JP2017093358A - 歯周病原因菌の分析方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】室温で簡便かつ迅速に歯周病原因菌を分析する。
【解決手段】歯周病原因菌のうちＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｅｓｉｓの３菌種のアルギニン特異的ペプチダーゼ活性を室温にて分析する。その際に、抗酸化作用を有する第１の化合物およびまたはＳＨ基（メルカプト基）を保護し、ジスルフィド結合を切断する作用を有する第２の化合物を、検体分析時に存在させておく。
【選択図】図１
【解決手段】歯周病原因菌のうちＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｅｓｉｓの３菌種のアルギニン特異的ペプチダーゼ活性を室温にて分析する。その際に、抗酸化作用を有する第１の化合物およびまたはＳＨ基（メルカプト基）を保護し、ジスルフィド結合を切断する作用を有する第２の化合物を、検体分析時に存在させておく。
【選択図】図１
Description
この発明は歯周病原因菌の分析方法、詳しくは、高温条件下で測定される歯周病原因菌を室温で分析することが可能であり、特殊機器を必要としない歯周病原因菌の分析方法に関する。
歯周病は、わが国の成人の約８０％が罹患しているといわれている。歯周病は、歯牙喪失を引き起こし、それに伴い味覚異常や唾液分泌異常が生じるだけでなく、中枢神経並びに自律神経系の異常を招くことが明らかとなっている。さらに、近年、歯周病が冠動脈性心疾患や脳梗塞などの様々な全身性疾患のリスクファクターになっていることが指摘されるようになった。
歯周病の検査項目のうち、細菌感染や炎症を検査する方法として、プラーク染色液を使用して染色歯面を目視で判定する方法や、染色せずに歯周プローブや歯科用探針等の先端で歯面を擦過してプラーク付着の有無を判定するするプラーク付着状況検査、歯肉縁下プラークをペーパポイントで採取し、検査機関に依頼してＤＮＡ定量法等により細菌数を測定する歯周病原細菌検査、歯周病原細菌に対する血清中のＩｇＧ抗体価を測定する抗体検査法等がある。これらの方法は、時間と労力、費用がかかるだけでなく、特殊な施設や技術を必要とするため、簡便、迅速に複数人の患者を同時に検査することができず、また、患者への負担も大きい。
歯周病の検査項目のうち、細菌感染や炎症を検査する方法として、プラーク染色液を使用して染色歯面を目視で判定する方法や、染色せずに歯周プローブや歯科用探針等の先端で歯面を擦過してプラーク付着の有無を判定するするプラーク付着状況検査、歯肉縁下プラークをペーパポイントで採取し、検査機関に依頼してＤＮＡ定量法等により細菌数を測定する歯周病原細菌検査、歯周病原細菌に対する血清中のＩｇＧ抗体価を測定する抗体検査法等がある。これらの方法は、時間と労力、費用がかかるだけでなく、特殊な施設や技術を必要とするため、簡便、迅速に複数人の患者を同時に検査することができず、また、患者への負担も大きい。
歯周病原因菌のうちＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｐ．ｇ菌）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（Ｔ．ｄ菌）、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｅｓｉｓ（Ｔ．ｆ菌）の３菌種はＲｅｄ Ｃｏｍｐｌｅｘ（レッドコンプレックス）と呼ばれ、重症な歯周病を引き起こす最も危険な菌種群であるとされている。この３菌種はアルギニン特異的ペプチダーゼ活性（トリプシン様酵素活性）を有しており、トリプシン様酵素活性を、合成基質を用いて検出する方法が特許文献１〜３において報告されている。
また、この酵素活性は還元剤により活性化されることも知られている（特許文献３〜４、非特許文献１）。
歯周病原因菌の重要な３菌種の存在を短時間で簡便にトリプシン様酵素活性を分析、判定することができれば、歯周病のスクリーニングとして有用な方法である。
また、この酵素活性は還元剤により活性化されることも知られている（特許文献３〜４、非特許文献１）。
歯周病原因菌の重要な３菌種の存在を短時間で簡便にトリプシン様酵素活性を分析、判定することができれば、歯周病のスクリーニングとして有用な方法である。
しかしながら、トリプシン様酵素活性は、その至適温度が５０〜６０℃でなければ十分な感度を得ることができず、測定には至適温度を維持できる特殊な機器が必要であり、歯周病原因菌の検査の普及の障害となる。このため、歯周病原因菌のうちＰ．ｇ菌、Ｔ．ｄ菌、Ｔ．ｆ菌の３菌種に特有のトリプシン様酵素活性を分析する際に、特殊な機器を必要としない室温での分析を可能とすることが切望されていた。
