JP2017044482A - 蛍光色素内包樹脂粒子溶液の選択方法および濃度調整方法 - Google Patents
蛍光色素内包樹脂粒子溶液の選択方法および濃度調整方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017044482A JP2017044482A JP2015164687A JP2015164687A JP2017044482A JP 2017044482 A JP2017044482 A JP 2017044482A JP 2015164687 A JP2015164687 A JP 2015164687A JP 2015164687 A JP2015164687 A JP 2015164687A JP 2017044482 A JP2017044482 A JP 2017044482A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fluorescent dye
- containing resin
- resin particles
- solution
- resin particle
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
【解決手段】(第1親和性分子を結合させた、一定量の溶液中に含まれる蛍光色素内包樹脂粒子に内包されている数と同数の蛍光色素単体での信号値)×(蛍光色素内包樹脂粒子一つ当たりに結合している表面親和性分子数)×{(蛍光色素内包樹脂粒子の発光強度)/(蛍光色素内包樹脂粒子に内包された色素単体での発光強度)}の値が0.5以上、1.2以下であるものを選択する工程、および当該選択工程の後、蛍光色素内包樹脂粒子溶液に含まれる蛍光色素内包樹脂粒子の表面積の総和(T)に対する信号値(S)の比の値(S/T)が所定の値となるように希釈し、蛍光色素内包樹脂粒子溶液の濃度を調整する工程を含む、蛍光色素内包樹脂粒子溶液の生産方法。
【選択図】なし
Description
表面に第1親和性分子を結合させた蛍光色素内包樹脂粒子を一定濃度で含む一定量の溶液を、該第1親和性分子と特異的に結合可能な第2親和性分子を一定密度で固定化したプレートと反応させた際に、計測される信号値(S)が下記式を満たすものを選択する工程を含む、蛍光色素内包樹脂粒子溶液の生産方法。
0.5×A×B×(C/D) ≦ S ≦ 1.2×A×B×(C/D)
A:第1親和性分子を結合させた、前記一定濃度の一定量の溶液中に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子に内包されている数と同数の蛍光色素単体を、前記プレートと反応させた際に計測される信号値
B:前記一定濃度の一定量の溶液に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子の全表面に結合している第1親和性分子の全数を蛍光色素内包樹脂粒子数で割った、蛍光色素内包樹脂粒子1つあたりに結合される第1親和性分子の数
C:前記蛍光色素内包樹脂粒子1粒子あたりの発光強度
D:前記蛍光色素内包樹脂粒子1粒子に内包されている数の蛍光色素単体の発光強度
表面に第1親和性分子を結合させた蛍光色素内包樹脂粒子を一定濃度で含む一定量の溶液を、該第1親和性分子と特異的に結合可能な第2親和性分子を一定密度で固定化したプレートと反応させた際に、計測される信号値(S)が下記式を満たす蛍光色素内包樹脂粒子溶液について、当該蛍光色素内包樹脂粒子溶液に含まれる蛍光色素内包樹脂粒子の表面積の総和(T)に対する、前記第2親和性分子を一定密度で固定化したプレートに前記蛍光色素内包樹脂粒子溶液を散布した際に計測される信号値(S)の比の値(S/T)が所定の値となるように希釈し、前記蛍光色素内包樹脂粒子溶液の濃度を調整する工程を含む、蛍光色素内包樹脂粒子溶液の生産方法。
0.5×A×B×(C/D) ≦ S ≦ 1.2×A×B×(C/D)
A:第1親和性分子を結合させた、前記一定濃度の一定量の溶液中に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子に内包されている数と同数の蛍光色素単体を、前記プレートと反応させた際に計測される信号値
B:前記一定濃度の一定量の溶液に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子の全表面に結合している第1親和性分子の全数を蛍光色素内包樹脂粒子数で割った、蛍光色素内包樹脂粒子1つあたりに結合される第1親和性分子の数
C:前記蛍光色素内包樹脂粒子1粒子あたりの発光強度
D:前記蛍光色素内包樹脂粒子1粒子に内包されている数の蛍光色素単体の発光強度
前記蛍光色素内包樹脂粒子を構成する母体である樹脂がメラミン樹脂およびスチレン樹脂からなる群から選択される樹脂である、項1または2に記載の生産方法。
前記蛍光色素内包樹脂粒子を構成する蛍光色素が有機色素である、項1〜3のいずれか一項に記載の生産方法。
前記蛍光色素内包樹脂粒子を構成する蛍光色素がペリレンジイミドおよびフルオレセインイソチアネートからなる群から選択される、項1〜4のいずれか一項に記載の生産方法。
