JP2016532450A - 凍結保存容器および方法 - Google Patents

Abstract

本書で画成されるように、内部空洞と内部空洞内に位置しているフレキシブルライナとを有するフレーム、または内部空洞を有する変形可能なフレーム、のいずれかを含む物品である。いずれのフレームも、浮遊している生細胞を含む液体などのサンプルを受け入れて、このサンプルを冷却凍結させて固体サンプルにすることができる。固体サンプルは、広範囲に亘って解凍することなく、フレキシブルライナを備えたフレームまたは変形可能なフレームを有する物品から、容易に排出することができる。固体サンプルは、本書で開示される方法および装置によって、物品から迅速に移動させることができる。

Description

関連出願の説明

本出願は、その内容全体が参照することにより本書に組み込まれる、２０１３年８月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／８６６７８５号の優先権の利益を米国特許法第１１９条の下で、また２０１３年１１月１５日に出願された米国特許出願第１４／０８１，３２６号の優先権の利益を米国特許法第１２０条の下で主張するものである。

本書で述べられる任意の刊行物または特許文献の全開示が、参照することにより組み込まれる。

本開示は、一般に凍結保存容器と、凍結保存容器の作製方法および使用方法に関する。

実施形態において本開示は、凍結保存容器またはコンテナと、例えば生体物質の凍結保存容器の作製方法および使用方法を提供する。開示される凍結保存容器は、液体サンプルを受け入れ、液体サンプルを固体サンプルに凍結させ、凍結保存された固体サンプルを再構成などのさらなる処理のために別の容器内に都合よくかつ効率的に分注するための、変形可能な内部チャンバを有する。

クライオチューブなど例示的な物品１００の態様を示した図 生体物質を受入れ用容器内に排出するよう物品２００と組み合わせて使用されている、図１の外部排出物品１５０を示した図 クライオチューブ用ホルスタ３００の上面断面図 クライオチューブ用ホルスタ３００の側面断面図 プランジャまたは外部排出物品１５０のいくつかの代わりの実施形態を示した図 クライオチューブからサンプルを移動させるために分離されたものとして組み合わせて使用される、複数の連動クライオチューブ５１０および連動排出器５５０の一例を示した図 クライオチューブからサンプルを移動させるために一体的なアセンブリの組合せとして使用される、複数の連動クライオチューブ５１０および連動排出器５５０の一例を示した図 ホルダまたは平面パネル６４０によって一緒に結合されかつ連動閉鎖具６１０を含む、個々のチューブ５１１を備えた一例の連動クライオチューブアレイ５１０を示した図 組込み式プランジャまたは排出器７５０を備えた、例示的なクライオチューブ７００の前面図および側面図 図７の組込み式プランジャまたは排出器７５０の実施形態の、プランジャセグメント７６０の展開を示した図 凍結した生体物質（図示なし）を受入れ用容器１６０内に排出するよう、内袋１２０を押して袋を変形させている、展開された図７のプランジャまたは排出器７５０およびセグメント７６０を示した図 手動で変形可能な本体と横長形状のチャンバ構造を有する、クライオチューブ７１１と、その動作を示した図

本開示の種々の実施形態を、図面がある場合にはこれを参照して詳細に説明する。種々の実施形態の参照は本発明の範囲を限定するものではなく、本発明はこれに添付される請求項の範囲によってのみ限定される。さらに、本明細書に明記されるいずれの例も制限的なものではなく、請求される発明の多くの考えられる実施形態のいくつかを単に明記したものである。

実施形態において、開示される物品、およびこの物品を作製および使用する開示される方法は、例えば以下で論じられるようなものを含め、１以上の有利な特徴または態様を提供する。請求項のいずれかで挙げられる特徴または態様は、一般に本発明のあらゆる面に適用可能である。任意の１つの請求項に明記される任意の単一または複数の特徴または態様は、任意の他の１以上の請求項に明記される任意の他の説明される特徴または態様と、組み合わせてもよいし、あるいは置換してもよい。

定義
「含む」または同様の用語は、包含するが限定しないことを意味し、すなわち含むものであって排他的なものではない。

本開示の実施形態の説明において採用される、例えば組成物における成分の量、濃度、容積、プロセス温度、プロセス時間、収量、流量、圧力、粘度、および同様の値、およびその範囲、または構成要素の寸法、および同様の値、およびその範囲、を修飾する「約」は、例えば、材料、組成物、合成物、濃縮物、構成部品、製造物品、または使用配合物、を用意するために使用される典型的な測定および取扱手順を通じて、これらの手順における不用意なエラーを通じて、方法を実行するために使用される出発材料または成分の、製造、ソース、または純度における違いを通じて、および同様の考慮事項を通じて、生じ得る数量の変動を称する。「約」という用語は、特定の初期濃度または混合での組成物または配合物の、経年変化に起因して異なる量、および、特定の初期濃度または混合での組成物または配合物の、混合または処理に起因して異なる量も含有する。

「随意的な」または「随意的に」とは、続いて説明される事象、状況、または構成要素が、存在する可能性もあるし、または存在しない可能性もあること、さらにその説明が、その事象、状況、または構成要素が存在する場合と存在しない場合とを含むことを意味する。

本書で使用される単数形は、他に既定がなければ、少なくとも１つ、すなわち１以上を意味する。

通常の当業者に周知の略記が使用され得る（例えば、時間に対して「ｈ」または「ｈｒｓ」、グラムに対して「ｇ」または「ｇｍ」、ミリリットルに対して「ｍＬ」、室温に対して「ｒｔ」、ナノメートルに対して「ｎｍ」、および類似の略記）。

組成物、成分、添加物、寸法、条件、および同様の点に対して開示された、具体的な値および好適な値、さらにその範囲は、説明のためのみのものであり、他の定義された値、または定義された範囲内の他の値を排除しない。本開示の物品および方法は、明白または潜在的なその中間値および範囲を含め、本書で説明される任意の値、または値の任意の組み合わせ、特定の値、より具体的な値、さらに好適な値を含み得る。

凍結保存は、細胞または組織を極低温で凍結させて、化学的および生物学的活性に起因する損傷を低減するプロセスである。生体物質を凍結保護物質と共に培地内に置き、この組合せを、液体窒素温度（−１９６℃）での冷凍に耐え得るガラスのクライオバイアルまたはプラスチックのクライオチューブ内に分注する。一般に哺乳類細胞は、１分当たりおよそ１℃の制御された速さでの凍結を必要とする。これは通常、−８０℃の冷凍室に２４時間置かれたときにこの速さの凍結を可能にする、物品内で行われる。この処理に続いて、クライオチューブまたはクライオバイアルを液体窒素の気相（−１５２℃）中に置いてもよい。ユーザは、液体窒素格納容器内でクライオチューブがどこに置かれるについては関与したくない。しかしながら、液体窒素はクライオチューブおよびクライオバイアル内に入り込むこともある。解凍手順の際に生存能力を維持するよう細胞を急速に暖めると、クライオチューブまたはクライオバイアル内の液体窒素汚染物質が急速に窒素ガスになり、これが膨張してクライオチューブまたはクライオバイアルを破裂させる可能性がある。

凍結した生体物質を解凍する従来の方法では、例えば、１）生体物質のクライオチューブまたはクライオバイアルを液体窒素格納容器から取り出し、２）クライオチューブまたはクライオバイアルを３７℃の水浴に運び、継続的に回転させて生体物質を急速解凍し（解凍期間がかかり過ぎた場合、浸透圧の変化と凍結保護物質の存在に起因して、細胞が生存能力を失う可能性がある。細胞がどのくらい速く生存能力を失うかは、細胞の種類に依存する）、さらに３）解凍された生体物質をクライオチューブまたはクライオバイアルから分注して、培養培地内に置く。凍結保護物質の濃度を著しく減少させるのに十分な容積の培養培地を、細胞培養に使用される容器内に入れてもよいし、あるいは、凍結保護物質を細胞ペレットから分離させる遠心分離に続いて凍結保護物質を取り除くことができるように、培地を遠心分離チューブに入れてもよい。

コンテナの破裂のリスクを低減し、汚染のリスクを低減し、さらに生体物質の生存能力を向上させる、凍結保存コンテナは、細胞培養産業のワーカーにとって有益であろう。

実施形態において本開示は物品を提供し、この物品は、
フレームであって、例えば剛性のまたは柔軟性のない性質、非常に柔軟な可逆的または変形可能な性質、または剛性と非常に柔軟なものとの間の中間の柔軟性または曲げ性の性質、を有する、管または類似の筐体などの、内部空洞を有するフレーム、および、
内部空洞内に位置し、かつ随意的にはフレームの外部またはフレームの内部空洞内などの、フレームの一部に取り付けられた、フレキシブルライナ、
を備え、フレームは、フレキシブルライナ内に液体サンプルを受け入れるための、さらに内部空洞内の受け入れた液体サンプルを可逆的に密封する、例えば、ねじ式キャップ、圧入プラグ、スナップ嵌合プラグ、または類似の部材などの、閉鎖部材を受けるための、第１の開口端部を有し、かつフレームは、例えば物品用のホルダに係合するための、または代わりにフレキシブルライナとサンプル内容物とを空洞内の第１の位置から移動させる排出器を受け入れるための、第２の開口端部を有している。

実施形態においてフレームは、第１の開口端部と第２の開口端部とを有する、例えば中空円筒または中空円錐でもよい。

実施形態において、内部空洞内のライナは、例えば生分解可能なフレキシブルライナでもよい。

実施形態において閉鎖部材は、例えば、フレームのねじ山に係合するよう適合されたねじ式キャップ、フレームに係合するストラップを有する、圧入プラグ、またはこれらの組合せ、のうちの少なくとも１つでもよい。

実施形態において、フレームは例えば複数のフレームでもよく、フレキシブルライナは例えば複数のフレキシブルライナでもよく、排出器は例えば複数の排出器でもよく、さらに閉鎖部材は例えば複数の閉鎖部材でもよい。

実施形態において排出器は、例えば物品と一体のもの、オペレータに装着されているもの、外部支持体に取り付けられているもの、またはこれらを組み合わせたものでもよい。

実施形態において、排出器が物品と一体のものである場合、排出器は少なくとも１つの格納可能な部材を含み、例として図７、８、および９を参照されたい。

実施形態において物品は、物品を保持し、かつ閉鎖部材を例えば人間の片手で、または単一の機械的把持部で、取り外すことを可能にする、ホルスタをさらに備えていてもよい。ホルスタは、例えば第２の端部の位置で物品のフレームのベースの少なくとも一部分の容積に一致する、凹んだ容積を有するものでもよく、またホルスタは、物品のフレームの回転の自由を制限するよう物品のフレームに係合する、戻り止め機能を有し得る。

実施形態において、ライナを有する物品は、少なくとも１つの排出部材をさらに備え得る。

実施形態において本開示は物品を提供し、この物品は、
可逆的に変形可能でありかつ弾性体である、内部空洞を有する柔軟なフレームを備え、フレームは、内部空洞内に液体サンプルを受け入れるための、さらに内部空洞内の受け入れた液体サンプルを可逆的に密封する随意的な閉鎖部材を受けるための、第１の開口端部を有し、かつフレームは、フレーム用ホルダに係合するための第２の閉鎖端部を有している。柔軟なフレームの実施形態では、凍結したサンプルをフレームの内部空洞から、排出部材を挿入する必要なく（すなわち、排出部材なしで）排出することができる。内部空洞は、例えば中空の円筒形状を有しかつ円筒のベースを第１の開口端部に向けてもよく、あるいは中空の円錐形状を有しかつ円錐のベースを第１の開口端部に向けてもよい。

実施形態において、フレーム用ホルダに係合する第２の閉鎖端部は、例えばフレームの壁の窪みでもよい。

実施形態において本開示は、フレームおよびフレキシブルライナを備えた上記の開示された物品の使用方法を提供し、この方法は、
物品のフレキシブルライナによって画成される空洞に、液体サンプルを充填するステップ、
物品を、例えば適切な閉鎖具で密封するステップ、
充填され密封された物品を冷却して、液体サンプルを固体サンプルへと変化させるステップ、および、
固体サンプルを、物品の空洞内のライナから受入れ用容器内へと、排出器を用いて排出するステップ、
を有してなる。

実施形態において上記方法は、排出の前に固体サンプルを、中間の値および範囲を含めて約０．５分から２０年、および類似の期間など、ある期間の間、極低温で保管するステップをさらに含み得る。

実施形態において、物品の空洞内のライナからの、固体サンプルの排出は、例えば排出部材を物品内へと挿入するまたは作動させることによって達成され得る。

実施形態において物品からの固体サンプルの排出は、実質的な中間解凍なしで達成することができ、例えば排出は、例えば物品または固体サンプルを解凍浴内に浸漬させることなく、または物品または固体サンプルを、中間の値および範囲を含めて１０秒から５分、３０秒から２分、および類似の期間などの短い期間よりも長く周囲温度に位置させることなく、あるいはこれらを組み合わせて、達成することができる。

実施形態において本開示は、柔軟なフレームを有する上記の開示された物品の使用方法を提供し、この方法は例えば、
物品の内部に液体サンプルを充填するステップ、
物品を適切な閉鎖具で密封するステップ、
充填され密封された物品を冷却して、液体サンプルを固体サンプルへと変化させるステップ、および、
物品の柔軟なフレームを手動でまたは機械的に圧迫するまたは絞ることによって、固体サンプルを物品から受入れ用容器内へと排出するステップ、
を有してなる。

実施形態において上記方法は、排出の前に固体サンプルを、中間の値および範囲を含めて約０．５分から２０年、および類似の期間など、ある期間の間、極低温で保管するステップをさらに含んでもよい。

実施形態において、この柔軟な壁の物品からの固体サンプルの排出は、柔軟な内部ライナを有する関連する物品の実施形態と同様に、実質的な中間解凍なしで達成することもできる。

実施形態において、柔軟なまたは変形可能なフレーム本体の圧迫または絞りは、例えば人間の手、機械的機器、ロボット、および類似の手段、またはこれらの組合せで、達成することができる。

実施形態において、本開示は凍結保存キットを提供し、この凍結保存キットは、
液体サンプルまたは固体サンプルを保持するための内部空洞を有する凍結保存物品であって、この物品の内部空洞内のサンプルを、例えば気密および液密に密封するための閉鎖具をさらに有している、凍結保存物品、
物品を保持するための、ホルスタ、
物品のフレームが剛性でありかつフレキシブルライナを有している場合には、物品の内部での凍結したサンプルすなわちワークピースを排出するための、排出器、および、
物品を使用するための取扱説明書、
を備えている。

実施形態において「から実質的に成る」もの、または「から成る」ものは、以下のものを称し得、例えば、
物品において、
内部空洞を有するフレーム、および、
フレームの内部空洞内に位置しているフレキシブルライナ、
などの本書で画成される１以上の開示される態様を有している物品であって、
前記フレームが、フレキシブルライナ内に液体サンプルを受け入れるための、さらに内部空洞内の受け入れた液体サンプルを可逆的に密封する閉鎖部材を受けるための、第１の開口端部を有し、かつフレームが、物品用のホルダに係合するための、またフレキシブルライナとサンプル内容物とを空洞内の位置から移動させる排出器を受け入れるための、第２の開口端部を有している、物品。

方法であって、
物品のライナに液体サンプルを充填するステップ、
物品を密封するステップ、
充填され密封された物品を冷却して、液体サンプルを固体サンプルへと変化させるステップ、
固体サンプルを、約０．５分から２０年などの期間の間、極低温で保管するステップ、および、
固体サンプルを、物品から受入れ用容器内へと、排出器を用いて排出するステップ、
など、本書で画成される１以上の開示されるステップを有してなる、フレキシブルライナを有する上記物品の使用方法。

物品において、
柔軟なまたは可逆的に変形可能な、内部空洞を有するフレーム、
などの本書で画成される１以上の開示される態様を有している物品であって、
前記フレームが、フレキシブルライナのないすなわちフレキシブルライナを含まない内部空洞内に、液体サンプルを受け入れるための、さらに内部空洞内の受け入れた液体サンプルを可逆的に密封する閉鎖部材を受けるための、第１の開口端部を有し、かつフレームが、フレーム用ホルスタに係合するための第２の閉鎖端部を有している、物品。

方法であって、
柔軟な可逆的に変形可能なフレームを有する物品の内部に、液体サンプルを充填するステップ、
物品を密封するステップ、
充填され密封された物品を冷却して、液体サンプルを固体サンプルへと変化させるステップ、
固体サンプルを、約０．５分から２０年などの期間の間、極低温で保管するステップ、および、
物品の柔軟なフレームまたは変形可能な本体を、手動でまたは機械的に圧迫するまたは絞ることによって、固体サンプルを物品から受入れ用容器内へと排出するステップ、
など、本書で画成される１以上の開示されるステップを有してなる、柔軟なフレームを有する上記のライナのない物品の使用方法。

凍結保存キットであって、
液体サンプルまたは固体サンプルのための内部空洞を有する凍結保存物品と、この物品の内部空洞内のサンプルを密封するための閉鎖具、
物品を保持するためのホルスタ、
物品のフレームが柔軟および可逆的に変形可能でありかつライナを有しているまたは有していない場合には、物品の内部の凍結したサンプルを、例えばフレームを絞るまたは圧迫することによって排出する排出器、および、
物品を使用するための取扱説明書、
などの、本書で画成される１以上の開示される態様を含む、凍結保存キット。

本開示の、物品、物品の作製方法、および物品の使用方法は、請求項に記載した構成要素またはステップに加え、本開示の組成物、物品、装置、または作製方法および使用方法の基本的および新規特性に本質的に影響を与えない、特定の物品構造、特定の添加剤または成分、特定の作用剤、特定の構造材料または構成要素、特定の照射、圧力、または温度条件、または類似の構造、材料、または選択されたプロセス変数などの、他の構成要素またはステップを含み得る。

実施形態において本開示はクライオチューブなどの第１の容器を提供し、第１の容器は、フラスコ、遠心分離管、マルチウェルプレート、または類似の入れ物などの第２の容器内の例えば３７℃の液体培地内への、この第１の容器からの凍結した生体物質の排出を可能にする。

凍結保存された生体物質を、この物質が未だ凍結されている間に第１の容器から３７℃の液体培地内へ排出することの利点は、第１の容器およびその使用方法によって、第１の容器を破裂させるリスクが低減されることである。第１の容器は室温に達する前に開口され、それにより第１の容器内にこれまでに入り込んだ可能性のあるいくらかの液体窒素が、気体に変化して閉鎖された第１の容器の内部で圧力を増加させることはない。

別の利点は、第１の容器およびその使用方法が、容器または管の破裂のリスクを減少させることで、またクライオチューブを水浴内に置いて解凍する必要性を排除することで、汚染のリスクを低減できることである。水浴からの水が解凍の際にクライオチューブに入る可能性もあり、これが汚染につながる。生体物質を第１の容器から排出すると、水浴内で解凍するステップを排除することにより時間を節約することができる。クライオチューブの内容物を３７℃の液体培地内に排出することの別の利点は、この排出によって、浸透圧と凍結保護物質の影響が低減されることである。第１の容器およびこの方法は、凍結保存された生体物質の生存能力を向上させることができる。さらに、凍結保存された細胞ペレットを、これが凍結している間に扱うことができる。これにより、ペレットをいくつかの部分に切断して、凍結している間に細胞をプールすることが可能になる。開示される個々のクライオバイアルの底部リムの切込みまたは凹所により、このバイアルを、拘束機能を有するラックまたは物品のホルスタと併せて使用すると、人間のオペレータまたはロボットは、片手でキャップの開け閉めを行うことが可能になる。

開示されるクライオチューブ物品の外部フレームまたは管は、例えばフッ素重合体、ポリオレフィン、ポリエチレン、および類似の重合体、または、これらまたは類似の材料の混合物から作製され得る。個々のクライオチューブは、例えば１から２ｍＬの、また５から６ｍＬの凍結した生体物質など、種々の容積の生体物質を含有するように作製され得る。アレイ構成のクライオチューブは、例えばサブミリメータ範囲の容積を保持することができる。内袋またはフレキシブルライナを含む実施形態では、袋もフッ素重合体、ポリエチレン、ポリオレフィン、これらの類の材料の混合物または積層体から成るものでもよく、あるいはセルロースなどの生分解性材料から成るものでもよい。袋またはライナを含む、また含まない、フレームまたは管は、例えば射出成形、ブロー成形、熱成形、および類似の方法、またはこれらの方法の組合せ、などの方法によって作製され得る。管および袋は、上記方法によって一緒に形成してもよいし、または別々に形成して、例えばオーバーモールド、熱接合、溶接、接着、および類似の方法、またはこれらの組合せによって結合させてもよい。

生分解可能な内袋またはフレキシブルライナを有する実施形態では、クライオチューブを凍結保存貯蔵コンテナから取り出した後に物品のキャップを取り除き、さらにライナの反対側の端部または乾燥側に排出器を挿入して、袋の内容物だけではなく、代わりに内袋および内容物の両方を受入れ用培地内に押し出してもよい。セルラーゼなどの試薬を培地に加えて、生体物質内容物を解放するべく袋の分解を助けてもよい。

クライオチューブまたはクライオプレートから凍結した生体物質を押し出すための排出器と、キャップをしたりキャップを外したりする際にクライオチューブを保持するためのラックまたはホルスタは、例えばプラスチック、ガラス、金属、および類似の材料、またはこれらの組合せを含む、任意の適切な材料から作製することができる。

以下の例は、上述した開示の使用の仕方をより十分に説明し、かつ本開示の種々の態様を実行するための意図されているベストモードをさらに明記する役割を果たす。これらの例は本開示の範囲を限定するものではなく、例証目的で示されるものである。実施例は、開示される物品をどのように準備し、また使用するかをさらに説明する。

図面を参照すると、図１はクライオチューブなどの例示的な物品１００の態様を示している。実施形態においてクライオチューブは、底部を備えていない（すなわち底が抜けている）ことを除いて既存の市販のクライオチューブに類似した、外部チューブ１１０を有し得る。内部には、チューブの外部または内部に対して一体的にシールされ得る、袋１２０またはフレキシブルライナが存在している。既に凍結保存された生体物質調合剤１２５を液体窒素コンテナから取り出して解凍するとき、チューブを生物学的フード（biological hood）へと運んでもよく、ここでクライオチューブのキャップ１３０を取り外してもよい。プランジャまたは排出器などの外部の機器または物品１５０を使用し、開口した底部から、共通の軸１０１に実質的に沿って排出器をクライオチューブ１１０内に挿入して内袋またはライナ１２０を変形させ、凍結した生体物質調合剤を受入れ用コンテナの３７℃の液体培地内に送り出すことによって、凍結した生体物質調合剤を物品から排出することができる。外側クライオチューブまたは外部チューブ（すなわちフレーム）の底部エッジすなわちリムは、ラックの拘束機能に係合することができる凹部１４０を有し得、これによりオペレータまたはロボットは片手またはロボットの把持部で、クライオチューブのキャップをしたりキャップを外したりすることができる。

図２は、凍結した生体物質調合剤を解凍する３７℃の液体培地を含有している、フラスコ（または遠心分離管）などの受入れ用容器１６０内に生体物質を排出するための、物品２００と組み合わせて使用される外部排出機器１５０を示している。あるいは、袋１２０全体またはその一部を、生分解可能な材料から成るものとし、この袋全体またはその一部を、クライオチューブ１１０から受入れ用容器１６０内へ、さらに生体物質が解凍されるときに袋を分解することができる液体培地内へと排出することができる。

図３Ａおよび３Ｂは夫々、クライオチューブ用ホルダ３００の上面断面図（３Ａ）および側面断面図（３Ｂ）を示し、クライオチューブ用ホルダ３００は、例えばベースまたはパック３１０と、拘束領域３２０と、クライオチューブの凹部１４０に係合して、クライオチューブのキャップをするまたはキャップを外すときにチューブ全体が方向を変える、回転する、またはこれ以外の動きをすることを防ぐ、ラックまたはホルスタなどに設けられた拘束機能３３０とを有している。図３Ａの３Ｂ断面が、図３Ｂに示されており、図３Ｂの３Ａ断面が、図３Ａに示されている。クライオチューブの凹部と係合するための戻り止め突起３３０が１つ図示されているが、ラックまたはホルスタはより大きなものであってもよく、２から約１，０００以上のチューブなど多くのチューブを受け入れるものでもよい。

図４は、プランジャまたは外部排出物品１５０のいくつかの代わりの実施形態を示している。実施形態において排出器は、人間の指４１０に滑らせて着けることができる、例えば一体リング４５３をさらに含んでもよい。指は、チューブ１１０から受入れ用容器１６０内に調合剤を移動させるように、排出器１５０をクライオチューブ内へと促す。実施形態において排出器は、クライオチューブの内袋１２０と接触している排出器を、ボタンを押すまたは引き金を引くことで動かす、例えば自動化された機器の一部でもよい。実施形態において排出器１５０は、所望であれば生物学的フードまたは類似の封じ込め環境内で保持され得る、例えば独立型の機器または支持体１５５の一部でもよい。

図５Ａおよび５Ｂは夫々、クライオチューブおよび排出器が、クライオチューブからサンプルを移動させるために、分離されたものとして組み合わせて使用され得る（図５Ａ）、または一体的なアセンブリの組合せとして使用され得る（図５Ｂ）、アレイの形などの複数の連動クライオチューブ５１０および連動排出器５５０の実施形態を示している。アレイは任意のサイズのものでもよいが、典型的には１以上のユニバーサルのマルチウェルプレート５３０の構成に一致し得る。実施形態においてクライオチューブアレイ５１０は、一体的なクライオチューブ内袋５２０のアレイを有する、マルチウェル"孔あき"プレートとして成形され得る。生体物質、調合剤、または配合物を各内袋の中に置き、このプレートを蓋またはキャップ（図示なし）で密封し、次いで凍結してもよい。クライオチューブプレート５１０を凍結保存貯蔵庫から取り出すと、蓋を取り外し、クライオプレートを、極低温条件下での使用に適した同じまたは類似した構成のマルチウェルプレート５３０の上で反転させ、さらに排出器アレイを用いて内袋を変形させて、一致したマルチウェルプレート５３０などの受入れ用容器内に凍結した生体物質を押し入れてもよい。連動クライオチューブ５１０および連動排出器から５５０が一体的アセンブリである場合（図５Ｂ）、アセンブリを凍結保存貯蔵庫から取り出して、蓋を取り外し、クライオプレートを、極低温条件下での使用に適した同じまたは類似した構成の受入れ用マルチウェルプレート５３０の上で反転させ、さらに一体的排出器アレイをクライオチューブ５１０の「押す」端部へと促すと同時に内袋を変形させ、かつ同時に、一致したマルチウェルプレート５３０などの受入れ用容器内に各クライオチューブ内の凍結した生体物質を移動させることができる。クライオチューブ５１０内に連動排出器５５０を促す、すなわち「押す」ことは、人間の手、ロボット、連動排出器と接触しているプレートを駆動するモータ、および類似の力の発生源、またはこれらの組合せなどの、任意の適切な推進力によって実現することができる。印加された排出力は、例えば板ばねまたはコイルばねなどの弾性フレーム部材５６０を潰す（状態５６２および５６５）のに十分な力で、凍結保存されたサンプルをクライオチューブ内から移動させる。

図６は、平面パネル６４０によって結合された個々のチューブ５１１を有する、クライオチューブアレイ５１０を示している。このクライオチューブアレイは、図５のクライオチューブアレイと同じように機能する。このクライオチューブアレイには、アレイの各クライオチューブ内に生体物質を密封することができる、閉鎖具または蓋６１０をかぶせることができる。アレイの状態で結合されたシリコーンまたは他のエラストマーのボタン部材６２０が、アレイ内の各クライオチューブの上部を塞いで密封することができる。本例の蓋は、アレイの各クライオチューブ内にボタン部材６２０が据えられると、プレートを包囲している例えばヒンジアーム６１０で所定位置に保持され得る。クライオチューブのアレイ上で蓋を密封するために使用され得る、多くの他の種類の代わりのエンクロージャが存在する。

図７は、組込み式のまたは一体化されたプランジャまたは排出器７５０と、随意的な閉鎖具とを有する、クライオチューブ７００の前面図および側面図である。クライオチューブ７１０は標準的なサイズおよび形状のものでもよいし、あるいはこれ以外のものでもよい。ただし開示されるクライオチューブは、外壁すなわち側面７１０に凹部７６５を有し得、一体的なプランジャのセグメント７６０すなわち脚がここに収容される。一体的なプランジャの実施形態を有しているクライオチューブは、外側底部のすぐ内側に、二重底をさらに有している。内側底部７５０は内袋１２０に接触している。内袋は、クライオチューブの例えば上部付近でクライオチューブ７１０の内部または外部に例えば取り付けられて、一体的に密封され得る。図７のクライオチューブの設計および構造は、外側チューブの底部リムに、あるいは底部リム付近に、随意的な凹部７４０をさらに含み得、これがクライオチューブホルスタまたはラックの嵌合用拘束機能と位置合わせされ得る。ベース７４５は開口７４７を含み、この開口によって、再配置されたセグメント７６０をベースに通して押して、内側底部７５０をプランジャのように前進させてクライオチューブ７１０の内容物を移動させることができる。

図８は、図７の組込み式プランジャまたは排出器の実施形態のプランジャセグメント７６０を示している。プランジャは、図示の左から右の順で広がって、クライオチューブ７１０の内袋１２０を押して凍結した内容物をチューブから受入れ用培地含有容器内へと押し入れることができる機器を生成することができる。ベース７４５および開口７４７がさらに図示されている。

図９は、組み立てられたプランジャ７５０と関連する脚７６０とを内袋１２０に押し付けて袋を変形させ、凍結した生体物質（図示なし）をフレーム７１０から、３７℃の培地を含有している受入れ用フラスコ１６０または遠心分離管内へと排出するところを示している。

図１０は、横長のまたは細長い形状を有する、クライオチューブ７１１を示している。このクライオチューブは断面で見ると、例えば長円形、卵形(ovoid, or egg shape)、または円形すなわち丸い形状を有し得る。クライオチューブのキャップ（例えば、円形の閉鎖具１０３０）を外して、すなわち開けて、クライオチューブ７１１の両側面を人間の手１０１０または類似の手段で圧迫するまたは絞ると、チューブが変形して凍結した生体物質内容物を円錐形、卵形、円形、または類似の形状などの空洞７１２から移動させるように、クライオチューブの壁の材料は機械的に可逆的に変形可能であるように選択され得る。この動作によって、凍結した材料をチューブから、３７℃の培地の受入れ用容器内へと滑り出させることができる。この設計は、外側チューブ７１１の底部リムに、上記したようにクライオチューブのラックまたはホルスタ（図示なし）の拘束機能と位置合わせすることができる、凹部１４０をさらに有し得る。図１０のクライオチューブ７１１は、例えば、ねじ式キャップまたはスナップ嵌合キャップなどの標準的な閉鎖用具の使用を可能にするよう、円錐形、卵形、または円形の本体から、異なる直径の円形開口へと推移するものでもよい。

材料および方法
プラスチッククライオチューブ、クライオバイアル、またはこの両方は、典型的には多数個取り成形で作製される射出成形製品である。クライオチューブは、例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリメチル・メタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリメチルペンテン、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリスチレン共重合体、ポリプロピレン共重合体、環状オレフィン共重合体、フッ素重合体、ポリ（スチレン‐ｃｏ‐無水マレイン酸）またはポリアミド、およびこれらまたは関連材料の類似の重合体または共重合体のうちの、少なくとも１つから成形され得る。開示されるクライオチューブ、クライオウェルプレート（cryowell plate）、および内袋から凍結した細胞を排出するのを助ける機器も、類似の重合体材料から成形または熱成形することができる。内袋を有する開示される容器は、例えば内袋にオーバーモールドされ得る外側クライオチューブまたはクライオウェルプレートを有するものでもよいし、あるいは袋を、射出成形の後に、熱溶接、接着、超音波溶接、および類似の方法、またはこれらの組合せなど、当技術において既知の任意の取付方法を用いて取り付けてもよい。内袋は、例えば、膜または多層膜積層体を、熱成形または熱密封することによって生成され得る。管材料を押出成形し、切断して密封し、袋を形成してもよい。袋は、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、パーフルオロ化ポリマー、ポリエステル、ポリジメチルシロキサン、および、これらの材料の混合物および積層体を含めた類似の材料、およびこれらの組合せから作製され得る。あるいは実施形態において、内袋はセルロースなどの生分解可能な材料から成るものでもよい。

開示される容器は、市販されているクライオチューブと同じように使用され得る。典型的には、凍結保存によって貯蔵される細胞を採取し、遠心分離管内に回収し、遠心分離にかけて、回収された細胞をペレットにする。遠心分離に続いて培地を遠心分離管から除去し、さらに細胞が形成するペレットを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、血清、および類似の材料、またはこれらの組合せなどの、凍結保護物質を含有する培地内で再懸濁する。凍結保護培地内の細胞を、クライオチューブまたはクライオプレート容器の内袋内に置く。クライオチューブにキャップをし、またはクライオウェルプレートの事例ではプレートに蓋をする。クライオチューブまたはクライオウェルプレートをその後、例えばプログラム可能な速度制御冷凍室か、あるいは、気相窒素に移動させる前に−８０℃の冷凍室で２４時間まで使用して、例えば約１から３℃／分の速度で冷却を促進することができるポリスチレンボックスまたはアルコール浴（例えば、Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）「Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ」）などの適切な代替手段の中に置いてもよい。

凍結した細胞を解凍および使用するよう準備する場合、クライオチューブを気相窒素貯蔵庫から取り出す。クライオチューブのキャップを外し、クライオチューブ内の凍結したペレットを、排出部材または類似の機器を用いてクライオチューブから排出する。排出部材または排出物品（「排出器」）をクライオチューブのベース内に挿入し、凍結したペレットを含有している内袋に接触するようこれを押圧することができる。ペレットをクライオチューブの袋から、３７℃の新鮮な培養培地が準備されたコンテナ内へと促し、または押し出して、ここでペレットはすぐに解凍される。クライオウェルプレートの場合にはプレートから蓋を取り外し、さらにこのプレートを、クライオウェルプレートと同じまたはより大きいウェル数および寸法を有し、かつ各ウェルが３７℃の新鮮な培養培地を含有している、マルチウェルプレートプレート上で反転させる。クライオウェルプレートの排出器アレイ機器を、クライオチューブ排出器と同じように使用することができる。卵形または長円形の断面を有するクライオチューブの事例では、長円形の頂点を押してクライオチューブ内から凍結したペレットを解放し、さらに反転させてペレットを３７℃の培地を含有している受入れ用容器内に送り出してもよい。

この手順は、クライオチューブまたはクライオウェルプレート内の細胞が、待機している新鮮な培地のコンテナ内に置かれる前に３７℃の水浴内に置かれて解凍されることがない点で、標準的な手順とは異なる。ペレットを凍結した状態で３７℃の培地内に直接排出することができるため、細胞を解凍するためにクライオチューブが水浴内で費やす時間が回避され、細胞が水浴によって汚染される可能性が減少し、さらに凍結保護物質の濃度が速やかに希釈されることによって細胞の生存能力が向上する。

本開示を、種々の特定の実施形態および技術を参照して説明してきた。しかしながら、本開示の範囲内のまま、多くの変形および改変が可能であることを理解されたい。

１００ 物品
１１０ チューブ
１２０ 内袋
１２５ 生体物質調製剤
１３０ キャップ
１４０ 凹部
１５０ 外部排出物品
１５５ 支持体
１６０ 受入れ用容器
３００ ホルスタ
５１０ 連動クライオチューブ
５５０ 連動排出器

Claims (10)

1. 物品であって、
   内部空洞を有するフレーム、および、
   前記内部空洞内に位置している、フレキシブルライナ、
   を備え、
   前記フレームが、前記フレキシブルライナ内にサンプルを受け入れるための第１の開口端部を有し、かつ前記フレームが、前記物品用のホルスタに係合するための、また前記フレキシブルライナと前記サンプルの内容物とを前記空洞内の位置から移動させる排出器を受け入れるための、第２の開口端部を有していることを特徴とする物品。
2. 前記フレームが、前記第１の開口端部と前記第２の開口端部とを有する、中空円筒または中空円錐であることを特徴とする請求項１記載の物品。
3. 前記内部空洞内の受け入れた前記サンプルを可逆的に密封する、閉鎖部材をさらに備え、かつ前記閉鎖部材が、前記フレームのねじ山に係合するよう適合された、ねじ式キャップ、前記フレームに係合する随意的なストラップを有する、圧入プラグ、またはこれらの組合せ、のうちの少なくとも１つを備えていることを特徴とする請求項１記載の物品。
4. 前記排出器が、前記物品と一体のもの、オペレータに装着されているもの、静止した外部支持体に取り付けられているもの、ロボットの外部支持体に取り付けられているもの、またはこれらを組み合わせたもの、であることを特徴とする請求項１記載の物品。
5. 複数の連動排出器を備えた、前記物品と一体の少なくとも１つの排出器をさらに備え、前記複数の連動排出器が複数のクライオチューブに位置合わせされており、かつ前記複数の連動排出器が、前記複数のクライオチューブに、少なくとも１つのばね部材で分離されて取り付けられていることを特徴とする請求項１記載の物品。
6. 前記物品を保持し、かつ前記閉鎖部材を、人間の片手で、または単一の機械的把持部で、取り外すことを可能にする、前記ホルスタをさらに備えていることを特徴とする請求項１記載の物品。
7. 物品において、
   内部空洞を有する変形可能なフレームであって、前記内部空洞内にサンプルを受け入れるための第１の開口端部、および該フレーム用のホルスタに係合するための第２の閉鎖端部を有するフレーム、
   を備えた物品。
8. 前記内部空洞が中空の円筒形状を有し、かつ前記円筒のベースが前記第１の開口端部の位置にある、あるいは、前記内部空洞が中空の円錐形状を有し、かつ前記円錐のベースが前記第１の開口端部の位置にあることを特徴とする、請求項７記載の物品。
9. 前記内部空洞内の受け入れた前記サンプルを可逆的に密封し、かつ前記内部空洞から液体窒素を排除する、閉鎖部材をさらに備えていることを特徴とする請求項７記載の物品。
10. 請求項１の物品の使用方法であって、
    前記物品の内部空洞内のライナにサンプルを充填するステップ、
    前記物品を密封するステップ、
    充填され密封された前記物品を冷却して、前記サンプルを凍結させるステップ、および、
    凍結した前記サンプルを、前記物品の前記内部空洞から受入れ用容器内へと、排出器を用いて排出するステップ、
    を有してなる方法。

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