JP2017048207A - アデノウイルス血清型26および血清型35のフィロウイルスワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
ためのアデノウイルス性ベクターに関する。
答の強力なインデューサー(誘導物質)であり、そのため、遺伝子ベースの(遺伝子に基
づく)、特に、レンチウイルスおよびフィロウイルス、ならびに他の非ウイルス性病原体
についてのワクチンのための有用なベクターとして機能するようになっている〔Shiver(
シヴァー)ら、(2002)Nature(ネイチャー)415(6869):331-5;(Hill(ヒル)ら、
Hum Vaccin(ヒューマン・ワクチンズ)6(1):78-83.;Sullivan(サリバン)ら、 (2
000) Nature 408(6812):605-9;Sullivanら、(2003)Nature 424(6949):681-4;S
ullivanら、(2006)PLoS Med(PLoS・メディシン)3(6):e177;Radosevic(ラドセヴ
ィック)ら、(2007);Santra(サントラ)ら、(2009) Vaccine(ワクチン)27(42):58
37-45〕。アデノウイルスベースのワクチンは、それらがGMP条件下で高力価に製造するこ
とができ、そして人間において安全で、かつ、免疫原性であることが証明されているので
、ヒトのワクチンとしていくつかの利点を有する〔Asmuth(アスムス)ら、J Infect Dis
(ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージズ)201(1):132-41;Kibuuk
a(キブッカ)ら、J Infect Dis、201(4):600-7;Koup(クルプ)ら、PLoS One(PloS
・ワン)5(2):e9015.;Catanzaro(カタンツァーロ)ら、(2006)J Infect Dis、19
4(12):1638-49;Harro(ハロ)ら、(2009)Clin Vaccine Immunol(クリニカル・ア
ンド・ワクチン・イムノロジー)16(9):1285-92〕。初期のワクチン研究のほとんどは
、広域抗体およびCD8+のT細胞応答を誘発することにおいて、その重要な潜在能力のため
に、rAd5を使用して行なわれたが、ヒトにおいてrAd5に対して以前から存在する免疫は有
効性を制限する可能性がある〔Catanzaro、(2006);Cheng(チェン)ら、(2007)PLoS P
athog(PLoS・パソジェンズ)3(2):e25.;McCoy(マッコイ)ら、(2007)J Virol(
ジャーナル・オブ・バイロロジー)81(12):6594-604.;Buchbinder(ブクバインダー
)ら、(2008)Lancet(ランセット)372(9653):1881-93〕。この特性は、エボラウイ
ルス(EBOV)およびマールブルグウイルス(MARV)を含め、現在開発中である多くのワク
チンのための臨床応用におけるrAd5の使用を制限するかもしれない。
査中である。これらには、稀なヒト血清型から導き出されたアデノウイルス性ベクター、
またチンパンジーのような他の動物に由来したベクターが含まれる〔Vogels(フォーゲル
ス)ら、(2003)J Virol、77(15):8263-71;Abbink(アビンク)ら、(2007)J Viro
l、81:4654-63;Santra(サントラ)(2009)〕。動物から派生したアデノウイルス性ベ
クターの使用における研究は、比較的発生期にあり、その一方、ヒトアデノウイルスはヒ
ト細胞上でよく特徴付けられた生態およびトロピズム(親和性)ならびに文書化された製
造可能性を有するという利点もつ〔Vogels(フォーゲルス)ら、(2007)J Gen Virol(
ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー)88(Pt 11):2915-24.〕。これらのベ
クターの免疫原性およびそれらのワクチンとしての可能性は、主として異種(非相同)ベ
クターとのプライム・ブーストの組合せとして、動物モデルにおいて示された〔Abbinkら
、2007;Shott(ショット)ら、(2008)Vaccine、26:2818-23〕。
存性である〔Mast(マスト)ら、(2010)Vaccine、28(4):950-7〕が、テストした51の
ヒトアデノウイルスの大きなグループの間では、Ad35およびAd11は、ほとんどが、6つの
地理学上の位置からの血清によっては稀にしか中和されなかった(Vogelsら、2003)。rA
d35ワクチンは、マウス、非ヒト霊長類、およびヒトにおいて免疫原性であり、そしてAd5
免疫を迂回することができることが示されている〔Barouch(バルーシュ)ら、(2004)J
Immunol(ジャーナル・オブ・イムノロジー)172(10):6290-7;Nanda(ナンダ)ら、
(2005)J Virol、79(22):14161-8;Ophorst(オホルスト)ら、(2006)Infect Immu
n(インフェクション・アンド・イミュニティ)74(1):313-20;Thorner(ソーナー)
ら、(2006)、J Virol、80(24):12009-16;Rodriguez(ロドリゲス)ら、(2009)Va
ccine、27(44):6226-33〕。rAd35ベクターは、臨床グレードのワクチンの製造に適し
た細胞系で高力価にまで増殖し〔Havenga(ハベンガ)ら、(2006)J Gen Virol、87(Pt
8):2135-43〕、および注射ならびに安定した吸入可能な粉末用に処方されている〔Jin
(ジン)ら、Vaccine、28(27):4369-75〕。これらのベクターは、ヒト樹状細胞の効率
的な伝達を示し〔de Gruijl(デ・グルイジル)ら、(2006)J Immunol、177(4)2208-1
5;Lore(ロア)ら、(2007)J Immunol、179(3):1721-9〕、そしてそのようにして、
高レベルの抗原送達および提示を媒介する能力を有する。Ad26は、サブグループDから、A
d5既存免疫を回避するその能力について選定された別のアデノウイルスである。Ad26の血
清学的陽性率は、一定の場合、成体集団において重要でありえるが、Ad26中和抗体力価は
Ad5の中和抗体力価よりも著しく低いままである(Abbinkら、2007;Mastら、2010)。研
究は、rAd26が、大規模で、かつ、臨床グレードでのこれらのベクターの製造に適したAd5
のE1-補完細胞系において、高力価にまで増殖しうることを示し、そしてこのベクターが
、体液性の、および細胞性の免疫応答を、プライム・ブーストワクチン戦略において誘導
することが示されている〔Abbinkら、2007;Liu(リュー)ら、(2009)Nature、457(72
25):87-91〕。
クターの単独接種の際、ならびに異種プライム・ブーストの組合せが、フィロウイルス感
染に対する防御免疫反応を生成するという発見に基づく。
分離した組換えアデノウイルスベクターを提供し、そこではアデノウイルスベクターには
、アデノウイルス26カプシド(キャプシド)タンパク質が含まれる(例として、rAd26ベ
クター)か、またはアデノウイルス35カプシドタンパク質が含まれる(例として、rAd35
ベクター)。アデノウイルスベクターは典型的に複製欠損(replication-defective)で
ある。
からの糖タンパク質である。エボラウイルスは、任意の種、たとえば、ザイールまたはス
ーダン/グル(Gulu)種であることができる。適切なフィロウイルス抗原をコードする模
範的な核酸は、配列番号1および配列番号2に示される。
子を提供する。核酸は、典型的に、フィロウイルス抗原タンパク質をコードするポリヌク
レオチド配列に操作可能に連結されたCMVプロモーターが含まれる発現カセットを含む。
フィロウイルス抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号1また
は配列番号2であってよい。
を提供する。免疫原性組成物は、さらに、アジュバントを含むことができる。
もまた提供される。これらの方法には、本発明のアデノウイルスベクターの免疫学的に効
果的な量を患者に対して施すことが含まれる。通常、アデノウイルスベクターは筋肉内に
施される。
n)、次いでブースティングワクチン投与(boosting vaccination)が続くように施され
る。たとえば、プライムはアデノウイルス26カプシドタンパク質を含むアデノウイルスベ
クターの投与であってよく、そしてブーストはアデノウイルス35カプシドタンパク質を含
むアデノウイルスベクターの投与であってよい。
たはトロピズム(親和性)の決定に関与するアデノウイルスのカプシド上のタンパク質に
言及する(例は、Ad26またはAd35)。アデノウイルスカプシドタンパク質には、典型的に
、繊維、ペントンおよび/またはヘキソン(hexon)タンパク質が含まれる。ここで用いる
ように、「Ad26カプシドタンパク質」または「Ad35カプシドタンパク質」は、たとえば、
Ad26またはAd35のカプシドタンパク質の少なくとも一部分を含むキメラカプシドタンパク
質でありうる。一定の具体化では、カプシドタンパク質は、Ad26またはAd35の全体のカプ
シドタンパク質である。一定の具体化において、ヘキソン、ペントンおよび繊維は、Ad26
のものか、またはAd35のものである。
刺激を引き起こす一またはそれよりも多く(一つ以上)の物質として規定される。このよ
うな関係においては、アジュバントは本発明のアデノウイルスベクターに対する免疫反応
を高めるために用いられる。
いてそれらの配列が最適に配列比較されるときの対応する位置を意味する。
核酸またはポリペプチド配列との関連、(例は、本発明でのアデノウイルスカプシドタン
パク質およびそれらをコードするポリヌクレオチド)で、二つ以上の配列またはサブシー
ケンス(部分配列)に言及し、それらは、同じであるか、または最大の対応について比較
および配列比較するとき、次に続く配列比較アルゴリズムの一つを用いて、または外観(
目視)検査によって測定されるように、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの指
定した割合を有する。
れた核酸分子(例は、DNAまたはRNA)またはウイルスである。たとえば、ベクターに含ま
れる組換えDNA分子は、本発明の目的のために単離されたと考えられる。分離されたDNA分
子のさらなる例には、異種宿主細胞において維持される組換えDNA分子または溶液におい
て(部分的にまたは十分に)精製されたDNA分子が含まれる。分離されたRNA分子には、本
発明のDNA分子の、インビボでの、またはインビトロでのRNA転写物が含まれる。本発明に
従う分離された核酸分子には、さらに、合成により生成されるそのような分子が含まれる
。
意図された目的のために協調して機能するように、互いに接合されていることを指す。た
