JP2017029039A - ヘムタンパク質の生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ヘムタンパク質としては、例えばシトクロムP450、シトクロム、ヘモグロビン、ミオグロビン、ペルオキシダーゼ、シトクロムc、シトクロムb、CooA、HemT等が挙げられる。本実施形態においては、ヘムタンパク質は、好ましくはシトクロムP450および/またはシトクロムである。シトクロムP450は、好ましくはCYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A5、CYP2J2、CYP4F2、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2D6*10、CYP2D6*39である。なお、「*」は遺伝子多型を表す。シトクロムは、好ましくはシトクロムb、シトクロムcである。具体的には、シトクロムb5(以下、「Cytochrome b5」ともいう)が例示される。
鱗翅目昆虫個体は、成虫、蛹および幼虫のいずれの形態であってよいが、セリンプロテアーゼの活性およびバキュロウイルスへの感受性の観点から、蛹を用いることが好ましい。
ポリヌクレオチドは、鱗翅目昆虫個体においてヘムタンパク質のアミノ酸配列部分(アポタンパク質)を発現しさえすれば如何なる形態で導入されていてもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、鱗翅目昆虫個体における遺伝子発現を可能にするプロモータを有し、プロモータの下流にポリヌクレオチドを挿入可能なベクターDNAに組み込まれており、より好ましくは、バキュロウイルスDNAとの相同組換えにより組換えバキュロウイルスを作製可能なトランスファーベクターに挿入されている。そのようなベクターDNA自体は当該技術において公知であり、例えばpM01、pM02、pYNG、pBM030、pBM050、pVL1392などが挙げられる。好ましい実施形態では、pM01が用いられる。pM01のベクターマップを図1に示す。なお、上記のプロモータは当該技術において公知のプロモータから適宜選択することができ、例えばポリへドリンプロモータ、p10プロモータ、カイコアクチンプロモータなどが挙げられる。
また、ポリヌクレオチドには、当業者に公知のタグをコードするポリヌクレオチド、例えばDDDDKタグをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド等が融合していてもよい。このようなタグは、ヘムタンパク質の取得を容易にし得る。
ポリヌクレオチドは、当業者に公知の方法に従って、人工的に合成することができる。
鱗翅目昆虫個体においてアポタンパク質を発現させる手段は特に限定されず、当業者が適宜決定できる。例えば、ベクターDNAを公知の遺伝子導入法により鱗翅目昆虫個体に直接トランスフェクションすることによって、アポタンパク質を発現させてもよい。本発明の好ましい実施形態においては、上記のベクターDNAで組み換えたバキュロウイルスを鱗翅目昆虫個体に感染させることによってアポタンパク質を発現させる。
このような補酵素としては、例えばシトクロムP450還元酵素等が挙げられる。ヘムタンパク質の近傍に補酵素を発現させることができる。
別の実施形態では、補酵素は、シトクロムの1つであるCytochrome b5である。Cytochrome b5については、上述のとおりである。
さらに別の実施形態では、補酵素は、ヒトCPRおよびCytochrome b5の両方である。
また、ヘムタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと、補酵素をコードするポリヌクレオチドとは、同一のバキュロウイルスに組み込まれてもよいし、別々のバキュロウイルスに組み込まれてもよい。
鉄自体は任意の溶媒中にイオンとして存在していてもよいし、固体であってもよい。好ましい実施形態では、ヘム前駆体および/またはヘム類縁体と同じ溶媒中にイオンとして存在する。
カウンターイオンは、ヘムタンパク質の産生が可能な限り特に限定されない。好ましくは、塩化物イオンまたはクエン酸イオンである。