そこで、本発明者らは、Ｐ．ｇ菌、Ｔ．ｄ菌、Ｔ．ｆ菌の化学的特性に着目し、抗酸化作用を有する化合物またはＳＨ基（メルカプト基）を保護し、ジスルフィド結合を切断する作用を有する化合物を、トリプシン様酵素活性を分析する際に存在させることで、トリプシン様酵素活性を室温にて分析することが可能であることを知見し、この発明を完成させた。
この発明は、高温条件下で測定される歯周病原因菌のうちＰ．ｇ菌、Ｔ．ｄ菌、Ｔ．ｆ菌の３菌種に特有のトリプシン様酵素活性を室温で分析することが可能であり、特殊機器を必要としない歯周病原因菌の分析方法を提供することを目的とする。
請求項１に記載の発明は、歯周病原因菌特有のトリプシン様プロテアーゼ活性を分析することにより、歯周病原因菌の存否を分析する歯周病原因菌の分析方法であって、抗酸化作用を有する第１の化合物およびまたはＳＨ基を保護し、ジスルフィド結合を切断する作用を有する第２の化合物を、前記トリプシン様プロテアーゼ活性の分析の際に存在させ、室温にて該トリプシン様プロテアーゼ活性を分析する歯周病原因菌の分析方法である。
第１の化合物は、抗酸化作用を有する化学物質であれば特に限定されるものではなく、公知の物質を用いることができる。例えば、アスコルビン酸、αトコフェロール、グルタチオン、システイン、Ｎ−アセチルシステイン等が挙げられる。第１の化合物は１種類でも、複数種類を組み合わせてもよい。
第２の化合物は、ＳＨ基を保護し、ジスルフィド結合を切断する作用を有する化学物質であれば特に限定されるものではなく、公知の物質を用いることができる。例えば、テトラヒドロほう酸ナトリウム、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプト酢酸（チオグリコール酸）、３−メルカプト−１，２−プロパンジオール（チオグリセロール）、２−メルカプトエタノール、トリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、トリブチルホスフィン（ＴＢＰ）、ヨードアセトアミド等が挙げられる。第２の化合物は１種類でも複数種類を組み合わせてもよい。
トリプシン様プロテアーゼ活性の分析の際に第１の化合物、第２の化合物のいずれか一方を存在させてもよく、第１の化合物、第２の化合物の両方を混在させてもよい。
第２の化合物は、ＳＨ基を保護し、ジスルフィド結合を切断する作用を有する化学物質であれば特に限定されるものではなく、公知の物質を用いることができる。例えば、テトラヒドロほう酸ナトリウム、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプト酢酸（チオグリコール酸）、３−メルカプト−１，２−プロパンジオール（チオグリセロール）、２−メルカプトエタノール、トリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、トリブチルホスフィン（ＴＢＰ）、ヨードアセトアミド等が挙げられる。第２の化合物は１種類でも複数種類を組み合わせてもよい。
トリプシン様プロテアーゼ活性の分析の際に第１の化合物、第２の化合物のいずれか一方を存在させてもよく、第１の化合物、第２の化合物の両方を混在させてもよい。
室温とは、外部系から加熱も冷却もしていない状態のことを指す。おおよそ２０℃〜３０℃である。
検体は、口腔内ふき取り試料、プラーク試料、舌苔試料、唾液等の分析対象試料を適当な媒体で希釈した希釈液または分析対象試料から歯周病原因菌を適当な媒体を用いて抽出した抽出液である。
請求項２に記載の発明は、前記第１の化合物を、前記検体中に含まれる酵素に対する基質と共に吸収性物質に含ませた請求項１に記載の歯周病原因菌の分析方法である。
請求項３に記載の発明は、前記第２の化合物を、前記検体中に含まれる酵素に対する基質と共に吸収性物質に含ませた請求項１または請求項２に記載の歯周病原因菌の分析方法である。
請求項３に記載の発明は、前記第２の化合物を、前記検体中に含まれる酵素に対する基質と共に吸収性物質に含ませた請求項１または請求項２に記載の歯周病原因菌の分析方法である。
第１の化合物、第２の化合物は、基質とともに吸水性物質に含ませることができる（乾燥保持法）。基質とは、検体中に含まれる歯周病原因菌の有する酵素の作用を受けて化学反応を起こす物質である。基質は、特に限定されるものではなく、公知の基質を採用することができる。この試薬を吸水性物質（試験片、担体）に含ませておき、分析対象検体と吸水性物質とを直接接触させ、歯周病原因菌の酵素活性により遊離する発色物質の有無を分析する。この場合、必要に応じて発色試薬を用いることができる。
発色試薬としては、種々の公知の試薬を用いることができる。例えば、４−ヒドロキシ−３−［（２，４−ジヒドロキシ−３−キノリル）アゾ］ベンゼンスルホン酸ナトリウム、４−ベンゾイルアミノ−２，５−ジエトキシベンゼンジアゾニウム、４−（ジメチルアミノ）シンナムアルデヒド等を用いることができる。