とえば、コード配列は、転写がプロモーターにおいて開始され、およびコードセグメント
(または複数)中をターミネーターまで進むように正しい読み枠においてプロモーターに
操作可能に連結される。
またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドに
は、RNAおよびDNAが含まれ、そして自然源から分離され、インビトロで合成され、または
自然および合成の分子の組合せから調製することができる。この用語が二本鎖分子に適用
されるとき、それは全体の長さを示すために用いられ、そして用語「塩基対」と等価であ
ると理解されるであろう。
結合によって接合されるアミノ酸残基のポリマーである。約50個未満のアミノ酸残基のポ
リペプチドは、普通に「オリゴペプチド」と称される。
れたコード配列の転写の開始が提供されるDNA配列を含む遺伝子の一部分を表わすために
、その技術分野で認識される意味として用いる。プロモーター配列は、典型的には、遺伝
子の5′非コード領域において見出される。
、炭水化物(糖質)基のような非ペプチド性成分を含んでもよい。糖質および他の非ペプ
チド性置換基は、タンパク質が産生される細胞によってタンパク質に加えられてよく、そ
してそれは細胞の種類によって変化する。タンパク質は、ここでは、それらのアミノ酸骨
格構造に関して規定され、糖質基のような置換基は、大抵は指定されないが、それでも存
在してもよい。
カプシドタンパク質またはフィロウイルス抗原)との関連で、最大の対応について比較し
、および配列比較するとき、次に続く配列比較アルゴリズムの一つを用いて測定されるよ
うに、または外観検査によって少なくとも60%、より一層好ましくは65%、さらにより一
層好ましくは70%、またより一層好ましくは75%、さらにより一層好ましくは80%、およ
び最も好ましくは90-95%のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有する二つ以上
の配列またはサブシーケンスに言及する。好適には、実質同一性は、長さが少なくとも約
50残基である配列の領域にわたり、より一層好ましくは少なくとも約100残基の領域にわ
たって存在し、および最も好ましくは、配列は少なくとも約150残基にわたって実質同一
である。最も好ましい具体化(実施形態)では、配列は、コード領域の全長にわたって実
質同一である。
列としてはたらく。配列比較アルゴリズムを用いて、テスト配列および参照配列をコンピ
ュータに入力するとき、サブシーケンスコーディネート(部分列座標)が指定され、そし
て必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次に、配列比較
アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対するテスト
配列(群)の配列同一性パーセントを算出する。
ウォーターマン)、Adv. Appl. Math.(アドバンシーズ・イン・アプライド・マセマティ
ックス)2:482(1981)の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch(ニー
ドルマン&ブンシュ)、J. Mol. Biol.(ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー)48:443(1970)の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman
(ピアソン&リップマン)、Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA(プロシーディングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステ
イツ・オブ・アメリカ)85:2444(1988)の類似法のための研究によって、これらのアル
ゴリズムのコンピュータ化された履行〔Wisconsin Genetics Software Package(ウィス
コンシン・ジェネティックス・ソフトウェア・パッケージ)におけるGAP、BESTFIT、FAST
A、およびTFASTA、Genetics Computer Group(ジェネティックス・コンピューター・グル
ープ)、575 Science(サイエンス)Dr., Madison(マディソン)、WI(ウィスコンシン
州)〕によって、または外観検査〔大抵は、Current Protocols in Molecular Biology(
分子生物学におけるカレント・プロトコールズ)、FM Ausubel(オーセベル)ら編、Curr
ent Protocols(カレント・プロトコールズ)、a joint venture between Greene Publis
hing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.(グリーンパブリッシングアソシ
エイツ社とジョンワイリー&サンズ社との間の合弁事業)(1995サプレメント)(Ausube
l)参照〕によって実行することができる。
よびBLAST 2.0アルゴリズムであり、それらは、Altschul(アルチュール)ら、(1990)J
. Mol. Biol.、215:403-410およびAltschuelら(1977)Nucleic Acids Res.(ヌクレイ
ック・アシッズ・リサーチ)25:3389-3402のそれぞれに記載されている。BLAST分析を実
行するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information(全米
バイオテクノロジー情報センター)を通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムに
は、高スコアリング配列ペア(high scoring sequence pairs、HSPs)を、クエリーシー
ケンス(問い合わせ配列)において、長さWの短いワードを識別することによって最初に
識別することが含まれ、それらは、データベース配列において同じ長さの一ワードに合わ
せたときに、若干の正の値のしきい値スコアTと一致するか、またはそれを満たすかのど
ちらかである。Tは隣接ワードスコア閾値と称される(Altschulら、前出)。これらの初
期の隣接ワードヒットは、それらを含むより一層長いHSPsを見出すために検索の開始用の
シードとして機能を果たす。次に、ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加さ
せることができる限り、各配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチ
ド配列について、パラメータM(マッチング残基のペアのためのリワードスコア;常に>0
)およびN(ミスマッチ残基のためのペナルティスコア;常に<0)を用いて算出される。
アミノ酸配列については、スコアリングマトリクスが累積スコアを計算するために使用さ
れる。各方向におけるワードヒットの延長は停止され、それは:累積アラインメントスコ
アがその最大達成値から量Xだけ低下し;累積スコアがゼロまたはそれより下に進み、一
つ以上の負のスコアの残基アラインメントの蓄積に起因し;または、いずれかの配列の末
端に達したときである。BLASTアルゴリズムパラメータW、T、およびXは、アラインメント
の感度および速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)は、デフォルト
値として、11のワード長(W)、10の期待値(E)、M=5、N=-4、および両方の鎖の比較を
用いる。アミノ酸配列については、BLASTPプログラムは、デフォルト値として、3のワー
ド長(W)、10の期待値(E)、およびBLOSUM62のスコアリングマトリクスを用いる〔Heni
koff & Henikoff(ヘニコフ&ヘニコフ)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:10915(19
89)を参照〕。
の統計的分析を行う〔例は、Karlin(カーリン)&Altschul、Proc. Nat’l. Acad. Sci.
USA、90:5873-5787(1993)参照〕。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1
つの尺度は、最小合計確率〔P(N)〕であり、それは、2つのヌクレオチドまたはアミノ
酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。たとえば、核酸は、参照核酸に対
するテスト核酸の比較として、最小合計確率が、約0.1未満、より一層好ましくは約0.01
未満、および最も好ましくは約0.001未満であれば、参照配列と類似すると考えられる。
標は、後述するように、第一の核酸によりコードされるポリペプチドが、第二の核酸によ
りコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性なことである。したがって、あるポ
リペプチドは、典型的に、たとえば、2つのペプチドが保存的置換によってだけで異なる
場合、第二のポリペプチドと実質的に同一である。2つの核酸配列が実質同一であるとい
う別の指標は、後述するように、2つの分子がストリンジェントな条件下に互いにハイブ
リダイズすることである。
連において、あるポリペプチドが、10-20個のアミノ酸の比較ウインドウ(comparison wi
ndow)上の参照配列と少なくとも90%、好適には、少なくとも95%の配列同一性を有する
配列を含むことを示す。配列同一性のパーセンテージは、比較ウインドウ上の2つの最適
に整列された配列を比較することにより決定され、そこでは、比較ウインドウにおけるポ
リヌクレオチド配列の一部分が、2つの配列の最適なアラインメントについて、付加また
は欠失(すなわちギャップ)を、参照配列(付加または欠失を含むないもの)と比較して
含んでいてもよい。パーセンテージは、位置の番号を決定することによって計算され、そ
こでは同じ核酸塩基またはアミノ酸残基が一致した位置の番号をもたらすように、双方の
配列において生じ、比較のウインドウにおける位置の総数により一致した位置の数が割ら
れ、そしてその結果が、配列同一性のパーセンテージをもたらすように、100を掛けられ
る。
ブーストの組合せによるrAd35およびrAd26ベクターがフィロウイルス感染に対する防御免
疫反応を生じさせるという発見に基づく。特に、本発明は、異種プライム・ブーストの組
合せ(特に、Ad26プライム次いでAd35ブーストが続くこと)が防御免疫反応を生成する際
に驚くほど効果的であるという証拠を提供する。これらのプライム・ブーストの組合せの
意外な効果は、本発明の時点で予測されたことはなかった。したがって、本発明は、フィ
ロウイルス抗原を発現する組換えアデノウイルスベクター(rAd35またはrAd26)を提供す
