CN108663519A - 快速预测和提高BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对Olaparib敏感性的方法 - Google Patents

快速预测和提高BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对Olaparib敏感性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种能快速预测和提高BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对PARP1抑制剂敏感性的方法。通过本发明的方法能快速的预测BRCA1/2野生型卵巢癌病人对PARP1抑制剂的敏感性并提高BRCA1/2野生型卵巢癌病人对PARP1抑制剂的敏感性。

Description

快速预测和提高BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对Olaparib敏感 性的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及能快速预测和提高BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对 PARP1抑制剂Olaparib抑制剂敏感性的方法。
背景技术
PARP1(Poly(ADP-Ribose)Polymerase1，多聚二磷酸腺苷酸核糖聚合酶1)抑制剂是目前卵巢癌治疗中最主要、最有效的靶向药物。2014年年底，美国FDA批准了第一个PARP1抑制剂Olaparib用于晚期卵巢癌的治疗。2016年5月，另一个PARP1抑制剂Niraparib在美国上市，也用于卵巢癌的治疗。然而，PARP1抑制剂主要用于BRCA1/2(乳腺癌1号/2号基因)发生突变的卵巢癌病人，因为前期的研究表明，PARP1抑制剂在具有BRCA1/2突变的卵巢癌细胞中的作用较其在BRCA1/2野生型的卵巢癌细胞的作用更为明确，不同的 BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对PARP1抑制剂的反应差异非常大。在临床上，超过70％的卵巢癌是BRCA1/2野生型的。目前缺乏在BRCA1/2野生型的卵巢癌细胞中筛选出对PARP1 抑制剂敏感的细胞类型的检测方法，也缺乏增强BRCA1/2野生型的卵巢癌病人对PARP1抑制剂敏感性的方法。
非折叠蛋白质相应通路(unfoldedprotein response，UPR)是一系列在进化中非常保守的旨在维持细胞内质网(Endoplasmic Reticulum，ER)中蛋白质合成后正确折叠并形成功能性构象的信号传导通路。其中，UPR的一个关键分支通路是由内质网膜蛋白偶联的PERK 蛋白引发的：当被上游信号激活后，PERK自身磷酸化，继而磷酸化其直接的下游分子eIF2α，后者则增强转录因子ATF4的翻译，ATF4最终进入细胞核启动相关的基因转录，包括CHOP、 ASNS和GADD34等，引起细胞存活或者凋亡的效应。
发明内容
本发明的目的是提供一种能快速预测和提高BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对PARP1抑制剂抑制剂敏感性的方法。通过本发明的方法能快速的预测BRCA1/2野生型卵巢癌病人对 PARP1抑制剂的敏感性并提高BRCA1/2野生型卵巢癌病人对PARP1抑制剂的敏感性。本发明提供的技术方案如下所述。
一种能快速预测BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对PARP1抑制剂敏感性的方法，通过检测细胞UPR中PERK通路的激活水平，即eIF2a蛋白的磷酸化程度和ATF4蛋白的表达水平来预测BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对PARP1抑制剂的敏感性。
本发明的另一目的是提供一种提高BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对PARP1抑制剂敏感性的方法，通过抑制UPR中PERK通路的激活水平来提升BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对Olaparib抑制剂的敏感性。
附图说明
图1是本发明实施例中1的结果图；