発色試薬としては、種々の公知の試薬を用いることができる。例えば、４−ヒドロキシ−３−［（２，４−ジヒドロキシ−３−キノリル）アゾ］ベンゼンスルホン酸ナトリウム、４−ベンゾイルアミノ−２，５−ジエトキシベンゼンジアゾニウム、４−（ジメチルアミノ）シンナムアルデヒド等を用いることができる。
吸水性物質は、吸水性を有し、第１の化合物、第２の化合物を含むことが可能な担体であれば特に限定されない。例えば、紙、ろ紙、セルロース、不織布、ガラス繊維または綿等を挙げることができる。この吸水性物質に基質を含ませておくこともできる。この吸水性物質は、そのまま使用することもでき、あるいは、適当な部材、例えば防水性紙、ガラス、プラスチック、木材または金属等に具備させ、取り扱いを容易にすることもできる。吸水性物質の形状ならびに長さ、太さは検体を接触することができれば特に限定されるものではない。
乾燥保持法として、第１の化合物、第２の化合物を基質とともにあるいは別々に適当な溶媒に溶解または分散させ、その溶解液（または分散液）を吸水性物質に含ませることができる。溶媒としては、例えばトリス塩酸緩衝液、トリスマレイン酸緩衝液、リン酸緩衝液または精製水等を使用することができる。さらにこれらの溶媒に適当な界面活性剤、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、オクチルフェノールエトキシレート等を添加したものを使用することができる。
第１の化合物、第２の化合物の１ｍＭ〜１００ｍＭの溶解液（分散液）を吸水性物質に１０μＬ〜５００μＬを染み込ませ、その後、自然乾燥、送風乾燥、減圧真空乾燥または凍結乾燥により乾燥させて用いることができる。
第１の化合物、第２の化合物の１ｍＭ〜１００ｍＭの溶解液（分散液）を吸水性物質に１０μＬ〜５００μＬを染み込ませ、その後、自然乾燥、送風乾燥、減圧真空乾燥または凍結乾燥により乾燥させて用いることができる。
請求項４に記載の発明は、前記第１の化合物を、前記検体中に含ませ、この第１の化合物が含まれた検体を、該検体中に含まれる酵素に対する基質に加える請求項１に記載の歯周病原因菌の分析方法である。
請求項５に記載の発明は、前記第２の化合物を、前記検体中に含ませ、この第２の化合物が含まれた検体を、該検体中に含まれる酵素に対する基質に加える請求項１または請求項４に記載の歯周病原因菌の分析方法である。
請求項５に記載の発明は、前記第２の化合物を、前記検体中に含ませ、この第２の化合物が含まれた検体を、該検体中に含まれる酵素に対する基質に加える請求項１または請求項４に記載の歯周病原因菌の分析方法である。
第１の化合物、第２の化合物を適当な溶媒に溶解した後、検体に添加することができる（溶液法）。また、第１の化合物、第２の化合物を直接検体に添加することもできる。
溶媒としては、例えばトリス塩酸緩衝液、トリスマレイン酸緩衝液、リン酸緩衝液または精製水等を使用することができる。さらにこれらの溶媒に適当な界面活性剤、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、オクチルフェノールエトキシレート等を添加したものを使用することができる。
第１の化合物、第２の化合物の１０ｍＭ〜１０００ｍＭの溶解液を検体に、検体の体積の１／１０容量を添加することができる。また、第１の化合物、第２の化合物を直接検体に添加する場合、添加量はおよそ１ｍＭ〜１００ｍＭである。
溶媒としては、例えばトリス塩酸緩衝液、トリスマレイン酸緩衝液、リン酸緩衝液または精製水等を使用することができる。さらにこれらの溶媒に適当な界面活性剤、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、オクチルフェノールエトキシレート等を添加したものを使用することができる。
第１の化合物、第２の化合物の１０ｍＭ〜１０００ｍＭの溶解液を検体に、検体の体積の１／１０容量を添加することができる。また、第１の化合物、第２の化合物を直接検体に添加する場合、添加量はおよそ１ｍＭ〜１００ｍＭである。
請求項６に記載の発明は、前記トリプシン様プロテアーゼ活性の分析は、Ｎ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニンペプチダーゼの有無により行う請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の歯周病原因菌の分析方法である。
本発明によれば、抗酸化作用を有する第１の化合物およびまたはＳＨ基を保護し、ジスルフィド結合を切断する作用を有する第２の化合物を検体に含ませることにより、従来高温条件下で測定されていたＰ．ｇ菌、Ｔ．ｄ菌、Ｔ．ｆ菌の３菌種に特有のトリプシン様酵素活性を室温で分析することが可能となる。これにより、トリプシン様酵素活性を短時間で簡便に分析、判定することができ、歯周病のスクリーニングとして有用である。