好ましい実施形態では、ヘム類縁体としてのヘミン、ヘム前駆体としてのアミノレブリン酸またはそれらの混合物が、鱗翅目昆虫個体としてのカイコ蛹の腹部体節、より具体的には腹部体節4-5間および6-7間の2カ所に投与される。しかしながら、この実施形態は、カイコ蛹個体のその他の場所にヘム類縁体およびヘム前駆体を投与することを除外するものではなく、ヘムタンパク質産生が可能である限り如何なる場所に投与してもよい。
第1の好ましい実施形態では、ヘムタンパク質としてシトクロムP450が用いられる。シトクロムP450は、脂質二重膜を足場として機能を発揮するタンパク質であり、薬物代謝に関与する。具体的には、薬物の-H基を-OH基に変換し、薬物の代謝を担う。
第1の好ましい実施形態では、シトクロムP450のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが導入されたカイコに、ヘミン、アミノレブリン酸またはそれらの混合物を投与し、カイコにおいてシトクロムP450を産生させる。
第2の好ましい実施形態では、シトクロムb5のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが導入されたカイコに、ヘミン、アミノレブリン酸またはそれらの混合物を投与し、カイコにおいてシトクロムb5を産生させる。
第3の好ましい実施形態では、シトクロムP450のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドおよびシトクロムP450還元酵素をコードするポリヌクレオチドが導入されたカイコに、ヘミン、アミノレブリン酸またはそれらの混合物を投与し、カイコにおいてシトクロムP450およびシトクロムP450還元酵素を産生させる。
第4の好ましい実施形態では、シトクロムP450のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドおよびシトクロムP450還元酵素をコードするポリヌクレオチドが導入された第1のカイコ、およびシトクロムb5をコードするポリヌクレオチドが導入されたポリヌクレオチドが導入された第2のカイコのそれぞれに、ヘミン、アミノレブリン酸またはそれらの混合物を投与し、これらのカイコにおいてシトクロムP450、シトクロムP450還元酵素およびシトクロムb5を産生させる。
取得方法は、特に限定されず、生産するヘムタンパク質の種類や性質に応じて当業者が適宜選択することができる。例えば、ヘムタンパク質が機能を発揮するために脂質二重層の足場が必要な場合には、ミクロソーム画分を得ることによって取得でき、ヘムタンパク質がミトコンドリアにおいて機能する場合には、ミトコンドリア画分を得ることによって取得できる。
可溶化の原料は、ミクロソーム画分に限定されない。カイコ蛹を破砕し、分画したいずれの画分からでも可溶化できる。好ましくは、ミクロソーム画分である。
可溶化して得られた精製ヘムタンパク質等は、リポソームやナノディスク等の当業者に公知の方法を用いて、脂質二重膜上に再構築してもよい。
第1の好ましい実施形態では、産生工程において産生されるヘムタンパク質は、シトクロムP450である。上記のとおり、シトクロムP450は、脂質二重膜を足場として機能を発揮するタンパク質であり、小胞体に多く存在する。よって、取得工程においては、ミクロソーム画分を取得する。ミクロソーム画分は、上記したような当業者に公知の遠心分離法に従って取得することができる。シトクロムP450は、脂質二重層の足場と結合した状態のものを取得することが望ましい。
また、本発明の範囲には、上記のヘムタンパク質および/または補酵素を含む組成物およびその生産方法も包含される。このような組成物は、例えば、薬物代謝試験用試薬として有用である。
ヘムタンパク質がミクロソーム画分に存在する場合、そのような組成物は、当業者に公知の方法に従って、鱗翅目昆虫個体の細胞を破砕し、ミクロソーム画分を得ることによって生産することができる。得られたミクロソーム画分は、さらに可溶化し、精製することによって精製品のヘムタンパク質としてもよい。
第1の好ましい実施形態では、組成物は、シトクロムP450を含む。シトクロムP450を含む組成物は、シトクロムP450のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが導入された鱗翅目昆虫個体から、ミクロソーム画分を取得することによって生産することができる。上記のとおり、シトクロムP450は、脂質二重膜を足場として機能を発揮するタンパク質である。よって、組成物は、足場としての脂質二重層に結合したシトクロムP450を含むことが好ましい。すなわち、組成物がシトクロムP450を含む場合、組成物はミクロソーム画分そのものであることが好ましい。
シトクロムP450のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが導入された鱗翅目昆虫個体に、ヘム前駆体およびヘム類縁体からなる群より選択される少なくとも1つを投与し、前記鱗翅目昆虫個体においてヘムタンパク質を産生させる工程、
前記鱗翅目昆虫個体から、シトクロムP450を含むミクロソーム画分を取得する工程
を含む、シトクロムP450を含む組成物の生産方法によって生産することができる。
シトクロムb5のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが導入された鱗翅目昆虫個体に、ヘム前駆体およびヘム類縁体からなる群より選択される少なくとも1つを投与し、前記鱗翅目昆虫個体においてヘムタンパク質を産生させる工程、
前記鱗翅目昆虫個体から、シトクロムb5を含むミクロソーム画分を取得する工程
を含む、シトクロムb5を含む組成物の生産方法によって生産することができる。
シトクロムP450のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドおよびシトクロムP450還元酵素をコードするポリヌクレオチドが導入された鱗翅目昆虫個体に、ヘム前駆体およびヘム類縁体からなる群より選択される少なくとも1つを投与し、前記鱗翅目昆虫個体においてヘムタンパク質を産生させる工程、
前記鱗翅目昆虫個体から、シトクロムP450およびシトクロムP450還元酵素を含むミクロソーム画分を取得する工程
を含む、シトクロムP450およびシトクロムP450還元酵素を含む組成物の生産方法によって生産することができる。
シトクロムP450のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと、シトクロムP450還元酵素を含むポリヌクレオチドとが導入された第1の鱗翅目昆虫個体、およびシトクロムb5をコードするポリヌクレオチドが導入された第2の鱗翅目昆虫個体のそれぞれに、ヘム前駆体およびヘム類縁体からなる群より選択される少なくとも1つを投与し、前記鱗翅目昆虫個体においてヘムタンパク質を産生させる工程、
前記第1および第2の鱗翅目昆虫個体から、それぞれシトクロムP450とシトクロムP450還元酵素とを含む第1のミクロソーム画分およびシトクロムを含む第2のミクロソーム画分を取得する工程、
前記第2のミクロソーム画分を可溶化し、可溶化画分を取得する工程、
前記第1のミクロソーム画分と前記可溶化画分とを混合し、組成物を取得する工程
を含む、シトクロムP450と、シトクロムP450還元酵素と、シトクロムとを含む組成物の生産方法によって生産することができる。
ヒトCYP3A4の完全長をコードする遺伝子に、DYKDDDDKタグ配列をコードしたポリヌクレオチド(5’-GACTATAAAGACGACGATGATAAA-3’;配列番号1)を付加したDNA断片を人工合成(ファスマック社に外注)により作製した。このタグ配列は、ヒトCYP3A4アミノ酸配列のC末端に付加されるよう配置された。このDNA断片をpM01ベクター(シスメックス株式会社)のマルチクローニングサイト(制限酵素BglII/XhoI)へ組み込んだ。得られたプラスミドコンストラクトをCYP3A4_pM01と呼ぶ。
実施例1と同様にしてヘミン溶液(10mM ヘミン、溶媒:DMSO)をカイコ蛹に接種した。また、実施例1で用いたヘミン溶液とは異なる溶媒のヘミン溶液(10mM ヘミン, 37.5mM L-アルギニン, 2.5% エタノール, 10% プロピレングリコール, PBS)をカイコ蛹1頭あたりに2ヶ所、注射法で接種した。ヘミン接種から2日後および3日後に蛹を回収し、-80℃で凍結した。また、対照として、ヘミンを接種していない蛹を-80℃で凍結した。これらの凍結蛹をカッターナイフで背割りにし、切断面を接写した。ヘミンを接種していない蛹の切断面を図3(1)に、ヘミン溶液(10mM ヘミンin DMSO)を接種した蛹の切断面を図3(2)に、ヘミン溶液(10mM ヘミン, 37.5mM L-アルギニン, 2.5% エタノール, 10% プロピレングリコール, PBS)を接種した蛹の切断面を図3(3)に示す。ヘミン(10mM)は濃い茶褐色の溶液であるため、ヘミン由来の色素を指標とすることで、カイコ蛹体内でのヘミンの分布を観察した。ヘミンを接種した場合は、蛹内部でヘミンが拡散している様子が観察された。溶解促進剤を用いた場合は、蛹全体により拡散している様子が観察された。
実施例1で作製したヒトCYP3A4発現用ウイルスおよびヒトCPR発現用ウイルスをウイルス力価で1:1の比率となるように混合し、カイコ蛹に接種した。ここで、ヒトCPR発現用ウイルスは、以下のようにして作製した。まず、ヒトCPRをコードする遺伝子に、DYKDDDDKタグ配列をコードしたポリヌクレオチド(5’-GACTATAAAGACGACGATGATAAA-3’;配列番号1)を付加したDNA断片を人工合成(ファスマック社に外注)した。このタグ配列は、ヒトCPRアミノ酸配列のC末端に付加されるよう配置された。このDNA断片をpM01ベクターのマルチクローニングサイト(制限酵素BglII/XhoI)に組み込むことによってプラスミドコンストラクトCPR_pM01を作製し、上記と同様にしてヒトCPR遺伝子を組み込んだバキュロウイルスを得た。
実施例1で作製したヒトCYP3A4発現用ウイルスと、実施例3で作製したヒトCPR発現用ウイルスとをウイルス力価で2:1の比率となるように混合し、カイコ蛹に接種した。ウイルス感染から3日経過した後に50 μLのアミノレブリン酸(5-Aminolevulinic Acid Hydrochloride、和光純薬)溶液をカイコ蛹1匹あたりに2ヶ所、注射法で接種した。アミノレブリン酸溶液は、試験区A(以下の表4)および試験区B(以下の表5)に従って調製した。ウイルス接種から6日後にカイコ蛹を回収し−80℃で凍結した。
実施例1で作製したヒトCYP3A4発現用ウイルスと、実施例3で作製したヒトCPR発現用ウイルスとをウイルス力価で2:1の比率となるように混合し、カイコ蛹に接種した。ウイルス感染後、試験区(以下の表6)に従って50 μLのヘムタンパク質化溶液を蛹1頭あたりに2ヶ所、注射法で接種した。ウイルス接種から6日後に蛹を回収し、−80℃で凍結した。凍結した蛹を用いてミクロソーム画分懸濁液を調製した。ミクロソーム画分懸濁液の調製は、実施例4に記載の手法に従った。得られたミクロソーム画分のCYP3A4活性を、市販P450-Glo CYP3A4 Screening System(プロメガ社)を用いて測定した。当該測定試薬に付随されているCYP3A4膜画分の代わりに、自家調製したミクロソーム画分を用い、その他の条件は測定試薬のマニュアルに従った。
実施例1で作製したヒトCYP3A4発現用ウイルスをカイコ蛹に接種した。ウイルス感染から3日経過した後に50 μLのヘムタンパク質化溶液(2mM アミノレブリン酸, 0.2mM 塩化鉄(II))を蛹1頭あたりに2ヶ所、注射法で接種した。ウイルス接種から6日後に蛹を回収し、-80℃で凍結した。凍結した蛹を用いて第1上清を得た。第1上清の調製は、実施例1に記載の手法に従った。また、遠心分離後の沈殿物に25 mLの緩衝液(50mM リン酸カリウム, 6mM酢酸マグネシウム, 20%グリセロール, 1mM DTT, 1mM EDTA, pH7.4)を加えて懸濁した後、微量超音波ホモジナイザー(QSonica, モデルQ55)で破砕した。超音波破砕物を含む懸濁液を遠心分離(1850×g, 4℃, 10分)して上清を回収し、この上清を第2上清とした。第1上清および第2上清を用いて、ミクロソーム画分懸濁液を得た。
ヒトCytochrome b5の完全長をコードする遺伝子に、DYKDDDDKタグ配列をコードしたポリヌクレオチド(5’-GACTATAAAGACGACGATGATAAA-3’;配列番号1)を付加したDNA断片を人工合成(ファスマック社に外注)により作製した。このタグ配列は、ヒトCytochrome b5アミノ酸配列のN末端に付加されるよう配置された。このDNA断片をpM01ベクター(シスメックス株式会社)のマルチクローニングサイト(制限酵素BglII/XhoI)へ組み込んだ。得られたプラスミドコンストラクトをCytochrome b5_pM01と呼ぶ。
P450の補酵素であるCytochrome b5の精製物を、カイコ発現系で調製したミクロソーム画分に添加することでCYP3A4代謝活性が向上するか否かを調べた。具体的には、実施例5と同様にして、CYP3A4発現用ウイルスとヒトCPR発現用ウイルスをカイコ蛹に接種した。ウイルス感染後、3日経過した時点でヘムタンパク質化溶液(1mM ヘミン, 5mM L-アルギニン, 0.3% エタノール, 1mM プロピレングリコール, PBS, 2mM ALA, 0.2mM 塩化鉄(II))50μLを蛹1頭あたりに2ヶ所、注射法で接種した。ウイルス接種から6日後に蛹を回収した。蛹からのミクロソーム画分の調製については、実施例6で記載した手法に従った。一方、Cytochrome b5の精製は、実施例7に従って調製した。
実施例8で調製したカイコ発現系CYP3A4ミクロソーム画分および大腸菌発現系で調製されたミクロソーム画分市販品について、それぞれBradford法で総タンパク質濃度を測定した。得られた濃度を基準に、1レーンあたり総タンパク質量2μgのミクロソーム画分をポリアクリルアミドゲルに供し、電気泳動によりタンパク質を分離・分析した(図12)。各レーンにアプライしたサンプルの詳細を以下の表7に示す。
大腸菌発現系でCYP3A4ミクロソーム画分を調製する場合、使用するヘムタンパク質化試薬(5-アミノレブリン酸塩酸塩)は、ミクロソーム画分1mgあたり280〜340μgとなる(Pritchard MP, McLaughlin L, Friedberg T. (2006) Establishment of functional human cytochrome P450 monooxygenase systems in Escherichia coli. Methods Mol Biol. 320, 19-29)。一方、カイコ蛹発現系で同様のミクロソーム画分を調製する場合、使用するアミノレブリン酸は、ミクロソーム画分1mgあたり5.7〜8.5μgである(表8)。以上より、カイコ発現系では、大腸菌発現系でのヘムタンパク質化試薬の使用量の1/40〜1/50を用いれば同等量のミクロソームを取得することができた。
ヒトCYP1A2の完全長をコードする遺伝子に、DYKDDDDKタグ配列をコードするポリヌクレオチド(5’-GACTATAAAGACGACGATGATAAA-3’;配列番号1)を付加したDNA断片を人工合成(ファスマック社に外注)により作製した。このタグ配列は、ヒトCYP1A2アミノ酸配列のC末端に付加されるよう配置された。このDNA断片をpM01ベクター(シスメックス株式会社)のマルチクローニングサイト(制限酵素BglII/XhoI)へ組み込んだ。得られたプラスミドコンストラクトをCYP1A2_pM01と呼ぶ。
ヒトCYP2C8の完全長をコードする遺伝子に、DYKDDDDKタグ配列をコードするポリヌクレオチド(5’-GACTATAAAGACGACGATGATAAA-3’;配列番号1)を付加したDNA断片を人工合成(ファスマック社に外注)により作製した。このタグ配列は、ヒトCYP2C8アミノ酸配列のC末端に付加されるよう配置された。このDNA断片をpM01ベクター(シスメックス株式会社)のマルチクローニングサイト(制限酵素BglII/XhoI)へ組み込んだ。得られたプラスミドコンストラクトをCYP2C8_pM01と呼ぶ。
ヒトCYP2C9の完全長をコードする遺伝子に、DYKDDDDKタグ配列をコードしたポリヌクレオチド(5’-GACTATAAAGACGACGATGATAAA-3’;配列番号1)を付加したDNA断片を人工合成(ファスマック社に外注)により作製した。このタグ配列は、ヒトCYP2C9アミノ酸配列のC末端に付加されるよう配置された。このDNA断片をpM01ベクター(シスメックス株式会社)のマルチクローニングサイト(制限酵素BglII/XhoI)へ組み込んだ。得られたプラスミドコンストラクトをCYP2C9_pM01と呼ぶ。
ヒトCYP2C19の完全長をコードする遺伝子に、DYKDDDDKタグ配列をコードしたポリヌクレオチド(5’-GACTATAAAGACGACGATGATAAA-3’;配列番号1)を付加したDNA断片を人工合成(ファスマック社に外注)により作製した。このタグ配列は、ヒトCYP2C19アミノ酸配列のC末端に付加されるよう配置された。このDNA断片をpM01ベクター(シスメックス株式会社)のマルチクローニングサイト(制限酵素BglII/XhoI)へ組み込んだ。得られたプラスミドコンストラクトをCYP2C19_pM01と呼ぶ。
ヒトCYP2D6の完全長をコードする遺伝子に、DYKDDDDKタグ配列をコードしたポリヌクレオチド(5’-GACTATAAAGACGACGATGATAAA-3’;配列番号1)を付加したDNA断片を人工合成(ファスマック社に外注)により作製した。このタグ配列は、ヒトCYP2D6アミノ酸配列のC末端に付加されるよう配置された。このDNA断片をpM01ベクター(シスメックス株式会社)のマルチクローニングサイト(制限酵素BglII/XhoI)へ組み込んだ。得られたプラスミドコンストラクトをCYP2D6_pM01と呼ぶ。
Claims (16)
- ヘムタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが導入された鱗翅目昆虫個体に、ヘム前駆体およびヘム類縁体からなる群より選択される少なくとも1つを投与し、前記鱗翅目昆虫個体においてヘムタンパク質を産生させる工程、および
前記鱗翅目昆虫個体から、前記ヘムタンパク質を取得する工程
を含む、ヘムタンパク質の生産方法。 - 前記鱗翅目昆虫が、カイコである、請求項1に記載の方法。
- 前記ヘムタンパク質が、シトクロムP450およびシトクロムからなる群より選択される少なくとも1つである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記ヘムタンパク質が、シトクロムP450およびシトクロムである、請求項1〜3のいずれか1つに記載の方法。
- 前記ヘムタンパク質が、シトクロムP450であり、
前記産生工程において、前記鱗翅目昆虫個体に、前記シトクロムP450の補酵素のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドがさらに導入されている、請求項1〜4のいずれか1つに記載の方法。 - 前記補酵素が、シトクロムP450還元酵素である、請求項5に記載の方法。
- 前記産生工程において、前記鱗翅目昆虫個体に、前記ポリヌクレオチドが組み込まれたバキュロウイルスを感染させることにより、前記ポリヌクレオチドが導入されている、請求項1〜6のいずれか1つに記載の方法。
- 前記ヘム前駆体がヘミンであり、前記ヘム類縁体がアミノレブリン酸である、請求項1〜7のいずれか1つに記載の方法。
- 前記産生工程において、ヘム前駆体およびヘム類縁体からなる群より選択される少なくとも1つを含む溶液が投与される、請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
- 前記溶液が、ヘム前駆体およびヘム類縁体からなる群より選択される少なくとも1つの溶解性を向上させる溶解促進剤をさらに含む、請求項9に記載の方法。
- 前記溶解促進剤が、炭素数1〜6の低級アルコールである、請求項10に記載の方法。
- 前記産生工程において、一個体あたり0.001 mg以上3 mg以下のヘミンが投与される、請求項1〜11のいずれか1つに記載の方法。
- 前記産生工程において、一個体あたり0.001 mg以上0.7 mg以下のアミノレブリン酸が投与される、請求項1〜12のいずれか1つに記載の方法。
- 前記溶液が鉄イオンを含む、請求項9〜11のいずれか1つに記載の方法。
- ヘムタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが導入された鱗翅目昆虫個体に、ヘム前駆体およびヘム類縁体からなる群より選択される少なくとも1つを投与し、前記鱗翅目昆虫個体においてヘムタンパク質を産生させることにより得られるヘムタンパク質。
- シトクロムP450のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと、シトクロムP450還元酵素を含むポリヌクレオチドとが導入された第1の鱗翅目昆虫個体、およびシトクロムをコードするポリヌクレオチドが導入された第2の鱗翅目昆虫個体のそれぞれに、ヘム前駆体およびヘム類縁体からなる群より選択される少なくとも1つを投与し、前記鱗翅目昆虫個体においてヘムタンパク質を産生させる工程、
前記第1および第2の鱗翅目昆虫個体から、それぞれシトクロムP450とシトクロムP450還元酵素とを含む第1のミクロソーム画分およびシトクロムを含む第2のミクロソーム画分を取得する工程、
前記第2のミクロソーム画分を可溶化し、可溶化画分を取得する工程、
前記第1のミクロソーム画分と前記可溶化画分とを混合し、組成物を取得する工程
を含む、シトクロムP450と、シトクロムP450還元酵素と、シトクロムとを含む組成物の生産方法。
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