图2是本发明实施例中2的结果图；
图3是本发明实施例中3的结果图；
图4是本发明实施例中4的结果图；
图5是本发明实施例中5的结果图；
图6是本发明实施例中6的结果图；
图7是本发明实施例中7的结果图。
具体实施方式
下面给出本发明的较佳的实施例，这些实施例并非限制本发明的内容。
实施例1
在体外细胞培养条件下，用“浓度—效应”法测定8株BRCA1/2野生型卵巢癌细胞系对 Olaparib处理的半致死浓度(EC50)。
实验方法：
1.8株BRCA1/2野生型卵巢癌细胞OVCA1，OVCA2，OVCA3，OVCA4，OVCA5，OVCA6，OVCA7和OVCA8用RPMI-1640培养基进行培养(同时添加10％胎牛血清，10unit/ml青霉素和10unit/ml链霉素)。培养条件为37℃，5％CO2。Olaparib(Selleck Chem公司)用DMSO 进行溶解，储存液浓度为10mM。
2.在96孔细胞培养板上，以4000细胞/孔的密度种植8株细胞。在细胞种植24小时后，对细胞进行Olaparib的处理，浓度为40μM，20μM，10μM，5μM，2.5μM，1.25μM，0.625 μM，0.31μM和0μM(DMSO)。处理72小时后，用CellTiter Glo(Promega公司)试剂进行细胞活性测定，用Prism软件进行“浓度—效应”的计算，得出8株细胞对Olaparib处理的半致死浓度(EC50)。
实验结果：
见图1。
实施例2
通过蛋白质印迹技术(Western blotting)，获得8株BRCA1/2野生型卵巢癌细胞系中 eIF2α磷酸化，ATF4表达水平和内参GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase) 的数据。然后把上述蛋白的表达量和各自细胞株对的EC50浓度进行相关性分析，发现磷酸化eIF2α和ATF4的水平与细胞对Olaparib的EC50呈显著相关：eIF2α磷酸化水平越高，ATF4 的表达水平越高，BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对Olaparib的敏感性越低(EC50越高)。
实验方法：
1.8株BRCA1/2野生型卵巢癌细胞OVCA1，OVCA2，OVCA3，OVCA4，OVCA5，OVCA6，OVCA7和OVCA8用RPMI1640培养基进行培养(同时添加10％胎牛血清，10unit/ml青霉素和10unit/ml链霉素)。培养条件为37℃，5％CO2。Olaparib用DMSO进行溶解，储存液浓度为10mM。
2.用标准的RIPA缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 7.5)，150mM NaCl，1mM Na2EDTA，1mMEGTA(Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid)，1％NP-40，1％sodiumdeoxycholate(脱氧胆酸钠)，2.5mM sodium pyrophosphate(焦磷酸钠)，1mM beta-glycerophosphate(β-甘油磷酸钠)，1mMNa3VO4(钒酸钠)，1μg/ml leupeptin(亮抑蛋白酶肽)，1mM PMSF(Phenylmethanesulfonyl fluoride))在冰上收集上述8株细胞的细胞裂解液。用Bradford方法测定上述裂解液的蛋白质浓度，并用RIPA缓冲液(Abcam公司)， 350mMDTT(DL-Dithiothreitol)，25％glycerol，2％SDS，0.01％Bromophenol Blue(溴酚蓝BPB)配成1μg/μl的蛋白裂解液。75℃加热10分钟。
3.用蛋白印记技术(Western Blotting)法对上述8株细胞的蛋白样本中的eIF2a磷酸化水平，eIF2a表达水平，ATF4表达水平和GAPDH表达水平进行测定。
1)用SDS-PAGE法(分离胶浓度为10％)进行蛋白质的分离；
2)把蛋白转移到硝酸纤维膜上；
3)用含5％脱脂牛奶的TBST缓冲液在室温封闭1小时；
4)一抗孵育：抗磷酸化eIF2α(Cell signaling technology#9721)，抗ATF4(CellSignaling technology#11815)，抗GAPDH抗体在4℃孵育12小时；
5)用与上述一抗相应的辣根过氧化物酶偶联的二抗进行室温孵育1小时。