以下、この発明の実施例を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
（第１の化合物、第２の化合物の調製）
抗酸化作用を有する化合物（第１の化合物）として、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−システイン塩酸塩、グルタチオンをそれぞれ６２．５ｍＭ、１２５ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ採取し、採取した第１の化合物を５０ｍＭトリスマレインン酸緩衝液ｐＨ８．５に溶解後、溶解液のｐＨが８．５となるようにｐＨ調整を行った。
ＳＨ基を保護し、ジスルフィド結合を切断する作用を有する化合物（第２の化合物）として、ＤＴＴ、チオグリコールさん、チオグリセロール、メルカプトエタノール、ＴＣＥＰを６２．６ｍＭ、１２５ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ濃度に、５０ｍＭトリスマレイン酸緩衝液ｐＨ８．５に溶解後、溶解液のｐＨが８．５となるようにｐＨ調整を行った。
抗酸化作用を有する化合物（第１の化合物）として、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−システイン塩酸塩、グルタチオンをそれぞれ６２．５ｍＭ、１２５ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ採取し、採取した第１の化合物を５０ｍＭトリスマレインン酸緩衝液ｐＨ８．５に溶解後、溶解液のｐＨが８．５となるようにｐＨ調整を行った。
ＳＨ基を保護し、ジスルフィド結合を切断する作用を有する化合物（第２の化合物）として、ＤＴＴ、チオグリコールさん、チオグリセロール、メルカプトエタノール、ＴＣＥＰを６２．６ｍＭ、１２５ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ濃度に、５０ｍＭトリスマレイン酸緩衝液ｐＨ８．５に溶解後、溶解液のｐＨが８．５となるようにｐＨ調整を行った。
（基質の調製）
基質として、Ｎ−α−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−２−ナフチルアミド塩酸塩（シグマアルドリッチジャパン合同会社から入手）を５０ｍＭトリスマレイン酸緩衝液ｐＨ８．５に溶解した。基質濃度は０．１１重量％である。
基質として、Ｎ−α−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−２−ナフチルアミド塩酸塩（シグマアルドリッチジャパン合同会社から入手）を５０ｍＭトリスマレイン酸緩衝液ｐＨ８．５に溶解した。基質濃度は０．１１重量％である。
（発色液の調製）
４−（ジメチルアミノ）シンナムアルデヒド（ＤＭＡＣ）（シグマアルドリッチジャパン合同会社から入手）を１ｍｏｌ／Ｌ塩酸に溶解した。ＤＭＡＣの濃度は０．１重量％である。
４−（ジメチルアミノ）シンナムアルデヒド（ＤＭＡＣ）（シグマアルドリッチジャパン合同会社から入手）を１ｍｏｌ／Ｌ塩酸に溶解した。ＤＭＡＣの濃度は０．１重量％である。
（Ｐ．ｇ菌（検体）の培養）
調整Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｐ．ｇ菌）ＪＣＭ１２２５７を、ブイヨン培地に接種し、３７℃、２４時間嫌気培養し、１．１×１０６ｃｆｕ／ｍＬの菌培養液を得た。
ブイヨン培地は、トリプリケースソイブロス３．０ｇ、イーストエクストラクト０．５ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．０５ｇ、ヘミン溶液０．１ｍＬ、ビタミンＫ１溶液０．０２ｍＬ、蒸留水１００ｍＬによって調製し、調整後に１２１℃、１５分間殺菌処理を行った。
ヘミン溶液はヘミン０．００５ｇ、リン酸水素カリウム０．０１７４ｇを蒸留水１ｍＬに溶解したものである。ビタミンＫ１溶液は、ビタミンＫ１を５ｍｇ、エタノール１ｍＬに溶解したものである。
菌数の測定方法は、嫌気培養後のブイヨン培養液を滅菌生理食塩水にて１０倍段階希釈し、ＣＤＣ嫌気性菌用ヒツジ血液寒天培地（ベクトンデッキンソン社から入手）に接種後、３７℃、４８時間培養し、培地上に発育した集落を肉眼にて計測することで菌数測定を行った。
調整Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｐ．ｇ菌）ＪＣＭ１２２５７を、ブイヨン培地に接種し、３７℃、２４時間嫌気培養し、１．１×１０６ｃｆｕ／ｍＬの菌培養液を得た。
ブイヨン培地は、トリプリケースソイブロス３．０ｇ、イーストエクストラクト０．５ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．０５ｇ、ヘミン溶液０．１ｍＬ、ビタミンＫ１溶液０．０２ｍＬ、蒸留水１００ｍＬによって調製し、調整後に１２１℃、１５分間殺菌処理を行った。
