JP2016536622A - 肺がん診断 - Google Patents
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Abstract
本発明は、抗体の検出方法、肺がんの診断方法、及び肺がん診断用キットに関する。本発明の方法は、対象の血液または血清試料に基づくものである。好ましい実施形態によれば、本発明は、ＢＡＲＤ１のひと続きのアミノ酸配列、短ペプチド、及び／またはその長い断片を含む異なるペプチドの組み合わせを用いる。好ましい実施形態では、本発明の方法は、異なるペプチドの各々に結合している試料中の自己免疫抗体の量測定することと、診断を行うために統計的に決定された評価を適用することとを含む。【選択図】図２Ａ
Description
本発明は、肺がんの診断方法、肺がんの検出方法、抗体の検出方法、さらなる方法及び検出キット並びに診断検査キットに関する。
背景技術及び本発明の根底にある課題
肺がんは、世界中のがんによる死亡の主要原因である。手術以外の治療方法は、あまり効果的ではなく、耐性につながる。そのため、肺がんの病因やその進行についての見識が至急必要とされている。大腸がんは、がん関連死の別の主要原因であり、世界中で４番目に最も一般的なものである。大腸がん患者の生存率及び予後は、診断時の腫瘍のステージに依存する。早期ステージの大腸がんは治癒可能である。残念なことに、５７％以上は、診断時に疾患が周辺に広がっていたり、あるいは遠隔転移していたりする。がんの管理における多額の投資や進歩にもかかわらず、５年生存率は、進行期の大腸がん患者でわずか１５％である。
肺がんは、世界中のがんによる死亡の主要原因である。手術以外の治療方法は、あまり効果的ではなく、耐性につながる。そのため、肺がんの病因やその進行についての見識が至急必要とされている。大腸がんは、がん関連死の別の主要原因であり、世界中で４番目に最も一般的なものである。大腸がん患者の生存率及び予後は、診断時の腫瘍のステージに依存する。早期ステージの大腸がんは治癒可能である。残念なことに、５７％以上は、診断時に疾患が周辺に広がっていたり、あるいは遠隔転移していたりする。がんの管理における多額の投資や進歩にもかかわらず、５年生存率は、進行期の大腸がん患者でわずか１５％である。
近年、多くのグループは、腫瘍におけるタンパク質、ＲＮＡ、及びマイクロＲＮＡを健常組織と比較することで、肺がんを促進するメカニズムに対処してきた。肺がんで最も頻繁に欠失されるかまたは変異した遺伝子であるＴＰ５３に加えて、ｐ５３−ＡＲＦ経路の構成要素も一貫して欠失、変異、または後成的に修飾される。大腸がんに関して、課題は、分子基盤を理解し、発生を引き起こし、進行を促進する因子を決定することである。大腸がんの発症及び転移進行に関与する分子事象は、ほんの一部しか解明されていない。近年の研究では、大腸がんにおいて分子及び生化学的マーカーに利用できる可能性を明らかにし、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、β−カテニン、及びｐ５３などの化学療法に対する成果及び応答を予測している。
分子プロファイルは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の予測及び予後パラメーターとして出現しており、ＥＲＣＣ１、ＲＲＭ１、及びＢＲＣＡ１などの、ＤＮＡ損傷修復に関与する遺伝子が含まれる。乳がん素因遺伝子であるＢＲＣＡ１のアップレギュレート発現は、ＮＳＣＬＣにおける治療に応答する予後及び予測マーカーとして提案された。大腸がんに関して、ＢＲＣＡ１の研究は、大腸がんリスク及びＢＲＣＡ１変異に主に限定される。いくつかの研究は、ＢＲＣＡ１変異と大腸がんリスクを相関させようと試みたが、明確な結論は得られなかった。現在の限られた利用可能な証拠に基づくと、ＢＲＣＡ変異キャリアは、大腸がんのリスクが高いと見なすべきである。しかしながら、大腸がんにおけるＢＲＣＡ１発現の特異的役割は不明である。
ＢＲＣＡ１は、多くの増殖細胞で発現され、ＤＮＡ修復経路及び細胞周期制御における腫瘍抑制因子として作用する。ＢＲＣＡ１タンパク質の安定性及び機能は、ＢＡＲＤ１（ＢＲＣＡ１関連ＲＩＮＧドメインタンパク質１）との相互作用に依存する。ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１ヘテロ二量体は、Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性を有するため、ユビキチン化を介して主要な標的タンパク質の安定性を制御する。ＢＡＲＤ１は、ｐ５３依存性アポトーシスにも関与しており、ほとんどの肺がんで欠乏している。ＢＡＲＤ１は、ｐ５３を安定させ、そのリン酸化を促進し、ＢＡＲＤ１の発現は、アポトーシスに向かって信号伝達する適切なｐ５３機能に必要とされる。そのため、ＢＡＲＤ１は、ＢＲＣＡ１及びｐ５３双方の結合パートナーとして、腫瘍抑制における二重の役割を果たす。いくつかの研究では、ＢＡＲＤ１は、有糸分裂中に、Ｅ２Ｆによって転写的に、かつ、リン酸化によって翻訳後にアップレギュレートされることが示されており、重要なのは、これが、有糸分裂に不可欠なことである。他の研究によれば、ＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤ１双方が、遺伝性非ポリポーシス大腸がん（ＨＮＰＣＣ）と一般に関連付けられた遺伝子であるｈＭＳＨ２と相互作用することが示され、ｈＭＳＨ２の変異は、ＨＮＰＣＣのおおよそ３０〜４０％を占めるように思われる。ＢＲＣＡ１−ｈＭＳＨ２信号伝達過程における欠失は、腫瘍形成への感受性増大をもたらす。
ＷＯ９８／１２３２７（ボード・オブ・リージェンツ、ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム）には、乳がんタンパク質であるＢＲＣＡ１への結合に基づいてスクリーニングアッセイで同定されたいくつかの遺伝子が開示されている。これらの遺伝子の１つは、ＢＡＲＤ１と呼ばれ、これは、ＢＲＣＡ１と相互作用し、種々のがん関連の診断及び治療方法、特に、乳房、卵巣、及び子宮がんと関連したものでの使用が考えられるＲＩＮＧタンパク質である。
ＷＯ２００８／１１９８０２（ジュネーヴ大学）には、婦人科がんにおいて、ＢＡＲＤ１の欠失保持アイソフォームが過剰発現され、細胞質に異常に局在化され、それらの発現は、乳房及び卵巣がんの予後不良と相関していることが開示されている。これらのアイソフォームの構造分析により、それらは、ＢＲＣＡ１と相互作用するかまたはアポトーシスを誘発する領域が欠けていることが示された。これらのアイソフォームは、婦人科がんに特異的であり、アイソフォームα、β、η、γ、ε、φ、δ、及びΩと呼ばれる。
ＷＯ２０１２／０２３１１２には、肺及び結腸がんで特異的に発生する、ＢＡＲＤ１の新規アイソフォームが開示されている。これらのアイソフォームの検出方法が開示されている。
肺がんの重症度により、対象における肺がんの効果的な診断方法を提供することが至急必要とされている。進行した状況にある対象のがんは治癒ができないことにより、肺がんを早期診断することが可能な方法を提供することが至急必要とされている。早期診断は、肺がんを患っている対象の予後を著しく改善させる。
本発明の目的は、非侵襲であるかまたは最小侵襲手順を要する診断方法を提供することである。血液試料に基づいて行うことができる診断検査が有益であろう。
本発明の別の目的は、肺がんを診断するための迅速で、信頼性が高く、感受性があり、かつ特異的な検査を提供することである。
本発明は、上記の問題に対処する。
本発明は、肺がんの診断に適する方法、キット、及びアッセイを提供する。
一態様では、本発明は、血液及び／または血清試料中の抗体のレベルの検出及び／または測定方法を提供し、異なるペプチドに特異的に結合する抗体のレベルを測定し、前記ペプチドは、ヒトＢＡＲＤ１のひと続きのアミノ酸配列（配列番号４２）及び／またはそのアイソフォーム（配列番号４３〜５１）を含む。
一態様では、本発明は、哺乳類対象の循環抗体のレベルの検出及び／または測定方法を提供し、多くの異なるペプチドに特異的な抗体を検出し、前記ペプチドは、ＢＡＲＤ１に関係する、及び／またはＢＡＲＤ１のアミノ酸配列またはそのアイソフォームのいずれか１つの断片を含む。
ヒトＢＡＲＤ１のアミノ酸配列（全長）は、含まれる配列リストの配列番号４２で提供される。ＢＡＲＤ１のアイソフォームは、アイソフォームα（アルファ）（配列番号４３）；アイソフォームπ（パイ）（配列番号４４）；アイソフォームβ（ベータ）（配列番号４５）；アイソフォームκ（配列番号４６）；アイソフォームγ（配列番号４７）；アイソフォームλ（配列番号４８）；アイソフォームφ（ファイ）（配列番号４９）；アイソフォームε（イプシロン）（配列番号５０）；及びアイソフォームη（イータ）（配列番号５１）を包含する。
一態様では、本発明は、哺乳類対象における循環抗体のレベルを検出することによる肺がんの診断方法を提供し、多くの異なるペプチドに特異的な抗体を検出し、前記ペプチドは、ＢＡＲＤ１に関係する、及び／またはＢＡＲＤ１のアミノ酸配列またはそのアイソフォームのいずれか１つの断片を含む。
一態様では、本発明は、哺乳類対象における循環抗体のレベルを測定する及び／または検出するインビトロ及び／またはエクスビボ方法を提供し、本方法は、ａ）対象から採取した血液または血清試料に基づいて、ヒトＢＡＲＤ１のひと続きのアミノ酸配列（配列番号４２）及び／またはそのアイソフォーム（配列番号４３〜５１）を含む異なるペプチドに特異的に結合している循環血清抗体の量に関係するパラメーターを決定するステップを含む。