る。アデノウイルスベクターはワクチンとして調剤することができ、およびフィロウイル
ス感染に対して、単独での、またはプライム・ブーストの組合せのいずれでも、保護免疫
を誘導するために使用することができる。
ロッパ、およびアフリカで人間および霊長目の動物において致死率が高い出血熱のアウト
ブレイク(大流行)と関連したフィロウイルスである〔Peters(ピータース), C.J.らの
:Fields Virology(フィールズ・バイロロジー)、Fields, B.N.ら編、1161-1176、Phil
adelphia(フィラデルフィア)、Lippincott-Raven(リッピンコット・ラブン)、1996;
Peters(ピータース), C.J.ら、1994、Semin Virol(セミナーズ・イン・バイロロジー
)5:147-154において〕。いくつかのサブタイプが規定されたが、これらのウイルスの遺
伝子組織体は類似しており、各々が7つの線形にアレイされた遺伝子を含む。ウイルスタ
ンパク質の間で、エンベロープ糖タンパク質は、ウイルスの侵入を媒介するRNA編集によ
って発生する2つの代替形態、50-70キロダルトン(kDa)の分泌されたタンパク質(sGP)
および130kDaの貫膜糖タンパク質(GP)において存在する〔Peters, C.J.らのin:Fields
Virology、Fields, B.N.ら編、1161-1176、Philadelphia、Lippincott-Raven、1996;Sa
nchez(サンチェス), A.らの1996 PNAS USA(プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・ア
メリカ)93:3602-3607〕。他の構造遺伝子産物には、核タンパク質(NP)、マトリクス
タンパク質(基質タンパク質)のVP24およびVP40、推定された非構造タンパク質のVP30お
よびVP35、およびウイルスポリメラーゼが含まれる(Peters, C.J.らのin:Fields Virol
ogy、Fields, B.N.ら編、1161-1176、Philadelphia、Lippincott-Raven、1996)。
ス、ザイール〔基準種(模式種)、またここではZEBOVと称する〕、スーダン(またここ
ではSEBOVと称する)、Reston(レストン)、Bundibugyo(ブンディブギョ)およびIvory
Coast(アイボリー・コースト、象牙海岸)の5つの種がある。マールブルグウイルス(
またここではMARVと称する)の一種類がある。
い。本発明のアデノウイルスベクターは、フィロウイルス抗原の多種多様な抗原決定基を
含むタンパク質を発現するために使用することができる。典型的かつ好ましい実施形態で
は、本発明のベクターには、ウイルス糖タンパク質(GP)の貫膜形態をコードする核酸が
含まれる。他の実施形態では、本発明のベクターは、ウイルス糖タンパク質(SGP)、ま
たはウイルス核タンパク質(NP)の分泌形態をコードしうる。
は、ここに記載の核酸分子が、修飾発現されたタンパク質が病原体または病気に対する免
疫反応を引き出す限りにおいて、変異されうることを認識するであろう。したがって、こ
こで用いるように、用語「フィロウイルス抗原タンパク質」は、上述したフィロウイルス
タンパク質の少なくとも一つの抗原決定基を含むタンパク質に言及する。この用語には、
フィロウイルス抗原(すなわち、フィロウイルスの遺伝子産物)、ならびに1以上のフィ
ロウイルスの抗原決定基を含む組換えタンパク質を包含する。
ともできる(例は、国際公開第2006/037038号参照)。本発明にはまた、核酸分子の組合
せを含むワクチンが含まれる。たとえば、そしてこれには限定されないが、ザイール、ス
ーダンおよびアイボリー・コーストのエボラ株のGP、SGPおよびNPをコードする核酸分子
は、一のワクチン組成物において、任意の組合せにおいて組み合わせることができる。
影響をおよぼすことがある一定のアデノウイルス血清型に対する免疫応答をもたらした。
本発明は、2つの珍しい血清型:Ad26およびAd35からのカプシドタンパク質を含むアデノ
ウイルスベクターを提供する。典型的な実施形態では、ベクターはrAd26またはrAd35ウイ
ルスである。
ァイバー(繊維)、ペントンまたはヘキソンタンパク質〕を含む。熟練者は、全体のAd26
またはAd35のカプシドタンパク質が、本発明のベクターにおいて使用される必要のないこ
とを認識するであろう。したがって、Ad26またはAd35のカプシドタンパク質の少なくとも
一部を含むキメラカプシドタンパク質は、本発明のベクターにおいて使用することができ
る。また、本発明のベクターには、カプシドタンパク質を含むことができ、そこでは、そ
のファイバー、ペントン、およびヘキソンタンパク質は、少なくとも一つのカプシドタン
パク質がAd26またはAd35から由来する限り、異なる血清型にそれぞれ由来する。好ましい
実施形態では、ファイバー、ペントンおよびヘキソンタンパク質はAd26から、またはAd35
からそれぞれ由来する。
おいて組み合わせることができることを認識するであろう。したがって、異なる血清型か
らの望ましい特性を組み合わせたキメラアデノウイルスを生産することができる。このよ
うにして、いくつかの実施形態において、本発明のキメラアデノウイルスは、温度安定性
、アセンブリー(組立)、アンカリング(固着)、生産収率、リダイレクトされた(向け
直された)か、またあ改良された感染、標的細胞でのDNAの安定性などのような特徴を有
するAd26およびAd35の血清型の既存の免疫の不存在を組み合わせることができた。
たは完全に、Ad35からか、またはAd26から由来する(つまり、ベクターはrAd35またはrAd
26である)。若干の実施形態では、アデノウイルスは複製欠損であり、例は、それがゲノ
ムのE1領域において欠失を含むからである。本発明のアデノウイルスで、Ad26またはAd35
に由来するもののために、Ad5のような、ヒトサブグループCのアデノウイルスのE4-orf6
を有するアデノウイルスのE4-orf6コード配列を交換することが一般的である。このこと
は、Ad5のE1遺伝子を発現するよく知られた補完細胞系、たとえば、293細胞、PER.C6細胞
、その他のようなものにおいて、そのようなアデノウイルスの繁殖を可能にする〔例は、
Havenga (ハベンガ)ら、2006、J Gen Virol、87:2135-43;WO 03/104467)参照〕。一
定の実施形態では、アデノウイルスは血清型35のヒトアデノウイルスであり、そのアデノ
ウイルスは抗原をコードする核酸がその中にクローニングされているE1領域において欠失
を有し、かつ、Ad5のE4 orf6領域を有する。一定の実施形態では、アデノウイルスは血清
型26のヒトアデノウイルスであり、そのアデノウイルスは抗原をコードする核酸がその中
にれにクローニングされているE1領域における欠失を有し、かつ、Ad5のE4 orf6領域を有
する。Ad35アデノウイルスのためには、アデノウイルスにおいてE1B 55K読み枠の3′末端
、例としては、pIX読み枠から直接上流の166塩基対、またはこれを含む、pIX開始コドン
の直接上流の243 bpフラグメント(断片)、およびBsu36I制限部位による5′末端にマー
クされたようなフラグメントを保持することが典型的であり、それは、これがアデノウイ
ルスの安定性を高め、なぜならpIX遺伝子のプロモーターがこのエリアに部分的に備わっ
ているからである(例は、Havengaら、2006、上記;WO 2004/001032参照)。
クターの調製は、たとえば、WO2007/104792において、およびAbbink(アビンク)ら(200
7)Virol(ジャーナル・オブ・バイロロジー)81(9):4654-63において記載されている
。Ad26の模範的なゲノム配列は、GenBank(ジェンバンク)アクセッション(受入番号)E
F 153474に、およびWO2007/104792での配列番号1に見出せる。rAd35ベクターの調製は、
たとえば、米国特許第7270811号明細書およびVogelsら(2003)J Virol、77(15):8263
-71において記載されている。Ad35の模範的ゲノム配列はジェンバンクアクセッションAC_
000019において見出される。
を用いて生産される(例は、プラスミド、コスミド、またはバキュロウイルスベクター)
。したがって、本発明はまた、本発明のアデノウイルスベクターをコードする分離された
核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、RNAの形態において、またはクローニングに
よって得られたか、または合成的に生産されたDNAの形態でありうる。DNAは二本鎖または
一本鎖であってよい。
は、ウイルスは、E1領域のような、ウイルスの複製に重要な領域の欠失または不活性化に
よって複製欠損にされる。これらの領域は、実質的に、たとえば、目的の遺伝子を挿入す
る(通常、プロモーターに連結される)などして、欠失または不活化することができる。
若干の実施形態では、本発明のベクターは、E2、E3またはE4領域またはプロモーターに連
結された異種遺伝子の挿入などのような、他の領域における欠失を含んでいてもよい。E2
-および/またはE4変異アデノウイルスのために、大抵は、E2-および/またはE4-補完細胞
系が、組換えアデノウイルスを生成するために使用される。アデノウイルスのE3領域での
変異は、E3が複製のために必要とされないので、その細胞系によって補完される必要はな
い。
生産するために使用される。パッケージング細胞は、複製欠損ベクターにおいて欠失また
は不活化されたそのような遺伝子を含む細胞であり、このようにして、ウイルスが細胞内
で複製することができる。好適な細胞系には、たとえば、PER.C6、911、293、およびE1 A
549が含まれる。
いて発現させることができる。必要に応じて、フィロウイルス抗原タンパク質をコードす
る異種遺伝子が、処置された宿主(例は、人間)における適切な発現を確実にするために
、コドン最適化をすることができる。コドン最適化は、この技術分野で広く適用されてい
る技術である。典型的には、異種遺伝子はアデノウイルスゲノムのE1および/またはE3領
域中にクローニングされる。
romoter(メジャー後期プロモーター)の制御の下にあって(すなわち、操作可能に連結
されて)よく、または異種プロモーターの制御の下にあってもよい。好適な異種プロモー
ターの例には、CMVプロモーターおよびRSVプロモーターが含まれる。好ましくは、プロモ
ーターは発現カセット内で興味ある異種遺伝子の上流に位置する。
多種多様のフィロウイルス抗原を含むことができる。表1には、本発明の模範的ベクター
の概要を提供する。
術においてよく知られた方法に従ってワクチン(また「免疫原性組成物」とも称される)
として調剤することができる。このような組成物には、免疫反応を高めるためにアジュバ
ントが含まれうる。調剤物において各成分の最適な比率は、この技術で熟練した者によく
知られた技術によって決定することができる。
物には、大抵は、たとえば、水、石油、動物または植物の油、鉱油または合成油などのよ
うな液状キャリヤ(液状担体)が含まれる。生理的塩類溶液、デキストロース(ブドウ糖
)または他の糖類溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエ
チレングリコールなどのようなグリコールが含まれていてもよい。
るとき、初期(プライミング)投与後の接種は、免疫応答をブーストする(高める)ため
に与えられ、そして典型的にブースター接種と称される。本発明の組成物は、任意の多様
な異なるプライミング組成物を用い、抗原によってプライミングされたブースティング組
成物として、またはプライミング組成物として使用することができる。このようにして、
本発明の一態様は、個体における抗原に対する免疫応答をプライミングおよび/またはブ
ースティングする方法を提供する。たとえば、若干の好適実施形態では、本発明の一つの
アデノウイルスベクター(例は、rAd26)のプライミング投与には、第2のアデノウイルス
ベクターのブースター接種(例は、rAd35)が続く。
範囲内である。ブースティング組成物は、プライミング組成物の投与後に、大抵は数週間
または数ヶ月投与され、たとえば、約2-3週間または4週間、または8週間、16週間、また
は20週間、または24週間、または28週間、または32週間または1乃至2年である。
はブースティング接種は他の抗原を含みうる。本発明のアデノウイルスベクターと組み合
わせて使用される他の抗原は、本発明にとって絶対的でないが、また、たとえば、フィロ
ウイルス抗原、それらを発現する核酸、ウイルス様粒子(VLPs)、または先行技術ウイル
スベクターであってよい。そのようなウイルスベクターには、たとえば、他のアデノウイ
ルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、鶏痘またはカナリアポックスなどのような
アビポックスベクター、ヘルペスウイルスベクター、水疱性口内炎ウイルスベクター、ま
たはアルファウイルスベクターが含まれる。熟練者は、本発明の免疫原性組成物が複数の
抗原およびベクターを含みうることを認識するであろう。
されるのはブースティング組成物)は、同一である必要はないが、抗原決定基を共有すべ
きである。
る同時投与に適したアジュバントは、QS-21、Detox(デトックス)-PC、MPL-SE、MoGM-CS
F、TiterMax(タイターマックス)-G、CRL-1005、GERBU、TERamide(テラミド)、PSC97B
、Adjumer(アジュマー)、PG-026、GSK-I、GcMAF、B-alethine(アレザイン)、MPC-026
、Adjuvax(アジュバックス)、CpG ODN、Betafectin(ベータフェクティン)、Alum(ミ
ョウバン)、およびMF59が含まれ、人々にいおて潜在的に安全で、耐容性および効果的で
あるものでなければならない。
カインで、たとえば、アルファ-インターフェロン、ガンマーインターフェロン、血小板
由来増殖因子(PDGF)、顆粒球コロニー刺激因子(gCSF)、顆粒球マクロファージコロニ
ー刺激因子(gMCSF)、腫瘍壊死因子(TNF)、上皮増殖因子(EGF)、IL-I、IL-2、IL-4
、IL-6、IL-8、IL-IO、およびIL-12または従って核酸をコードするものが含まれる。
許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または他の材料を含んでもよい。このような材
料は、非毒性であるべきで、しかも、活性成分の有効性を妨害してはならない。担体また
は他の物質の正確な性質は、投与の経路、例は、経口、静脈内、皮膚または皮下、粘膜内
(例は、腸)、鼻腔内、筋肉内、または腹腔内の経路に依存しうる。投与(Adiminstrati
on)は典型的に筋肉内である。
ードルを使用することによって達することができる。別の方法としては、組成物〔例は、
Biojector(TM、商品名)(バイオジェクター)を使用し)を投与するために、ニードル
レス(needless、不必要な)注射器具、またはワクチンを含有する凍結乾燥粉体の使用が
ある。
ベクターは、パイロジェンフリー(発熱物質を含有しないもの)であり、そして適切なpH
、等張性および安定性を有する非経口的に許容可能な水溶液の形態である。この技術での
熟練者は、たとえば、Sodium Chloride Injection(塩化ナトリウム注射液)、Ringer's
Injection(リンゲル注射液)、Lactated Ringer's Injection(乳酸リンゲル注射液)の
ような等張ビヒクルを用いて適切な溶液をうまく調製することができる。必要に応じて、
保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤および/または他の添加剤が含まれうる。徐放性製
剤をもまた、採用してもよい。
を生じさせるために、予防的目的を有する。本発明に従って処置または防止することがで
きる疾患および障害には、免疫反応が保護的または治療的な役割を果たしうるものが含ま
れる。他の実施形態では、アデノウイルスベクターは、ポスト曝露予防薬のために投与す
ることができる。
ィロウイルス免疫反応を生じさせる。検出可能な免疫応答を誘導するのに十分な組成物の
量は、「免疫学的に有効な用量」であると規定される。以下に示すように、本発明の免疫
原性組成物は、体液性ならびに細胞媒介性免疫応答を誘導する。典型的な実施形態におい
て、免疫反応は防御免疫応答である。
び重症度しだいである。処置の処方は、例は、投与量等の決定は、一般開業医および他の
医師、または獣医学との関連で獣医の責任の範囲内であり、そして典型的には、処置すべ
き疾患、個々の受動体(患者)の状態、受渡しの部位、投与の方法および開業者に知られ
る他の要因を考慮する。上述の技術およびプロトコルの例は、Remington's Pharmaceutic
al Sciences(レミントンのファーマシューティカル・サイエンス)、第16版、Osol(オ
ソル), A.編、1980年に見出すことができる。
て、アデノウイルスベクターは、個体、特に、ヒトまたは他の霊長類に対して投与されう
る。投与は、ヒト、または他の哺乳動物、例は、マウス、ラット、ハムスター、モルモッ
ト、ラビット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウシ、ロバ、サル、イヌまたはネコであって
よい。非ヒト哺乳動物への受渡しは治療目的のためである必要はないが、実験的な関連で
、例として、アデノウイルスベクターに対する免疫応答のメカニズムの研究での使用のた
めのものでありうる。
2までのウイルス粒子/mlの濃度を含む塩類溶液の約100μlから約10mlまでの範囲内で投与
される(例は、筋肉内)。典型的には、アデノウイルスベクターは、一投与中に、ヒト被
験体に、約109から約1012までのウイルス粒子(vp、viral particles)、より一層典型的
には約1010から約1012vpまでの量で投与される。初期のワクチン接種は、上述のようにブ
ーストによって続けることができる。組成物は、所望であれば、キット、パックまたはデ
ィスペンサーに存在してよく、それは活性成分が含まれる1つ以上の単位剤形を含んでい
てもよい。キットは、たとえば、ブリスターパックなどの、金属またはプラスチックホイ
ルを伴うことができる。キット、パック、またはディスペンサーには、投与のための説明
書が添付されてもよい。
または他の処置との組合せのいずれかでも投与することができる。
限せずに提供する。
らかとも関連する異なった利点があり、それは免疫レジメンを最適化するとき、即時型免
疫対長期免疫のための必要性に依存し、考慮されなければならない。EBOVおよび他のフィ
ロウイルスのアウトブレイクは、突然に起き、そして迅速に個体群間で広まり、そこでは
、医療設備が不足する傾向がある。このようにして、これらの状況下では、ショートワク
チンのレジメンは望ましいことがある。この理由から、EBOV糖タンパク質(GP)および核
タンパク質(NP)遺伝子を含むrAd5ベクターによるシングル・ショットワクチン接種が、
非ヒト霊長類において開発された(Sullivanら、2006)。そのようなワクチンは、おそら
く挿入物の高い発現レベルおよび樹枝状細胞についてのAd5のトロピズムのために、1ヵ月
以内に強い免疫反応を誘発することが示された(Sullivanら、2003)。他方、長期の保護
免疫は、おそらく、耐久性T細胞メモリーを誘導することができる二つ以上の投与が含ま
れるプライム・ブーストワクチンのレジメンを必要とする。したがって、本発明者らは、
rAd35およびrAd26ベクターを用いる単独接種およびプライム・ブーストの組合せの双方に
ついての免疫原性および有効性を試験するために、一連の実験を設計し、そして、これら
の研究の結果をここに提示する。
1/E3欠失rAd26およびrAd35ワクチンベクターを構築し、増殖させ、そして前述したように
精製した(Abbinkら、2007)。EBOV GPを発現しないAd5のベクターを構築し、増殖させ、
そして同様の方法によって精製し、それぞれの実験で指示したように選定された動物にお
いてAd5に対する免疫を誘導するために用いた。ザイール(配列番号1)およびスーダン/
グル(配列番号2)の種の読み枠にわたるEBOV GP挿入物を、ヒトCMVプロモーターおよびS
V-40ポリアデニル化配列の転写制御下に、左ITRおよびパッケージングシグナルを含め、A
dゲノムの左側部分を含むプラスミド中にクローニングした。残りのAd配列(E3-欠失され
たもの)を含むコスミドによるこのプラスミドのPER.C6(R)細胞へのコトランスフェク
ション(同時形質移入)は、E1/E3欠失した複製欠損組換えAd26またはAd35のワクチンベ
クターを産生した。PER.C6(R)細胞上でのrAd26およびrAd35ベクターの複製を容易にす
るために、ネイティブ(自然な)E4 orf6領域を、Ad5 E4orf6配列によって置換えた(Hav
engaら、2006)。そのrAdウイルスを、プラーク精製し、そしてそれぞれの1つのプラーク
を、およそ2.4Lの生産規模まで拡大した。2つのステップの塩化セシウム勾配超遠心分離
法を、rAd EBOVベクターを精製するために使用した。精製rAd EBOVワクチンを単独使用の
アリコートとして-65℃未満で貯蔵した。ウイルス粒子の力価を260nmでの光学密度を測定
して定めた〔Maizel(メンゼル)ら、1968、Virology(バイロロジー)36(1):115-25
〕。感染性は911細胞を用いたTCID50により評価した〔Fallaux(ファラオー)ら、(1996
)Hum Gene Ther(ヒューマン・ジーン・セラピー)7(2):215-22〕。アデノウイルス
媒介EBOV GPの発現はA549細胞の感染に次いでウエスタンブロット上で培養溶解物の分析
を続けることにより評価した。精製したベクターの同一性はPCRによって確認し、そして
フランキング配列を含めて、完全な導入遺伝子領域をDNAシークエンシングを用いてチェ
ックした。
用いて構築した。アミノ酸配列はクラスタルXプログラムを使用して配列決定し〔Larkin
ら、(2007)Bioinformatics、23(21):2947-8〕、そしてツリーを、Clustal X Neighbou
r-Joining method(クラスタルX近隣結合法)を使用して組み立て、そしてツリーは1000
回ブートストラップされた。ツリーはフィリップ・フィロジェニー・インファレンス・パ
ッケージ(Phylip Phylogeny Inference package)のバージョン3.68からのDrawtree pro
gramme(ドローツリー・プログラム)を使用して視覚化し、そしてプロットした。
インおよびNIHポリシーに十分に準拠して実施した。カニクイザル・マカク〔Macaca fasc
icularis(マカカ・ファシクラリス)〕は、齢3-5年および重さ2-3kgの間のものを、すべ
ての研究のためにCovance(コバンス)から入手した。サルは個別に収容し、そして定期
的にthe Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(実験動物のケアおよび使
用のためのガイド)(DHEW番号NIH 86-23)が推奨するように、濃縮物(enrichment)を
与えた。動物を、採血またはワクチン接種前にケタミンで麻酔した。本研究において各ワ
クチン群は3つのカニクイザル・マカクを含み、そして各コントロール群は単一のカニク
イザル・マカクを含む。四週間のポストEBOVワクチン接種で、動物を、尾側の大腿部への
筋肉内経路によって送達されるザイールEBOVの1,000 PFUの標的投与量での感染のために
最大封じ込め研究所(Maximum Containment Laboratory)(BSL-4)に移した。ZEBOVチャ
レンジストック(保存株)を、以前のザイールでの1995年のアウトブレイクにおけるヒト
死者から調製した。動物は調査が完了するまでそこに残した。BSL-4施設にいる間、サル
は最低でも一日一回、給餌され、そしてチェックされた。
われた動物調査は、USAMRIIDの施設内動物のケアおよび使用のための委員会(USAMRIID I
nstitutional Animal Care and Use Committee)によって承認された。動物研究は、アメ
リカ動物保護法(Animal Welfare Act)および他のアメリカ連邦法規(Federal statutes
)、および動物および動物を伴う実験に関連し(relating to animals and experiments
involving animals)、および実験動物のケアおよび使用に関する指針、アメリカ研究評
議会(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, National Research Counci
l)、1996年に記載された原則に支持される規則(regulations)を遵守して実行した。使
用した施設は実験動物ケアインターナショナルの評価および認定のための協会によって十
分に認定されている。
およびシリンジによって両側の三角筋に筋肉内接種を受けた。選定した動物は、各実験で
示されたように、Ad5の免疫を誘導するために、エンプティー(空)のAd5ベクターの1011
PFUでプレ(予備)免疫化した。Ad5のELISA抗体力価は、EBOVワクチン接種前に、これら
の動物において確立された。
、Vienna(ウィーン)、VA(ヴァージニア州)、またはNunc(ヌンク)、Rochester(ロ
チェスター)、NY(ニューヨーク州)を、ウェルあたり100μlの抗原によってコーティン
グ(被覆)し、そして4℃で一晩中インキュベートした。その後のインキュベーションは
室温で行った。293T細胞のリン酸カルシウム媒介一過性トランスフェクションによって生
成した貫膜欠失EBOV GP(EBOV GPΔTM)は抗原として役立った。プレートを抗原コーティ
ングした後、PBS含有Tween(ツイーン)20を用いて6回洗浄した。試験血清は1:50から1
:50,000に至るまでの7つの濃度に連続的に希釈し、そして60分間抗原でコーティングさ
れたウェルに添加した。プレートを、6回洗浄し、次いで検出抗体、ホースラディッシュ
ペルオキシドに結合したヤギ抗ヒトIgG〔H+L;Chemicon(ケミコン)/Millipore(ミリポ
ア社)、Billerica(ビレリカ)、MA(マサチューセッツ州)〕とのインキュベーション
を続けた。Sigma Fast o-Phenylenediamine Dihydrochloride(シグマファストo-フェニ
レンジアミン二塩酸塩)〔Sigma(シグマ社)、St. Louis(セントルイス)、MO(ミズー
リ州)〕基質をウェルに添加し、そして光学密度を測定した(450 nm)。各動物について
のワクチン接種前血清サンプル(試料)を、アッセイを行うたびごとにテストを行った。
既知ザイールEBOV GP IgG応答を有する単一動物からの陽性コントロール血清サンプルは
、アッセイを行うたびごとにテストを行った。バックグラウンド減算ELISA力価は、EC90
、逆数光学密度値として表わされ、それは、抗原結合において90%減少が存在する希釈を
表す。
胞(PBMC)を単離するためにFicoll(フィコール)上での密度勾配遠心分離にかけた。お
よそ1×106細胞を、37℃で6時間、10%熱不活性化ウシ胎仔血清を含む100μlのRPMI培地
において、抗CD28(クローンCD28.2)および-CD49d(クローンL25)抗体〔BD Bioscience
s(BDバイオサイエンシーズ社)〕、Brefeldin(ブレフェルジン)-A〔Sigma-Aldrich(
シグマ・アルドリッチ社)、St. Louis、MO〕、およびDMSOまたは全体のザイールEBOV GP
読み枠にわたるペプチドのプールのいずれかで刺激した。ペプチドは、新鮮な無菌のDMSO
において、各ペプチドについて2.5μg/mlの終濃度で再構成した11個のアミノ酸によって
重複した15量体であった。各サンプルについて、同等のアリコートを陽性コントロールと
してSEBで刺激した。6時間の刺激後、PBMCを、系統マーカー(lineage markers)(CD3-C
y7-APC、クローンSP34-2(BD Biosciences)、CD4-QD605クローンM-T477(BD Bioscience
s)、CD8-TRPEクローンRPA-T8、CD95 Cy5-PE、クローンDX2(BD Biosciences)、CD45RA
QD655、クローン5H3に対する抗体の混合物を用いて20分間室温で染色した。CD45RA QD655
およびCD8-TRPE抗体を、前述したように標準化されたプロトコルに従って共役させた〔Ko
upら、2010 Priming Immunization with DNA Augments Immunogenicity of Recombinant
Adenoviral Vectors for Both HIV-1 Specific Antibody and T-Cell Responses.(HIV-1
特異的抗体およびT細胞応答の双方のための組換えアデノウイルスベクターのDNA増強免疫
原性によるプライミング免疫化)。PLoS One 5(2):e9015.doi(ドイ):10.1371/journ
al.pone.(ジャーナル・ポン)0009015〕。2回洗浄した後、細胞を固定し、そしてCytofi
x(サイトフィックス)/Cytoperm(サイトパーマ)(BD Biosciences)で透過性にし、次
いでサイトカインTNFα-APCに対する抗体、クローンMAb11(BD Biosciences)、およびIL
-2 PE、クローンMQ17H12(BD Biosciences)を用いて染色を続けた。残存判別染料(viab
ility dye)ViViD(ビビッド)(Invitrogen)は生細胞と死細胞との間の区別を可能にす
るために含ませた〔Perfetto(パーフェト)ら、(2006)J Immunol Methods(ジャーナ
ル・オブ・イムノロジカル・メソッズ)313(1-2):199-208〕。サンプルは、LSR IIサ
イトメーター(血球計算機)(BD Biosciences)にて取得し、最大で1,000,000の事象ま
で収集し、そしてFlowJo(フロージョ)9.1およびSPICE(スパイス)5.0ソフトウェア〔T
ree Star(ツリースター)〕を用いて分析した。サイトカイン陽性細胞はCD4+およびCD8+
T細胞メモリーサブセット内の割合として規定した。メモリーサブセットはCD45RA±/CD95
+またはCD28±/CD95+として規定した。後者の場合、CD28 Alexa(アレクサ)488〔クロー
ン28.2、BioLegend(バイオレジェンド)〕は、非共役CD28 mAbの代わりに刺激のために
用いた。
ザイールEBOV感染でNHPから収集した。総白血球数、白血球差(white blood cell differ
entials)、赤血球数、血小板数、ヘマトクリット値、総ヘモグロビン、平均細胞容量、
平均血球容量、および平均血球ヘモグロビン濃度は、EDTAを含むチューブに採取した血液
サンプルから、レーザーベースの血液学的分析機(laser-based hematologic Analyzer)
〔Coulter Electronics(クールターエレクトロニクス)、Hialeah(ハイアレア)、FL(
フロリダ州)、USA(米国)〕を使用することによって決定された。血清サンプルは、ア
スパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)の濃度について、Piccolo Point-Of-Care
Blood Analyzer(ピッコロポイントオブケア血液アナライザー)〔Abaxis(アバクシス
)、Sunnyvale(サニーベール)、CA(カリフォルニア州)、USA〕を用いて試験した。
。簡単には、血しょうサンプルの10倍増加希釈物を、複製ウェルにおいてベロー単層に対
して吸着させ(ウェルあたり0.2ml);このようにすることで、検出の制限は25pfu/mlで
あった。
イン産生の比較を、GraphPad Prism(グラフパッドプリズム)ソフトウェアにおける両側
T検定を用いて行った。
において強力な防御免疫を提供し、そしてヒトの臨床試験において安全性および免疫原性
が証明された(Asmuthら;Kibuukaら;Harroら、2009;)。マカクおよびヒトにおける調
査は、既存の指示免疫性のベクターがウイルス性ベクターベースのワクチンの効力を制限
することがあることを示した(McCoyら、2007;Buchbinderら、2008)。血清学的陽性率
データは、ヒト集団の大部分がAd5による自然感染を世界的に経験していることを示唆し
ているから、本発明者らは、ワクチンベクターとして使用するための他のアデノウイルス
血清型を評価した(図1A)。本発明者らは、Ad35、グループBおよびAd26、グループDのア
デノウイルスが、rAd5、グループCから遺伝的に分離され、それでこれらの血清型由来の
ワクチンベクターは霊長類でAd5の免疫力に敏感になるという仮説を立てた。Ad35およびA
d26ベクターがAd5での使用とは異なる受容体を用いるが、それにもかかわらず、それらは
単球由来樹状細胞の効率的な形質導入を実証し、そしてマウスでのAd5の免疫を免れる。
したがって、EBOVのザイールまたはスーダン/グル種からのGPインサート(GP挿入物)は
、ヒトCMVプロモーターの転写制御下に、rAd35およびrAd26ベクターのE1領域中にクロー
ニングされた(図1B)。双方のベクターゲノムは、それらを複製欠損にし、そしてワクチ
ン接種した対象における組換えのための可能性を低減させるために、E1遺伝子において欠
失されている。
し、Ad5ナイーブマカクにおける免疫応答を誘導するために、およびまたAd5に対する既存
の免疫の関連内でのベクター能力を評価するために、初期の調査は、ザイールエボラウイ
ルス(ZEBOV)、GP(Z)からのGPをコードする単一のEBOV種ワクチンを用いて行った。六
匹のカニクイザル・マカク、三匹のAd5ナイーブおよび三匹のAd5免疫を、各々針注入によ
ってrAd35-GP(Z)(Ad35BSU.Ebo.GP(Z)FL.wt)の1010粒子により筋肉内にワクチン接
種した。三週間のポストワクチン接種では、抗原特異的抗体およびT細胞応答を、個々の
対象から得た末梢血サンプルで評価した。ELISAによって評価したEBOV-GP(Z)に対する
抗体は、すべての対象において誘導され、rAd35-GP(Z)ベクターが標的細胞のインビボ
形質導入および効率的な抗原提示を好首尾に媒介することを示した(図2A)。AD5ナイー
ブおよびAd5免疫の対象は、およそ1:700から1:3000までにおよぶ血清抗体価を生成した
。これらの抗体レベルは、GP(Z)インサートを含むAd5ベースのワクチンについて観察さ
れ、そしてこのマカクAdワクチンモデルにおいてEBOV感染に対する免疫防御と関連付けら
れた最小値(1:500)を超えた範囲内である(Sullivan、2009)。有意な抗体力価は、す
べてのワクチンで誘導されたが、いずれの対象も、マカクにおいてAd5-GPワクチンベクタ
ーの投与後100%の保護を予測する閾値力価(約1:3500)を超えない。しかしながら、Ad
5ナイーブ対Ad免疫の対象における抗体力価の比較において、これらのグループのうち誘
発された平均力価において有意差がなかったことを示した(それぞれ1:1600対1:1800)
ことは注目すべきであり、rAd35ベクターが、Ad5に対し以前さらされた対象において有効
なワクチンであることを示唆した。
TNF-α(CD8+)またはIL-2(CD4+)のいずれかについて細胞内サイトカイン染色(ICS)
により評価した。CD45RAおよびCD95を用いるリンパ球の表面染色は、CD4+およびCD8+T細
胞(図2 B-C)のメモリーサブポピュレーション(メモリー部分母集団)における抗原特
異的免疫応答を評価するために実行した。抗体反応について観察されたように、rAd35ベ
クターによりワクチン接種されたマカクはEBOV-GPに対する細胞性免疫を生成し、そして
抗原特異的T細胞の出現頻度はAd5免疫状態によって影響を受けなかった。対象の全体にわ
たって双方のCD4+およびCD8+リンパ球における細胞応答の順位の重要性(大きさ)は、抗
体反応に類似していたが、ある対象V3についての抗原特異的T細胞の出現頻度は検出可能
なレベルよりも低かった。マカクにおける以前の調査では、rAd5ベースのワクチンベクタ
ーは、CD4+応答より優位であるCD8+T細胞の出現頻度を誘導することが示された。本調査
では、rAd35ワクチン接種した対象体は、同様の出現頻度でGP-特異的CD4+およびCD8+リン
パ球を生成した。しかしながら、対象体の比較的少数を試験した場合、差異が、存在して
も、明らかにできない可能性がある。全体的に見て、これらの結果は、rAd35-GPがカニク
イザル・マカクにおいて免疫原性であること、および抗原特異的体液性および細胞性免疫
応答の誘導についてのベクター能力がAd5に対する既存の免疫性を有する対象体において
低減されないことを示す。
でのワクチン接種がZEBOVの高用量での感染によるチャレンジに対する保護を提供するか
どうかを試験した。上記免疫応答の査定後一週間に、六匹のrAd35-GPをワクチン接種した
カニクイザル・マカクおよび一匹のナイーブのカニクイザル・マカクを、ZEBOVの1995 Ki
kwi(キクウィト)株の1000PFUに対し筋肉内注入により曝した。肝酵素を、感染によるチ
ャレンジ後定期的に測定し、それはこれらのマーカーにおける上昇はマカクでの増殖性(
productive)EBOV感染の特徴だからである。アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)
の循環レベルを、日10-14を通して(図2D)、およびその後28日間のフォローアップ期間
(図示せず)の最後の日に、急性感染期間中に3-4日毎に評価した。血しょうASTは、すべ
ての対象体において感染後3日を通してベースラインレベルにとどまり、感染EBOVチャレ
ンジ直後に正常な肝機能が示された。EBOV暴露後6日目まで、ワクチン未接種コントロー
ル対象体は、酵素レベルの10倍の増加を示し、この対象体での活動性感染が指し示された
。Ad5ナイーブ/rAd35ワクチン接種グループにおける二体の対象(V1、V3)からの血液サ
ンプルはまた、ASTでの劇的な増加を示し、その一方、このグループV2での第三の対象体
は、ベースラインレベルに戻る分解前の単一の時点で、わずかな増加のみを示した。同様
に、Ad5免疫/rAd35ワクチン接種のグループ(V4、V5)における三体のうち二体の対象は
、ワクチン未接種のコントロールよりもはるかに低いものの、ASTでの上昇を示し、その
一方、一体の対象V6は、感染のこのパラメータについて通常にとどまった。全体として、
ASTレベルは、Ad5免疫のワクチン接種対象におけるよりもAd5ナイーブにおいて高かった
。この臨床観察について正常にとどまった各対象が、そのそれぞれのワクチングループ内
での最も高いプレチャレンジ、抗原特異的CD8+および抗体応答を示したことは注目に値す
る言及である。血しょうのウイルス血症レベル(図2E)は、高められたASTを示したすべ
ての動物でのEBOV感染を確認した。
あることを示す。ワクチンは防御免疫反応を生じさせるが、この用量およびレジメンはす
べての対象体の均一な保護のためには最善に次ぐものであった。ワクチングループ内で、
防御免疫は最も重要な抗原特異的抗体およびCD8+T細胞応答と関連した。
、1010から1012の粒子までにおよぶ範囲の用量でマカクに投与される。rAd5-GPでの以前
の結果は、EBOV感染に対するカニクイザル・マカクの100%の保護を達成するための最小
限の用量として1010ウイルス粒子が実証された(Sullivan、2006)。前述の調査がこの用
量範囲の下限で行われ、そして均一な保護がもたらされなかったので、rAd5ベクターのそ
れと比較したときに、rAd35ベクターを用いて達成されたわずかに低いインビボ抗原発現
さえも、最善に次ぐ免疫応答をもたらすことが可能である。したがって、本発明者らは、
より一層高いワクチン用量の投与が、免疫防御のより一層大きな程度を誘発できるかどう
かを問うた。この実験ではワクチンはまた、スーダンおよびザイール種の双方からGPを構
成するrAd5ワクチンでの歴史上データに対する有効性を比較するために、スーダンEBOV種
(S/G)からGPを発現するrAd35を含んだ。本調査では、カニクイザル・マカク(群あたり
n=3)を、各々のAd35BSU.Ebo.GP(Z)FL.wtおよびAd35BSU.Ebo.GP(S/G)FLの1010または
1011ウイルス粒子でワクチン接種し、そして免疫応答を以前の実験においてワクチン接種
した後に三週間測定した。
クチン用量が以前の実験のものと同じか、またはそれより高かったからである。しかしな
がら、この実験で1010粒子を用いてワクチン接種した2体の対象(V8、V9)における力価
は、それぞれ1:340および1:500であり、Ad5-GPワクチン接種した対象での保護を予測す
るために以前に観察された最小カットオフに近いか、またはそれよりも低いレベルであっ
た(Sullivanら、2009)。観察された最大抗体力価は、図2に示すようにrAd35対象体にお
いて観察された最大力価と同じである1:2,900であった(対象体V10)。平均抗体力価は1
011投与量グループにおいてより一層高かった(1:1500対1:700)が、その差は統計的有
意性には達しなかった(P=0.02)。低用量グループで観察されたように、その力価が免疫
保護のためのrAd5-GPワクチンカットオフ(対象体V11、1:540)の近くにあったある種の
対象体が存在した。
在した。CD4+またはCD8+T細胞応答のいずれかでも明確な用量反応は存在しなかった。細
胞性免疫応答の動態は、対象体間で、特に非近交系動物において変動し、そして応答の測
定は、それが抗体レベルを有するように、経時的に累積的ではないので、グループの傾向
は時として単一の時点で捕らえることが困難である。各個体内で、抗原特異的T細胞の出
現頻度は、CD8+細胞についてのものよりもCD4+についてものが高かったが、第一の実験か
らの結果と組み合わせたとき、これらの実験においてrAd35-GPベクターによって誘導され
るCD4+またはCD8+細胞の優性(dominance)へのいずれの傾向もなかった。
チン未接種の対象体を、筋肉内注入により1000PFUのZEBOVに曝露し、そして増殖性感染の
兆候が観察された。EBOV感染の出血症状は日常的に、感染したマカクの顔または四肢に斑
点状丘疹(maculopapular rash)の出現をもたらし;対象体はまた典型的には、食物摂取
量を減らし、そして脱水状態になる。2体のワクチン接種した対象についての症状の最も
初期の外観は、EBOV暴露後6日目に発生し;そしてそれぞれが7日目までに症状の十分な一
群(full constellation)を示す(データは図示せず)。表2は、感染によるチャレンジ
の成果および双方のrAd35調査についての非生存体における死の日を示す。ワクチン未接
種対象体は、日9および8(それぞれ実験1および2)に感染の致死効果に屈した。死んだワ
クチン接種対象体は、それらがコントロールよりも長く平均2日まで生き残ったことを除
いて、コントロール、ワクチン未接種対象体に類似していたが、死んだことが最終的に観
察されたにもかかわらず、ワクチン接種の潜在的な部分的免疫の利益が示唆された。生存
体の数は、ワクチン用量にかかわらず、GP(Z)プラスGP(S/G)を受けているものに比べ
、rAd35-GP(Z)だけを受けとる対象体においてより一層大きかったが、残存率での差は
、2つのチャレンジ実験における任意のワクチングループの全体にわたって有意ではなか
った。
てrAd35を用いる調査は、抗原の受渡および提示が抗原特異的免疫応答を生成するのに十
分であるが、絶対的な免疫防御のために必要とされるよりも低いレベルであったことを示
した。より一層低い防御免疫は、保護のための限界であることがrAd5ベクターを用いて示
されているものと一致する若干の動物において検出された抗体レベルと関連した。
次に、EBOV感染に対する防御免疫を生成する能力について、組換えAd26ベースのワクチン
、グループDのアデノウイルスを評価した。この血清型はAd35と同じ細胞受容体(CD46)
を使用するが、プライミングワクチンベクターとして使用したときには、わずかに高い免
疫応答を生成することが示された(Liuら、2009)。これらの調査では、用量増大は、2つ
の別々の感染によるチャレンジ実験において3桁の規模(three orders of magnitude)に
渡って導かれた。最初の調査では、本発明者らは、各ベクター、Ad26.Ebo.GP(Z)FL.wt
およびAd26.Ebo.GP(S/G)FL.wtについて1010または1011粒子の用量にてワクチンをテス
トし、および第二の調査において本発明者らはそれぞれ、1012粒子の用量を用いた。最初
の調査は、rAd26が、rAd35ように、Ad5に対する既存の免疫の存在下で抗原特異的免疫応
答を引き出すことができるかどうかを評価するために、Ad5免疫のカニクイザル・マカク
においてワクチンを試験した。グループ毎に四匹のAd5免疫のカニクイザル・マカクを筋
肉内注入によりワクチン接種し、および血液サンプルをEBOV GPに対して、循環性の体液
性および細胞性免疫応答を評価するために、3週間後に取得した(図4A)。平均循環抗GP
抗体力価は、投与グループ全体にわたり用量反応を示し;1010被ワクチン接種体について
1:700および1011粒子を受ける対象体について1:4500であった(P=0.06)。1010用量グ
ループにおいて4分の3の対象体についての平均力価は、rAd5ワクチン接種対象体における
免疫保護のための最小閾値をちょうど超えた(1:500)が、対象体V16はごくわずかの抗
体応答、1:100だけを生成し、それはAd5-GPワクチンのための予測された保護カットオフ
よりも十分に低かった。対照的に、rAd26ワクチンの1011粒子でワクチン接種された対象
体V19は、非常に高い抗体力価、1:10,500を生成し、完全な免疫防御に関連したレベル(
1:3,500)がほぼ3倍だけ超えられ、その一方でこのワクチングループでの他のものは限
定的に生存転帰(survival outcome)を予測しないで、中間の力価を示した。調査2では
、4体の対象は、各rAd26ベクターの1012粒子を受け、そして1011の用量グループにおける
ものと非常に似た抗体応答を生成し、その大部分は1:1000-1:4000の間の対象体の力価
を有する。このグループの平均抗GP抗体力価は1:3000であった。
調査1における用量反応への傾向を示したが、1010および1011用量グループ間での差は有
意ではなかった(CD4+およびCD8+、それぞれ、p=0.12および0.26)。平均抗原特異的CD4+
T細胞出現頻度は、1010粒子のrAd26-GPを受けるワクチン接種について0.14%であり、そ
れに対してより一層高いワクチン用量では0.24%であり、そしてより一層低い用量グルー
プの一つのワクチン接種、対象体V14は、検出不可能なCD4+応答を有した(図4B)。rAd26
ワクチンはCD4+またはCD8+の優性のどちらへも細胞性免疫応答を歪めず(not skew);CD
8+出現頻度、0.13%および0.25%(それぞれ、1010および1011のワクチン用量)は、本質
的にCD4+応答の重要性を反映した。CD8+T細胞の場合、低用量グループにおいて2体の対象
、V13およびV14が存在し、検出不可能な抗原特異的応答を有した(図4B、C)。rAd26調査
2では、平均抗原特異的CD8+出現頻度(0.34%)はCD4+応答(0.08%)よりも高いが、CD8+
応答へのこの明らかな歪み(skewing)は、主に単一の対象、V24によって導かれ、そのも
のは非常に高いCD8+出現頻度および低いCD4+応答を有する。さもなければ、全体的な細胞
性免疫応答は、rAd26調査の一つで観察されたものと同様であった。
1000PFUのZEBOVのIM注入によって行い、そして肝酵素レベルを疾患を監視するために測定
した(図4D)。ワクチン未接種対象は注入の日3および6の間に肝損傷の発現を見せた。最
低用量rAd26ワクチン、1010粒子を受け取るすべての対象体は、同じような症状の病気を
示したが、ASTレベルはより一層遅い速度で増加した。本臨床指標から予測されるように
、このグループにおけるすべての対象体は、日8のポストZEBOVチャレンジによる感染の致
死効果に屈した(図5A)。抗体およびT細胞応答は、このグループにおける若干の対象体
では低いか、または検出されなかった。Ad26研究1における用量グループ(1010および101
1)間での免疫応答の重要性における違いは、rAd26-GPの1011粒子によりワクチン接種さ
れた対象体において、生存率での、概してより一層高い生存転帰を有し、保護された4の
うち2体に反映された(p=0.01)。 1011粒子でのAd26は、より一層低い用量に対して優れ
ていただけではなく、投与量が一致したときにもrAd35-GPよりも大きい保護を提供した(
図5B)。最後に、1012粒子の用量で与えるrAd26は、これらの研究でテストされた任意の
ワクチンレジメン(ワクチン療法)について生存体の最大数をもたらし(4のうち3体)、
そして免疫防御のレベルはrAd5ベクターで以前に観察されているものとは有意差はなく(
p=0.32、図5C);しかしながら、この生存率はrAd26について用量がrAd5についてのもの
よりも高いもの、それぞれ、1012対1010粒子を用いて得られ、この動物モデルにおけるこ
れらのベクター間の潜在的な能力の差が示唆される。
の用量反応特徴および1012ベクター粒子を用いる高い生存転帰は、このベクターがGP抗原
の発現を効率的に誘導することを示唆した。非ヒトおよびヒト対象体の双方において、EB
OVおよび他の病原体について、その異種プライム・ブーストワクチン接種がシングルショ
ットのワクチン接種よりも強力な免疫性を引き出すことができることが示された〔Sulliv
anのNature、2000;Sampra(サンプラ)ら、Vaccine、27(2009)5837-5845;Koupら、PL
oS One 2010;Geisbert(ガイスバート)ら、(2010)Virol 84(19):10386-94〕ので
、本発明者らはrAd26-GP免疫応答がEBOV感染に対する保護を改善するために異種のベクタ
ーでブーストすることができるかどうか問うた。四匹のカニクイザル・マカクを、Ad26.E
bo.GP(Z)FL.wtおよびAd26.Ebo.GP(S/G)FL.wtの各々の1011粒子を接種した。1ヶ月後
、すべての対象体はAd35BSU.Ebo.GP(Z)FL.wtおよびAd35BSU.Ebo.GP(S/G)FLの同じ用
量でのブーストワクチン接種を受けた。免疫応答は、ブーストの直前、およびその後三週
間評価した。図6AはEBOV-GP(Z)に対する抗体応答がプライミングワクチン接種により効
率的に誘導されたことを示す。個々の対象体は1:2700から1:7100までのGPに対するEC90
抗体力価を生成し、そしてそのグループについての平均力価は1:4000であり、単独接種
ワクチンとしての1011のrAd26をテストする以前の調査において観察された応答(1:4500
)と一致した。本調査には、比較のために、1010粒子のrAd5-GP(Z)およびrAd5-GP(S/G
)のそれぞれを用いて接種した単一の対象体が含まれ、そのもののポストワクチン抗体力
価は1:6800であった。rAd35-GPベクターの1011粒子を用いたrAd26-GP-プライミング対象
体のその後の接種は、抗原特異的抗体レベルをほとんどの被ワクチン接種体についておよ
そ1桁の大きさで1:32,000の平均力価にブーストしたが、それには対象体V27が除かれ、
そのポストプライム抗体力価は非常に高かった。興味深いことに、ブーストワクチン接種
は、対象体の全体にわたってより一層均一な力価を生成し、54%の標準偏差を見せたポス
トプライム力価に比べて、対象体にの全体にわたり弱10%の標準偏差を有した。
にブーストされた(図6B、C)。CD4+T細胞は、一つの対象体、V25を除いてすべてにおい
てブーストされ;rAd35-GP投与後の平均増加は、すべての対象体にわたって2倍であり、
そしてブースティングは、応答がブースティング前には検出されなかった対象体V27にお
いて測定可能な応答を明らかにした。最終的に、ポスト・ブーストCD4+T細胞出現頻度は
、rAd5-GPワクチン接種によって生成されたものに匹敵した。ブースト効果は、CD8+T細胞
について最も大きく、そしてすべての対象体はこの細胞内コンパートメントでブースト効
果を見せ、2つの対象体(V27およびV28)において、rAd5-GPワクチン接種によって生成さ
れたものを超える応答が産生された。ICSによって測定された平均GP特異的CD8+T細胞出現
頻度は、一次免疫後0.09%であり、そしてrAd35-GP二次ワクチン接種後3週間0.41%まで、
4.7倍に増加した。
たマカクをブースティングするために有力であることを示した。ポストブーストGP指向性
(directed)抗体は、rAd5-GPワクチン接種された霊長類で100%の免疫防御のための予測
レベルよりもほとんど高いログの(nearly a log higher than)平均レベルに誘導された
(Sullivanら、2009)。重要なことに、rAd35-GPブーストは、CD8+T細胞の出現頻度の著
しい増大を提供し、またEBOV感染に対する免疫防御に関連付けられることを示した。した
がって、免疫応答の評価後一週間(ポストブースト4週間)、すべてのワクチン接種対象
体および一つのワクチン未接種コントロールのマカクを、筋肉内注入によりZEBOV 1000 P
FUにさらした。コントロール対象体はEBOV感染の臨床症状の特徴を見せ、そしてチャレン
ジ後日6での致死効果に屈した(図6C、D)。対照的に、すべてのワクチン接種対象体は、
循環性ASTレベルについて正常にとどまり(図6C)、そして研究終了での全体の病理評価
において出血性疾患の証拠を見せなかった(図示せず)。すべての4体のワクチン接種対
象は、感染によるチャレンジを生き延び、そして研究終了までの28日間のフォローアップ
期間中に症状のないままであった。これらの結果は、異種プライム・ブーストワクチンレ
ジメンとして投与されたrAd26/rAd35ベクターがZEBOV感染に対する一様な免疫防御を提供
し、そして混合ワクチンでの添加または相乗的結果を達成するためのこのアプローチの潜
在的な有用性が実証されることを示した。
クチンベクターとしてよく機能する〔Lasaro(ラサロ)ら、(2009)Mol Ther(モレキュ
ラー・セラピー)17(8):1333-9〕。特に、rAd5ベクターは、マウス、非ヒト霊長類、
およびヒトにおいて、EBOV-GPが標的抗原であるときに本発明者らが観察したように、有
力な抗原特異的免疫応答を生成する。しかしながら、症状発現前およびヒト臨床研究は、
rAd5ベースのベクターの効力が、Ad5に対しあらかじめ曝露されている個体において危う
くされる可能性があることを示唆し、それはそれらのものがベクターに対する免疫の高い
レベルを有する場合である。ここでは、研究の目的は、ナイーブおよびAd5免疫の双方の
対象体においてEBOV GP抗原を送達することができるrAdベクターを識別することであった
。任意のウイルス性ベクターに対する既存の免疫がその有効性を制限する可能性があるの
で、本発明者らは、本発明者の注意力を、血清反応陽性の対象体の有病率および/または
中和抗体の低レベルによって示されるような、比較的稀にしかヒトに感染しないウイルス
に着目した。珍しいヒトアデノウイルス血清型、Ad35およびAd26を、今回の作業において
ワクチン開発のために選定した。
使用されたときにあらかじめ観察された範囲内の抗原特異的抗体およびT細胞応答を生成
した。すべてのrAd35ワクチン接種体についての平均抗GP抗体力価(用量にかかわらない
もの)、1:1400は、1010のrAd5-GPでワクチン接種したすべての歴史的な対象体の平均(
1:11,000、n=17)よりも低く、rAd35について抗体力価がrAd5のEBOVワクチンについての
ものと同じ相関があるならば、ベクターの効力が2つの血清型間で異なる場合があるとい
う初期の徴候を提供する。CD4+およびCD8+のT細胞応答は、感染によるチャレンジの前に
、ほとんどの対象体において検出可能であったが、絶対等級は、アッセイブリッジコント
ロール(assay bridging controls)のためのPBMCサンプルの不存在下にこれらの研究に
おいて含まれないrAd5ワクチンと比較することはできない。
接種は、効果的に抗原特異的抗体およびTリンパ球の免疫応答を誘導し、稀な血清型のベ
クターゲノムが異種ベクター指向性免疫に抵抗するために、共通の血清型から十分に離れ
ていることを示唆された。ベクター性能のこの特色は、天然のウイルス感染からだけでな
く、プライミングワクチン接種または他の病原体に対するワクチン接種における異種ベク
ターの使用から生じる既存の免疫を迂回するのに重要である。実際に、rAd35-GP接種は、
rAd26-GPによってプライミングしたマカクにおいて、細胞媒介性の、および抗体の応答の
双方の強力なブースティングを提供した。この結果は興味深いことであったが、それはそ
れが一次免疫応答に対する二次応答の誘導のためのベクター潜在力において明らかな違い
を示すからであり;免疫応答をブースティングするためのrAd35-GPの能力はプライミング
ワクチン接種後に観察された応答の大きさによって予測されなかった。これらのデータは
、rAd35およびその他のrAdベクターが、Lindsay(リンジー)ら、J Immunol、185(3):
1513-21によって最近示唆されたように、標的樹状細胞の一定の集団または活性化状態に
おいて高い形質導入効率を有することを示すことができ、それは、この場合には、二次免
疫応答の間に、より一層豊富であるか、またはアクセス可能でありうる。
ことが判明し、試験した最高用量でワクチン接種されたマカクの75%までにおいて生存が
媒介された。rAd26-GPワクチンは、防御免疫を誘導するための明確な用量反応を示し、抗
原発現におけるわずかな改善が、EBOVチャレンジの高用量に対して、ここで用いるものの
ような均一な保護を生成するためにrAd26ベースのワクチンの効力を高めることができる
ことを示唆した。興味深いことに、一致した用量(1011粒子)にてrAd35-GPと比べてrAd2
6-GPベクターが提供する保護のより一層高い程度は、より一層高いELISA抗GP力価、1:45
00対1:1400にそれぞれ関連付けられた。これらのデータは、プレチャレンジ抗体力価がr
Ad5-GPワクチンについて観察されたように、ベクターグループ内に加えrAd血清型の全体
にわたるZEBOV感染に対する保護の免疫相関として役割を果たしうるという可能性を強調
する。抗体応答の誘導についての効力の序列は、ベクターグループ全体にわたる保護のた
めの順位を予測した。
そして霊長類においてワクチンベクターとして使用するための代替血清型rAdsの有用性を
実証した。その結果は、これらのワクチンがプライム・ブーストの組合せにおいて最も有
用でありうることを示唆する。
な免疫性がDNAでのプライミングrAdによって最適に達成されうることが提案された〔Sant
raら、(2005)。J Virol、79(10):6516-22〕。DNAが、複数のプライマーを必要とし
、そしてrAdベクターがするように迅速な保護を誘導しないので、異種rAdプライム・ブー
ストは、迅速な、および長期にわたる防御免疫の誘導の間のバランスを生成するのに最適
な機会を提供することができる。
て当業者に様々な修飾または変化が示唆され、そしてこの出願の精神および視野ならびに
添付の請求の範囲内に含まれるべきであろうことが理解される。ここで引用したすべての
刊行物、特許、および特許出願は、参照することにより、あらゆる目的のために本明細書
にそっくりそのまま組み込まれる。
Claims (35)
- フィロウイルス抗原に対する免疫反応を対象体において誘導する方法であって、フィロ
ウイルス抗原タンパク質がコードされる核酸を含む組換えアデノウイルスベクターの免疫
学的に有効な量を対象体に施すことを含み、アデノウイルスベクターには、アデノウイル
ス26カプシドタンパク質、またはアデノウイルス35カプシドタンパク質が含まれる、
方法。 - アデノウイルスベクターは筋肉内に施される、請求項1に記載の方法。
- 投与のステップはプライミングワクチン投与に次いでブースティングワクチン投与を含
む、請求項1または2の方法。 - プライミングワクチン投与には、アデノウイルス26カプシドタンパク質を含むアデノ
ウイルスベクターの投与が含まれ、およびブースティングワクチン投与には、アデノウイ
ルス35カプシドタンパク質を含むアデノウイルスベクターの投与が含まれる、請求項3
の方法。 - アデノウイルス26カプシドタンパク質を含むアデノウイルスベクターはrAd26ベ
クターであり、およびアデノウイルス35カプシドタンパク質を含むアデノウイルスベク
ターはrAd35ベクターである、請求項4の方法。 - フィロウイルス抗原タンパク質は糖タンパク質である、請求項1〜5のいずれか一項の
方法。 - フィロウイルス抗原タンパク質はエボラウイルス由来である(is from)、請求項1〜
6のいずれか一項の方法。 - エボラウイルスはザイール種である(is of species Zaire)、請求項7の方法。
- フィロウイルス抗原タンパク質は配列番号1に示されるようにポリヌクレオチド配列に
よってコードされる、請求項8の方法。 - エボラウイルスはスーダン/グル種である、請求項7の方法。
- フィロウイルス抗原タンパク質は配列番号2に示されるようにポリヌクレオチド配列に
よってコードされる、請求項10の方法。 - フィロウイルス抗原タンパク質は配列番号3に示されるようにポリヌクレオチド配列に
よってコードされる、請求項10の方法。 - フィロウイルス抗原タンパク質はマールブルグウイルス由来である、請求項1〜6のい
ずれか一項の方法。 - フィロウイルス抗原タンパク質は配列番号4に示されるようにポリヌクレオチド配列に
よってコードされる、請求項14の方法。 - フィロウイルス抗原タンパク質をコードする核酸を含む組換えアデノウイルスベクター
であって、アデノウイルス26カプシドタンパク質、またはアデノウイルス35カプシド
タンパク質を含む、アデノウイルスベクター。 - アデノウイルス26カプシドタンパク質を含む、請求項15のアデノウイルスベクター
。 - rAd26ベクターである、請求項16のアデノウイルスベクター。
- アデノウイルス35カプシドタンパク質を含む、請求項15のアデノウイルスベクター
。 - rAd35ベクターである、請求項18のアデノウイルスベクター。
- アデノウイルスベクターは複製欠損である、請求項15〜19のいずれか一項のアデノ
ウイルスベクター。 - フィロウイルス抗原タンパク質は糖タンパク質である、請求項15〜20のいずれか一
項のアデノウイルスベクター。 - フィロウイルス抗原タンパク質はエボラウイルス由来である、請求項15〜21のいず
れか一項のアデノウイルスベクター。 - エボラウイルスはザイール種である、請求項22のアデノウイルスベクター。
- フィロウイルス抗原タンパク質は配列番号1に示されるようにポリヌクレオチド配列に
よってコードされる、請求項23のアデノウイルスベクター。 - エボラウイルスはスーダン/グル種である、請求項22のアデノウイルスベクター。
- フィロウイルス抗原タンパク質は配列番号2に示されるようにポリヌクレオチド配列に
よってコードされる、請求項25のアデノウイルスベクター。 - フィロウイルス抗原タンパク質は配列番号3に示されるようにポリヌクレオチド配列に
よってコードされる、請求項25のアデノウイルスベクター。 - フィロウイルス抗原タンパク質はマールブルグウイルス由来である、請求項15〜21
のいずれか一項のアデノウイルスベクター。 - フィロウイルス抗原タンパク質は配列番号4に示されるようにポリヌクレオチド配列に
よってコードされる、請求項28のアデノウイルスベクター。 - フィロウイルス抗原タンパク質をコードする核酸が含まれる組換えアデノウイルスベク
ターをコードする分離された核酸分子であって、アデノウイルスベクターはアデノウイル
ス26カプシドタンパク質、またはアデノウイルス35カプシドタンパク質を含む、核酸
分子。 - フィロウイルス抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に操作可能に連結さ
れたCMVプロモーターが含まれる発現カセットを含む、請求項30の分離された核酸分
子。 - フィロウイルス抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号1に示
されるような配列を含む、請求項30または31の分離された核酸分子。 - フィロウイルス抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号2に示
されるような配列を含む、請求項30または31の分離された核酸分子。 - 請求項15〜28のいずれか一項の分離されたアデノウイルスベクターを含む、免疫原
性組成物。 - さらにアジュバントを含む、請求項34の免疫原性組成物。
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