6)用SuperSignalTM West Pico化学发光底物进行显色，在胶片上进行曝光。胶片用 Epson扫描仪(爱普生公司)扫描后各个样本中的蛋白条带的强度用ImageJ软件进行定量。 4.用Prism如见对上述蛋白的表达量和各自细胞对Olaparib的EC50进行Pearson相关性分析，获得相应的相关系数和统计学显著性。
实验结果：
磷酸化eIF2α和ATF4的水平与细胞对Olaparib的EC50呈显著相关：eIF2α磷酸化水平越高，ATF4的表达水平越高，BRCA1/2卵巢癌细胞对Olaparib的敏感性越低(EC50 越高)。结果见图2。
实施例3
把5株细胞OVCA1，OVCA2，OVCA4，OVCA6和OVCA7种植到裸鼠皮下并形成肿瘤，在种植两周后进行Olaparib的处理，得到5株细胞在形成肿瘤过程被Olaparib 抑制的程度的数据(TGI值)。然后把5株细胞中eIF2a的磷酸化水平和ATF4表达水平与5株细胞在裸鼠体内被Olaparib抑制的程度进行相关性分析。结论为eIF2a的磷酸化水平和ATF4表达水平与细胞在裸鼠体内对Olaparib响应程度显著相关。
实验方法：
采取实施例1中的方法进行株细胞OVCA1，OVCA2，OVCA4，OVCA6和OVCA7 这5株细胞的培养，维持和扩增。采集106的细胞注射到8周龄的裸小鼠(nude mice) 的右腹股沟皮下，每种细胞注射10只裸鼠。注射后，把10只动物随机分成两组，A组为对照组，B组为Olaparib注射组。B组的动物接受50mg/kg/d剂量的Olaparib悬液的腹腔注射，注射期限为动物接种肿瘤细胞后的第三周到第六周。A组动物用相同的注射方法在相同的时间内进行生理盐水的注射。在接种肿瘤细胞六周后，各组动物的肿瘤被取出，称重。肿瘤抑制率的计算方法为：TGI＝(A组肿瘤平均值-B组肿瘤平均值)/A 组肿瘤平均值×100％。
采用Prism软件对5株细胞的eIF2a磷酸化水平和ATF4表达水平(结果来自实施例1)和来自5株细胞的TGI数值进行Pearson相关性分析。
实验结果：
上述5株细胞中磷酸化eIF2α和ATF4的水平与细胞对Olaparib的TGI呈显著的负相关：eIF2α磷酸化水平越高，ATF4的表达水平越高，BRCA1/2野生型卵巢癌细胞在裸鼠体内被Olaparib的抑制程度(TGI)越低，即敏感性越低。结果见图3。
实施例4
在细胞体外培养的条件下，通过RNA干扰技术降低PERK的表达水平可以有效降低OVCA7细胞在Olaparib处理时的EC50，提高细胞对Olaparib的敏感性。
实验方法：
采用pLKO.1(来自美国addgene公司)空质粒，把化学合成的小DNA片段TGCATCTGCCTGGTTACTTAA(shPERK-1)和 GTTGTGCTAGCAACCCTAATA(shPERK-2)克隆进去pLKO.1质粒。把上述质粒，包括对照的空质粒(shControl)，shPERK-1和shPERK-2，通过Lipofectamine2000试剂(Thermo Fisher Scientific公司)转染OVCA7细胞，用2ug/ml浓度的puromycin(CST公司)对转染后的OVCA7细胞进行筛选，获得稳定表达上述质粒的OVCA7细胞 (OVCA7-shControl，OVCA7-shPERK-1，和OVCA7-shPERK-2)。OVCA7细胞中的 PERK蛋白的表达水平，eIF2a的磷酸化水平和GAPDH蛋白的表达水平用实施例2中的蛋白印记技术和定量方法进行检测和定量。
利用上面获得的OVCA7-shControl，OVCA7-shPERK-1，和OVCA7-shPERK-2细胞，进行实施例1中的Olaparib处理，获得Olaparib对上述细胞的EC50值。
实验结果：
通过对比蛋白印记的实验定量结果和EC50值，发现OVCA7细胞的PERK蛋白通过RNA干扰技术降低后，Olaparib对细胞的EC50值降低了，表明细胞对Olaparib变得更加敏感。见图4。
实施例5
在细胞体外培养的条件下，通过RNA干扰技术降低ATF4的表达水平可以有效降低OVCA7细胞中ATF4的表达水平，同时，也降低细胞在Olaparib处理时的EC50。实验方法：
采用pLKO.1(来自美国addgene公司)质粒，把化学合成的小DNA片段CCACTCCAGATCATTCCTTTA(shATF4-1)和GCCTAGGTCTCTTAGATGATT (shATF4-2)克隆进去pLKO.1质粒。把上述质粒，包括对照的空质粒(shControl)， shATF4-1和shATF4-2，通过Lipofectamine2000试剂转染OVCA7细胞，用2ug/ml浓度的puromycin对转染后的OVCA7细胞进行筛选，获得稳定表达上述质粒OVCA7细胞(OVCA7-shControl，OVCA7-shATF4-1和OVCA7-shATF4-2)。用Cell-to-CT试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)和试剂盒自带的程序提取细胞的mRNA并同时进行反转录，获得cDNA。然后，利用荧光定量PCR技术，采用正向引物GACCACGTTGGATGACACTTG和反向引物GGGAAGAGGTTGTAAGAAGGTG对 OVCA7细胞中的ATF4的mRNA水平进行检测，使用的荧光定量PCR仪器为 ThermoFisher的QuantStudioTM6，荧光素使用SYBR Green，荧光定量PCR的程序使用该仪器的自带标准程序。
利用上面获得的OVCA7-shControl，OVCA7-shATF4-1和OVCA7-shATF4-2细胞，进行实施例1中的Olaparib处理，获得Olaparib对上述细胞的EC50值。
实验结果：
通过对ATF4mRNA水平的荧光定量PCR检测，发现OVCA7细胞的ATF4蛋白通过RNA干扰技术降低后，Olaparib对细胞的EC50值也相应降低了，表明细胞对Olaparib 变得更加敏感。见图5
实施例6
在细胞内外培养的条件下，加入PERK的小分子抑制剂可以增强OVCA7细胞对Olaparib的敏感性。
实验方法：
50000个OVCA7细胞种植在3.5cm直径的细胞培养皿上，加入终浓度为0.5μM的PERK小分子抑制剂(GSK2656157，EMD Millipore公司)进行预处理，处理时间为48 小时。预处理后，未经处理的OVCA7对照细胞和进行过PERK抑制剂预处理的OVCA7 细胞按照实施例1中的方法种植到96孔板上，进行同样浓度梯度的Olaparib处理，测试细胞存活，对比两种细胞对Olaparib的EC50值。
实验结果：
经过PERK小分子抑制剂预处理后，OVCA7对Olaparib的EC50值被降低了54％。见图6。
实施例7
使用OVCA7细胞进行裸鼠皮下的成瘤实验，通过进行A)对照、B)PERK抑制剂处理、C)Olaparib处理和D)PERK抑制剂和Olaparib共同处理等四种方式的处理，对比各组动物中肿瘤的生长情况，发现PERK抑制剂可以增强Olaparib的体内抑瘤作用。
实验方法：
采取实施例1中的方法进行OVCA7细胞的培养，维持和扩增。采集106的细胞注射到8周龄的裸小鼠(nude mice)的右腹股沟皮下，共注射40只裸鼠。注射后，把40 只动物随机分成四组，A组为对照组(PBS处理)，B组为PERK小分子抑制剂 GSK2656157处理组，C组为Olaparib处理组，D组为GSK2656157和Olaparib联合处理组。GSK2656157的处理剂量为50mg/Kg/d，Olaparib处理的剂量为50mg/Kg/d，均为腹腔注射，注射期限为动物接种肿瘤细胞后的第三周到第六周。A组动物用相同的注射方法在相同的时间内进行生理盐水的注射。在接种肿瘤细胞六周后，各组动物的肿瘤被取出，称重。肿瘤抑制率的计算方法为：TGI＝(A组肿瘤平均值-B/C/D组肿瘤平均值) /A组肿瘤平均值×100％。
实验结果：
使用PERK抑制剂降低PERK通路的活性可以有效提高Olaparib在动物体内抑制BRCA1/2野生型卵巢癌生长的能力。见图7。

Claims (2)

1.一种能快速预测BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对PARP1抑制剂敏感性的方法，其特征在于，通过检测细胞UPR中PERK通路的激活水平，即eIF2a蛋白的磷酸化程度和ATF4蛋白的表达水平来预测BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对PARP1抑制剂的敏感性。
2.一种提高BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对PARP1抑制剂敏感性的方法，其特征在于，通过抑制UPR中PERK通路的激活水平来提升BRCA1/2野生型卵巢癌细胞对Olaparib抑制剂的敏感性。
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