采用胃肠外给药。可以是局部给药亦可以为全身给药。
可以同步地或顺序地给予有效量的RSAD2抑制剂和至少一种有效量的其他胶质瘤治疗药物。
使用时，可将有效量的RSAD2抑制剂和有效量的其他胶质瘤治疗药物同时使用，也可将有效量的RSAD2抑制剂和有效量的其他胶质瘤治疗药物先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对生物体有效的期间内向生物体施加其他药物。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1：细胞培养
人神经胶质瘤细胞系U87和U251均购自北纳生物细胞库。U87和U251细胞均用含10％胎牛血清(FBS)及含谷氨酰胺、丙酮酸钠的DMEM-H培养，置于37℃，5％C02培养箱培养。
将U87细胞和U251细胞暴露在浓度逐渐增加的替莫唑胺(temozolomide,TMZ)中，培养耐药细胞U87R和U251细胞。简而言之，使用含有2μM TMZ的培养基培养细胞，进行传代。TMZ的诱导剂量每代增加2μM。当浓度达到20μM时停止培养。同样的方式使用DMSO处理U87细胞和U251作为耐药对照。
实施例2：细胞系耐药性分析
用含10％胎牛血清的培养液将细胞配成单个细胞悬液，以每孔1000个细胞接种到96孔板，每孔体积200μL。37℃、5％CO2恒温培养箱中培养3-5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配制，pH＝7.4)10μL继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液(悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液)。每孔加100μL DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。选择490nm，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。并通过曲线计算IC50值。以上实验重复3次。原代细胞和耐药细胞的IC50值见表1。
表1：原代细胞和耐药细胞的IC50
Figure BDA0001626168860000101
结论：耐药细胞系U87R和U251R相对各自敏感细胞株U87和U251对TMZ有强的耐药抵抗性(如图1A和图1B所示)。
实施例3：实时定量PCR分析RSAD2在各细胞系中的表达
用
Figure BDA0001626168860000111
试剂提取样本总RNA。通过NanoDrop 2000(Thermo Fisher ScientificInc,USA)进行定量后，使用200ng总RNA利用ReverTra Ace qPCR RT Kit(Toyobo,Japan)，根据说明书进行逆转录操作。用以下引物进行实时定量PCR扩增，RSAD2基因编码区引物：
RSAD2
Forward:5’-ATTTGGCCATATGAGGCTGT-3’(SEQ ID NO.1)
Reverse:5’-ATCCTGGATGAGACACGCAC-3’(SEQ ID NO.2)
GAPDH
Forward:5’-AACAGCCTCAAGATCATCAGC-3’(SEQ ID NO.3)
Reverse:5’-GGATGATGTTCTGGAGAGCC-3’(SEQ ID NO.4)。
PCR反应参数：95℃5min；95℃30sec,59℃30sec,72℃30min共40个循环。70℃至95℃绘制溶解曲线。以上实验重复三次。以GAPDH为内对照，通过2-ΔΔCt法计算各组之间目标基因RSAD2表达水平的差异；按照下列公式计算样本的相对表达量：其中ΔΔCt＝ΔCt处理组-ΔCt对照组；ΔCt＝Ct RSAD2-Ct GAPDH；
表2：实时定量PCR反应体系(20μL)
Figure BDA0001626168860000112
结论：在TMZ耐受细胞系U87R和U251R中RSAD2的表达明显高于其原代敏感细胞。表明RSAD2的表达与TMZ的耐药性成正相关(如图2A和图2C)。
实施例4：Western Blot分析RSAD2在各细胞系中的表达
取生长至对数期的培养细胞，用含蛋白酶抑制剂的新鲜细胞裂解液，裂解细胞提取总蛋白。用Bio-Rad公司Bradford方法测定蛋白浓度。按每个泳道加4μg蛋白质，计算细胞蛋白体积，按1：4的比例加5×SDS上样缓冲液将其溶解，100℃变性5min，立即置于冰上5min，短暂快速离心。上样后进行电泳，先在80V下电泳至溴酚蓝染料进入分离胶，再将电压调至120V继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。Bio-Rad电泳仪120mV恒压进行70min蛋白质的电转移，使分离的蛋白质转移至硝酸纤维素滤膜上。滤膜用PBST溶剂配制的5％脱脂牛奶在室温下封闭2h。反贴法孵育一抗4h，一抗孵育后用PBST洗膜3次，每次15min。辣根过氧化物酶标记的抗兔及鼠二抗以1：4000稀释在5％脱脂牛奶中，室温孵育滤膜Ih,PBST洗膜3次，每次15min。洗膜后进行ECL化学发光、X光片曝光并显影、定影，分析结果。
结论：在TMZ耐药细胞系U87R和U251中RSAD2的蛋白表达水平高于各自原代敏感细胞株U87和U251，表明RSAD2在蛋白水平上的表达与TMZ的耐药性也成正相关(如图2B和图2D所示)。
实施例5：筛选高效的干扰RSAD2的siRNAs片段
设计和合成针对RSAD2基因的瞬时干扰寡核苷酸序列，也就是说针对RSAD2基因的siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：
CCAGAAUUAUGGUGAGUAU；
所述siRNA的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：
AUACUCACCAUAAUUCUGG。
所述siRNA的靶序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：
5’-CCCACTAGCGTCAATTACCACTTCA-3’。
Si-RSAD2质粒载体获取自上海吉玛制药技术有限公司(GenePharma,Shanghai,China)。
设定以下分组：NC组(U87R/U251R细胞不进行处理)，TMZ组(U87R/U251R细胞加入100μM TMZ),si-RSAD2组(U87R/U251R细胞转染si-RSAD2)，si-RSAD2+TMZ组(U87R/U251R细胞转染si-RSAD2，并加入100μM TMZ)。转染前24h，取对数生长期的U87R/U251R细胞，胰酶消化后加完全培养基重悬，吸管吹打混匀制成细胞悬液。按1×106个/孔的细胞浓度将细胞接种至6孔板中，置37℃，5％CO2培养箱培养18-24h，使其转染前每孔细胞达到80％-90％的汇合率。转染前3h，去除原培养基，更换为不含血清和抗生素的新鲜基础培养基。采用脂质体Lipofectamine 2000(Life Technologies,USA)根据试剂盒说明书进行转染，在37℃，5％CO2的条件下培养48小时。
结果：将干扰序列转染入各组细胞后其干扰效果显著，RSAD2的表达水平显著降低(如图3所示)。遂本实验皆采用该序列处理细胞进行下一步研究。
实施例6：siRNA干扰RSAD2的表达可逆转肿瘤细胞对TMZ的敏感性，降低细胞存活率
细胞转染后，取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶溶液消化后吹打成单个细胞，后加入RPMI1640培养基。以1×103每孔浓度接种细胞悬液到培养皿中，轻轻摇晃培养皿使细胞均匀分散。后将培养皿置于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养1-2周，更换培养液。待培养皿出现肉眼可见的细胞克隆时终止培养。弃去上清，使用PBS清洗后，用4％多聚甲醛固定15min，去固定液，GIMSA染色10-30min，后去染色液，于空气中干燥。随机取多个视野于显微镜下计数，实验重复3次，分析不同组中肿瘤细胞的生存率及耐药性的改变。
结果：降低RSAD2在耐药细胞U87R或者U251中的表达，可以降低细胞存活力，增强其对TMZ的敏感性，逆转其对TMZ的耐药性。显示RSAD2抑制剂(例如RSAD2的siRNA干扰序列)可作为一个TMZ耐药逆转剂(如图4A和图4B所示)。
实施例7：siRNA干扰RSAD2的表达可逆转肿瘤细胞对TMZ的敏感性，提高细胞凋亡率
将细胞转染48h后，各组细胞经过收取、洗涤、重悬后，按照PE Annexin V凋亡检测试剂盒(BD，USA)说明操作，使用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞凋亡，并用FACS Diva软件分析数据。实验重复3次，分析不同组中肿瘤细胞的凋亡率及耐药性的改变。
结果：降低RSAD2在耐药细胞U87R或者U251中的表达，可以提高细胞凋亡率，增强其对TMZ的敏感性，逆转其对TMZ的耐药性。显示RSAD2抑制剂(例如RSAD2的siRNA干扰序列)可作为一个TMZ耐药逆转剂(如图4C和图4D所示)。
实施例8：Western Blot分析siRNA干扰RSAD2后wnt通路的表达情况
将细胞转染48h后，用Western Blot分析各组中wnt通路相关蛋白的表达情况。Western Blot的操作如上所述。结论：降低RSAD2在耐药细胞U87R或者U251中的表达，可以抑制wnt通路，显示RSAD2可能通过调节wnt通路影响细胞TMZ耐药性(如图5所示)。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 上海交复生物医药科技有限公司
<120> RSAD2通过wnt通路影响肿瘤细胞替莫挫胺耐药性
<130> 182069
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atttggccat atgaggctgt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atcctggatg agacacgcac 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aacagcctca agatcatcag c 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggatgatgtt ctggagagcc 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccagaauuau ggugaguau 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
auacucacca uaauucugg 19
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccactagcg tcaattacca cttca 25

Claims (4)

1.RSAD2 抑制剂用于制备胶质瘤化疗药物敏感性促进剂的用途，所述胶质瘤化疗药选自替莫唑胺。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述RSAD2抑制剂用于提高胶质瘤细胞对胶质瘤化疗药物的敏感性。
3.RSAD2抑制剂在制备胶质瘤化疗药物耐药性逆转剂中的用途，所述胶质瘤化疗药选自替莫唑胺。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述RSAD2抑制剂用于降低胶质瘤细胞对胶质瘤化疗药物的耐药性。
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"Rare ADAR and RNASEH2B variants and a type I interferon signature in glioma and prostate carcinoma risk and tumorigenesis";Ulrike Beyer et al.;《Acta Neuropathol》;20171113;参加摘要，第916页左栏第917页左栏，以及图4-5 *
"STAT6 expression in glioblastoma promotes invasive growth";Barbara C Merk et al.;《BMC Cancer》;20111231;摘要和表2 *
Barbara C Merk et al.."STAT6 expression in glioblastoma promotes invasive growth".《BMC Cancer》.2011, *

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