JP2016525103A - リベス種から誘導可能な新たな生物活性アルカロイドおよびアルカロイド画分 - Google Patents

リベス種から誘導可能な新たな生物活性アルカロイドおよびアルカロイド画分 Download PDF

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Abstract

【課題】リベス種から誘導可能な新たな生物活性アルカロイドおよびアルカロイド画分を提供すること。【解決手段】本発明は、好ましくはリベス・ルブルムおよびリベス・ニグルムの中から選択されるリベスから誘導可能な新しいアルカロイドおよび新しい生物活性アルカロイド画分；該生物活性リベスアルカロイド画分の製造方法ならびにそれらのＩＫＫ−β、ＰＤＥ４および／またはＰＤＥ５の阻害のための使用ならびにそれに加えてそれらのミトコンドリアの生物発生および機能に対する促進効果；ミトコンドリア機能障害もしくはＩＫＫ−β、ＰＤＥ４および／もしくはＰＤＥ５活性を伴う状態、例えば炎症、神経変性、脂質異常症、２型糖尿病、創傷治癒障害、サルコペニアおよび他の筋機能不全もしくは疲労感および疲労を伴う状態、または筋機能もしくは認知機能の最適化が望まれる状態などの管理における栄養物または医薬品としてのそれらの治療的応用または非治療的応用；該アルカロイドを含有するリベスの抽出物、汁または濃縮物；医薬組成物、機能性食品および栄養補助組成物などの栄養物、化粧料組成物および医療機器を含む、該アルカロイドを含む組成物に関する。

Description

本発明は、好ましくはリベス・ルブルム（Ｒｉｂｅｓ Ｒｕｂｒｕｍ）およびリベス・ニグルム（Ｒｉｂｅｓ ｎｉｇｒｕｍ）の中から選択されるリベス（Ｒｉｂｅｓ）から誘導可能な新たなアルカロイドおよび新たな生物活性アルカロイド画分；該生物活性リベスアルカロイド画分の製造方法ならびにそれらのＩＫＫ−β、ＰＤＥ４および／またはＰＤＥ５の阻害のための使用ならびにそれに加えてそれらのミトコンドリアの生物発生および機能に対する促進効果；ミトコンドリア機能障害もしくはＩＫＫ−β、ＰＤＥ４および／もしくはＰＤＥ５活性を伴う状態、例えば炎症、神経変性、脂質異常症、２型糖尿病、創傷治癒障害、サルコペニアおよび他の筋機能不全もしくは疲労感および疲労を伴う状態、または筋機能もしくは認知機能の最適化が望まれる状態などの管理における栄養物または医薬品としてのそれらの治療的応用または非治療的応用；該アルカロイドを含むリベスの抽出物、汁または濃縮物；医薬組成物、機能性食品および栄養補助組成物などの栄養物、化粧料組成物および医療機器を含む、該アルカロイドを含む組成物に関する。
国際社会は、２型糖尿病（ＤＭ２）およびアテローム性心血管疾患（ＣＶＤ）のような生活習慣病の負担の増加に伴う、重大な課題に直面している。ＤＭ２およびＣＶＤが一体化したものが、メタボリック症候群である。メタボリック症候群は、アテローム性脂質異常症、腹部肥満、高血圧、インスリン抵抗性陽性／陰性の耐糖能障害、炎症促進状態および血栓形成促進状態を含む、複数のリスク因子の集合体が特徴である［Ｓｃｏｔｔ ２００４年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ；１０９：４３３−４３８］。米国心臓学会は、メタボリック症候群を、脂質異常症、腹部肥満、高血圧およびインスリン抵抗性の組合せであり、個別の構成要素のどれよりもはるかに大きい心臓血管リスクをもたらす一連の障害と定義している［Ｇｒｕｎｄｙ ２００４年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ；１０９：４３３−４３８］。
ＣＶＤは全世界的に死因の第１位であり、毎年、ＣＶＤが原因で死亡する人々は他のどの死因による死亡者よりも多い。２００８年に推定１，７３０万人がＣＶＤで死亡し、これは全世界のすべての死亡の３０％に相当する。これらの死亡のうち、推定７３０万件の死因が冠状動脈性心疾患、６２０万件の死因が脳卒中であった。２０３０年までに、２，３６０万人近くがＣＶＤ、主に心疾患および脳卒中が原因で死亡すると予想される。これらは単独で死因の第１位であり続けると予想される［ＷＨＯ Ｆａｃｔ ｓｈｅｅｔ第３１７号、２０１１年９月］。ＣＶＤは、冠状動脈性心疾患および脳卒中の原因となる動脈プラーク形成に繋がる脂質異常症を伴う。全世界の糖尿病患者３億４，６００万人のうち、９０％がＤＭ２患者である。２００４年には推定３４０万人が高血糖の影響が原因で死亡した。ＷＨＯは、糖尿病による死亡が２００５年から２０３０年にかけて倍増すると予想している［ＷＨＯ Ｆａｃｔ ｓｈｅｅｔ第３１２号、２０１１年８月］。ＤＭ２は、インスリン抵抗性および血糖値上昇が特徴であり、またＣＶＤを伴う割合が高い［Ｍｏｌｌｅｒ ２００１年、Ｎａｔｕｒｅ；４１４、８２１−２７］。現在、ＤＭ２患者およびメタボリック症候群患者に典型的に見られる複合型アテローム性脂質異常症に対する関心がますます高まっている。
ＣＶＤはもとより、ＤＭ２についても、基本的処置は血中コレステロールの低減、特にＬＤＬの低減である。脂質異常症の処置は、スタチン、フィブラート、コレステロール吸収阻害、肝臓コレステロール合成阻害、コレステロール排泄増加および遊離脂肪酸放出阻害を含む［Ｂｈａｔｎａｇａｒ ２００８年、ＢＭＪ；３３７：５０３−８］。これらのような既存の処置は、筋肉痛および生命を脅かし得る損傷（横紋筋融解症）を含む多数の悪影響を伴うほか、肝臓損傷および消化管副作用も伴う。したがって、より幅広い集団への応用に適する、効果的な治療原理が強く必要とされている。
創傷治癒過程は複雑で動的な、細胞構造および組織層の回復過程である。急性創傷は外傷または外科創傷のいずれかであり、また発生から、予測可能な速度での治癒過程を経て、閉鎖へと移行する。難治性創傷または慢性創傷は、通常の治癒段階を経て進行するわけではない複雑な損傷である。難治性創傷においては、高レベルの炎症性サイトカインや低レベルの成長因子など、治癒に貢献しない変化が慢性創傷の分子環境内で起こる。これらの変化が治癒過程を終了させ、細菌感染の潜在性を増大させる。生理学的創傷変化の原因と考えられる問題への対処は、治癒を再開させると共にさらなる合併症のリスクを低減し得るものであり、また創傷治癒の迅速化は細菌への曝露時間および結果的な感染を減少させる。
様々な種類の創傷の処置は、全世界の医療制度および患者に対する膨大な負担、ならびに慢性創傷の効果的処置の不足に起因する治療面での計り知れない課題を象徴する。
７，１５０万件の外科手術が、２０００年に米国で実施された。未治癒の急性創傷は感染性因子を受けやすく、また感染は手術創傷の約１０％で発生していることから、創傷治癒の迅速化は総じて有利である。さらに、多数の外科患者が肥満である、もしくは創傷治癒障害を引き起こす慢性疾患を抱えていることから、創傷治癒の改善の必要性が大いに生じる。急性創傷治癒の付加的負担は、患者にとって長期間持続する機能的影響、審美的影響のほか、心理的影響も及ぼし得る瘢痕化という課題である。瘢痕は、負傷、修復過程およびその後の瘢痕化過程改善に向けた介入の集約を象徴する。普通の瘢痕および肥厚性瘢痕はいずれも依然として処置が難しく予防不可能であり、厄介な瘢痕化を伴わずに創傷治癒を前進させる治療原理が大いに必要とされている。
慢性難治性創傷は、世界人口の大部分に影響を及ぼすと共に公衆衛生に多大な脅威をもたらす、１つの無症候性流行病に相当する。米国だけでも、慢性創傷は６５０万人の患者に影響を及ぼす。スカンジナビア諸国では、関連コストが医療支出全体の２％−４％を占める。主な慢性創傷の種類は糖尿病性潰瘍、褥瘡および静脈性潰瘍である。
世界中で、推定が可能であった地域において、すなわち膨大な数の発展途上国を除いても、褥瘡患者は７４０万人を超えると推定されている。入院後最初の２週間の間に、入院患者の約９％に院内褥瘡が発生し、また米国では年間６０，０００件近くの死亡が院内褥瘡に起因して発生している。褥瘡は主な感染源となり、敗血症や骨髄炎などの合併症、さらには死亡に至ることもあり得る。褥瘡の治癒は長期間を要し、処置にも多大な費用および時間を要する。
全糖尿病患者のうち最大２５％が糖尿病性足潰瘍を発症すると推定され、また足潰瘍患者の１２％において切断が必要になると推定されている。２００４年に米国で約７１，０００件の、糖尿病患者における非外傷性下肢切断が実施された。糖尿病性足潰瘍の処置は、専門医の仕事となることが多く、また現代の創傷ケアにおける膨大な未解決の課題を象徴する。
静脈性潰瘍は、下肢に見つかる潰瘍の７０％−９０％を占める。静脈性下肢潰瘍形成は、高齢者に共通する再発性の問題をもたらし、患者にとっては不快感や苦痛を生み出すと共にヘルスケアサービスにとっては多大な費用負担となる。６５歳以上の高齢者において、静脈性下肢潰瘍は集団の約１．６９％に影響を及ぼしている。処置を受けた患者のうち最大３分の１が、４回以上の再発を経験する。処置の中心は、局所創傷ケアおよび熟練者が行う包帯による、または段階的圧縮ストッキングによる継続圧縮療法を含む。しかし、圧縮療法は閉塞性動脈疾患患者においては禁忌であり、熟練職員が圧縮包帯を巻く必要があり、また圧縮ストッキングの患者コンプライアンスが乏しいことが多い。
創傷治癒環境の改善を目的とする局所薬が多数出回っている。創傷切除は、失活組織および蓄積した壊死組織片を取り除き、また潅注、剥離切除、酵素的切除およびウジ虫療法での生物学的切除を含む。局所療法は、高圧酸素療法、負圧創傷療法、血小板由来成長因子、上皮成長因子および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子など成長因子の適用、ヨウ素、クロルヘキシジン、銀および抗生物質を含む防腐剤および抗菌剤を使用する局所用製剤を含む。ガーゼ包帯、微細格子ガーゼに石油、パラフィンワックスまたは他の軟膏、フィルム、発泡体、アルギン酸塩、ヒドロコロイド、ヒドロゲルおよび湿式活性被覆材を含浸させたものを含め、様々な創傷被覆材が創傷内および創傷周囲の水分量管理に使用される。局所処置の本質そのものの理由から、これらは創傷治癒の表面だけに対処するものであり、効果的処置には不十分と証明済みである。創傷治癒を改善する効果的な経口療法はない。したがって、創傷治癒を内側から促進する効果的な経口療法が大いに必要とされている。
創傷治癒を内側から促進するため、創傷治癒過程の様々な様態が対処され得る。治癒は従来、止血、炎症、増殖および化膿、これら４つの重なり合う段階に関して説明される。止血段階では、血小板が、後で白血球およびマクロファージを負傷部位へ誘引する炎症性サイトカインおよびケモカインの分泌によって、組織治癒における血餅形成および初期炎症様態に極めて重要な役割を果たす。これらの細胞が負傷組織を切除し、そして治癒の様々な様態を伝播するプロテアーゼ、サイトカインおよび成長因子を分泌する。増殖段階では、上皮形成、線維増殖および血管形成が起こり、炎症細胞、線維芽細胞および新血管系統を含む肉芽組織を、フィブロネクチン、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよびプロテオグリカンから成る基質内に形成する。最後に、化膿段階では、コラーゲンが他のコラーゲンおよびタンパク質分子との緊密な架橋を形成し、瘢痕の引張強度を増加させる。創傷治癒過程全体は非常に複雑で、開放創傷から瘢痕形成に至る細胞事象は重なり合う。新生組織の持続には豊富な血液供給が不可欠で、また血管形成は創傷治癒における主要な様態である。血管形成は多数の血管新生促進分子の放出が関係し、その中でマクロファージおよび表皮細胞によって分泌される血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）が血管形成に極めて重要である。
創傷治癒との関連で、ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害は非常に有望な治療戦略である。ｃＡＭＰは、すべてが創傷治癒過程に関連のある、炎症細胞のサイトカイン生産、血管形成およびケラチン生成細胞の機能特性に関係する２次メッセンジャーである。細胞内のｃＡＭＰレベルは、ｃＡＭＰをＡＭＰへと加水分解するＰＤＥ４およびＡＴＰからｃＡＭＰを合成するアデニレートシクラーゼの活性によって決まる。ＰＤＥ４は、すべて皮膚中に存在する、炎症細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、内皮細胞およびケラチン生成細胞［Ｂａｕｍｅｒ ２００７年、Ｉｎｆｌａｍｍ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ、３月、６（１）：１７−２６］を含む多様な細胞内で発現する。
ｃＡＭＰの効果は、偏在的に発現した２つの細胞内ｃＡＭＰ受容体、すなわちプロテインキナーゼ（ＰＫＡ）およびｃＡＭＰによって直接活性化される交換タンパク質（ＥＰＡＣ）によって変換される［Ｗｈｉｔｔｍａｎｎ ２０１３年、Ｐ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｔｈｅｒ、４月２７日；３（１）：１−１５］。ｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号伝達経路は、内皮細胞の萌芽および管形成を促進することが実証済みであり［Ａｓｌａｍ ２０１３年、Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａ；２０７（６９４）：Ｏ１０］、ｃＡＭＰはｃＡＭＰ／ＰＫＡ信号伝達経路を介してプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）によって介在されるＶＥＧＦの放出における２次メッセンジャーの役割を果たす［Ｉｋａｒｉ ２０１３年、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１０月；４９（４）：５７１−８１］。ｃＡＭＰ／Ｅｐａｃ信号伝達経路を介したＥｐａｃの活性化は、内皮細胞中のトロンビン誘発性過透過性を減衰することが実証済みである［Ａｓｌａｍ ２０１３年、Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａ ２０１３年；２０７（６９４）：Ｏ１０］。内皮前駆細胞（ＥＰＣ）は、血管系再生時の血管形成に中心的に関係し、またこれらの細胞の動員には部分的に、後でＥＰＣを骨髄から虚血性部位へと動員するストロマ細胞由来因子１α（ＳＤＦ−１α）やＶＥＧＦのような血管形成準備因子の増強発現に対する創傷刺激性上皮細胞における低酸素勾配が介在する［Ｃｅｒａｄｉｎｉ ２００４年、Ｎａｔ Ｍｅｄ、８月；１０（８）：８５８−６４］、［Ｔｅｐｐｅｒ ２００５年、Ｂｌｏｏｄ、２月１日；１０５（３）：１０６８−７７］。創傷など低酸素条件下において、ＥＰＣは、刺激を受けて組織化細胞集合を形成し、これが後に、運河化され既存の血管へ接続する索状血管構造を形成する。
慢性創傷では血管形成過程が阻害される結果、肉芽組織形成に欠陥が生じ、最終的に創傷治癒障害を引き起こし、増殖段階を経て進行する。例えば、糖尿病性創傷は、創傷内での血管形成減少およびＶＥＧＦ発現減少を伴う創傷治癒障害が特徴であり［Ｂｉｔｔｏ ２０１３年、Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ、１２月；１２５（１２）：５７５−８５］、［Ｇｕ ２０１３年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ；１０月；１０２（１）：５３−９］、［Ａｓａｉ ２００６年、Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ、５月；１２６（５）１１５９−６７］、また局所ＶＥＧＦは糖尿病マウスの実験的創傷における修復の著しい加速を誘発し、ＶＥＧＦの外因性適用はラットの虚血性創傷における早期の血管形成および引張強度を増加させ得ることが実証済みである［Ｓｉｎｎｏ ２０１３年、Ｐｌａｓｔ Ｓｕｒｇ Ｉｎｔ；２０１３：１−７］。ホスホジエステラーゼ４阻害は、プロスタグランジンＥ２によって誘発されるヒト肺線維芽細胞ＶＥＧＦ生産を増強し［Ｉｋａｒｉ ２０１３年、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１０月；４９（４）：５７１−８１］、またｃＡＭＰの安定化アナログであるナトリウムＮ−６，２０−Ｏ−ジブチリルアデノシン−３０，５０−サイクリックホスフェート（ＤＢｃＡＭＰ）を糖尿病性創傷へ局所投与すると、創傷治癒が著しく増進する［Ａｓａｉ ２００６年、Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ、５月；１２６（５）：１１５９−６７］。したがって、ＰＤＥ４の阻害は局所ＶＥＧＦ分泌を増加させ、創傷治癒を促進する、特に障害のある創傷治癒を促進する可能性が非常に高い。
肉芽形成段階における別の一重要因子は、ストロマ細胞由来因子（ＳＤＦ）−１αである。ＳＤＦ−１αは、正常な環境および糖尿病環境いずれにおいても、創傷治癒過程に極めて重要で多面的な役割を果たす。ＳＤＦ−１αは、ＥＰＣの移動および血管形成を調節する化学走化性因子である。したがって、ＳＤＦ−１αの上方調節は創傷治癒を増進し［Ｎａｋａｍｕｒａ ２０１３年、Ｂｉｏｍｅｔｅｒｉａｌｓ、１２月；３４（３７）：９３９３−４００］、またＳＤＦ−１αレベルの低下は、細胞移動の減少および血管形成の減少により、治癒を阻害する。糖尿病性創傷はＳＤＦ−１αが欠乏し、またＳＤＦ−１αレベルの上昇は糖尿病性創傷の治癒を増強する［Ｂｉｔｔｏ ２０１３年、Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ、１２月；１２５（１２）：５７５−８５］、［Ｂｅｒｍｕｄｅｚ ２０１１年、Ｊ Ｖａｓｃ Ｓｕｒｇ；５３：７７４−８４］。ＤＢ−ｃＡＭＰの糖尿病性創傷への局所投与によるｃＡＭＰ増加は、マクロファージおよび間葉細胞によるＳＤＦ−１αの転写および生産を増加させ、創傷治癒を大幅に加速させることが実証済みである［Ａｓａｉ ２００６年、Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ、５月；１２６（５）１１５９−６７］。
表皮基底細胞の増殖は、創傷治癒における別の主要な一様態である。ｃＡＭＰは長年にわたり、ヒトケラチン形成細胞増殖における２次メッセンジャーおよび調節因子と見なされてきた。ｃＡＭＰ信号伝達は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）活性のモジュレーションによって、ケラチン形成細胞増殖を調節する。ＤＢｃＡＭＰは、ケラチン形成細胞および線維芽細胞による形質転換成長因子−βの生産のほか、ケラチン形成細胞の増殖および移動を促進し［Ｚｈｏｕ ２０００年、Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ、９月；１４３（３）：５０６−１２］、［Ｏｎｕｍａ ２００１年、Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｒｅｓ、３月；２９３（３）：１３３−８］、［Ｉｗａｓａｋｉ １９９４年、Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ、６月；１０２（６）：８９１−７］、また全層創傷の治癒および再上皮化を加速させることが実証済みである［Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ ２００６年、Ｂｉｏｍｅｔｅｒｉａｌｓ、３月；２７（８）：１３５５−６１］。したがって、ＰＤＥ４によるｃＡＭＰ増加も同様に、創傷治癒過程における上皮形成を増進し得る。
ＰＤＥ４は、創傷治癒過程における創傷床にすべて存在する、内皮細胞、ケラチン形成細胞および線維芽細胞などの細胞内で発現する［Ｂａｕｍｅｒ ２００７年、Ｉｎｆｌａｍｍ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ、３月；６（１）：１７−２６］。ＰＤＥ４阻害剤の局所適用は、抗炎症効果を発揮し、それに伴ってサイトカインおよび接着分子の発現が減少することが実証済みである［Ｉｓｈｉｉ ２０１３年、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ、７月；３４６（１）：１０５−１２］。ＤＢｃＡＭＰの局所投与は、局所ｃＡＭＰを増加させる別の一手段であり、マウスでのアラキドン酸誘発性耳浮腫モデルにおいて、炎症性浮腫を大幅に低減することが実証済みである［Ｒｕｎｄｆｅｌｄｔ ２０１２年、Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｒｅｓ、２月３日（３０４）：３１３−３１７］。創傷治癒補助における、ＰＤＥ４阻害によって生じる抗炎症効果の役割は、慢性炎症が創傷の難治状態における重要な様態であり、炎症の減少に伴って創傷治癒が増加するという、慢性創傷において最も顕著となり得る［Ｅｍｉｎｇ ２００７年、Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ、３月；１２７（３）：５１４−２５］。したがって、ＰＤＥ４阻害による前炎症性メディエーターのモジュレーションは、血管形成伝播および上皮形成増進を介してＰＤＥ４阻害によって発揮される創傷治癒効果を増大させ得る。
結論として、ｃＡＭＰ信号伝達は、血管形成、炎症および上皮形成を含む、創傷治癒に重要な複数の機能の調節が関係する。したがって、ＰＤＥ４阻害を介したｃＡＭＰの増加は、前炎症性メディエーターのモジュレーション、血管形成伝播および上皮形成増進を介した急性創傷および慢性創傷の治癒の増進に向けた、非常に関連性の高い治療戦略である。
創傷治癒増進との関連で、ホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）阻害は、別の非常に有望な一治療戦略である。ＰＤＥ５は、ｃＧＭＰを５’−ＧＭＰへと分解することによりｃＧＭＰの活性を阻害する能力を有する、ホスホジエステラーゼである。ＰＤＥ５阻害はｃＧＭＰの分解を防ぐことにより、ｃＧＭＰの効果を増進および／または延長する。ｃＧＭＰは、可溶性グアニリルシクラーゼの一酸化窒素（ＮＯ）活性化の結果として合成され得る２次メッセンジャーである。ｃＧＭＰは、プロテインキナーゼＧ（ＰＫＧ）の活性化を介して、様々な生理的過程に関係する。ＰＤＥ５によるｃＧＭＰから５’−ＧＭＰへの転換は効果的にＮＯ／ｃＧＭＰ信号伝達を阻害する一方、ＰＤＥ５阻害はＮＯ／ｃＧＭＰ信号伝達を回復させる。ＮＯは、３つの特徴的な一酸化窒素合成酵素のイソフォームによってアミノ酸Ｌ−アルギニンから形成される、小さいラジカルである。誘導性イソフォーム（ｉＮＯＳ）は創傷治癒の早期段階で、炎症細胞、主にマクロファージによって合成される。しかし、創傷後の増殖段階では多数の細胞がＮＯ合成に関与する。ＮＯの有益な効果は創傷治癒において何度も実証済みであり、また血管拡張、酸化的ストレス成分の除去、血管形成改善および内皮細胞増殖促進を含む、複数の機構を介して作用し得る［Ｆａｒｓａｅｉ ２０１２年、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ Ｓｃｉ；１５（４）：４８３−４９８］。ＮＯは、ケラチン形成細胞における遺伝子発現および増殖、創傷組織における線維芽細胞移動およびコラーゲン沈着を調節する、重要なメディエーターの役割を果たす［Ｈａｎら ２０１２年、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、４月；１８０（４）：１４６５−７３］、［Ｆｒａｎｋら ２００２年、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；６１：８８２−８８８］。ｉＮＯＳを介して放出されるＮＯは、動物の創傷治癒モデルにおいて、コラーゲン形成、細胞増殖および創傷収縮を調節することが示されている［Ｗｉｔｔｅ ２００２年、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、１０月；５１（１０）：１２６９−７３］。相応に、ｃＧＭＰのＰＤＥ５転換阻害による、ＮＯ−ｃＧＭＰ−ＰＫＧ信号伝達経路の保護および増進は実際、難治性創傷に関する１５件の別々の動物実験および２件の臨床ヒト研究において、経口ＰＤＥ５阻害剤シルデナフィルを使用して大幅に改善された創傷治癒によって追認される通り、創傷治癒に有益である［Ｆａｒｓａｅｉ ２０１２年、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ Ｓｃｉ；１５（４）：４８３−４９８］。さらに、血管形成促進戦略としてのＰＤＥ５阻害は、ＶＥＧＦのタンパク質発現を上方調節すると共に末梢血中および骨髄中でのＥＰＣ動員を増進するＰＤＥ５阻害剤バルデナフィルとの関連で、マウスでの片側性後肢虚血のモデルにおいて、新血管形成に貢献することが実証済みである［Ｓａｈａｒａ ２０１０年、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ、７月；３０（７）：１３１５−２４］。この所見は、インビトロおよびインビボでの、内皮前駆細胞がＰＤＥ５を発現させるという所見、ＰＤＥ５阻害剤タダラフィルはＣＸＣＲ４発現増加が介在するＥＰＣ数の大幅な増加を誘発するという所見、ならびにヒトにおけるＰＤＥ５阻害剤での長期治療が循環ＥＰＣを増加させるという所見によって裏付けられ、骨髄からのＥＰＣ放出およびＥＰＣ介在型末梢内皮再生の双方におけるｃＧＭＰの２次メッセンジャーシステムの関与という概念を裏付けるものである［Ｆｏｒｅｓｔａら ２００５年、Ｉｎｔ Ｊ Ｉｍｐｏｔ Ｒｅｓ、７月−８月；１７（４）：３７７−８０］、［Ｆｏｒｅｓｔａら ２００９年、Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、９月；７１（３）：４１２−６］、［Ｆｏｒｅｓｔａら ２０１０年、Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ、１０月；７（４）：２７４−８２］。結論として、ＰＤＥ５阻害は、創傷治癒増進との関連で非常に関連性の高い治療戦略であることが説得力のある形で実証済みである。
創傷治癒における別の有望な一治療標的は、ミトコンドリアである。ＥＰＣは糖尿病条件下で機能不全となり、末梢循環障害および創傷治癒遅延という結果をもたらす。ミトコンドリア自食作用およびミトコンドリア障害は高糖条件下のＥＰＣにおいて誘発され、その結果、創傷治癒障害を含む糖尿病性心血管系合併症をミトコンドリア機能不全と結び付けることが実証済みである。したがって、ミトコンドリア機能の最適化も、糖尿病性創傷治癒を改善し得る［Ｋｉｍ ２０１４年、Ｂｉｏｌ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ；３７（７）：１２４８−５２］。
炎症性疾患および炎症状態との関連で、ＰＤＥ４阻害およびＩκＢキナーゼβ（ＩＫＫ−β）阻害は非常に有望な治療戦略である。ＰＤＥ４は、好酸球、好中球、マクロファージ、Ｔ細胞および単球を含む多様な炎症細胞における支配的なｃＡＭＰ分解酵素であり、またＴＮＦ−α、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２およびＩＦＮ−γなど前炎症性メディエーターを増加させ得ると共に、ＩＬ−１０など抗炎症性メディエーターを減少させ得る。ＰＤＥ４の阻害はこれらの細胞中のｃＡＭＰ増加という結果をもたらし、それが転じて炎症応答を下方調節する。ＰＤＥ４阻害剤の抗炎症効果は、インビトロでもインビボでも十分に文書化されており、またＰＫＡが部分的に介在するが、望ましくない炎症の抑制に主要な役割を果たすと見られるＥｐａｃも伴う［Ｐａｒｎｅｌｌ ２０１２年、Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ；１６６（２）４３４−４６］。ＰＤＥ４阻害剤アプレミラストは、動物の炎症性疾患モデルのほか、乾癬および乾癬性関節炎などヒト慢性炎症性疾患においても、顕著な抗炎症特性を有する。アプレミラストは複雑な炎症過程を低減し、またロイコトリエンＢ４、誘導型一酸化炭素合成酵素、マトリックスメタロプロテイナーゼの生産に干渉し、また多様な細胞型における腫瘍壊死因子アルファ、インターロイキン２３、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０など様々な前炎症性のサイトカインおよびケモカインの合成を阻止し［Ｓｃｈｅｔｔ ２０１０年、Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ Ｄｉｓ、１０月；２（５）２７１−８］、皮膚、関節、肺および腸における関節炎、乾癬、慢性閉塞性肺疾患および炎症性腸疾患など様々な慢性炎症状態におけるＰＤＥ４阻害の高い関連性を裏付けている。ＰＤＥ４の標的化とのさらなる関連性に関して、ＰＤＥ４欠乏は白色脂肪組織におけるマクロファージ浸潤を抑制し、脂肪症を低減することから、ＰＤＥ４阻害剤は肥満の処置および白色脂肪組織における肥満による炎症に有用となり得ることを示唆する［Ｒｅｎ ２００９年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ；１５０：３０７６−３０８２］。ｃＡＭＰ特異的ＰＤＥ４の阻害剤は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（アポＡ−Ｉ）介在型コレステロール流出をヒトのＴＨＰ−１マクロファージにおいて最大８０％、マウスのＪ７７４．Ａ１マクロファージにおいて最大１４０％増加させ、それに伴ってｃＡＭＰレベルが上昇することが示されており、またアテローム性病変からのコレステロール動員によるＣＶＤの処置に向けた新たな戦略を提供し得る［Ｌｉｎ ２００２年、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、１月１８日；２９０（２）：６６３−９］。ＰＤＥ４は、ＡＭＰＫの活性化／リン酸化状態に影響を及ぼすｃＡＭＰプールを調節し、またＰＤＥ４阻害はＡＭＰＫを活性化させることが示されている［Ｏｍａｒ ２００９年、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ、５月；２１（５）：７６０−６］、［Ｐａｒｋ ２０１２年、Ｃｅｌｌ、２月３日；１４８（３）：４２１−３３］。ＡＭＰＫは、グルコース代謝、脂質代謝およびタンパク質代謝の調節ならびにエネルギー恒常性の維持に関与する、極めて重要なセリンキナーゼ／スレオニンキナーゼである。最近の研究は、ＡＭＰＫはＮＦ−κＢの阻害、炎症性遺伝子の発現抑制および炎症性負傷の軽減も為し得ることを実証した［Ｙａｏ ２０１２年、Ｓｈｅｎｇ Ｌｉ Ｘｕｅ Ｂａｏ、６月２５日；６４（３）：３４１−５］。肝臓において、ＡＭＰＫの活性化は脂肪酸酸化の増進のほか、グルコース生産減少にも繋がる。ＡＭＰＫ系は部分的に、運動による健康上の便益をもたらし得るものであり、また抗糖尿病薬メトホルミンの標的である。ＡＭＰＫ系は肥満、ＤＭ２およびメタボリック症候群の新規治療法開発に主要な役割を果たす［Ｔｏｗｌｅｒ ２００７年、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ、２月１６日；１００（３）：３２８−４１］。このように、ＰＤＥ４阻害は、炎症状態改善のほか、代謝条件改善においても、有望な治療戦略である。
ＩＫＫ−βは、炎症の上流ＮＦ−κＢ信号変換カスケードの一部である。ＩＫＫ−βは阻害ＩκＢタンパク質をリン酸化し、その結果、ＩκＢをＮＦ−κＢから解離させる。すると、ＮＦ−κＢは自由に核へ移動し、前炎症性サイトカインのカスケードの転写を活性化する［Ｈａｃｋｅｒ ２００６年、Ｓｃｉ． ＳＴＫＥ；３５７：１３］。様々な組織中での軽度の炎症が、ＤＭ２およびＣＶＤなど代謝異常に関係する。肥満の場合、内臓脂肪中の炎症マクロファージ浸潤に伴う遊離脂肪酸の過負荷、小胞体の過負荷および過剰血糖値が慢性炎症を引き起こし、ＩＫＫ−βを活性化し、継続的炎症の悪循環、インスリン抵抗性の誘発、ＶＬＤＬ−トリグリセリドおよびリポタンパク質の生産増進に繋がる。マクロ生理学的レベルに対する結果は、高血糖症および高トリグリセリド血症である［Ｍｅｓｈｋａｎｉ ２００９年、Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ；４２（１３−１４）：１３３１−４６］、［Ｔｓａｉ ２００９年、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ；２９６（６）：Ｇ１２８７−９８］、［ｖＤｉｅｐｅｎ ２０１１年、Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ；５２：９４２−９５０］、［Ｓｏｌｉａｎｓ、２０１０年、Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ；２４：２５９６−２６１１］。ＩＫＫ−βは、肥満、代謝性炎症およびグルコース恒常性異常の間における、極めて重要な分子リンクの役割を果たすことが既に判明している。ＩＫＫ−βは、インスリン抵抗性または膵島機能不全に関係すると見なされてきた、ほぼすべての形態の代謝ストレスによって活性化される。さらに、ＩＫＫ−βは食餌性肥満、代謝性炎症、インスリン抵抗性およびβ細胞機能不全の促進に極めて重要に関係する。高グリセリド血症は、肥満を伴う脂質代謝変化の結果としての血漿中ＶＬＤＬ粒子蓄積によって引き起こされる。多数の組織における脂質蓄積は、白色脂肪組織中のマクロファージ浸潤および炎症性メディエーター生産など炎症過程の増大を伴う。肝臓において、脂肪蓄積は前炎症性ＮＦ−κＢの活性を増大させ、ＮＦ−κＢの肝臓特異的活性化は代謝障害を誘発する［Ｃａｉ ２００５年、Ｎａｔ Ｍｅｄ；１１：１８３−９０］、［Ａｒｋａｎ、２００５年、Ｎａｔ Ｍｅｄ；１１：１９１−９８］。前炎症性サイトカインは、高グリセリド血症を引き起こす可能性があり、逆に炎症抑制は高グリセリド血症を低減する可能性があり［Ｇｏｌｄｆｉｎｅ ２００８年、Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｓｃｉ；１：３６−４３］、高グリセリド血症の発達における炎症経路に対する直接の因果的役割を示唆している。肝細胞内に限った炎症経路の特異的活性化は高グリセリド血症を誘発し、また肝細胞のＩＫＫ−β経路は、高グリセリド血症の処置に向けて可能性のある標的として特定されている［Ｊａｎｎａ ２０１１年、Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ；５２：９４２−５０］。さらに、ＩＫＫ−β阻害はインスリン抵抗を逆転し［Ｍｉｎｓｈｅｎｇ ２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、８月３１日；２９３（５５３５）：１６７３−７］、またＩＫＫ−β経路阻害は肝臓のアポＢ１００の分解を増進することが示されており、炎症性ＩＫＫ−β介在型信号伝達カスケードのモジュレーションおよび肝合成およびアポＢ１００含有リポタンパク質分泌の間における重要な連鎖を明らかにしている［Ｔｓａｉ ２００９年、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ、６月；２９６（６）：Ｇ１２８７−９８］。このように、ＩＫＫ−β阻害は、炎症状態改善のほか、高グリセリド血症および代謝条件の改善においても、有望な治療戦略である。
ミトコンドリアは、エネルギーを要求する過程に必要なＡＴＰを生成するために酸素および基質を消費する、固有のゲノムを有する真核細胞中の細胞小器官である。好気性細胞中ではＡＴＰの大部分が酸化的リン酸化反応によって生産される。ミトコンドリア中では、クレブス回路から提供された電子が、電子伝達鎖を含む４つの錯体（錯体Ｉ−ＩＶ）を通過し、最終的に酸素を還元して水を生産する。電子束は、膜間腔とミトコンドリア基質との間に電気化学ポテンシャルを生み出す。このポテンシャルは、ＡＴＰシンターゼがＡＤＰをリン酸化してＡＴＰを生産する際に利用される（酸化的リン酸化反応）。ミトコンドリアはまた、信号変換、細胞周期調節、熱発生およびアポトーシスを含む、他の広範な細胞過程にも関与する。ミトコンドリアは、分裂、融合、自食作用および生物発生を介して再構築を継続する、非常に動的な細胞小器官である。ミトコンドリア生物発生とは、既存のミトコンドリア内容物の膨張を指し、ミトコンドリアネットワークの成長（ミトコンドリア質量増加）を介した膨張または既存のミトコンドリアの分裂（ミトコンドリア数の増加）を介した膨張のいずれを問わない。ミトコンドリア生物発生は、例えば運動、ストレス、低酸素状態、栄養可用性、インスリンを含むホルモン、反応性酸素生産および温度に対する応答として、エネルギー需要が呼吸容量を超えると引き起こされる。
予備呼吸容量は、基礎活性での酸化的リン酸化反応によって生産されるＡＴＰと最大活性での酸化的リン酸化反応によって生産されるＡＴＰとの差である。ある条件下で、組織はストレスまたは仕事量増加への応答として、付加的細胞エネルギーの突発的な急増を要求し得る。細胞の予備呼吸容量が、要求されるＡＴＰの提供に十分でない場合、影響を受ける細胞は老化または細胞死へと追い込まれる危険に曝される。予備呼吸容量の枯渇は、心臓疾患、神経変性障害および平滑筋細胞死を含む様々な病状と相互に関連付けられている［Ｄｅｓｌｅｒ ２０１２年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；２０１２年：１−９頁］。
ペルオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ共活性化因子１α（ＰＧＣ−１α）は、ミトコンドリアの生物発生および機能の主たる調節因子として幅広く認識されており、したがってミトコンドリア機能のモジュレーションとの関連で非常に興味深い、直接または間接の治療標的の代表例である。ＰＧＣ−１αは、ミトコンドリアタンパク質をコードする核遺伝子の発現、およびミトコンドリア転写因子Ａ（ＴＦＡＭ）をコードしてミトコンドリアＤＮＡ転写を調節する核遺伝子の発現も調節する、転写因子を共活性化させる。このように、ＰＧＣ−１αは、核遺伝子およびミトコンドリア遺伝子双方でコードされたミトコンドリアタンパク質の協調的発現を調節し、呼吸鎖でのタンパク質転写を調節する核呼吸因子１（ＮＲＦ−１）および核呼吸因子２（ＮＲＦ−２）の活性化、脂肪酸酸化（β酸化）を受け持つ酵素を調節するＰＰＡＲ−αの活性化、ミトコンドリア生物発生に繋がるミトコンドリアゲノムの発現を活性化するミトコンドリア転写因子Ａの活性化、ならびにグルコース摂取改善に繋がるグルコース輸送体の膜への転座によるインスリン感度上昇へ繋がる筋細胞増強因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）の共活性化を含む、一連の転写因子を活性化する。
ＰＧＣ−１αの活性化は、ＮＯ／ｃＧＭＰ信号伝達経路へ関連付けられており、したがってこれはＰＤＥ５の阻害を介したミトコンドリア機能のモジュレーションのための、関連性が高い戦略の代表例である［Ｎｉｓｏｌｉ ２００４年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、１１月２３日；１０１（４７）：１６５０７−１２］。低濃度ＮＯへの長期曝露は、ｃＧＭＰが介在するミトコンドリア生物発生を誘発し、またＰＧＣ−１α、ＮＲＦ−１およびミトコンドリア転写因子Ａの発現増加を伴う［Ｎｉｓｏｌｉ ２００３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２月７日；２９９（５６０８）：８９６−９］。ＮＯ／ｃＧＭＰ依存型のミトコンドリア生物発生はさらに、呼吸機能および代謝活性に関して機能的に活性のミトコンドリアを産出する［Ｎｉｓｏｌｉ ２００４年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、１１月２３日；１０１（４７）：１６５０７−１２］。したがって、ｃＧＭＰレベルの上昇という結果に至るＰＤＥ５阻害は、ミトコンドリアの生物発生および機能性を刺激するための、非常に興味深い標的である。これは、ｃＧＭＰ選択型ホスホジエステラーゼ阻害剤が腎組織中でのミトコンドリア生物発生を刺激するという所見［Ｗｈｉｔａｋｅｒ ２０１３年、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ、１２月；３４７（３）：６２６−３４］によって裏付けられ、またＰＤＥ５阻害剤シルデナフィルでの短期ＰＤＥ５阻害は、筋肉疲労を低減し、骨格筋タンパク質合成を増加させることが示されている［Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ Ｍｏｒｅら ２０１３年、Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｓｃｉ、１２月；６（６）：４６３−８］。
ＰＤＥ５阻害同様、ＰＤＥ４阻害も、ＰＧＣ−１αの活性化ならびにミトコンドリアの生物発生および耐久性強化の刺激に関連付けられているが、経路は異なる。したがって、ＰＤＥ４阻害剤ロリプラムは、ミトコンドリア生物発生を誘発しＰＧＣ−１α発現を増加させるほか、ロリプラム処置を受けたマウスは対照マウスに比べ、極度の疲労に達する前のトレッドミル上での距離が大幅に長くなるという効果を発揮することも実証済みである。
持久運動訓練はミトコンドリアの大幅な増加を誘発すること、さらにはたった１回の運動でも、ＰＧＣ−１αの活性化および発現増加双方が介在するミトコンドリア生物発生の急増を誘発することは、十分に立証されている［Ｈｏｌｌｚｙ ２０１１年、Ｃｏｍｐｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ、４月；１（２）９２１−４０］、［Ｈｏｌｌｏｓｚｙ ２００８年、Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、１２月；５９ Ｓｕｐｐｌ ７：５−１８］、［Ｂａｒｌｅｔｔ ２０１２年、Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、４月；１１２（７）：１１３５−４３］。ＰＧＣ−１α信号伝達は骨格筋の持久運動への応答としてミトコンドリア生物発生および血管形成を制御し、またＰＧＣ−１αは運動能力を高めることが示されており［Ｔａｄａｉｓｈｉら ２０１１年、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、１２月、第６巻、第１２号：１−１３］、またかなりの度合いで、持久訓練によって誘発される、線維型転換、ミトコンドリア生物発生、血管形成、インスリン感度および代謝柔軟性の改善など、骨格筋の適応変化は、ＰＧＣ−１αによって調節される［Ｌｉｒａ ２０１０年、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅａｔｂ、８月；２９９（２）Ｅ１４５−６１］、［Ｃａｌｖｏら ２００８年、Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００８年５月；１０４（５）：１３０４−１２］。このように、ミトコンドリアの機能および生物発生の増加は、スポーツとの関連で運動能力および持久力を高めるための、関連性が高い戦略である。
老化は、様々な生理的機能の漸進的劣化を特徴とする不可避の生物学的過程であり、高齢者を次第に虚弱にし、疾患に対する感受性を増大させる。老化過程は、ミトコンドリアの酸化的リン酸化反応の減速によるミトコンドリア機能不全の悪化、ミトコンドリアのＲＯＳ生産許容力の増大、および特定の基質のミトコンドリア酸化の障害と関連がある。結果としてミトコンドリア機能におけるこうした老化による変化は、エネルギー生産を阻害するほか、有毒な活性酸素中間体の生産を増加させる［Ｍａｒｃｏｖｉｎａ ２０１３年、Ｔｒａｎｓｌ Ｒｅｓ、２月；１６１（２）：７３−８４］。酸化的リン酸化反応およびミトコンドリアＤＮＡ変異の蓄積に対する、加齢に伴うミトコンドリアの許容力低下は、脱毛症、骨粗鬆症、脊柱後弯症、心筋症、貧血症、生殖腺萎縮およびサルコペニアを含む、加齢に伴う一連の病理学的変化の発症機序に関連付けられており［Ｄｅｓｌｅｒ ２０１２年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１２：１−９］、またミトコンドリア機能不全は、神経変性、心血管疾患および糖尿病など、大部分の加齢に伴う疾患に関連付けられている。
骨格筋機能の低下は、床上安静に伴って、または癌、筋ジストロフィーおよび心不全など多様な疾患に伴って発生するほか、健康的な老化の過程でも発生する。筋機能低下の症状としての筋疲労は、スポーツや運動活動中によく見られる症状であるだけでなく、日々の活動を行う過程での多数の疾患および健康状態において、二次的結果として観察される例も増えている。しかし、骨格筋機能障害を改善するための、一般に認められた薬理療法はない。このように、老化した骨格筋または運動しない骨格筋の内部では、線維数が大幅に失われ、明白な生化学的異常および形態学的異常が生じる。１７歳から９１歳までの人々からの骨格筋生検に関する複数の大規模研究において、ミトコンドリア呼吸容量の、加齢に伴う大幅な減少を示している。老化が進む筋肉におけるミトコンドリア呼吸容量の大幅な低下は、高齢者の運動能力低下、およびそれに伴う、ますます運動しなくなる生活様式に関連する疾患のリスク増大に寄与し得る。またミトコンドリアの変化は、老化に伴う筋機能損失の根底を成すだけでなく、加齢に伴って見られることの多い他の病状の根底も成し、異所性脂質浸潤、全身性炎症およびインスリン抵抗性などの疾患のリスクを増大させ得る［Ｄｅｓｌｅｒ ２０１２年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１２：１−９］、［Ｓｃｈｅｉｂｙｅ−Ｋｎｕｄｓｅｎら ２０１３年、Ａｇｉｎｇ、３月、第５巻第３号：１９２−２０８］、［Ｐｅｔｅｒｓｏｎら ２０１２年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１−２０頁］、［Ｂｏｆｆｏｌｉら １９９４年、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．、４月１２日；１２２６（１）：７３−８２］。前述の通り、ＰＧＣ−１αはミトコンドリアの生物発生および機能の主要な調節因子であり、また生涯にわたる訓練はミトコンドリアＤＮＡおよびＰＧＣ−１αを保全する一方、生涯にわたる運動不足の行動は、ミトコンドリア内容物におけるこれらのマーカーを減少させてしまう。さらに、運動しない老化に伴ってミトコンドリア機能不全が観察されるものの、運動しない高齢者の筋肉でも、ミトコンドリア生物発生の早期過程の調節を伴う急性信号伝達経路を活性化させる能力を保持することが示されている［Ｃｏｂｌｅｙ ２０１２年、Ｂｉｏｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ、１３（６）：６２１−６３１］。したがって、例えば高齢者のほか、床上安静中の人または有病者または筋機能障害の状態にある人における、ＰＤＥ４阻害およびＰＤＥ５阻害によるＰＧＣ−１α活性化などを介したミトコンドリアの生物発生および機能の改善は、関連性が高い。
中枢神経系は特に、ミトコンドリア機能不全に陥りやすく、またミトコンドリア機能の増強は、一連のＣＮＳ障害に中枢的役割を果たし得る。神経細胞の予備呼吸容量の枯渇は、致命的影響を及ぼし得る。安静時の神経細胞は自己の最大呼吸容量を約６％しか利用しない一方、発火時の神経細胞は最大８０％利用する。したがって、加齢に伴う予備呼吸容量のわずかな減少でも、生体エネルギー枯渇に対する神経細胞脆弱性を増大させ、組織を罹患しやすくする。このように、ミトコンドリア異常は様々な神経変性疾患患者に発生し、独特のミトコンドリア異常が特定の障害の特徴である。これはアルツハイマー病など加齢に伴って見られることの多い障害に当てはまる。アルツハイマー病は、アルツハイマー病に苦しむ人々が大部分を占める認知症患者が２，５００万人を超える、世界の高齢人口における１つの重大問題である。米国だけでも、アルツハイマー病患者は約５４０万人にのぼり、２０５０年までに１，２００万人乃至１，６００万人に達すると予想されている。米国では２０１１年、６５歳以上のアルツハイマー病患者および他の認知症患者の医療、長期ケアおよびホスピスサービスの費用が１，８３０億ドルと予想された。アルツハイマー病をミトコンドリア機能不全と関連付ける証拠がますます増えている。齧歯動物での神経変性アルツハイマー病モデルは、ミトコンドリア呼吸欠乏がアルツハイマー病の発症機序に先行することを示している。またアルツハイマー病は、ミトコンドリア生物発生に関係する酵素の発現および活性の減少も伴う。相応に、アルツハイマー病患者において、診断より１０年も早く、脳代謝低下が検出され得る。機能的変化に加え、広範な文献が示唆するところ、ミトコンドリアの構造力学はアルツハイマー病患者においても変わる。他にも、同じくミトコンドリア機能不全に関連のある神経変性疾患としてパーキンソン病、ＡＬＳ運動ニューロン変性およびハンチントン病がある［Ｌｅｚｉ ２０１２年、Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ；９４２：２６９−２８６］、［Ｄｅｓｌｅｒ ２０１２年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；２０１２：１−９］。
リベスは、北半球の温暖地域全域にわたり自生する約１５０種の顕花植物から成る一属である。リベスは通常、スグリ科（Ｇｒｏｓｓｕｌａｒｉａｃｅａｅ）に属する唯一の属として扱われる。リベス・ルブルム種およびリベス・ニグルム種は、食用の赤スグリ、黒スグリ、緑スグリおよび白スグリの実を生産することから、幅広く栽培されている。多様な亜種および多数の栽培品種が認識されている。これらの漿果は、例えば汁の形で、飲食料品産業で幅広く利用されている。
２００２年、Ｌｕらは２つのニトリルアルカロイド、ニグルミン−５−クマレート［系統名（Ｅ）−（Ｅ）−２−シアノ−４−（β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）ブタ−２−エン−１−イル３−（４−ヒドロキシフェニル）アクリレート］およびニグルミン−５−フェルレート［系統名（Ｅ）−（Ｅ）−２−シアノ−４−（β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）ブタ−２−エン−１−イル３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）アクリレート］を、リベス・ニグルムの種子中に発見した［Ｌｕ ２００２年、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；５９（４）：４６５−８］。
２００７年、Ｓｃｈｗａｒｔｚらは系統名（Ｅ）−２−シアノ−４−（β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）ブタ−２−エン−１−イル４−ヒドロキシ−３−メトキシベンゾエートおよび（Ｅ）−２−シアノ−４−（β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）ブタ−２−エン−１−イル‘４−ヒドロキシベンゾエートという２つのニトリルアルカロイドを、系統名１−β−Ｄ−グルコピラノシル−１Ｈ−インドール−３−酢酸および１−β−Ｄ−グルコピラノシル−１Ｈ−インドール−３−酢酸メチルエステルというインドールアルカロイドと一緒に発見し、これらはすべて、赤スグリの苦味に寄与すると観察された［Ｓｃｈｗａｒｔｚ ２００７年、Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ；５５：１４０５−１４１０］。
上記のリベス種に見つかったアルカロイドはいずれも、如何なる薬効特性にも原因帰属されていない。
Ｓｃｏｔｔ ２００４年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ；１０９：４３３−４３８ Ｇｒｕｎｄｙ ２００４年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ；１０９：４３３−４３８ ＷＨＯ Ｆａｃｔ ｓｈｅｅｔ第３１７号、２０１１年９月 ＷＨＯ Ｆａｃｔ ｓｈｅｅｔ第３１２号、２０１１年８月 Ｍｏｌｌｅｒ ２００１年、Ｎａｔｕｒｅ；４１４、８２１−２７ Ｂｈａｔｎａｇａｒ ２００８年、ＢＭＪ；３３７：５０３−８ Ｂａｕｍｅｒ ２００７年、Ｉｎｆｌａｍｍ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ、３月、６（１）：１７−２６ Ｗｈｉｔｔｍａｎｎ ２０１３年、Ｐ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｔｈｅｒ、４月２７日；３（１）：１−１５ Ａｓｌａｍ ２０１３年、Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａ；２０７（６９４）：Ｏ１０ Ｉｋａｒｉ ２０１３年、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１０月；４９（４）：５７１−８１ Ｃｅｒａｄｉｎｉ ２００４年、Ｎａｔ Ｍｅｄ、８月；１０（８）：８５８−６４ Ｔｅｐｐｅｒ ２００５年、Ｂｌｏｏｄ、２月１日；１０５（３）：１０６８−７７ Ｂｉｔｔｏ ２０１３年、Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ、１２月；１２５（１２）：５７５−８５ Ｇｕ ２０１３年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ；１０月；１０２（１）：５３−９ Ａｓａｉ ２００６年、Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ、５月；１２６（５）１１５９−６７ Ｓｉｎｎｏ ２０１３年、Ｐｌａｓｔ Ｓｕｒｇ Ｉｎｔ；２０１３：１−７ Ｎａｋａｍｕｒａ ２０１３年、Ｂｉｏｍｅｔｅｒｉａｌｓ、１２月；３４（３７）：９３９３−４００ Ｂｅｒｍｕｄｅｚ ２０１１年、Ｊ Ｖａｓｃ Ｓｕｒｇ；５３：７７４−８４ Ｚｈｏｕ ２０００年、Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ、９月；１４３（３）：５０６−１２ Ｏｎｕｍａ ２００１年、Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｒｅｓ、３月；２９３（３）：１３３−８ Ｉｗａｓａｋｉ １９９４年、Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ、６月；１０２（６）：８９１−７ Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ ２００６年、Ｂｉｏｍｅｔｅｒｉａｌｓ、３月；２７（８）：１３５５−６１ Ｉｓｈｉｉ ２０１３年、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ、７月；３４６（１）：１０５−１２ Ｒｕｎｄｆｅｌｄｔ ２０１２年、Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｒｅｓ、２月３日（３０４）：３１３−３１７ Ｅｍｉｎｇ ２００７年、Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ、３月；１２７（３）：５１４−２５ Ｆａｒｓａｅｉ ２０１２年、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ Ｓｃｉ；１５（４）：４８３−４９８ Ｈａｎら ２０１２年、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、４月；１８０（４）：１４６５−７３ Ｆｒａｎｋら ２００２年、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；６１：８８２−８８８ Ｗｉｔｔｅ ２００２年、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、１０月；５１（１０）：１２６９−７３ Ｓａｈａｒａ ２０１０年、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ、７月；３０（７）：１３１５−２４ Ｆｏｒｅｓｔａら ２００５年、Ｉｎｔ Ｊ Ｉｍｐｏｔ Ｒｅｓ、７月−８月；１７（４）：３７７−８０ Ｆｏｒｅｓｔａら ２００９年、Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、９月；７１（３）：４１２−６ Ｆｏｒｅｓｔａら ２０１０年、Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ、１０月；７（４）：２７４−８２ Ｋｉｍ ２０１４年、Ｂｉｏｌ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ；３７（７）：１２４８−５２ Ｐａｒｎｅｌｌ ２０１２年、Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ；１６６（２）４３４−４６ Ｓｃｈｅｔｔ ２０１０年、Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ Ｄｉｓ、１０月；２（５）２７１−８ Ｒｅｎ ２００９年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ；１５０：３０７６−３０８２ Ｌｉｎ ２００２年、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、１月１８日；２９０（２）：６６３−９ Ｏｍａｒ ２００９年、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ、５月；２１（５）：７６０−６ Ｐａｒｋ ２０１２年、Ｃｅｌｌ、２月３日；１４８（３）：４２１−３３ Ｙａｏ ２０１２年、Ｓｈｅｎｇ Ｌｉ Ｘｕｅ Ｂａｏ、６月２５日；６４（３）：３４１−５ Ｔｏｗｌｅｒ ２００７年、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ、２月１６日；１００（３）：３２８−４１ Ｈａｃｋｅｒ ２００６年、Ｓｃｉ． ＳＴＫＥ；３５７：１３ Ｍｅｓｈｋａｎｉ ２００９年、Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ；４２（１３−１４）：１３３１−４６ Ｔｓａｉ ２００９年、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ；２９６（６）：Ｇ１２８７−９８ ｖＤｉｅｐｅｎ ２０１１年、Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ；５２：９４２−９５０ Ｓｏｌｉａｎｓ、２０１０年、Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ；２４：２５９６−２６１１ Ｃａｉ ２００５年、Ｎａｔ Ｍｅｄ；１１：１８３−９０ Ａｒｋａｎ、２００５年、Ｎａｔ Ｍｅｄ；１１：１９１−９８ Ｇｏｌｄｆｉｎｅ ２００８年、Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｓｃｉ；１：３６−４３ Ｊａｎｎａ ２０１１年、Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ；５２：９４２−５０ Ｍｉｎｓｈｅｎｇ ２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、８月３１日；２９３（５５３５）：１６７３−７ Ｄｅｓｌｅｒ ２０１２年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；２０１２年：１−９頁 Ｎｉｓｏｌｉ ２００４年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、１１月２３日；１０１（４７）：１６５０７−１２ Ｎｉｓｏｌｉ ２００３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２月７日；２９９（５６０８）：８９６−９ Ｗｈｉｔａｋｅｒ ２０１３年、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ、１２月；３４７（３）：６２６−３４ Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ Ｍｏｒｅら ２０１３年、Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｓｃｉ、１２月；６（６）：４６３−８ Ｈｏｌｌｚｙ ２０１１年、Ｃｏｍｐｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ、４月；１（２）９２１−４０ Ｈｏｌｌｏｓｚｙ ２００８年、Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、１２月；５９ Ｓｕｐｐｌ ７：５−１８ Ｂａｒｌｅｔｔ ２０１２年、Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、４月；１１２（７）：１１３５−４３ Ｔａｄａｉｓｈｉら ２０１１年、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、１２月、第６巻、第１２号：１−１３ Ｌｉｒａ ２０１０年、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅａｔｂ、８月；２９９（２）Ｅ１４５−６１ Ｃａｌｖｏら ２００８年、Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００８年５月；１０４（５）：１３０４−１２ Ｍａｒｃｏｖｉｎａ ２０１３年、Ｔｒａｎｓｌ Ｒｅｓ、２月；１６１（２）：７３−８４ Ｓｃｈｅｉｂｙｅ−Ｋｎｕｄｓｅｎら ２０１３年、Ａｇｉｎｇ、３月、第５巻第３号：１９２−２０８ Ｐｅｔｅｒｓｏｎら ２０１２年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１−２０頁 Ｂｏｆｆｏｌｉら １９９４年、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．、４月１２日；１２２６（１）：７３−８２ Ｃｏｂｌｅｙ ２０１２年、Ｂｉｏｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ、１３（６）：６２１−６３１ Ｌｅｚｉ ２０１２年、Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ；９４２：２６９−２８６ Ｌｕ ２００２年、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；５９（４）：４６５−８ Ｓｃｈｗａｒｔｚ ２００７年、Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ；５５：１４０５−１４１０
本発明は、系統名（Ｅ）−（Ｅ）−２−シアノ−４−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブタ−２−エン−１−イル３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アクリレートという、新たな高度生物活性ニトリルアルカロイド（以下「リベトリルＡ」という）の発見に関する。
Figure 2016525103
発明者らは該化合物を複数のリベス種から単離した。
この新たなアルカロイド、リベトリルＡは驚くほど強い生物活性を示し、また実施例３で実証される通り、同じフェニル−アクリル酸の骨格を有する２つの既知の構造的類似体に比べ、４８倍および１１８倍低い活性濃度（ＩＣ−５０）を示す。
本発明はさらに、高度生物活性アルカロイド画分をリベス・ルブルムおよびリベス・ニグルムなどリベスの漿果および葉から取得できるという、驚異的発見にも関する。リベスから取得可能な該アルカロイド画分は、実施例３、実施例４および実施例５で実証される通り、低濃度で、インビトロのＩＫＫ−β、ＰＤＥ４およびＰＤＥ５に対して強い阻害効果を示す。加えて、細胞実験の結果、実施例６、実施例７および実施例８で実証される通り、ミトコンドリアの生物発生および予備呼吸容量に対する非常に驚異的な刺激効果が実証された。
その上、またはその代わりに、本発明の生物活性アルカロイド画分であるリベトリルＡは場合によって、前述の４つのニトリルアルカロイドを含む。
Figure 2016525103
 系統名：（Ｅ）−（Ｅ）−２−シアノ−４−（β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）ブタ−２−エン−１−イル３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）アクリレート（以下「リベトリルＢ」という）
Figure 2016525103
 系統名：（Ｅ）−（Ｅ）−２−シアノ−４−（β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）ブタ−２−エン−１−イル３−（４−ヒドロキシフェニル）アクリレート（以下「リベトリルＣ」という）
Figure 2016525103
 系統名：（Ｅ）−２−シアノ−４−（β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）ブタ−２−エン−１−イル４−ヒドロキシ−３−メトキシベンゾエート（以下「リベトリルＤ」という）
Figure 2016525103
 系統名：（Ｅ）−２−シアノ−４−（β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）ブタ−２−エン−１−イル４−ヒドロキシベンゾエート（以下「リベトリルＥ」という）
さらに、本発明のアルカロイド画分は、以下の式で表わされる、前述のインドールアルカロイドを含み得る。
Figure 2016525103
 系統名：２−（１−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インドール−３−イル）酢酸（以下「グルコインドールＡ」という）
Figure 2016525103
 系統名：メチル２−（１−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−１Ｈ−インドール−３−イル）アセテート（以下「グルコインドールＢ」という）
これらのアルカロイドはいずれもまだ、薬効効果または健康促進効果に原因帰属されていない。
実施例１で実証される通り、本発明のアルカロイドは自然形態のリベスの漿果中にごく少量、例えば典型的にリベトリルＡが０〜０．８ｐｐｍ、またリベトリルＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥが合計で０．５〜１．５ｐｐｍといった量しか存在しない。同様にごく少量のグルコインドールが、典型的に３．２〜６．９ｐｐｍといった濃度で認められる。
本発明によれば、リベスの革新的な濃縮物または抽出物は、生理的活性レベルの本発明の活性リベスアルカロイドを提供し得る生産物の取得に必要であると見られる。
驚くことに、本発明者らは、該リベスアルカロイド画分は十分な量を哺乳動物へインビボ投与した場合、強い健康促進効果を有することを発見し、これについて発明者らが立てた仮説は、前述の、ＩＫＫ−β、ＰＤＥ４またはＰＤＥ５に対する阻害効果、またはミトコンドリアの生物発生および予備呼吸容量に対する刺激効果に関する。
相応に、発明者らは、本発明のアルカロイド画分は強い創傷治癒特性を示すことを発見した。既存の処置は圧倒的に局所適用されるものである一方、リベスアルカロイド画分は、局所適用を排除することなく、効果的な全身性創傷治癒剤であると見られる。
これは、日用量１１２μｇ／ｋｇのリベトリルＡおよび合計４９２μｇ／ｋｇの各種リベトリル、ならびに合計２４０μｇ／ｋｇの各種グルコインドールに相当する本発明のリベスアルカロイド画分を経口投与したところ、複数のマウス群において、極めて類似の結果を伴った２つの同一実験でビヒクル処置を施された対照マウスに比べ、大きな皮膚切除創傷の治癒が大幅に速かったという、実施例１１において、説得力のある形で実証および追認される。切除負傷の３日後、創傷閉鎖度はリベスアルカロイド処置群がビヒクル処置群より７８％高く、また５日後の創傷閉鎖度はリベスアルカロイド処置群がビヒクル処置群より２倍超高かった。第１の実験において、創傷の半分が閉じるまでの平均所要時間はリベスアルカロイド処置群で５．９日であったのに比べ、対照群では８．３日であった。第２の実験において、創傷の半分が閉じるまでの平均所要時間はリベスアルカロイド処置群で６．０日であったのに比べ、ビヒクル処置対照群では８．２日であった。これらの効果はすべて、統計的に有意であった（Ｐ＜０．０５）。
実施例１２において、創傷治癒に対するリベスアルカロイドの用量反応関係が示唆されたが、これは合計４９２μｇ／ｋｇの各種リベトリルおよび合計２４０μｇ／ｋｇの各種グルコインドールの日用量を提供した高用量アルカロイド製剤が、合計１８μｇ／ｋｇの各種リベトリルおよび合計９７μｇ／ｋｇの各種グルコインドールを提供した本発明のアルカロイド製剤と比較された結果である。前処置後、これらの群はいずれも、創傷の半分が閉じるまでの平均所要時間に対して統計的に有意な効果をもたらした（高用量群で７．１日、低用量群で７．９日であったのに比べ、ビヒクル処置群では９．３日であったことから、用量反応関係が示唆される）。
実施例１３において、本発明の２つの異なるリベス画分における潜在的相乗効果が示唆されたが、これはリベス・ルブルム由来の濃縮物（グルコインドールが支配的な化学的プロファイル）およびリベス・ニグルム由来の濃縮物（リベトリルが支配的な化学的プロファイル）を重量比５０／５０で混合したものが、本発明の個別のリベスアルカロイド濃縮物（創傷の半分が閉じるまでの平均所要時間は７．２日および７．１日）およびビヒクル対照群（創傷の半分が閉じるまでの平均所要時間は７．９日）よりも一層顕著な創傷治癒効果を発揮したことによる。
実施例１４において、糖尿病マウスでの慢性創傷モデルにおける有意な創傷治癒効果が、本発明の２つの異なるリベスアルカロイド製剤により実証された。
実施例１５において、経口投与された本発明のリベスアルカロイド抽出物の創傷治癒効果は多様な種にまたがって、また雌雄を問わず認められることが実証された。
実施例１７において、目覚ましい、発現が速く統計的に有意な創傷治癒効果が、実施例１６で調製されるようなリベスアルカロイド画分を含む経口栄養物を自己管理で摂取したヒト対象の急性創傷でも認められることが実証された。創傷治癒の増進度は、齧歯動物モデルで観察された効果と同等であった。
このように、発明者らは、本発明のアルカロイドは急性難治性創傷はもとより、慢性難治性創傷においても創傷治癒剤として使用することができ、また経口投与後に活性となるという顕著な優位性を有することを発見した。より迅速な急性創傷治癒は、創傷治癒速度の上昇に伴って感染および難治性創傷発達のリスクが減少することから、関連性が高い。さらに、より迅速な慢性創傷治癒は、医療制度における慢性創傷管理の処置上の重大な課題および膨大な経済的負担に対して大いに求められてきた解決策を提供するものである。
実施例９において、本発明の１つのリベスアルカロイド組成物が、高脂肪食によって誘発される脂質異常症のモルモットにおけるコレステロール低下効果の可能性について試験された。１１２μｇ／ｋｇのリベトリルＡおよび合計４９２μｇ／ｋｇの各種リベトリルならびに合計２４０μｇ／ｋｇの各種グルコインドールから成るリベスアルカロイド画分、ならびに１０ｍｇ／ｋｇの陽性基準化合物アトルバスタチンが１日１回、連続２８日間にわたり経口投与された。１日目の初回投与前、１５日目および２９日目に、夜間絶食させた動物から、血清総コレステロールレベル、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルおよびトリグリセリドレベルの測定向けに血液が採取された。驚くことに、わずか１５日後にリベスアルカロイド処置動物は、ビヒクル対照群に比べ、トリグリセリドレベルの３２％低下を示し（Ｐ＜０．０５）、低下はさらに進んで２９日間の処置後には５０％低下となった（Ｐ＜０．０５）。さらに、リベスアルカロイド処置群は２９日間の処置後に血清総コレステロールの４０％減少（Ｐ＜０．０５）およびＬＤＬの３９％減少（Ｐ＜０．０５）を示し、これは陽性対照のアトルバスタチンと同程度であった。総合的に考えて、トリグリセリドレベルおよび総コレステロール双方の低下により、本発明のリベスアルカロイド画分は、トリグリセリドレベルに対して有意な減少効果を示さなかったアトルバスタチンより優れていた。これは本発明のアルカロイドの作用機序が完全に異なることが背景にある可能性が最も高い。
トリグリセリド、ＬＤＬおよび総コレステロールの有意な低下効果は、実施例１９で実証される通り、ヒト対象において説得力のある形で追認された。
実施例１０において、本発明の１つのリベスアルカロイド組成物が、非インスリン依存性糖尿病の一モデルであるＢＫＳ Ｃｇ−Ｌｅｐｒ ｄｂ／Ｌｅｐｒ ｄｂマウスにおける血糖低下効果の可能性について試験された。６匹〜１２匹のマウスから成る複数の群が、日用量１１２μｇ／ｋｇのリベトリルＡおよび合計４９２μｇ／ｋｇの各種リベトリルならびに合計２４０μｇ／ｋｇの各種グルコインドールから成る本発明のリベスアルカロイド画分、または３００ｍｇ／ｋｇの陽性抗糖尿病基準化合物メトホルミンによる処置を連続１４日間にわたり受け、ビヒクル処置対照群と比較された。血清グルコースレベルおよび血清インスリンが、１日目の処置前ならびに７日目および１４日目の日用量投与の９０分後に測定された。リベスアルカロイド組成物処置群は１４日目に、インスリンレベルに影響を及ぼすことなく、メトホルミン同様の血糖値低下を示した（Ｐ＜０．０５）。
実施例６において、本発明の２つのリベスアルカロイド組成物が、培養筋細胞中でのミトコンドリア生物発生を増進する能力について試験された。この実験において、これらのリベスアルカロイド組成物での４８時間にわたるインキュベーションが、生理学的に関連性のある濃度でのミトコンドリア生物発生を大幅に増加させることが、説得力のある形で実証された。筋細胞中でのミトコンドリア生物発生増加は、ストレスの多い条件および／もしくは運動中の筋肉における高いエネルギー需要に対処するために許容力増強が必要な場合、または不活動、病気または年齢に起因するミトコンドリアの量および機能の減少が筋細胞の機能性を減じている場合に、関連性が高い。
実施例７および８において、本発明の３つのリベスアルカロイド画分が、培養筋細胞中での予備呼吸容量を増加させる能力について試験された。驚くことに、本発明のリベスアルカロイド画分、ＲＡＰ１３、ＲＡＰ１４およびＲＡＰ１５は、培養筋細胞が標準的なミトコンドリアストレステストに曝された場合、生理学的に関連性のある濃度でＣ２Ｃ１２細胞の予備呼吸容量を大幅に増加させることが実証された。これは極めて興味深く、何故なら細胞の予備呼吸容量が、要求されるＡＴＰの提供に十分でない場合、影響を受ける細胞の機能が最適な水準に及ばず、さらには老化または細胞死へと追い込まれる危険に曝されるからである。したがって、筋細胞中の予備呼吸容量増加は、筋肉の機能および能力における持久力の改善、ストレスに対する抵抗性の改善はもとより、老化および不活動の効果への拮抗の改善にも、極めて有用である。
ミトコンドリアは、障害されると病的状態へと劣化し得る多数の重要な生理的過程の調節における、主要な岐路であることが、幅広く認識されつつある。さらに、ミトコンドリアは、エネルギー産生代謝、糖分および脂質のＡＴＰへの転換における、終着点に相当する。ミトコンドリア生物発生および予備呼吸容量双方に対するリベスアルカロイド画分の複合的効果は、ミトコンドリア機能不全を伴う病的状態のほか、健康改善、スポーツおよび筋肉性能の様々な領域、ならびにエネルギーを必要とする条件においても、ミトコンドリア機能を最適化するための全く新たな方法を提供する。さらに、ミトコンドリア機能不全および予備呼吸容量低下は、脱毛症、骨粗鬆症、脊柱後弯症、心筋症、貧血症、生殖腺萎縮およびサルコペニアに繋がる、老化段階での様々な生理的機能の劣化に直接関連付けられている。加えて、中枢神経系は、ミトコンドリア機能不全に対して特に脆弱な、エネルギー需要の多い組織であり、また加齢に伴う予備呼吸容量減少は、この組織を罹患しやすくする。したがって、ミトコンドリア機能不全は、診断より１０年も早く脳代謝低下が検出され得るアルツハイマー病を含め、様々な神経変性疾患患者において発生する。他にも、同じくミトコンドリア機能不全に関連のある神経変性疾患としてパーキンソン病、ＡＬＳ運動ニューロン変性およびハンチントン病がある。加齢に伴うこれらの生理的劣化および病気すべてに関して、本発明のリベスアルカロイド画分は、新しい有望な介入原理を提供する。
本発明のリベスアルカロイドおよびアルカロイド画分の、老化および神経変性の分野内での応用は、実施例２３および２７によって強固に裏付けられる。実施例２３において、本発明のリベスアルカロイドを含む栄養物は、ある８１歳の男性のスポーツ競技中における疲労感および疲労を減少させ、本発明のリベスアルカロイド画分の栄養物製剤を摂取する前に比べ、標準条件下でテニス競技を５０％長く続ける能力を高めた。これは、加齢に伴う身体疲労および筋肉疲労に対する、本発明のリベスアルカロイドを含む栄養物による有意な改善効果を意味する。
実施例２７において、外傷性脳出血を患っていたある７５歳の女性のリハビリ期間中に絶え間なく続いていた身体疲労および精神疲労が、本発明のリベスアルカロイドを含む栄養物の摂取後、１週間以内に激減した。これは、本発明のリベスアルカロイドを含む栄養物による、中枢神経系機能の改善および正常化への多大な貢献を意味し、これは対象が驚異的な速度で、毎日の日課および活動を従前の能力に匹敵するレベルで再開できるようになったことから、非常に有意であった。
ミトコンドリアの生物発生および機能の改善は持久力および運動能力の最適化における主要な一様態であるという、強固な既存の証拠を基に、実施例２４、２５および２６における３名の競技試験対象において際立って改善された能力は、実施例６、７および８で実証されるような筋細胞中で得られるミトコンドリアの生物発生および予備呼吸容量の増進によるものと見なすことができること、また本発明のリベスアルカロイド組成物は、持久力および運動能力に関連する筋肉生理の関連性の高い様態を増進するための経口管理に応用できることは明白である。これは、ある１６歳の男性の水泳選手が本発明のリベスアルカロイドを含む栄養物を１４日間摂取した後に、総体的な標準水泳試験タイムが６．４％向上し、水泳試験の後半では一層目覚ましく１２．１％も向上したという、実施例２４によって強固に裏付けられる。これは、別段にはより長期間にわたる極めて集中的なトレーニング体制を通じてしか達成し得ない、例外的改善であり、本発明のリベスアルカロイドを含む栄養物の身体能力および持久力の増進効果を実証するものである。
実施例２５において、ある２８歳の身体トレーニングを十分に積んだ男性長距離走選手が、本発明の栄養物をわずか７日間にわたり経口投与した後の標準的なコンコーニテストにおいて、計算上のＶＯ２Ｍａｘが７．８％改善した。これは、対象の高レベルのフィットネスおよびそれ故の処置前の非常に高いＶＯ２Ｍａｘを考慮しても、通常はより長期間にわたる苛酷なインターバルトレーニングを通じてしか達成し得ない例外的改善であり、本発明のリベスアルカロイドを含む栄養物の、運動選手におけるＶＯ２Ｍａｘの増進効果を実証するものである。
実施例２６において、本発明のリベスアルカロイドを含む栄養物を毎日経口投与するようになってからわずか４日後、ある４８歳の、身体トレーニングを十分に積み、長距離の激しいサイクルトレーニング中の無酸素閾値心拍数が１７５ｂｐｍで定着していた男性が、長距離の激しいトレーニングパスの間に２０分間にわたり平均心拍数が５．７％向上して１８５ｂｐｍとなり、これは本発明のリベスアルカロイドを含む栄養物によって発揮される、迅速な作用の発現ならびに持久力および乳酸閾値の向上を意味する。
実施例３および４において、本発明のリベスアルカロイド画分は、様々な種類の炎症の伝播との関連性がいずれも高い酵素であるＩＫＫ−βおよびＰＤＥ４を用量依存的に阻害する能力があることが実証された。これらの効果の生理学的関連性は、ある４７歳の、左手の第１手根中手関節に骨関節炎を患い、２年超にわたり痛み、腫れ、凝りおよび関節機能障害の症状が増大していた男性が、自身の状態を軽減するための手術を勧められていたという、実施例２１によって強固に裏付けられる。対象は本発明のリベスアルカロイドを含む栄養物での経口処置を開始したところ、罹患関節の痛みおよび腫れが徐々に減少し、そして本発明のリベスアルカロイドを含む栄養物を１２週にわたり摂取した結果、骨関節炎の症状がすべて完全に解消した。対象は、手根中手関節の痛みまたは他の症状を全く生じることなく、あらゆる種類の日常活動および手作業において親指を制限なく使えるようになった（痛みは１００％低減されたと推定される）。さらなる８週間の処置の間、骨関節炎の症状が出ない状態が続いたことから、手術は取り止めとなった。
実施例２２において、右足で４年間、左足で３年間にわたり第１中足指節関節の骨関節炎と診断されていたある４３歳の女性が、痛みの増大および関節可動性減少に苦しんでいた。本発明のリベスアルカロイドを含む栄養物を２週間経口投与した後、両足の第１中足指節関節の痛みが対象の推定によると８０％低減され、関節可動性はほぼ正常に戻った。骨関節炎の症状のこの顕著な改善は、処置後２週間にわたり安定して状態を維持したが、これは処置の効果がしっかり持続したことを意味する。対象は過去４年間、状態の改善を経験したことがなく、逆に悪化する一方であった。実施例２１および２２は、本発明のリベスアルカロイド画分を含む栄養物の、骨関節炎に対する抗炎症活性、ならびに関節および軟骨の健康促進効果を明確に示す。
このように、発明者らは、本発明のアルカロイドおよびリベスアルカロイド画分は、心血管疾患、脂質異常性障害、前糖尿病性障害、２型糖尿病、メタボリック症候群、関節炎など炎症状態の処置または予防はもとより、認知および神経細胞の健康増進、加齢に伴う身体的持久力低下および認知されるエネルギーレベル低下の改善、そしてスポーツ競技中の持久力、ＶＯ２Ｍａｘおよび乳酸閾値の改善についても、新たな生物活性原理を備えるものであることを発見した。
本発明のある態様および実施形態は、請求項に記載される。さらなる態様および実施形態は本明細書に記載される。態様、実施形態および請求項の特徴は組み合わされ得る。
一態様によれば、本発明は請求項１の主題に関する。
別の態様によれば、本発明は請求項３の主題に関する。
一態様によれば、本発明は請求項１０の主題に関する。
さらなる態様によれば、本発明は請求項１６の主題に関する。
別の態様によれば、本発明は請求項３９の主題に関する。
別の態様によれば、本発明は請求項４０の主題に関する。
別の態様によれば、本発明は請求項４１の主題に関する。
別の態様によれば、本発明は請求項４２の主題に関する。
別の態様によれば、本発明は請求項４５の主題に関する。
別の態様によれば、本発明は請求項４６の主題に関する。
別の態様によれば、本発明は請求項５９の主題に関する。
別の態様によれば、本発明は請求項６１の主題に関する。
別の態様によれば、本発明は請求項７０の主題に関する。
別の態様によれば、本発明は請求項８４の主題に関する。
本発明の前述の態様および他の態様は以下、本明細書に記載の他の実施形態に関して詳細に記述される。本発明は異なる形態で実施され得る旨、理解されるべきであり、また本発明は本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきでない。
本発明によるさらなる実施形態は、請求項にて言及される。
引用文献はすべて組み込まれる。
別段に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が関係する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において本発明の記述に使用される専門用語は、特定の実施形態に限った記述を目的とするものであり、本発明の制限を意図するものではない。本発明および本明細書に記載の請求項の記述での使用と同様に、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文面において別段に明示される場合を除き、複数形を含むと意図される。当業者は、名詞の複数形または単数形はある場所で使用され、複数形は単数形を範囲に含む場合があり、その逆も同様である旨、理解する。本明細書において使用される通り、「および／または」という表記は、それに関連する列挙項目の１つ以上のありとあらゆる組合せを含む。
本明細書において本発明のアルカロイドに使用される系統的化学名はすべて、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｏｆｔ製のＣｈｅｍＢｉｏＤｒａｗ Ｕｌｔｒａ １２．０というソフトウェアの適用により、立体化学用のカーン・インゴルド・プレローグ順位則に従って生成されている。
他の化学物質の場合、例えばリベス中に存在するフラバノール、フェノール酸、プロアントシアニジンおよびアントシアニジンなどの場合、一般的に使用される名称が適用される。
本明細書においては以下の語句、用語および定義が使用される。
「リベス」という用語の意味は、本発明のアルカロイドおよびアルカロイド画分の生産に適するリベス種またはその栽培品種を包含する。適切な種および亜種の非限定的例としてリベス・ルブルム、リベス・ニグルム、リベス・サチブム（Ｒｉｂｅｓ ｓａｔｉｖｕｍ）、リベス・ペトラエウム（Ｒｉｂｅｓ ｐｅｔｒａｅｕｍ）、リベス・ムルチフロルム（Ｒｉｂｅｓ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）、リベス・ロンジラケモスム（Ｒｉｂｅｓ ｌｏｎｇｅｒａｃｅｍｏｓｕｍ）、リベス・シルベストレ（Ｒｉｂｅｓ ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ）、リベス・スピカトゥム（Ｒｉｂｅｓ ｓｐｉｃａｔｕｍ）、リベス・ブルガーレ（Ｒｉｂｅｓ ｖｕｌｇａｒｅ）、リベス・ｘ・パリドゥム（Ｒｉｂｅｓ ｘ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、リベス・ｘ・ニディグロラリア（Ｒｉｂｅｓ ｘ ｎｉｄｉｇｒｏｌａｒｉａ）、リベス・ユーロパエウム（Ｒｉｂｅｓ ｅｕｒｏｐａｅｕｍ）、リベス・スカンジナビクム（Ｒｉｂｅｓ ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃｕｍ）、リベス・シビリクム（Ｒｉｂｅｓ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ）、リベス・トリステ（Ｒｉｂｅｓ ｔｒｉｓｔｅ）、リベス・フドソニアナム・リッチ（Ｒｉｂｅｓ ｈｕｄｓｏｎｉａｎｕｍ Ｒｉｃｈ）およびリベス・アメリカヌム・ミル（Ｒｉｂｅｓ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ Ｍｉｌｌ）が挙げられる。栽培品種の非限定的例は、米国農務省発行の全リベス栽培品種概要に列記されており、同省ホームページで見ることができる［ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｒｓ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／Ｍａｉｎ／ｄｏｃｓ．ｈｔｍ？ｄｏｃｉｄ＝１１３５３］。
「アルカロイド画分」および「リベスアルカロイド」という用語の意味は、本発明の単一の分離されたアルカロイド、または２つ、３つ、４つ、５つ、６つもしくは７つすべての混合物を包含する。本発明のアルカロイドは、利用可能な天然資源から取得する、組換え技術によって製造する、または合成的に製造することができる。本発明によれば、アルカロイドは上記の図に記載の分子と定義される。
化学分野で一般的に理解されている通り、「質量分率」（Ｗｉ）は、質量Ｍｉを有する１つの物質と混合物全体の質量Ｍｔｏｔとの比率を指し、以下の通り定義される。
Figure 2016525103
ここでは質量分率は概してパーセント（％）単位で表わされる。
「治療的使用」という用語は、以下に定義される通りの「処置」に関連する本発明の任意の応用を指す。
「栄養物」という用語は、治療的便益または非治療的便益となり得る生理学的便益または医学的便益を付与するよう、本発明の１つのアルカロイドもしくはアルカロイド画分を添加された食品もしくは非食品、または代替として該アルカロイドもしくはアルカロイド画分の量を自然発生形態に比べ増やした食品または非食品を指す。
本発明の文脈における「食品」の形態での栄養物は、純粋な栄養学的効果以外の付加的便益、例えば上記で定義されているような生理学的便益、医学的便益、治療的便益または非治療的便益を生命体に提供するよう設計された食品を指す。非限定的例として、一般的に機能性食品、補助食品、栄養補助食品、栄養剤、栄養補給食品または医療用食品と呼ばれる食品が挙げられる。該生産物の規制上の定義および呼称は世界の様々な地域で大幅に異なり、通常変更され得る。該生産物は特別に調理された食品、もしくは一般的な食品または飲料の形態であってもよい。
「非食品」の形態の栄養物は、非限定的例として錠剤、カプセル剤、散剤、チューインガムおよびロゼンジ剤が挙げられる経口投与物などの生産物、または非限定的例として軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、溶液剤もしくはシャンプー剤が挙げられる局所投与物などの生産物を指す。
「絞りかす」という用語は、漿果の汁を圧搾した後に残る皮、果肉、種子および茎を指す。
「生理学的便益」とは、以下を含め、正常な生理学的範囲の内外において、ある栄養物が生理学的過程に及ぼす効果を指す。
正常な生理学的範囲内での生理学的な過程またはパラメータの維持、係る過程もしくはパラメータへの寄与、または係る過程もしくはパラメータの増進、または異常に高いもしくは低い生理学的な過程もしくはパラメータの低減もしくは増進、例えば生理学的な過程またはパラメータの安定化または正常化。生理学的便益の非限定的例として筋持久力もしくは筋力の維持もしくは改善、短期記憶など認知機能の維持もしくは改善、創傷もしくは他の種類の組織損傷の治癒など体内での治癒過程の維持もしくは改善、病気および加齢に伴う状態のリスクの低減もしくは予防ならびに／または病気や疾患の間の治癒過程の補助、ミトコンドリア機能の維持もしくは改善、または老化もしくは老化の徴候の拮抗が挙げられる。
「医学的便益」とは、疾患または疾患に繋がる潜在性のある生理学的過程の予防または拮抗を目的に、ある栄養物が病理学的過程に及ぼす効果を指す。医学的便益の非限定的例として、入院患者など運動しない患者の筋肉量低下に拮抗する筋細胞中のミトコンドリアの生物発生および機能の改善、高齢者の身体的活性化に必要な持久力の促進によるサルコペニア（加齢に伴う筋肉量損失）の拮抗が挙げられる。栄養物がもたらす別の医学的便益として、軟骨の健康改善、最も一般的な関節炎の形態である骨関節炎を助長する炎症過程の予防のほか、心臓血管の健康改善、ならびに不健康な血中脂質の低減などによる主要なリスク因子の拮抗が挙げられる。
「治療的便益」とは、例えば疾患または疾患過程に関連する、正常範囲外の生理学的な過程またはパラメータの正常化または拮抗を指す。
「非治療的便益」とは、正常範囲内の生理学的な過程またはパラメータの正常化または拮抗、スポーツ持久力の最適化などを指す。
「処置する」および「処置」という用語は、本発明を応用した結果、対象の状態の重篤度が低減される、もしくは状態が少なくとも部分的に改善されること、および／または少なくとも１つの臨床症状の緩和、軽減または減少が達成されること、および／または状態の進行が遅くなること、および／または状態の発症が予防または遅延されることを指す。したがって、「処置する」という用語は予防的処置体制および治療的処置体制の双方を指す。
「創傷」という用語は、以下の非限定的区分の創傷を指す。
・急性または慢性の皮膚創傷
・筋肉、脂肪、骨、内臓、神経組織、軟骨、関節、動脈、静脈、胃腸管、粘膜および眼球の中から選択される身体組織に関連する急性または慢性の創傷
・外傷性創傷、外科創傷、感染創傷、粘膜創傷、火傷創傷、基礎疾患に起因する創傷および角膜潰瘍の中から選択される急性創傷
・外科創傷、外傷性創傷、火傷創傷、感染創傷または汚染創傷、静脈性潰瘍、動脈性潰瘍、静脈動脈混合性潰瘍、褥瘡、糖尿病性潰瘍、神経障害性潰瘍、瘻孔、免疫学的潰瘍、悪性潰瘍、皮膚炎潰瘍、放射線潰瘍、壊疽性膿皮症および皮膚移植処置後創傷の中から選択される慢性創傷
・切傷、挫傷、穿刺、裂傷、打撲傷、擦過傷および剥離創の中から選択される外傷性創傷
・治癒が乏しいおよび／または遅い創傷
・ヒトまたは動物の創傷
ＩＫＫ−βまたはＰＤＥ４の阻害は、実施例３および実施例４に記載の方法に従ってインビトロで測定される。一部の実施形態において、本発明のリベスのアルカロイド画分、抽出物または組成物は、ＩＫＫ−βもしくはＰＤＥ４いずれかに対して支配的効果を有し得る、またはこれらの作用機序と無関係な効果を有し得る。
「低減（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」、「低減する（ｒｅｄｕｃｅ）」、「阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」または「阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）」とは、指定された活性における少なくとも約１０％、２５％、３５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、９５％以上の減少または減退を指す。一部の実施形態において、低減は検出可能な活性がごくわずか、または本質的に全くない結果となる（多くとも約１０％未満、さらには５％未満など、有意でない量）。
「有効量」という用語は、本発明のリベスのアルカロイド画分、抽出物、汁または濃縮物もしくは組成物の、所望の効果を生み出すのに十分な量を指す。有効量は、リベスのアルカロイド画分、抽出物、汁もしくは濃縮物または組成物の使用対象用途、対象者の年齢および身体状態、状態の重症度、処置の持続時間、並行処置の性質、使用される担体、ならびに当業者の知識および専門知識の範囲内での類似要因に応じて変動する。
「汁」という用語は、漿果、茎および／または葉など、リベスに自然に含まれ、リベスを機械的に絞るまたは浸漬することによって得られる液体を指す。
「抽出物」という用語は、リベスから、特に漿果、茎および／または葉から、抽出物の成分を分解する能力のある溶媒でのリベスの抽出によって得られる物質の混合物を指す。リベスは、好ましくは生の状態または乾燥した状態で抽出され得る。本発明では、溶媒での浸出または浸漬、蒸留または超臨界抽出など、様々な溶媒および様々な抽出技法が使用され得る。
「濃縮物」という用語は、抽出を行わずにアルカロイドの質量分率が高められる、リベスから誘導された生産物を指す。濃縮物調製方法の非限定的例として沈殿、凝縮、空気乾燥または凍結乾燥が挙げられる。
「許容されるビヒクル」、「医薬として許容されるビヒクル」または「化粧料として許容されるビヒクル」とは、ある組成物の担体、希釈剤または賦形剤など一成分であって、該組成物の他の成分との相溶性があり、本発明の化合物および／または組成物と、これらの生物学的活性を排除することなく組み合わせることができ、また本明細書に記載の対象者での使用に適し、過度の有害な副作用を生じないものを指す。「許容されるビヒクル」の非限定的例として、制限なく、水、乳剤、リニメント剤、錠剤、カプセル剤、散剤など、標準的な医薬担体、食品担体または化粧料担体が挙げられる。これはさらに、液状、半固体状または固体状のビヒクルを定義する意味もある。
「医療機器」という用語は、規制により定義される通りの機器を指す。
「食品組成物」という用語は、清涼飲料水、ジュース、スムージーおよび乳製品などを含む、食品もしくは飲料の何らかの種類の液状もしくは固体状の成分、または食品および飲料の完成品を指す。「食品組成物」という用語はさらに、機能性食品、医療用食品、栄養補助食品および栄養補給食品を含む、何らかの種類の食品または飲料の完成品を含む。
「補助する」という用語は「維持する」、「回復する」または「保全する」という用語と区別なく使用される。
「減少する」という用語は「低下する」、「拮抗する」、「減少する」または「低減する」という用語と区別なく使用される。
「正常化する」という用語は「調節する」または「モジュレートする」という用語と区別なく使用される。
「改善する」という用語は「増進する」、「促進する」、「刺激する」、「増加する」または「上昇する」という用語と区別なく使用される。
さらなる態様および実施形態
本発明は、とりわけ、式（Ｉ）：
Figure 2016525103
 の新たな高生物活性ニトリルアルカロイドリベトリルＡを提供する。
別の態様において、本発明は、リベスから誘導可能なアルカロイド画分であって、リベトリルＡ、ならびに場合によって
ｉ）式（ＩＩ）：
Figure 2016525103
 （式中、
Ｒは４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸、（Ｅ）−３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）アクリル酸および（Ｅ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）アクリル酸から成る群から選択される酸から誘導されるアシルオキシ部分である）の少なくとも１つの化合物、および／または
ｉｉ）式（ＩＩＩ）：
Figure 2016525103
 （式中、ＲはＯＨまたはＯＣＨ３である）
の少なくとも１つの化合物を含むアルカロイド画分を提供する。
好適な実施形態において、アルカロイド画分は、リベス・ルブルムおよびリベス・ニグルムの中から選択される１つのリベスから誘導される。一部の実施形態において、アルカロイド画分は、好ましくはリベス・ルブルムおよびリベス・ニグルムの中から選択される単一のリベスから誘導され得る。他の実施形態において、アルカロイド画分は、好ましくはリベス・ルブルム、リベス・ニグルムまたは他のリベス種の中から選択される２つまたは３つのリベスから誘導され得る。このように、本発明のアルカロイド画分の化学的組成は、誘導元のリベスの選択により、特定の目的に対し最適化され得る。
一部の例において、特定の栽培品種を優先的に選択してもよい。
より具体的には、本発明は、少なくとも１つの式（ＩＩ）の化合物がリベトリルＢ、リベトリルＣ、リベトリルＤおよびリベトリルＥから成る群から選択される、１つのアルカロイド画分を提供する。
より具体的には、本発明は、少なくとも１つの式（ＩＩＩ）の化合物がグルコインドールＡおよびグルコインドールＢから成る群から選択される、１つのアルカロイド画分を提供する。
実施例において実証される通り、本発明のアルカロイド画分の化学的組成は、製造工程の特異的調節を通じて変化し得る。
典型的実施形態において、アルカロイド画分は、式（Ｉ）の化合物の合計量と式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）の化合物の合計量の重量比が１：１０００から１０００：１の範囲、より好ましくは１：１００から１００：１の範囲、より好ましくは１：５０から５０：１の範囲、最も好ましくは１：２０から２０：１の範囲である、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）の化合物を含むことになる。
ある実施形態において、本発明によるアルカロイド画分は、９５％〜１００％の全質量分率の式（Ｉ）の化合物を含む。
他の実施形態において、本発明によるアルカロイド画分は、９５％〜１００％の全質量分率の式（ＩＩ）の化合物を含む。
さらなる実施形態において、本発明によるアルカロイド画分は、９５％〜１００％の全質量分率の式（ＩＩＩ）の化合物を含む。
本発明は、とりわけ、好ましくはリベス・ルブルムおよびリベス・ニグルムの中から選択され、増加した質量分率の本発明のアルカロイド（複数可）含む抽出物、汁または濃縮物を提供する。「増加した質量分率」という用語は、少なくとも約２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９５％、１２０％、１５０％、２００％、３００％、５００％、１０００％、５０００％、１００００％以上の増加を指す。
実施例１で実証される通り、本発明のアルカロイドは自然形態のリベスの漿果中にごく少量、例えば典型的にリベトリルＡが０〜０．８ｐｐｍ、またリベトリルＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥが合計で０．５〜１．５ｐｐｍといった量しか存在しない。同様にごく少量のグルコインドールが、典型的に３．２〜６．９ｐｐｍといった濃度で認められる。
本発明によれば、リベスの革新的な濃縮物または抽出物は、生理的活性レベルの本発明の活性リベスアルカロイドを提供し得る生産物の取得に必要である。
本発明の一部の実施形態において、リベスの抽出物、汁または濃縮物はさらに、
ｉ）ケルセチン、ミリセチン、ケンペロールおよびこれらのグルコシドから成る群から選択される少なくとも１つのフラボノール；ならびに／または
ｉｉ）ｐ−ヒドロキシ安息香酸、バニリン酸、カフェイン酸、ｐ−クマル酸、フェルラ酸およびこれらのグルコシドから成る群から選択される少なくとも１つのフェノール酸；ならびに／または
ｉｉｉ）エピカテキン、エピガロカテキンおよびこれらのオリゴマーから成る群から選択される少なくとも１つのプロアントシアニジン；ならびに／または
ｉｉｉｉ）シアニジン、デルフィニジンおよびこれらのグルコシドから成る群から選択される少なくとも１つのアントシアニジン
を含む。
これらのような付加的化合物は生産物の製剤特性を改善し、安定性を高め、さらには生産物の有益な効果に貢献し得る。
本発明のアルカロイドまたはアルカロイド画分の用量および剤形は、使用目的に応じて変動することも、当業者に理解される。
本発明の組成物の調製に関する指針は、以下の文献に記載されている。
・「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ」、第２１版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（２０１１年１１月２０日）、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０８５７１１０４２８
・Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｅｏｆｆｒｅｙ Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｐｌａｔｔ編、図解版（２００９年９月１１日）、Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、ＩＳＢＮ−１３：９７８−０６３２０６４２１２
・Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍａｒｃ Ｐａｙｅ編、第３版（２００９年３月３日）、Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＩＳＢＮ−１３：９７８−１４２００６９６３１
本発明の別の一態様は、リベスに比べ、増加した質量分率の本発明のアルカロイドまたはアルカロイド画分を含むリベスの抽出物、汁または濃縮物を提供する。
ｉ）例えば、リベスの前記抽出物、汁または濃縮物におけるリベトリルＡの質量分率が０．０００１％〜１００％、０．０００２５％〜９０％、０．０００５％〜８０％、０．０００２５％〜７０％、０．０００５％〜６０％、０．０００７５％〜５０％、０．００１％〜４５％、０．００２５％〜４０％、０．００５％〜３５％、０．００７５％〜３０％、０．０１％〜２５％、０．０２５％〜２０％、０．０５％〜１９％、０．０７５％〜１８％、０．１％〜１７％、０．２５％〜１６％、０．５％〜１５％、０．７５％〜１４％、１％〜１３％、１．５％〜１２％、２．０％〜１１％、３．０％〜１０％、４．０％〜９．０％、５．０％〜８．０％および６．０％〜７．０％の中から選択されるもの；
ｉｉ）例えば、リベスの前記抽出物、汁または濃縮物におけるリベトリルＡ、リベトリルＢ、リベトリルＣ、リベトリルＤおよび／またはリベトリルＥの質量分率が０．０００２％〜１００％、０．０００５％〜９０％、０．０００８％〜８０％、０．００１％〜７０％、０．００２５％〜６０％、０．００５％〜５０％、０．００７５％〜４５％、０．０１％〜４０％、０．０２５％〜３５％、０．０５％〜３０％、０．０７５％〜２５％、０．１％〜２０、０．２５％〜１９％、０．５％〜１８％、０．７５％〜１７％、１．０％〜１６％、１．５％〜１５％、２．０％〜１４％、２．５％〜１３％、３．０％〜１２％、４．０％〜１１％、５．０％〜１０％、６．０％〜９．０％および７．０％〜８．０％の中から選択されるもの；
ｉｉｉ）例えば、リベスの前記抽出物、汁または濃縮物におけるグルコインドールＡおよび／またはグルコインドールＢの質量分率が０．０００８％〜１００％、０．００１％〜９０％、０．００２５％〜８０％、０．００５％〜７０％、０．００７５％〜６０％、０．０１％〜５０％、０．０２５％〜４５％、０．０５％〜４０％、０．０７５％〜３５％、０．１％〜３０％、０．２５％〜２５％、０．５％〜２０％、０．７５％〜１９％、１．０％〜１８％、１．５％〜１７％、２．０％〜１６％、２．５％〜１５％、３．０％〜１４％、３．５％〜１３％、４．０％〜１２％、４．５％〜１１％、５．０％〜１０％、６．０％〜９．０％および７．０％〜８．０％の中から選択されるもの。
純粋なアルカリロイドのほか、本発明のリベスアルカロイドの含有量が大きく変動する多様な抽出物および濃縮物も調製される実施例１で実証される通り、本発明の潜在的実施形態が多数存在する。
本発明の抽出物および濃縮物は好ましくは液状、粉末状またはペースト状である。
本発明のさらに別の態様は、本発明によるアルカロイドまたはアルカロイド画分を含むリベスの抽出物または濃縮物を製造するための、ステップ：
ｉ）粉砕された漿果および／または葉の汁または懸濁物の調製；
ｉｉ）場合により、汁または粉砕された漿果および／もしくは葉の、抽出剤による抽出；
ｉｉｉ）場合により、前記抽出剤および／または余分な水の除去；
ｉｉｉｉ）アルカロイド画分を得るための、アルカロイドの濃縮
を含む方法を提供する。
好適な実施形態において、リベスはリベス・ルブルム、リベス・ニグルムおよび／またはこれらの組合せの中から選択される。
本発明のある実施形態において、粉砕された漿果の懸濁物は、好ましくはアルカロイド画分の収率を高めるための酵素処理を施され得る。好適な実施形態において、酵素はセルラーゼ、アミラーゼまたはペクチナーゼの中から選択される。工程を最適化するために使用される酵素の量、ｐＨおよび／または温度の調整ならびに酵素処理の持続時間は、当業者にとって明白と思われる。
本発明の好適な実施形態において、粉砕された漿果および／または葉の抽出剤による抽出ステップにおいて、前記抽出剤は、好ましくは水、有機溶媒またはこれらの混合物を含む。適切な有機溶媒の非限定的例としてメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、アセトン、メチルエチルケトンおよび酢酸エチル、またはこれらの混合物が挙げられる。ある実施形態において、超臨界抽出は、好ましくは例えば二酸化炭素を抽出剤として使用して適用され得る。
本発明のある実施形態において、アルカロイド画分濃縮ステップは、実施例１で実証されるような遠心分離、限外濾過、ナノ濾過、クロマトグラフィー、固液抽出、液液抽出および／または乾燥を含む。
本発明のさらに別の一態様において、本発明のアルカロイド（複数可）は、有益な健康効果が十分立証されている他の活性成分を有する栄養物と組み合わせされ得る。係る付加的成分の非限定的例としてアルファリノレン酸、ベータグルカン、キトサン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ペクチン、グルコマンナン、グアーガム、リノール酸、紅色酵母米、植物ステロールおよび植物スタノール、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、ビオチン、葉酸、マグネシウム、ナイアシン、チアミン、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ヨウ素、鉄、亜鉛、炭水化物、銅、カリウム、カルシウム、マンガン、ビタミンＤ、タンパク質、アミノ酸、クロム、パントテン酸、リンヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルファシクロデキストリン、小麦胚乳から生産されたアラビノキシラン、水、バリン、リシン、トレオニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、システイン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、セリン、システイン、チロシン、アスパラギン酸、プロリン、ヒドロキシプロリン、シトルリン、アルギニン、オルニチン、ヒドロキシグルタミン酸、グルタミン、グルタミン酸が挙げられる。
実験
［実施例１］
目的
この一連の実験の目的は、リベトリルＡ、リベトリルＢ、リベトリルＣ、リベトリルＤ、リベトリルＥ、グルコインドールＡおよびグルコインドールＢの各種アルカロイドをリベスから単離すること、ならびに増加した質量分率の本発明のアルカロイド画分を含むリベスの抽出物、汁および濃縮物を調製することであった。
原材料、試験化合物および化学物質
採用した化学物質はすべて、多様な供給業者から調達した標準の分析グレードであった。特殊な例については供給業者が指定される。
リベス・ルブルムおよびリベス・ニグルムの試料はすべて、デンマーク、コペンハーゲンのＡｓｉｒｏｓ Ａ／Ｓより提供（デンマーク、ポーランドまたはドイツで商業的に栽培されたもの）、またはデンマークのコペンハーゲン大学の遺伝学的収集物Ｐｏｍｅｔｅｔから入手した。
リベス漿果からの純アルカロイドの調製
５００ｇの漿果（リベス・ルブルムまたはリベス・ニグルムいずれかの漿果）を粉砕して均質化し、続いて５００ｍｌの２−プロパノールを使用して３０分間にわた２回、ＩＫＡ（登録商標）Ｔ２５ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘを２４０００ｒｐｍで稼働させての均質化条件下で抽出した。さらなる処理の前に、粗抽出物を真空吸引装置付きブフナー漏斗で濾過した。
次のステップで、５０℃の真空条件下の回転蒸発器（真空制御装置Ｖ−８５０付きＢｕｃｈｉ Ｒｏｔａｖａｐｏｒ Ｒ−２１０）上で溶媒を除去した。
続いて抽出物を５００ｍｌの水中で溶解／分散し、そして５００ｍｌのヘプタンによる分液漏斗内液液抽出で２回処理して不要な脂質を除去した。その後、抽出物水溶液を５００ｍｌの酢酸エチルによる分離漏斗内液液抽出で３回処理し、酢酸エチル抽出物を採取した。
続いて酢酸エチルを５０℃の真空条件下の回転蒸発器（真空制御装置Ｖ−８５０付きＢｕｃｈｉ Ｒｏｔａｖａｐｏｒ Ｒ−２１０）上で除去した。無溶媒酢酸エチル抽出物を採取し、これを分取クロマトグラフィー用原材料として使用した。
分取クロマトグラフィー
本発明による純アルカロイドの単離は、２台の分取用ＨＰＬＣポンプ（ＬＣ−２０ＡＰ）、１つの分取用手動注入器（ＲＨ３７２５）、１つのダイオードアレイ検出器（ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ）、１つのＨＰＬＣ画分採取装置（ＦＲＣ−１０Ａ）および１つのシステム制御装置から成るＳｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ分取用ＨＰＬＣシステムを使用して実施した。データはすべて、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｌａｂｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｕｌｔｉ ＬＣ−ＰＤＡというソフトウェアを使用して記録した。化合物の分離は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製Ｓｙｎｅｒｇｙ ４ｕ Ｍａｘ−ＲＰ ８０Ａ型カラム（２５０×２１．２０ｍｍ）上で達成された。使用した溶媒はすべて、民間供給業者からのＨＰＬＣ品質であった。ＵＶデータは、２００〜７００ｎｍの範囲での完全走査ＵＶスペクトルとして取得した。画分収集物は２８０ｎｍを使用して取得した。
２通りの異なる移動相設定、すなわち粗分画のためのアイソクラチック移動相および最終分画のための勾配移動相を使用した。
アイソクラチック移動相は、０．５％のギ酸を含む７０％ｖ／ｖの水、および０．５％のギ酸を含む３０％ｖ／ｖのアセトニトリルから成り、実行時間２０分、流量１１ｍｌ／分であった。
勾配移動相は０．５％のギ酸を含む水および０．５％のギ酸を含むアセトニトリルから成り、０．５％のギ酸を含む２〜９０％ｖ／ｖのアセトニトリルの勾配（０〜１２５分）および０．５％のギ酸を含む９０〜２％ｖ／ｖのアセトニトリルの勾配（１２５〜１２６分）を使用し、流量は１１ｍｌ／分であった。
以下の一般的手順を、純化合物の採取に使用した。５０〜２００ｍｇの粗抽出物を注入し、アイソクラチック法を使用して画分を採取し、対象の１つ以上の画分をＵＶスペクトルに基づいて抽出した。画分の純度を、分析セクションに記載の分析システム上で判定した。非常に粗い場合、アイソクラチック法を使用して画分を再注入し、また過度に粗くない場合は勾配法を使用して画分を再注入した。対象画分の純度を分析システムを使用して判定し、また通常、画分は、アイソクラチック法を２〜５回実行し、続いて勾配法を２〜３回実行することによって取得可能であった。
単離されたアルカロイドの同一性および純度を、ＨＰＬＣ−ＤＡＤ−ＭＳによって検証した。新たなアルカロイド、リベトリルＡの構造を、ＨＰＬＣ−ＤＡＤ−ＭＳに加え、２Ｄ １Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ ＮＭＲを使用して解明した。
リベトリルＡ
ＨＰＬＣ−ＤＡＤ−ＭＳを、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００システム（詳細については下記の分析セクションを参照のこと）により実施したところ、一次発色団（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アクリル酸に類似の予想されたＵＶスペクトルならびに予想された一次ＭＳ信号（ＥＳＩ陽イオンモード）ｍ／ｚ４３８［Ｍ＋Ｈ］＋およびｍ／ｚ２７６が生成された。
ＮＭＲ分析向けにリベトリルＡを４０μＬのメタノール−ｄ４中に溶解させ、外径１．７ｍｍのＮＭＲチューブへ移した。ＮＭＲスペクトルを、極低温冷却型逆１．７ｍｍプローブヘッドを装備した６００ＭＨｚのＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ分光計上で、３００Ｋにて取得した。陽子スペクトルを、１２ｋＨｚの分光幅を使用して、領域データポイントを６５５３６（２１６）回集めて取得した。追加過渡数を、十分な信号対ノイズ比を得られるよう、概して５１２〜１０２４回の走査に調整した。水信号を、２５Ｈｚをカバーするよう較正された合成パルス［Ｂａｘ １９８５年、Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ；６５：１４２−１４５］を使用して、緩和遅延（４．０秒）中の予備飽和によって抑制した。一次元実験と同じ分光幅および搬送波周波数による等核二次元実験（２０４８回の領域データポイントを収集）を、励起スカルプティングによる水信号抑制を使用して実施した［Ｈｗａｎｇ １９９５年、Ｊ Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ、Ｓｅｒｉｅｓ Ａ；１１２：２７５−２７９］。二重量子フィルター処理された１Ｈ−１Ｈ ＣＯＳＹを５１２回のインクリメントによって取得し、それぞれ走査は合計３２回で、パージパルスは緩和遅延（１．０秒）の前であった。位相敏感ＮＯＥＳＹを３２回の走査および２５６回のインクリメントによって取得し、混合時間は６０ミリ秒、緩和遅延は２．０秒であった。
１Ｈ−１３Ｃ相関型のＨＳＱＣ実験［Ｂｏｙｅｒ ２００３年、Ｊ Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ；１６５：２５３−２５９］およびＨＭＢＣ実験［Ｃｉｃｅｒｏ ２００１年、Ｊ Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ；１４８：２０９−２１３］を、勾配選択型エコー・アンチエコー取得スキームを使用して、一次元１Ｈ実験と同じ搬送波周波数および分光幅により実施した。時間領域データポイント数は２０４８、緩和遅延は１．０秒であった。１４５Ｈｚの１ＪＨ，Ｃについて最適化され、すべての１３Ｃ逆パルスについて断熱形状パルスを伴う多重度編集ＨＳＱＣを、間接次元において２６ｋＨｚをカバーする１６回の走査および２５６回のインクリメントにより取得した。８Ｈｚの１Ｈ−１３Ｃ結合（混合時間６２．５ミリ秒）について、１２５Ｈｚおよび１６５Ｈｚにノードを有する二重ローパスフィルターを使用して最適化されたＨＭＢＣを、１２８ｋＨｚをカバーする６４回の走査および１２８回のインクリメントにより取得した。
時間領域の原データは概してゼロ補填した、またはスペクトルを取得するための適切な窓関数（指数乗算または平方正弦関数）の適用およびフーリエ変換の前にサイズが２倍となるよう線形的に予測した。３．３１ｐｐｍ（１Ｈ）および４９．１５ｐｐｍ（１３Ｃ）でのメタノール−ｄ４残留溶媒信号を、周波数軸の較正に使用した。
リベトリルＡの構造を、以下の通り解明した。リベトリルＡを（Ｅ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブタ−２−エンニトリルの（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アクリル酸類似体と同定した。構造は構造解明に使用された付番と併せて図１に示されている。１Ｈ ＮＭＲスペクトルはすべての共鳴の注記と併せて図２に示されている。このように、アノマーＨ−１’（δ４．３４、ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）の共鳴に基づき、β−Ｄ−グルコピラノシド単位を、ＣＯＳＹスペクトル内の単離されたスピン系（Ｈ１’−Ｈ２’−Ｈ３’−Ｈ４’−Ｈ５’−Ｈ６’Ａ／Ｈ６’Ｂ）として同定した。同時にＤ−グルコシドのβ立体配置を、Ｈ１’とＨ２’の間の軸軸結合（ＪＨ１’，Ｈ２’＝７．８Ｈｚ）に基づいて確立し、その結果、グリコシド結合のエクアトリアル位も確立した。ジアステレオトピック陽子のペア、Ｈ１Ａ（δ４．５４、ｄｄ、ＪＨ１Ａ，Ｈ２＝６．５Ｈｚ）およびＨ１Ｂ（δ４．６５、ｄｄ、ＪＨ１Ｂ，Ｈ２＝６．０Ｈｚ）は、ＨＳＱＣスペクトル内のＣ１（δ６７．９８）に対する相関に基づいて同定され、いずれもＨ２に対するＣＯＳＹ交差ピークを示した（δ６．８５、ｔ、ＪＨ１Ａ，Ｈ２≒ＪＨ１Ｂ，Ｈ２≒６．３Ｈｚ）。中心的な（Ｅ）−４−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）ブタ−２−エンニトリル単位の残りの共鳴をＨ４（δ４．８２、水共鳴と重複）からＣ２（δ１４８．８）、Ｃ３（δ１１２．６）およびＣ５（δ１１５．７）へのＨＭＢＣ相関に基づいて同定したほか、二重結合の（Ｅ）立体配置を確立するＮＯＥＳＹスペクトル内での強い交差ピークも同定した（図３参照）。位置４での（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アクリル酸の位置を、Ｈ４とＨ２’’の間の交差ピーク（弱）のほか、Ｈ４とＨ３’’の間の交差ピーク（弱）にも基づいて同定した。加えて、Ｈ４からＣ１’’（（Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アクリル酸１６８．０；カルボニル炭素）への相関も、ＨＭＢＣスペクトル内で見受けられた。
リベトリルＡの構造を、１Ｈ共鳴および１３Ｃ共鳴の割当に使用された付番と併せて示す図である。リベトリルＡの付番は厳密なＩＵＰＡＣ付番と異なるという点に注意のこと。 上：選択されたＮＯＥ相関（両矢印）。下：選択されたＨＭＢＣ相関（ＨからＣを指す矢印）。 １Ｈ ＮＭＲスペクトルを、リベトリルＡのすべての１Ｈ共鳴と併せて示す図である。 ＲＡＰ１３アルカロイドまたはＲＡＰ１４アルカロイドに４８時間曝露させたＣ２Ｃ１２細胞において、未処置対照群に比べ、ミトコンドリアレベルの増加が認められたことを示す図である。 メスの無毛マウスにおける２０００ｍｇ／ｋｇ／日でのＲＡＰ４およびＲＡＰ１６の経口投与による創傷面積低減率（％）を示す図である。
１Ｈ共鳴および１３Ｃ共鳴の割当を以下に記載する。
１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ），δ３．２２［ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．９，８．８Ｈｚ，Ｈ−Ｃ（４’）］，３．３０［ｍ，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（５’）］，３．３１［ｍ，１Ｈ，Ｈ−Ｃ（４’）］，３．３７［ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｈ−Ｃ（３’）］，３．６９［ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１，１２．１Ｈｚ，Ｈ−Ｃ（６ａ’）］，３．８８［ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０，１２．０Ｈｚ，Ｈ−Ｃ（６ｂ’），４．３４［ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−Ｃ（１’）］，４．５４［ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５，１４．６Ｈｚ，Ｈ−Ｃ（１ａ）］，４．６５［ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０，１４．６Ｈｚ，Ｈ−Ｃ（１ｂ）］，４．８２［ｍ，２Ｈ，Ｈ−Ｃ（４）］，６．３０［ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，Ｈ−Ｃ（２’’）］，６．７９［ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，Ｈ−Ｃ（８’’）］，６．８５［ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，Ｈ−Ｃ（２）］，６．９７［ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９，８．２Ｈｚ，Ｈ−Ｃ（９’’）］，７．０６［ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｈ−Ｃ（５’’）］，７．６１［ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，Ｈ−Ｃ（３’’）］；１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ），δ６２．４［Ｃ（６’）］，６４．１［Ｃ（４）］，６８．０［Ｃ（１）］，７１．２［Ｃ（４’）］，７４．７［Ｃ（２’）］，７７．７［Ｃ（３’）］，７７．８［Ｃ（５’）］，１０４．０［Ｃ（１’）］，１１２．６［Ｃ（３）］，１１３．７［Ｃ（２’’）］，１１５．０［Ｃ（５’’）］，１１５．７［Ｃ（５）］，１１６．３［Ｃ（８’’）］，１２３．０［Ｃ（９’’）］，１２７．１［Ｃ（４’’）］，１４６．３［Ｃ（６’’）］，１４７．８［Ｃ（３’’），１４８．２［Ｃ（７’’），１４８．８［Ｃ（２），１６８．０［Ｃ（１’’）］．
リベトリルＢ
ＨＰＬＣ−ＰＤＡ−ＭＳを、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００システム（詳細については下記の分析セクションを参照のこと）により実施したところ、一次発色団（Ｅ）−３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）アクリル酸に類似の予想されたＵＶスペクトルならびに予想された一次ＭＳ信号（ＥＳＩ陽イオンモード）ｍ／ｚ４５２［Ｍ＋Ｈ］＋およびｍ／ｚ２９０が生成された。
リベトリルＣ
ＨＰＬＣ−ＰＤＡ−ＭＳを、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００システム（詳細については下記の分析セクションを参照のこと）により実施したところ、一次発色団（Ｅ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）アクリル酸に類似の予想されたＵＶスペクトルならびに予想された一次ＭＳ信号（ＥＳＩ陽イオンモード）ｍ／ｚ４２２［Ｍ＋Ｈ］＋およびｍ／ｚ２９０が生成された。
リベトリルＤ
ＨＰＬＣ−ＰＤＡ−ＭＳを、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００システム（詳細については下記の分析セクションを参照のこと）により実施したところ、一次発色団４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸に類似の予想されたＵＶスペクトルならびに予想された一次ＭＳ信号（ＥＳＩ陽イオンモード）ｍ／ｚ４２６［Ｍ＋Ｈ］＋およびｍ／ｚ２６４が生成された。
リベトリルＥ
ＨＰＬＣ−ＰＤＡ−ＭＳを、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００システム（詳細については下記の分析セクションを参照のこと）により実施したところ、一次発色団４−ヒドロキシ安息香酸に類似の予想されたＵＶスペクトルならびに予想された一次ＭＳ信号（ＥＳＩ陽イオンモード）ｍ／ｚ３９６［Ｍ＋Ｈ］＋およびｍ／ｚ２３４が生成された。
グルコインドールＡ
ＨＰＬＣ−ＰＤＡ−ＭＳを、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００システム（詳細については下記の分析セクションを参照のこと）により実施したところ、一次発色団２−（１Ｈ−インドール−３−イル）酢酸に類似の予想されたＵＶスペクトルならびに予想された一次ＭＳ信号（ＥＳＩ陽イオンモード）ｍ／ｚ３３８［Ｍ＋Ｈ］＋およびｍ／ｚ３２０が生成された。
グルコインドールＢ
ＨＰＬＣ−ＰＤＡ−ＭＳを、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００システム（詳細については下記の分析セクションを参照のこと）により実施したところ、一次発色団メチル２−（１Ｈ−インドール−３−イル）酢酸に類似の予想されたＵＶスペクトルならびに予想された一次ＭＳ信号（ＥＳＩ陽イオンモード）ｍ／ｚ３５２［Ｍ＋Ｈ］＋およびｍ／ｚ３３４が生成された。
リベスにおける各種リベトリルおよび各種グルコインドールの質量分率の確立
・リベス・ルブルム栽培品種およびリベス・ニグルム栽培品種から産出された市販原料からのリベス汁を、漿果中における本発明のアルカロイドの自然発生レベルの確立に使用した。本発明のアルカロイドはすべて水溶性が高く、したがって漿果中の量を代表する汁中レベルで存在することになることから、これはアルカロイドの自然発生レベルの判定に際し、健全な開始材料である。
下記の実験セクションに記載の定量分析を応用した結果、汁からの乾燥物の最高可能注入量は以下の質量分率を示した。
リベトリルＡ：０〜０．００００８％
各種リベトリル合計：０．００００５〜０．０００１５％
各種グルコインドール合計：０．０００３２〜０．０００６９％（これを基に、０．０００８％を超える各種グルコインドール合計レベルは、リベスに比べ増加した質量分率と定義される。）
結論：
これを基に、０．０００１％を超えるリベトリルＡの質量分率は、リベスに比べ増加した質量分率と定義される。
これを基に、０．０００２％を超える各種リベトリル合計レベルは、リベスに比べ増加した質量分率と定義される。
これを基に、０．０００８％を超える各種グルコインドール合計レベルは、リベスに比べ増加した質量分率と定義される。
本発明のアルカロイド画分を含む、リベスの抽出物、汁または濃縮物の調製
本発明の様々なアルカロイド組成物をリベスから調製するため、以下の一般的ステップを適用した。
１．粉砕された漿果および／または葉の懸濁物の調製。
産業用「汁品質」の漿果、すなわち当該のリベスの茎および多少の葉が付いた漿果５００ｇを粉砕し、均質化した。均質化の最終ステップで、ＩＫＡ（登録商標）Ｔ２５ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘを２４０００ｒｐｍで３０分間稼働させ、そしてリベス試料の含水量に応じて、均質化しやすくなるよう５００ｍｌの脱塩水を添加した。
本発明のアルカロイド画分の抽出性を高めるため、一部の例において、懸濁物に、以下に挙げるデンマークのＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓより提供の酵素のカクテルのうち１つによる酵素処理を施した。
ａ．強いペクチン分解活性、ならびにアラビナーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼおよびキシラナーゼを含む多様なカルボヒドラーゼを有する多酵素複合体である、０．１〜０．５ｇのＶｉｓｃｏｚｙｍｅ Ｌ。
酵素処置は、０．１ＭのＮａＯＨによってｐＨを４．５へ調整した後、５０℃で４時間にわたり行われた。
ｂ．強いペクチン分解活性を有する酵素である、０．１〜０．５ｇのＰｅｃｔｉｎｅｘ（登録商標）ＢＥ ＸＸＬ。
２．場合により、粉砕された漿果および／または葉の、抽出剤による抽出。
このステップは、汁生産物または濃縮物が想定される場合には省略した。このステップを、以下の中から選択した抽出剤を５００〜１５００ｍｌ添加することによって実施した。
−脱塩水
−メタノール
−エタノール
−アセトン
−１−プロパノール
−２−プロパノール
−酢酸エチル
抽出はすべて、２５〜７０℃で１〜４時間にわたり実施した。
その後の抽出に同じ溶媒を使用した場合、アルカロイド画分の収率が高くなった。
全般的所感として、本発明のすべてのアルカロイドの完全抽出は、必要な抽出の反復回数ならびに温度および時間に関する抽出条件のみに依存する形で、異なる溶媒を使用して取得可能と見られた。
異なる溶媒によるアルカロイドの完全抽出後に得られる抽出物の主な差異は、異なるリベスからの、他のクラスの化合物の共抽出であった。
行われた抽出プログラムからの経験を基に、本発明のアルカロイドの完全抽出は、総体的に極性が変動する場合であっても、上記の溶媒と他の溶媒の様々な混合物によって取得可能と考えられるとの結論に至った。当業者により理解される通り、浸漬、浸出、ソックスレー抽出、超臨界抽出などを含む多様な抽出技法によって、同様の結果を得ることができる。
さらなる処理の前に、抽出後の植物材料の粒子を真空吸引装置付きブフナー漏斗での濾過によって除去する最終ステップを、粗抽出物に施した。
３．場合により、抽出剤の除去。
このステップを、５０℃の真空条件下の回転蒸発器（真空制御装置Ｖ−８５０付きＢｕｃｈｉ Ｒｏｔａｖａｐｏｒ Ｒ−２１０）上で実施した。有機溶媒の残留物を除去するため、最大５００ｍｌのエタノールによるストリッピングステップを適用した。
当業者により理解される通り、凍結乾燥、流動床乾燥など、他の乾燥技法によっても同様の結果を得ることができる。
一部の例において、このステップが余分となったが、それは単に粗抽出物を直接、次のステップに回すことができたためである。ステップ１から直接取得された汁の場合、このステップは場合によってさらなる処理のための汁濃縮物の調製に使用され得る。
４．場合によってアルカロイド画分のさらなる濃縮。
明らかに、このステップは、本発明のアルカロイドの所望の濃縮物を上記の加工ステップによって取得した場合には省略した。
このステップを、様々な技法を単独で使用して、または複合的に使用して実施した。
ａ．遠心分離
粗抽出物を冷却後、または乾燥させた粗抽出物を水中で再懸濁させた後、一部の例において、沈殿した脂質、タンパク質または多糖類など粒状物質を除去するため、遠心分離のステップを使用した。
ｂ．濾過
一部の例において、溶液中の残留巨大分子を除去するため限外濾過のステップを適用し、その結果、本発明のアルカロイド画分の濃度を粗抽出物中濃度に比べ大幅に高めることができた。
このステップを、米国のＰａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＭｉｎｉｍａｔｅ（商標）接線流濾過システム上で実施した。このシステムは３０００、１００００、３００００または１０００００ダルトンの分子カットオフを有するポリエーテルスルホン限外濾過膜（Ｏｍｅｇａ（商標）ＴＦＦカプセル）を装備していた。当業者により理解される通り、他のフィルター材料および分子カットオフによっても同様の結果を得ることができる。さらに、単糖類、無機イオンおよび小さいカルボン酸を除去するため、ナノ濾過のステップを適用すると有利となり得る。
ｃ．液液抽出
一部の例において、液液抽出のステップを適用し、伝統的な分液漏斗内で実施した。本発明のアルカロイドが可溶性の水非混和性有機溶媒によって、リベス抽出物水溶液を抽出した。酢酸エチルまたは１−ブタノールによって、液液抽出に成功した。
当業者により理解される通り、有用な濃度の本発明のアルカロイドは、他の様々な溶媒または溶媒混合物によっても得ることができる。
ｄ．固液抽出
一部の例において、本発明のアルカロイドを選択的に溶解させる溶媒中に乾燥させた粗抽出物を再溶解させる場合、固液抽出のステップを適用した。粗抽出物次第であるが、２−プロパノール、１−ブタノールまたは酢酸エチルによって、固液抽出に成功した。
当業者により理解される通り、有用な濃度の本発明のアルカロイドは、他の溶媒または溶媒混合物によっても得ることができる。
ｅ．クロマトグラフィー
精製された本発明のリベスアルカロイド画分を取得するため、一部の例において、クロマトグラフィーのステップを適用した。
このステップを、固相抽出カラム、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）ＤＳＣ−１８、１０ｇ、６０ｍｌのチューブをＳｕｐｅｌｃｏ Ｖｉｓｉｐｒｅｐ ２４ ＴＭ ＤＬ真空システム上に装着したものを使用して実施した。以下の標準的な手順を適用した。
−カラムを６０ｍｌのメタノール（ＭｅＯＨ）によって条件調整し、２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＭｅＯＨ水溶液６０ｍｌによって平衡化した。
−乾燥物１０００ｍｇに相当するリベスの粗抽出物または精製前抽出物を、（可溶性に応じて）容積１０−２５ｍｌの水を入れたカラムに加えた。
−カラムを１００ｍｌの水によって希釈し、これを別個の画分として採取した。
−カラムを１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＭｅＯＨ水溶液１００ｍｌによって希釈し、これを別個の画分として採取した。
−カラムを２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＭｅＯＨ水溶液１００ｍｌによって希釈し、これを別個の画分として採取した。
−カラムを３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＭｅＯＨ水溶液１００ｍｌによって希釈し、これを別個の画分として採取した。
−カラムを４０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＭｅＯＨ水溶液１００ｍｌによって希釈し、これを別個の画分として採取した。
−カラムを５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＭｅＯＨ水溶液１００ｍｌによって希釈し、これを別個の画分として採取した。
−カラムを６０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＭｅＯＨ水溶液１００ｍｌによって希釈し、これを別個の画分として採取した。
−カラムを７０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＭｅＯＨ水溶液１００ｍｌによって希釈し、これを別個の画分として採取した。
−カラムを８０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＭｅＯＨ水溶液１００ｍｌによって希釈し、これを別個の画分として採取した。
このように、本発明によるアルカロイド画分をさらに濃縮したものを採取した。
様々なカラム材料、および他の種類の逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど様々なクロマトグラフィー原理を応用して同様の結果を得ることができることは、当業者に理解される。
ｆ．乾燥
先行処理に応じて、場合によって最終の乾燥ステップを適用した。
ほとんどの場合、乾燥は５０℃の真空条件下の回転蒸発器（真空制御装置Ｖ−８５０付きＢｕｃｈｉ Ｒｏｔａｖａｐｏｒ Ｒ−２１０）上で実施した。当業者により理解される通り、凍結乾燥、流動床乾燥、噴霧乾燥など、他の乾燥技法によっても同様の結果を得ることができる。
調製目的でのスケールアップ
一部の例において、例えば本発明の栄養物を採用する臨床試験向けに、十分な量の本発明のアルカロイド画分を含むリベスの抽出物、汁または濃縮物を取得するため、前述の実験的製造工程を試験的生産規模にまでスケールアップした。
分析セクション
本発明による精製アルカロイド、およびそれらを含む抽出物、汁または濃縮物すべてについて、１台のバイナリポンプ、１つのオートサンプラ、１つのカラムオーブン、１つのダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）、および１つのエレクトロスプレーイオン化源を装備したＭＳ四重極検出器から成るＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ−ＤＡＤ−ＭＳシステムを使用して特性評価を行った。データはすべて、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎというソフトウェアを使用して記録した。化合物の分離は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＰｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ ＳＢ−Ｃ１８型カラム（３×１５０ｍｍ、２．７μｍ）上で達成された。使用した溶媒はすべて、民間供給業者からのＭＳ品質であった。移動相は０．５％のギ酸を含む水および０．５％のギ酸を含むアセトニトリルから成り、０．５％のギ酸を含む２〜９８％ｖ／ｖのアセトニトリルの勾配（０〜１１０分）および０．５％のギ酸を含む９８〜２％ｖ／ｖのアセトニトリルの勾配（１１０〜１２０分）を使用し、流量は０．５ｍｌ／分であった。ＵＶデータは、２００〜７００ｎｍの範囲での完全走査ＵＶスペクトルとして取得した。ＭＳデータは、ｍ／ｚ１００〜１０００での完全走査質量スペクトルとして取得した（ＥＳＩ陽イオンモード）。
結果
分析の結果、前述のようなバイオアッセイ用単離アルカロイドの純度が確認された。
以下の、本発明の抽出物、汁および濃縮物を分析した。
Figure 2016525103
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Figure 2016525103
［実施例２］
目的
この研究の目的は、リベス・ルブルムおよびリベス・ニグルムの濃縮物／抽出物の様々な混合比の混合物の存続性について、若干高めの温度（摂氏４０度）に３か月間曝露させた後の該混合物の安定性を単純に試験することによって試験することであった。
方法
ＲＡＰ１６およびＲＡＰ１７を実施例１において調製した。
ＲＡＰ１６とＲＡＰ１７の混合物１０ｇを、下表に記載の比で調製した。
Figure 2016525103
すべての試料を滅菌ガラス容器に入れ、高めの温度（摂氏４０度）で９０日間保存した。
すべての試料の化学的プロファイルを、実施例１に記載のＨＰＬＣ−ＤＡＤ−ＭＳ法を採用して、９０日間の保存の前後に確立させた。
結果
ＲＡＰ１６とＲＡＰ１７の各混合物の高めの温度での保存の前後の化学的プロファイルを比較した。違いは観察されなかった。
結論
試験したＲＡＰ１６とＲＡＰ１７の混合物はすべて安定していると認められ、よってリベス・ルブルムおよびリベス・ニグルムの化学的プロファイルの違いは、安定性に関して、これらを組み合わせる潜在性に全く悪影響を及ぼさなかった。
［実施例３］
目的
この研究の目的は、本発明の単離アルカロイドがＩｋａｐｐａＢキナーゼβ（ＩＫＫ−β）に及ぼすインビトロ阻害効果の調査であった。
背景
ＩＫＫ−βは、ＮＦ−κＢを伴う阻害ＩκＢタンパク質をリン酸化する。リン酸化の結果、ＩκＢがＮＦ−κＢから解離し、ＮＦ−κＢは少なくとも１５０の遺伝子の転写を活性化し得る細胞核中へ移動できるようになる。Ｚ９−ＬＹＴＥ（商標）キナーゼアッセイキット−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ ５ Ｐｅｐｔｉｄｅは、蛍光光度計による検出のためのクマリンとフルオレセインの間での蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用して、潜在的なＩＫＫ−β阻害効果をスクリーニングするよう設計されている。
方法
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより提供のＺ９−ＬＹＴＥ（商標）キナーゼアッセイキット−ＳＥＲ／ＴＨＲ ５ ＰＥＰＴＩＤＥプロトコルに従ってアッセイを実施した［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｚ’−ＬＹＴＥ（商標） Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ − Ｓｅｒ／Ｔｈｒ ５ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ、Ｏ−０６２１８７−ｒｌ ＵＳ ０４０５］。キットのＩＫＫ−β証明書に基づき、５００ｎｇ／ｍｌのキナーゼ濃度を選定した。ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）キナーゼアッセイのための最適化に従って、ＡＴＰ ９．４μＭのためのＫｍを選定した［ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ＩＫＢＫＢ＿％２８ＩＫＫ＿ｂｅｔａ％２９＿ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ＿Ａｃｔｉｖｉｔｙ．ｐｄｆ］。
計装のセットアップ
蛍光プレートリーダー（Ａｐｐｌｉｓｋａｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、以下のパラメータによる蛍光放射信号の検出に使用した。
Figure 2016525103
試験化合物
実施例１において調製した本発明のアルカロイドから選択したものを、５０％阻害濃度（ＩＣ−５０）を確立するため５倍希釈物中で試験した。
結果
Figure 2016525103
結論
同じフェニル−アクリル酸の骨格を有する２つの最も密接に関連するアルカロイドに比べ、リベトリルＡは大幅に強力なＩＫＫ−β阻害剤であった。このように、リベトリルＡはリベトリルＢに比べ１／４８のＩＣ−５０を示し、またリベトリルＣに比べ１／１１８のＩＣ−５０を示した。
結論として、試験した本発明のアルカロイドはすべて、生理学的に関連性のある濃度での用量依存型で有意なＩＫＫ−β阻害を示した。
文献
１．Ｒｏｄｅｍｓ ２００２年、ＡＳＳＡＹ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌ Ｔｅｃｈｎｏｌ；１：９−１９。
２．Ｋｌｅｍａｎ−Ｌｅｙｅｒ ２００３年、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ Ｄｅｖｅｌ；６：８１−２。
３．Ｚｈａｎｇ １９９９年、Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ；４：６７−７３。
４．Ｄａｖｉｅｓ ２０００年、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ；３５１：９５−１０５。
５．Ｃｈｉｊｉｗａ １９９０年、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ；２６５：５２６７−７２。
［実施例４］
目的
この研究の目的は、本発明のアルカロイドがホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）に及ぼすインビトロ阻害効果の調査であった。
背景
ＰＤＥ４は、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）を不活性アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）へと加水分解する。ＰＤＥ４の阻害は、ｃＡＭＰの加水分解を阻止することにより、ｃＡＭＰレベルを高める。ＰＤＥ４Ａ１Ａアッセイキットは、蛍光偏光を使用してＰＤＥ４Ａ１Ａ阻害剤を同定する目的で設計されている。アッセイは、ＰＤＥ４Ａ１Ａによって生成される蛍光ＡＭＰを結合剤へ結合させることに基づく。
方法
ＢＳＰ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ提供のＰＤＥ４Ａ１Ａアッセイのプロトコルに従って、アッセイを実施した［ＢＳＰ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｄａｔａ ｓｈｅｅｔ ＰＤＥ４Ａ１Ａ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、カタログ番号６０３４０］。
計装のセットアップ
蛍光プレートリーダー（Ａｐｐｌｉｓｋａｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、以下のパラメータによる蛍光放射信号の検出に使用した。
Figure 2016525103
試験化合物
実施例１において調製した本発明のアルカロイドから選択したものを、５０％阻害濃度（ＩＣ−５０）を確立するため５倍希釈物中で試験した。
結果
Figure 2016525103
結論
同じフェニル−アクリル酸の骨格を有する２つの最も密接に関連するアルカロイドに比べ、リベトリルＡは大幅に強力なＰＤＥ４阻害剤であった。このように、リベトリルＡはリベトリルＢに比べ１／５のＩＣ−５０を示し、またリベトリルＣに比べ１／２０のＩＣ−５０を示した。
結論として、試験した本発明のアルカロイドはすべて、生理学的に関連性のある濃度で有意な用量依存型のＰＤＥ４阻害を示した。
文献
Ｇｏｌｄｈｏｆｆ ２００８年、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；１４（２３）：７７１７−２５。
［実施例５］
目的
この研究の目的は、本発明のアルカロイドがホスホジエステラーゼ５Ａ（ＰＤＥ５）に及ぼすインビトロ阻害効果の調査であった。
背景
ＰＤＥ５は、環状グアノシンアデノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）を不活性５’−ＧＭＰへと加水分解する。ＰＤＥ５の阻害は、ｃＧＭＰの加水分解を阻止することにより、ｃＧＭＰレベルを高める。ＰＤＥ５Ａアッセイキットは、蛍光偏光を使用してＰＤＥ５Ａ阻害剤を同定する目的で設計されている。アッセイは、ＰＤＥ５Ａによって生成される蛍光ヌクレオチド一リン酸を結合剤へ結合させることに基づく。
方法
ＢＳＰ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ提供のＰＤＥ５Ａアッセイのプロトコルに従って、アッセイを実施した［ＢＳＰ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｄａｔａ ｓｈｅｅｔ ＰＤＥ５Ａ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、カタログ番号６０３５０］。
計装のセットアップ
蛍光プレートリーダー（Ａｐｐｌｉｓｋａｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、以下のパラメータによる蛍光放射信号の検出に使用した。
Figure 2016525103
試験化合物
実施例１において調製した本発明のアルカロイドから選択したものを、５０％阻害濃度（ＩＣ−５０）を確立するため５倍希釈物中で試験した。
結果
Figure 2016525103
結論
同じフェニル−アクリル酸の骨格を有する２つの最も密接に関連するアルカロイドに比べ、リベトリルＡは大幅に強力なＰＤＥ５阻害剤であった。このように、リベトリルＡはリベトリルＢに比べ１／３のＩＣ−５０を示し、またリベトリルＣに比べ１／８のＩＣ−５０を示した。
結論として、試験した本発明のアルカロイドはすべて、生理学的に関連性のある濃度で有意な用量依存型のＰＤＥ５阻害を示した。
文献
Ｍａｕｒｉｃｅ ２００５年、Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ；１０：１２２１−８。
［実施例６］
目的
この研究の目的は、マウスのＣ２Ｃ１２筋管におけるミトコンドリア生物発生に対する、本発明の２つのリベスアルカロイド画分、ＲＡＰ１３およびＲＡＰ１４の効果の調査であった。Ｃ２Ｃ１２細胞は、エネルギー需要の高い運動中の筋肉に類似する高い有酸素容量を有する筋管へと分化され得る、マウスの筋芽細胞株である。
方法
以下の本発明のアルカロイドを含む、ＲＡＰ１３およびＲＡＰ１４を実施例１において調製した。
ＲＡＰ１３アルカロイド
リベトリルＡ：３．３％
リベトリルＢ：２．４％
リベトリルＤ：５．４％
リベトリルＥ：１２．８％
グルコインドールＡ：５８．８％
グルコインドールＢ：１７．３％
ＲＡＰ１４アルカロイド
リベトリルＡ：２１．７％
リベトリルＢ：１．３％
リベトリルＣ：７．５％
リベトリルＤ：１０．３％
リベトリルＥ：３３．０％
グルコインドールＡ：２６．２％
細胞培地中での投与向けに、ＲＡＰ１３アルカロイドおよびＲＡＰ１４アルカロイドを、１０％（容積）のエタノール中で溶解させ、そして所望の濃度を得るため１％（ｖｏｌ）を加え、インキュベーション培地中でのエタノールの最終濃度を０．１％（非細胞毒性）とした。未分化のＣ２Ｃ１２細胞（筋芽細胞）を、基底細胞培養培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ −高グルコース（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ０８１９）中において、４５００ｍｇ／Ｌのグルコース、Ｌ−アラニル−グルタミンおよび重炭酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム不添加、１０％のＦＢＳ（ロット：０７３９Ｌ）、１００ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンによって培養した。細胞培養物を、３７℃、湿度９５％およびＣＯ２ ５％の大気中でインキュベートした。３０，０００個の細胞を３．５ｃｍの皿内に播種し、翌日、２回／３回定量で２５ｎｇ／ｍＬまたは５０ｎｇ／ｍＬのＲＡＰ１３アルカロイドまたはＲＡＰ１４アルカロイドに曝露させ、４８時間インキュベートした。比較のため、未処置対照および陽性対照（３０μＭのレスベラトロールおよび５０ｍＭのピルビン酸塩）もインキュベートした。インキュベーション後、細胞を皿から取り出してトリプシン処理し、培地中で洗浄し、ハンクス緩衝生理食塩水中で０．０６μＭのＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（ＭＴＧ）によって再懸濁させた。細胞をＭＴＧによって室温で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）を使用して蛍光を判定した。自己蛍光を差し引いた信号の平均の幾何平均として、蛍光レベルを推定した（無染色対照から推定）。統計分析を、スチューデントｔ−検定により実施した。
結果
ＭＴＧを使用したところ、２５ｎｇ／ｍＬおよび５０ｎｇ／ｍＬのＲＡＰ１３アルカロイドまたはＲＡＰ１４アルカロイドに４８時間曝露させたＣ２Ｃ１２細胞において、未処置対照群に比べ、ミトコンドリアレベルの増加が認められた。差は２５ｎｇ／ｍＬのＲＡＰ１３アルカロイドについて統計的に有意（ｐ＜０．０５）で、２５ｎｇ／ｍＬおよび５０ｎｇ／ｍＬのＲＡＰ１４アルカロイドについて統計的に有意（ｐ＜０．０５）であった。結果は図４に要約されている。
結論
Ｃ２Ｃ１２筋管において、ＲＡＰ１３アルカロイドおよびＲＡＰ１４アルカロイドは、生理学的に関連性のある濃度でミトコンドリア生物発生を大幅に増加させることができた。筋細胞中でのミトコンドリア生物発生増加は、ストレスの多い条件および／もしくは運動中の筋肉における高いエネルギー需要に対処するために許容力増強が必要な場合、または不活動、病気もしくは年齢に起因するミトコンドリアの量および機能の減少が筋細胞の機能性を阻害している場合に、関連性が高い。
［実施例７］
目的
この研究の目的は、標準的なミトコンドリアストレステストに曝されたマウスのＣ２Ｃ１２筋管における予備呼吸容量に対する、本発明の２つのリベスアルカロイド画分、ＲＡＰ１３およびＲＡＰ１４の効果の評価であった。このモデルは、最大限にストレスの多い条件下で基本レベルを超えてＡＴＰ生産を増加させるミトコンドリアの能力の定量化により、筋細胞中でのミトコンドリアの機能性に関する貴重な情報を提供する。
方法
以下の本発明のアルカロイドを含む、ＲＡＰ１３およびＲＡＰ１４を実施例１において調製した。
ＲＡＰ１３アルカロイド
リベトリルＡ：３．３％
リベトリルＢ：２．４％
リベトリルＤ：５．４％
リベトリルＥ：１２．８％
グルコインドールＡ：５８．８％
グルコインドールＢ：１７．３％
ＲＡＰ１４アルカロイド
リベトリルＡ：２１．７％
リベトリルＢ：１．３％
リベトリルＣ：７．５％
リベトリルＤ：１０．３％
リベトリルＥ：３３．０％
グルコインドールＡ：２６．２％
細胞培地中での投与向けに、ＲＡＰ１３アルカロイドおよびＲＡＰ１４アルカロイドを、１０％（容積）のエタノール中で溶解させ、そして所望の濃度を得るため１％（ｖｏｌ）を加え、インキュベーション培地中でのエタノールの最終濃度を０．１％（非細胞毒性）とした。Ｃ２Ｃ１２細胞を細胞培養培地中で６日間、細胞培養培地に含まれるＡｓｉｒｏｓ化合物によって増殖させた。ＲＡＰ１３アルカロイドおよびＲＡＰ１４アルカロイド双方を、４通りの濃度（５０ｎｇ／ｍｌ、１６．７ｎｇ／ｍｌ、５．６ｎｇ／ｍｌおよび１．９ｎｇ／ｍｌ）にて、８つの複製において試験した。基底細胞培養培地はＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ・ｓ Ｍｅｄｉｕ −グルコースなし（ＤＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１９６６）を１０％のウシ胎仔血清、１００ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび１ｇ／ｌのｄ−グルコースで補ったもので構成された。すべての細胞培養物を、３７℃、湿度９５％およびＣＯ２ ５％の大気中でインキュベートした。培地を４８時間おきに交換した（培地交換の都度、試験化合物を新たに添加）。培養６日目、細胞を、１ウェル当たり細胞１２，０００個の密度で、Ｓｅａｈｏｒｓｅアッセイプレートへ再播種した（１化合物あたり８つの複製）。Ｓｅａｈｏｒｓｅ測定日（７日目）に、培地をＸＦアッセイ培地（無ＨＣＯ３ −修正型ＤＭＥＭ、Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に変更し、これを４ｍＭのＬ−グルタミンおよび１ｍＭのピルビン酸塩で補った。培地のｐＨを３７℃にて７．４へ調整した。ＸＦ Ｃｅｌｌ Ｍｉｔｏストレステストを、ＸＦ９６細胞外フラックス分析装置（Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上で、Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＸＦ Ｃｅｌｌ Ｍｉｔｏストレステストキット取扱説明書ＸＦ９６ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓに従って、１μＭのオリゴマイシン、０．４μＭのＦＣＣＰおよび１μＭのロテノン／アンチマイシンの逐次添加によって実施した。一方向ＡＮＯＶＡに続くダンネットテストを、ビヒクル群と試験群の差を試験するために適用した。差はＰ＜０．０５の場合に有意と見なされる。外れ値は分析から除外した。
結果
ＲＡＰ１３アルカロイドは、ビヒクル処置群に比べ、すべての試験対象用量（５０ｎｇ／ｍｌ、１６．７ｎｇ／ｍｌ、５．６ｎｇ／ｍｌおよび１．９ｎｇ／ｍｌ）において、標準的なミトコンドリアストレステストに曝されたＣ２Ｃ１２細胞の予備呼吸容量を大幅に増加させた。ＲＡＰ１４アルカロイドの場合、すべての試験対象用量において予備呼吸容量の増加に向かう明らかな傾向があり、最も高い２通りの用量（５０ｎｇ／ｍｌおよび１６．７ｎｇ／ｍｌ）での増加が顕著であった。
結果は下表に要約されている。
Figure 2016525103
Figure 2016525103
結論
Ｃ２Ｃ１２筋管において、ＲＡＰ１３アルカロイドおよびＲＡＰ１４アルカロイドは、生理学的に関連性のある濃度でミトコンドリアの予備呼吸容量を大幅に増加させることができた。Ｃ２Ｃ１２筋管は、運動中の筋肉に類似する高い有酸素容量を有する。ある条件下で、組織はストレスまたは仕事量増加への応答として、付加的細胞エネルギーの突発的な急増を要求し得、この応答は組織の予備呼吸容量に依存する。細胞の予備呼吸容量が、要求されるＡＴＰの提供に十分でない場合、影響を受ける細胞の機能が最適な水準に及ばず、さらには老化または細胞死へと追い込まれる危険に曝される。したがって、筋細胞中の予備呼吸容量増加は、筋肉の機能および能力における持久力の改善、ストレスに対する抵抗性の改善はもとより、老化および不活動の効果への拮抗の改善にも、極めて有用である。
［実施例８］
目的
この研究の目的は、ミトコンドリアストレスに曝されたマウスのＣ２Ｃ１２筋管における予備呼吸容量に対する、本発明の２つのリベスアルカロイド画分、ＲＡＰ１５の効果の評価であった。
方法
以下の本発明のアルカロイドを含む、ＲＡＰ１５を実施例１において調製した。
ＲＡＰ１５アルカロイド
リベトリルＡ：１６．０％
リベトリルＢ：２．３％
リベトリルＣ：４．９％
リベトリルＤ：１６．４％
リベトリルＥ：１５．５％
グルコインドールＡ：３１．０％
グルコインドールＢ：１３．９％
手順はすべて、実施例７に記載の方法と同一であった。ＲＡＰ１５アルカロイドを、２通りの濃度、２０ｎｇ／ｍｌおよび４ｎｇ／ｍｌにて、いずれも８つの複製において試験した。一方向ＡＮＯＶＡに続くダンネットテストを、ビヒクル群と試験群の差を試験するために適用した。差はＰ＜０．０５の場合に有意と見なされる。外れ値は分析から除外した。
結果
ＲＡＰ１５アルカロイドは、試験対象用量において、標準的なミトコンドリアストレステストに曝されたＣ２Ｃ１２細胞の予備呼吸容量を、対照に比べ大幅に増加させた。
結果は下表に要約されている。
Figure 2016525103
結論
Ｃ２Ｃ１２筋管において、ＲＡＰ１５は、本発明による類似のリベスアルカロイドの従前の試験対象用量と同等な生理的に関連性のある濃度でミトコンドリアの予備呼吸容量を大幅に増加させることができた。
［実施例９］
目的
この研究の目的は、高脂肪食によって誘発される脂質異常症のモルモットにおける、本発明の２つの異なるリベスアルカロイド組成物、ＲＡＰ２およびＲＡＰ４のコレステロール低下効果の調査であった。
試験化合物および化学物質
リベスアルカロイド濃縮物ＲＡＰ２およびリベスアルカロイド抽出物ＲＡＰ４を、実施例１において生産した。ＲＡＰ２およびＲＡＰ４を、０．５％のメチルセルロース中において、５０℃の水槽内での２０分間の超音波処理によって溶解／懸濁させた。アトルバスタチンをコレステロール低下基準化合物として使用した。ビヒクルは０．５％のメチルセルロースであった。
実験手順
オスの体重３００＋／−３０ｇのＤｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙ系モルモットを、実験の存命段階の１週間前に順応させた。研究食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ、ＵＳＡ）は１５％のコーン油および０．２５％のコレステロールを含有した。９μｇ／ｋｇのリベトリルＡおよび合計８２μｇ／ｋｇの各種リベトリルならびに合計６３２μｇ／ｋｇの各種グルコインドールに相当する、日間経口用量２０００ｍｇ／ｋｇのＲＡＰ２を、１０ｍＬ／ｋｇの投与容積にて経口投与した。１１２μｇ／ｋｇのリベトリルＡおよび合計４９２μｇ／ｋｇの各種リベトリルならびに合計２４０μｇ／ｋｇの各種グルコインドールに相当する、日間経口用量２０００ｍｇ／ｋｇのＲＡＰ４を、１０ｍＬ／ｋｇの投与容積にて経口投与した。陽性対照アトルバスタチン（１０ｍｇ／ｋｇ）およびビヒクル（０．５％のメチルセルロースをそれぞれ、１０ｍＬ／ｋｇの投与容積にて経口投与した。試験化合物、基準化合物またはビヒクルを、６匹の動物から成る複数の群へ１日１回、連続２８日間にわたり経口強制投与した。
夜間絶食後、血液試料を、初回の試験物質および／またはビヒクル投与の５分前（処置前）、また１４日目および２８日目の投与から２４時間後（処置後）に、各動物の後眼窩静脈洞から採取した。血清総コレステロール（ＴＣ）、低比重リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）、高比重リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）およびトリグリセリド（ＴＧ）を、酵素法によって判定した（Ｗａｋｏ総コレステロール、ＬＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−ＣおよびＴＧ診断キットならびに東芝製ＴＡＢ−１２０ＦＲ型自動分析装置）。
結果
２８日間の処置後、ＲＡＰ２処置動物はビヒクル処置群に比べ、トリグリセリドレベルの４５％低減（Ｐ＜０．０５）、血清総コレステロールの３６％減少（Ｐ＜０．０５）およびＬＤＬの３５％減少（Ｐ＜０．０５）を示した。わずか１５日後に、ＲＡＰ４処置動物は、ビヒクル対照群に比べ、トリグリセリドレベルの３２％低減を示し（Ｐ＜０．０５）、低下はさらに進んで２８日間の処置後には５０％低下となった（Ｐ＜０．０５）。驚くことに、ＲＡＰ４処置群は２８日間の処置後に血清総コレステロールの４０％減少（Ｐ＜０．０５）およびＬＤＬの３９％減少（Ｐ＜０．０５）を示し、これは陽性対照のアトルバスタチンと同程度であった。
結論
トリグリセリド低減に関して、ＲＡＰ２およびＲＡＰ４はいずれも、迅速な発現および大幅なトリグリセリド低減を示した一方でアトルバスタチンはトリグリセリドを大幅に低減したわけではなかったことから、アトルバスタチンよりも完全に優れていた。さらに、ＲＡＰ２およびＲＡＰ４はいずれも、２８日間の処置後における総コレステロールおよびＬＤＬに対するその多大な低減効果において、アトルバスタチンと同等であった。ＲＡＰ４はＲＡＰ２に比べ発現が速く効果が高かったことは、リベトリルＡの含有量が大幅に高いことによるものと考えられ、それは各種アルカロイドの合計含有量が本発明の組成物においてほぼ同じであったからである。
文献
１．Ａｏｋｉ ２００１年、Ａｒｚｎｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ；５１（Ｉ）１９７−２０３、２００１。
２．Ｖａｎ ２００１年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ；５０：１３３０−１３３５。
３．Ｂｅｎｓｃｈ １９９９年、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ；２８９：８５−９２。
４．Ｄａｇｇｙ １９９７年、Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ；３８：４９１−５０２。
［実施例１０］
目的
この研究の目的は、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の一モデルであるＢＫＳ Ｃｇ−Ｌｅｐｒ ｄｂ／Ｌｅｐｒ ｄｂマウスにおける、本発明のリベスアルカロイド組成物ＲＡＰ４の血糖降下効果の調査であった。
試験化合物および化学物質
リベスアルカロイド抽出物ＲＡＰ４を、実施例１において生産した。ＲＡＰ４を、２％のＴｗｅｅｎ８０中において、５０℃の水槽内での２０分間の超音波処理によって溶解／懸濁させた。メトホルミンを抗糖尿病基準化合物として使用した。
実験手順
オスの１２−１３週齢、体重５０＋／−５ｇの非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）のマウス（ＢＫＳ Ｃｇ−Ｌｅｐｒ ｄｂ／Ｌｅｐｒ ｄｂ）を使用した。１１２μｇ／ｋｇのリベトリルＡおよび合計４９２μｇ／ｋｇの各種リベトリルならびに合計２４０μｇ／ｋｇの各種グルコインドールに相当する、日間経口用量２０００ｍｇ／ｋｇのＲＡＰ４を、１０ｍＬ／ｋｇの投与容積にて、１２匹の動物へ合計連続１４日間にわたり経口投与した。メトホルミン（３００ｍｇ／ｋｇ）およびビヒクル（２％のＴｗｅｅｎ８０）の陽性対照はそれぞれ、１０ｍＬ／ｋｇの投与容積にて、６匹の動物から成る群が１日１回、合計連続１４日間にわたり経口投与を受けた。１日目のゼロ分（処置前）ならびに７日目および１４日目の日用量投与の９０分後（処置後）に、血清グルコースレベルを自動分析装置（ＴＢＡ−１２０ＦＲ、東芝）によって測定し、血清インスリンをＥＬＩＳＡによって測定した。
結果
連続１４日間にわたるＲＡＰ４の経口投与は、１４日目の投与後にＬｅｐｒ ｄｂマウスモデルにおけるビヒクル対照に比べ血清グルコースレベルの大幅な減少を伴い（Ｐ＜０．０５）、これは３００ｍｇ／ｋｇの陽性対照メトホルミンの場合も同様であった（Ｐ＜０．０５）。インスリンレベルの減少は観察されなかった。
結論
このデータは、本発明のリベスアルカロイド組成物が１４日目に、インスリンレベルに影響することなく、有意な血糖低減を誘発することができた（Ｐ＜０．０５）ことを示す。
文献
Ｊｏｈｎｓｏｎ １９９３年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ；４２：１１７９−１１８６、１９９３。
［実施例１１］
目的
この研究の目的は、２度の同一の、ただし別々の研究において皮膚切除負傷を負わされた正常なＩＣＲマウスにおける創傷治癒に対する、本発明のリベスアルカロイド組成物の効果の調査であった。
試験化合物および化学物質
リベスアルカロイド抽出物ＲＡＰ４を、実施例１において生産した。ＲＡＰ４を、０．５％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）中において、５０℃の水槽内での２０分間の超音波処理によって溶解／懸濁させた。
実験手順
体重２４＋／−２ｇのオスのＩＣＲマウス６匹から成る複数の群を使用した。動物は１１２μｇ／ｋｇのリベトリルＡおよび合計４９２μｇ／ｋｇの各種リベトリル、ならびに合計２４０μｇ／ｋｇの各種グルコインドールに相当する、ビヒクル（０．５％のＣＭＣ）および２０００ｍｇ／ｋｇのＲＡＰ４の、皮膚切除負傷（１日目）前の連続７日間にわたる強制投与による前処置を施された。動物は研究全体を通じて個別のケージに収容された。イソフルランガス麻酔下で、各動物の肩および背中の領域を剃った。鋭利な穿孔生検用ナイフ（内径１２ｍｍ）を使用して、皮筋層および付着組織を含む皮膚を切除した。１日目、３日目、５日目、７日目、９日目および１１日目に、創傷部分を透明樹脂板に転写し、画像分析装置ＰｒｏＰｌｕｓ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、バージョン４．５．０．２９）を使用して面積を測定した。ＲＡＰ４およびビヒクル（０．５％のＣＭＣ）を、負傷の１時間前およびその後１日１回、合計連続１０日間にわたり経口強制投与した。創傷閉鎖率（％）を計算し、Ｇｒａｐｈ−Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）を使用して線形回帰によって創傷半閉鎖時間（ＣＴ５０）を分析した。各測定時点において、処置群とビヒクル群を比較するため、対応のないスチューデントｔ−検定を適用した。差はＰ＜０．０５の場合に有意と見なされる。
結果
ＲＡＰ４の経口投与は、皮膚切除負傷を負わされたマウスにおいて早期の作用発現を伴って創傷治癒を大幅に促進し、その結果、ビヒクル対照群に比べＣＴ５０値が大幅に低減した。ＣＴ５０はＲＡＰ４が５．９日、ビヒクル処置群が８．３日であった。切除負傷の３日後、創傷閉鎖度はリベス処置群がビヒクル処置群より７８％高く、また５日後の創傷閉鎖度はリベス処置群がビヒクル処置群より２倍超高かった。
結果は下表に要約されている。
Figure 2016525103
この研究を全く同じ研究設計により繰り返し行った。結果は下表に要約の通り、前回の研究と非常に類似していた。
Figure 2016525103
結論
この実験の結果は、経口投与された本発明のリベスアルカロイド組成物の創傷治癒促進効果を、説得力のある形で確認する結果であった。
文献
Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏｓ １９９７年、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ；１８６：１６１５−１６２０、１９９７。
［実施例１２］
目的
この研究の目的は、皮膚切除負傷を負わされた正常なＩＣＲマウスにおける創傷治癒に対する、本発明の２つのリベスアルカロイド組成物、ＲＡＰ４およびＲＡＰ１６の効果の調査であった。研究設定は、潜在的用量反応および前処置が結果に影響するか否かを調査した実施例７と同様であった。
実験手順
リベスアルカロイド抽出物ＲＡＰ４およびＲＡＰ１６を、実施例１において生産した。ＲＡＰ４およびＲＡＰ１６を、０．５％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）中において、５０℃の水槽内での２０分間の超音波処理によって溶解／懸濁させた。試験物質（ＲＡＰ４：１１２μｇ／ｋｇのリベトリルＡおよび合計４９２μｇ／ｋｇの各種リベトリル、ならびに合計２４０μｇ／ｋｇの各種グルコインドールに相当する２０００ｍｇ／ｋｇ）、（ＲＡＰ１６：３μｇ／ｋｇのリベトリルＡおよび合計１８μｇ／ｋｇの各種リベトリル、ならびに合計９７μｇ／ｋｇの各種グルコインドールに相当する２０００ｍｇ／ｋｇ）およびビヒクル（０．５％のＣＭＣ）を、１２ｍｍの皮膚穿孔の７日前から１０日後にかけて合計連続１７日間にわたり、１日１回、正常なオスＩＣＲマウスへ経口強制投与した。別の群を、創傷前の７日間の投与を省いて、１０日間にわたりＲＡＰ４によって処置した。３日目、５日目、７日目、９日目および１１日目に創傷閉鎖率（％）を判定し、創傷半閉鎖時間（ＣＴ５０）を判定した。一方向ＡＮＯＶＡに続くダンネットテストを、ビヒクル群と試験群の差を試験するために適用した。差はＰ＜０．０５の場合に有意と見なされる。
結果
ＲＡＰ４の経口投与は、皮膚切除負傷前の７日間前処置を受けたマウスにおいて早期の作用発現を伴って創傷治癒を大幅に促進し、その結果、ビヒクル対照に比べＣＴ５０値が大幅に低減した。ＣＴ５０はＲＡＰ４が７．１日、ビヒクル処置群が９．３日であった。ＲＡＰ４による前処置を受けなかったマウス群も、前処置群同様、大幅に速い創傷治癒（ＣＴ５０は７．２）を示し、リベスアルカロイド組成物ＲＡＰ４の創傷治癒促進効果を得るには必ずしも前処置の必要がないことを実証した。別のマウス群は、別のリベスアルカロイド組成物ＲＡＰ１６による処置を受けた。この群もＣＴ５０値７．９日という、大幅に増進された創傷治癒を示し、本発明の別のリベスアルカロイド製剤が創傷治癒に及ぼす効果を実証した。ただし、ＲＡＰ１６の効果はＲＡＰ４の効果より大幅に低く、これはＲＡＰ１６におけるリベスアルカロイドレベルがＲＡＰ４に比べかなり低いことに相当し、本発明のリベスアルカロイドの用量反応を示唆するものである。
結果は下表に要約されている。
Figure 2016525103
結論
この実験の結果は、経口投与された本発明のリベスアルカロイド組成物の２つの異なる製剤の創傷治癒促進効果を実証した。この結果は、本発明のアルカロイドのレベル／用量に依存する用量反応を示唆した。さらに、本発明のリベスアルカロイド組成物の経口投与による有意な創傷治癒効果を得るには、創傷治癒に先立つ前処置が必要ないことも、明確に実証された。
文献
Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏｓ １９９７年、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ；１８６：１６１５−１６２０、１９９７。
［実施例１３］
目的
この研究の目的は、本発明の３つのリベスアルカロイド組成物、ＲＡＰ１６、ＲＡＰ１７、そしてＲＡＰ１６とＲＡＰ１７の５０：５０混合物（重量比）であるＲＡＰ１８の、皮膚切除負傷を負わされた正常なオスＩＣＲマウスにおける創傷治癒効果の調査であった。研究手順は実施例１１における研究設定と同様であった。
実験手順
リベスアルカロイド組成物ＲＡＰ１６、ＲＡＰ１７およびＲＡＰ１８を、実施例１において生産した。ＲＡＰ１６、ＲＡＰ１７およびＲＡＰ１８を、０．５％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）中において、５０℃の水槽内での２０分間の超音波処理によって溶解／懸濁させた。試験物質（ＲＡＰ１６：３μｇ／ｋｇのリベトリルＡおよび合計１８μｇ／ｋｇの各種リベトリル、ならびに合計９７μｇ／ｋｇの各種グルコインドールに相当する２０００ｍｇ／ｋｇ）、（ＲＡＰ１７：８μｇ／ｋｇのリベトリルＡおよび合計２８μｇ／ｋｇの各種リベトリル、ならびに合計２１μｇ／ｋｇの各種グルコインドールに相当する２０００ｍｇ／ｋｇ）、（ＲＡＰ１８：６μｇ／ｋｇのリベトリルＡおよび合計２３μｇ／ｋｇの各種リベトリル、ならびに合計５９μｇ／ｋｇの各種グルコインドールに相当する２０００ｍｇ／ｋｇ）およびビヒクル（０．５％のＣＭＣ）を、１２ｍｍの皮膚穿孔の７日前から１０日後にかけて合計連続１７日間にわたり、１日１回、正常なオスＩＣＲマウスへ経口強制投与した。３日目、５日目、７日目、９日目および１１日目に創傷閉鎖率（％）を記録し、創傷半閉鎖時間（ＣＴ５０）を判定した。一方向ＡＮＯＶＡに続くダンネットテストを、ビヒクル群と試験群の差を試験するために適用した。差はＰ＜０．０５の場合に有意と見なされる。差はＰ＜０．０５の場合に有意と見なされる。
結果
グルコインドール含有率が最も高いＲＡＰ１６の経口投与は、皮膚切除負傷前の７日間前処置を受けたマウスにおいて創傷治癒を大幅に促進し、その結果、ＣＴ５０値がビヒクル対照群（ＣＴ５０ ７．９日）に比べ大幅に低減した（ＣＴ５０ ７．２日）。リベトリル含有率が最も高いＲＡＰ１７の経口投与は、皮膚切除負傷前の７日間前処置を受けた別のマウス群において、大幅に、またＲＡＰ１６の場合と同程度（ＣＴ５０ ７．１日）に、創傷治癒を促進した。興味深いことに、ＲＡＰ１８（ＲＡＰ１６とＲＡＰ１７の５０：５０混合物）はリベトリルおよびグルコインドールの含有率のバランスがより良好であったが、明らかに、ＲＡＰ１６およびＲＡＰ１７に比べ顕著な創傷治癒効果（ＣＴ５０ ６．４日）を有し、これはＲＡＰ１６に多く含まれるグルコインドール（リベス・ルブルムから誘導）およびＲＡＰ１７に多く含まれるリベトリル（リベス・ニグルムから誘導）の相乗効果を示唆する。これはさらに、ビヒクル対照群と比較した創傷閉鎖度が、ＲＡＰ１８については５回の測定日すべてにおいて統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）一方、ＲＡＰ１６は２回の測定日、ＲＡＰ１７は１回の測定日に、有意な効果を得ているという事実によって強調される。
結果は下表に要約されている。
Figure 2016525103
結論
この実験の結果は、リベトリルの含有量およびグルコインドールの含有量がそれぞれ高い、２つの異なる経口投与された本発明のリベスアルカロイド組成物の創傷治癒促進効果を、説得力のある形で実証した。さらに、大幅に高い効果が５０：５０の組み合わせによって観察されたことから、リベトリルを組み合わせた場合に増進される潜在的相乗効果が示唆される。この結果は、相補的なアルカロイドプロファイルを背景とするリベス・ルブルムとリベス・ニグルムの組合せに基づく、本発明のアルカロイド組成物の作製に対する強固な論拠を成すものである。
文献
Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏｓ １９９７年、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ；１８６：１６１５−１６２０、１９９７。
［実施例１４］
目的
この研究の目的は、創傷治癒が最も困難な糖尿病マウス系である糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスにおける、経口投与された本発明のリベスアルカロイド組成物の２つの製剤、ＲＡＰ４およびＲＡＰ１６の創傷治癒効果の調査であった。
実験手順
実験手順は実施例７に記載の手順とほぼ同一であった。手短に言えば、動物繁殖研究所（ＩＡＲ、日本）より提供の、体重５０＋／−５ｇ（約１０週齢）の、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）のオスのｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬＫＳ／Ｊ Ｉａｒ−＋Ｌｅｐｒｄｂ／＋Ｌｅｐｒｄｂ）を使用した。これらの動物は高血糖症を呈し、１２−１３週齢の時期に使用された。リベスアルカロイド抽出物ＲＡＰ４およびＲＡＰ１６を、実施例１において生産した。ＲＡＰ４およびＲＡＰ１６を、０．５％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）中において、５０℃の水槽内での２０分間の超音波処理によって溶解／懸濁させた。試験物質（ＲＡＰ４：１１２μｇ／ｋｇのリベトリルＡおよび合計４９２μｇ／ｋｇの各種リベトリル、ならびに合計２４０μｇ／ｋｇの各種グルコインドールに相当する２０００ｍｇ／ｋｇ）、（ＲＡＰ１６：３μｇ／ｋｇのリベトリルＡおよび合計１８μｇ／ｋｇの各種リベトリル、ならびに合計９７μｇ／ｋｇの各種グルコインドールに相当する２０００ｍｇ／ｋｇ）およびビヒクル（０．５％のＣＭＣ）を、直径１２ｍｍの皮膚穿孔（１日目として指定された皮膚生検日）の７日前（前処置）から１５日後にかけて合計連続２２日間にわたり、１日１回、経口強制投与した。１日目、２日目、４日目、６日目、８日目、１０日目、１４日目および１６日目に創傷閉鎖率を判定し、創傷半閉鎖時間（ＣＴ５０）を判定した。一方向ＡＮＯＶＡに続くダンネットテストを、ビヒクル群と試験群の差を試験するために適用した。差はＰ＜０．０５の場合に有意と見なされる。
結果
７日間の前処置を含む１５日間にわたる１日１回２０００ｍｇ／ｋｇでのＲＡＰ４アルカロイドおよびＲＡＰ１６アルカロイドの経口投与は、皮膚切除負傷を負わされた糖尿病マウスにおいて、８日目、１０日目または１６日目に創傷治癒を大幅に促進し、その結果、ＣＴ５０値がビヒクル対照群（ＣＴ５０ １０．７日）に比べ大幅に低減し、ＲＡＰ４では９．６日、ＲＡＰ１６では９．５日であった。
結果は下表に要約されている。
Figure 2016525103
結論
この実験の結果は、経口投与された２つの異なる本発明のリベスアルカロイド組成物の、糖尿病マウスにおける創傷治癒促進効果を、説得力のある形で実証した。観察された効果は、慢性難治性創傷を負ったマウス系でも同様に説得力がある。
文献
１．Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏｓ １９９７年、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ；１８６：１６１５−１６２０、１９９７。
２．Ｂｏｔｕｓａｎ ２００８年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ；１０５：１９４２６−１９４３１、２００８。
［実施例１５］
目的
この研究は、経口投与された本発明のリベスアルカロイド画分の２つの製剤、ＲＡＰ４およびＲＡＰ１６の、無毛の皮膚を特徴とする異なるマウス種での穿孔生検創傷における創傷治癒効果の調査を目的に、マウスでの従前の実験と異なる場所で実施した。
実験手順
リベスアルカロイド組成物ＲＡＰ４およびＲＡＰ１６を、実施例１において生産した。ＲＡＰ４およびＲＡＰ１６を、脱塩水中において２５０ｍｇ／ｍｌの濃度で配合した。ビヒクル対照は脱塩水であった。無毛であるが免疫応答性のある１２−１４週齢（平均体重２５ｇ）のメスのマウスＣ３．Ｃｇ ＴｉｆＢｏｍＴａｃ（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｒｙ、デンマーク）を１０匹ずつ無作為に、処置群またはビヒクル群へ配分した。Ｈｙｐｏｎｏｒｍ Ｄｏｒｍｉｃｕｍ浅麻酔下にて、８ｍｍの全層穿孔生検を２回行って、背の皮筋層および付着組織を含む皮膚を切除した。１回の生検は背の各側で行った。試験物質（ＲＡＰ４：１１２μｇ／ｋｇのリベトリルＡおよび合計４９２μｇ／ｋｇの各種リベトリル、ならびに合計２４０μｇ／ｋｇの各種グルコインドールに相当する２０００ｍｇ／ｋｇ）、（ＲＡＰ１６：３μｇ／ｋｇのリベトリルＡおよび合計１８μｇ／ｋｇの各種リベトリル、ならびに合計９７μｇ／ｋｇの各種グルコインドールに相当する２０００ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルを１日１回、強制経口投与した。切除負傷の後、すべての群を、１日目として指定される皮膚負傷日を含む合計連続１４日間にわたり処置した。Ｈｙｐｏｎｏｒｍ Ｄｏｒｍｉｃｕｍ浅麻酔下にて、創傷を週３回測定した。創傷の端部を、先細の油性マジックを使用してガラス顕微鏡スライドへ転写した。転写物をデジタルスキャンし、ＩｍａｇｅＪ １．４７ｑ（米国国立衛生研究所）によって創傷部分をデジタル処理により分析および定量化した（処置群別に盲検化）。一方向ＡＮＯＶＡに続くダンネットテストのほか、マンホイットニーノンパラメトリック検定を、ビヒクル群と試験群の差を試験するために適用した。差はＰ＜０．０５の場合に有意と見なされる。
結果
７日間の前処置と併せた１４日間にわたる、メスの無毛マウスにおける２０００ｍｇ／ｋｇ／日でのＲＡＰ４およびＲＡＰ１６の経口投与は、対照群に比べ、創傷治癒を大幅に促進した。観察された差は、両方のリベスアルカロイド組成物について、３日目から８日目までのすべての時点で（マンホイットニーノンパラメトリック検定 ｐ＜０．０００１）統計的に極めて有意で、また１０日目の段階でも有意で、ＲＡＰ４についてはｐ＝０．０２８、ＲＡＰ１６についてはｐ＝０．０２９であった。８日目の段階で、処置群の創傷はほぼ完全に閉鎖された（８９％）のに比べ、ビヒクル群では６９％であった。一方向ＡＮＯＶＡも、３日目、５日目および８日目に有意性を実証した。
結果は図５に示されている。
結論
この実験の結果は、経口投与されたリベスアルカロイド組成物の、メスの無毛マウスにおける有意な創傷治癒促進効果を実証した。この実験は、異なる場所で異なる研究設計により実施したオスのＩＣＲマウスおよび糖尿病マウスにおいて複数の研究で既に実証済みであった創傷治癒に関する結果を確認するものであり、また経口投与された本発明のリベスアルカロイド組成物の創傷治癒効果が、複数の種にまたがって、雌雄を問わず、研究の場所や設計に関係なく認められ得ることを実証するものである。
［実施例１６］
この実施例は、本発明による栄養物の調製に関する（以下、ＮＰ１という）。
目的
本発明のリベスアルカロイド濃縮物を含む経口投与用栄養物組成物の調製。
試験化合物および化学物質
本発明のリベスアルカロイド濃縮物ＲＡＰ１６を、実施例１において生産した。
実験手順
２．０ｇのソルビン酸カリウムを保存剤として添加した後、合計容積が４０００ｍｌとなるよう調整された精製水中での２０００ｇのＲＡＰ１６の溶解によって、組成物を調製した。
結果
毎日の消費向けに安定し適切な、投与しやすい液剤ＮＰ１を取得した。
［実施例１７］
目的
この研究の目的は、実施例１６において生産された経口投与用栄養物、すなわち本発明のリベスアルカロイドを含むＮＰ１の、ヒト予備研究における急性創傷の治癒に対する効果の調査であった。
材料および手順
リベスアルカロイド組成物ＮＰ１を実施例１において生産し、透明な赤色の流体として経口摂取向けに配合し、４℃で保存した。４５μｇのリベトリルＡ、合計２７３μｇの各種リベトリルおよび合計１４５５μｇの各種グルコインドールに相当する、３０ｇのＲＡＰ１６に相当する日用量２５ｍｌのＮＰ１を１日２回（朝夕）。
この研究を、２つの連続的創傷期間を設けた自由交差研究として実施した。ある４５歳の、正常な皮膚を有し、創傷治癒障害の経歴のない健康な男性が、殿裂のすぐ上の臀部において横一直線状に、局部麻酔下で、３ｍｍの全層皮膚穿孔生検を８回受けた。スポンゴスタンによって止血し、創傷をＭｅｐｉｌｅｘ Ｂｏｒｄｅｒ Ｌｉｔｅ泡状包帯によって被覆した。１日目として指定された生検日に、創傷を撮影した。続いて１０日間にわたり１日１回、創傷を撮影し、０．５％、ｐＨ３．５のカルボキシメチルセルロースを２０μｌ、２０分間にわたり適用した後、創傷をＭｅｐｉｌｅｘによって被覆した。最初の創傷切開から３週間後に開始したＮＰ１の経口投与による７日間の前処理後、前回の生検より１ｃｍ上方にて、新たな３ｍｍの全層皮膚穿孔生検を８回実施した。創傷切開日を１日目として指定した。研究対象は、生検後連続１０日間にわたり、ＮＰ１の経口投与による処置を受けた。創傷を対照創傷期間として扱い、文書に記録した。
測定および統計：コンピューター画面上で、撮影された測定スケールを基準に創傷の写真を標準化し、創傷縁辺を透明なガラス顕微鏡スライドに転写し、デジタルスキャンした。ＩｍａｇｅＪ １．４７ｑ（米国国立衛生研究所）によって創傷部分をデジタル測定し、１日目と比較した２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目および１０日目の創傷閉鎖率（％）を計算した。無処置の創傷と処置された創傷の有意差を判定するため、スチューデントｔ−検定を使用した。有意差はＰ＜０．０５の水準で確立される。
結果
正常な皮膚を有する健康な４５歳の男性における、７日間の前処置と併せた１０日間にわたるＮＰ１の経口投与は、急性創傷の治癒を大幅に促進した。治癒は早期発現を伴って促進され、２日目から治癒過程が加速した。
結果は下表に要約されている。
Figure 2016525103
結論
この実験の結果は、本発明のリベスアルカロイドを含む栄養物、ＮＰ１をヒト対象に経口投与した場合の有意な創傷治癒促進効果を実証した。創傷治癒促進の迅速な発現は、マウスでの急性創傷治癒研究で観察された効果と同様であった。この研究は、ヒトでの創傷治癒促進における本発明の関連性を実証するものである。
文献
Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏｓ １９９７年、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ；１８６：１６１５−１６２０、１９９７。
［実施例１８］
この実施例は、本発明による栄養物の調製に関する（以下、ＮＰ２という）。
目的
本発明のリベスアルカロイド濃縮物を含む経口投与用栄養物組成物の調製。
試験化合物および化学物質
本発明のリベスアルカロイド濃縮物ＲＡＰ４を、実施例１において生産した。
実験手順
２．０ｇのソルビン酸カリウムを保存剤として、また２．０ｇのＴｗｅｅｎ８０を乳化剤として添加した後、合計容積が４０００ｍｌとなるよう調整された精製水中での１０００ｇのＲＡＰ４の溶解によって、組成物を調製した。
結果
毎日の消費向けに安定し適切な、投与しやすい液剤ＮＰ２を取得した。
［実施例１９］
目的
この実施例は、脂質異常症を患い、ＢＭＩが増加したあるヒト対象における、増量した本発明のアルカロイド画分を含む、実施例１８において生産された機能性食品組成物の形態でのリベス組成物による処置に関する。
手順
脂質異常症の家族歴を有するある４４歳の男性は、血清総コレステロール（ＴＣ）が６．６、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルが４．８、トリグリセリドレベルが１．８６と高い状態が続いていた。本人の体重は処置期間開始日に８１．８ｋｇで、ＢＭＩに換算すると２５．３であった。この開始時点から、対象は、実施例１８において生産された機能性食品製剤ＮＰ２の１日２回の経口投与を開始した。２５ｇのＲＡＰ４に相当する日間合計用量１００ｍｌのＮＰ２を毎日、８週間の処置期間全体にわたり投与した。ＲＡＰ４の日用量は、１３９８μｇのリベトリルＡ、合計６１４５μｇの各種リベトリルおよび合計３０００μｇの各種グルコインドールに相当した。食物摂取量、生活様式、運動または投薬は、８週間の処置期間にわたり全く変化がなかった。
結果
４週間の処置後、ＴＣが２３％低減して５．１となり、ＬＤＬが２７％低減して３．５となり、トリグリセリドが３２％低減して１．２６となった。さらに、体重も２．０ｋｇ低減して７９．８ｋｇとなり、ＢＭＩも低減して２４．７となった。
８週間の処置後、ＴＣが２６％低減して４．９となり、ＬＤＬが３５％低減して３．１となり、トリグリセリドレベルが３１％低減して１．２９となった。さらに、体重も２．７ｋｇ低減して７９．１ｋｇとなり、ＢＭＩは２４．４となった。
結論
結論として、本発明のリベスアルカロイド抽出物を含む食品製剤の形態での栄養物の経口投与は、対象の血中脂質プロファイルを正常化し、正常なＢＭＩの達成に役立った。
［実施例２０］
この実施例は、本発明による栄養物の調製に関する（以下、ＮＰ３という）。
目的
リベス・ルブルムから誘導された本発明のリベスアルカロイド濃縮物をリベス・ニグルムから誘導された本発明のリベスアルカロイド濃縮物と組み合わせたものを含む、経口投与用栄養物組成物の調製。
試験化合物および化学物質
ＮＰ３は以下の成分で構成される（重量％による割合）
・ＲＡＰ１６（実施例１において調製）：４０．００％
・ＲＡＰ１７（実施例１において調製）：４０．００％
・精製水：１６．５０５％
・硫酸マグネシウム７水和物：２．０２７％
・水酸化カリウム：１．３００％
・ソルビン酸カリウム：０．１００％
・スクラロース：０．０６８％
実験手順
ＮＰ３を逐次、加熱せず混合する。得られる生産物は安定し、注入しやすく、投与に便利である。
日用量２５ｍｌは３０ｇのＮＰ３に相当し、これを１日１回摂取するが、水で１：４の割合で希釈すると美味しく飲める漿果飲料となる。
日用量は、６５μｇのリベトリルＡ、合計３３６μｇの各種リベトリルおよび合計７０８μｇの各種グルコインドールに相当する。
［実施例２１］
目的
この実施例は、実施例２０において生産されたＮＰ３の形態での増量した本発明のリベスアルカロイドを含む本発明の栄養物を毎日経口摂取することによる、関節の健康との関連で、あるヒト対象において得られた健康上の便益に関する。
対象
ある４７歳（体重７６ｋｇ）の全般的に健康状態が良く、病態もない男性が、Ｘ線写真に基づく手外科医による診断の前、２年超にわたり、左手の第１手根中手関節に骨関節炎を患い、痛み、腫れ、凝りおよび関節機能障害の症状が増大していた。診断後、本人は１年間にわたり３か月おきに副腎皮質ステロイドの関節内注射を繰り返し受けたが、副腎皮質ステロイド注射は一時的に症状を緩和するばかりで、最も軽微な親指の使用すら激痛を引き起こし、その結果、手作業を要する多くの作業が極めて苦痛となった。症状は最終的に非常に重度で消耗性となったため、本人は関節機能を回復させ痛みを解消するための手術を勧められた。手術前の待機期間中、対象は本発明の栄養物を毎日経口摂取した。日用量２５ｍｌ（３０ｇ）のＮＰ３を１日１回、使用した。
手順
対象は、実施例２０において生産された本発明の栄養物ＮＰ３を３０ｇずつ１日１回、経口投与し始めた。毎日の摂取は２０週にわたり続いた。食物摂取量、生活様式、運動または投薬は処置期間中、全く変化がなかった。
結果
最初の６週間の処置の間に、対象は第１手根中手関節の痛みおよび断続的な腫れの漸進的減少を経験し、この時点で対象は痛みが６０％低減したと推定した。１２週間の処置後、罹患関節の痛みおよび腫れを含むすべての症状が完全になくなり、対象は、手根中手関節の痛みまたは他の症状を全く生じることなく、あらゆる種類の日常活動および手作業において親指を制限なく使えるようになった（痛みは１００％低減されたと推定される）。続く８週間の処置にわたり、改善は安定した状態を維持したため、関節手術は取り止めとなった。対象は、大好きなギター演奏を含め、左手を使用する手作業をすべて再開できるようになった。
結論
結論として、本発明のリベスアルカロイドを含む経口投与された栄養物は、対象の第１手根中手関節の骨関節炎の重度の症状を完全に解消し、関節機能を回復させ痛みを解消した結果、計画されていた関節手術を不要にした。これは、体内における過剰な炎症過程に起因する健康上の欠点に対する本発明の栄養物の改善効果を、説得力のある形で実証するものである。また、骨関節炎の主要な要因である軟骨の健康に対する有益な効果も意味する。
［実施例２２］
目的
この実施例は、実施例２０において生産された栄養物の形態での増量した本発明のリベスアルカロイドを含む本発明の栄養物、ＮＰ３を毎日経口摂取することによる、関節の健康との関連で、あるヒト対象において得られた健康上の便益に関する。
対象
ある４３歳の女性が、右足で４年間、左足で３年間にわたり第１中足指節関節における、痛みの増大および関節可動性減少に苦しんでいた。本人は整形外科医による評価およびＸ線写真による評価通り、骨関節炎と診断されており、それが原因で、凝りおよび関節痛が日を追う毎に増大し、処置開始の前年は際立って悪化していた。本人は手術を勧められたが、痛みから解放される保証はなかった。痛みおよび関節可動性減少の症状は対象にとって、ハイヒールを履くなど足親指にストレスもしくは圧力の掛かる活動の間、特にそのような活動の後、またはランニングなどフィットネス活動を行った場合、特に厄介であった。本人は将来の自分の可動性を心配した。
手順
対象は、実施例２０において生産された本発明の栄養物ＮＰ３を３０ｇずつ１日１回、経口投与し始めた。毎日の摂取は４週にわたり続いた。食物摂取量、生活様式、運動または投薬は処置期間中、全く変化がなかった。
結果
２週間の処置後、、両足の第１中足指節関節の痛みが対象の推定によると８０％低減され、関節可動性はほぼ正常に戻った。対象はハイヒールを履いて痛みを伴わずに歩けるようになり、さらにはランニングなどフィットネス活動も痛みを伴わずに行えるようになり、その後悪化することはなかった。骨関節炎の症状のこの顕著な改善は、続く２週間の処置にわたり安定した状態を維持したが、これは処置の効果がしっかり持続したことを意味する。対象は過去４年間、状態の改善を経験したことがなく、逆に悪化する一方であった。そのため本人はこれほど顕著な症状の低減を経験したことで、大いに安心した。本人は最初の４週間の結果の後も処置を続けることにした。
結論
結論として、本発明のリベスアルカロイド画分を含む経口投与された栄養物は、対象の足親指の中足指節関節における骨関節炎の症状を、本人がほぼ正常な関節可動性を取り戻し、また処置前の痛みや症状悪化の原因であったと思われる活動の際に著しい痛みや凝りに苦しむことがなくなったほど、改善した。この実施例は明らかに、本発明のリベスアルカロイド画分を含む栄養物の、骨関節炎に対する抗炎症活性を明確に示すものである。
［実施例２３］
目的
この実施例は、実施例２０において生産された食品の形態での増量した本発明のリベスアルカロイドを含む本発明の栄養物、ＮＰ３を毎日経口摂取することによる、あるヒト対象において得られた健康上の便益に関する。対象は、身体的に要求の厳しい運動との関連で、加齢に伴う全身疲労に苦しんでいた。
対象
ある８１歳（体重７２ｋｇ）の全般的に良好な健康状態の男性が、長年にわたり、週２回２時間ずつ、予定を組んでテニスの練習に励んでいた（同じテニスパートナーとのダブルスの練習）。本人はこの定期練習日程を維持してきたが、ここ数年、徐々に練習中のエネルギー減退や練習後の疲労増加を経験しており、本人は加齢が原因と考えていた。そうすると、本人は先々必ず、ダブルスの練習を計画通り２時間行った後、疲れ果ててそれ以上練習を続けられなくなる。
手順
対象は、実施例２０において生産された本発明の栄養物ＮＰ３を３０ｇずつ１日１回、経口投与し始めた。毎日の摂取は４週にわたり続いた。食物摂取量、生活様式、運動または投薬は処置期間中、全く変化がなかった。
結果
２週間の処置後、対象は処置開始前に比べ、ダブルスを２時間行った後の疲労が目覚ましく減少した。本人は、ダブルスの練習を終える前にもう１時間続行できるようになったほど、エネルギーおよび体力の充実を感じた。さらに、本人は以前はダブルスを２時間練習しただけで感じていた疲労感を、練習時間がこのように長くなった後も感じなくなった。この疲労減少のパターン、および以前の習慣より長いテニスの練習時間に耐える持久力は、続く２週間の処置にわたり繰り返され、対象は同じレベルの疲労および身体的消耗に達する前に、処置前より約５０％長い時間、テニスを続けられるようになった。
結論
結論として、本発明のリベスアルカロイド画分を含む経口投与された栄養物は、対象の全身疲労を減少させ、また長時間の身体能力に関連する消耗レベルを低下させた。疲労は、加齢に伴い全般的に低下した持久力閾値、そして筋力および筋機能の減退が原因とされた。本発明のリベスアルカロイド画分を含む栄養物による２週間の処置後、エネルギー低減および疲労増大という、加齢に伴う症状は目覚ましく減少し、また対象が標準的な条件下で消耗する前に身体活動を行うことができる期間もかなり伸びた。
［実施例２４］
目的
この実施例は、実施例２０において生産された食品の形態での増量した本発明のリベスアルカロイドを含む本発明の栄養物、ＮＰ３を毎日経口摂取することによる、身体能力および持久力に関して、ある健康な若手運動選手において得られた健康上の便益に関する。
対象
ある１６歳（体重７８ｋｇ）の男性は、水泳と陸上トレーニングから成る週５回のトレーニング計画を着実に積んできた健康な対象であった。水泳トレーニングは、毎週のトレーニングにおいて最速パスおよび持久力パスを両方取り入れた、全４科目の混成であった。陸上トレーニングはいくつかの激しい練習から成り、主に体幹および上半身の強化に焦点を当てていた。対象が達成したフィットネスおよび持久力のレベルは十分に確立され、安定し、対象のトレーニング体制の一環として定期的に定量化された。
手順
処置開始前夜、水泳試験を実施した。この試験は、各パス間に１５秒間の休止を取って、３回のパスをそれぞれ自由形で如何に速く泳げるかに焦点を当てた最速試験として実施した。３つのパスは以下の通りであった。
１回目のパス：１００ｍ
２回目のパス：５０ｍ
３回目のパス：５０ｍ
試験後、対象は、実施例２０において生産された本発明の栄養物ＮＰ３を３０ｇずつ１日１回、経口投与し始めた。毎日の摂取は１４日間続いた。食物摂取量、生活様式、運動または投薬は処置期間中、全く変化がなかった。
７日間の処置後、対象は処置開始前に行った試験と同一の水泳試験をもう１回実施した。
さらに１４日間の処置後、対象のトレーニング体制を全く変えずに、３回目の水泳試験を実施した。
結果
合計２００ｍの自由形水泳試験の総体的なタイムは、処置前の１４３．１４秒から、処置後には１３３．３３秒に縮まった。これは９．２１秒の改善であり、６．４％の改善に相当する。タイムの改善は試験の最後２回のパスだけで得られたもので、すなわち２回目の試験の最後２回のパスでの改善が合計１２．１％であった。
さらに１４日後、合計２００ｍの自由形水泳試験の総体的なタイムは、２回目の水泳試験と同等であった（１３４．６２秒）。やはり、総体的なタイムの改善は水泳試験の最後２回のパスでの改善に帰せられた。この若い男性は、試験中に「力の余裕」を感じたと評し、結果を提示されると大いに感心した。
結果は下表に提示されている。
Figure 2016525103
結論
増量したリベスアルカロイド画分を含む本発明の栄養物を、若く壮健な、自身のトレーニングパスにおいて安定したタイムを維持してきたある男性水泳選手へ７日間経口投与した後、水泳試験の総体的なタイムの６．４％もの顕著な改善が達成され、水泳試験の後半での改善が１２．１％と目覚ましかったことから、対象の持久力の増加が実証された。これは、別段には長期間にわたる極めて集中的なトレーニング体制を通じてしか達成し得ない、例外的改善であった。３回目の水泳試験からの結果によって実証された通り、結果は非常に強固で、対象が新たな、より高いレベルの持久力および能力に到達したことを示し、また増量したリベスアルカロイド画分を含む本発明の栄養物の身体能力および持久力の増進効果を実証する結果であった。
［実施例２５］
目的
この実施例は、実施例２０において生産された食品の形態での増量した本発明のリベスアルカロイドを含む本発明の栄養物、ＮＰ３を毎日経口摂取することによる、コンコーニテストに基づくＶＯ２Ｍａｘのレベルによって示される、ある若手運動選手において得られた健康上の便益に関する。
対象
ある２８歳（体重７３ｋｇ）の男性は、長距離走とマウンテンバイク競技から成る週５回のトレーニング計画を着実に積んできた、トライアスロン分野においてフィットネスレベルをよく知られた、身体トレーニングを十分に積んだ対象であった。対象が達成したフィットネスおよび持久力のレベルは十分に知られ、安定し、対象のトレーニング体制の一環として、コンコーニテストによって定期的に定量化された。試験は対象にとって周知であった。
手順
処置開始前の朝、コンコーニテストを実施した。コンコーニテストは主に持久スポーツにおいて、無酸素閾値の判定およびＶＯ２Ｍａｘの計算に使用される。コンコーニテストは、対象の心拍数を測定しながら、対象に与える作業負荷を徐々に増やしてゆくテストである。今回の場合、対象はトレッドミル上を走り、対象が速度を維持できなくなるまで２００メートル毎に速度を０．５ｋｍ／時ずつ上げていった。心拍数を監視し、５秒毎に記録した。次いで速度と心拍数の対比をグラフ化し、それを基に対象のＶＯ２Ｍａｘを計算することができた。ＶＯ２Ｍａｘが増えると、運動選手はより激しい訓練に、より長期間にわたり耐えられるようになる。
試験後、対象は、実施例２０において生産された本発明の栄養物ＮＰ３を３０ｇずつ１日１回、経口投与し始めた。毎日の摂取は７日間続いた。訓練体制、食物摂取量、生活様式、または投薬は処置期間中、全く変化がなかった。
７日間の処置後、対象は処置開始前に行ったテストと同一のコンコーニテストをもう１回実施した。
結果
本発明の栄養物の経口投与開始前に実施したコンコーニテストの測定値を基に、ＶＯ２Ｍａｘは５５．２７ｍｌ／ｋｇ／分と算出された。本発明の栄養物の７日間の経口投与後、コンコーニテストの測定値を基に、ＶＯ２Ｍａｘは５９．５６ｍｌ／ｋｇ／分と算出された。ＶＯ２Ｍａｘの差は４．２７ｍｌ／ｋｇ／分、７．８％の改善であった。
対象は最後のテスト中、自身の極限（速度）に達するまで走ったにもかかわらず、エネルギーの余裕を感じたと評した。
結果は下表に提示されている。
Figure 2016525103
結論
本発明の栄養物を、若く壮健な、自身のトレーニングパスにおいて安定したタイムを維持してきたある男性長距離走選手へわずか７日間にわたり経口投与した後、対象のトレーニング体制は処置期間中全く変わることなく、ＶＯ２Ｍａｘの計算値の７．８％の改善が達成された。これは、対象の高レベルのフィットネスおよびそれ故の処置前の非常に高いＶＯ２Ｍａｘを考慮しても、通常は際立った改善の達成には長期間にわたる苛酷なインターバルトレーニングが必要となる、例外的改善であった。
［実施例２６］
目的
この実施例は、実施例２０において生産された食品の形態での増量した本発明のリベスアルカロイドを含む本発明の栄養物、ＮＰ３を毎日経口摂取した後の身体持久力および乳酸閾値に関して、ある男性運動選手において得られた健康上の便益に関する。
対象
ある４８歳（体重８０ｋｇ）の男性は、平均週５回（週当たり５時間の自転車競技）のトレーニング計画を着実に積んできた健康な対象であった。長距離高速トレーニングパスの間に対象が達成したフィットネス、持久力および平均心拍数のレベルは、長年にわたるトレーニングやレースを通じて、よく知られていた。つまり、長距離トレーニングパス中の最大心拍数は、決して１７５ｂｐｍを超えることはなかった（すなわち無酸素閾値が１７５ｂｐｍ）。
手順
対象は、実施例２０において生産された本発明の栄養物ＮＰ３を３０ｇずつ１日１回、経口投与し始めた。毎日の摂取は７日間続いた。訓練体制、食物摂取量、生活様式または投薬は処置期間中、全く変化がなかった。
結果
４日間の処置後、対象はフランス南部の山岳地帯で開催されたロードレースの際、試験を受けた。対象はＧＰＳ装置を使用して心拍数、タイムおよび速度を測定した。長い上り坂およびそれに続くハイペースの速度リッジの間、驚くことに、それまで知られていた無酸素閾値より５．７％高い、１８５ｂｐｍ前後の安定した心拍数が約２０分間観察され、これは以前の達成値より無酸素閾値が大幅に高くなったことを意味する。
結論
長距離の非常に激しいトレーニング中の平均心拍数は、無酸素閾値および持久力を示す１つの指標である。この実施例では、本発明の栄養物を毎日経口投与するようになってからわずか４日後、ある４８歳の、身体トレーニングを十分に積み、長距離の激しいサイクルトレーニング中の無酸素閾値心拍数が１７５ｂｐｍで定着していた男性が、長距離の激しいトレーニングパスの間に２０分間にわたり平均心拍数が５．７％向上して１８５ｂｐｍとなり、これは本発明のリベスアルカロイドによって発揮される、迅速な作用の発現ならびに持久力および乳酸閾値の向上を意味する。
［実施例２７］
目的
この実施例は、実施例１９において生産された食品の形態での増量したリベスアルカロイドを含む本発明の栄養物を毎日経口摂取することによる、あるヒト対象において得られた健康上の便益に関する。対象は、重度の脳外傷後のリハビリ期間中、しつこい身体疲労および精神疲労に苦しんでいた。
対象
ある７５歳（体重５７ｋｇ）の、病状もなく全般的に良好な健康状態および体格の持ち主であった女性が、３か月前に（転落事故のため）外傷性頭蓋内出血を生じて昏睡に陥り、脳組織に対する圧力を軽減するため緊急出血除去手術を余儀なくされ、その後の復帰段階にあった。頭蓋内硬膜外血腫は、最も重篤な頭部負傷合併症とされている。事故後、出血および震盪が脳組織に与えた影響により、本人は最も早い段階で表現性失語症に見舞われ、身体虚弱を感じ、精神的にも身体的にも消耗しやすく、睡眠の必要性が著しく増えた。本人は続く数か月間、徐々に、着実に回復したが、激しい疲労に苦しみ、事故前に比べ朝の起床が１時間半遅くなったうえ、就寝が２時間早くなった。合計すると必要な睡眠が事故前より３時間半長くなった。本人は通常の日課の散歩に出掛けるエネルギーもなかった。日課の身体リハビリプログラムに励んだ結果、身体能力は改善したものの、激しい疲労は依然として最大の課題であった。
手順
対象は、実施例１９において生産された本発明の栄養物ＮＰ３を３０ｇずつ１日１回、経口投与し始めた。毎日の摂取は４週にわたり続いた。食物摂取量、生活様式、運動または投薬は処置期間中、全く変化がなかった。
結果
１週間の処置後、対象は全身の身体エネルギーおよび精神エネルギーの顕著な増加を経験した。本人はそれから事故前のように（１時間半早く）７時に起床できるようになり、さらには事故前に常々行っていた家事も疲れることなくこなせるようになった。本人は、本発明の栄養物を毎日摂取し始める前に比べ、昼間はエネルギーの余裕を感じながら過ごし、１時間遅い２２時に就寝できるようになり、これは外傷に起因する追加的な睡眠の必要性が７１％低減したことに相当する。
２週間の処置後、対象はエネルギーの余裕を一層感じ、追加的な睡眠の必要性は１００％低減され、そしてエネルギーを取り戻したおかげで再び日課の散歩に出掛けられるようになった。プラスの精神的消耗および身体的消耗の閾値が説得力のある形で改善されるまで、本人の訓練計画は変更されず、他の身体的状況または精神的状況にも変化はなく、また本人が事故前の身体状態および精神状態に近く戻れそうだと感じたほど、かなりの改善であった。この改善はその後の処置期間もずっと安定していた。
結論
結論として、リハビリ期間中に絶え間なく続いていた身体疲労および精神疲労が、本発明のリベスアルカロイドを含む栄養物の摂取するようになって１週間以内に激減した。これは、中枢神経系機能の改善および正常化への多大な貢献を意味し、これは対象が驚異的な速度で、毎日の日課および活動を従前の能力に匹敵するレベルで再開できるようになったことから、非常に有意であった。
Figure 2016525103
［実施例８］
目的
この研究の目的は、ミトコンドリアストレスに曝されたマウスのＣ２Ｃ１２筋管における予備呼吸容量に対する、本発明のリベスアルカロイド画分、ＲＡＰ１５の効果の評価であった。

Claims (88)

  1. 式（Ｉ）：
    Figure 2016525103
     のアルカロイド化合物。
  2. 化合物が、（Ｅ）−（Ｅ）−２−シアノ−４−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）ブタ−２−エン−１−イル３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）アクリレート（「リベトリルＡ」）である、請求項１に記載のアルカロイド化合物。
  3. リベス（Ｒｉｂｅｓ）から取得可能なアルカロイド画分であって、前記画分が式（Ｉ）の化合物および請求項２の化合物および
    式（ＩＩ）：
    Figure 2016525103
     （式中、Ｒは、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸、（Ｅ）−３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）アクリル酸および（Ｅ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）のアクリル酸から成る群から選択される酸から誘導されるアシルオキシ部分である）の化合物および
    式（ＩＩＩ）：
    Figure 2016525103
     （式中、Ｒは、ＯＨまたはＯＣＨ３である）の化合物の中から選択され、リベスに比べ増加した質量分率の少なくとも１つの化合物を含む、アルカロイド画分。
  4. 前記少なくとも１つの式（ＩＩ）の化合物が：
    （Ｅ）−（Ｅ）−２−シアノ−４−（β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）ブタ−２−エン−１−イル３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）アクリレート（「リベトリルＢ」）；
    （Ｅ）−（Ｅ）−２−シアノ−４−（β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）ブタ−２−エン−１−イル３−（４−ヒドロキシフェニル）アクリレート（「リベトリルＣ」）；
    （Ｅ）−２−シアノ−４−（β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）ブタ−２−エン−１−イル４−ヒドロキシ−３−メトキシベンゾエート（「リベトリルＤ」）；
    （Ｅ）−２−シアノ−４−（β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）ブタ−２−エン−１−イル４−ヒドロキシベンゾエート（「リベトリルＥ」）から成る群から選択される、請求項３に記載のアルカロイド画分。
  5. 前記少なくとも１つの式（ＩＩＩ）の化合物が：
    １−β−Ｄ−グルコピラノシル−１Ｈ−インドール−３−酢酸（「グルコインドールＡ」）；および
    １−β−Ｄ−グルコピラノシル−１Ｈ−インドール−３−酢酸メチルエステル（「グルコインドールＢ」）から成る群から選択される、請求項３に記載のアルカロイド画分。
  6. 前記少なくとも１つの化合物が、式（Ｉ）および式（ＩＩ）の化合物の中から選択される、請求項３に記載のアルカロイド画分。
  7. 式（Ｉ）の化合物の合計量と式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）の化合物の合計量の重量比が、１：１００から１００：１の範囲、より好ましくは１：２０から２０：１の範囲、より好ましくは１：１０から１０：１の範囲、最も好ましくは１：５から５：１の範囲である、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）の化合物を含む、請求項３から６のいずれか一項に記載のアルカロイド画分。
  8. 式（Ｉ）の化合物の質量分率が、前記画分の合計量の５０％から９９％を占める、請求項３から７のいずれか一項に記載のアルカロイド画分。
  9. 式（ＩＩ）の化合物の質量分率が、前記画分の合計量の５０％から９９％を占める、請求項３から８のいずれか一項に記載のアルカロイド画分。
  10. リベスに比べ増加した質量分率の、請求項３から９のいずれか一項に記載のアルカロイドまたはアルカロイド画分を含む、リベスの抽出物、汁または濃縮物。
  11. リベスが、リベス・ルブルム（Ｒｉｂｅｓ Ｒｕｂｒｕｍ）またはリベス・ニグルム（Ｒｉｂｅｓ ｎｉｇｒｕｍ）の中から選択される、請求項１０に記載の抽出物、汁または濃縮物。
  12. ｉ）ケルセチン、ミリセチン、ケンペロールおよびこれらのグルコシドから成る群から選択される少なくとも１つのフラボノール；ならびに／または
    ｉｉ）ｐ−ヒドロキシ安息香酸、バニリン酸、カフェイン酸、ｐ−クマル酸、フェルラ酸およびこれらのグルコシドから成る群から選択される少なくとも１つのフェノール酸；ならびに／または
    ｉｉｉ）エピカテキン、エピガロカテキンおよびこれらのオリゴマーから成る群から選択される少なくとも１つのプロアントシアニジン；ならびに／または
    ｉｉｉｉ）シアニジン、デルフィニジンおよび／もしくはこれらのグルコシドから成る群から選択される少なくとも１つのアントシアニジン
    をさらに含む、請求項１０または１１に記載のリベスの抽出物、汁または濃縮物。
  13. 前記リベスの抽出物、汁または濃縮物におけるリベトリルＡの質量分率が、０．０００１％〜１００％、０．０００２５％〜９０％、０．０００５％〜８０％、０．０００２５％〜７０％、０．０００５％〜６０％、０．０００７５％〜５０％、０．００１％〜４５％、０．００２５％〜４０％、０．００５％〜３５％、０．００７５％〜３０％、０．０１％〜２５％、０．０２５％〜２０％、０．０５％〜１９％、０．０７５％〜１８％、０．１％〜１７％、０．２５％〜１６％、０．５％〜１５％、０．７５％〜１４％、１％〜１３％、１．５％〜１２％、２．０％〜１１％、３．０％〜１０％、４．０％〜９．０％、５．０％〜８．０％および６．０％〜７．０％の中から選択される、請求項１０から１２のいずれかに記載のリベスの抽出物、汁または濃縮物。
  14. 前記リベスの抽出物、汁または濃縮物におけるリベトリルＡ、リベトリルＢ、リベトリルＣ、リベトリルＤおよび／またはリベトリルＥの合計質量分率が、０．０００２％〜１００％、０．０００５％〜９０％、０．０００８％〜８０％、０．００１％〜７０％、０．００２５％〜６０％、０．００５％〜５０％、０．００７５％〜４５％、０．０１％〜４０％、０．０２５％〜３５％、０．０５％〜３０％、０．０７５％〜２５％、０．１％〜２０％、０．２５％〜１９％、０．５％〜１８％、０．７５％〜１７％、１．０％〜１６％、１．５％〜１５％、２．０％〜１４％、２．５％〜１３％、３．０％〜１２％、４．０％〜１１％、５．０％〜１０％、６．０％〜９．０％および７．０％〜８．０％の中から選択される、請求項１０から１２のいずれかに記載のリベスの抽出物、汁または濃縮物。
  15. 前記リベスの抽出物、汁または濃縮物におけるグルコインドールＡおよび／またはグルコインドールＢの合計質量分率が、０．０００８％〜１００％、０．００１％〜９０％、０．００２５％〜８０％、０．００５％〜７０％、０．００７５％〜６０％、０．０１％〜５０％、０．０２５％〜４５％、０．０５％〜４０％、０．０７５％〜３５％、０．１％〜３０％、０．２５％〜２５％、０．５％〜２０％、０．７５％〜１９％、１．０％〜１８％、１．５％〜１７％、２．０％〜１６％、２．５％〜１５％、３．０％〜１４％、３．５％〜１３％、４．０％〜１２％、４．５％〜１１％、５．０％〜１０％、６．０％〜９．０％および７．０％〜８．０％の中から選択される、請求項１０から１２のいずれかに記載のリベスの抽出物、汁または濃縮物。
  16. 前記栄養物が、食品もしくは非食品の提供および請求項１から９のいずれかに記載の少なくとも１つのアルカロイドもしくはアルカロイド画分の追加または増量によって取得可能な栄養物。
  17. 前記アルカロイドの自然発生量に比べ増量した前記少なくとも１つのアルカロイドまたはアルカロイド画分を含む、請求項１６に記載の栄養物。
  18. 前記栄養物におけるリベトリルＡの質量分率が、０．０００１％〜１００％、０．０００２５％〜９０％、０．０００５％〜８０％、０．０００２５％〜７０％、０．０００５％〜６０％、０．０００７５％〜５０％、０．００１％〜４５％、０．００２５％〜４０％、０．００５％〜３５％、０．００７５％〜３０％、０．０１％〜２５％、０．０２５％〜２０％、０．０５％〜１９％、０．０７５％〜１８％、０．１％〜１７％、０．２５％〜１６％、０．５％〜１５％、０．７５％〜１４％、１％〜１３％、１．５％〜１２％、２．０％〜１１％、３．０％〜１０％、４．０％〜９．０％、５．０％〜８．０％および６．０％〜７．０％の中から選択される、請求項１６または１７に記載の栄養物。
  19. 前記栄養物におけるリベトリルＡ、リベトリルＢ、リベトリルＣ、リベトリルＤおよび／またはリベトリルＥの合計質量分率が、０．０００２％〜１００％、０．０００５％〜９０％、０．０００８％〜８０％、０．００１％〜７０％、０．００２５％〜６０％、０．００５％〜５０％、０．００７５％〜４５％、０．０１％〜４０％、０．０２５％〜３５％、０．０５％〜３０％、０．０７５％〜２５％、０．１％〜２０％、０．２５％〜１９％、０．５％〜１８％、０．７５％〜１７％、１．０％〜１６％、１．５％〜１５％、２．０％〜１４％、２．５％〜１３％、３．０％〜１２％、４．０％〜１１％、５．０％〜１０％、６．０％〜９．０％および７．０％〜８．０％の中から選択される、請求項１６または１７に記載の栄養物。
  20. 前記栄養物におけるグルコインドールＡおよび／またはグルコインドールＢの合計質量分率が、０．０００８％〜１００％、０．００１％〜９０％、０．００２５％〜８０％、０．００５％〜７０％、０．００７５％〜６０％、０．０１％〜５０％、０．０２５％〜４５％、０．０５％〜４０％、０．０７５％〜３５％、０．１％〜３０％、０．２５％〜２５％、０．５％〜２０％、０．７５％〜１９％、１．０％〜１８％、１．５％〜１７％、２．０％〜１６％、２．５％〜１５％、３．０％〜１４％、３．５％〜１３％、４．０％〜１２％、４．５％〜１１％、５．０％〜１０％、６．０％〜９．０％および７．０％〜８．０％の中から選択される、請求項１６または１７に記載の栄養物。
  21. 請求項１から９のいずれかに記載のアルカロイドまたはアルカロイド画分を、単回用量を０．０１〜５０００ｍｇ、０．０５〜４０００ｍｇ、０．１〜３０００ｍｇ、０．２５〜２０００ｍｇ、０．５〜１７５０ｍｇ、０．７５〜１５００ｍｇ、１〜１２５０ｍｇ、１．５〜１０００ｍｇ、２〜９００ｍｇ、２．５〜８００ｍｇ、３〜７００ｍｇ、４〜６００ｍｇ、５〜５００ｍｇ、７．５〜４００ｍｇ、１０〜３５０ｍｇ、１５〜３００ｍｇ、２０〜２５０ｍｇ、３０〜２００ｍｇ、４０〜１５０ｍｇ、５０〜１２５ｍｇおよび７５〜１００ｍｇの中から選択して提供可能な、請求項１６から１８のいずれかに記載の栄養物。
  22. 前記少なくとも１つのアルカロイドまたはアルカロイド画分が、栄養物そのものとして、場合によって保存剤など１つ以上の追加構成要素または追加成分を添加して使用される、請求項１６から２１のいずれかに記載の栄養物。
  23. 前記栄養物の生理学的便益または医学的便益に関する情報を提供する表示を施されている、請求項１６から２２のいずれかに記載の栄養物。
  24. 筋機能、運動能力、ミトコンドリア機能、神経細胞機能、精神機能、皮膚機能、代謝機能、心血管機能、関節機能の補助、正常化もしくは改善のための、または少なくとも１つの生理学的老化徴候減少のための、請求項１６から２３のいずれかに記載の栄養物。
  25. 請求項１０から１３のいずれかに記載のリベスの抽出物、汁または濃縮物を含む、請求項１６から２４のいずれかに記載の栄養物。
  26. リベス・ルブルムとリベス・ニグルムの間の重量比が、１：２０〜２０：１、１：１５〜１５：１、１：１０〜１０：１、１：９〜９：１、１：８〜８：１、１：６〜６：１、１：５〜５：１、１：４〜４：１、１：３〜３：１、１：２〜２：１および１：１の中から選択される、リベス・ルブルムの抽出物、汁または濃縮物およびリベス・ニグルムの抽出物、汁または濃縮物を含む、請求項２５に記載の栄養物。
  27. 少なくとも１つの追加活性化合物をさらに含み、前記活性化合物が好ましくはアルファリノレン酸、ベータグルカン、キトサン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ペクチン、グルコマンナン、グアーガム、リノール酸、紅色酵母米、植物ステロールおよび植物スタノール、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、ビオチン、葉酸、マグネシウム、ナイアシン、チアミン、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ヨウ素、鉄、亜鉛、炭水化物、銅、カリウム、カルシウム、マンガン、ビタミンＤ、タンパク質、アミノ酸、クロム、パントテン酸、リンヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルファシクロデキストリン、小麦胚乳から生産されたアラビノキシラン、水、バリン、リシン、トレオニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、システイン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、セリン、システイン、チロシン、アスパラギン酸、プロリン、ヒドロキシプロリン、シトルリン、アルギニン、オルニチン、ヒドロキシグルタミン酸、グルタミン、グルタミン酸から成る群から選択される、請求項１６から２６のいずれかに記載の栄養物。
  28. 全般的健康状態を補助するための、請求項１６から２７のいずれかに記載の栄養物。
  29. ミトコンドリアの生理学における少なくとも一様態を補助または改善するための、前記様態がミトコンドリア機能、ミトコンドリア生物発生およびミトコンドリア予備呼吸容量から成る群から選択される、請求項１６から２７のいずれかに記載の栄養物。
  30. 皮膚生理学における少なくとも一様態を調節するための、前記様態が好ましくは皮膚完全性の補助、皮膚機能および皮膚構造の正常化または改善、正常な皮膚の維持への貢献、正常な結合組織形成の維持への貢献ならびに正常な粘膜の維持への貢献の中から選択される、請求項１６から２７のいずれかに記載の栄養物。
  31. 老化の生理学における少なくとも一様態を調節するための、前記様態が好ましくは健康的老化の補助、加齢に伴う筋肉量喪失の低減、加齢に伴う筋力喪失の低減、加齢に伴う心筋機能喪失の低減、加齢に伴う皮膚構造劣化の低減、加齢に伴う皮膚再生喪失の低減、加齢に伴う骨形成劣化の低減、加齢に伴う内分泌機能喪失の低減、加齢に伴う神経細胞機能喪失の低減、加齢に伴うミトコンドリア機能劣化の低減、加齢に伴うミトコンドリア生物発生劣化の低減、加齢に伴うミトコンドリア予備呼吸容量劣化の低減、加齢に伴う視覚機能喪失の低減、加齢に伴う記憶機能喪失の低減、加齢に伴う精神機能喪失の低減、加齢に伴う身体持久力喪失の低減、加齢に伴う筋機能低下の低減、高齢者における筋機能補助および高齢者における筋持久力改善の中から選択される、請求項１６から２７のいずれかに記載の栄養物。
  32. 筋肉の生理学における少なくとも一様態を調節するための、前記様態が好ましくは運動しないことによる筋機能低下の拮抗、不活動によって減少した筋機能の改善、不活動によって減少した筋機能の補助、正常な筋機能への貢献、正常な筋機能の維持への貢献、筋肉量成長への貢献、筋肉量維持への貢献および正常な心機能への貢献の中から選択される、請求項１６から２７のいずれかに記載の栄養物。
  33. 持久力およびスポーツ生理学における少なくとも一様態を調節するための、前記様態が好ましくは運動能力の改善、スポーツ競技中の筋機能の補助、持久運動中の筋機能の補助、スポーツ競技中の持久力の改善、長時間の持久力訓練中の持久力維持への貢献、短時間の激しい訓練の連続的突発における身体能力の増強、運動選手における無酸素閾値の改善、運動選手におけるＶＯ２ｍａｘの改善、ミトコンドリア予備呼吸容量の改善、正常なミトコンドリア機能の補助、ミトコンドリアの強化、ミトコンドリア生物発生の改善、疲労感および疲労の拮抗、疲労感および疲労の低減への貢献、ならびに正常なエネルギー産生代謝への貢献の中から選択される、請求項１６から２７のいずれかに記載の栄養物。
  34. 関節生理学における少なくとも一様態を調節するための、前記様態が好ましくは軟骨機能および関節機能の補助ならびに関節の柔軟性の補助の中から選択される、請求項１６から２７のいずれかに記載の栄養物。
  35. 認知機能および精神機能における少なくとも一様態を調節するための、前記様態が好ましくは喪心状態の改善、精神機能の補助、健常な精神機能の補助、健忘症の拮抗、記憶機能の改善、正常な心理機能への貢献、正常な脳機能維持への貢献、正常な認知機能への貢献、神経系の正常な機能状態への貢献および正常な神経伝達への貢献の中から選択される、請求項１６から２７のいずれかに記載の栄養物。
  36. 血中脂質の生理学における少なくとも一様態を調節するための、前記様態が好ましくは正常な血中コレステロールレベル維持への貢献、正常な血中トリグリセリドレベル維持への貢献、血中コレステロールの低下または低減、および血中トリグリセリドレベルの低下または低減の中から選択される、請求項１６から２７のいずれかに記載の栄養物。
  37. 血糖生理学における少なくとも一様態を調節するための、前記様態が好ましくは正常な血糖値維持への貢献の中から選択される、請求項１６から２７のいずれかに記載の栄養物。
  38. 創傷治癒を改善するための、請求項１６から２７のいずれかに記載の栄養物。
  39. 前記少なくとも１つのアルカロイドの医学的便益または生理学的便益に関する情報を含む、請求項１６から３８のいずれかに記載の栄養物を含む部分から成るキットおよび使用説明書。
  40. 筋機能、運動能力、ミトコンドリア機能、神経細胞機能、精神機能、皮膚機能、代謝機能、心血管機能、関節機能の補助、正常化もしくは改善のための、または少なくとも１つの生理学的老化徴候減少のための、請求項１６から３８のいずれかに記載の栄養物の非治療的使用。
  41. 式（Ｉ）、式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）の化合物を含む群の中から選択される、好ましくはリベトリルＡ、リベトリルＢ、リベトリルＣ、リベトリルＤ、リベトリルＥ、グルコインドールＡおよびグルコインドールＢから成る群から選択される、医薬として使用するためのアルカロイド。
  42. 式（Ｉ）、式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）の化合物を含む群の中から選択される、好ましくはリベトリルＡ、リベトリルＢ、リベトリルＣ、リベトリルＤ、リベトリルＥ、グルコインドールＡおよびグルコインドールＢから成る群から選択されるアルカロイドの、医薬を調製するための使用。
  43. 前記医薬の目的が、皮膚疾患、心血管疾患、脂質異常症障害、前糖尿病障害、２型糖尿病、メタボリック症候群、肥満、虚弱、サルコペニア、骨関節炎、炎症性疾患およびミトコンドリア機能不全を伴う疾患から成る群の中から選択される疾患の処置または予防である、請求項４２に記載の使用。
  44. 前記医薬の目的が、創傷の処置または予防である、請求項４２に記載の使用。
  45. 栄養物中で使用するための、または栄養物として使用するためのアルカロイドであって、前記アルカロイドが式（Ｉ）、式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）の化合物を含む群の中から選択され、好ましくはリベトリルＡ、リベトリルＢ、リベトリルＣ、リベトリルＤ、リベトリルＥ、グルコインドールＡおよびグルコインドールＢの中から選択される、アルカロイド。
  46. 式（Ｉ）、式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）の化合物を含む群の中から選択され、好ましくはリベトリルＡ、リベトリルＢ、リベトリルＣ、リベトリルＤ、リベトリルＥ、グルコインドールＡおよびグルコインドールＢから成る群から選択されるアルカロイドの、栄養物を調製するための使用。
  47. 筋機能、運動能力、ミトコンドリア機能、神経細胞機能、精神機能、皮膚機能、代謝機能、心血管機能、関節機能の補助、正常化もしくは改善のための栄養物のための、または少なくとも１つの生理学的老化徴候減少のための栄養物のための、請求項４６に記載の使用。
  48. 全般的健康状態を補助するための栄養物のための、請求項４６に記載の使用。
  49. ミトコンドリアの生理学における少なくとも一様態を補助または改善するための、前記様態が、ミトコンドリア機能、ミトコンドリア生物発生およびミトコンドリア予備呼吸容量から成る群から選択される栄養物のための、請求項４６に記載の使用。
  50. 皮膚生理学における少なくとも一様態を調節するための、前記様態が好ましくは皮膚完全性の補助、皮膚機能および皮膚構造の正常化または改善、正常な皮膚の維持への貢献、正常な結合組織形成の維持への貢献ならびに正常な粘膜の維持への貢献の中から選択される栄養物のための、請求項４６に記載の使用。
  51. 老化の生理学における少なくとも一様態を調節するための、前記様態が好ましくは健康的老化の補助、加齢に伴う筋肉量喪失の低減、加齢に伴う筋力喪失の低減、加齢に伴う心筋機能喪失の低減、加齢に伴う皮膚構造劣化の低減、加齢に伴う皮膚再生喪失の低減、加齢に伴う骨形成劣化の低減、加齢に伴う内分泌機能喪失の低減、加齢に伴う神経細胞機能喪失の低減、加齢に伴うミトコンドリア機能劣化の低減、加齢に伴うミトコンドリア生物発生劣化の低減、加齢に伴うミトコンドリア予備呼吸容量劣化の低減、加齢に伴う視覚機能喪失の低減、加齢に伴う記憶機能喪失の低減、加齢に伴う精神機能喪失の低減、加齢に伴う身体持久力喪失の低減、加齢に伴う筋機能低下の低減、高齢者における筋機能補助および高齢者における筋持久力改善の中から選択される栄養物のための、請求項４６に記載の使用。
  52. 筋肉の生理学における少なくとも一様態を調節するための、前記様態が好ましくは運動しないことによる筋機能低下の拮抗、不活動によって減少した筋機能の改善、不活動によって減少した筋機能の補助、正常な筋機能への貢献、正常な筋機能の維持への貢献、筋肉量成長への貢献、筋肉量維持への貢献および正常な心機能への貢献の中から選択される栄養物のための、請求項４６に記載の使用。
  53. 持久力およびスポーツ生理学における少なくとも一様態を調節するための、前記様態が好ましくは運動能力の改善、スポーツ競技中の筋機能の補助、持久運動中の筋機能の補助、スポーツ競技中の持久力の改善、長時間の持久力訓練中の持久力維持への貢献、短時間の激しい訓練の連続的突発における身体能力の増強、運動選手における無酸素閾値の改善、運動選手におけるＶＯ２ｍａｘの改善、ミトコンドリア予備呼吸容量の改善、正常なミトコンドリア機能の補助、ミトコンドリアの強化、ミトコンドリア生物発生の改善、疲労感および疲労の拮抗、疲労感および疲労の低減への貢献、ならびに正常なエネルギー産生代謝への貢献の中から選択される栄養物のための、請求項４６に記載の使用。
  54. 関節生理学における少なくとも一様態を調節するための、前記様態が好ましくは軟骨機能および関節機能の補助ならびに関節の柔軟性の補助の中から選択される栄養物のための、請求項４６に記載の使用。
  55. 認知機能および精神機能における少なくとも一様態を調節するための、前記様態が好ましくは喪心状態の改善、精神機能の補助、健常な精神機能の補助、健忘症の拮抗、記憶機能の改善、正常な心理機能への貢献、正常な脳機能維持への貢献、正常な認知機能への貢献、神経系の正常な機能状態への貢献および正常な神経伝達への貢献の中から選択される栄養物のための、請求項４６に記載の使用。
  56. 血中脂質の生理学における少なくとも一様態を調節するための、前記様態が好ましくは正常な血中コレステロールレベル維持への貢献、正常な血中トリグリセリドレベル維持への貢献、血中コレステロールの低下または低減、および血中トリグリセリドレベルの低下または低減の中から選択される栄養物のための、請求項４６に記載の使用。
  57. 血糖生理学における、正常な血糖値維持への貢献など、少なくとも一様態を調節するための栄養物のための、請求項４６に記載の使用。
  58. 創傷治癒を改善するための栄養物のための、請求項４６に記載の使用。
  59. ｉ）請求項１から９のいずれか一項に記載のアルカロイドまたはアルカロイド画分；および
    ｉｉ）適切なビヒクル
    を含む組成物。
  60. 組成物が医薬、医療機器または栄養物である、請求項５９に記載の組成物。
  61. 医薬として使用するための、請求項１から９のいずれか一項に記載のアルカロイドまたはアルカロイド画分を含む組成物。
  62. 皮膚疾患、心血管疾患、脂質異常症障害、前糖尿病障害、２型糖尿病、メタボリック症候群、肥満、虚弱、サルコペニア、骨関節炎、炎症性疾患およびミトコンドリア機能不全を伴う疾患の処置または予防のための、請求項５９から６１のいずれかに記載の組成物。
  63. 創傷の処置または予防のための、請求項５９から６１いずれかに記載の組成物。
  64. 前記組成物におけるリベトリルＡの合計質量分率が、０．０００１％〜１００％、０．０００２５％〜９０％、０．０００５％〜８０％、０．０００２５％〜７０％、０．０００５％〜６０％、０．０００７５％〜５０％、０．００１％〜４５％、０．００２５％〜４０％、０．００５％〜３５％、０．００７５％〜３０％、０．０１％〜２５％、０．０２５％〜２０％、０．０５％〜１９％、０．０７５％〜１８％、０．１％〜１７％、０．２５％〜１６％、０．５％〜１５％、０．７５％〜１４％、１％〜１３％、１．５％〜１２％、２．０％〜１１％、３．０％〜１０％、４．０％〜９．０％、５．０％〜８．０％および６．０％〜７．０％の中から選択される、請求項５９から６３のいずれかに記載の組成物。
  65. 前記組成物におけるリベトリルＡ、リベトリルＢ、リベトリルＣ、リベトリルＤおよび／またはリベトリルＥの合計質量分率が、０．０００２％〜１００％、０．０００５％〜９０％、０．０００８％〜８０％、０．００１％〜７０％、０．００２５％〜６０％、０．００５％〜５０％、０．００７５％〜４５％、０．０１％〜４０％、０．０２５％〜３５％、０．０５％〜３０％、０．０７５％〜２５％、０．１％〜２０％、０．２５％〜１９％、０．５％〜１８％、０．７５％〜１７％、１．０％〜１６％、１．５％〜１５％、２．０％〜１４％、２．５％〜１３％、３．０％〜１２％、４．０％〜１１％、５．０％〜１０％、６．０％〜９．０％および７．０％〜８．０％の中から選択される、請求項５９から６３のいずれかに記載の組成物。
  66. 前記組成物におけるグルコインドールＡおよび／またはグルコインドールＢの合計質量分率が、０．０００８％〜１００％、０．００１％〜９０％、０．００２５％〜８０％、０．００５％〜７０％、０．００７５％〜６０％、０．０１％〜５０％、０．０２５％〜４５％、０．０５％〜４０％、０．０７５％〜３５％、０．１％〜３０％、０．２５％〜２５％、０．５％〜２０％、０．７５％〜１９％、１．０％〜１８％、１．５％〜１７％、２．０％〜１６％、２．５％〜１５％、３．０％〜１４％、３．５％〜１３％、４．０％〜１２％、４．５％〜１１％、５．０％〜１０％、６．０％〜９．０％および７．０％〜８．０％の中から選択される、請求項５９から６３のいずれかに記載の組成物。
  67. 請求項１から９のいずれかに記載のアルカロイドまたはアルカロイド画分を、単回用量を０．０１〜５０００ｍｇ、０．０５〜４０００ｍｇ、０．１〜３０００ｍｇ、０．２５〜２０００ｍｇ、０．５〜１７５０ｍｇ、０．７５〜１５００ｍｇ、１〜１２５０ｍｇ、１．５〜１０００ｍｇ、２〜９００ｍｇ、２．５〜８００ｍｇ、３〜７００ｍｇ、４〜６００ｍｇ、５〜５００ｍｇ、７．５〜４００ｍｇ、１０〜３５０ｍｇ、１５〜３００ｍｇ、２０〜２５０ｍｇ、３０〜２００ｍｇ、４０〜１５０ｍｇ、５０〜１２５ｍｇおよび７５〜１００ｍｇの中から選択して提供可能な、請求項５９から６４のいずれかに記載の組成物。
  68. アルカロイド画分が、合成物質または組換え技術による生産物である、請求項５９から６７のいずれか一項に記載の組成物。
  69. アルカロイド画分が、天然供給源から誘導される、請求項５９から６８のいずれかに記載の組成物。
  70. 対象を、請求項１から６９のいずれかに記載のアルカロイド画分、リベスの抽出物、汁または濃縮物、栄養物または組成物を前記対象へ投与することによって処置する方法。
  71. 皮膚疾患、心血管疾患、脂質異常症障害、前糖尿病障害、２型糖尿病、メタボリック症候群、肥満、虚弱、サルコペニア、骨関節炎、炎症性疾患およびミトコンドリア機能不全を伴う疾患の処置または予防のための、請求項７０に記載の方法。
  72. 創傷の処置または予防のための、請求項７０に記載の方法。
  73. 筋機能、運動能力、ミトコンドリア機能、神経細胞機能、精神機能、皮膚機能、代謝機能、心血管機能、関節機能の補助、正常化もしくは改善のための、または少なくとも１つの生理学的老化徴候減少のための、請求項７０に記載の方法。
  74. 全般的健康状態を補助するための、請求項７０に記載の方法。
  75. ミトコンドリアの生理学における少なくとも一様態を補助または改善するための、前記様態がミトコンドリア機能、ミトコンドリア生物発生およびミトコンドリア予備呼吸容量から成る群から選択される、請求項７０に記載の方法。
  76. 皮膚生理学における少なくとも一様態を調節するための、前記様態が好ましくは皮膚完全性の補助、皮膚機能および皮膚構造の正常化または改善、正常な皮膚の維持への貢献、正常な結合組織形成の維持への貢献ならびに正常な粘膜の維持への貢献の中から選択される、請求項７０に記載の方法。
  77. 老化の生理学における少なくとも一様態を調節するための、前記様態が好ましくは健康的老化の補助、加齢に伴う筋肉量喪失の低減、加齢に伴う筋力喪失の低減、加齢に伴う心筋機能喪失の低減、加齢に伴う皮膚構造劣化の低減、加齢に伴う皮膚再生喪失の低減、加齢に伴う骨形成劣化の低減、加齢に伴う内分泌機能喪失の低減、加齢に伴う神経細胞機能喪失の低減、加齢に伴うミトコンドリア機能劣化の低減、加齢に伴うミトコンドリア生物発生劣化の低減、加齢に伴うミトコンドリア予備呼吸容量劣化の低減、加齢に伴う視覚機能喪失の低減、加齢に伴う記憶機能喪失の低減、加齢に伴う精神機能喪失の低減、加齢に伴う身体持久力喪失の低減、加齢に伴う筋機能低下の低減、高齢者における筋機能補助および高齢者における筋持久力改善の中から選択される、請求項７０に記載の方法。
  78. 筋肉の生理学における少なくとも一様態を調節するための、前記様態が好ましくは運動しないことによる筋機能低下の拮抗、不活動によって減少した筋機能の改善、不活動によって減少した筋機能の補助、正常な筋機能への貢献、正常な筋機能の維持への貢献、筋肉量成長への貢献、筋肉量維持への貢献および正常な心機能への貢献の中から選択される、請求項７０に記載の方法。
  79. 持久力およびスポーツ生理学における少なくとも一様態を調節するための、前記様態が好ましくは運動能力の改善、スポーツ競技中の筋機能の補助、持久運動中の筋機能の補助、スポーツ競技中の持久力の改善、長時間の持久力訓練中の持久力維持への貢献、短時間の激しい訓練の連続的突発における身体能力の増強、運動選手における無酸素閾値の改善、運動選手におけるＶＯ２ｍａｘの改善、ミトコンドリア予備呼吸容量の改善、正常なミトコンドリア機能の補助、ミトコンドリアの強化、ミトコンドリア生物発生の改善、疲労感および疲労の拮抗、疲労感および疲労の低減への貢献、ならびに正常なエネルギー産生代謝への貢献の中から選択される、請求項７０に記載の方法。
  80. 関節生理学における少なくとも一様態を調節するための、前記様態が好ましくは軟骨機能および関節機能の補助ならびに関節の柔軟性の補助の中から選択される、請求項７０に記載の方法。
  81. 認知機能および精神機能における少なくとも一様態を調節するための、前記様態が好ましくは喪心状態の改善、精神機能の補助、健常な精神機能の補助、健忘症の拮抗、記憶機能の改善、正常な心理機能への貢献、正常な脳機能維持への貢献、正常な認知機能への貢献、神経系の正常な機能状態への貢献および正常な神経伝達への貢献の中から選択される、請求項７０に記載の方法。
  82. 血中脂質の生理学における少なくとも一様態を調節するための、前記様態が好ましくは正常な血中コレステロールレベル維持への貢献、正常な血中トリグリセリドレベル維持への貢献、血中コレステロールの低下または低減、および血中トリグリセリドレベルの低下または低減の中から選択される、請求項７０に記載の方法。
  83. 血糖生理学における、正常な血糖値維持への貢献など、少なくとも一様態を調節するための、請求項７０に記載の方法。
  84. 請求項１から９のいずれかに記載のアルカロイド画分を含むリベスの抽出物、汁または濃縮物を製造するための、ステップ：
    ｉ）粉砕された漿果および／または葉の汁または懸濁物の調製；
    ｉｉ）場合によって、汁または粉砕された漿果および／もしくは葉の、抽出剤による抽出；
    ｉｉｉ）場合によって、前記抽出剤および／または余分な水の除去；
    ｉｉｉｉ）アルカロイド画分を得るための、アルカロイドの濃縮
    を含む方法。
  85. リベスが、リベス・ルブルムおよび／またはリベス・ニグルムの中から選択される、請求項８４に記載の方法。
  86. 粉砕された漿果および／または葉の汁または懸濁物が、好ましくはセルラーゼ、アミラーゼおよびペクチナーゼの中から選択される少なくとも１つの酵素による処理を施される、請求項８４または８５に記載の方法。
  87. 粉砕された漿果および／または葉の抽出剤による抽出ステップを含み、前記抽出剤が水、有機溶媒またはこれらの混合物を含む、請求項８４から８６のいずれかに記載の方法。
  88. アルカロイド画分抽出ステップが、遠心分離、限外濾過、ナノ濾過、クロマトグラフィー、固液抽出、液液抽出および／または乾燥を含む、請求項８４から８７のいずれかに記載の方法。
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