前記蛍光色素内包樹脂粒子に結合している第1親和性分子がビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびニュートラアビジン、抗ジニトロフェノール抗体および抗ジゴキシゲニン抗体からなる群から選択される、項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
前記第1親和性分子が、高分子由来のスペーサーを介して前記蛍光色素内包樹脂粒子に結合している、項1〜6のいずれか一項に記載の生産方法。
前記スペーサーがポリエチレングリコール(PEG)である、項7に記載の生産方法。
本発明の蛍光色素内包樹脂粒子溶液の生産方法は、以下に述べる所定の「選択工程」および/または「濃度調整工程」を含む。「濃度調整工程」に用いられる所定の蛍光色素内包樹脂粒子溶液は、典型的には「選択工程」において選択されたものであり、したがって本発明の蛍光色素内包樹脂粒子溶液の生産方法は「選択工程」に続いて「濃度調整工程」を含む実施形態であってもよい。一方で、「濃度調整工程」に用いられる所定の蛍光色素内包樹脂粒子溶液は、本発明における「選択工程」とは別の手段によって選択されたもの、または「濃度調整工程」を含む蛍光色素内包樹脂粒子溶液の生産方法の実施者とは異なる実施者による(つまり「濃度調整工程」とは不連続な)「選択工程」によって選択されたものであってもよい。
(蛍光色素内包樹脂粒子)
蛍光色素内包樹脂粒子とは、詳しくは、樹脂でできた粒子(母体)中に、比較的多量の蛍光色素が内包(集積化)された構造を有するナノサイズの粒子である。蛍光色素は、好ましくは樹脂の分子構造(たとえばメラミン樹脂のような熱硬化性樹脂が有する三次元的な網目構造)によって粒子内に閉じ込められている。あるいは、蛍光色素が有する官能基ないし部位と樹脂が有する官能基ないし部位との間に静電的相互作用(イオン結合)が働いているか、またはそれらの間で共有結合が形成されていることが好ましい。このようにして蛍光色素が強固に樹脂粒子に固定化されている蛍光色素内包樹脂粒子は、濃度消光を起こしにくく、また蛍光観察時に一定時間蛍光を当て続けても褪色しにくいため、ノイズであるエオジンの蛍光や細胞自家蛍光に対して著しく高い輝度を有する。その上、組織染色の透徹工程で用いられる有機溶媒(キシレン)によって蛍光色素が粒子外に溶出してしまうことも抑制されるため、蛍光標識体として優れている。
本明細書において「蛍光色素」とは、外部からのX線、紫外線または可視光線の照射を受けて励起し、励起状態から基底状態に到る過程において光を発光する物質一般を指す。したがって、本発明にいう「蛍光色素」は、励起状態から基底状態に戻るときの遷移態様の如何を問うものでなく、励起一重項からの失活に伴う発光である狭義の蛍光を発する物質であってもよいし、三重項からの失活に伴う発光である燐光を発する物質であってもよい。
蛍光色素としての使用可能な有機蛍光色素のとしては、ペリレン系色素分子、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Alexa Fluor(登録商標、インビトロジェン社製)系色素分子、BODIPY(登録商標、インビトロジェン社製)系色素分子、Cy(登録商標、GEヘルスケア社製)系色素分子、クマリン系色素分子、NBD(登録商標)系色素分子、エオジン系色素分子およびピレン系色素分子等を挙げることができる。
クマリン系色素分子の具体例としては、メトキシクマリン、エオジン系色素分子の具体例としてはエオジン、NBD(登録商標)系色素分子の具体例としては、NBD、ピレン系色素分子の具体例としてはピレンが挙げられる。
蛍光色素としての使用可能な無機蛍光色素の例としては、量子ドットを挙げることができる。量子ドットとしては、II−VI族化合物、III−V族化合物、又はIV族元素を成分として含有する量子ドット(それぞれ、「II−VI族量子ドット」、「III−V族量子ドット」、「IV族量子ドット」ともいう。)のいずれかを用いることができる。具体的には、国際公開WO2012/133047号公報に例示されたCdSe等の粒子ドットを挙げることができる。これらの無機蛍光色素は、いずれかの種類を単独で用いても、複数種を併用してもよい。
蛍光色素内包樹脂粒子から表面修飾蛍光色素内包樹脂粒子を作製するための修飾工程は、一般的な表面修飾蛍光色素内包樹脂粒子と同様の、公知の修飾方法を利用して行うことができる。
本発明における第1親和性分子は、蛍光色素内包樹脂粒子の表面を修飾する分子であり、蛍光色素内包樹脂粒子を修飾でき、かつ後述する第2親和性分子に結合する分子であればとくに限定されるものではない。
本発明において、第2親和性分子は、プレートに固定化され、第1親和分子と結合した蛍光色素内包樹脂粒子と反応することで発光する蛍光を信号値として計測するために用いられる分子であり、選択される第1親和性分子に対応した、それと特異的に結合する分子であればよい。このような第2親和性分子は、免疫染色を行なう際に、検出目的とする生体分子に対して直接的または間接的に結合させることで、第1親和性分子と結合した蛍光色素内包ナノ粒子と生体分子間の結合の仲立ちとなるために用いられる。
本発明における選択工程は、表面に第1親和性分子を結合させた蛍光色素内包樹脂粒子を一定濃度で含む一定量の溶液を、該第1親和性分子と特異的に結合可能な第2親和性分子を一定密度で固定化したプレートと反応させた際に、計測される信号値(S)が下記式を満たすものを選択する工程である。