一態様では、本発明は、哺乳類対象における肺がんのインビトロ及び／またはエクスビボ診断方法を提供し、本方法は、ａ）対象から採取した血液または血清試料に基づいて、ヒトＢＡＲＤ１のひと続きのアミノ酸配列（配列番号４２）及び／またはそのアイソフォーム（配列番号４３〜５１）を含む異なるペプチドに特異的に結合している循環血清抗体の量に関係するパラメーターを決定するステップと；ｂ）前のステップで得られたパラメーターに基づいて、前記対象が肺がんを患っているかどうかを診断するステップとを含む。
一態様では、本発明は、肺がんの発生と関連付けられた抗体のレベルを検出する及び／または測定するインビトロ及び／またはエクスビボ方法を提供し、本方法は、ａ）対象から採取した前記血液または血清試料に基づいて、ヒトＢＡＲＤ１のひと続きのアミノ酸配列（配列番号４２）及び／またはそのアイソフォーム（配列番号４３〜５１）を含む異なるペプチドに特異的に結合している抗体の量に関係するパラメーターを決定するステップを含む。
一態様では、本発明は、対象が肺がんを患う可能性及び／またはリスクの評価方法を提供し、本方法は、ａ）対象から採取した血液または血清試料に基づいて、ヒトＢＡＲＤ１のひと続きのアミノ酸配列（配列番号４２）及び／またはそのアイソフォーム（配列番号４３〜５１）を含む異なるペプチドに特異的に結合している抗体の量に関係するパラメーターを決定するステップと；ステップａ）で測定したパラメーターから前記対象が肺がんを患う可能性及び／またはリスクを評価するステップとを含む。
一態様では、本発明は、本発明のインビトロ及び／またはエクスビボ方法、例えば、肺がんのスクリーニング、モニタリング、診断、予後、予測、及び再発のための方法、及び／または、肺がんのスクリーニング、モニタリング、診断、予後、予測、及び再発の臨床効率を高める方法において、ヒトＢＡＲＤ１のひと続きのアミノ酸配列（配列番号４２）及び／またはそのアイソフォーム（配列番号４３〜５１）を含む異なるペプチドの組み合わせの使用を提供する。
一態様では、本発明は、血液及び／または血清試料中に存在する抗体のレベルの検出及び／または決定方法を提供し、本方法は、哺乳類対象から血液または血清試料を提供するステップと；前記血液または血清試料を、異なるペプチドであって、ヒトＢＡＲＤ１のひと続きのアミノ酸配列（配列番号４２）及び／またはそのアイソフォーム（配列番号４３〜５１）を含む、ペプチドが結合している１つ以上の表面及び／または固体マトリックスに接触させるステップであって、接触ステップは、前記試料中に存在する抗体を、抗原抗体相互作用を介して異なるペプチドに結合させるのに十分な条件下である、接触ステップと；１つ以上の表面または固体マトリックスから任意の非結合抗体を除去するための血液または血清試料を除去するステップと；前記表面及び／またはマトリックスに結合している抗原−抗体複合体のレベルを決定するステップとを含む。
一態様では、本発明は、哺乳類対象における肺がんの診断方法を提供し、本方法は、哺乳類対象から血液または血清試料を提供するステップと；前記血液または血清試料を、異なるペプチドであって、ヒトＢＡＲＤ１のひと続きのアミノ酸配列（配列番号４２）及び／またはそのアイソフォーム（配列番号４３〜５１）を含む、ペプチドが結合している１つ及び／またはそれ以上の表面または固体マトリックスに接触させるステップであって、接触ステップは、前記試料中に存在する抗体を、抗原抗体相互作用を介して異なるペプチドに結合させるのに十分な条件下である、接触ステップと；表面及び／またはマトリックスから任意の非結合抗体を除去するための血液または血清試料を除去するステップと；前記表面及び／またはマトリックスに結合している抗原-抗体複合体のレベルを決定するステップと；前のステップで得られたレベルに基づいて、前記対象が肺がんを患っているかどうかを診断するステップとを含む。
一態様では、本発明は、女性ヒト対象における肺がんのインビトロ及び／またはエクスビボ診断方法を提供する。好ましい実施形態では、方法は、女性対象から採取した血液または血清試料に基づいて、少なくとも１９個の異なるペプチドに特異的に結合している抗体の量に関係するパラメーターを決定するステップであって、前記ペプチドは、それぞれ、配列番号１〜配列番号６；配列番号１１〜配列番号１４；配列番号１８〜配列番号２１；配列番号２６〜配列番号３０のアミノ酸配列を含むペプチドである、決定するステップと；前のステップで得られた前記パラメーターに基づいて、前記女性対象が肺がんを患っているかどうかを診断するステップとを含む。
一態様では、本発明は、男性ヒト対象における肺がんのインビトロ及び／またはエクスビボ診断方法を提供する。好ましい実施形態では、この方法は、男性対象から採取した血液または血清試料に基づいて、少なくとも２２個の異なるペプチドに特異的に結合している抗体の量に関係するパラメーターを決定するステップであって、前記ペプチドは、それぞれ、配列番号１〜配列番号５；配列番号７；配列番号８；配列番号１１〜配列番号１３；配列番号１５；配列番号１８〜配列番号２０；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２６；配列番号２７；及び配列番号３１〜配列番号３４のアミノ酸配列を含むペプチドである、決定するステップと；前のステップで得られた前記パラメーターに基づいて、前記男性対象が肺がんを患っているかどうかを診断するステップとを含む。
一態様では、本発明は、対象における肺がんのインビトロ及び／またはエクスビボ診断方法を提供し、本方法は、
ａ）- 異なるペプチドの組み合わせを、対象の血液または血清試料に暴露させるステップであって、前記ペプチドは、ヒトＢＡＲＤ１のアミノ酸配列のひと続きのアミノ酸配列（配列番号４２）またはそのアイソフォームのアミノ酸配列（配列番号４３〜５１）を含むペプチドから選択され、前記ペプチドは、独立して、４〜３００個のアミノ酸の長さを有する、曝露させるステップと；
- 前記ペプチドの各々に結合している前記試料中の抗体の量に関係するパラメーターを決定するステップと；
ｂ）前のステップで得られたパラメーターから、前記対象が肺がんに対して陽性または陰性と診断されるかどうかを決定するステップとを含む。
ａ）- 異なるペプチドの組み合わせを、対象の血液または血清試料に暴露させるステップであって、前記ペプチドは、ヒトＢＡＲＤ１のアミノ酸配列のひと続きのアミノ酸配列（配列番号４２）またはそのアイソフォームのアミノ酸配列（配列番号４３〜５１）を含むペプチドから選択され、前記ペプチドは、独立して、４〜３００個のアミノ酸の長さを有する、曝露させるステップと；
- 前記ペプチドの各々に結合している前記試料中の抗体の量に関係するパラメーターを決定するステップと；
ｂ）前のステップで得られたパラメーターから、前記対象が肺がんに対して陽性または陰性と診断されるかどうかを決定するステップとを含む。
いくつかの態様では、本発明は、本発明の方法を行うためのキットを提供する。キットは、少なくとも４つの異なるペプチドを含むのが好ましい。
一態様では、本発明は、肺がんの診断用の診断検査キットを提供し、前記診断検査キットは、少なくとも１１個の異なるペプチドの組み合わせを含み、各ペプチドは、ヒトＢＡＲＤ１のひと続きのアミノ酸配列（配列番号４２）及び／またはそのアイソフォーム（配列番号４３〜５１）を含む。一実施形態では、前記異なるペプチドは、配列番号１〜４１のいずれか１つによるアミノ酸配列を含むペプチドの群から選択される。
本発明のさらなる態様及び好ましい実施形態は、以下及び添付の特許請求の範囲に規定される。本発明のさらなる特徴及び利点は、下記の好ましい実施形態の説明から当業者に明らかになるであろう。
いくつかの実施形態では、本発明は、診断方法及び診断の使用、哺乳類対象の血液及び／または血清抗体の検出方法、肺がんの発生と関連付けられた抗体のレベルの検出及び／または測定方法、対象が肺がんを患う可能性及び／またはリスクの評価方法に関する。本発明は、使用及びキットにも関する。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、血液及び／または血清試料中の抗体のレベルを検出する及び／または測定するステップを含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、哺乳類対象の循環抗体のレベルを検出する及び／または測定するステップを含む。抗体は、自己免疫抗体であるのが好ましい。
一実施形態では、本発明の方法は、エクスビボ及び／またはインビトロ方法である。本発明の方法は、ヒトまたは動物体で直接行わないのが好ましい。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、血液試料を提供するステップを含む。血液試料を採取する、例えば、血液ランセットを用いた、例えば、毛細管採血によって、例えば、数滴の血液を吸引するのが好ましい。血液試料は、静脈採血（静脈穿刺）によって提供してもよい。本発明の方法は、常用手技によって対象から予め採取された試料に基づいて行うのが好ましい。いくつかの実施形態では、採血するステップは、本発明の方法の一部ではない。
従って、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、血液または血清試料を提供するステップを含む。血液及び／または血清試料は、哺乳類対象から採取するのが好ましい。
本発明の目的のため、対象は、哺乳動物またはヒトであるのが好ましい。対象は、ヒトであるのが最も好ましい。一実施形態によれば、対象は、喫煙歴を有するヒトである。従って、診断方法は、喫煙者であるかまたは以前に喫煙者であったヒトに限定して設計されているのが好ましい。好ましい実施形態では、診断方法は、多量の喫煙歴があるヒトに限定して設計されているのが好ましい。
血液試料中の抗体のレベルは、例えば、定量的及び／または半定量的に測定してもよい。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、試料中の抗体の量、及び／または循環抗体の量に関係するパラメーターを決定するステップを含む。パラメーターは、試料中に存在する抗体の量に関係する数値であるのが好ましい。数値は、この明細書中のどこかに例示されるように、適当な読み取り装置及びデータ処理装置を用いて自動化処理で生成されるのが好ましい。
