CN106062562A - 肺癌诊断 - Google Patents

肺癌诊断 Download PDF

Info

Publication number
CN106062562A
CN106062562A CN201480071075.7A CN201480071075A CN106062562A CN 106062562 A CN106062562 A CN 106062562A CN 201480071075 A CN201480071075 A CN 201480071075A CN 106062562 A CN106062562 A CN 106062562A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
peptide
group
peptides
kinds
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201480071075.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106062562B (zh
Inventor
伊姆加德·艾尔明格-芬格
马克西姆·皮柳金
皮埃尔-阿拉因·安德烈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bard 1 AG
Bard1AG SA
Original Assignee
Bard 1 AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bard 1 AG filed Critical Bard 1 AG
Publication of CN106062562A publication Critical patent/CN106062562A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106062562B publication Critical patent/CN106062562B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明涉及用于检测抗体的方法、用于诊断肺癌的方法以及用于肺癌诊断的试剂盒。本发明的方法是基于受试者的血液或血清样品。根据优选的实施方案，本发明使用包含BARD1、其短肽和/或较大片段的氨基酸段的不同肽的组合。在优选的实施方案中，本发明的方法包括测量所述样品中结合各所述不同肽的自身免疫抗体的量并且应用统计学上确定的评估进行所述诊断。