式中、Aは第1親和性分子を結合させた、前記一定量の溶液中に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子に内包されている数と同数の蛍光色素単体を、前記プレートと反応させた際に計測される信号値を示し、
Bは前記一定濃度の一定量の溶液に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子の全表面に結合している第1親和性分子の全数を蛍光色素内包樹脂粒子数で割った、蛍光色素内包樹脂粒子1つあたりに結合している第1親和性分子の数を示し、
Cは前記蛍光色素内包樹脂粒子1粒子あたりの発光強度を示し、
Dは前記蛍光色素内包樹脂粒子1粒子に内包されている数の蛍光色素単体の発光強度を示す。
上記Cの「前記蛍光色素内包樹脂粒子1粒子あたりの発光強度」は、次のようにして計算することが可能である。すなわち、粒子カウンターを利用して、一定濃度(例えば0.01nM、すなわち6.02×109粒子/mL)の一定量の蛍光色素内包樹脂粒子溶液(蛍光色素内包樹脂粒子標準液)を調製し、発光ピーク波長における蛍光強度を測定する。蛍光色素内包樹脂粒子標準液の蛍光強度を、当該標準液中に含まれる蛍光色素内包樹脂粒子の数で除することにより、蛍光色素内包樹脂粒子1粒子あたりの発光強度が求まる。
信号値が上記式を満たす蛍光色素内包樹脂粒子溶液、換言すれば、相対値化された信号値:S/{A×B×(C/D)}が0.5〜1.2の範囲にある蛍光色素内包樹脂粒子溶液は、染色液として十分な染色性能があると考えられる。
上記の方法で選択された蛍光色素内包樹脂粒子溶液に含まれる蛍光色素内包樹脂粒子の表面積の総和(T)に対する、前記工程で計測された信号値(S)の比の値(S/T)が所定の値となるように適当な溶媒で希釈することで、複数のロット由来であるにも関わらず、一定の染色性能を持つ蛍光色素内包樹脂粒子溶液を得ることができる。ここで用いられる溶媒は、選択工程に先だって第1親和性分子と結合させた蛍光色素内包樹脂粒子の溶液を調製する際に用いた溶媒と同じものでよく、例えば1%程度のBSA含有PBSが特に好適である。
本発明の生産方法により得られた蛍光色素内包樹脂粒子溶液は、一般的な蛍光色素内包樹脂粒子溶液と同様の用途を有し、例えば蛍光免疫染色またはFISHのための染色液として用いることができる。具体的には、例えば、人体(患者)から採取した組織切片についてプレパラートを作製し、特定のタンパク質または遺伝子の発現状況を反映した染色像を観察することにより、そのタンパク質または遺伝子の発現量および発現部位等に基づいて病理診断のための情報を得ることのできる、組織免疫染色またはFISHのための染色液としての用途が挙げられる。蛍光免疫染色は、組織染色に限定されるものではなく、細胞染色に適用することも可能である。検出対象とする生体分子は、それと特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されるものではない。
免疫染色工程において、第1親和性分子が結合した蛍光色素内包樹脂粒子を用いて特定の抗原に対する蛍光免疫染色を行うための手順は、第1親和性分子として前記第1〜第3のいずれのグループの分子を用いるかに応じて、適宜調整することができる。
標本後処理工程には、固定処理、脱水・透徹処理、封入処理、その他必要に応じて洗浄処理等が含まれる。
封入処理は、キシレン置換した切片に油系封入剤を載せ、カバーガラス等を載せる事で行なわれる。
(i:明視野観察工程)
明視野観察工程は、細胞または組織内の染色対象とする生体分子(抗原等)の位置を特定するために形態観察染色処理を行った場合に、染色された組織切片に照明光を当て、組織切片に沈着した発色剤の色素を観察し、細胞膜の形状等に係る画像を取得する工程である。
蛍光観察工程は、免疫染色処理された組織切片中の蛍光色素内包樹脂粒子に励起光を照射することにより、内包されている蛍光色素の発する蛍光を観察し、細胞または組織内の染色対象とする生体分子の量(輝点数または発光強度等)に係る画像を取得する工程である。
[作製例1]SA結合蛍光色素内包樹脂粒子−1
(1−1)蛍光色素内包樹脂粒子の合成工程
N,N'−ビス(2,6−ジイソプロピルフェニル)−1,6,7,12−テトラフェノキシペリレン−3,4:9,10−テトラカルボキシジイミドを濃硫酸で処理し、ペリレンジイミドスルホン酸誘導体を作製した。これを酸クロリドに変換してペリレンジイミドスルホン酸クロリド誘導体とした。
上記合成工程(1)で得られた蛍光色素内包樹脂粒子−1、0.1mgをEtOH(エタノール)1.5mL中に分散し、アミノプロピルトリメトキシシランLS−3150(信越化学工業社製)2μLを加えて8時間反応させて表面アミノ化処理を行なった。
蛍光色素内包樹脂粒子の合成工程(1)において、原料の量を、ペリレンジイミドスルホン酸クロリド誘導体14.4mg、メラミン樹脂「ニカラックMX−035」0.65g、ギ酸100μLに変更し、それ以外は実施例1と同様にして、蛍光色素内包樹脂粒子−2を得た。蛍光色素内包樹脂粒子−2の平均粒子径は150nmであった。続いて、実施例1の第1親和性分子による修飾工程(2)と同様にして、SA結合蛍光色素内包樹脂粒子−2を得て、保存した。
蛍光色素内包樹脂粒子の合成工程(1)において、原料の量を、ペリレンジイミドスルホン酸クロリド誘導体12.8mg、メラミン樹脂「ニカラックMX−035」0.58g、ギ酸100μLに変更し、それ以外は実施例1と同様にして、蛍光色素内包樹脂粒子−3を得た。蛍光色素内包樹脂粒子−3の平均粒子径は100nmであった。続いて、実施例1の第1親和性分子による修飾工程(2)と同様にして、SA結合蛍光色素内包樹脂粒子−3を得て、保存した。
蛍光色素内包樹脂粒子の合成工程(1)において、原料の量を、ペリレンジイミドスルホン酸クロリド誘導体9.3mg、メラミン樹脂「ニカラックMX−035」0.42g、ギ酸100μLに変更し、それ以外は実施例1と同様にして、蛍光色素内包樹脂粒子−4を得た。蛍光色素内包樹脂粒子−4の平均粒子径は50nmであった。続いて、実施例1の第1親和性分子による修飾工程(2)と同様にして、SA結合蛍光色素内包樹脂粒子−4を得て、保存した。
第1親和性分子による修飾工程(2)において、ストレプトアビジンの代わりに1次抗体として抗HER2ウサギモノクローナル抗体(4B5、ベンタナ社製)を用い、チオール基が付加された当該1次抗体とマレイミド基が付加された蛍光色素内包樹脂粒子を反応させるようにし、それ以外は作製例1と同様にして、1次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子−1を得て、保存した。
第1親和性分子による修飾工程(2)において、ストレプトアビジンの代わりに1次抗体として抗HER2ウサギモノクローナル抗体(4B5)を用い、チオール基が付加された当該1次抗体とマレイミド基が付加された蛍光色素内包樹脂粒子を反応させるよう変更し、それ以外は作製例2と同様にして、1次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子−2を得て、保存した。
第1親和性分子による修飾工程(2)において、ストレプトアビジンの代わりに1次抗体として抗HER2ウサギモノクローナル抗体(4B5)を用い、チオール基が付加された当該1次抗体とマレイミド基が付加された蛍光色素内包樹脂粒子を反応させるよう変更し、それ以外は作製例3と同様にして、1次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子−3を得て、保存した。
第1親和性分子による修飾工程(2)において、ストレプトアビジンの代わりに1次抗体として抗HER2ウサギモノクローナル抗体(4B5)を用い、チオール基が付加された当該1次抗体とマレイミド基が付加された蛍光色素内包樹脂粒子を反応させるよう変更し、それ以外は作製例4と同様にして、1次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子−4を得て、保存した。
第1親和性分子による修飾工程(2)において、ストレプトアビジンの代わりに2次抗体として抗ウサギIgG抗体(LO−RG−1、フナコシ社製)を用い、チオール基が付加された当該2次抗体とマレイミド基が付加された蛍光色素内包樹脂粒子を反応させるよう変更し、それ以外は作製例2と同様にして、2次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子−2を得て、保存した。
第1親和性分子による修飾工程(2)において、ストレプトアビジンの代わりに2次抗体として抗ウサギIgG抗体(LO−RG−1)を用い、チオール基が付加された当該2次抗体とマレイミド基が付加された蛍光色素内包樹脂粒子を反応させるよう変更し、それ以外は作製例2と同様にして、2次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子−2を得て、保存した。
第1親和性分子による修飾工程(2)において、ストレプトアビジンの代わりに2次抗体として抗ウサギIgG抗体(LO−RG−1)を用い、チオール基が付加された当該2次抗体とマレイミド基が付加された蛍光色素内包樹脂粒子を反応させるよう変更し、それ以外は作製例3と同様にして、2次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子−3を得て、保存した。
第1親和性分子による修飾工程(2)において、ストレプトアビジンの代わりに2次抗体として抗ウサギIgG抗体(LO−RG−1)を用い、チオール基が付加された当該2次抗体とマレイミド基が付加された蛍光色素内包樹脂粒子を反応させるよう変更し、それ以外は作製例4と同様にして、2次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子−4を得て、保存した。
N,N'−ビス(2,6−ジイソプロピルフェニル)−1,6,7,12−テトラフェノキシペリレン−3,4:9,10−テトラカルボキシジイミドと等量のスルホニルクロリドを反応させ、ペリレンジイミドクロリド誘導体(反応性色素)とした。ストレプトアビジン(SA)を1mg/mLとなるよう、1mLの0.1Mホウ酸バッファー(pH8.3)に溶かした。上記反応性色素をDMSOに10mg/mLとして溶かした。撹拌しているSA溶液に、ゆっくりと100μLの反応性色素を加え、室温中で撹拌し、1時間反応した。Zeba Spin Desalting Columnsを用い、溶媒にPBSを用いて余剰の色素を除去することで、蛍光色素としてペリレンジイミドを有するSA結合蛍光色素を得た。
