JP2017060493A - 高品質濃縮タンパク質のための微生物ベース・プロセス - Google Patents
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Abstract
【解決手段】非動物ベースの濃縮タンパク質を生産する方法であって,マッシュを形成するように約50〜170℃,圧縮比約3:1,せん断効果を与える十分なスクリュー回転数で植物材料を押し出し,更に押出し物をオートクレーブ処理し,これに複数のセルロース分解酵素及び微生物を接種し,放出された糖をタンパク質及びプルランに変換する。更に生産されたタンパク質,微生物,及びプルランを回収する方法。
【選択図】図1
Description
開示する微生物は、炭水化物および他の栄養素を変換培養物中で高品質の濃縮タンパク質に変換することが可能でなければならない。いくつかの実施形態では、本微生物は、イースト状菌である。イースト状菌の例の1つは、オーレオバシディウム・プルランスである。他の微生物の例には、クルイウェロマイセス属、ピチア族、乳酸菌、トリコデルマ・リーセイ、ヒラタケ、リゾープス属などのイースト、および、多くの種類のリグノセルロース分解微生物が含まれる。一般に、微生物の例には、スタキオース、ラフィノース、キシロースおよび他の糖を代謝させることの可能な微生物が含まれる。ただし、当業者には、過度の実験なしに、開示している方法に基づいて他の適当な微生物を選択することが可能である。
いくつかの例示的実施形態では、前処置の後、タンパク質材料(押し出した大豆白フレークなど)を、少なくとも5%の固体負荷率で水とブレンドすることもあるが、pHは、4.5〜5.5に調整される。次いで、適当な用量の加水分解酵素を添加し、3〜24時間、50℃、150〜250rpmでの攪拌によりスラリーインキュベーション(slurry incubation)を行うことができる。35℃に冷却した後、オーレオバシディウム・プルランスからなる接種材料を添加し、更に72〜120時間、または炭水化物か消費されるまで、培養物のインキュベーションを行ってもよい。インキュベーション中、無菌空気を0.5〜1L/L/hの速度でリアクタ内に噴霧してもよい。いくつかの実施形態では、変換培養物が、大豆材料を用いたインキュベーションによる約96時間未満の変換を経る。いくつかの実施形態では、変換培養物は、約96時間〜約120時間インキュベーションされることとなる。いくつかの実施形態では、変換培養物が、約120時間を超える変換を経る。変換培養物は、約35℃でインキュベーションを行うこともある。
いくつかの例示的実施形態では、変換を経た変換培養物から回収した高品質濃縮タンパク質を、食餌調合物中で使用する。いくつかの実施形態では、回収した高品質濃縮タンパク質(HQPC)が、食餌調合物中の主要なタンパク源になる。食餌調合物中のタンパク源の割合は限定されず、24〜80%のタンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、高品質濃縮タンパク質(HQPC)は、総食餌調合物タンパク源の約50%超、約60%超、または約70%超である。回収したHQPCは、フィッシュミール、大豆ミール、小麦粉、小麦グルテン、濃縮小麦、トウモロコシ粉、トウモロコシグルテン、濃縮トウモロコシなどのタンパク源、および、血粉、家禽ミール、羽毛粉などの動物性副産物の代用とすることができる。回収したHQPCを使用する食餌調合物は、残りの栄養素要件を適宜満たすように、ミネラル・プレミックスやビタミン・プレミックスなどの補助剤を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、処置ごとの(すなわち、実験用食餌と対照食餌とのブレンド物)4つの実験単位の複製を使用することもある(たとえば、それぞれ約60〜120日ごと)。試験は、固体サンプ(solids sump)、バイオリアクタ、ならびにフィルタ(100μmバッグ・フィルタ、炭素フィルタ、および紫外線フィルタ)からなり、遠心ポンプにより駆動される閉ループ再循環システムに並列に接続した110L円形タンク(タンクごとに20匹の魚)内で実施してもよい。生物種特有の成長に最適な温度を維持するために、必要に応じてヒート・ポンプを使用してもよい。全てのシステムにおいて、水質(例、溶存酸素、pH、温度、アンモニア、および窒素)をモニタしてもよい。
[実施例1:高品質濃縮大豆タンパク質(HQSPC)]
図1は、白フレークに前処置を行うための全体的な手法である、糖を細胞塊(タンパク質)およびガムに変換することと、HQSPCを回収し、水産食餌を生成すること(図2)と、結果として得られる水産食餌を魚食餌供給試験にてテストすることとを示す。まず、白フレークを、含水率15%、50℃、75rpmで押出し前処置(例、米国、ニュージャージー州、ハッケンサック、Brabender Plasti-corder SINGLE SCREW Extruder Model PL2000)にかけて、構造を破壊し、後の糖化中の加水分解酵素の注入を増やすことを可能にした。これらの条件により、バレルの両側でリッジ状チャネルに対するせん断効果がもたらされたが、これにより、酵素加水分解後の糖の放出が50〜70%増加することが前もって観察されていた。次いで、押し出した白フレークを、3mmハンマーミル・スクリーンを通過させて粉砕し、固体負荷率が10%になるように水とブレンドし、pH5に調整した。マッシュを滅菌または殺菌するために加熱した後、約50℃に冷却し、セルロース分解酵素およびオリゴ糖分解酵素(白フレーク1kgにつき、合計で15ml)を添加して、ポリマーを単糖に加水分解した(4〜24時間の加水分解)。具体的な用量には、CELLIC HTEK、6%(グルカン1g当たり)、CELLIC HTEK、0.3%(全固形分1g当たり)、NOVOZYME 960、0.015%(固体1g当たり)が含まれた。次いで、結果として得られるマッシュを30℃に冷却し、pHを3〜5に調整し、オーレオバシディウム・プルランスを接種し(1%v/v)、50〜200rpmでの混合および通気速度0.5L/L/分にて4〜5日間インキュベーションを行って、糖をタンパク質およびガムに変換した。インキュベーション中、サンプルを定期的に取り出して、糖、細胞数およびガム生産について分析した。インキュベーションの後、pHを6.5に上昇させ、エタノール(0.6L/Lブロス)を添加して、ガムを沈殿させた。タンパク質、プルランおよび微生物塊(HQSPC)を遠心分離で回収し、乾燥させ、上澄み液を蒸留して、エタノールを回収し、今後の本プロセスの開始時の再利用のために残液を化学的にアッセイした。次いで、HQSPCを、地方市場で重要な魚の1つであるイエローパーチでの食餌供給試験にてテストした。フィッシュミールおよび競合する植物ベースの材料と比較するHQSPCを用いて、テスト育成餌を調合した。性能(例、成長、食餌転換、タンパク効率)、内蔵特性、および腸組織構造を調べて、魚の反応を評価した。
本システムは、675Lバイオリアクタ、可変速度プログレッシブ空洞ポンプ(variable speed progressive cavity pump)、連続流遠心分離機、および1×4m乾燥テーブルを含んだ。675Lバイオリアクタ中で使用する接種物を、2台の5L NEW BRUNSWICK BIOFLO 3 BIOREACTOR内で調製した。試験ごとに、先に記載したようにオーレオバシディウム・プルランスを2〜3日間成長させることにより、量が8〜10Lの接種物を調製した。この材料を使用して、675Lバイオリアクタ内で調製し、押出し、糖化を行ったより多量の白フレークに接種を行った。インキュベーションの後に、 エタノールを添加し、マッシュを遠心分離にかけて、湿り気を帯びた固体を回収し、次いで、この固体を乾燥し、魚食餌供給試験にて使用した。本変換プロセスの性能をモニタすることにより、HQSPCの歩留まりや組成といった、固体回収率に大きく影響するいくつかのパラメータが観察された。大規模試験では、パラメータは、表1に示すように多様であった。
−エタノールで固体の全てを沈殿させ、遠心分離を行い、固体を乾燥させ、結果得られる上澄み液中の残留固体を測定する。
−まずブロスに遠心分離を行って、固体を回収し、固体を乾燥させ、結果得られる上澄み液からプルランを沈殿させ、乾燥を行う。
市販のSPC間のいくつかの違いを、主にタンパク質およびアミノ酸の組成ならびに栄養分吸収阻止特性について、前もって特定したが、これらの要素は、成長性能および魚の組成に多様性をもたらす。それらの実験により、フィッシュミールを含有する餌と同等であるか、またはそれよりも良好な成長性能をサポートする、より高品質なSPC生産物を開発する必要性が正当化された。商用SPCおよびメンハーデン・フィッシュミール対照と比較して、2つのHQSPC大豆生産物(発酵試験5および6)の評価を行うために、イエローパーチを利用して食餌供給試験を行った。
餌1=フィッシュミール対照
餌2=商用SPC
餌3=商用SPC(リジン+メチオニンを補充)
餌4=HQSPC試験5
餌5=HQSPC試験5(リジン+メチオニンを補充)
餌6=HQSPC試験6
餌7=HQSPC試験7(リジン+メチオニンを補充)
*全ての材料は、含水率を除き、乾燥物質基準で(現状どおりに)表している。
粗タンパク質(AOAC2006、メソッド990.03)、粗脂肪(AOAC2006、メソッド9903)、粗繊維(AOAC2006、メソッド978.10)、含水率(AOAC2006、メソッド934.01)、酸化クロム(AOAC2006、メソッド990.08)、灰(AOAC2006、メソッド942.05)、およびアミノ酸(AOAC2006、メソッド982.30E(a、b、c))についての分析を行った。
含水率(%)、水分活性(aw)、単位密度(kg/m3)、ペレット耐久性指標(%)、水安定度(分)、および色(L、a、b)について、それぞれの餌のサンプルを3回分析し、n=10の反復で、耐圧強度(g)および直径(mm)を求めた。スタンダード・メソッド2.2.2.5(NFTA、2001)を使用して含水率(%)を得た。Lab Touch awアナライザ(スイス、ラーヘン、Nocasina社)を用いてペレットのサンプル2gの水分活性(aw)を測定した。スペクトロフォトカラリメータ(spectrophotocolorimeter)(米国、バージニア州、レストン、LabScan XE、HunterLab社)を用いて、3つの色変量を、Hunter L(明度/暗度)、Hunter a(赤色度 緑色度)、およびHunter b(黄色度/青色度)として分析した。ペレット100mlの重さを量り、その質量(kg)を0.0001m3で除算することで、単位密度(UD)を概算した。スタンダード・メソッドS269.4(ASAE2003)に従って、ペレット耐久性指標(PDI)を求めた。PDIは、PDI(%)=(Ma/Mb)×100で計算したが、ただし、Maはタンブリング後の質量(g)であり、Mbはタンブリング前の質量(g)である。ペレットの安定度(分)を静的(Wstatic)メソッド(Ferouz ら、Cereal Chem (2011) 88:179-188)で求めて、それぞれが消費されるまでのタンク内でのペレット浸出を似たものにした。安定度は、(浸出による重量の減少)/(初期サンプルの乾燥重量)で計算した。ペレット直径を、従前からのノギスを使用して測定した。TA.XT Plus Texture Analyzer(米国、ニューヨーク州、スカースデール)を使用することにより、耐圧強度についてペレットをテストした。
食餌調合物は、試験3(表1)からのHQSPC栄養素分析に基づくものであり、全ての濃縮大豆タンパク質は、等しく45%(100%フィッシュミール代替物)で試験餌中に含めた。試験5および6の分析は、予定していた食餌供給試験開始日の後に完了し(表2)、結果は概ね、同様の餌であるが等窒素系ではない餌であった。タンパク質42%および脂質10%を含有し、エネルギーとタンパク質との(E:P)比率が7.91〜7.94(kcal/g)になるように餌を調合した。少し前の分析では、粗タンパク質(乾燥物質基準)が、44.9%(餌1)、43.2%(餌2および3)、36.8%(餌4および5)、37.5%(餌6および7)であった。全ての餌について、粗脂質は約10%であった。餌のアミノ酸分析では、イエローパーチの要件と比較して、補充を行わなかった餌の間に潜在的な不足は明らかにされなかった(表3)。
与えている値は、処置平均に関連する平均値(±標準誤差)である。差が著しくない値(P>0.05)は、所与の行に同一の文字を入れている。MC(%db)=含水量、aw(−)=水分活性、BD(kg/m3)=単位密度、CS(g)=耐圧強度、PDI(%)=ペレット耐久性指標、WSIstill(%)=静水中の水溶性指標、L(‐)=Hunter明度、a(‐)=Hunter黄色度、b(‐)=Hunter赤色度、Dia.(mm)=直径
餌6が、成長性能において、餌1(フィッシュミール)に最も類似した結果を示した。成長性能は、全てのカテゴリーで処置間の差が著しかった(表5)。
実験餌を与えたパーチの平均体重増加(WG、%)、比成長率(SGR)、生存率(S、%)、総消費量(TC、g)、食餌転換率(FCR)、タンパク効率(PER)、およびフルトン型条件因子(K)の値。値は、処置平均に関連する平均値(±標準誤差)である。差が著しくない値(P>0.005)は、所与の列に同一の文字を入れている。
試験分析の終わりには、最終成長、FCR、PER、消費量、および剖検による栄養の不足の調査が含まれてもよい。標準方式を使用することにより、リジンおよびメチオニンについて血漿のアッセイを完成させることもできる。筋肉の割合、肝臓体細胞指標、内蔵体細胞指標、身組成、および後腸組織構造(腸炎炎症のスコア)を量化するために、個々の魚を頚椎脱臼で安楽死させることもある。試験餌のタンパク質およびエネルギーの利用率を、食餌および糞便物質中の酸化クロム(CrO3)マーカーを使用することにより概算することもできる。糞便物質は、剖検により下部腸管から集めることもできる。
イエローパーチ用のスクリュープレスを施した合成食餌を、HQSPC餌、フィッシュ対照ミール、および商用濃縮大豆タンパク質(SPC)を使用して例示した。HQSPCベースの餌は、フィッシュミールと同等の性能を有し、商用SPCを上回った。成長および転換性能は予想を超え、HQSPC餌中の粗タンパク質含有量は、フィッシュミール対照よりも約7%低く、商用SPCよりも約6%低かった。したがって、本HQSPC餌は、フィッシュミールの完全代替物として働くことができる。
上記のイエローパーチの結果に加えて、環境に適応させたニジマス系統(シャスタ)を使用することにより、90日間の食餌供給試験を行った。表6は、魚の種類およびサイズごとのタンパク質標的をまとめている。これらの餌タンパク質標的またはレベル(%)を、こうした商業的に重要な魚用の実験餌の調合に使用することができる。
与えている値は、処置平均に関連する平均値(±標準誤差)である。
ニジマス用のスクリュープレスを施した合成食餌を、HQSPC餌およびフィッシュ対照ミールを使用して例示した。この試験では、HQSPCベースの餌は、フィッシュミールと同等の性能を有した。やはり、これらのデータは、HQSPC餌がSPC使用の予想結果より優れており(たとえば、HQSPCは含有レベル30%を超える濃度で使用することができる)、フィッシュミールの有効な代替物として働くことができることを示している。
バレル長:スクリュー直径が1:20で、圧縮比が3:1の単一スクリュー押出し機(米国、ニュージャージー州、ハッケンサック、Brabender Plasti-corder Extruder Model PL2000)を使用した押出しの、DDGSの糖化の改善への影響を調べた(図4および5)。DDGS含水率25%、温度100℃〜160℃、スクリュー回転数200rpmでは、トウモロコシ繊維からの糖の回収率は36%になると分かった(図5)。様々なNOVOZYMEリグノセルロース分解酵素の性能を別々に評価し、CELLIC CTEK2 6%(グルカン1g当たり)、CELLIC HTEK2 0.3%(全固形分1g当たり)の糖回収率は最大で70%であることが分かった。これらの前処置条件および糖化条件を、HP‐DDGSを生成するのに使用することもできる。処理コストを削減するためにフェドバッチ・バイオリアクタを使用するのとともに、添加する酵素の必要性を低減するためのセルラーゼ生産株との共培養などの次のオプションを実施してもよい。
1)本微生物と共培養することになるセルラーゼ生産微生物による、セルラーゼ酵素の代用
2)初期の固体負荷率の最大化
3)酵素の正味用量を最小限に抑え、タンパク質濃度およびガム濃度を最大にし、生産物回収コストを最小限に抑えるための、糖化または微生物変換局面(すなわち、フェドバッチ操作)中でのより多くの押出し物質の添加
対象種の要件に鑑みて、特にイエローパーチに焦点を置いて、上記の従前のドライ分別HP‐DDGSを栄養的確性について分析する。サンプルに、Van Soest繊維、不溶性炭水化物、アミノ酸、脂肪酸、およびミネラルの近似分析といった化学的分析を行う。これにより、栄養上のベンチマークが満たされていることが確実になる。HP‐DDGSの栄養分吸収阻止特性(例、フィチン酸含有量)を現在のDDGSと比較し、更なるプロセス改変のための基礎を提供する。
従前のドライ分別HP‐DDGS変換プロセスの投入量および産出量をモニタし、プロセス物質収支を確立するためにそれらを使用する。同様に、プロセスについてのエネルギー要件を測定および/または推定して、総エネルギー使用を計算する。同時に、これらの投入量を使用して暫定的コストを評価し、これを、従前のドライ分別HP‐DDGSの値と比較する。
Claims (6)
- 非動物ベースの濃縮タンパク質を生産する方法であって、
a.マッシュを形成するように、室温より上の温度で植物材料を押し出し、前記マッシュをバイオリアクタに移送することと、
b.前記バイオリアクタ内で、前記マッシュ中に糖を放出するために1つまたは複数のセルロース分解酵素を添加することと、
c.前記酵素処理を行ったマッシュに少なくとも1つの微生物を接種することであって、前記微生物が、放出された糖をタンパク質およびプルランに変換することと、
d.結果として得られるタンパク質、微生物、およびプルランをエタノール、綿状沈殿剤、またはこれらの組合せで沈殿させることと、
e.沈殿した材料を流体力により回収することと、
f.前記沈殿した材料を乾燥させることと
を含む方法。 - 押出しが、約50℃〜約170℃、圧縮比約3:1、バレルの両側でリッジ状チャネルに対するせん断効果をもたらすのに十分なスクリュー回転数で行われる、
請求項1に記載の方法。 - 前記バイオリアクタ内で少なくとも約5%の固体負荷率(solid loading rate)を実現するように、前記押し出した材料を水と混合することと、
任意選択で、前記希釈した押し出した材料にオートクレーブ処理を行い、冷却を行うことと
を更に含み、
前記1つまたは複数のセルロース分解酵素が、エンド-キシラナーゼおよびβ-キシロシダーゼ、グリコシドヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ、ヘミセルラーゼ活性、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される、
請求項1に記載の方法。 - 前記酵素処理を行ったマッシュの温度を約30℃〜約37℃に下げることと、
前記冷却したマッシュに、前記少なくとも1つの微生物の24時間培養物を約2%(v/v)接種することであって、前記少なくとも1つの微生物が、NRRL番号50792、NRRL番号50793、NRRL番号50794、NRRL番号50795、およびこれらの組合せからなる群から選択されるオーレオバシディウム・プルランス株であることと、
任意選択で、前記接種を行ったマッシュに約0.05L/L/分で空気を供給することと、
i.糖の利用が終わるまで、または、ii.前記少なくとも1つの微生物を用いたインキュベーションが約96〜120時間経過するまで、インキュベーションをおこなうことと、
を更に含む、請求項1に記載の方法。 - マッシュ1Lにつきエタノールを約0.6L添加することと、
前記エタノール処理を行ったマッシュを遠心分離することと、
を更に含み、
前記エタノールを上澄み液から回収することと、
前記上澄み液中に懸濁する微粒子を回収することと、
前記回収した微粒子を乾燥させることと、
前記回収した微粒子を前記乾燥させた沈殿した材料に統合することと、
を任意選択で更に含む、
請求項1に記載の方法。 - NRRL番号50792、NRRL番号50793、NRRL番号50794、NRRL番号50795からなる群から選択されるオーレオバシディウム・プルランス株の生物学上純粋な培養物。
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