Description

肺癌诊断
技术领域
本发明涉及用于诊断肺癌的方法、用于检测肺癌的方法、用于检测抗体的方法、其它方法和检测试剂盒以及诊断测试试剂盒。
现有技术和本发明的问题
肺癌是全世界癌症死亡的主要原因。除手术以外的治疗方法不是非常有效的并且导致耐药性。因此，迫切需要深入了解肺癌的病因学及其进展。结肠直肠癌是全世界癌症相关死亡的另一个主要原因并且是第四最常见的癌症。结肠直肠癌患者的存活和预后取决于肿瘤在诊断时的阶段。早期结肠直肠癌是可以治愈的。不幸的是，在诊断时超过57％的疾病已局部或远距离扩散。尽管在癌症的控制上投入了大量资金并取得了显著进步，但晚期结直肠癌患者的五年存活率仅为15％。
最近，许多团体通过将肿瘤的蛋白、RNA和微RNA与健康组织相比较来说明驱动肺癌的机理。除了TP53(肺癌中最频繁缺失或突变的基因)，p53-ARF途径的组分也不断地缺失、突变或表观遗传学修饰。关于结肠直肠癌，难题是理解分子基础，并且确定启动发展且推动进展的因素。涉及结肠直肠癌发作的分子事件和转移性进展仅部分得到了阐明。最近的研究已显示分子和生化标记在结肠直肠癌中的潜在用途，以预测对于化疗(如MLH1、MSH2、β-连环蛋白和p53)的结果和反应。
分子谱作为非小细胞肺癌(NSCLC)中的预测和预后参数而出现，包括参与DNA损伤修复的基因，诸如ERCC1、RRM1和BRCA1。已提出将乳腺癌易感性基因BRCA1的上调表达作为NSCLC中对治疗的反应的预后和预测标记。关于结肠直肠癌，BRCA1的研究主要局限于结肠直肠癌风险和BRCA1突变。一些研究试图将BRCA1突变与结肠直肠癌风险相关联，但没有得到任何明确的结论。基于当前有限可得的证据，BRCA突变携带者应被视为处于结肠直肠癌的高风险。然而，BRCA1表达在结肠直肠癌中的具体作用是不清楚的。
BRCA1在许多增生组织中被表达并且在DNA修复途径和细胞周期控制中作为肿瘤抑制基因起作用。BRCA1蛋白稳定性和功能取决于其与BARD1(BRCA1相关的RING结构域蛋白1)的相互作用。BRCA1-BARD1异二聚体具有E3泛素连接酶活性，因此通过泛素化来控制关键靶蛋白的稳定性。BARD1还参与大多数肺癌中缺乏的p53依赖性细胞凋亡。BARD1使p53稳定且促进其磷酸化，并且BARD1的表达是p53在发出细胞凋亡的信号中适当起作用所需要的。因此，BARD1在肿瘤抑制中起双重作用，作为BRCA1和p53两者的结合搭配物。一些研究已显示，在有丝分裂期间BARD1通过E2F转录性上调且通过磷酸化翻译后上调，并且重要地，这是有丝分裂所必需的。根据其它研究，已显示BRCA1和BARD1两者均与hMSH2相互作用，hMSH2是通常与遗传性非息肉性结肠直肠癌(HNPCC)相关的基因，并且hMSH2的突变似乎占HNPCC的大约30-40％。BRCA1-hMSH2信号传导过程的缺陷导致对肿瘤发生的易感性增加。
WO 98/12327(德克萨斯大学系统董事会(Board of Regents，the University ofTexas System))公开了几个基因，这些基因是在基于结合乳腺癌蛋白BRCA1的筛选测定中鉴定出来的。这些基因中的一个称为BARD1，它是与BRCA1相互作用的RING蛋白并且被设想用于各种癌症相关的诊断和治疗方法，特别是与乳腺癌、卵巢癌和子宫癌相关的那些癌症。
WO 2008/119802(日内瓦大学(Université de Genève))公开，在妇科癌症中，BARD1的具有缺失的同工型是过表达的且异常地定位至细胞质，并且其表达与乳腺癌和卵巢癌的不良预后相关。这些同工型的结构分析表明它们缺乏与BRCA1相互作用或诱导细胞凋亡的区域。这些同工型对妇科癌症具有特异性并且称为同工型α、β、η、γ、ε、δ以及Ω。
WO 2012/023112公开了BARD1的新颖的同工型，所述新颖的同工型特定地在肺癌和结肠癌中出现。公开了用于检测这些同工型的方法。
由于肺癌的严重性，存在提供用于诊断受试者中肺癌的有效方法的迫切需要。由于处于晚期状态中的受试者癌症的不能治愈性，存在提供允许早期诊断肺癌的方法的迫切需要。早期诊断显著地改善患有肺癌的受试者的预后。
本发明的一个目的是提供无创伤性或需要微创手术的诊断方法。可在血液样品基础上进行的诊断测试将是有利的。
本发明的另一个目的是提供一种用于诊断肺癌的快速、可靠、灵敏且特异性的测试。
本发明解决了上述问题。
发明概述
本发明提供适于诊断肺癌的方法、试剂盒和测定。
在一个方面，本发明提供一种用于检测和/或测量血液和/或血清样品中的抗体水平的方法，其中测量特异性结合不同肽的抗体的水平，其中所述肽包含人BARD1(SEQ IDNO：42)和/或其同工型(SEQ ID NO：43-51)的一段氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种用于检测和/或测量哺乳动物受试者的循环抗体水平的方法，其中检测对许多不同肽具有特异性的抗体，其中所述肽与BARD1相关并且/或者包含BARD1或其同工型中的任何一个的氨基酸序列的片段。
人BARD1的氨基酸序列(全长)以SEQ ID NO：42提供于所附序列表中。BARD1的同工型包括同工型α(alpha)(SEQ ID NO：43)；同工型π(pi)(SEQ ID NO：44)；同工型β(beta)(SEQ ID NO：45)；同工型κ(SEQ ID NO：46)；同工型γ(SEQ ID NO：47)；同工型λ(SEQ IDNO：48)；同工型(phi)(SEQ ID NO：49)；同工型ε(epsilon)(SEQ ID NO：50)；以及同工型η(eta)(SEQ ID NO：51)。
在一个方面，本发明提供一种通过检测哺乳动物受试者中循环抗体的水平来诊断肺癌的方法，其中检测对许多不同肽具有特异性的抗体，其中所述肽与BARD1相关并且/或者包含BARD1或其同工型中的任何一个的氨基酸序列的片段。
在一个方面，本发明提供一种用于测量和/或检测哺乳动物受试者中循环抗体水平的体外和/或离体方法，所述方法包括以下步骤：a)在取自受试者的血液或血清样品基础上，确定与特异性结合不同肽的循环血清抗体的量相关的参数，所述不同肽包含人BARD1(SEQ ID NO：42)和/或其同工型(SEQ ID NO：43-51)的一段氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种用于诊断哺乳动物受试者中肺癌的体外和/或离体方法，所述方法包括以下步骤：a)在取自受试者的血液或血清样品基础上，确定与特异性结合不同肽的循环血清抗体的量相关的参数，所述不同肽包含人BARD1(SEQ ID NO：42)和/或其同工型(SEQ ID NO：43-51)的一段氨基酸序列；b)在前一步骤获得的参数的基础上，诊断所述受试者是否患有肺癌。
在一个方面，本发明提供一种检测和/或测量与肺癌发生相关的抗体水平的体外和/或离体方法，所述方法包括以下步骤：a)在取自受试者的所述血液或血清样品基础上，确定与特异性结合不同肽的抗体的量相关的参数，所述不同肽包含人BARD1(SEQ ID NO：42)和/或其同工型(SEQ ID NO：43-51)的一段氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供一种用于评估受试者患肺癌的概率和/或风险的方法，所述方法包括以下步骤：a)在取自受试者的血液或血清样品基础上，确定与特异性结合不同肽的抗体的量相关的参数，所述不同肽包含人BARD1(SEQ ID NO：42)和/或其同工型(SEQID NO：43-51)的一段氨基酸序列；由在步骤a)中测量的参数评估所述受试者患肺癌的概率和/或风险。
在一个方面，本发明提供包含人BARD1(SEQ ID NO：42)和/或其同工型(SEQ IDNO：43-51)的一段氨基酸序列的不同肽的组合在本发明体外和/或离体方法中，例如在用于肺癌筛查、监测、诊断、预后、预测、复发的方法中，和/或在用于提高肺癌筛查、监测、诊断、预后、预测和复发的临床效率的方法中的用途。
在一个方面，本发明提供一种用于检测和/或确定存在于血液和/或血清样品中的抗体水平的方法，所述方法包括以下步骤：提供来自哺乳动物受试者的血液或血清样品；使所述血液或血清样品与结合不同肽的一个或多个表面和/或固体基质接触，所述肽包含人BARD1(SEQ ID NO：42)和/或其同工型(SEQ ID NO：43-51)的一段氨基酸序列，其中所述接触是处在足以通过抗原-抗体相互作用将存在于所述样品中的抗体与不同肽结合的条件下；移除血液或血清样品用于将任何未结合的抗体从一个或多个表面或固体基质移除；确定与所述表面和/或基质结合的抗原-抗体复合物的水平。
在一个方面，本发明提供一种用于诊断哺乳动物受试者中肺癌的方法，所述方法包括以下步骤：提供来自哺乳动物受试者的血液或血清样品；使所述血液或血清样品与结合不同肽的一个和/或多个表面或固体基质接触，所述肽包含人BARD1(SEQ ID NO：42)和/或其同工型(SEQ ID NO：43-51)的一段氨基酸序列，其中所述接触是处在足以通过抗原-抗体相互作用将存在于所述样品中的抗体与不同肽结合的条件下；移除血液或血清样品用于将任何未结合的抗体从表面和/或基质移除；确定与所述表面和/或基质结合的抗原-抗体复合物的水平；以及在前一步骤获得的水平的基础上，诊断所述受试者是否患有肺癌。