樹脂粒子としてポリスチレン粒子を用いる場合、SA結合樹脂粒子はポリスチレン粒子とSAとの物理吸着により作製可能である。市販のCOOH末端のポリスチレン粒子(200nm、Life Technologies社)に、0.1Mホウ酸バッファー(pH8.3)に溶かしたSAを1000倍等量加え、撹拌することで、樹脂粒子としてポリスチレン粒子を有するSA結合樹脂粒子を得た。
SAの代わりに1次抗体として抗HER2ウサギモノクローナル抗体(4B5)を用い、反応性色素と当該1次抗体とを反応させるように変更し、それ以外は比較作成例1と同様にして、1次抗体結合蛍光色素を得た。
SAの代わりに1次抗体として抗HER2ウサギモノクローナル抗体(4B5)を用い、ポリスチレン粒子に当該1次抗体を吸着させるように変更し、それ以外は比較作製例2と同様にして、1次抗体結合樹脂粒子を得た。
SAの代わりに2次抗体として抗ウサギIgG抗体(LO−RG−1)を用い、反応性色素と当該2次抗体とを反応させるように変更し、それ以外は比較作成例1と同様にして、2次抗体結合蛍光色素を得た。
SAの代わりに2次抗体として抗ウサギIgG抗体(LO−RG−1)を用い、ポリスチレン粒子に当該2次抗体を吸着させるように変更し、それ以外は比較作成例2と同様にして、2次抗体結合樹脂粒子を得た。
[実施例1〜4および比較例1〜2]SA結合蛍光標識液の試験
作製例1〜4のSA結合蛍光色素内包樹脂粒子および比較作製例1〜2のSA結合対照物(SA結合蛍光標識体)を用いて、次のような手順でそれらの溶液(SA結合蛍光標識液)を調製した後、ビオチンプレートを用いた試験を行った。実施例1〜4および比較例1〜2は、それぞれ作製例1〜4および比較例1〜2のSA結合蛍光標識溶液についての試験に対応する。
作製例1〜4および比較作製例1〜2のSA結合蛍光標識体の代わりに、作製例5〜8の1次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子および比較作製例3〜4の1次抗体結合対照物(1次抗体結合蛍光標識体)を用いたこと、およびビオチンプレートの代わりに下記の手順で作製した2次抗体(抗ウサギIgG抗体)プレートを用いたこと以外は、実施例1〜4および比較例1〜2と同様の手順で、1次抗体結合蛍光標識液を調製し、2次抗体プレートを用いた試験を行い、蛍光強度の信号値(S)を測定した。実施例5〜8および比較例3〜4は、それぞれ作製例5〜8および比較作製例3〜4の1次抗体結合蛍光標識溶液についての試験に対応する。
作製例1〜4および比較作製例1〜2のSA結合蛍光標識体の代わりに、作製例9〜12の2次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子および比較作製例5〜6の2次抗体結合対照物(2次抗体結合蛍光標識体)を用いたこと、およびビオチンプレートの代わりに下記の手順で作製した1次抗体(抗HER2ウサギモノクローナル抗体)プレート)を用いたこと以外は、実施例1〜4および比較例1〜2と同様の手順で、2次抗体結合蛍光標識液を調製し、1次抗体プレートを用いた試験を行い、蛍光強度の信号値(S)を測定した。実施例9〜12および比較例5〜6は、それぞれ作製例9〜12および比較作製例5〜6の2次抗体結合蛍光標識溶液についての試験に対応する。
<SA結合蛍光標識液を用いた場合>
実施例1〜4のSA結合蛍光色素内包樹脂粒子の溶液および比較例1〜2のSA結合対照物の溶液(SA結合蛍光標識液)を用いて、次のような手順で培養細胞を染色し、染色画像を取得した。
なお、形態観察染色による像を観察する際には、免疫染色用の蛍光色素を励起させるための励起光を照射する必要はないので、光学顕微鏡と同様の観察条件下で観察した。
実施例5〜8の1次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子の溶液および比較例3〜4の1次抗体結合対照物の溶液(1次抗体結合蛍光標識液)を用いて、次のような手順で培養細胞を染色し、染色画像を取得した。
実施例9〜12の2次抗体結合蛍光色素内包樹脂粒子および比較例5〜6の2次抗体結合対照物(2次抗体結合蛍光標識液)を用いて、次のような手順で培養細胞を染色し、染色画像を取得した。
[実施例13〜16]
実施例1〜4の蛍光色素内包樹脂粒子溶液に含まれる蛍光色素内包樹脂粒子(平均粒子径はそれぞれ200nm、150nm、100nmおよび50nm)の表面積の総和(T)に対する、ビオチンを一定密度で固定化したプレートに蛍光色素内包樹脂粒子溶液を散布した際に計測される信号値(S)の比の値(S/T)が所定の値(2×1012/nm2)となるように希釈することによって、濃度が調整された蛍光色素内包樹脂粒子溶液を得た。
実施例1〜4の蛍光色素内包樹脂粒子溶液を、蛍光色素内包樹脂粒子の濃度が0.05nMとなるように希釈することによって、濃度が調整された蛍光色素内包樹脂粒子溶液を得た。