ヘミン溶液はヘミン０．００５ｇ、リン酸水素カリウム０．０１７４ｇを蒸留水１ｍＬに溶解したものである。ビタミンＫ１溶液は、ビタミンＫ１を５ｍｇ、エタノール１ｍＬに溶解したものである。
菌数の測定方法は、嫌気培養後のブイヨン培養液を滅菌生理食塩水にて１０倍段階希釈し、ＣＤＣ嫌気性菌用ヒツジ血液寒天培地（ベクトンデッキンソン社から入手）に接種後、３７℃、４８時間培養し、培地上に発育した集落を肉眼にて計測することで菌数測定を行った。
（実施例１）第１の化合物及び第２の化合物の単独添加による乾燥保持法の実施
（Ａ）基質及び第１の化合物、第２の化合物の乾燥保持
調整した第１の化合物または第２の化合物と、基質とを１：９の割合で混合し、１０ｍｍのペーパディスク（アドバンテック社から入手）１枚あたり８０μＬ染み込ませた。その後、ペーパディスクを２５℃、一晩乾燥させた。
（Ａ）基質及び第１の化合物、第２の化合物の乾燥保持
調整した第１の化合物または第２の化合物と、基質とを１：９の割合で混合し、１０ｍｍのペーパディスク（アドバンテック社から入手）１枚あたり８０μＬ染み込ませた。その後、ペーパディスクを２５℃、一晩乾燥させた。
（Ｂ）Ｐ．ｇ菌の調整
２４時間培養後の菌培養液を５０ｍＭトリスマレイン酸緩衝液ｐＨ８．５にて１０倍段階希釈し、１．１×１０６ｃｆｕ／ｍＬ、１．１×１０５ｃｆｕ／ｍＬ、１．１×１０４ｃｆｕ／ｍＬ、１．１×１０３ｃｆｕ／ｍＬの菌液を調整した。
２４時間培養後の菌培養液を５０ｍＭトリスマレイン酸緩衝液ｐＨ８．５にて１０倍段階希釈し、１．１×１０６ｃｆｕ／ｍＬ、１．１×１０５ｃｆｕ／ｍＬ、１．１×１０４ｃｆｕ／ｍＬ、１．１×１０３ｃｆｕ／ｍＬの菌液を調整した。
（Ｃ）試験方法
各濃度の第１の化合物または第２の化合物と、基質とを染み込ませたペーパディスクに調製後のＰ．ｇ菌液を８０μＬ染み込ませたものを２つ用意し、一方を室温で、他方を５０℃にてそれぞれ１０分間静置した。前者を室温分析、後者を５０℃分析と称する。その後、ペーパディスクに発色液を３０μＬ滴下し、ペーパディスクの発色を肉眼にて観察、判定を行った。
各濃度の第１の化合物または第２の化合物と、基質とを染み込ませたペーパディスクに調製後のＰ．ｇ菌液を８０μＬ染み込ませたものを２つ用意し、一方を室温で、他方を５０℃にてそれぞれ１０分間静置した。前者を室温分析、後者を５０℃分析と称する。その後、ペーパディスクに発色液を３０μＬ滴下し、ペーパディスクの発色を肉眼にて観察、判定を行った。
（Ｄ）結果
第１の化合物、第２の化合物のＰ．ｇ菌の検出感度を図１に示す。図１に示すように第１の化合物、第２の化合物が存在しない室温分析では、１．１×１０６ｃｆｕ／ｍＬしか検出できていないが、５０℃分析では、１．１×１０４ｃｆｕ／ｍＬまで検出でき、５０℃分析は室温と比較すると１００倍の検出感度であることがいえる。第１の化合物、第２の化合物を存在させると５０℃分析で得られる感度が室温でも同等の感度が得られることが判明した。すなわち、第１の化合物、第２の化合物が存在しない場合、室温分析と５０℃分析では１００倍の感度差が認められるが、第１の化合物、第２の化合物を存在させることで化合物の種類により検出感度に違いはあるものの、どの化合物も室温分析と５０℃分析の感度がほぼ同等であることが判明した。また、第１の化合物、第２の化合物を存在させることで得られる最小検出感度と第１の化合物、第２の化合物の至適温度を表１に示す。表１に示すように、第１の化合物、第２の化合物の効果は広い至適濃度を有していることが確認できた。
第１の化合物、第２の化合物のＰ．ｇ菌の検出感度を図１に示す。図１に示すように第１の化合物、第２の化合物が存在しない室温分析では、１．１×１０６ｃｆｕ／ｍＬしか検出できていないが、５０℃分析では、１．１×１０４ｃｆｕ／ｍＬまで検出でき、５０℃分析は室温と比較すると１００倍の検出感度であることがいえる。第１の化合物、第２の化合物を存在させると５０℃分析で得られる感度が室温でも同等の感度が得られることが判明した。すなわち、第１の化合物、第２の化合物が存在しない場合、室温分析と５０℃分析では１００倍の感度差が認められるが、第１の化合物、第２の化合物を存在させることで化合物の種類により検出感度に違いはあるものの、どの化合物も室温分析と５０℃分析の感度がほぼ同等であることが判明した。また、第１の化合物、第２の化合物を存在させることで得られる最小検出感度と第１の化合物、第２の化合物の至適温度を表１に示す。表１に示すように、第１の化合物、第２の化合物の効果は広い至適濃度を有していることが確認できた。
（実施例２）第１の化合物及び第２の化合物の単独添加による溶液法の実施
（Ａ）基質乾燥保持
調製した基質を５０ｍＭトリスマレイン酸緩衝液ｐＨ８．５と体積割合で９：１となるように混合し、１０ｍｍのペーパディスク（アドバンテック社から入手）１枚あたり８０μＬ染み込ませた。その後、ペーパディスクを２５℃、一晩乾燥させた。
（Ａ）基質乾燥保持
調製した基質を５０ｍＭトリスマレイン酸緩衝液ｐＨ８．５と体積割合で９：１となるように混合し、１０ｍｍのペーパディスク（アドバンテック社から入手）１枚あたり８０μＬ染み込ませた。その後、ペーパディスクを２５℃、一晩乾燥させた。
（Ｂ）Ｐ．ｇ菌の調整
調整した第１の化合物または第２の化合物を５０ｍＭトリスマレイン酸緩衝液ｐＨ８．５にて９倍希釈して化合物の希釈液を調整する。
２４時間培養後の菌培養液を化合物の希釈液を用いて１０段階希釈し、１．１×１０６ｃｆｕ／ｍＬ、１．１×１０５ｃｆｕ／ｍＬ、１．１×１０４ｃｆｕ／ｍＬ、１．１×１０３ｃｆｕ／ｍＬの菌液を調整した。
調整した第１の化合物または第２の化合物を５０ｍＭトリスマレイン酸緩衝液ｐＨ８．５にて９倍希釈して化合物の希釈液を調整する。
２４時間培養後の菌培養液を化合物の希釈液を用いて１０段階希釈し、１．１×１０６ｃｆｕ／ｍＬ、１．１×１０５ｃｆｕ／ｍＬ、１．１×１０４ｃｆｕ／ｍＬ、１．１×１０３ｃｆｕ／ｍＬの菌液を調整した。
（Ｃ）試験方法
基質を染み込ませたペーパディスクに調整後のＰ．ｇ菌液を８０μＬ染み込ませたものを２つ用意し、一方を室温で、他方を５０℃にてそれぞれ１０分間静置した。前者を室温分析、後者を５０℃分析と称する。その後、ペーパディスクに発色液を３０μＬ滴下し、ペーパディスクの発色を肉眼にて観察、判定を行った。
基質を染み込ませたペーパディスクに調整後のＰ．ｇ菌液を８０μＬ染み込ませたものを２つ用意し、一方を室温で、他方を５０℃にてそれぞれ１０分間静置した。前者を室温分析、後者を５０℃分析と称する。その後、ペーパディスクに発色液を３０μＬ滴下し、ペーパディスクの発色を肉眼にて観察、判定を行った。
（Ｄ）結果
第１の化合物、第２の化合物のＰ．ｇ菌の検出感度を図２に示す。図２に示すように第１の化合物、第２の化合物が存在しない室温分析では、１．１×１０６ｃｆｕ／ｍＬしか検出できていないが、５０℃分析では、１．１×１０４ｃｆｕ／ｍＬまで検出でき、５０℃分析は室温と比較すると１００倍の検出感度であることがいえる。第１の化合物、第２の化合物を存在させると、実施例１に示した乾燥保持法と同様に、５０℃分析で得られる感度が室温でも同等の感度が得られることが判明した。すなわち、第１の化合物、第２の化合物が存在しない場合、室温分析と５０℃分析では１００倍の感度差が認められるが、第１の化合物、第２の化合物を存在させることで化合物の種類により検出感度に違いはあるものの、どの化合物も室温分析と５０℃分析の感度がほぼ同等であることが判明した。また、第１の化合物、第２の化合物を存在させることで得られる最小検出感度と第１の化合物、第２の化合物の至適温度を表２に示す。表２に示すように、第１の化合物、第２の化合物の効果は広い至適濃度を有していることが確認できた。
第１の化合物、第２の化合物のＰ．ｇ菌の検出感度を図２に示す。図２に示すように第１の化合物、第２の化合物が存在しない室温分析では、１．１×１０６ｃｆｕ／ｍＬしか検出できていないが、５０℃分析では、１．１×１０４ｃｆｕ／ｍＬまで検出でき、５０℃分析は室温と比較すると１００倍の検出感度であることがいえる。第１の化合物、第２の化合物を存在させると、実施例１に示した乾燥保持法と同様に、５０℃分析で得られる感度が室温でも同等の感度が得られることが判明した。すなわち、第１の化合物、第２の化合物が存在しない場合、室温分析と５０℃分析では１００倍の感度差が認められるが、第１の化合物、第２の化合物を存在させることで化合物の種類により検出感度に違いはあるものの、どの化合物も室温分析と５０℃分析の感度がほぼ同等であることが判明した。また、第１の化合物、第２の化合物を存在させることで得られる最小検出感度と第１の化合物、第２の化合物の至適温度を表２に示す。表２に示すように、第１の化合物、第２の化合物の効果は広い至適濃度を有していることが確認できた。
本発明は、至適温度が５０〜６０℃の酵素活性が、室温分析では十分な感度が得られないものが、抗酸化作用を有する第１の化合物またはＳＨ基を保護しジスルフィド結合を切断する作用を有する化合物を吸水性物質に乾燥保持、または検体に添加することで、室温分析でも５０℃分析と同等の感度で分析できることが明らかとなった。
（実施例３）第１の化合物と第２の化合物の混合添加による乾燥保持法の実施
（Ａ）第１の化合物と第２の化合物の混合調製
第１の化合物と第２の化合物を表３に示す組合せで混合した。混合濃度は第１の化合物および第２の化合物それぞれ５００ｍＭを５０ｍＭトリスマレイン酸緩衝液ｐＨ８．５に溶解後、第１の化合物と第２の化合物を等量混合し、それぞれが２５０ｍＭになるように調製した。
（Ａ）第１の化合物と第２の化合物の混合調製
第１の化合物と第２の化合物を表３に示す組合せで混合した。混合濃度は第１の化合物および第２の化合物それぞれ５００ｍＭを５０ｍＭトリスマレイン酸緩衝液ｐＨ８．５に溶解後、第１の化合物と第２の化合物を等量混合し、それぞれが２５０ｍＭになるように調製した。
（Ｂ）基質及び第１の化合物と第２の化合物の混合物の乾燥保持
第１の化合物と第２の化合物を混合した溶液と調製した基質とを１：９の割合で混合し、１０ｍｍのペーパーディスクに１枚あたり８０μＬ染み込ませた。その後、ペーパーディスクを２５℃、一晩乾燥させた。（混合した第１の化合物および第２の化合物はそれぞれ終濃度２５ｍＭ）
第１の化合物と第２の化合物を混合した溶液と調製した基質とを１：９の割合で混合し、１０ｍｍのペーパーディスクに１枚あたり８０μＬ染み込ませた。その後、ペーパーディスクを２５℃、一晩乾燥させた。（混合した第１の化合物および第２の化合物はそれぞれ終濃度２５ｍＭ）
（Ｃ）Ｐ．ｇ菌の調整
２４時間培養後の菌培養液を５０ｍＭトリスマレイン酸緩衝液ｐＨ８．５にて１０倍段階希釈し、１．１×１０６ｃｆｕ／ｍＬ、１．１×１０５ｃｆｕ／ｍＬ、１．１×１０４ｃｆｕ／ｍＬ、１．１×１０３ｃｆｕ／ｍＬの菌液を調整した。
２４時間培養後の菌培養液を５０ｍＭトリスマレイン酸緩衝液ｐＨ８．５にて１０倍段階希釈し、１．１×１０６ｃｆｕ／ｍＬ、１．１×１０５ｃｆｕ／ｍＬ、１．１×１０４ｃｆｕ／ｍＬ、１．１×１０３ｃｆｕ／ｍＬの菌液を調整した。
（Ｄ）試験方法
第１の化合物と第２の化合物の混合物と基質とを染み込ませたペーパディスクに調整後のＰ．ｇ菌液を８０μＬ染み込ませたものを２つ用意し、一方を室温で、他方を５０℃にてそれぞれ１０分間静置した。前者を室温分析、後者を５０℃分析と称する。その後、ペーパディスクに発色液を３０μＬ滴下し、ペーパディスクの発色を肉眼にて観察、判定を行った。
第１の化合物と第２の化合物の混合物と基質とを染み込ませたペーパディスクに調整後のＰ．ｇ菌液を８０μＬ染み込ませたものを２つ用意し、一方を室温で、他方を５０℃にてそれぞれ１０分間静置した。前者を室温分析、後者を５０℃分析と称する。その後、ペーパディスクに発色液を３０μＬ滴下し、ペーパディスクの発色を肉眼にて観察、判定を行った。
（Ｅ）結果
第１の化合物と第２の化合物を混合添加したＰ．ｇ菌の検出感度を図３に示す。図３に示すように第１の化合物または第２の化合物を単独で添加した場合と同様に、室温分析と
５０℃分析において同等の感度となることが確認できた。検出感度に関して、Ｌ−アスコルビン酸とメルカプトエタノールの組合せにおいて、それぞれの単独添加と比較して感度が低下する現象が認められた。それ以外の組合せにおいては、単独添加と同等の感度であった。
このことから、第１の化合物と第２の化合物を混合して使用しても、単独使用の場合と同様に室温分析と５０℃分析で同等の感度が得られた。
第１の化合物と第２の化合物を混合添加したＰ．ｇ菌の検出感度を図３に示す。図３に示すように第１の化合物または第２の化合物を単独で添加した場合と同様に、室温分析と
５０℃分析において同等の感度となることが確認できた。検出感度に関して、Ｌ−アスコルビン酸とメルカプトエタノールの組合せにおいて、それぞれの単独添加と比較して感度が低下する現象が認められた。それ以外の組合せにおいては、単独添加と同等の感度であった。
このことから、第１の化合物と第２の化合物を混合して使用しても、単独使用の場合と同様に室温分析と５０℃分析で同等の感度が得られた。
（実施例４）第１の化合物と第２の化合物の混合添加による溶液法の実施
（Ａ）第１の化合物と第２の化合物の混合調製
第１の化合物と第２の化合物を表３に示す組合せで混合した。混合濃度は第１の化合物および第２の化合物それぞれ５５.５ｍＭを５０ｍＭトリスマレイン酸緩衝液ｐＨ８．５に溶解後、第１の化合物と第２の化合物を等量混合し、それぞれが２７．７５ｍＭになるように調製した。
（Ａ）第１の化合物と第２の化合物の混合調製
第１の化合物と第２の化合物を表３に示す組合せで混合した。混合濃度は第１の化合物および第２の化合物それぞれ５５.５ｍＭを５０ｍＭトリスマレイン酸緩衝液ｐＨ８．５に溶解後、第１の化合物と第２の化合物を等量混合し、それぞれが２７．７５ｍＭになるように調製した。
（Ｂ）基質乾燥保持
調製した基質を５０ｍＭトリスマレイン酸緩衝液ｐＨ８．５と体積割合で９：１となるように混合し、１０ｍｍのペーパディスク（アドバンテック社から入手）１枚あたり８０μＬ染み込ませた。その後、ペーパディスクを２５℃、一晩乾燥させた。
調製した基質を５０ｍＭトリスマレイン酸緩衝液ｐＨ８．５と体積割合で９：１となるように混合し、１０ｍｍのペーパディスク（アドバンテック社から入手）１枚あたり８０μＬ染み込ませた。その後、ペーパディスクを２５℃、一晩乾燥させた。
（Ｃ）Ｐ．ｇ菌の調整
２４時間培養後の菌培養液を、調製した第１の化合物と第２の化合物の混合液で１０段階希釈し、１．１×１０６ｃｆｕ／ｍＬ、１．１×１０５ｃｆｕ／ｍＬ、１．１×１０４ｃｆｕ／ｍＬ、１．１×１０３ｃｆｕ／ｍＬの菌液を調整した。
２４時間培養後の菌培養液を、調製した第１の化合物と第２の化合物の混合液で１０段階希釈し、１．１×１０６ｃｆｕ／ｍＬ、１．１×１０５ｃｆｕ／ｍＬ、１．１×１０４ｃｆｕ／ｍＬ、１．１×１０３ｃｆｕ／ｍＬの菌液を調整した。
（Ｄ）試験方法
基質を染み込ませたペーパディスクに調整後のＰ．ｇ菌液を８０μＬ染み込ませたものを２つ用意し、一方を室温で、他方を５０℃にてそれぞれ１０分間静置した。前者を室温分析、後者を５０℃分析と称する。その後、ペーパディスクに発色液を３０μＬ滴下し、ペーパディスクの発色を肉眼にて観察、判定を行った。
基質を染み込ませたペーパディスクに調整後のＰ．ｇ菌液を８０μＬ染み込ませたものを２つ用意し、一方を室温で、他方を５０℃にてそれぞれ１０分間静置した。前者を室温分析、後者を５０℃分析と称する。その後、ペーパディスクに発色液を３０μＬ滴下し、ペーパディスクの発色を肉眼にて観察、判定を行った。
第１の化合物と第２の化合物を混合添加したＰ．ｇ菌の検出感度を図４に示す。図４に示すように第１の化合物または第２の化合物を単独で添加した場合と同様に、室温分析と
５０℃分析において同等の感度となることが確認できた。検出感度に関して、Ｌ−システイン塩酸酸とＴＣＥＰの組合せ及びグルタチオンとＴＣＥＰの組合せにおいて、それぞれの単独添加と比較して感度が低下する現象が認められたが、第１の化合物も第２の化合物も存在しない場合と比較し、１０倍の高感度となっていた。それ以外の組合せにおいては、単独添加と同等の感度であった。このことから、第１の化合物と第２の化合物を混合して使用しても、単独使用の場合と同様に室温分析と５０℃分析で同等の感度が得られた。
５０℃分析において同等の感度となることが確認できた。検出感度に関して、Ｌ−システイン塩酸酸とＴＣＥＰの組合せ及びグルタチオンとＴＣＥＰの組合せにおいて、それぞれの単独添加と比較して感度が低下する現象が認められたが、第１の化合物も第２の化合物も存在しない場合と比較し、１０倍の高感度となっていた。それ以外の組合せにおいては、単独添加と同等の感度であった。このことから、第１の化合物と第２の化合物を混合して使用しても、単独使用の場合と同様に室温分析と５０℃分析で同等の感度が得られた。
本発明は、至適温度が５０〜６０℃の酵素活性が、室温分析では十分な感度が得られないものが、抗酸化作用を有する第１の化合物とＳＨ基を保護しジスルフィド結合を切断する作用を有する化合物を混合し、吸水性物質に乾燥保持、または検体に添加することで、室温分析でも５０℃分析と同等の感度で分析できることが明らかとなった。
この発明は、歯周病原因菌検出や診断において、歯周病のリスク判定及び進行度合いの確認、更には治療効果の確認等を簡便に把握する技術に有用である。
Claims (6)
- 歯周病原因菌特有のトリプシン様プロテアーゼ活性を分析することにより、歯周病原因菌の存否を分析する歯周病原因菌の分析方法であって、
抗酸化作用を有する第１の化合物およびまたはＳＨ基を保護し、ジスルフィド結合を切断する作用を有する第２の化合物を、前記トリプシン様プロテアーゼ活性の分析の際に存在させ、室温にて該トリプシン様プロテアーゼ活性を分析する歯周病原因菌の分析方法。 - 前記第１の化合物を、前記検体中に含まれる酵素に対する基質と共に吸収性物質に含ませた請求項１に記載の歯周病原因菌の分析方法。
- 前記第２の化合物を、前記検体中に含まれる酵素に対する基質と共に吸収性物質に含ませた請求項１または請求項２に記載の歯周病原因菌の分析方法。
- 前記第１の化合物を、前記検体中に含ませ、
この第１の化合物が含まれた検体を、該検体中に含まれる酵素に対する基質に加える請求項１に記載の歯周病原因菌の分析方法。 - 前記第２の化合物を、前記検体中に含ませ、
この第２の化合物が含まれた検体を、該検体中に含まれる酵素に対する基質に加える請求項１または請求項４に記載の歯周病原因菌の分析方法。 - 前記トリプシン様プロテアーゼ活性の分析は、Ｎ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニンペプチダーゼの有無により行う請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の歯周病原因菌の分析方法。
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|---|---|---|---|---|
| JPH01144997A (ja) * | 1987-11-30 | 1989-06-07 | Sunstar Inc | 歯周病原性菌検査薬 |
-
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2016
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