一実施形態では、本発明の方法は、ａ）対象から採取した血液または血清試料に基づいて、ヒトＢＡＲＤ１のひと続きのアミノ酸配列（配列番号４２）及び／またはそのアイソフォーム（配列番号４３〜５１）を含む異なるペプチドに特異的に結合している循環血清抗体の量に関係するパラメーターを決定するステップを含む。血清抗体の量に関係するパラメーターは、前記試料中の抗体のレベルを表す及び／または該レベルに対応してもよい。
本発明のペプチドは、単離された及び／または精製されたペプチドであるのが好ましい。好ましい実施形態によれば、ペプチドは、組み換えペプチドである。一実施形態によれば、ペプチドは、合成ペプチドである。固相ペプチド合成などの合成化学法を用いて、本発明によるポリペプチドを合成することができる。これらのペプチドの精製は、タンパク質／ペプチド精製の当該技術分野で公知の任意の技術によって行ってもよい。技術の例としては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び免疫親和法が挙げられる。
本発明の一実施形態では、血液試料中の抗体のレベルを決定するステップ、及び／または前記ステップａ）は、
１）前記血液または血清試料を、前記異なるペプチドが結合している１つ以上の表面及び／または固体マトリックスに接触させるステップであって、接触ステップは、前記試料中に存在する抗体を、抗原抗体相互作用を介して異なるペプチドに結合させるのに十分な条件下である、接触ステップと；
２）１つ以上の表面または固体マトリックスから任意の非結合抗体を除去するための血液または血清試料を除去するステップと；
３）前記表面及び／またはマトリックスに結合している抗原−抗体複合体のレベルを測定することで、循環血清抗体の量に関係する前記パラメーターを決定するステップとを含む。
１）前記血液または血清試料を、前記異なるペプチドが結合している１つ以上の表面及び／または固体マトリックスに接触させるステップであって、接触ステップは、前記試料中に存在する抗体を、抗原抗体相互作用を介して異なるペプチドに結合させるのに十分な条件下である、接触ステップと；
２）１つ以上の表面または固体マトリックスから任意の非結合抗体を除去するための血液または血清試料を除去するステップと；
３）前記表面及び／またはマトリックスに結合している抗原−抗体複合体のレベルを測定することで、循環血清抗体の量に関係する前記パラメーターを決定するステップとを含む。
「固体マトリックス（ｓｏｌｉｄ ｍａｔｒｉｘ）」及び「固体マトリックス（ｓｏｌｉｄ ｍａｔｒｉｃｅｓ）」という表現には、免疫測定法または本発明による方法を実施するのに適切な任意の固相支持体が含まれる。それには、ビーズ、微粒子、ナノ粒子、管、織物またはプレート、フィルム、スライド、ウェル、ガラスから形成されたかまたはガラスで被膜されたもの、ポリスチレン、ポリプロピレン、ニトロセルロース、石英、セラミック、デキストラン、または他の材料が挙げられる。例えば、固体マトリックスは、９６ウェルまたは３１２ウェルのマイクロタイタープレートなどのマイクロタイターウェルの形態である。いくつかの実施形態では、「固体マトリックス」及び／または表面とは、例えば、電気化学発光アッセイにおいて電極材として適切な炭素材または他の材料のことを言う。
例えば、本発明の方法及びキットにおける、本発明によるペプチドの固体マトリックスへの固定及び／または結合は、固相支持体への吸着または化学的結合によって行ってもよい。タンパク質またはペプチドを固体支持体に固定化するための当該技術分野で公知の任意の手段を用いることができる。本発明によるペプチドは、アミドまたはエステル結合または吸着を介して、共有結合などの技術によって固体マトリックスに共有的または非共有的に結合することができる。ペプチドは、ビオチンとアビジンまたは抗体と抗原などの結合対を用いて結合することができる。ペプチドを固体マトリックスに固定した後、固体マトリックスをブロッキング溶液（ウシ血清アルブミンなどのブロッキングタンパク質を含む）でインキュベートし、検査試料中の抗体の支持体表面への非特異的吸着を減らすことができる。一実施形態によれば、本発明によるペプチドは、例えば、本発明のキットの固体マトリックス上で直接合成することができる。
本明細書の目的のため、「抗原−抗体複合体」という表現は、試料中の抗体の本発明のペプチドへの結合によって形成される複合体のことを言い、表面及び／または固体支持体上に提供されるのが好ましい。従って、「抗原−抗体複合体」とは、本明細書の目的のため、「ペプチド−抗体複合体」とも呼ばれる。前記ステップ３）にて、表面及び／またはマトリックス上に保持される抗体は、抗原−抗体複合体を形成するものであるのが好ましく、前記ペプチドは、前記抗体の抗原として機能する。
前記血液及び／または血清試料を除去するステップ２）は、１つ以上の表面及び／または固体マトリックスを、例えば、ＰＢＳなどの適切な洗浄緩衝液で洗浄及び／または濯ぐことで行うのが好ましい。このステップは、ステップ１）で発生したかもしれない抗原−抗体を乱さないのが好ましい。
一実施形態では、ステップ３）は、ステップ１）及び／またはステップ２）の後に、マーカー分子を１つ以上の表面または固体マトリックスに加えるステップを含み、前記マーカーは、前記表面及び／またはマトリックスに結合している抗原−抗体複合体を形成する血液または血清試料の抗体と相互作用する、及び／または、該抗体に結合している。
マーカー分子は、信号読み取りステップで読み取ることができる信号を生成するかまたは該信号を生成するように誘発することができるエンティティであるのが好ましい。一般に、マーカー分子は、抗体、特に、抗原−抗体複合体と関連している、または何らかの方法で関連付けられている。従って、マーカーの存在は、一般に、抗原−抗体複合体の存在、より詳細には、ペプチドに特異的な抗体の存在を示すものである。
マーカーは、染料などの信号生成化合物または分子に共有結合した抗体または抗体断片を含んでもよい。あるいは、マーカーは、表面及び／または固体マトリックス上で抗原−抗体複合体の形態で結合した抗体に直接コンジュゲートすることができる分子であってもよい。
当業者に利用可能な多くの種類のマーカーがあり、例えば、光信号（染料）、磁気信号（例えば、磁気ビーズ）、及び放射性信号（例えば、放射免疫測定用の放射性標識）を生成するマーカーなどである。
一実施形態では、本発明の方法（例えば、ステップａ））は、それぞれのペプチドの各々に結合している前記試料中の抗体の量に関係する信号を生成する及び／または測定するステップを含む。一実施形態では、方法は、前記表面及び／またはマトリックスに結合している抗原−抗体複合体の存在及び／または量に依存する信号を測定するステップを含む。
好ましい実施形態では、マーカー分子を誘発して、適切な読み取り装置で読み取ることができる信号を生成することができる。従って、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、前記表面及び／またはマトリックスに結合している抗原−抗体複合体の存在及び／または量に依存する及び／または影響を受ける信号を生成し、測定するステップを含み、前記複合体の量は、前記信号の性質、強度、及び／または強さに影響を及ぼす。
使用するマーカー分子に応じて、当業者は、信号を生成するのに適切な方法、例えば、ＥＬＩＳＡの場合には酵素に対する基質、または電気化学発光の場合には電気の印加などを選択するであろう。
信号の読み取りは、適切な読み取り装置を用いて自動化処理で行うのが好ましい。プレートリーダーを信号の測定に用いるのが好ましい。例えば、光信号を測定する場合、読み取り装置は、光センサー、例えば、光電子増倍管及び／またはカメラを含み得る。例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラを用いてもよい。
読み取り装置は、一般に、信号の測定から、血液試料中の抗体の量に関係する数値パラメーターを直接算出または決定する。電気化学発光検出（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， ＵＳＡ）の場合、ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６０００及び２４００は、市販のイメージング検出システムである。そのような装置は、アッセイプレート上で読み取られた信号から数値を直接算出する適切なソフトウェアで実行される。ＥＬＩＳＡの場合、例えば、従来のＥＬＩＳＡプレートリーダーを、抗体の量に関係する数値パラメーターを決定するのに使用してもよい。
一般的な言葉で述べると、ステップａ）を行う、及び／または、血液試料中の抗体のレベルを測定する方法は、光学検出法（例えば、ＥＬＩＳＡ）、質量変化検出（例えば、表面プラズモン共鳴、質量分析）、及び電気検出（例えば、インピーダンス、分光、電気化学）技術を包含する。
一実施形態では、血液試料中の抗体のレベルは、例えば、放射免疫測定法、免疫蛍光測定法によって、または、例えば、酵素結合免疫吸着法、及びタンパク質への抗体に基づく免疫測定法によって免疫化学的に決定される。
当業者には理解されるように、単数形における「ペプチド」という言葉の使用には、複数の同じ及び／または同一ペプチドが、例えば、マイクロタイタープレートの１スポット上に固定された（配列及び／または構造という観点から）複数の同一ペプチドのことを言うことを包含する。