実施例1〜4の蛍光色素内包樹脂粒子溶液について、まず蛍光色素内包樹脂粒子の濃度が所定の値(0.05nM)となるように希釈してその蛍光強度を測定し、その蛍光強度が等しくなるよう、それぞれの希釈液をさらに希釈することによって、輝度が調整された蛍光色素内包樹脂粒子溶液を得た。
実施例13〜16および比較例7〜14それぞれの染色液を用いて、前記[3.培養細胞の染色]の手法と同様にして、細胞を染色し、染色画像を取得した。各実施例および比較例について、細胞の染色および染色画像の取得を9反復ずつ行い、染色後における輝点数のばらつきを計測した。
Claims (8)
- 表面に第1親和性分子を結合させた蛍光色素内包樹脂粒子を一定濃度で含む一定量の溶液を、該第1親和性分子と特異的に結合可能な第2親和性分子を一定密度で固定化したプレートと反応させた際に、計測される信号値(S)が下記式を満たすものを選択する工程を含む、蛍光色素内包樹脂粒子溶液の生産方法。
0.5×A×B×(C/D) ≦ S ≦ 1.2×A×B×(C/D)
A:第1親和性分子を結合させた、前記一定濃度の一定量の溶液中に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子に内包されている数と同数の蛍光色素単体を、前記プレートと反応させた際に計測される信号値
B:前記一定濃度の一定量の溶液に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子の全表面に結合している第1親和性分子の全数を蛍光色素内包樹脂粒子数で割った、蛍光色素内包樹脂粒子1つあたりに結合している第1親和性分子の数
C:前記蛍光色素内包樹脂粒子1粒子あたりの発光強度
D:前記蛍光色素内包樹脂粒子1粒子に内包されている数の蛍光色素単体の発光強度 - 表面に第1親和性分子を結合させた蛍光色素内包樹脂粒子を一定濃度で含む一定量の溶液を、該第1親和性分子と特異的に結合可能な第2親和性分子を一定密度で固定化したプレートと反応させた際に、計測される信号値(S)が下記式を満たす蛍光色素内包樹脂粒子溶液について、当該蛍光色素内包樹脂粒子溶液に含まれる蛍光色素内包樹脂粒子の表面積の総和(T)に対する、前記第2親和性分子を一定密度で固定化したプレートに前記蛍光色素内包樹脂粒子溶液を散布した際に計測される信号値(S)の比の値(S/T)が所定の値となるように希釈し、前記蛍光色素内包樹脂粒子溶液の濃度を調整する工程を含む、蛍光色素内包樹脂粒子溶液の生産方法。
0.5×A×B×(C/D) ≦ S ≦ 1.2×A×B×(C/D)
A:第1親和性分子を結合させた、前記一定濃度の一定量の溶液中に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子に内包されている数と同数の蛍光色素単体を、前記プレートと反応させた際に計測される信号値
B:前記一定濃度の一定量の溶液に含まれる全蛍光色素内包樹脂粒子の全表面に結合している第1親和性分子の全数を蛍光色素内包樹脂粒子数で割った、蛍光色素内包樹脂粒子1つあたりに結合している第1親和性分子の数
C:前記蛍光色素内包樹脂粒子1粒子あたりの発光強度
D:前記蛍光色素内包樹脂粒子1粒子に内包されている数の蛍光色素単体の発光強度 - 前記蛍光色素内包樹脂粒子を構成する母体である樹脂がメラミン樹脂およびスチレン樹脂からなる群から選択される樹脂である、請求項1または2に記載の生産方法。
- 前記蛍光色素内包樹脂粒子を構成する蛍光色素が有機色素である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の生産方法。
- 前記蛍光色素内包樹脂粒子を構成する蛍光色素がペリレンジイミドおよびフルオレセインイソチアネートからなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の生産方法。
- 前記蛍光色素内包樹脂粒子に結合している第1親和性分子がビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、抗ジニトロフェノール抗体および抗ジゴキシゲニン抗体からなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の生産方法。
- 前記第1親和性分子が、高分子由来のスペーサーを介して前記蛍光色素内包樹脂粒子に結合している、請求項1〜6のいずれか一項に記載の生産方法。
- 前記スペーサーがポリエチレングリコール(PEG)である、請求項7に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015164687A JP6493085B2 (ja) | 2015-08-24 | 2015-08-24 | 蛍光色素内包樹脂粒子溶液の選択方法および濃度調整方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015164687A JP6493085B2 (ja) | 2015-08-24 | 2015-08-24 | 蛍光色素内包樹脂粒子溶液の選択方法および濃度調整方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017044482A true JP2017044482A (ja) | 2017-03-02 |
JP6493085B2 JP6493085B2 (ja) | 2019-04-03 |
Family
ID=58211740
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015164687A Active JP6493085B2 (ja) | 2015-08-24 | 2015-08-24 | 蛍光色素内包樹脂粒子溶液の選択方法および濃度調整方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6493085B2 (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020066369A1 (ja) * | 2018-09-25 | 2020-04-02 | デンカ株式会社 | 検査キット用膜担体および検査キット |
WO2020075751A1 (ja) * | 2018-10-10 | 2020-04-16 | コニカミノルタ株式会社 | 発光色素含有粒子及び病理診断用標識剤 |
WO2020142280A1 (en) * | 2018-12-31 | 2020-07-09 | Dow Silicones Corporation | Bioconjugated molecule, method of preparing same, and diagnostic method |
WO2020217985A1 (ja) * | 2019-04-26 | 2020-10-29 | コニカミノルタ株式会社 | 発光色素含有粒子及び病理診断用標識剤 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008231378A (ja) * | 2007-03-23 | 2008-10-02 | Fujifilm Corp | 蛍光性重合体微粒子及びその製造方法、蛍光検出用複合体、蛍光検出方法並びに蛍光検出キット |
US20090108235A1 (en) * | 2005-09-22 | 2009-04-30 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Semiconductor-Nanoparticle-Dispersed Small Glass Particles and Process for Preparing the same |
US20100285594A1 (en) * | 2009-05-07 | 2010-11-11 | Nodality, Inc. | Microbead kit and method for quantitative calibration and performance monitoring of a fluorescence instrument |
JP2011220705A (ja) * | 2010-04-05 | 2011-11-04 | Furukawa Electric Co Ltd:The | イムノクロマトグラフィー用複合粒子 |
-
2015
- 2015-08-24 JP JP2015164687A patent/JP6493085B2/ja active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090108235A1 (en) * | 2005-09-22 | 2009-04-30 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Semiconductor-Nanoparticle-Dispersed Small Glass Particles and Process for Preparing the same |
JP2008231378A (ja) * | 2007-03-23 | 2008-10-02 | Fujifilm Corp | 蛍光性重合体微粒子及びその製造方法、蛍光検出用複合体、蛍光検出方法並びに蛍光検出キット |
US20100285594A1 (en) * | 2009-05-07 | 2010-11-11 | Nodality, Inc. | Microbead kit and method for quantitative calibration and performance monitoring of a fluorescence instrument |
JP2011220705A (ja) * | 2010-04-05 | 2011-11-04 | Furukawa Electric Co Ltd:The | イムノクロマトグラフィー用複合粒子 |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020066369A1 (ja) * | 2018-09-25 | 2020-04-02 | デンカ株式会社 | 検査キット用膜担体および検査キット |
CN112740040A (zh) * | 2018-09-25 | 2021-04-30 | 电化株式会社 | 检验试剂盒用膜载体及检验试剂盒 |
EP3859335A4 (en) * | 2018-09-25 | 2021-12-08 | Denka Company Limited | MEMBRANE SUPPORT FOR TEST KIT AND TEST KIT |
WO2020075751A1 (ja) * | 2018-10-10 | 2020-04-16 | コニカミノルタ株式会社 | 発光色素含有粒子及び病理診断用標識剤 |
WO2020142280A1 (en) * | 2018-12-31 | 2020-07-09 | Dow Silicones Corporation | Bioconjugated molecule, method of preparing same, and diagnostic method |
WO2020217985A1 (ja) * | 2019-04-26 | 2020-10-29 | コニカミノルタ株式会社 | 発光色素含有粒子及び病理診断用標識剤 |
JP7456438B2 (ja) | 2019-04-26 | 2024-03-27 | コニカミノルタ株式会社 | 発光色素含有粒子及び病理診断用標識剤 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6493085B2 (ja) | 2019-04-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2021152545A (ja) | S−アデノシルメチオニン、s−アデノシルホモシステイン及びホモシステインを迅速かつ簡単に測定するための蛍光の使用 | |
JP4716337B2 (ja) | フローサイトメトリーによる細胞の検出・分取システム、及び検出・分取方法 | |
JP2022521672A (ja) | 単分子定量検出方法及び検出システム | |
JP6493085B2 (ja) | 蛍光色素内包樹脂粒子溶液の選択方法および濃度調整方法 | |
JP6129330B2 (ja) | 蛍光体集積ナノ粒子標識剤、およびこれを用いた蛍光免疫染色法 | |
JP6296050B2 (ja) | 蛍光標識用樹脂粒子 | |
JP6241239B2 (ja) | 蛍光色素内包ナノ粒子、蛍光色素内包ナノ粒子の製造方法、蛍光標識剤、及び蛍光免疫染色方法 | |
CN110869764A (zh) | 用于检测样品中的细胞外囊泡的方法 | |
WO2015045961A1 (ja) | 蛍光ナノ粒子標識体、多重免疫染色剤キットおよび多重免疫染色法 | |
JP6424826B2 (ja) | 組織切片における生体物質の定量法 | |
WO2016152244A1 (ja) | 目的生体物質の検出方法および検出システム | |
WO2016117054A1 (ja) | 蛍光観察に使用する蛍光体集積ナノ粒子 | |
KR101521565B1 (ko) | 생체 분자 분석 키트 및 분석 방법 | |
JP6237194B2 (ja) | 染色方法 | |
JP2012194013A (ja) | 免疫組織化学染色方法及び反応試薬 | |
JP6658330B2 (ja) | 組織切片から蛍光ナノ粒子の解離を防止する方法 | |
WO2019131727A1 (ja) | 医薬の評価方法 | |
WO2017014196A1 (ja) | 目的生体物質の解析方法および解析システム | |
US20210011007A1 (en) | Fluorescent premix particles, fluorescent stain containing same, and fluorescent staining method in which these are used | |
JP6583011B2 (ja) | 酸性水溶液を用いた免疫染色スライドの洗浄方法 | |
CN115825452A (zh) | 胶质纤维酸性蛋白检测试剂盒 | |
JP6769360B2 (ja) | 蛍光体集積粒子複合体を用いた多段階蛍光染色方法および蛍光体集積粒子複合体 | |
JP6524833B2 (ja) | 蛍光体集積ナノ粒子を用いたfishまたは免疫染色スライドの封入方法 | |
WO2016093268A1 (ja) | 蛍光ナノ粒子用希釈液、これを用いた蛍光免疫染色用キット、蛍光免疫染色用溶液、および蛍光免疫染色法、遺伝子染色法 | |
WO2022030371A1 (ja) | 免疫染色方法及び免疫染色組織標本の作製方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20171214 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20181031 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181106 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190205 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190218 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6493085 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |