JP2016538961A - 高周波電気的膜破壊（ｒｆ‐ｅｍｂ）による癌免疫療法 - Google Patents

Abstract

【課題】完全かつ即座の細胞膜破裂及び破壊を引き起こすために十分なエネルギーのパルスの、両極性の、瞬時の荷電反転電界の適用によって、体内の望ましくない組織の非熱的アブレーションの方法を提供する。【解決手段】本発明において、エネルギーは、特定の周波数、波長特性、パルス幅及びパルス数の高周波パルスを介して送達される。その結果、増強された物理的応力が、細胞膜上に付与され、その即座かつ完全な破壊を生じ、それによって、細胞内容物及び膜構成要素全体を、タンパク質を変性させることなく、細胞外空間内に流出させ、生体内の至る所の標的組織及び特異な組織を破壊及び除去するための免疫学的応答を可能にする。【選択図】図９

Description

（関連出願の相互参照）
本特許出願は、２０１３年１２月５日に出願された、米国仮特許出願第６１／９１２，１７２号明細書、発明の名称「免疫療法のための補助メカニズムとしての高周波電気的膜破壊（ＲＦ‐ＥＭＢ）による抗原提示細胞に対する癌抗原強化提示」に対する優先権を主張し、参照によってその全体において本明細書中に援用される。本特許出願は、また、２０１４年８月４日に出願された、米国特許出願第１４／４５１，３３３号明細書、発明の名称「組織切除のための高周波エネルギー電気的膜破壊のためのシステム及び方法」に対する優先権を主張し、参照によってその全体において本明細書中に援用される。

本発明は、一般的に、疾患の処置のための生物学的組織の医学的切除の分野に関し、より具体的には、電気的膜破壊による細胞破壊を通して、そのような組織を切除するために、ヒト及び哺乳動物における軟部組織及び癌組織への高周波エネルギーの制御された適用に関する。

癌は、単一の疾患ではなく、持続された細胞増殖、減少された又は遅延された細胞死亡率、体内血管新生及び代謝プロセスの吸収、並びに、新生物、すなわち、より共通には、腫瘍と呼ばれる望ましくない軟部組織の増殖を生じる体内免疫応答の回避を、しばしば生じる共通の特徴を有する一群の疾患である。この異所性組織の除去および又は破壊は、多くの癌治療方法及びモダリティのゴールである。外科的腫瘍削除は、このゴールを達成するための一つの方法である。組織切除は、体内の望ましくない組織を破壊する、他の低侵襲の方法であり、一般的に、熱的及び非熱的切除技術に分類されてきた。熱的切除は、望ましくない細胞を破壊するための熱の追加及び除去を包含する。冷凍アブレーションは、−１５℃で始まる細胞脱水を生じる細胞外コンパートメントの凍結によって、及びより冷たい温度で生じる膜断裂を引き起こす細胞内氷形成（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｃｅ ｆｏｍａｔｉｏｎ）によって、細胞を殺す十分に確立された技術である。冷凍アブレーション技術は、一定の条件下で、細胞タンパク質を変性させることなく、細胞膜を断裂させることができるため、そのような技術は、患者における抗腫瘍免疫応答を刺激するための付加的な能力を有する。

熱ベースの技術は、また、癌及び非癌組織の切除のために十分に確立されており、体内の正常３７℃より高い局在化された組織温度を十分に上げる高周波（ＲＦ）熱、マイクロ波及び高密度焦点式超音波アブレーションを含む。これらの方法は、組織内温度を上げるために、標的細胞にエネルギーを付与するための種々の技術を使用する。例えば、高周波（ＲＦ）熱アブレーションは、摩擦によって熱に変換される細胞膜内に振動を誘発するために、高周波電界を使用する。細胞の温度が一度５０℃に達すると、細胞死は、わずか３０秒で生じ、温度が上昇するにつれて、減少する。６０℃で、細胞死は、瞬間的である。細胞内温度が約６０℃と９５℃との間まで上昇すると、細胞死に関連する機構は、細胞乾燥及びタンパク質凝固を含む。細胞内温度が１００℃に達すると、細胞内水分が沸騰して蒸気になるため、細胞蒸発（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｖａｐｏｒｉｚａｔｉｏｎ）が生じる。組織切除の関連において、５０℃を越えない細胞の温度は、臨床的に有意であると見なされない。細胞タンパク質は、熱アブレーション技術の熱によって変性されるため、細胞タンパク質は、それらが冷凍アブレーションを用いてなされるように、特定の免疫応答を刺激するために使用できない。熱ベースの技術及び冷凍アブレーション技術は、ともに、それらが、処置領域における正常構造を残すための能力を、ほとんど又は全く有さないため、腫瘍部位に基づいて、避けられ得るか、二次的損傷（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ ｉｎｊｕｒｙ）からの問題に通じるという欠点を受ける。

非熱アブレーション技術として、互いに全く異なるが、それぞれが、電気穿孔法の現象に依存する電気化学療法及び不可逆電気穿孔法が挙げられる。図１を参照して、電気穿孔法は、一定のパラメータ内での高電圧パルス電界に曝された細胞の形質膜が、脂質二重層の不安定化及び細孔Ｐ．の形成に起因して、一過性に浸透性になるという事実をいう。細胞形質膜は、約５ｎｍの厚みｔを有する脂質二重層からなる。図２Ａを参照して、細胞形質膜は、非導電性の、誘電体バリア形成、本質的に、蓄電器（キャパシタ）として作用する。生理的条件は、印加された電場が存在しない場合でも、細胞の内側と外側との間に膜を越えた電荷分離に起因して、自然電位差を生成する。この静止膜内外電位差Ｖ’ｍは、脂肪細胞に対する４０ｍＶから、骨格筋細胞に対する８５ｍＶ及び心筋細胞に対する９０ｍＶの範囲であり、とりわけ、細胞の大きさ及びイオン濃度によって変更可能である。

続けて図２Ｂ〜２Ｄを参照して、外部に印加された電界への細胞の露出によって、外部電界が存在する限り、膜を越えた付加的な電圧Ｖが誘導される。誘導された膜内外電圧は、外部電界の強さ及び細胞の半径に比例する。累積静止及び印加膜内外電位が、典型的に、２００ｍＶと１Ｖとの間であり得る閾値電圧を越えると、膜内に膜貫通細孔Ｐの形成が生じる。膜内外電位が、臨海値を越えなければ、膜の穿孔は可逆的であり、細孔領域は、膜領域全体に関して小さい。そのような可逆的な電気穿孔法において、印加された電界が取り除かれた後、細胞膜が回復し、細胞は生存可能のままである。臨界細胞内外電位より高く、かつ露出時間がより長くなると、穿孔は不可逆的となり、恒常性の損失及びそれに続くアポトーシスを生じる細胞外イオンの流入に起因する、最終的な細胞死に通じる。細胞の不可逆的な電気穿孔後の病理は、特定の極めて限られた組織型を除いて、電界露出後２４時間まで、構造又は細胞変化を示さない。しかしながら、全ての場合において、ＩＲＥ（不可逆的電気穿孔）による細胞破壊及び細胞死のメカニズムは、経過するに相当な時間を必要とし、方法にとって重要な臨床的欠点であるＩＲＥ処置の有効性を決定するのに臨床的に有用である時間枠において病理学的に可視的でないアポトーシスである。

１９９０年代初期に開発されて、電気化学療法は、可逆的細胞膜穿孔の物理的効果と、シスプラチン及びブレオマイシン等の化学療法剤の投与と、を組み合わせる。細胞膜の透過性を一時的に増加させることによって、非透過性又は低透過性の化学療法剤の取り込みが、大いに向上される。電界が中断されると、細孔が閉じられ、薬剤分子は、暴露された細胞に対する重大な損傷なく、標的細胞の内部で保持される。この化学療法に対するアプローチは、治療的効果のための遺伝子及びＤＮＡ分子のトランスフェクション用の技術として、電気穿孔を開発する初期の研究から生じた。この文脈において、細胞死に通じる不可逆的電気穿孔は、処置された細胞が、意図されたような改変を実現するために生存しなかったために、失敗として評価された。

米国特許第８，０４８，０６７号明細書 米国特許出願第１３／３３２，１３３号明細書

アブレーション法としての不可逆的電気穿孔（ＩＲＥ）は、可逆的電気穿孔を達成するための「失敗」が、望ましくない組織を選択的に殺すために利用され得るという現実から生じた。ＩＲＥは、隣接する脈管及びコラーゲン構造を破壊する熱アブレーション法の欠点を有さず、予測可能な処置領域を有効に殺す。典型的なＩＲＥ処置の間、１〜３対の電極が、腫瘍内又は腫瘍周辺に配置される。臨界膜内外電位より高い電界強度を誘導するために慎重に選択された電気パルスは、１０のグループにおいて、通常、９サイクルで送達される。各１０‐パルスサイクルは、約１秒を要し、電極は、次のサイクルを開始する前に、一時的に休止する。参照によって本明細書中に援用される、Ｒｕｂｉｎｓｋｙらによる特許文献１及びＡｒｅｎａらによる特許文献２に記載されるように、電界強度及びパルス特性は、ＩＲＥのために必要な電界強度を提供するが、ＲＦ熱アブレーションを用いる場合のように熱効果を誘導することなく、選択される。しかしながら、ＩＲＥ法によって切除された細胞は、膜断裂することなくアポトーシス死を経験するため、冷凍アブレーションを用いて観察されるような追加の免疫応答を誘導するためのそれらの能力は、損なわれている。処置プロトコルにおいて唯一のアブレーションツールとして使用される場合、追加の免疫応答を誘導するためのＩＲＥの不能性は、患者に対するその治療的有効性にとっての大幅な制限である。他方、冷凍アブレーションは、極度の寒さ及び近くの重要な健全な構造を破壊するその能力から生じる重大な臨床的な不利益を受ける。必要なことは、健全な組織を損傷することを防ぐことができ、そのような細胞内容物を変性させることなく細胞内容物を暴露し、それらが臨床的に有用な免疫応答を増幅させることができる低侵襲の組織アブレーション技術である。

従って、細胞の膜を完全に破壊するメカニズムを通して、即座の細胞死を引き起こす、電気パルスを用いる組織アブレーションの方法を提供することが、本発明の目的である。

細胞膜を電気的に破壊し、即座の細胞死を引き起こすことで、それが、処置の有効性を評価するとともに、必要に応じて処置を調整するために、組織の即座の病理学的、化学的又は分光学的検査によって監視されることができる組織アブレーションの方法を提供することが、本発明の他の目的である。

感受性組織構造が残され、細胞内及び膜タンパク質が、特定の腫瘍免疫応答を禁止（ｉｌｌｉｃｉｔ）するために、体内の免疫システムに曝されるべく、変性することなく細胞外空間内に流出されるように、非熱的に即座の細胞破壊を引き起こす、電気パルスを用いる組織アブレーションの方法を提供することが、本発明のさらに他の目的である。

種々の付加的な免疫モジュレータによって調整及び向上されることができる特定の腫瘍免疫応答を禁止（ｉｌｌｉｃｉｔ）するために、免疫システムに、非変性の細胞内及び膜タンパク質を曝す、組織アブレーションの方法を提供することが、本発明のさらに他の目的である。

本発明に従って、上述の及び他の目的は、細胞膜を直接及び完全に崩壊させるように特別に構成された外部電界を、体内の望ましくない組織に印加することによって、達成される。電気的膜破壊（ＥＭＢ）と言われる、外部振動電界の印加によって、細胞膜の劇的及び即座の機械的断裂又は破裂を生じる細胞膜の振動及び屈曲が、引き起こされる。ＥＭＢは、細胞膜を電気穿孔するためよりも、細胞膜を破裂させるために、従来法よりも有意により高いエネルギー準位を付与する。従来法と異なり、ＥＭＢは、細胞外液中に、細胞の全内容物を排出し、対象者による免疫学的応答を誘導する細胞膜の内部要素を露出させる。

ＥＭＢを誘導するのに必要な電界の発生のためのシステムとして、適切な電界を発生させせるのに必要な電気パルスの発生及び送達を制御するためのコントローラに動作可能的に連結される両極性パルス発生器が挙げられる。電界は、対象者の体内の軟部組織及び癌細胞の近傍に配置される治療プローブによって発生され、両極性パルスは、最適な態様においてその結果を達成するために、形成、設計及び付与される。温度プローブは、信号発生器の信号出力特性を制御するために構成されるコントローラに対する温度フィードバックのために提供されてもよい。ＥＭＢプロトコルは、細胞膜を越えて膜内外電位の同様の急速及び振動ビルドアップを誘導する電極間に振動電界を発生させるための一連の短くかつ強力な両極性電気を必要とする。強化された電荷は、臨界値に達するとすぐに、細胞膜に、膜の強力な破裂及び細胞内容物の流出を生じる、振動及び屈曲力を付与する。両極性であることに加えて、電気パルスは、好ましくは、矩形波状を描き、両極性パルスの正極性及び負極性の間に、実質的に緩和時間を有さない瞬時の電荷反転によって特徴付けられる。瞬時の電荷反転パルスは、誘電細胞膜の破壊において、有意により効果的である。

印加された電界の重要な特徴として、電界強度（Ｖ／ｃｍ）、周波数、極性、形状、持続時間、数及び間隔が挙げられる。電界強度（Ｖ／ｃｍ）は、印加された電圧及び電極間隔の関数であり、好ましくは、熱を考慮しないで、１５００Ｖ／ｃｍ〜１００００Ｖ／ｃｍの範囲内である。ＲＦ‐ＥＭＢアブレーションは、好ましくは、任意の臨床的に重要な態様で、熱の問題を発展させることなく、標的組織上に必要なエネルギーを付与するために、パルス列内に、一連の少なくとも１００電気パルスを印加することによって、行われる。パルスの持続時間は、好ましくは、１００〜１００μｓ（マイクロ秒）である。各パルスの持続時間と周波数との間の関係によって、各パルスの間に細胞膜によって経験される瞬時の電荷反転の数が決定される。各中間パルスバースト間隔の持続時間は、熱の考慮に基づいて、コントローラ１４によって決定される。処置部位のリアルタイム温度フィードバックは、コントローラ１４に供給されてもよく、それによって、コントローラ１４は、要求通りに熱効果を取り除くために、処置パラメータを調整することができる。

ＥＭＢアブレーション法は、まず、ＣＴ又はＭＲＩもしくは他の手段等の医用画像技術によって、切除されるべき対象者内部の軟部組織の位置を同定することによって、実行される。標的組織に対する電極の好ましい位置及び間隔は、コントローラ１４に接続された１〜６個の針電極から決定され、信号発生器は、処置部位内及び周辺の位置に挿入される。電極の配置及び位置決めは、医用画像によって確認され、パルス発生器は、電極に電気パルスを付与するために作動され、処置電界を発生させることによって、軟部組織内に、細胞の電気的膜破壊を生じさせる。

電気的膜破壊は、破裂された細胞の全ての細胞内要素の細胞外空間への即座の流出を生じさせ、対象者の体内のこのような材料を破壊及び除去するための免疫学的応答を誘導する抗原を含む細胞及び細胞膜の内部構成部分を露出させる。免疫学的応答は、薬剤を含む免疫学的応答プロセスを増加させる薬品の投与によって向上されることができる。電気的膜破壊は、即座の、視覚的に観察可能な組織変化、細胞膜破壊及び細胞死を引き起こすため、電気的膜破壊は、患者が、付加的な処置のためにまだその位置にいる間、処置の完了直後の処置有効性を確認するために、処置された標的組織の部分の生検を含んでもよい。他の態様において、重要な処置位置に配置された針プローブは、また処置有効性を確認するために、細胞内内容物の即座の破壊及び流出に関連された化学的又は分光学的手段によって、種々のパラメータを監視することができる。ある状況において、処置の様式は、既知のＲＦ熱技術に従った電極での組織温度を増加させるために、パルス発生器によって発生された信号を再構成することによって、電極の取り外し又は再位置決めなしに、ＥＭＢから熱アブレーションに切り替えられてもよい。

細胞膜の細孔を示す図である。 従来法による細胞膜の細孔形成を示す図である。 従来技術の電荷反転と、本発明に係る瞬時の電荷反転との比較を示す図である。 本発明に係る瞬時の電荷反転パルスからの方形波形状である。 本発明に係る電界パルス幅の関数として細胞膜上に付与される力の図である。 過電流に起因して、従来技術が所定のパルスを送達することができない様子を示す図である。 コントローラが、最大で又は最大より低い電流アンペア数を維持するために、印加された信号電圧を低減する、本発明に係るフィードバックループの概要図である。 本発明に係る連続した信号送達を許容するために、最大電流レベルに到達してすぐに印加された信号電圧が低減する様子を示す図である。 本発明の方法を適用するためのパルス発生及び送達システムの概要図である。 本発明に係る部分的パルス列のパラメータを示す図である。 本発明に係る典型的な処置プロトコルパラメータのチャートである。 典型的な処置プロトコル番号１のパラメータを示す図である。 典型的な処置プロトコル番号２のパラメータを示す図である。 典型的な処置プロトコル番号３のパラメータを示す図である。 典型的な処置プロトコル番号４のパラメータを示す図である。

本発明の種々の実施形態の製造及び使用について、以下に詳細に説明するが、本発明は、多種多様な特定の状況において実施されることができる多くの利用可能な発明概念を提供することを、評価されるべきである。本明細書中に記載される特定の実施形態は、本発明を製造及び使用するための特定の態様の例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。

組織アブレーション法としての不可逆的電気穿孔は、市場で入手可能なＡｎｇｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ社（レイサム、ニューヨーク）によるナノナイフ（ＮａｎｏＫｎｉｆｅ）等の商業的に製造された装置とともに、十分に発展されている。述べられるように、このアブレーション技術は、特定のパラメータ内で、高い電界強度を利用し、恒常性の損失及びアポトーシスに起因する最終的な細胞死を生じる細胞膜の不可逆的電気穿孔を誘導する。本発明は、また、高周波及び高強度の電界を使用して対象者の体内の細胞を切除するが、極めて異なるエネルギー特性を用いる電気的膜破壊（ＥＭＢ）の異なるプロセス全体を通して細胞を切除するための方法を記載する。電気的膜破壊は、細胞膜の劇的及び即座の機械的断裂、崩壊又は破裂を生じる細胞膜の振動及び屈曲を引き起こす、外部振動電界の適用である。ＩＲＥでは、ナノ細孔が細胞膜内に形成されても、細胞の内容物は、ほとんど又は全く放出されないが、ＩＲＥと異なり、ＥＭＢは、細胞膜を完全に断裂、開口させ、細胞の内容物全体が、細胞外液中に放出され、細胞膜の内部要素自体が、露出される。

本発明は、印加された電界と、膜内外電位との相互関係に依存するが、ＩＲＥとのその相同性は、そこで終わる。ＥＭＢは、特異的に構成された電界プロファイルによって有意に高いエネルギー準位を適用し、細胞膜を電気穿孔するよりむしろ、細胞膜を直接及び完全に崩壊させる。ＥＭＢのために必要なエネルギー準位は、現在入手可能なＩＲＥ装置及びプロトコルによって送達される同様のパルス構成（パルス数及び電圧密度）を用いるＩＲＥのために必要なエネルギー準位より１００倍大きいことを示したものもいる。現在のＩＲＥ法及びエネルギープロトコルが、ＥＭＢを生じるのに必要なエネルギーを送達できないことによって、ＩＲＥ処置された試料の病理学的検査が、ＥＭＢの病理学的特性を示さなかった理由が説明され、現在まで、ＥＭＢが、細胞破壊の代替法として認識されてこなかった重大な理由である。

図９は、患者１２内部の細胞１１のＥＭＢを誘導するために必要な電界の生成のためのシステム１０を示す概要図である。システム１０は、ＥＭＢを達成するための適切な電界を生成するのに必要な電気パルスの発生及び治療プローブ又は複数の治療プローブ２０（二つの治療プローブを示す）への送達を制御するためのコントローラ１４に動作可能に連結される両極性パルス発生器１６を含む。治療プローブは、ＥＭＢのプロセスを通して切除されることを意図されるン軟部組織又は癌細胞１１の近傍に配置され、両極性パルスは、最適な態様においてその結果を達成するために、形成、設計及び付与される。温度プローブ２２は、経皮的な温度測定及び電極での又は電極近くの温度のコントローラへのフィードバックのために、提供されてもよい。コントローラは、好ましくは、搭載デジタルプロセッサ及び目盛りを含んでもよく、多目的のコンピュータシステム、プログラマブル論理制御装置（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｌｏｇｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）又は同様のデジタル論理制御装置であってもよい。コントローラは、好ましくは、パルスの電圧、周波数、形状、極性及び持続時間、パルス列内に送達されるパルスの総数、並びに中間パルスバースト間隔の持続時間を含む、信号発生の信号出力特性を制御するために構成される。

図９を参照して、ＥＭＢプロトコルは、標的組織１１中に直接挿入されるか、標的組織１１の周囲に配置される一以上の治療プローブ２０（電極）を通して、パルス発生器から送達される一連の短くかつ強力な両極性電気パルスを必要とする。両極性パルスは、細胞膜を越えて膜内外電位の同様の急速及び振動ビルドアップを誘導する電極間に振動電界を発生させる。強化された電荷は、臨界値に達するとすぐに、細胞膜に、膜の破裂及び細胞内容物の流出を生じる、振動及び屈曲力を付与する。両極性パルスは、パルス電界が、細胞膜内で荷電分子の移動を引き起こすため、単極性パルスより致命的であり、電界の配向性又は極性における反転は、荷電分子の移動の及び細胞上に作用する力の方向における対応する変化を引き起こす。荷電分子の移動における変化を交互に繰り返すことによって、細胞膜上に配置されるさらなるストレスは、細胞膜のより広範で、多様かつランダムな損傷及び崩壊を引き起こす、細胞膜における刻み目（ｉｎｄｅｎｔａｔｉｏｎ）、割れ目、裂け目及び不規則な突然の断裂を生じる、さらなる内側及び外側変化を形成する。

図４を参照して、両極性であることに加えて、電気パルスの好ましい実施毛形態は、その一つとして、経時的な電圧は、方形波形状の足跡を辿るとともに、瞬時の電荷反転パルス（ＩＣＲ）によって特徴付けられる。方形電圧波形は、極遷移の間を除いて、足跡の単一極性部分の持続時間の間、ピーク電圧の少なくとも８０％の実質的に一定電圧を維持する波形である。瞬時の電荷反転パルスは、両極性パルスの正極性と負極性との間に、実質的な緩和時間が許容されないことを保証するために、特別に設計されるパルスである。すなわち、極遷移は、実質的に即座に生じる。

印加された電圧パルスが、中間において遅延することなく、正極性から負極性に遷移することができる場合、電気的膜破壊のプロセスを介した誘電細胞膜の破壊は、有意により効果的である。瞬時の電荷反転は、細胞における短状態の引張及び一過性の機械的応力を生じる誘導された表面電荷の再構成を防ぎ、その効果は、大きくかつ突然の力反転によって増幅される。構造疲労を引き起こす標的細胞上の交互応力は、ＥＭＢのために要求される臨界電界強度を低減すると考えられている。細胞膜の内側及び細胞膜に沿って添加された構造疲労は、細胞の構造における物理的変化を生じるか、物理的変化に寄与する。これらの物理的変化及び欠陥は、振動ＥＭＢプロトコルを用いて付与された力に応答して現れ、全体的な膜断裂及び破滅的な流出の点まで、振動に応答した膜位置移動として、誘電膜破壊に近づく。このことは、材料が、例えば、繰返し曲げを受ける金属ペーパークリップ等の繰り返し負荷を受ける場合に生じる累進的および局所的な構造的ダメージによって引き起こされる、材料の疲労又は弱体化であると推論されることができる。そのようなダメージを引き起こす名目最大応力値は、通常の条件下における材料の強度よりはるかに小さくてもよい。他のパルス波形に比し、この波形の有効性は、総エネルギー必要量の１／５〜１／６まで節約することができる。

図１０を参照して、印加された電界の他の重要な特徴は、両極性パルス発生器１６によって電極に印加された電圧３０及び電極間隔の関数である電界強度（Ｖ／ｃｍ）である。両極性の、針型プローブのための典型的な電極間隔は、１ｃｍであり得るのに対して、複数の針電極プローブ間の間隔は、外科医によって選択されることができ、一般的には、０．７５ｃｍ〜１．５ｃｍであり得る。本発明の適用のためのパルス発生器は、１０ｋＶ電位まで送達することが可能である。実際に印加された電界強度は、熱発生における制御因子である回路電流量、及び（組織インピーダンスが処置の間に低下するのにつれて、大きな予期しない電流フローを防ぐ）患者の安全性を制御するために、処置の間に変化するだろう。電圧及びそれによって電界強度が、熱関連（ｈｅａｔｉｎｇ ｃｏｎｃｅｒｎｓ）によって制限されている場合、処置サイクルの期間は、減少された電荷蓄積を補うために、延長されてもよい。熱を考慮しないで、ＥＭＢのための好ましい電界強度は、１５００Ｖ／ｃｍ〜１００００Ｖ／ｃｍの範囲内である。

続いて図１０を参照して、電極２０に印加された電気信号及びそれによって得られる電界の電界両極性振動の周波数３１は、対象組織上に付与される総エネルギーに影響し、それによて処置の有効性は、他の特徴より重要でない。好ましい信号周波数は、１４．２ｋＨｚ〜５００ｋＨｚ未満である。より低い周波数帯（ｂｏｕｎｄ）は、さらなる増加エネルギー蓄積が達成されないサイクル当りの最大エネルギーを付与する。図５を参照して、上限周波数は、５００ｋＨｚを越えると、両極性振動が短すぎて、望ましい細胞膜の歪み及び移動を誘導するために、細胞膜上に十分な推進力を展開できないという観察に基づいて、設定される。より具体的には、５００ｋＨｚで、単一の全サイクルの持続期間は、２μｓ（マイクロ秒）であり、その半分は、正極性であり、あとの半分は、負極性である。単一極性の持続時間が、１μｓ（マイクロ秒）に近づくと、電荷が蓄積されるとともに、推進力が膜上に展開される十分な時間がない。その結果、膜運動は、減少されるか、消失され、ＥＭＢは生じない。より好ましい実施形態において、信号周波数は、１００ｋＨｚ〜４５０ｚである。ここで、より低い周波数帯（ｂｏｕｎｄ）は、身体に印加されるン電気信号の筋収縮刺激効果を制限又は避けるために、麻酔薬又は神経筋ブロック薬に対する必要性を避けたいという要望によって決定される。このより好ましい実施形態における上側帯（ｕｐｐｅｒ ｂｏｕｎｄ）は、ＦＤＡによって既に承認された高周波熱アブレーション装置の周波数によって示され、内科患者における治療用途にとって安全であるとされてきた。

パルス振幅３０、周波数３１、両極性パルス発生器１６によって供給される極性及び形状を制御するのに加えて、ロジックコントローラ１４は、一連の処置又はパルス列において付与される電気パルス３２の数、各電気パルス３２の持続時間及び中間パルスバースト間隔３３を制御する。スペースの制約によって、図１０において、二つのみが示されているが、ＲＦ‐ＥＭＢアブレーションは、任意の臨床的に重要な態様で、熱問題を発展させることなく、標的組織１１上に必要なエネルギーを与えるために、パルス列内に、一連の少なくとも１００の電気パルス３２を印加することによって、実行されることが好ましい。各個々の電気パルス３２の幅は、その間に、熱放散を促進するとともに、熱影響を避けるために、電圧が印加されない中間パルスバースト間隔３３と一緒に、１００〜１０００μｓ（マイクロ秒）であることが好ましい。各電気パルス３２の持続時間と周波数３１（期間）との間の関係によって、各電気パルス３２の間に、細胞膜によって経験される瞬時の電荷反転の数が決定される。中間パルスバースト間隔３３の持続期間は、熱考慮に基づいて、コントローラ１４によって決定される。代替の実施形態において、システム１０は、コントローラ１４に、処置部位で読み取る局所温度を提供するために、標的組織１１の近位に挿入された温度プローブ２２が、さらに設けられている。温度プローブ２２は、熱電対チップを有する、独立した、針型プローブであってもよいし、一以上の針電極を用いて一体的に形成されるか、一以上の針電極から展開されてもよい。リアルタイムにおける温度フィードバックを用いて、コントローラ１４は、観察された温度と、メモリ中に格納された種々の温度設定点とを比較することによって、要望通りに熱効果を除去するために、処置パラメータを改変することができる。より具体的には、コントローラ１４は、各電気パルス３２の持続時間を短くしたり長くしたりすることで、処置部位における設定温度を維持し、例えば、出血を防ぐために、針領域のために熱（高温）を生成するか、任意の凝固壊死を防ぐために、熱（低温）を制限したりすることができる。中間パルスバースト間隔３３の持続期間は、処置を止める必要性を取り除いたり、ＲＦ‐ＥＭＢを達成するためのエネルギーの蓄積を最大限にしたりするために、同様に改変されることができる。パルス振幅３０及びパルス列内のパルスの総数は、また、同じ目的及び結果のために、改変されてもよい。

さらに他の実施形態において、コントローラ１４は、過熱を防ぐ目的で、処置中に組織を通る電流フローを監視又は決定するのに対して、印加された電圧を低減することによって、処置が続くことを許容するようにしてもよい。電荷ビルドアップ及び膜破裂に起因して、処置中の組織インピーダンスにおける減少によって、処置部位に付加的な熱を発生させる電流フローの増加が引き起こされることができる。図６を参照して、従来の処置方法は、処置目標値が見合わないように電流が最大許容量を超える場合、処置を中止する必要性を受けていた。直接温度モニタリングと同様に、本発明は、望ましくない臨床的に重要な熱効果を制御及び防止するために、印加された電圧及びそれによって組織を通る電流を低減させることによって、処置を止める必要性を避けることができる。パルス持続時間及びパルスバースト間隔持続時間の改変は、上述のようなこの目的のために、コントローラ１４によって用いられてもよい。

図１１を参照して、ＲＦ‐ＥＭＢ処置プロトコルの四つの実施例について説明する。さらに図１２を参照して、プロトコル１において、それぞれ１０ｍｓの持続期間のパルス列８３の電気パルス３２は、１ｃｍ間隔の電極に、６００Ｖで印加され、電極間に６００Ｖ／ｃｍの電界強度を生じる。本実施例において、印加されたパルスは、１２５ｋＨｚの周波数を有し、１０ｍｓのパルス幅を有する両極性であり、パルス列の０．８３秒の持続期間に亘って印加される総エネルギーは、１０．３８ｍＪであった。これらの処置モデル及び送達される総エネルギーについては、
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からダウンロード可能な、Ｆｏｌｔｚ， Ｇ．による Ａｌｇａｅ Ｌｙｓｉｓ Ｗｉｔｈ Ｐｕｌｓｅｄ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｉｅｌｄｓ，カリフォルニア州立工科大学、サンルイスオビスポ ２０１２の、藻類の膜破壊のために使用されるエネルギーパラメータを記載する研究から参照した。Ｆｏｌｔｚは、瞬時の電荷反転パルスを利用することなく、単極性パルスを用いて、このエネルギー必要量を示し、これを、ＥＭＢを生成するためのエネルギー必要量に対するワーストケースシナリオにした。

図１３を参照して、プロトコル２において、ＥＭＢは、０．４９秒の総処置時間の間、１０ｋＶ／ｃｍの電界において、２００μｓ（マイクロ秒）まで減少されたパルス幅及び２４９０パルスまで拡張されたパルス列によって達成される。印加された総エネルギーは、再び、１０．３８ｍＪである。図１４を参照して、プロトコル３において、初めに目標にされた２４９０より高い付加的なパルスは、処置部位からのフィードバックに基づいて、処置中の電圧／電界強度における低下を補うために、コントローラ１４によって追加される。図１５を参照して、プロトコル４において、初めに目標にされた２４９０より高い付加的なパルスは、従前の実施プロトコルにおける１２５ｋＨｚの信号周波数に比し、２５０ｋＨｚ信号から生じる有効性の損失を補うために、追加される。

本発明の望ましくない軟部組織を切除する方法は、まず、切除されるべき対象者内部の軟部組織の位置を同定することによって、実行される。組織の同定は、超音波、ＣＴ又はＭＲＩ等の既知の医用画像技術によって行われてもよい。標的の軟部組織は、悪性であってもなくてもよいが、ある理由のために、その現在の位置において望ましくない組織のみを必要とする。標的組織の同定の後、標的軟部組織に対する電極の好ましい位置及び間隔は、切除されるべき組織の位置及び形状、隣接構造の形状及び位置、標的及び周囲の軟部組織の比誘電率及び導電率に基づいて決定される。一般的に、１〜６の針型プローブ電極が使用される。電極は処置内及び周辺の位置内に導入され、電界発生及び処置のための電気パルスの送達を制御するためのコントローラに接続されている。プローブ電極は、電極での又は電極の近くでの局所温度を読み取るとともに、コントローラに信号を送るための熱電対等の温度センサを含んでもよい。電極の配置及び位置決めは、好ましくは、医用画像によって確認されてもよい。パルス発生器は、コントローラによって作動され、電極に電気パルスを印加し、上述のように処置電界を発生させることによって、軟部組織の幾つか又は全ての細胞の電気的膜破壊を生じさせる。

電気的膜破壊は、ＩＲＥ又は熱アブレーション技術と異なり、破裂された細胞の全ての細胞内要素の細胞外空間への即座の流出を生じさせ、細胞外空間に、細胞膜の内部要素部分を露出させる。細胞内要素は、細胞抗原を含み、細胞膜の内部要素部分は、対象者の体内のこのような材料を破壊及び除去するための免疫学的応答を誘導する細胞膜に特異的な抗原を含む。同様の材料は、転移組織を含む処置部位から離れた位置での同様の細胞抗原又は細胞膜特異抗原を有する、対象者の体内の他の材料であってもよい。しかしながら、人体は、また、幾つかの場合において腫瘍の破壊及び／又は除去を防ぐ腫瘍に対する自然防御システムを有する。これらの一つは、人体の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）にそれ自身を提示する、抑制シグナルを介して、癌細胞を認識及び破壊する体内の細胞に作用し、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ‐４）に結合し、さもなければ腫瘍細胞を破壊し得る細胞傷害性応答を遮断する。

従って、本発明の他の実施形態によれば、ＲＦ‐ＥＭＢの免疫学的応答は、細胞傷害性リンパ球のＣＴＬＡ‐４抑制シグナルの抑制をブロックするか、制御性骨髄性細胞機能の改変に関連する、Ｓ１００‐Ａ９タンパク質に結合する、薬剤を含む免疫学的応答プロセスを増加させる薬品の投与によって向上される。前者の薬剤タイプの例としては、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）として販売されている）が挙げられる。後者の薬剤タイプの例としては、タスキニモド（Ｔａｓｑｕｉｎｉｍｏｄ）が挙げられる。そのような薬剤は、静脈内、経口又は筋肉内を含むが含むがこれらに限定されない、任意の手段によって投与されることができ、さらに、ＥＭＢ電界を印加する直前又は直後に、或いは、後述するサンプル処置プロトコルにおいて記載されるように、ＲＦ‐ＥＭＢ処置の数日前又は数日後に、標的軟部組織中に直接又は標的軟部組織に隣接して注入されてもよい。薬剤を高めるそのような免疫学的応答は、自己樹状細胞を備えてもよい。例えば、シプロイセル‐Ｔ（プロベンジ（登録商標）として販売されている）療法は、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）を用いて活性化されるととともに、患者の系統に注入して戻される自己患者樹状細胞を使用する。他の関連する免疫性薬剤は、ペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）であり、プログラムされたデスレセプタ（ＰＤ‐１）として知られるタンパク質、又はＰＤ‐Ｌ１として知られる関連タンパク質を遮断することによって機能し、その両方は、腫瘍と戦う細胞（ｔｕｍｏｒ‐ｆｉｇｈｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）に対する防御として、腫瘍によって使用される。さらに他の関連する免疫性薬剤は、シクロホスファミドであり、制御性Ｔ細胞を抑制し、ＤＮＡ複製に干渉する。本明細書中に記載される薬剤等の多くの免疫性薬剤は、一つ又はほんの一握りの癌種に対して有効であるが、このクラスの薬剤が、使用されるために設計された全ての癌種に対して、単独では、有効ではない。

ＲＦ‐ＥＭＢ処置と、上述の薬剤等の免疫性薬剤の投与との組み合わせによって、標的細胞の抗原がそのままで、外部環境に曝されるようになり、それらが、患者の免疫系と反応することが許容され、その全てが、免疫性薬剤の機能を助ける。併用療法は、二つの異なる病因一つを有する患者の処置の助けとなり得る。第一の実施形態において、原発性の癌性腫瘍及び高尤度の微小転移性病態を有する患者を処置するための方法を備え、ＲＦ‐ＥＭＢは、ＲＦ‐ＥＭＢ処置の結果として、露出されてきたそのままの抗原と協調的に相互作用するように設計された免疫性薬剤療法の投与によって先行又は伴われる原発性腫瘍の直接的破壊を引き起こすように適用され得る。選択される免疫性薬剤は、そうでなければ、患者の身体が、ＲＦ‐ＥＭＢ標的細胞を認識及び破壊することから防ぎ得る抑制反応を遮断するもの及びＲＦ‐ＥＭＢ処置の結果として同様の細胞抗原（すなわち、微小転移性増殖）を有するものであり得る。第二の実施形態において、進行した転移性疾患を有する患者を処置するための方法を備え、ＲＦ‐ＥＭＢ処置は、上述の免疫性薬剤を使用する進行中の処置計画の中間点で投与されてもよい。本実施形態の下、ＲＦ‐ＥＭＢ処置は、患者の免疫系に、固有の細胞抗原を露出させることによって、免疫性薬剤の有効性を向上させる。

免疫性薬剤の投与との併用におけるＲＦ‐ＥＭＢの使用のための三つのサンプル処置プロトコルについて、説明する。実施例１において、処置の一日目に、３００ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミドを、患者の静脈内に投与する。３日目に、患者は、図１１を参照して上述された四つのプロトコルの一つに従って、ＲＦ‐ＥＭＢ処置を受ける。ＲＦ‐ＥＭＢ処置の二週間後から初めて、ＲＦ‐ＥＭＢ処置を伴う２６週まで続けて、２５ｍｇのシクロホスファミドを、６サイクルの間、各サイクル当り四週間、患者に経口投与する。患者は、７日オン（薬剤を投与する）、７日オフ（薬剤を投与しない）サイクルで、一日二回シクロホスファミドの経口投与を受ける。実施例２において、患者は、図１１を参照して上述された四つのプロトコルの一つに従って、ＲＦ‐ＥＭＢ処置で一日目に処置される。一日目にまた、患者は、９０分のコースに亘って、３ｍｇ／ｋｇのイピリムマブを静脈内に投与される。次に、患者は、各用量を、三週間の期間に分けて、３ｍｇ／ｋｇのイピリムマブを、さらに三用量受ける。実施例３において、処置の一日目に、３００ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミドを、患者の静脈内に投与する。処置の３日目に、患者は、図１１を参照して上述された四つのプロトコルの一つに従って、ＲＦ‐ＥＭＢ処置を受け、自己樹状細胞の注射を、標的腫瘍内に直接追加する。ＲＦ‐ＥＭＢ処置の二週間後から初めて、ＲＦ‐ＥＭＢ処置を伴う２６週まで続けて、２５ｍｇのシクロホスファミドを、６サイクルの間、各サイクル当り四週間、患者に経口投与する。患者は、７日オン（薬剤を投与する）、７日オフ（薬剤を投与しない）サイクルで、一日二回、シクロホスファミドの経口投与を受ける。

電気的膜破壊は、即座の、視覚的に観察可能な組織変化、細胞膜破壊及び細胞死を引き起こす。その結果、方法は、患者が、付加的な処置のためにまだその位置にいる間、処置の完了直後の処置有効性を確認するために、処置された標的組織の部分の生検を含んでもよい。付加的な処置は、生検結果及び処置有効性の視覚的決定に基づいて、直ちに投与されてもよい。

或いは、細胞内環境は、高カリウム及び尿酸濃度等の独自の化学組成物を備えるため、細胞内容物の流出は、現在、化学試薬、電気インピーダンス、抵抗測定、ｐＨ測定及び分光学等を用いて、化学レベルを測定するために、処置領域の重要部位内に、一以上の針プローブを配置する等の方法によって、検出されることができる。さらに、極微針の中空コア内に一体化されるか、極微針の中空コアを通って挿入される、上述の品質を測定可能な一以上のセンサを備える、極微針センサ等の装置は、ＲＦ‐ＥＭＢ処置の間、処置領域における一以上の所定部位で挿入され、リアルタイムで細胞外化学組成物を介して細胞流出を測定するようにしてもよい。

本方法に従って、好ましい実施形態において、（極微針として知られる）１ミリメートル未満の少なくとも一つの寸法を有する中空針には、針の中空中心を通ってセンサを挿入することによって、一以上のセンサが設けられている。センサは、ｐＨセンサ、乳酸センサ、グルコースセンサ、電気インピーダンスセンサ、カリウムセンサ、及び／又は尿酸センサを含むがこれらに限定されない、上述された一以上のタイプであってもよい。複数のそのようななセンサは、一緒にまとめられてもよいし、一以上の関連する特性を測定する単一のセンサが使用されてもよい。代替の実施形態において、センサは分光計であってもよい。最も好ましくは、一以上のセンサを含む極微針は、ＲＦ‐ＥＭＢ処置の適用の直前に、選択された処置領域内に挿入され、処置セッションの期間全体に亘って、処置された組織内に挿入されたままである。センサからの読み取りは、当技術分野で周知の任意の手段によって測定されてもよい。そのような方法は、処置提供者が、標的細胞破壊のレベル、及びそれによって、リアルタイムで及び生体内の、処置有効性を観察及び定量することを許容する、付加的な利益を有する。対照的に、従来技術の、熱アブレーション法又はＩＲＥ等の非熱アブレーション法は、それらが、測定可能な量の細胞内容物が、細胞外領域内に直ちに流出されることを引き起こさず、代わりに、任意の細胞内容物が測定のために露出される前に、細胞及びその内容物を破壊する熱壊死又は標的アポトーシス細胞死を生じる点で、この能力を欠いている。従って、従来技術のアブレーション法は、しばしば、処置有効性を決定するために、処置された領域の生検を必要とし、処置の終了まで完了されることができない。

この好ましい実施形態に従って、処置パラメータ及び／又は部位は、処置プロセスの間、細胞流出のリアルタイムで測定されたレベルに基づいて、リアルタイムで監視及び又は調整されてもよい。さらに、又は或いは、本明細書中に記載される細胞内容物の測定は、処置有効性を測定するために、患者が、生検又は他の侵襲的手順を受ける必要がなく、処置の期間の前、後又は期間中に行われてもよい。細胞内容物のための測定技術は、本明細書中に記載される技術に限定されず、生体内で及び／又はリアルタイムで、標的処置領域の化学組成物を測定するという当技術分野において公知の任意の手段によって実行されてもよい。

本発明のさらに他の代替の実施形態において、有効性のための中間生検及び視覚的観察を用いて又は用いずに、本発明に係る処置のモードは、電極の取り外し又は再位置決めなく、ＥＭＢから熱アブレーションに切り替えられてもよい。熱アブレーションへの切替は、ＲＦ‐ＥＭＢと共同して、組織部位での出血を制御するか、望ましくない組織を直接破壊するために、望ましい。切替は、コントローラの作動によって単一のパルス列の内部で生じてもよいし、ＲＦ熱アブレーションのみに指向された第二の又は付加的なパルス列によって達成されてもよい。切替は、公知のＲＦ熱技術に従って、電極での組織温度を増加させるために、パルス発生器によって発生される信号を再構成することによって、達成される。

本発明に係る概念の好ましい実施形態及び特定の改変について、十分に記載してきたが、種々の他の実施形態、並びに本明細書中に示される及び記載される実施形態の特定の変更及び改変は、本発明に係る概念に馴染むとすぐに、当業者に明らかになるであろう。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲において特に記載される以外に実施されてもよいことが、理解されるべきである。

研究によって、１日当り世界で約２００００人が、癌で亡くなっていると推定される。癌性腫瘍及び望ましくない軟部組織を生じる他の状態のより効果的で低侵襲的方法を用いて、多数の死亡者が避けられることができるとともに、生命の質が、多くの患者のために改善されることができる。患者の体内の望ましくない又は癌性組織を攻撃及び除去する際に、患者自身の免疫系を補助することが可能な低侵襲的処置は、さらに、生命を救うこと及び患者の生命の質を改善することに助けとなるだろう。必要なことは、癌性腫瘍等の、望ましくない軟部組織の低侵襲的な除去方法である。本発明は、多くの種類の癌性及び非癌性組織にｔ該する適用性を有し、そのような手順を実行する有効性を有意に改善し、そして、生体内且つ処置と同時に、そのような手順の有効性を直接測定するための手段を、さらに提供する、患者の体内の望ましくない軟部組織を切除する革新的な方法である。

Claims (46)

1. 生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法であって、
   前記生体内部の前記軟部組織の位置を同定する工程と、
   前記軟部組織に対する少なくとも一つの電極の位置を決定する工程と、
   前記生体内部の前記位置に、前記少なくとも一つの電極を導入する工程と、前記少なくとも一つの電極は、該電極への電気パルスの送達を制御するためのコントローラに電気的に接続され、前記コントローラは、電気パルス発生器を備え、
   前記軟部組織の複数の細胞の細胞膜の電気的膜破壊を生じさせるのに十分な電界を、前記軟部組織に印加して、細胞外空間内への全ての細胞内要素の即座の流出及び前記細胞外空間内への前記細胞膜の内部構成部分の露出を生じさせる工程と、を備え、前記電界は、前記パルス発生器から前記少なくとも一つの電極に、前記電気的膜破壊を生じるように構成された少なくとも一つの両極性電気パルスを送達することによって、前記軟部組織に印加される、生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
2. 前記少なくとも一つの両極性電気パルスの電圧は、０．５ｋＶ〜１０ｋＶであり、前記電界の周波数は、１４．２ｋＨｚ〜５００ｋＨｚ未満である、請求項１に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
3. 前記電界の前記周波数は、１００Ｈｚ〜４５０ｋＨｚである、請求項２に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
4. 前記両極性電気パルスの経時的な前記電圧は、極性振動の正極性及び負極性要素に対して、方形波形状の足跡を辿る、請求項２に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
5. 前記両極性電気パルスの前記電圧は、各サイクルの正電荷と負電荷との間の、瞬時の電荷反転によって特徴付けられる、請求項２に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
6. 前記少なくとも一つの両極性電気パルスの持続期間は、１００〜１０００マイクロ秒である、請求項１に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
   
7. 前記決定する工程は、前記軟部組織の比誘電率及び導電性を評価又は測定する工程を、さらに備える、請求項１に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
8. 前記少なくとも一つの両極性電気パルスは、一連の少なくとも１００の両極性パルスであり、前記一連の前記各両極性パルスは、電圧が、前記少なくとも一つの電極に印加されない中間パルスバースト間隔によって分離されている、請求項１に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
9. 前記軟部組織に、臨床的に重要な熱的損傷を引き起こさない電界を印加するために、前記パルス発生器から前記少なくとも一つの電極に送達される前記一連の電気パルスを構成する工程を、さらに備える、請求項８に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
10. 前記一連の電気パルスは、前記軟部組織の温度を、高くて摂氏５０℃まで上昇させる電界を印加するように構成される、請求項９に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
11. 前記パルス発生器から前記少なくとも一つの電極に、前記軟部組織に第二の電界を印加するために送達される第二連の電気パルスを送達する工程を、さらに備える、請求項８に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
12. 前記軟部組織に、臨床的に重要な熱的損傷を引き起こすために、前記第二の電界を印加するための前記第二連の電気パルスを構成する工程を、さらに備える、請求項１１に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
13. 前記組織の少なくとも部分の温度を、摂氏５０℃を越えるように構成された第二連の電気パルスを、前記パルス発生器から前記少なくとも一つの電極に送達する工程を、さらに備える、請求項８に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
14. 組織変化、細胞膜破壊及び細胞死は、前記軟部組織に、前記電界を印加した直後に採取された前記望ましくない軟部組織の試料中に、視覚的に観察可能であり、前記一連の電気パルスを送達することによって、前記軟部組織に、前記電界を印加した後、前記切除の有効性を決定するために、前記軟部組織の部分を直ちに生検する工程と、
    前記有効性が、所定の閾値を超える場合、望ましくない軟部組織の前記切除を中止する工程と、
    前記有効性が、前記所定の閾値を超えない場合、前記軟部組織に、第二の電界を印加するために、前記パルス発生器から前記少なくとも一つの電極に、第二の少なくとも一つの両極性電気パルスを送達する工程を、さらに備える、請求項８に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
15. 前記第二の少なくとも一つの両極性電気パルスは、前記第二の電界が、前記軟部組織の複数の細胞の前記細胞膜の電気的膜破壊を生じさせるのに十分であるように構成された第二連の少なくとも１００の電気パルスである、請求項１４に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
16. 前記第二の少なくとも一つの両極性電気パルスは、前記第二の電界が、前記組織の少なくとも部分の温度を、摂氏５０℃を超えさせるように構成される、請求項１４に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
17. 前記第二の電界は、、前記組織の少なくとも部分の温度が、摂氏６０℃を超えさせるが、摂氏９５℃を超えさせない、請求項１４に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
18. 前記少なくとも一つの電極に近接して温度プローブを導入する工程と、前記温度プローブは、前記コントローラに動作可能に接続され、前記コントローラに温度読み取りを報告する工程と、を、さらに備え、前記コントローラは、前記報告された温度に応じて、前記少なくとも一つの両極性電気パルスの少なくとも一つの特性を変更することを制御する、請求項１に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
19. 前記温度プローブは、熱電対である、請求項１８に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
20. 前記温度プローブは、前記少なくとも一つの電極に一体化されるとともに、それとともに導入される、請求項１８に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
    
21. 前記少なくとも一つの両極性電気パルスは、電圧が、前記少なくとも一つの電極に印加されない中間パルスバースト間隔によって分離された一連の少なくとも１００の両極性パルスであり、
    前記コントローラのメモリ内に、少なくとも一つの温度設定点を格納する工程と、
    前記一連の少なくとも一つのパルス持続期間の少なくとも部分に対して、前記コントローラによって、前記温度設定点を越える、前記温度プローブから前記コントローラに報告された前記温度読み取りに応じて、前記一連の前記中間パルスバースト間隔及びパルスの総数を変更する工程と、
    を、さらに備える、請求項１８に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
22. 前記温度設定点を下回る、前記温度プローブによって報告された前記温度に応じて、前記変更する工程を開始する工程を、さらに備える、請求項２１に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
23. 前記変更する工程は、前記パルス持続期間を減少させる工程を備える、請求項２１に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
24. 前記変更する工程は、前記中間パルスバースト間隔を増加させる工程を備える、請求項２２に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
25. 前記変更する工程は、前記一連におけるパルスの数を減少させる工程を備える、請求項２３に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
26. コントローラのメモリ内に、少なくとも一つの最大電流設定点を格納する工程と、前記コントローラは、少なくとも一つの両極性電気パルスの前記送達を制御し、
    前記コントローラによって、前記少なくとも一つの電極を通る電流を決定する工程と、
    前記電流が前記最大電流設定点に等しい場合、前記少なくとも一つの電極に送達される前記少なくとも一つの両極性電気パルスの前記電圧を減少させる工程と、
    を、さらに備える、請求項１に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
27. 前記細胞内要素及び前記細胞膜の内部構成部分は、前記生体の前記細胞外空間内に残され、前記生体の免疫学的プロセスは、前記細胞外空間から前記細胞内要素及び前記細胞膜の内部構成部分を除去するために、活性化される、請求項１に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
28. 前記細胞内要素は、細胞抗原を備え、前記細胞膜の前記内部構成部分は、細胞膜特異抗原を、さらに備え、
    前記免疫学的プロセスは、一以上の前記細胞抗原及び前記細胞膜特異抗原を有する前記生体における第二の部位での望ましくない軟部組織であって、望ましくない軟部組織を切除する前記方法を経験しなかった前記生体における第二の部位での前記望ましくない軟部組織を除去する工程を、さらに備える、請求項２７に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
29. 前記細胞内要素は、細胞抗原を備え、前記細胞膜の前記内部構成部分は、前記細胞膜に特異的な抗原を、さらに備え、
    前記生体の前記免疫学的プロセスが、前記細胞外空間から前記細胞内要素及び前記細胞膜の内部構成部分を除去するために、活性化されることを増加させるために、免疫学的応答促進剤を、前記生体に投与する工程を、さらに備える、請求項２７に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
30. 前記免疫学的応答促進剤は、細胞傷害性リンパ球のＣＴＬＡ‐４抑制シグナルの抑制をブロックする、請求項２９に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
31. 前記免疫学的応答促進剤は、静脈内、経口及び筋肉内の一つによって投与される、請求項２９に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
32. 前記免疫学的応答促進剤は、前記軟部組織に、電界を印加する前記工程の前又は後に、望ましくない軟部組織内に直接又は望ましくない軟部組織に隣接して注入される、請求項２９に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
33. 前記免疫学的応答促進剤は、自己樹状細胞を含む、請求項２９に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
34. 前記免疫学的応答促進剤は、Ｓ１００Ａ９に結合し、骨髄性細胞機能を改変する、請求項２９に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
35. 前記免疫学的応答促進剤は、静脈内、経口及び筋肉内の一つによって投与される、請求項２９に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
36. 前記免疫学的応答促進剤は、前記軟部組織に、電界を印加する前記工程の前又は後に、望ましくない軟部組織内に直接又は望ましくない軟部組織に隣接して注入される、請求項２９に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
37. 前記免疫学的応答促進剤は、自己樹状細胞を含む、請求項３６に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
38. 前記生体内部の前記軟部組織内に、一以上のセンサを挿入する工程と、
    複数の細胞の細胞膜の電気的膜破壊を生じさせるのに十分な電界を、前記軟部組織に印加する前記工程と同時に、前記センサから複数の測定値を得る工程と、
    前記測定値に基づいて、生体内の望ましくない軟部組織を切除する前記方法の処置有効性を決定する工程と、
    を、さらに備える、請求項１に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
39. 少なくとも一つの前記一以上のセンサは、ｐＨセンサ、乳酸センサ、グルコースセンサ、電気インピーダンスセンサ、カリウムセンサ、尿酸センサ、及び分光計を含む群から選択される、請求項３８に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
40. 前記処置有効性に基づいて、前記電界の一以上のパラメータを変更する工程を、さらに備える、請求項３８に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
41. 生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法であって、
    前記生体内部の前記軟部組織の位置を同定する工程と、
    前記軟部組織の組織型に基づいて、電気的膜破壊によって細胞膜破裂を生じさせるために、前記軟部組織の細胞に印加されるのに必要な最小エネルギープロファイルを決定する工程と、
    細胞塊に対する少なくとも一つの電極の位置を決定する工程と、
    前記生体内部の前記位置に前記少なくとも一つの電極を導入する工程と、前記少なくとも一つの電極は、該電極への電気パルスの送達を制御するためのコントローラに電気的に接続され、前記コントローラは、電気パルス発生器を備え、
    前記最小エネルギープロファイル及び前記少なくとも一つの電極の前記位置に基づいて、前記細胞塊に、前記最小エネルギープロファイルを印加するのに必要な電界強度を決定する工程と、
    前記電界強度に基づいて、少なくとも１００のパルスを有する両極性電気パルス列プロファイルを決定する工程と、前記両極性電気パルス列プロファイルは、パルス数、パルス持続期間及び中間パルスバースト間隔によって特徴付けられ、前記パルスは、それぞれ、周波数及び電圧を有し、前記電圧は、極性の瞬時の反転によって特徴付けられ、
    前記コントローラによって、前記パルス発生器から前記少なくとも一つ電極に、前記両極性電気パルス列プロファイルに従う一連の電気パルスを送達し、それによって、パルス電界が発生され、前記パルス電界は、電気的膜破壊によって、細胞死を引き起こすために、前記軟部組織の複数の前記細胞に、十分なエネルギーを印加する、生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
42. 前記免疫学的応答促進剤は、ＰＤ‐１及びＰＤ‐Ｌ１を含む群から選択されるタンパク質をブロックする、請求項２９に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
43. 生体内の免疫学的応答を増加させるための方法であって、
    前記生体内部の望ましくない軟部組織の位置を同定する工程と、
    前記望ましくない軟部組織上で、非熱アブレーション処置を実行する工程と、
    前記生体に、免疫学的応答促進剤を投与する工程と、
    を備える、生体内の免疫学的応答を増加させるための方法。
44. 非熱アブレーション処置を実行する前記工程は、前記望ましくない軟部組織に対する少なくとも一つの電極の位置を決定する工程と、
    前記生体内部の前記位置に、前記少なくとも一つの電極を導入する工程と、
    前記少なくとも一つの電極は、該電極への電気パルスの送達を制御するためのコントローラに電気的に接続され、前記コントローラは、電気パルス発生器を備え、
    前記軟部組織の複数の細胞の細胞膜の電気的膜破壊を生じさせるのに十分な電界を、前記軟部組織に印加して、細胞外空間内への全ての細胞内要素の即座の流出及び前記細胞外空間内への前記細胞膜の内部構成部分の露出を生じさせる工程と、を備え、前記電界は、前記パルス発生器から前記少なくとも一つの電極に、前記電気的膜破壊を生じるように構成された少なくとも一つの両極性電気パルスを送達することによって、前記軟部組織に印加される、請求項４３に記載の生体内の免疫学的応答を増加させるための方法。
45. 前記免疫学的応答促進剤は、ＰＤ‐１及びＰＤ‐Ｌ１を含む群から選択されるタンパク質をブロックする、請求項４３に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。
46. 前記免疫学的応答促進剤は、細胞傷害性リンパ球のＣＴＬＡ‐４抑制シグナルの抑制をブロックする、請求項４３に記載の生体内の望ましくない軟部組織を切除するための方法。