「異なるペプチド」という表現は、一般に、異なる構造、及び／または、アミノ酸配列を有するペプチドのことを言う。一般に、「異なるペプチド」という表現は、より詳細には、いくつかの複数または群のペプチド（複数の複数）のことを言い、各複数または各群は、その複数及び／または群内のペプチドのアミノ酸配列及び／または構造の同一性によって特徴付けられる。一方、「異なるペプチド」は、異なる複数及び／または群に含まれ、それらが含むペプチドが、異なる構造及び／または異なる配列を有する点で異なっている。従って、「異なるペプチド」という表現は、本明細書の目的のため、「同じアミノ酸配列を有する異なる個々のペプチド分子」を意味するものではない。
一実施形態によれば、各個別のパラメーターが前記異なるペプチドの１つの特定のペプチドに結合している抗体の量に関係する複数の前記パラメーターを得るように、抗体の量に関係するパラメーターをペプチドごとに別々に決定する。
一実施形態では、前記異なるペプチドは、異なるペプチドの組み合わせである。
本発明の方法の一実施形態では、抗体の量は、前記異なるペプチドごとに別々に決定される。特に、本発明の方法、キット、及び／またはアッセイの一部であるペプチドの各々において、試料中に存在する抗体の量に関係する値及び／またはパラメーターが生成される。異なるペプチドの各々において、ペプチドに特異的に結合している抗体のレベルを決定するのが好ましい。
本発明の方法は、複数の異なるペプチドの使用と、異なるペプチドの各々に結合している抗体のレベルを測定することとを包含する。
一実施形態では、前記ペプチドは、マイクロタイタープレートの１つ以上のウェルで提供される。本発明の方法では、前記対象の試料を前記１つ以上のウェルに加えるのが好ましい。一実施形態では、各ウェルは、いくつかの領域を含み、各領域は、前記異なるペプチドの組み合わせから選択される複数の特異的な、定義されたペプチドを含む。
一実施形態では、前記異なるペプチドの全てのペプチドは、独立して、４〜３００個、好ましくは８〜２５０個のアミノ酸の長さを有する。好ましい実施形態では、前記ペプチドは、８〜２００個、より好ましくは８〜１５０個、さらにより好ましくは８〜１００個、及び最も好ましくは８〜５０個のアミノ酸の長さを有する。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、約６〜３０個のアミノ酸長の短断片であり、例えば、他の実施形態では、ペプチドは、例えば、１００〜３００個、好ましくは１３０〜２６０個のアミノ酸長を有する長い断片である。いくつかの実施形態では、本発明の方法及びキットで用いるペプチドは、短い及び長い断片、あるいは上記範囲の間にある長さ、例えば、３０〜１００個のアミノ酸長を有する断片を含む。
一実施形態では、前記異なるペプチドは、５〜３５個、好ましくは１１〜３０個、及び最も好ましくは１７〜２８個の異なるペプチドからなる。好ましい実施形態によれば、前記異なるペプチドは、１１個以上の異なるペプチドを含む。
好ましい実施形態では、前記異なるペプチドは、４１個のペプチドの群から選択され、４１個のペプチドの前記群の各ペプチドは、それぞれ、配列番号１〜４１からなる前記群の４１個のアミノ酸配列の１つを含む、及び／または、から実質的になる。前記異なるペプチドは、異なるペプチドの組み合わせであるのが好ましく、前記組み合わせは、それぞれ、４１個の異なるペプチドからなり、各ペプチドは、配列番号１〜４１からなる前記群の４１個のアミノ酸配列の１つを含む、及び／または、から実質的になる。
本明細書の目的のため、「から実質的になる」という表現は、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９７％以上の配列同一性のことを言う。例えば、「から実質的になる」とは、９８％、９９％、最も好ましくは９９．５％の配列同一性のことを言う。本明細書の目的のため、配列同一性率は、予め設定された標準パラメーター及びデータベース選択によるインターネット（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）上の基本Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴを用いて決定される。この配列比較ツールは、以下の２つの刊行物に詳述されているアルゴリズムに基づくものである：Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ． Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｔｈｏｍａｓ Ｌ． Ｍａｄｄｅｎ， Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ． Ｓｃｈaｆｆｅｒ， Ｊｉｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ， Ｚｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ， Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ， ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｊ． Ｌｉｐｍａｎ （１９９７）， “Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９−３４０２． Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ． Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｊｏｈｎ Ｃ． Ｗｏｏｔｔｏｎ， Ｅ． Ｍｉｃｈａｅｌ Ｇｅｒｔｚ， Ｒｉｃｈａ Ａｇａｒｗａｌａ， Ａｌｅｋｓａｎｄｒ Ｍｏｒｇｕｌｉｓ， Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ． Ｓｃｈaｆｆｅｒ， ａｎｄ Ｙｉ−Ｋｕｏ Ｙｕ （２００５）“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈｅｓ ｕｓｉｎｇ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ ａｄｊｕｓｔｅｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｃｅｓ”， ＦＥＢＳ Ｊ． ２７２：５１０１〜５１０９。
標準パラメーターには、ｂｌａｓｔｐの選択（タンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ、短い入力配列に対するパラメーターの自動調節；期待閾値１０、ワードサイズ３、マトリックスＢＬＯＳＵＭ６２の使用；ギャップコスト：存在：１１、拡張 １；条件付き組成スコアマトリックス調整、フィルターなし、マスクなし）が含まれる。例えば、比較配列または初期配列のいずれか１つが、アミノ酸残基を欠いている、さらなるアミノ酸残基を有する、及び／または、別の残基で置換された１つ以上のアミノ酸残基を有する場合、初期配列に対する比較配列の配列同一性は減少する。本明細書で定義したように任意の配列と８０％程度の配列同一性を有する配列は、まだ機能性を提供することができ、すなわち、本発明のキット及び方法においてペプチドとして適している。
一実施形態では、本発明は、本発明の方法で使用することができる、特に、肺がんの診断用のペプチドの選択に関する。いくつかの実施形態では、異なる群のペプチドは、本発明により確立され、前記異なるペプチドは、ペプチドのこれらの群の１つ以上から選択してもよい。前記ペプチドは、Ａ群〜Ｅ群である５つの群に分類されるのが好ましい。
従って、一実施形態では、前記異なるペプチドは、いくつかの群のペプチド、Ａ群のペプチド、Ｂ群のペプチド、Ｃ群のペプチド、Ｄ群のペプチド、及びＥ群のペプチドを含む。
一実施形態では、前記Ａ群は、配列番号１（＃２８６）；配列番号２（＃７２０）；配列番号３（＃４９３）；配列番号４（＃６８／５２４）；配列番号５（＃１４０）；配列番号６（＃１３９）；配列番号７（＃３４９）；及び配列番号８（＃１１７）；配列番号９（＃５）；及び配列番号１０（＃−４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、または、から実質的になるペプチドを含む。
一実施形態では、前記Ｂ群は、配列番号１１（＃１６）；配列番号１２（＃４５３）；配列番号１３（ＥＸ４．．２）；配列番号１４（＃ＢＲＣＴ２．２．）；配列番号１５（＃１５）；配列番号１６（＃５２３）；及び配列番号１７（＃１０９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、または、から実質的になる１つ以上のペプチドを含む。
一実施形態では、前記Ｃ群は、配列番号１８（＃１１７／６３５）；配列番号１９（＃３６８）；配列番号２０（ＢＲＣＴ．１．）；配列番号２１（ＥＸ４．．１）；配列番号２２（＃１８８）；配列番号２３（ＬＩＮＫ）；配列番号２４（＃Ａ２１／６３５）；及び配列番号２５（ＲＩＮＧ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、または、から実質的になる１つ以上のペプチドを含む。
一実施形態では、前記Ｄ群は、配列番号２６（Ａｎｋ）；配列番号２７（＃Ａ２０／１２２）；配列番号２８（＃５４）；配列番号２９（＃４８／５２２）；配列番号３０（＃１４９）；配列番号３１（＃７３）；配列番号３２（＃Ａ−４）；配列番号３３（＃３ＯＲＦ）；及び配列番号３４（＃５５７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、または、から実質的になる１つ以上のペプチドを含む。
一実施形態では、前記Ｅ群は、配列番号３５（＃３１９）；配列番号３６（＃７０２）；配列番号３７（＃１７５）；配列番号３８（＃８４）；配列番号３９（＃Ａ２９）；配列番号４０（＃５４２）；及び配列番号４１（＃３０９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、または、から実質的になる１つ以上のペプチドを含む。
一実施形態では、前記異なるペプチドは、前記Ａ群から選択された１つ以上のペプチドと、前記Ｂ群、Ｃ群、Ｄ群、及び／またはＥ群の前記いずれか１つから選択された１つ以上のペプチドとを含む。
一実施形態では、前記異なるペプチドは、前記Ａ群から選択された１つ以上のペプチドと、前記Ｂ群から選択された１つ以上のペプチドと、前記Ｃ群、Ｄ群、及び／またはＥ群から選択された１つ以上のペプチドとを含む。
一実施形態では、前記異なるペプチドは、前記Ａ群から選択された１つ以上のペプチドと、前記Ｂ群から選択された１つ以上のペプチドと、前記Ｃ群から選択された１つ以上のペプチドと、前記Ｄ群及び／またはＥ群から選択された１つ以上のペプチドとを含む。
一実施形態では、前記異なるペプチドは、前記Ａ群から選択された３つ以上のペプチドと、前記Ｂ群、Ｃ群、Ｄ群、及び／またはＥ群の前記いずれか１つから選択された３つ以上のペプチドとを含む。
一実施形態では、前記異なるペプチドは、前記Ａ群から選択された３つ以上のペプチドと、前記Ｂ群から選択された２つ以上のペプチドと、前記Ｃ群、Ｄ群、及び／またはＥ群から選択された２つ以上のペプチドとを含む。
一実施形態では、前記異なるペプチドは、前記Ａ群から選択された３つ以上のペプチドと、前記Ｂ群から選択された２つ以上のペプチドと、前記Ｃ群から選択された２つ以上のペプチドと、前記Ｄ群及び／またはＥ群から選択された２つ以上のペプチドとを含む。
一実施形態では、前記異なるペプチドの組み合わせは、前記Ａ群から選択された５つ以上のペプチドと；Ｂ群から選択された２つ以上のペプチドと、Ｃ群から選択された２つ以上のペプチドとを含む。
一実施形態では、前記異なるペプチドの組み合わせは、Ｅ群からの任意のペプチドが無い。
一実施形態では、前記異なるペプチドは、配列番号１〜５から選択されたアミノ酸配列を含む２つ以上のペプチドと；配列番号１１〜１３から選択された１つ以上のペプチドと；配列番号１８〜２０から選択された１つ以上のペプチドとを含む。
一実施形態では、前記異なるペプチドは、配列番号１〜５から選択されたアミノ酸配列を含む３つ以上のペプチドと；配列番号１１〜１３から選択された２つ以上のペプチドと；配列番号１８〜２０から選択された２つ以上のペプチドとを含む。
一実施形態では、前記異なるペプチドは、配列番号１〜５から選択されたアミノ酸配列を含む４つ以上のペプチドと；配列番号１１〜１３から選択された３つ以上のペプチドと；配列番号１８〜２０から選択された３つ以上のペプチドとを含む。
一実施形態では、前記異なるペプチドの組み合わせは、１１個以上の異なるペプチドを含み、前記ペプチドは、それぞれ、配列番号１〜５；１１〜１３、及び１８〜２０のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、前記異なるペプチドの組み合わせは、少なくとも１０個の異なるペプチドを含み、前記１０個のペプチドの各々は、それぞれ、配列番号１〜１０からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含む、または、から実質的になる。
一実施形態では、前記異なるペプチドの組み合わせは、少なくとも１７個の異なるペプチドを含み、前記１７個のペプチドの各々は、それぞれ、配列番号１〜配列番号１７からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含む、または、から実質的になる。
一実施形態では、前記異なるペプチドの組み合わせは、少なくとも２５個の異なるペプチドを含み、前記２５個のペプチドの各々は、それぞれ、配列番号１〜配列番号２５からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含む、または、から実質的になる。
一実施形態では、本発明の方法は、ヒト女性対象における肺がんの診断方法である。別の実施形態では、本発明の方法は、ヒト男性対象における肺がんの診断方法である。
方法が特にヒト女性対象に関する場合、異なるペプチドは、好ましくは１９個の異なるペプチドを含み、前記異なるペプチドは、それぞれ、配列番号１〜配列番号６；配列番号１１〜配列番号１４；配列番号１８〜配列番号２１；配列番号２６〜配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
方法が特にヒト男性対象に関する場合、異なるペプチドは、好ましくは２２個の異なるペプチドを含み、前記異なるペプチドは、それぞれ、配列番号１〜配列番号５；配列番号７；配列番号８；配列番号１１〜配列番号１３；配列番号１５；配列番号１８〜配列番号２０；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２６；配列番号２７；及び配列番号３１〜配列番号３４のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、本発明の方法は、前記対象が肺がんを患っているかどうかを診断するステップを含む。診断は、前記血清及び／または血液試料中の抗体のレベルに基づいて、及び／または、循環血清抗体の量に関係するパラメーターに基づいて行うのが好ましい。
一実施形態では、本発明の方法は、前記パラメーター及び／または前記信号に基づいて、かつ、各ペプチドに特有の統計的に決定された係数から対象の試験値を算出するステップを含む。本発明の方法は、前記試験値を閾値と比較することで、前記対象が肺がんを患っているかどうかを診断するステップを含んでもよい。
別の実施形態では、本発明の方法は、前記試験値を１つ以上の閾値と比較することで、対象が肺がんを患う可能性及び／またはリスクを評価するステップを含む。
別の実施形態では、本発明の方法は、前記試験値を１つ以上の閾値と比較することで、肺がんのスクリーニング、モニタリング、診断、予後、予測、及び再発の臨床効率を高めるステップを含む。次いで、前記スクリーニング、モニタリング、診断、予後、予測の結果または成果は、試験値が閾値よりも高いかまたは低いかどうかに依存する。例えば、閾値を超える試験値は、一般に、対象が肺がんを患っていることの診断、予測、及び／または予後の臨床効率を示す及び／または高める。
ペプチドごとの係数は、統計的に決定するのが好ましい。一実施形態では、ペプチドごとの係数は、Ｒｉｂｂｉｎｇ Ｊ， Ｎｙｂｅｒｇ Ｊ， Ｃａｓｔｅｒ Ｏ ＆ Ｊｏｎｓｓｏｎ ＥＮ （２００７） Ｔｈｅ ｌａｓｓｏ−ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｃｏｖａｒｉａｔｅ ｍｏｄｅｌ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｉｎ ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｍｉｘｅｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｍｏｄｅｌｓ． Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ ３４： ４８５-５１７に開示される「Ｌａｓｓｏモデル」を用いて決定される。好ましいペプチドの具体的な係数は、以下に記載の実施例に開示している。
抗体のレベル及び／または各抗体の量に関係するパラメーターは、数値に変換するのが好ましい。アッセイのペプチドごとの係数、及びペプチドごとに別々に決定された数値に基づいて、所与の対象に特有の試験値が決定される。
診断ステップは、対象の試験値を所定の閾値と比較することで行われる。閾値は、例えば、Ｌａｓｓｏモデルを用いて統計的に決定されるのも好ましい。特に、閾値は、肺がんを患っているか患っていないかが分かっている多くの個人からの血液及び／または血清試料を用いることで統計的に決定することができる。閾値を決定するため、血液及び／または血清試料中の抗体のレベルの測定に用いた方法を考慮するのが好ましい。
いくつかの態様では、本発明は、検査キットに関する。「キット」という表現には、本明細書に記載されるように、固体マトリックスに結合されるかまたはすでに結合している本発明による少なくとも１つのペプチドまたはその変異体もしくはその組み合わせ及び必要に応じて指示書を含む。キットは、異なるペプチドが沈着される及び／または固定される固体支持表面を含むのが好ましい。例えば、表面は、プレート、フィルム、スライド、及び／またはウェル上に提供される。キットに用いるペプチドの支持体は、抗体結合アッセイを行うようになっているのが好ましい。特に、支持体は、ペプチドに例えば、共有的に、結合し、及び血液及び／または血清試料に暴露されるようになっている。好ましくは、キットの支持体表面及び／またはマトリックスは、非結合抗体を除去するために洗浄し、かつマーカーに暴露するのに適しているのが好ましい。ペプチドを含む支持体及び／またはマトリックスは、非共有的相互作用によって形成されたペプチド−抗体複合体のレベル及び／または量を検出する及び測定するのに適切な装置によって読み取られるようになっているのが好ましい。
キットのペプチドは、本発明の方法で用いるものと同じであるのが好ましい。従って、本明細書のどこかで定義される実施形態及び好ましい実施形態が、特に、本発明の方法とともに、本発明のキットに適用される。このことは、特に、使用するペプチドの選択だけでなく、サイズや数などの一般的なペプチドの特徴にも適用される。
一実施形態では、キットは、本発明による方法を実施するためのキットである。
一実施形態では、本発明の検査キットは、複数のウェルを含むマイクロタイタープレートを含み、各ウェルは、複数の領域を含み、複数の１つの特定のペプチドが、前記ウェルの特定領域に提供されるため、各領域は、特定のペプチドに特有である。例えば、本発明のキットは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、ＵＳＡから市販のものなどのマルチスポット及び／またはマルチアレイプレートを含む。例えば、プレートの各ウェルは、いくつかのスポットを含んでもよく、各スポットは、ペプチドで被膜されるかまたは被膜することができる。
実施例１：ペプチド選択および合成
ＢＡＲＤ１（配列番号４２〜５１）のアイソフォームの発現の研究後、配列番号１〜４１を含む４１個の異なるペプチドを定義し、選択した。これらの実験には、１つのアイソフォームのｓｉＲＮＡベースの特異的抑制、ウェスタンブロットでの潜在的な翻訳産物の抑制の確認、アイソフォームの過剰発現、及び正しいサイズの内因性タンパク質の発現の確認を伴った。
ＢＡＲＤ１（配列番号４２〜５１）のアイソフォームの発現の研究後、配列番号１〜４１を含む４１個の異なるペプチドを定義し、選択した。これらの実験には、１つのアイソフォームのｓｉＲＮＡベースの特異的抑制、ウェスタンブロットでの潜在的な翻訳産物の抑制の確認、アイソフォームの過剰発現、及び正しいサイズの内因性タンパク質の発現の確認を伴った。
アイソフォームγ（配列番号４７）の研究により、例えば、このアイソフォームがエクソン１〜３でコードされたタンパク質を発現することが確認された（エクソン４及びエクソン５〜１１の欠失は、エクソン５中の停止コドンにより発現されなかった）。これらの研究に基づいて、４１個のペプチドを定義した（配列番号１〜４１）。
配列番号１〜４１の４１個の異なるペプチドを、当業者に公知の標準ペプチド固相合成手順によって合成した。ペプチドの純度は、少なくとも８０％であった。ペプチドを緩衝液中１ｍｇ／ｍＬの原液に溶解させ、２００ｍＬのアリコートで−２０℃にて保存した。ペプチドをｐＨ９．６の炭酸系緩衝液に保存した。
配列番号１〜４１のほとんどのペプチドは、８〜約３０個のアミノ酸長の短断片である。大きな断片は、配列番号１３（ＥＸ４．．２）、配列番号１４（ＢＲＣＴ．２．）、配列番号２０（ＢＲＣＴ．１．）、配列番号２１（ＥＸ４．．１）、配列番号２３（ＬＩＮＫ）、配列番号２６（Ａｎｋ）である。
実施例２：ペプチドを用いたアッセイの調製
実施例１の４１個のペプチドを、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ ＭＳＤ技術プラットフォーム（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ， ＭＤ ２０８５０〜３１７３， Ｒｏｃｋｅｖｉｌｌｅ， ＵＳＡ）を用いてマイクロタイターウェル上に沈着させた。特に、各ペプチドを、マルチスポットプレートのスポット上に所定量で沈着させた。各マルチスポットアレイは、ペプチドを沈着する炭素被覆作用電極を含む。抗体結合の検出では、電気刺激により、スルホタグマーカー分子（ルテニウムＩＩトリス−ビピリジン−（４−メチルスルホナート）ＮＳＨエステルを介した光生成をもたらす。ペプチドのプレーティングは、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅで行った。各ウェルには、１０個の異なるスポットを含むため、１０個の異なるペプチドを、９６−ウェルマイクロタイタープレートの１つのウェルにプレートした。
実施例１の４１個のペプチドを、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ ＭＳＤ技術プラットフォーム（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ， ＭＤ ２０８５０〜３１７３， Ｒｏｃｋｅｖｉｌｌｅ， ＵＳＡ）を用いてマイクロタイターウェル上に沈着させた。特に、各ペプチドを、マルチスポットプレートのスポット上に所定量で沈着させた。各マルチスポットアレイは、ペプチドを沈着する炭素被覆作用電極を含む。抗体結合の検出では、電気刺激により、スルホタグマーカー分子（ルテニウムＩＩトリス−ビピリジン−（４−メチルスルホナート）ＮＳＨエステルを介した光生成をもたらす。ペプチドのプレーティングは、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅで行った。各ウェルには、１０個の異なるスポットを含むため、１０個の異なるペプチドを、９６−ウェルマイクロタイタープレートの１つのウェルにプレートした。
実施例３：患者及び対照対象の血液試料の分析
血液試料を肺（ｎ＝１７８）、結腸（ｎ＝８０）、良性乳房（ｎ＝９）、悪性乳房（ｎ＝１４）、良性卵巣（ｎ＝５０）、悪性卵巣（ｎ＝４３）、及び神経芽細胞腫（ｎ＝２０）のヒトがん患者及び健常対照（ｎ＝２６６）から収集した。性別及び年齢は、大部分の対象から分かっていた。
血液試料を肺（ｎ＝１７８）、結腸（ｎ＝８０）、良性乳房（ｎ＝９）、悪性乳房（ｎ＝１４）、良性卵巣（ｎ＝５０）、悪性卵巣（ｎ＝４３）、及び神経芽細胞腫（ｎ＝２０）のヒトがん患者及び健常対照（ｎ＝２６６）から収集した。性別及び年齢は、大部分の対象から分かっていた。
実施例２に記載のペプチド被覆マイクロタイタープレートを用いて血液試料を分析した。Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ２４００（ＳＩ２４００）装置とＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ ３．０ソフトウェアを用いて、血液試料中の抗体の量に関係する数値を生成した。
全ての患者の血清が、ＢＡＲＤ１の同じエピトープに対する抗体を含むわけではなかったが、がん患者で陽性だったエピトープ／ペプチドの異なる組み合わせについて広範な分布があったことが、データ分析により示された。一番特徴的な及び一番特徴的ではないペプチドをこれらの結果から決定した。
抗体がＢＡＲＤ１アイソフォーム上に存在したペプチドと特異的に反応したことを確認するため、短いペプチド断片と同じ方法で長い断片をスポットした。血清抗体の長い断片との反応性により、ペプチドで観察された結果が確認された。
短ペプチドとＢＡＲＤアイソフォームの長い断片との組み合わせにより、より多くのがん患者を検出できることが分かった。
実施例４：統計分析及びモデル構築
実施例３で得られたデータを統計的に分析した。データセットは、少なくとも１組の変数が測定されている３７９個の固有の試料からなる。いくつかの試料では、２回または３回の別々の測定を行い、平均をとった。変数は、血液試料を４０個のペプチドの１つに暴露させた時に測定された信号から得られた数値である。言い換えると、変数は、ペプチドの１つに特異的に結合している試料中の抗体の量に関係する値である。全体で、データセットは、４０個の変数の測定を含み、各々が１０個の変数の４つのサブセットに分割する（１０個の異なるペプチドを、１つのウェルの１０個の異なるスポットとしてプレートする）。各プレートは、１つのそのようなサブセットからペプチドの測定値を含み、４枚のプレートは、サブセットごとに分析されている。プレートは、分析した日付けで示されるであろう。いくつかの試料では、変数の１つのサブセットのみを測定したが、他の試料では、いくつかのサブセットの測定値が存在する。同じ変数が異なるプレート上で何回も測定されているいくつかの試料も存在する。性別及び年齢についての情報は、研究試料の大部分において入手可能である。がん試料については、より詳細な診断情報も提供する。
実施例３で得られたデータを統計的に分析した。データセットは、少なくとも１組の変数が測定されている３７９個の固有の試料からなる。いくつかの試料では、２回または３回の別々の測定を行い、平均をとった。変数は、血液試料を４０個のペプチドの１つに暴露させた時に測定された信号から得られた数値である。言い換えると、変数は、ペプチドの１つに特異的に結合している試料中の抗体の量に関係する値である。全体で、データセットは、４０個の変数の測定を含み、各々が１０個の変数の４つのサブセットに分割する（１０個の異なるペプチドを、１つのウェルの１０個の異なるスポットとしてプレートする）。各プレートは、１つのそのようなサブセットからペプチドの測定値を含み、４枚のプレートは、サブセットごとに分析されている。プレートは、分析した日付けで示されるであろう。いくつかの試料では、変数の１つのサブセットのみを測定したが、他の試料では、いくつかのサブセットの測定値が存在する。同じ変数が異なるプレート上で何回も測定されているいくつかの試料も存在する。性別及び年齢についての情報は、研究試料の大部分において入手可能である。がん試料については、より詳細な診断情報も提供する。
対照（健常）と肺がんの血液血清試料を判別する検査システムの予測力に着目した分析結果の概要を以下に示す。方法論と分析結果の違いについて論じる。
「Ｌａｓｓｏ」法は、異なるペプチド選択を用いて、モデルを構築するのに近年用いられ、その後、これらのモデルの予測能力を比較した（図１）。小さなデータセットを分析する場合、段階的共変量モデリング手順（ＳＣＭ）は、選択バイアスと低い予測性能という問題がある共変量モデルを生成する場合がある。ＳＣＭと比べて、Ｌａｓｓｏは、小さなデータセットまたは小さな部分群で予測共変量モデルを得る場合に、ＳＣＭよりも優れている（Ｒｉｂｂｉｎｇ Ｊ， Ｎｙｂｅｒｇ Ｊ， Ｃａｓｔｅｒ Ｏ ＆ Ｊｏｎｓｓｏｎ ＥＮ （２００７） Ｔｈｅ ｌａｓｓｏ−ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｃｏｖａｒｉａｔｅ ｍｏｄｅｌ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｉｎ ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｍｉｘｅｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｍｏｄｅｌｓ． Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ ３４： ４８５-５１７）。交差検証を用いて、Ｌａｓｓｏは、共変量モデルの検証を提供し、ユーザーが選択のためにＰ値を特定する必要はない。この方法により、がん試料と対照試料を区別するためのオリゴペプチドとＢＡＲＤ１断片の最適な組み合わせを得ることができた。最終的には、これは、がん試料と対照試料を区別することができる最良のペプチド組み合わせの選択をもたらす。最適を超えてペプチド数が増加しても、より強い予測力は生まないことが、図にも示されている。最適な２５個の変数（短ペプチド及び長い断片）を用いたモデリングは、９０個の肺がん試料対９４個の対照試料について行い、ＡＵＣ＝０．９６６が得られた。
Ｌａｓｓｏモデル構築及び特徴選択をＲ−ｐａｃｋａｇｅ：ｇｌｍｎｅｔを用いて交差検証した。３つのモデルは、２５個（配列番号１〜２５）、１７個（配列番号１〜１７）または１０個（配列番号１〜１０）のペプチドで構築されている。
図１は、近似モデルの二項式の逸脱度を示す。モデルに使用したペプチド数を上部に示す。交差検証した最良のモデルは、この曲線（２６個のペプチド）の最小値（第１の垂直点線）である。第２の点線は、モデル（この場合、１１個のペプチド）への交差検証に関してモデルが有意に異なっていない（エラーバーに示すように１標準誤差（１ｓｅ）内）値である。従って、１７個のペプチドのモデルは、統計的に意義があるが、１０個のペプチドのモデルは、統計的に意義がない。
２５個の変数（短ペプチド及び長い断片）（配列番号１〜２５）を用いたモデリングは、９０個の肺がん試料対９４個の対照試料について行い、ＡＵＣ＝０．９６６が得られた（図２Ａ）。モデリングのためのこれらの試料は、上述した全部で３７９個の入手可能な試料から選択した。また、このモデリングは、がんと対照をｐ＞０．０５で区別するのに十分な最小セットのペプチドを見つけるためにも行った。図２Ｂに示すＡＯＣ曲線では、１７個のペプチド（配列番号１〜１７）のモデルを使用し、図３Ｃでは、１０個のペプチド（配列番号１〜１０）のモデルを使用した。
Ｌａｓｓｏ法を用いて、対照対象とがん患者を区別するために共変量モデルを構築した。結果は、１００モデリングシリーズ（モデリングは１００回繰り返した）において、それぞれ、図Ａ、Ｂ、及びＣで４０個、３０個、及び１０個のペプチドを用いて図３Ａ〜３Ｃに示す。図Ａ〜Ｃの各々は、左から右に、代表的なＲＯＣ曲線；がん及び対照試料の相対信号値の分布を示す箱ひげ図；１００個のモデリングシリーズ（平均ＡＵＣは約０．８３）におけるＡＵＣ値分布を示す箱ひげ図である。
実施例５：２５個のペプチドのモデルに対するペプチド係数及びカットオフ値
以下の表１に示すように、予測因子値の算出を示すこの実施例は、各ペプチドに起因する係数に基づくものである。
以下の表１に示すように、予測因子値の算出を示すこの実施例は、各ペプチドに起因する係数に基づくものである。
予測因子＝１．８７８１５５×ｌｏｇ１０（＃１６値）−４９．１０８×ｌｏｇ１０（＃１１７値）−１６．４２８９×ｌｏｇ１０（＃２８６値）＋２４．１１７６７×ｌｏｇ１０（＃４９３値）−３．７４６７４×ｌｏｇ１０（＃５２３値）＋３９．８９１８１×ｌｏｇ１０（＃７２０値）＋３．４９７３３×ｌｏｇ１０（＃１１７／６３５値）−３．２１７４４×ｌｏｇ１０（＃５値）−１３．１５０４×ｌｏｇ１０（＃３４９値）−１９．７８×ｌｏｇ１０（＃４５３値）＋１０．３５３７×ｌｏｇ１０（Ａ２１／６３５値）＋２７．３７５４９×ｌｏｇ１０（＃６８／５２４値）−１２．５６１２×ｌｏｇ１０（＃１５値）−７．８２５８２×ｌｏｇ１０（＃１０９値）＋１５．０５７３２×ｌｏｇ１０（＃１３９値）＋１１．３８０４×ｌｏｇ１０（＃１４０値）＋４．０２４６９７×ｌｏｇ１０（＃１８８値）−８．８０７３×ｌｏｇ１０（＃３６８値）＋０．２４６６２５×ｌｏｇ１０（ＲＩＮＧ値）−０．２３９５２×ｌｏｇ１０（ＥＸ４．１値）−５．００９８９×ｌｏｇ１０（ＥＸ４．２値）−０．１７３５２×ｌｏｇ１０（ＬＩＮＫ値）＋０．７２６５６３×ｌｏｇ１０（ＢＲＣＴ１値）＋１．６４５８１５×ｌｏｇ１０（ＢＲＣＴ２値）＋３．０５９３１×ｌｏｇ１０（＃−４値）−１５．０９４８
値、例えば、「＃１６値」は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒによって決定されたパラメーターの数値に対応する。数値を上記の式「予測因子」に挿入することで、予測因子値を得て、これをカットオフ及び／または閾値と比較する。
種々のカットオフを推定し、陽性と陰性の区別に用いてもよい。各カットオフの選択は、モデルの特異性及び／または感度に影響を及ぼす。最大の特異性及び感度では、カットオフ＝０．０８１３１０２１である。
カットオフ値は、診断検査の結果に対する閾値を表す。算出した予測因子が＞０．０８１３１０２１である場合、対象は、がんと診断される（陽性検査結果）。算出した予測因子が＜０．０８１３１０２１である場合、検査結果は陰性である。
実施例６：肺がん女性対健常女性を区別するためのモデル
実施例４に記載のＬａｓｓｏ法を用いて、特に女性の肺がんを診断するためのモデルを開発した。このモデルでは、統計的に有意であり、優れたＡＵＣ値をもたらすモデルを得るために、１９個のペプチドが必要であることが分かった。１９個の異なるペプチドは、配列：配列番号１〜配列番号６；配列番号１１〜配列番号１４；配列番号１８〜配列番号２１；配列番号２６〜配列番号３０を有するペプチドである。
実施例４に記載のＬａｓｓｏ法を用いて、特に女性の肺がんを診断するためのモデルを開発した。このモデルでは、統計的に有意であり、優れたＡＵＣ値をもたらすモデルを得るために、１９個のペプチドが必要であることが分かった。１９個の異なるペプチドは、配列：配列番号１〜配列番号６；配列番号１１〜配列番号１４；配列番号１８〜配列番号２１；配列番号２６〜配列番号３０を有するペプチドである。
実施例７：肺がん男性対健常男性を区別するためのモデル
実施例４に記載のＬａｓｓｏ法を用いて、特に男性の肺がんを診断するためのモデルを開発した。このモデルでは、統計的に有意であり、優れたＡＵＣ値をもたらすモデルを得るために、２２個のペプチドが必要であることが分かった。２２個の異なるペプチドは、配列：配列番号１〜配列番号５；配列番号７；配列番号８；配列番号１１〜配列番号１３；配列番号１５；配列番号１８〜配列番号２０；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２６；配列番号２７；及び配列番号３１〜配列番号３４を有するペプチドである。
実施例４に記載のＬａｓｓｏ法を用いて、特に男性の肺がんを診断するためのモデルを開発した。このモデルでは、統計的に有意であり、優れたＡＵＣ値をもたらすモデルを得るために、２２個のペプチドが必要であることが分かった。２２個の異なるペプチドは、配列：配列番号１〜配列番号５；配列番号７；配列番号８；配列番号１１〜配列番号１３；配列番号１５；配列番号１８〜配列番号２０；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２６；配列番号２７；及び配列番号３１〜配列番号３４を有するペプチドである。
結論
１７８個の肺がん試料と２６６個の対照試料を分析した。データセットは、少なくとも１組の変数（ペプチドまたはポリペプチド）が測定されている３７９個の固有の試料からなる。全体で、データセットは、４０個の変数の測定を含み、各々が１０個の変数の４つのサブセットに分割する。
１７８個の肺がん試料と２６６個の対照試料を分析した。データセットは、少なくとも１組の変数（ペプチドまたはポリペプチド）が測定されている３７９個の固有の試料からなる。全体で、データセットは、４０個の変数の測定を含み、各々が１０個の変数の４つのサブセットに分割する。
４０個のペプチドの生データから、「Ｌａｓｓｏ」法を用いた独自分析を行い、異なるペプチド選択を統計的に評価した。例えば、２０個の選択されたペプチドを用いて、肺がん診断の予測性能が＞９５％（０．９７ＲＯＣ）で得られることが分かった。
これは、非常に決定的な結果であり、無症候者における肺がんの診断レベルの予測に十分な精度（＞９５％）を全て示唆するものである。これは、特に、長年にわたる多量の喫煙歴がある個人に当てはまる。
Claims (20)
- 哺乳類対象における肺がんのインビトロ及び／またはエクスビボ診断方法であって、
ａ）前記対象から採取した血液または血清試料に基づいて、ヒトＢＡＲＤ１のひと続きのアミノ酸配列（配列番号４２）及び／またはそのアイソフォーム（配列番号４３〜５１）を含む異なるペプチドに特異的に結合している抗体の量に関係するパラメーターを決定するステップと；
ｂ）前のステップで得られた前記パラメーターに基づいて、前記対象が肺がんを患っているかどうかを診断するステップと
を含む、方法。 - 対象が肺がんを患う可能性及び／またはリスクの評価方法であって、
ａ）前記対象から採取した血液または血清試料に基づいて、ヒトＢＡＲＤ１のひと続きのアミノ酸配列（配列番号４２）及び／またはそのアイソフォーム（配列番号４３〜５１）を含む異なるペプチドに特異的に結合している抗体の量に関係するパラメーターを決定するステップと；
ｂ）ステップａ）で測定した前記パラメーターから前記対象が肺がんを患う可能性及び／またはリスクを評価するステップと
を含む、方法。 - 肺がんのスクリーニング、モニタリング、診断、予後、予測、及び再発のためのインビトロ及び／またはエクスビボ方法、及び／または、肺がんのスクリーニング、モニタリング、診断、予後、予測、及び再発の臨床効率を高める方法における、ヒトＢＡＲＤ１のひと続きのアミノ酸配列（配列番号４２）及び／またはそのアイソフォーム（配列番号４３〜５１）を含む異なるペプチドの組み合わせの使用。
- 各個別のパラメーターが前記異なるペプチドの１つの特定のペプチドに結合している抗体の量に関係する複数のパラメーターを得るように、抗体の量に関係する前記パラメーターをペプチドごとに別々に決定する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記異なるペプチドが、異なるペプチドの組み合わせである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ステップｂ）が、前記パラメーターに基づいて、かつ、各ペプチドに特有の統計的に決定された係数から、前記対象の試験値を算出するステップを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記試験値を閾値と比較することで、前記対象が肺がんを患っているかどうかを診断するステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
- 前記ペプチドが、独立して、４〜３００個、好ましくは８〜２５０個のアミノ酸の長さを有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記異なるペプチドが、５〜３５個、好ましくは１１〜３０個、及びより好ましくは１７〜２８個の異なるペプチドからなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
- 異なるペプチドの組み合わせが、４１個のペプチドの群から選択され、４１個のペプチドの前記群の各ペプチドが、それぞれ、配列番号１〜４１からなる前記群の４１個のアミノ酸配列の１つを含む、及び／または、から実質的になる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記異なるペプチドが、いくつかの群のペプチド、Ａ群のペプチド、Ｂ群のペプチド、Ｃ群のペプチド、Ｄ群のペプチド、及びＥ群のペプチドを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記Ａ群が、配列番号１（＃２８６）；配列番号２（＃７２０）；配列番号３（＃４９３）；配列番号４（＃６８／５２４）；配列番号５（＃１４０）；配列番号６（＃１３９）；配列番号７（＃３４９）；及び配列番号８（＃１１７）；配列番号９（＃５）；及び配列番号１０（＃−４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、または、から実質的になる１つ以上のペプチドを含み、前記Ｂ群が、配列番号１１（＃１６）；配列番号１２（＃４５３）；配列番号１３（ＥＸ４．．２）；配列番号１４（＃ＢＲＣＴ２．２）；配列番号１５（＃１５）；配列番号１６（＃５２３）；及び配列番号１７（＃１０９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、または、から実質的になる１つ以上のペプチドを含み、前記Ｃ群が、配列番号１８（＃１１７／６３５）；配列番号１９（＃３６８）；配列番号２０（ＢＲＣＴ．１．）；配列番号２１（ＥＸ４．．１）；配列番号２２（＃１８８）；配列番号２３（ＬＩＮＫ）；配列番号２４（＃Ａ２１／６３５）；及び配列番号２５（ＲＩＮＧ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、または、から実質的になる１つ以上のペプチドを含み、前記Ｄ群が、配列番号２６（Ａｎｋ）；配列番号２７（＃Ａ２０／１２２）；配列番号２８（＃５４）；配列番号２９（＃４８／５２２）；配列番号３０（＃１４９）；配列番号３１（＃７３）；配列番号３２（＃Ａ−４）；配列番号３３（＃３ＯＲＦ）；及び配列番号３４（＃５５７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、または、から実質的になる１つ以上のペプチドを含み、前記Ｅ群が、配列番号３５（＃３１９）；配列番号３６（＃７０２）；配列番号３７（＃１７５）；配列番号３８（＃８４）；配列番号３９（＃Ａ２９）；配列番号４０（＃５４２）；及び配列番号４１（＃３０９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、または、から実質的になる１つ以上のペプチドを含み、ペプチドの前記組み合わせが、前記Ａ群から選択された１つ以上のペプチドと、前記Ｂ群、Ｃ群、Ｄ群、及び／またはＥ群の前記いずれか１つから選択された１つ以上のペプチドとを含む、請求項１１に記載の方法。
- 前記異なるペプチドが、前記Ａ群から選択された５つ以上のペプチドと；Ｂ群から選択された２つ以上のペプチドと；及びＣ群から選択された２つ以上のペプチドとを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記異なるペプチドが、少なくとも１０個の異なるペプチドを含み、前記１０個のペプチドの各々が、それぞれ、配列番号１〜１０からなる群から選択される１つのアミノ酸配列を含む、または、から実質的になる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記異なるペプチドが、配列番号１〜４；１１〜１３；１８〜２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
- 女性ヒト対象における肺がんのインビトロ及び／またはエクスビボ診断方法であって、
- 前記女性対象から採取した血液または血清試料に基づいて、少なくとも１９個の異なるペプチドに特異的に結合している抗体の量に関係するパラメーターを決定するステップであって、前記ペプチドが、それぞれ、配列番号１〜配列番号６；配列番号１１〜配列番号１４；配列番号１８〜配列番号２１；配列番号２６〜配列番号３０のアミノ酸配列を含むペプチドである、決定するステップと；
- 前のステップで得られた前記パラメーターに基づいて、前記女性対象が肺がんを患っているかどうかを診断するステップと
を含む、方法。 - 男性ヒト対象における肺がんのインビトロ及び／またはエクスビボ診断方法であって、
- 前記女性対象から採取した血液または血清試料に基づいて、少なくとも２２個の異なるペプチドに特異的に結合している抗体の量に関係するパラメーターを決定するステップであって、前記ペプチドが、それぞれ、配列番号１〜配列番号５；配列番号７；配列番号８；配列番号１１〜配列番号１３；配列番号１５；配列番号１８〜配列番号２０；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２６；配列番号２７；及び配列番号３１〜配列番号３４のアミノ酸配列を含むペプチドである、決定するステップと；
- 前のステップで得られた前記パラメーターに基づいて、前記男性対象が肺がんを患っているかどうかを診断するステップと
を含む、方法。 - 肺がんを診断するための診断検査キットであって、前記診断検査キットは、少なくとも１１個の異なるペプチドの組み合わせを含み、各ペプチドは、ヒトＢＡＲＤ１のひと続きのアミノ酸配列（配列番号４２）及び／またはそのアイソフォーム（配列番号４３〜５１）を含む、診断検査キット。
- 肺がんのスクリーニング、モニタリング、診断、予後、予測、及び再発の臨床効率を高める方法であって、
ａ）前記対象から採取した血液または血清試料に基づいて、ヒトＢＡＲＤ１のひと続きのアミノ酸配列（配列番号４２）及び／またはそのアイソフォーム（配列番号４３〜５１）を含む異なるペプチドに特異的に結合している抗体の量に関係するパラメーターを決定することと；
ｂ）、前のステップで得られた前記パラメーターに基づいて、前記対象が肺がんを患うリスク及び／または可能性が増しているかどうかを決定すること、
を含む、方法。 - 肺がんの発生と関連付けられた抗体のレベルを検出する及び／または測定するインビトロ及び／またはエクスビボ方法であって、
ａ）前記対象から採取した前記血液または血清試料に基づいて、ヒトＢＡＲＤ１のひと続きのアミノ酸配列（配列番号４２）及び／またはそのアイソフォーム（配列番号４３〜５１）を含む異なるペプチドに特異的に結合している抗体の量に関係するパラメーターを決定するステップ
を含む、方法。
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| IRMGARD IRMINGER-FINGER; PIERRE-ALAIN ANDRE; MAXIM PIYUGIN; ET AL: "CANCER-ASSOCIATED ONCOGENIC BARD1 ISOFORMS: FROM BIOMARKER EXPRESSION STUDIES TO DEVELOPMENT OF A BL", EUROPEAN RESPIRATORY JOURNAL, vol. VOL:40, NR:56, JPN5016011719, 1 September 2012 (2012-09-01), pages PAGE(S):1640 * |
| IRMINGER-FINGER I; P-A ANDRE; PILYUGIN M; HEGEDUS B; LAURENT G J; BIANCO A: "ABSTRACT B44: DEVELOPMENT OF A SERUM TEST FOR THE DETECTION OF LUNG CANCER BASED ON ONCOGENIC BARD1", CLINICAL CANCER RESEARCH, vol. VOL:18, NR:3_SUPPLEMENT, JPN5016011718, 1 February 2012 (2012-02-01), pages PAGE(S):B44 * |
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