在一个方面，本发明提供一种用于诊断女性人类受试者中肺癌的体外和/或离体方法。在优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：在取自女性受试者的血液或血清样品基础上，确定与特异性结合至少19种不同肽的抗体的量相关的参数，其中所述肽是分别包含氨基酸序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：26至SEQ ID NO：30的肽；以及，在前一步骤获得的参数的基础上，诊断所述女性受试者是否患有肺癌。
在一个方面，本发明提供一种用于诊断男性人类受试者中肺癌的体外和/或离体方法。在优选的实施方案中，此方法包括以下步骤：在取自男性受试者的血液或血清样品基础上，确定与特异性结合至少22种不同肽的抗体的量相关的参数，其中所述肽是分别包含氨基酸序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：11至SEQID NO：13；SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：27；以及SEQ ID NO：31至SEQ ID NO：34的肽；以及，在前一步骤获得的参数的基础上，诊断所述男性受试者是否患有肺癌。
在一个方面，本发明提供一种用于诊断受试者中肺癌的体外和/或离体方法，所述方法包括以下步骤：
a)-将不同肽的组合暴露于受试者的血液或血清样品，其中所述肽选自包含人BARD1(SEQ ID NO：42)或其同工型(SEQ ID NO：43-51)的一段氨基酸序列的肽，并且其中所述肽独立地具有4至300个氨基酸的长度；
-确定与所述样品中结合每种所述肽的抗体的量相关的参数；
b)由前一步骤获得的参数来确定所述受试者被诊断为肺癌阳性还是阴性。
在一些方面中，本发明提供用于进行本发明方法的试剂盒。优选地，所述试剂盒包括至少4种不同肽。
在一个方面，本发明提供一种用于诊断肺癌的诊断测试试剂盒，其中所述诊断测试试剂盒包括至少11种不同肽的组合，每种肽包含人BARD1(SEQ ID NO：42)和/或其同工型(SEQ ID NO：43-51)的一段氨基酸序列。在一个实施方案中，所述不同肽选自由包含根据SEQ ID NO：1至41中任一个的氨基酸序列的肽组成的组。
本发明的其它方面和优选实施方案在下文和所附权利要求中限定。本发明的其它特征和优点对于技术人员来说，将通过以下给出的优选实施方案的描述而变得显而易见。
附图简述
图1示出拟合模型(此处是逻辑回归模型)的偏差。所示模型是用于肺癌的诊断试剂盒质量(以区分力(discriminative power)的方式)的量度，并且用于依据本发明的实施方案来比较不同模型。
图2A至图2C示出根据本发明诊断测试模型实施方案的接受者操作特征(ROC)曲线和曲线下面积(AUC)值(越高越好，最大值＝1)。(A)表示最佳25-肽模型(min)，AUC＝0.966，优异的区分能力；(B)17-肽模型(1se)，AUC＝0.927，良好的区分能力；(C)10-肽模型(AUC＜0.828)；较差的区分能力。
图3A至图3C示出支持向量机(SVM)分类器分别基于40、30和10种肽(变量)的性能。每个图A至C从左到右示出代表性ROC曲线；展示针对癌症和对照样品的相对信号值分布的箱线图；展示100个建模系列中AUC值分布(均值为～0.83)的箱线图。
优选实施方案的详述
在一些实施方案中，本发明涉及诊断的方法和用途、检测哺乳动物受试者的血液和/或血清抗体的方法、用于检测和/或测量与肺癌发生相关的抗体水平的方法、用于评估受试者患肺癌的概率和/或风险的方法。本发明还涉及用途和试剂盒。
在一些实施方案中，本发明的方法包括检测和/或测量血液和/或血清样品中抗体水平的步骤。在一些实施方案中，本发明的方法包括检测和/或测量哺乳动物受试者的循环抗体水平的步骤。所述抗体优选地是自身免疫抗体。
在一个实施方案中，本发明的方法是离体和/或体外方法。本发明的方法优选地不直接在人类或动物身体中进行。在一些实施方案中，本发明的方法包括提供血液样品的步骤。优选地，例如通过使用例如采血针的毛细血管采血法来取得血液样品，例如抽出几滴血液。还可通过静脉血液取样(静脉穿刺术)来提供血液样品。优选地，本发明的方法在先前通过常规技术取自受试者的样品基础上进行。在一些实施方案中，血液取样步骤不是本发明方法的一部分。
因此，在一些实施方案中，本发明的方法包括提供血液或血清样品的步骤。优选地，血液和/或血清样品取自哺乳动物受试者。
出于本发明的目的，受试者优选地是哺乳动物或人。更优选地，受试者是人。根据一个实施方案，受试者是具有吸烟史的人。因此，诊断方法优选地是针对现在是或一直以来是吸烟者的人特别设计的。在优选的实施方案中，诊断方法优选地是针对具有严重的长期吸烟史的人特别设计的。
血液样品中的抗体水平可被例如定量测量和/或半定量测量。在一些实施方案中，本发明的方法包括确定与样品中的抗体和/或循环抗体的量相关的参数的步骤。优选地，所述参数是与存在于样品中的抗体量相关的数值。所述数值优选地使用合适的读取和数据处理设备在自动化过程中产生，如将在本说明书中其它地方所例证。
在一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：a)在取自受试者的血液或血清样品基础上，确定与特异性结合不同肽的循环血清抗体的量相关的参数，所述不同肽包含人BARD1(SEQ ID NO：42)和/或其同工型(SEQ ID NO：43-51)的一段氨基酸序列。与血清抗体的量相关的参数可表示和/或对应于所述样品中的抗体水平。
本发明的肽优选地是分离的和/或纯化的肽。根据优选的实施方案，所述肽是重组肽。根据一个实施方案，所述肽是合成肽。合成化学方法(诸如固相肽合成)可用于合成根据本发明的多肽。可借助于蛋白质/肽纯化领域中的任何已知技术来进行这些肽的纯化。示例性技术包括离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法和免疫亲和法。
在本发明的实施方案中，确定血液样品中抗体水平的步骤和/或所述步骤a)包括以下步骤：
1)使所述血液或血清样品与结合所述不同肽的一个或多个表面和/或固体基质接触，其中所述接触是处在足以通过抗原-抗体相互作用将存在于所述样品中的抗体与不同肽结合的条件下；
2)移除血液或血清样品用于将来自表面和/或基质的任何未结合的抗体从一个或多个表面或固体基质移除；
3)通过测量与所述表面和/或基质结合的抗原-抗体复合物水平来确定与循环血清抗体的量相关的所述参数。
表达“固体基质(solid matrix)”和“固体基质(solid matrices)”包括适合用于进行免疫测定或根据本发明方法的任何固相载体。所述固体基质包括珠粒、微粒、纳米粒子、管、织物或板、膜、切片、孔，由玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、硝化纤维素、石英、陶瓷、右旋糖酐或其它材料形成或涂布。例如，固体基质是微量滴定孔的形式，诸如96-孔或312-孔微量滴定板。在一些实施方案中，“固体基质”和/或表面是指碳材料或适合作为例如电化学发光测定中的电极材料的其它材料。
例如在本发明的方法和试剂盒中，可通过吸附或化学耦合至固相载体来进行根据本发明的肽到固体基质的固定和/或结合。可使用本领域中用于将蛋白质或肽固定至固体载体的任何已知方式。根据本发明的肽可由诸如通过酰胺或酯键的共价结合或者吸附的技术来共价或非共价结合至固体基质。可使用诸如生物素和亲和素或抗体和抗原的结合对来结合肽。在肽附着于固体基质之后，可用阻断溶液(含有诸如牛血清白蛋白的阻断蛋白)来孵育固体基质以减少测试样品中抗体到载体表面的非特异性吸附。根据一个实施方案，根据本发明的肽可例如在本发明试剂盒的固体基质上直接合成。
出于本说明书的目的，表达“抗原-抗体复合物”是指通过将样品中的抗体结合至本发明的肽而形成的复合物，本发明的肽优选地提供于表面和/或固体载体上。因此，出于本说明书的目的，“抗原-抗体复合物”也可被称为“肽-抗体复合物”。在所述步骤3)中，保留在表面和/或基质上的抗体优选地是形成抗原-抗体复合物的那些抗体，其中所述肽用作针对所述抗体的抗原。
优选地通过例如用合适的洗涤缓冲液(诸如PBS)来洗涤和/或冲洗一个或多个表面和/或固体基质，来进行移除所述血液和/或血清样品的步骤2)。优选地，此步骤不破坏可能已在步骤1)中出现的抗原-抗体。
在一个实施方案中，步骤3)包括在步骤1)之后和/或在步骤2)之后向一个或多个表面或固体基质中添加标记分子的步骤，所述标记与血液或血清样品的抗体(抗体形成了与所述表面和/或基质结合的抗原-抗体复合物)相互作用和/或与之结合。
标记分子优选地是产生或可被诱导以产生可在信号读取步骤中被读取的信号的实体。通常，标记分子与抗体，特别是与抗原-抗体复合物相结合或以某种形式相结合。因此，标记的存在通常表明抗原-抗体复合物的存在，并且更确切地说，表明对所述肽具有特异性的抗体的存在。
标记可包括共价连接至产生信号的化合物或分子(诸如染料等)的抗体或抗体片段。或者，标记可以是可与抗体直接缀合的分子，所述抗体以抗原-抗体复合物的形式结合到表面和/或固体基质上。
对于技术人员来说存在许多类型的可用标记，诸如例如产生光信号的标记(染料)、产生磁信号的标记(例如，磁珠)和产生放射性信号的标记(例如，用于放射免疫测定的放射性标记)。
在一个实施方案中，本发明的方法(例如，步骤a))包括产生和/或测量信号的步骤，所述信号与所述样品中分别结合至各肽的抗体的量相关。在一个实施方案中，所述方法包括测量信号的步骤，所述信号取决于结合至所述表面和/或基质的抗原-抗体复合物的存在和/或数量。
在优选实施方案中，标记分子可被诱导以产生可用合适的读取设备来读取的信号。因此，在一些实施方案中，本发明的方法包括生成和测量信号的步骤，所述信号取决于结合至所述表面和/或基质的抗原-抗体复合物的存在和/或数量和/或受其影响，其中所述复合物的数量影响所述信号的性质、强度和/或力度。
取决于所使用的标记分子，技术人员将选择适当的方法用于生成信号，诸如例如，在ELISA情况下选择用于酶的底物，或例如在电化学发光的情况下应用电力。
信号读取优选地使用合适的读取设备在自动化过程中进行。优选地，平板读数器被用于测量所述信号。例如，如果测量光信号，那么读取设备可包括光传感器，例如光电倍增管和/或照相机。例如，可使用电荷耦合器件(CCD)照相机。
读取设备通常由信号的测量值直接计算或确定与血液样品中的抗体量相关的数值参数。在电化学发光检测(Meso Scale Discovery，USA)的情况下，SECTOR Imager 6000和2400是可商购获得的成像检测系统。此类装置运行由在测定板上读取的信号直接计算数值的合适的软件。在ELISA情况下，例如，常规ELISA平板读数器可用于确定与抗体的量相关的数值参数。
一般来说，用于进行步骤a)和/或用于测量血液样品中抗体水平的方法包括光学检测方法(例如ELISA)、质量变化检测(例如表面等离子体共振、质谱法)和电学检测(例如，阻抗、光谱学、电化学)技术。
在一个实施方案中，例如通过放射免疫测定、免疫荧光测定或通过酶联免疫吸附测定，以及例如基于抗体对蛋白质的免疫测定来以免疫化学方法确定血液样品中的抗体水平。
如技术人员将了解，以单数形式使用的词语“肽”包括提及多个同样的和/或相同的肽，例如固定在微量滴定板的一个点上的多个相同肽(就序列和/或结构而言)。
表达“不同肽”通常是指具有不同结构和/或氨基酸序列的肽。通常，表达“不同肽”更确切地是指若干多个或组的肽(多个的多个)，其中每个多个或组的特征在于所述多个和/或组内肽的氨基酸序列和/或结构的本质。另一方面，“不同肽”包含在不同的多个和/或组中，不同之处在于它们所含有的肽具有不同结构和/或不同序列。因此，出于本说明书的目的，表达“不同肽”并不旨在意指“具有相同氨基酸序列的不同个体肽分子”。
依据一个实施方案，针对每种肽分别地确定与抗体的量相关的参数，以便获得多个所述参数，其中每个单独参数与结合至所述不同肽的一种特定肽的抗体的量相关。
在一个实施方案中，所述不同肽是不同肽的组合。
在本发明方法的一个实施方案中，针对所述不同肽中的每个分别地确定抗体的量。具体地说，针对是本发明方法、试剂盒和/或测定的一部分的肽中的每个，产生与存在于样品中的抗体的量相关的值和/或参数。优选地，针对不同肽中的每个，确定特异性结合至肽的抗体水平。
本发明的方法包括使用多个不同肽并且测量结合至各不同肽的抗体水平。
在一个实施方案中，所述肽被提供在微量滴定板的一个或多个孔中。优选地，在本发明的方法中，将所述受试者的样品添加到所述一个或多个孔。在一个实施方案中，每个孔包括几个区域，并且其中每个区域包括所述不同肽的组合中选择的多个特定的、限定的肽。
在一个实施方案中，所述不同肽的所有肽独立地具有4至300、优选8至250个氨基酸的长度。在优选实施方案中，所述肽具有8至200、更优选8至150、甚至更优选8至100并且最优选8至50个氨基酸的长度。
在一些实施方案中，肽是例如约6至30个氨基酸长度的短片段，并且在其它实施方案中，肽是具有例如100-300、优选130-260个氨基酸长度的较长片段。在一些实施方案中，用于本发明方法和试剂盒的肽包括较短和较长片段和长度介于以上范围之间的可能片段，例如30-100个氨基酸。
在一个实施方案中，所述不同肽由5至35、优选11至30，并且最优选17至28种不同肽组成。根据优选的实施方案，所述不同肽包括十一(11)种或更多种不同肽。
在优选的实施方案中，所述不同肽选自四十一种肽的组，其中所述四十一种肽的组中的每种肽分别包含和/或基本上由包括SEQ ID NO：1至41的组的四十一种氨基酸序列中的一种组成。优选地，所述不同肽是不同肽的组合，其中所述组合分别由41种不同肽形成，其中每种肽包含和/或基本上由包括SEQ ID NO：1至41的组的四十一种氨基酸序列中的一种组成。
出于本说明书的目的，表达“基本上由……组成”是指至少85％、优选至少90％、甚至更优选至少95％，并且最优选97％或更高的序列同一性。例如，“基本上由……组成”是指98％、99％并且最优选99.5％的序列同一性。出于本说明书的目的，通过使用因特网(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov)上的基本蛋白blast与预设标准参数和数据库选择来确定序列同一性百分比。这种序列比较工具基于以下两个出版物中详述的算法：StephenF.Altschul，Thomas L.Madden，Alejandro A.Jinghui Zhang，Zheng Zhang，WebbMiller，和David J.Lipman(1997)，″Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation ofprotein database search programs″，Nucleic Acids Res.25：3389-3402。StephenF.Altschul，John C.Wootton，E.Michael Gertz，Richa Agarwala，Aleksandr Morgulis，Alejandro A.和Yi-Kuo Yu(2005)″Protein database searches usingcompositionally adjusted substitution matrices″，FEBS J.272：5101-5109。
标准参数包括blastp选择(蛋白-蛋白BLAST、针对短输入序列的参数自动调节；期望阈值10、字号3、矩阵BLOSUM62的使用；空位罚分：存在空位：11，空位延伸：1；条件合成得分矩阵调整(conditional compositional score matrix adjustment)，无过滤器并且无掩蔽)。例如当比较序列或原始序列中的任一个缺乏氨基酸残基、具有另外的氨基酸残基和/或具有由另一个残基取代的一个或多个氨基酸残基时，比较序列相对于原始序列的序列同一性减小。与如本文所定义的任何序列具有低至80％序列同一性的序列仍可提供功能性，即，适合作为本发明试剂盒和方法中的肽。
在一个实施方案中，本发明涉及选择可用于本发明方法，特别是用于诊断肺癌的肽。在一些实施方案中，依据本发明建立不同的肽组，其中所述不同肽可选自这些肽组中的一个或多个。优选地，将所述肽分成五(5)个组，它们是A-E组。
因此，在一个实施方案中，所述不同肽包括几个肽组：A肽组、B肽组、C肽组、D肽组以及E肽组。
在一个实施方案中，所述A组包括包含或基本上由选自由以下各项组成的组的氨基酸序列组成的肽：SEQ ID NO：1(#286)；SEQ ID NO：2(#720)；SEQ ID NO：3(#493)；SEQ IDNO：4(#68/524)；SEQ ID NO：5(#140)；SEQ ID NO：6(#139)；SEQ ID NO：7(#349)；SEQ IDNO：8(#117)；SEQ ID NO：9(#5)；以及SEQ ID NO：10(#-4)。
在一个实施方案中，所述B组包括包含或基本上由选自由以下各项组成的组的氨基酸序列组成的一种或多种肽：SEQ ID NO：11(#16)；SEQ ID NO：12(#453)；和SEQ ID NO：13(EX4..2)、SEQ ID NO：14(BRCT.2.)、SEQ ID NO：15(#15)、SEQ ID NO：16(#523)；以及SEQID NO：17(#109)。
在一个实施方案中，所述C组包括包含或基本上由选自由以下各项组成的组的氨基酸序列组成的一种或多种肽：SEQ ID NO：18(#117/635)；SEQ ID NO：19(#368)；SEQ IDNO：20(BRCT.1.)、SEQ ID NO：21(EX4..1)；SEQ ID NO：22(#188)、SEQ ID NO：23(LINK)、SEQID NO：24(#A21/635)；以及SEQ ID NO：25(RING)。
在一个实施方案中，所述D组包括包含或基本上由选自由以下各项组成的组的氨基酸序列组成的一种或多种肽：SEQ ID NO：26(Ank)；和SEQ ID NO：27(#A20/122)、SEQ IDNO：28(#54)；SEQ ID NO：29(#48/522)和SEQ ID NO：30(#149)；SEQ ID NO：31(#73)；SEQ IDNO：32(#A-4)；SEQ ID NO：33(#3ORF)；以及SEQ ID NO：34(#557)。
在一个实施方案中，所述E组包括包含或基本上由选自由以下各项组成的组的氨基酸序列组成的一种或多种肽：SEQ ID NO：35(#319)、SEQ ID NO：36(#702)；SEQ ID NO：37(#175)；SEQ ID NO：38(#84)；SEQ ID NO：39(#A29)SEQ ID NO：40(#542)以及SEQ ID NO：41(#309)。
在一个实施方案中，所述不同肽包括选自所述A组的一种或多种肽以及选自所述B、C、D和/或E组中的所述任何一组的一种或多种肽。
在一个实施方案中，所述不同肽包括选自所述A组的一种或多种肽、选自所述B组的一种或多种肽，以及选自所述C、D和/或E组的一种或多种肽。
在一个实施方案中，所述不同肽包括选自所述A组的一种或多种肽、选自所述B组的一种或多种肽、选自所述C组的一种或多种肽，以及选自所述D和/或E组的一种或多种肽。
在一个实施方案中，所述不同肽包括选自所述A组的三种或更多种肽，以及选自所述B、C、D和/或E组中的所述任何一组的三种或更多种肽。
在一个实施方案中，所述不同肽包括选自所述A组的三种或更多种肽、选自所述B组的两种或更多种肽，以及选自所述C、D和/或E组的两种或更多种肽。
在一个实施方案中，所述不同肽包括选自所述A组的三种或更多种肽、选自所述B组的两种或更多种肽、选自所述C组的两种或更多种肽，以及选自所述D和/或E组的两种或更多种肽。
在一个实施方案中，所述不同肽的组合包括选自所述A组的五种或更多种肽；选自B组的两种或更多种肽，以及选自C组的两种或更多种肽。
在一个实施方案中，所述不同肽的组合缺乏来自E组的任何肽。
在一个实施方案中，所述不同肽包括包含选自SEQ ID NO：1-5的氨基酸序列的两种或更多种肽；选自肽SEQ ID NO：11-13的一种或多种肽；和选自SEQ ID NO：18-20的一种或多种肽。
在一个实施方案中，所述不同肽包括包含选自SEQ ID NO：1-5的氨基酸序列的三种或更多种肽；选自肽SEQ ID NO：11-13的两种或更多种肽；和选自SEQ ID NO：18-20的两种或更多种肽。
在一个实施方案中，所述不同肽包括包含选自SEQ ID NO：1-5的氨基酸序列的四种或更多种肽；选自肽SEQ ID NO：11-13的三种或更多种肽；和选自SEQ ID NO：18-20的三种或更多种肽。
在一个实施方案中，所述不同肽的组合包括十一(11)种或更多种不同肽，其中所述肽分别包含SEQ ID NO 1-5；11-13和18-20的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述不同肽的组合包括至少10种不同肽，其中所述10种肽中的每个分别包含或基本上由选自由SEQ ID NO：1至10组成的组的一种氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，所述不同肽的组合包括至少17种不同肽，其中所述17种肽中的每个分别包含或基本上由选自由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：17组成的组的一种氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，所述不同肽的组合包括至少25种不同肽，其中所述25种肽中的每个分别包含或基本上由选自由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：25组成的组的一种氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，本发明的方法是一种用于诊断人类女性受试者中肺癌的方法。在另一个实施方案中，本发明的方法是一种用于诊断人类男性受试者中肺癌的方法。
如果所述方法特别针对人类女性受试者，那么不同肽优选地包括十九(19)种不同肽，其中所述不同肽分别包含氨基酸序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：11至SEQID NO：14；SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：26至SEQ ID NO：30。
如果所述方法特别针对人类男性受试者，那么不同肽优选地包括二十二(22)种不同肽，其中所述不同肽分别包含氨基酸序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：7；SEQID NO：8；SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：27；以及SEQ ID NO：31至SEQ IDNO：34。
在一个实施方案中，本发明的方法包括诊断所述受试者是否患有肺癌的步骤。优选地在所述血清和/或血液样品中的抗体水平的基础上，和/或在与循环血清抗体的量相关的参数的基础上进行所述诊断。
在一个实施方案中，本发明的方法包括在所述参数和/或所述信号的基础上并且由对每种肽具有特异性的统计学上确定的系数来计算受试者的测试值的步骤。本发明的方法可包括通过将所述测试值与阈值相比较来诊断所述受试者是否患有肺癌的步骤。
在另一个实施方案中，本发明的方法包括通过将所述测试值与一个或多个阈值相比较来评估受试者患肺癌的概率和/或风险的步骤。
在另一个实施方案中，本发明的方法包括通过将所述测试值与一个或多个阈值相比较来提高肺癌筛查、监测、诊断、预后、预测和复发的临床效率的步骤。于是，所述筛查、监测、诊断、预后、预测的结果(result)或结果(outcome)取决于测试值是高于还是低于阈值。例如，超过阈值的测试值通常指示和/或提高诊断、预测和/或预后受试者患肺癌的临床效率。
优选地以统计学方法确定每种肽的系数。在一个实施方案中，使用“Lasso模型”来确定每种肽的系数，所述模型公开于：Ribbing J，Nyberg J，Caster O和Jonsson EN(2007)The lasso-a novel method for predictive covariate model building in nonlinearmixed effects models。J Pharmacokinet Pharmacodyn 34：485-517。优选肽的特定系数在下文实施例中公开。
优选地将抗体的水平和/或与各抗体的量相关的参数转化成数值。在针对测定的每种肽的系数和针对每种肽分别确定的数值的基础上来确定对给定受试者具有特异性的测试值。
通过将受试者的测试值与预定阈值相比较来完成诊断步骤。优选地还使用例如lasso模型来以统计学方法确定阈值。具体地说，可通过使用来自已知是否患有肺癌的多个个体的血液和/或血清样品来以统计学方法确定阈值。为了确定阈值，优选地考虑用于测量血液和/或血清样品中抗体水平的方法。
在一些方面，本发明涉及一种测试试剂盒。表达“试剂盒”包括如本文所述的待耦合或已经耦合至固体基质的根据本发明的至少一种肽或其变体或其组合，和任选的说明性材料。优选地，试剂盒包括不同肽沉积和/或固定在其上的固体载体表面。例如，所述表面提供于板、膜、切片和/或孔上。优选地，用于试剂盒中所用的肽的载体适于执行抗体结合测定。具体地说，载体适于例如共价地结合肽，并且适于暴露于血液和/或血清样品。优选地，试剂盒的载体表面和/或基质优选地适于被洗涤以用于移除未结合的抗体并且适于暴露于标记。包含肽的载体和/或基质优选地适于被合适的装置读取以用于检测和测量通过非共价相互作用形成的肽-抗体复合物的水平和/或量。
试剂盒的肽优选地与用于本发明方法的那些肽是一样的。因此，特别是关于本发明方法的实施方案和在本说明书其它地方限定的优选实施方案也适用于本发明的试剂盒。这尤其适用于选择所使用的肽，但也适用于一般肽特征，诸如大小和数目。
在一个实施方案中，试剂盒是用于进行根据本发明的方法的试剂盒。
在一个实施方案中，本发明的测试试剂盒包括包含多个孔的微量滴定板，其中每个孔包括多个区域，并且其中多个一种特定肽提供于所述孔的特定区域中，使得每个区域是特定肽所特有的。例如，本发明的试剂盒包括多点和/或多阵列板，诸如从美国的MesoScale Discovery公司可商购获得的那些。例如，板的每个孔可包括若干点，其中每个点是由或可由肽涂布。
实施例
实施例1：肽的选择与合成
根据关于BARD1同工型(SEQ ID NO：42-51)表达的研究来限定和选择包含SEQ IDNO：1至41的四十一种不同肽。这些实验涉及一个同工型基于siRNA的特异性抑制和蛋白质印迹中潜在翻译产物的抑制的确认，以及所述同工型的过表达和正确大小的内源性蛋白的表达的确认。
例如关于同工型γ(SEQ ID NO：47)的研究确认，这种同工型表达在外显子1至3中编码的蛋白(由于外显子5中的终止密码子，外显子4和外显子5-11的缺失不表达)。基于这些研究，限定四十一种肽(SEQ ID NO：1至41)
通过本领域技术人员已知的标准肽固相合成程序来合成SEQ ID NO：1至41的四十一种不同肽。肽的纯度为至少80％。将肽溶解于在缓冲液中1mg/mL的储备溶液中并且按200mL的等分试样在-20℃储存。将肽储存在pH 9.6的碳酸盐缓冲液中。
SEQ ID NO：1至41中的大部分肽是8至约30个氨基酸长度的短片段。较长片段是SEQ ID NO：13(EX4..2)、SEQ ID NO：14(BRCT.2.)、SEQ ID NO：20(BRCT.1.)、SEQ ID NO：21(EX4..1)、SEQ ID NO：23(LINK)、SEQ ID NO：26(Ank)。
实施例2：使用肽的测定的准备
使用Meso Scale MSD技术平台(Mesoscale，MD 20850-3173，Rockeville，USA)将实施例1的41种肽沉积到微量滴定孔中。具体地说，以确定的量将每种肽沉积到多点板的点中。每个多点阵列包括肽沉积于其上的碳涂层工作电极。为了检测抗体结合，电刺激通过带磺基标签的标记分子(钌II三联吡啶-(4-甲基磺酸盐)NSH酯而产生光。通过Mesoscale执行肽的涂铺。每个孔含有10个不同点，使得10种不同肽涂铺于96-孔微量滴定板的一个孔中。
实施例3：分析患者和对照受试者的血液样品
从肺(n＝178)、结肠(n＝80)、良性乳腺(n＝9)、恶性乳腺(n＝14)、良性卵巢(n＝50)、恶性卵巢(n＝43)以及神经母细胞瘤(n＝20)人类癌症患者和健康对照者(n＝266)收集血液样品。大多数受试者的性别和年龄是已知的。
使用实施例2中所述的肽涂布微量滴定板来分析血液样品。使用Meso ScaleSECTOR Imager 2400(SI2400)装置和Discovery Workbench 3.0软件，产生与血液样品中的抗体量相关的数值。
数据分析表明，并不是所有患者的血清均包含针对BARD1相同表位的抗体，而是存在癌症患者中呈阳性的不同表位/肽组合的广泛分布。从这些结果来确定最独特和最不独特的肽。
为了证实抗体特异性地与呈现在BARD1同工型上的肽反应，以与较短肽片段相同的方式来点样较长片段。血清抗体与较长片段的反应性确认了关于肽所观察到的结果。
发现，短肽和BARD同工型较长片段的组合允许检测出更多癌症患者。
实施例4：统计分析和模型建立
用统计学方法分析在实施例3中获得的数据。数据集由至少一组变量已被测量的379个独特样品组成。对于一些样品，进行2或3次独立测量并且取平均值。变量是在使血液样品暴露于40种肽中的一种时由测量的信号获得的数值。换句话说，变量是与样品中特异性结合至肽中的一种的抗体的量相关的值。总的来说，数据集含有40个变量的测量值，将这些测量值分成各有10个变量的四个子集(10种不同肽在一个孔中被涂铺成10个不同点)。每个板含有来自一个此类子集的肽的测量值，并且已分析四个板的每个子集。当被分析时，这些板将通过日期被提及。对于一些样品，仅测量一个变量子集，而对于其它样品，测量几个子集。在不同板上，还有一些样品的相同变量被测量若干次。大多数所研究样品的有关性别和年龄的信息是可得的。癌症样品更详细的诊断信息也被提供。
以下给出关注于测试系统在区分对照(健康)血液血清样品与肺癌血液血清样品中的预测能力的分析结果概述。讨论方法学与分析结果的差异。
最近“Lasso”法用于使用不同肽选择来建立模型并且然后比较这些模型的预测能力(图1)。当分析小数据集逐步协变量建模过程(stepwise covariate modelingprocedure(SCM))时可能产生具有选择偏差和差预测性能的协变量模型。与SCM相比，lasso在小数据集或小子组中获得预测协变量模型的方面优于SCM(Ribbing J，Nyberg J，CasterO和Jonsson EN(2007)The lasso-a novel method for predictive covariate modelbuilding in nonlinear mixed effects models.J Pharmacokinet Pharmacodyn 34：485-517)。使用交叉验证，lasso提供协变量模型的验证并且不需要使用者指定用于选择的P值。这种方法允许获得寡肽和BARD1片段的最佳组合以用于区分癌症与对照样品。这最终导致选择允许区别癌症与对照样品的最好的肽组合。所述图还表明，超过最佳的增加的肽数目不产生更强的预测能力。使用最佳25个变量(短肽和较长片段)对90个肺癌样品进行的建模相对94个对照样品进行的建模产生AUC＝0.966。
Lasso模型建立和特征选择是使用R-package：glmnet进行交叉验证的。已使用25(SEQ ID NO：1-25)、17(SEQ ID NO：1-17)或10(SEQ ID NO：1-10)种肽建立了三个模型。
图1示出拟合模型的二项式偏差。用于所述模型的肽的数目在顶部示出。最好的交叉验证模型是此曲线的最小值(第一条垂直虚线)(26种肽)。第二条虚线是其中模型关于对模型的交叉验证(在这种情况下，有11种肽)没有明显不同的值(标准误差1(1se)内，显示为误差棒)。因此，具有17种肽的模型是统计学上有意义的，但具有10种肽的模型没有统计学意义。
使用25个变量(较短肽和较长片段)(SEQ IF NO：1-25)对90个肺癌样品进行的建模相对94个对照样品进行的建模产生AUC＝0.966(图2A)。用于建模的这些样品选自上述的全部379个可得样品。进行所述建模的目的还在于找出足以区分癌症与对照的最小肽集合，其中p＞0.05。对于图2B中示出的AOC曲线，使用具有17种肽(SEQ IF NO：1-17)的模型，并且对于图3C，使用具有10种肽(SEQ IF NO：1-10)的模型。
为了区分对照受试者与癌症患者，使用Lasso法来建立协变量模型建立。结果在图3A至3C中示出，在100个建模系列(建模重复100次)中，在图A、B和C中分别使用40、30和10种肽。每个图A至C从左到右示出代表性ROC曲线；展示癌症和对照样品的相对信号值分布的箱线图；展示100个建模系列中AUC值分布(AUC均值为～0.83)的箱线图。
实施例5：具有25种肽的模型的肽系数和截断值
此实施例说明，预测因子值的计算是基于归因于如以下表1所示的每种肽的系数。
预测因子＝1.878155x log10(#16值)-49.108x log10(#117值)-16.4289x log10(#286值)+24.11767x log10(#493值)-3.74674x log10(#523值)+39.89181x log10(#720值)+3.49733x log10(#117/635值)-3.21744x log10(#5值)-13.1504x log10(#349值)-19.78x log10(#453值)+10.3537x log10(A21/635值)+27.37549x log10(#68/524值)-12.5612x log10(#15值)-7.82582x log10(#109值)+15.05732x log10(#139值)+11.3804xlog10(#140值)+4.024697x log10(#188值)-8.8073x log10(#368值)+0.246625x log10(RING值)-0.23952x log10(EX4.1值)-5.00989x log10(EX4.2值)-0.17352x log10(LINK值)+0.726563x log10(BRCT1值)+1.645815x log10(BRCT2值)+3.05931x log10(#-4值)-15.0948
所述值，例如“#16值”对应于通过Meso Scale SECTOR Imager确定的参数的数值。通过将数值插入以上“预测因子”公式，获得与截断值和/或阈值相比较的预测因子值。
表1：25种肽的模型
各种截断值被估算并且可能用于区别阳性或阴性。各截断值的选择影响模型的特异性和/或灵敏性。对于最大特异性和灵敏性，截断值＝0.08131021。
截断值表示针对诊断测试结果的阈值。如果计算预测因子＞0.08131021，那么受试者被诊断为患有癌症(阳性测试结果)。如果计算预测因子＜0.08131021，那么测试结果是阴性。
实施例6：用于在女性中区分肺癌对比健康的模型
使用在实施例4中所描述的Lasso法，开发用于特异性地诊断女性中肺癌的模型。对于这种模型，发现需要19种肽以获得统计学上显著并且产生优异AUC值的模型。这19种不同肽是具有以下序列的肽：SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：26至SEQ ID NO：30。
实施例7：用于在男性中区分肺癌对比健康的模型
使用在实施例4中所描述的Lasso法，开发用于特异性地诊断男性中肺癌的模型。对于这种模型，发现需要22种肽以获得统计学上显著并且产生优异AUC值的模型。这22种不同肽是具有以下序列的肽：SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：8；SEQID NO：11至SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：27；以及SEQ ID NO：31至SEQ ID NO：34。
结论
我们已分析了178个肺癌样品和266个对照样品。数据集由至少一组变量(肽或多肽)已被测量的379个独特样品组成。总的来说，数据集含有40个变量的测量值，将这些测量值分成各有10个变量的四个子集。
从40种肽的原始数据，进行使用“Lasso”法的独立分析来以统计学方法评估不同肽选择。发现，例如针对肺癌诊断，使用20种选定的肽获得＞95％的预测性能(0.97ROC)。
这是高度结论性的结果，其给出了足以实现无症状个体中肺癌的预测至诊断水平的准确性(＞95％)的所有指示。这尤其适用于具有严重的长期吸烟史的个体。

Claims (20)

1.一种用于诊断哺乳动物受试者中肺癌的体外和/或离体方法，所述方法包括以下步骤：
a)在取自所述受试者的血液或血清样品基础上，确定与特异性结合不同肽的抗体的量相关的参数，所述不同肽包含人BARD1(SEQ ID NO：42)和/或其同工型(SEQ ID NO：43-51)的一段氨基酸序列；
b)在前一步骤获得的所述参数的基础上，诊断所述受试者是否患有肺癌。
2.一种用于评估受试者患肺癌的概率和/或风险的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在取自所述受试者的血液或血清样品基础上，确定与特异性结合不同肽的抗体的量相关的参数，所述不同肽包含人BARD1(SEQ ID NO：42)和/或其同工型(SEQ ID NO：43-51)的一段氨基酸序列；
b)由在步骤a)中测量的所述参数评估所述受试者患肺癌的概率和/或风险。
3.不同肽的组合在用于肺癌筛查、监测、诊断、预后、预测、复发的体外和/或离体方法中，和/或在用于提高肺癌筛查、监测、诊断、预后、预测和复发的临床效率的方法中的用途，所述不同肽包含人BARD1(SEQ ID NO：42)和/或其同工型(SEQ ID NO：43-51)的一段氨基酸序列。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中针对每种肽分别地确定与抗体的量相关的参数，以便获得多个所述参数，其中每个单独参数与结合至所述不同肽的一种特定肽的抗体的量相关。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述不同肽是不同肽的组合。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤b)包括在所述参数基础上并且由对每种肽具有特异性的统计学上确定的系数来计算所述受试者的测试值的步骤。
7.如权利要求6所述的方法，其还包括通过将所述测试值与阈值相比较来诊断所述受试者是否患有肺癌的步骤。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肽独立地具有4至300、优选8至250个氨基酸的长度。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述不同肽由5至35、优选11至30，并且最优选17至28种不同肽组成。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中不同肽的组合选自四十一种肽的组，其中所述四十一种肽的组中的每种肽分别包含和/或基本上由包括SEQ ID NO：1至41的组的四十一种氨基酸序列中的一种组成。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述不同肽包括几个肽组：A肽组、B肽组、C肽组、D肽组以及E肽组。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述A组包括包含或基本上由选自由以下各项组成的组的氨基酸序列组成的一种或多种肽：SEQ ID NO：1(#286)；SEQ ID NO：2(#720)；SEQ IDNO：3(#493)；SEQ ID NO：4(#68/524)；SEQ ID NO：5(#140)；SEQ ID NO：6(#139)；SEQ IDNO：7(#349)；以及SEQ ID NO：8(#117)；SEQ ID NO：9(#5)；和SEQ ID NO：10(#-4)，所述B组包括包含或基本上由选自由以下各项组成的组的氨基酸序列组成的一种或多种肽：SEQ IDNO：11(#16)；SEQ ID NO：12(#453)；SEQ ID NO：13(EX4..2)；SEQ ID NO：14(#BRCT2.2)以及SEQ ID NO：15(#15)；SEQ ID NO：16(#523)；和SEQ ID NO：17(#109)，所述C组包括包含或基本上由选自由以下各项组成的组的氨基酸序列组成的一种或多种肽：SEQ ID NO：18(#117/635)；SEQ ID NO：19(#368)；SEQ ID NO：20(BRCT.1.)；SEQ ID NO：21(EX4..1)；SEQ ID NO：22(#188)以及SEQ ID NO：23(LINK)；SEQ ID NO：24(#A21/635)；和SEQ ID NO：25(RING)，所述D组包括包含或基本上由选自由以下各项组成的组的氨基酸序列组成的一种或多种肽：SEQ ID NO：26(Ank)；SEQ ID NO：27(#A20/122)；SEQ ID NO：28(#54)；SEQ ID NO：29(#48/522)以及SEQ ID NO：30(#149)；SEQ ID NO：31(#73)；SEQ ID NO：32(#A-4)；SEQ ID NO：33(#3ORF)以及SEQ ID NO：34(#557)，所述E组包括包含或基本上由选自由以下各项组成的组的氨基酸序列组成的一种或多种肽：SEQ ID NO：35(#319)；SEQ ID NO：36(#702)；SEQ IDNO：37(#175)；SEQ ID NO：38(#84)；SEQ ID NO：39(#A29)SEQ ID NO：40(#542)以及SEQ IDNO：41(#309)，所述肽组合包括选自所述A组的一种或多种肽，和选自所述B、C、D和/或E组中所述任一组的一种或多种肽。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述不同肽包括选自所述A组的五种或更多种肽；选自B组的两种或更多种肽，以及选自C组的两种或更多种肽。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述不同肽包括至少10种不同肽，其中所述10种不同肽中的每种分别包含或基本上由选自由SEQ ID NO：1至10组成的组的一种氨基酸序列组成。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述不同肽包括包含选自由SEQ ID：1-4；11-13；18-2组成的组的氨基酸序列的肽。
16.一种用于诊断女性人类受试者中肺癌的体外和/或离体方法，所述方法包括以下步骤：
-在取自所述女性受试者的血液或血清样品基础上，确定与特异性结合至少19种不同肽的抗体的量相关的参数，其中所述肽是分别包含氨基酸序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：26至SEQ IDNO：30的肽；
-在前一步骤获得的所述参数的基础上，诊断所述女性受试者是否患有肺癌。
17.一种用于诊断男性人类受试者中肺癌的体外和/或离体方法，所述方法包括以下步骤：
-在取自所述女性受试者的血液或血清样品基础上，确定与特异性结合至少22种不同肽的抗体的量相关的参数，其中所述肽是分别包含氨基酸序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：27；以及SEQID NO：31.至SEQ ID NO：34的肽；
-在前一步骤获得的所述参数的基础上，诊断所述男性受试者是否患有肺癌。
18.一种用于诊断肺癌的诊断测试试剂盒，其中所述诊断测试试剂盒包括至少11种不同肽的组合，每种肽包含人BARD1(SEQ ID NO：42)和/或其同工型(SEQ ID NO：43-51)的一段氨基酸序列。
19.一种用于提高肺癌筛查、监测、诊断、预后、预测和复发的临床效率的方法，所述方法包括：
a)在取自所述受试者的血液或血清样品基础上，确定与特异性结合不同肽的抗体的量相关的参数，所述不同肽包含人BARD1(SEQ ID NO：42)和/或其同工型(SEQ ID NO：43-51)的一段氨基酸序列；
b)在前一步骤获得的所述参数的基础上，确定所述受试者是否处于患肺癌的增加的风险和/或可能性之中。
20.一种检测和/或测量与肺癌发生相关的抗体水平的体外和/或离体方法，所述方法包括以下步骤：
a)在取自所述受试者的所述血液或血清样品基础上，确定与特异性结合不同肽的抗体的量相关的参数，所述不同肽包含人BARD1(SEQ ID NO：42)和/或其同工型(SEQ ID NO：43-51)的一段氨基酸序列。
CN201480071075.7A 2013-11-06 2014-11-05 肺癌诊断 Active CN106062562B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13191739.5 2013-11-06
EP20130191739 EP2871480A1 (en) 2013-11-06 2013-11-06 Lung Cancer Diagnosis
PCT/EP2014/073834 WO2015067666A1 (en) 2013-11-06 2014-11-05 Lung cancer diagnosis

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106062562A true CN106062562A (zh) 2016-10-26
CN106062562B CN106062562B (zh) 2021-11-30

Family

ID=49518831

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480071075.7A Active CN106062562B (zh) 2013-11-06 2014-11-05 肺癌诊断

Country Status (10)

Country Link
US (1) US11137402B2 (zh)
EP (2) EP2871480A1 (zh)
JP (1) JP6698537B2 (zh)
KR (1) KR102245621B1 (zh)
CN (1) CN106062562B (zh)
AU (1) AU2014345613B2 (zh)
CA (1) CA2929457C (zh)
IL (1) IL245477B (zh)
SG (1) SG11201603343QA (zh)
WO (1) WO2015067666A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10538556B2 (en) 2016-11-07 2020-01-21 Colorado State University Research Foundation Anti-HIV peptides

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040234959A1 (en) * 2000-09-01 2004-11-25 Fabien Gautier Truncated bard1 protein, and its diagnostic and therapeutic uses
CN103238069A (zh) * 2010-08-17 2013-08-07 日内瓦大学 肺癌和结直肠癌中的bard1同工型及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4586697A (en) 1996-09-20 1998-04-14 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods comprising bard1 and other brca1 binding proteins
JP2008048733A (ja) * 2006-07-27 2008-03-06 Okayama Univ 癌の発症危険率を予測する方法
CA2681360A1 (en) 2007-04-02 2008-10-09 Universite De Geneve Deletion bearing bard1 isoforms and use thereof
WO2012038932A2 (en) * 2010-09-24 2012-03-29 Ayanda Biosystems Sa Kits for detecting breast or ovarian cancer in a body fluid sample and use thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040234959A1 (en) * 2000-09-01 2004-11-25 Fabien Gautier Truncated bard1 protein, and its diagnostic and therapeutic uses
CN103238069A (zh) * 2010-08-17 2013-08-07 日内瓦大学 肺癌和结直肠癌中的bard1同工型及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR102245621B1 (ko) 2021-04-29
CA2929457A1 (en) 2015-05-14
CN106062562B (zh) 2021-11-30
CA2929457C (en) 2022-09-20
IL245477A0 (en) 2016-06-30
WO2015067666A1 (en) 2015-05-14
US20160282347A1 (en) 2016-09-29
IL245477B (en) 2019-12-31
JP2016536622A (ja) 2016-11-24
EP3066473A1 (en) 2016-09-14
EP2871480A1 (en) 2015-05-13
US11137402B2 (en) 2021-10-05
KR20160102979A (ko) 2016-08-31
JP6698537B2 (ja) 2020-05-27
AU2014345613B2 (en) 2020-07-09
AU2014345613A1 (en) 2016-05-19
SG11201603343QA (en) 2016-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109142755B (zh) 一种诊断早期食管鳞状细胞癌的四种自身抗体联合检测试剂盒及应用
KR101431062B1 (ko) 유방암 진단용 다중 바이오마커 세트, 이의 검출 방법 및 이에 대한 항체를 포함하는 유방암 진단키트
KR102240473B1 (ko) 방법, 어레이 및 그의 용도
EP2404998A2 (en) Composition and method for diagnosing kidney cancer and for predicting prognosis for kidney cancer patient
CA2607133A1 (en) Composition and method for diagnosing esophageal cancer and metastasis of esophageal cancer
BRPI0709374A2 (pt) técnica de obtenção de impressão digital de apolipoproteìna e métodos relacionados á mesma
CN102504027A (zh) 一种多表位tk1抗体的制备及其在人群体检筛查中早期肿瘤检测和风险预警中的应用
CN106950366B (zh) 一种acpa阴性的ra诊断标志物及其应用
CN106062562A (zh) 肺癌诊断
US20220003768A1 (en) Serological biomarkers for early diagnosis of lung cancer
CN110554190B (zh) 来源于人外周血cd4+t细胞的生物标志物在胰腺癌预后中的应用
CN109735619A (zh) 与非小细胞肺癌预后相关的分子标志物及其应用
Sun et al. Epitope mapping of antibodies in C-reactive protein assay kits by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry explains differential results across kits
CN106093241A (zh) 可用于检测喉癌的标志物及其用途
KR20130005087A (ko) 대장암 진단용 단백질 마커 멜라노트랜스페린 및 이에 대한 항체를 포함하는 대장암 진단 키트
KR101395919B1 (ko) 벤조에이피렌 오염 검출을 위한 마커 및 키트
CN109517049A (zh) Linc00266-1多肽作为实体瘤标志物的应用
CN115385990B (zh) 分离的多肽及其在用于诊断或预测卵巢癌中的用途和检测设备
KR101467037B1 (ko) 햅토글로빈의 질량분석용 조성물 및 이를 이용하여 암을 진단하는 방법
KR102131860B1 (ko) 아르기닌이 메틸화된 ggt1에 특이적으로 결합하는 대장암 진단용 바이오마커 조성물
CN108931641A (zh) 特发性炎性肌病检测的生物标志物及其用途
KR20100064684A (ko) ＨＢｘ 형질전환 마우스 유래의 단백질 마커에 특이적인 항체를 포함하는 간암 진단 및 스크리닝용 키트 및 이를 이용한 간암 진단 및 스크리닝 방법
KR101431064B1 (ko) 유방암 진단용 단백질 마커 탄산탈수효소 1, 이의 검출 방법 및 이에 대한 항체를 포함하는 유방암 진단키트
KR100882231B1 (ko) 유방암 진단용 단백질 마커 플라빈 환원효소 및 이에 대한항체를 포함하는 유방암 진단키트
KR20130102689A (ko) 유방암 진단용 단백질 마커 아포리포단백질 ｃ-1, 이의 검출 방법 및 이에 대한 항체를 포함하는 유방암 진단키트

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1229426

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant