JP2016524902A - Ptoの切断及び延長−依存的固定化オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを用いたターゲット核酸配列の検出 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)前記ターゲット核酸配列を、アップストリームオリゴヌクレオチド(upstream oligonucleotide)及びプロービング・アンド・タギングオリゴヌクレオチド(Probing and Tagging Oligonucleotide;PTO)とハイブリダイズさせる段階であって;前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列(hybridizing nucleotide sequence)を含み;前記PTOは、(i)前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む3’−ターゲッティング部位、及び(ii)前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む5’−タギング部位を含み;前記3’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、前記5’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず;前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記PTOのアップストリームに位置し;
(b)前記PTOの切断のための条件下で、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階(a)の結果物を接触させる段階であって;前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記PTOの切断を誘導し、このような前記切断は、前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部を含む断片を放出し;
(c)前記PTOから放出された前記断片を、キャプチャリング・アンド・テンプレーティングオリゴヌクレオチド(Capturing and Templating Oligonucleotide;CTO)とハイブリダイズさせる段階であって;前記CTOは、3’→5’方向に(i)前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び(ii)前記PTOの5’−タギング部位及び3’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み;前記PTOから放出された前記断片は、前記CTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ;
(d)前記段階(c)の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を用いて延長反応を実施する段階であって;前記CTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて前記CTOのテンプレーティング部位に相補的な延長配列を含む延長鎖を生成し、延長二量体を形成し;前記延長鎖は、標識を含み;
(e)前記延長鎖を、固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド(Immobilized Oligonucleotide;IO)とハイブリダイズさせる段階であって;前記IOは、前記延長鎖に相補的な配列を含み;前記延長鎖及び前記IO間のハイブリダイゼーションは、前記固相基質上に検出可能なシグナルを提供し;及び(f)前記延長鎖の存在を示す前記シグナルを検出する段階であって;前記延長鎖の存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
(a)本発明は、まずPTOをターゲット核酸配列とハイブリダイズさせ、人為的に選択した配列を有するCTOをテンプレートとして使うことによって、ターゲット−依存的な方式で延長鎖を形成させ、最後に、前記延長鎖を固相に固定されたIOとハイブリダイズさせる。すなわち、本発明は、PTOハイブリダイゼーション及び切断、CTOハイブリダイゼーション及び延長、及びIOハイブリダイゼーションを含む一連の反応を用いて、本発明の特異性を非常に向上させる。
(b)固相は、制限された反応環境を提供することができるために、ターゲット核酸配列及び固相基質上に固定されたオリゴヌクレオチド間の直接的なハイブリダイゼーションは、効率的な反応結果が得られない。一方、本発明は、ターゲット核酸配列の関与なしに、延長鎖及びIO間のハイブリダイゼーションを用いるので、一般的または典型的な反応条件下でより効率的に検出結果が得られる。このような利点は、より便利な方式で非常に多様な特性を有する臨床試料の複数のターゲット核酸検出のための反応条件を確立可能にし、擬陽性シグナルの発生を防止する。
(c)固相に固定されたIOは、標識を含まない。したがって、固相に固定された標識オリゴヌクレオチドを長期保管する場合に発生する標識分解(degradation)の問題点がない。
(d)ターゲット核酸配列とプローブの直接的なハイブリダイゼーションを用いる従来の方法で、プローブは、相補的な配列と競争する方式でターゲット核酸配列に結合する。対照的に、本発明は、このような競争的なハイブリダイゼーションを避けることができる。本発明は、PTO及びCTOの量を調節することによって、延長鎖のみがCTOをテンプレートとして用いて増幅され、これにより、延長鎖がCTOの妨害なしに効率的にIOとハイブリダイズされることができるために、より効率的なプローブハイブリダイゼーションが可能である。
さらに、ターゲット核酸配列の一鎖とプローブの直接的なハイブリダイゼーションを用いる従来の方法で、ターゲット核酸配列の反対側鎖の長さは、プローブの長さよりも相対的に長い。したがって、より長い長さのプローブ(すなわち、より高いTm値のプローブ)を使って反対側鎖のハイブリダイゼーション競争力よりもプローブのハイブリダイゼーション競争力を向上させるのには限界がある。本発明で、延長鎖及びIO間のハイブリダイゼーションを抑制するCTOの長さは、より短く調節される。したがって、IOの長さを調節(すなわち、Tm値の調節)することによって、IOのハイブリダイゼーション競争力をCTOのハイブリダイゼーション競争力よりも向上させうる。
(e)本発明は、固相でのシグナルをリアルタイム方式で検出し、かつ一定の温度範囲で提供されるシグナル(例えば、メルティングカーブ分析)の検出も可能である。
(f)本発明は、固相に固定されたオリゴヌクレオチドを用いるので、一種の蛍光標識を使うとしても、複数のターゲット核酸配列を同時に検出することができる。
(g)PTOの5’−タギング部位の配列、CTOの配列及びIOの配列が、ターゲット核酸配列を考慮せずに選択可能であるということは注目すべき点である。これは、PTOの5’−タギング部位、CTO及びIOのための配列プール(pool)をあらかじめデザインすることを可能にする。PTOの3’−ターゲッティング部位は、必ずターゲット核酸配列を考慮して準備せねばならないが、CTO及びIOは、ターゲット核酸配列についての考慮や知識なしに既製作の方式で準備しうる。
段階(a):アップストリームオリゴヌクレオチド及びPTOとターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーション
本発明によれば、ターゲット核酸配列を、まずアップストリームオリゴヌクレオチド及びプロービング・アンド・タギングオリゴヌクレオチド(PTO)とハイブリダイズさせる。
引き続き、前記PTOの切断のための条件下で前記段階(a)の結果物を5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に接触させる。前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたPTOは、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって切断されて、前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部を含む断片を放出する。
前記PTOから放出された断片は、キャプチャリング・アンド・テンプレーティングオリゴヌクレオチド(CTO)とハイブリダイズされる。
前記段階(c)の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を用いて延長反応を実施する。前記CTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて前記CTOのテンプレーティング部位に相補的な延長配列を含む延長鎖を形成し、これにより、延長二量体を形成する。一方、前記CTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた非切断されたPTOは、延長されず、延長二量体も形成されない。
本発明は、単一標識を用いることによって、ターゲット核酸配列の存在を示す延長鎖の存在に対するシグナルを提供することができる(参照:図2及び図3)。単一標識で標識されたPTO断片は、CTOにハイブリダイズされ、CTO上で延長されて延長鎖を生成し、前記単一標識は、延長鎖に含まれる。引き続き、前記延長鎖が固相基質に固定されたIOにハイブリダイズされて、固相基質上に検出可能なシグナルを提供した後、延長鎖の存在を示すシグナルが検出される。
一具現例によれば、本発明で使われる標識は、延長鎖に挿入される標識であり、CTOのテンプレーティング部位は、第1非天然塩基を含むヌクレオチドを含み、前記段階(d)の延長反応は、標識及び前記第1非天然塩基に対して特異的結合親和性を有する第2非天然塩基を含むヌクレオチドの存在下で実施され、これにより、前記延長鎖に標識が挿入される。
一具現例によれば、本発明で使われる標識は、断片に結合された単一標識及び延長反応の間に延長鎖に挿入される標識の組合せであり、前記単一標識及び前記挿入された標識は、受容体(acceptor)及び供与体(donor)の対を含む相互作用的二重標識である。
一具現例によれば、前記段階(e)のハイブリダイゼーションは、インターカレーティング染料の存在下で実施し、延長鎖に含まれた標識は、前記インターカレーティング染料からのシグナルを受ける受容体であり、前記延長鎖及びIO間のハイブリッドに挿入されたインターカレーティング染料からのシグナルは、前記受容体に転移され、前記受容体は、検出可能なシグナルを提供する。
前記段階(d)の延長鎖は、固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド(IO)にハイブリダイズされ、これにより、ターゲット配列の存在を示すシグナルが固相基質上に提供される。
最終的に、生成された検出可能なシグナルが、固相基質上から検出される。前記検出可能なシグナルは、延長鎖の存在を示し、前記延長鎖の存在は、ターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明は、ターゲット核酸配列を合成することができるアップストリームプライマー及びダウンストリームプライマーで構成されたプライマー対を用いるターゲット核酸配列の増幅と共に同時に実施される。
(a)前記ターゲット核酸配列を、アップストリームプライマー及びダウンストリームプライマーを含むプライマー対及びプロービング・アンド・タギングオリゴヌクレオチド(PTO)とハイブリダイズさせる段階であって;前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーのそれぞれは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含み;前記PTOは、(i)前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む3’−ターゲッティング部位、及び(ii)前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む5’−タギング部位を含み;前記3’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、前記5’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず;前記PTOは、前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーの間に位置し;前記PTOは、その延長が防止されるように、その3’末端がブロッキングされており;
(b)前記プライマーの延長及び前記PTOの切断のための条件下で、5’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素に前記段階(a)の結果物を接触させる段階であって;前記PTOが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされれば、前記アップストリームプライマーは延長され、前記延長鎖は、前記5’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素による前記PTOの切断を誘導し、このような前記切断は、前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部を含む断片を放出し;
(c)前記PTOから放出された前記断片を、キャプチャリング・アンド・テンプレーティングオリゴヌクレオチド(CTO)とハイブリダイズさせる段階であって;前記CTOは、3’→5’方向に(i)前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び(ii)5’−タギング部位及び3’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み;前記PTOから放出された前記断片は、前記CTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ;
(d)前記段階(c)の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を用いて延長反応を実施する段階であって;前記CTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて前記CTOのテンプレーティング部位に相補的な延長配列を含む延長鎖を生成し、延長二量体を形成し;前記延長鎖は、標識を含み、
(e)前記延長鎖を、固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド(IO)とハイブリダイズさせる段階であって;前記IOは、前記延長鎖に相補的な配列を含み;前記延長鎖及び前記IO間のハイブリダイゼーションは、前記固相基質上に検出可能なシグナルを提供し;及び(f)前記延長鎖の存在を示す前記シグナルを検出する段階であって;前記延長鎖の存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明の追加的な態様において、本発明は、次の段階を含むPTOの切断及び延長−依存的固定化オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション(PCE−IH)分析によって固相で核酸試料内のターゲット核酸配列を検出する方法を提供する:
(a)前記ターゲット核酸配列を、プロービング・アンド・タギングオリゴヌクレオチド(PTO)とハイブリダイズさせる段階であって;前記PTOは、(i)前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む3’−ターゲッティング部位、及び(ii)前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む5’−タギング部位を含み;前記3’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、前記5’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず;
(b)前記PTOの切断のための条件下で、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階(a)の結果物を接触させる段階であって;前記PTOは、前記5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって切断され、このような前記切断は、前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部を含む断片を放出し;
(c)前記PTOから放出された前記断片を、キャプチャリング・アンド・テンプレーティングオリゴヌクレオチド(CTO)とハイブリダイズさせる段階であって;前記CTOは、3’→5’方向に(i)前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び(ii)前記PTOの5’−タギング部位及び3’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み;前記PTOから放出された前記断片は、前記CTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ;
(d)前記段階(c)の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を用いて延長反応を実施する段階であって;前記CTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて前記CTOのテンプレーティング部位に相補的な延長配列を含む延長鎖を生成し、延長二量体を形成し;前記延長鎖は、標識を含み、
(e)前記延長鎖を、固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド(IO)とハイブリダイズさせる段階であって;前記IOは、前記延長鎖に相補的な配列を含み;前記延長鎖と前記IOとの間のハイブリダイゼーションは、前記固相基質上に検出可能なシグナルを提供し;及び
(f)前記延長鎖の存在を示す前記シグナルを検出する段階であって;前記延長鎖の存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明のさらに他の態様において、本発明は、次を含むPTOの切断及び延長−依存的固定化オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション(PCE−IH)分析によって固相で核酸試料内のターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供する:
(a)アップストリームオリゴヌクレオチド;前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含み;
(b)プロービング・アンド・タギングオリゴヌクレオチド(PTO);前記PTOは、(i)前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む3’−ターゲッティング部位、及び(ii)前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む5’−タギング部位を含み;前記3’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、前記5’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず;前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記PTOのアップストリームに位置し;前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記PTOの切断を誘導し、このような切断は、前記PTOの5’−タギング部位及び5’−タギング部位の一部を含む断片を放出し;
(c)キャプチャリング・アンド・テンプレーティングオリゴヌクレオチド(CTO);前記CTOは、3’→5’方向に(i)前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び(ii)前記PTOの5’−タギング部位及び3’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み;前記PTOから放出された前記断片は、前記CTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ;前記CTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて前記CTOのテンプレーティング部位に相補的な延長配列を含む延長鎖を生成し、延長二量体を形成し;前記延長鎖は、標識を含み;及び
(d)固定化オリゴヌクレオチド(IO);前記IOは、固相基質上に固定化されており;前記IOは、前記延長鎖に相補的な配列を含み;前記延長鎖と前記IOとの間のハイブリダイゼーションは、前記固相基質上に検出可能なシグナルを提供する。
本発明者らは、マイクロアレイ上で単一標識されたプロービング・アンド・タギングオリゴヌクレオチド(PTO)、キャプチャリング・アンド・テンプレーティングオリゴヌクレオチド(CTO)及び固定化オリゴヌクレオチド(IO)を用いたPCE−IH分析が、ターゲット核酸配列を検出できるか否かを実験した。
NG−F 5’−TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG−3’(配列番号:1)
NG−R 5’−CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC−3’(配列番号:2)
PTO 5’−[Quasar570]ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spaser]−3’(配列番号:3)
CTO 5’−CATATCGTCCAGGGTATCCAGCGCTCAGCCAAGCCGTCGT[C3 spaser]−3’(配列番号:4)
IO 5’−[Amino C6]TTTTTTTTTTCATATCGTCCAGGGTATCCAGCGC[C3 spaser]−3’(配列番号:5)
Marker 5’−[Quasar570]ATATATATAT[Amino C7]−3’(配列番号:6)
(I:デオキシイノシン)
(下線を引いた文字は、PTO−NVの5’−タギング部位を示す)
延長鎖がターゲット核酸配列の存在下で生成される場合、延長鎖及びIO間のハイブリッドの形成は、CTOと延長鎖のハイブリダイゼーションによって抑制されうる。本発明者らは、多様な濃度のCTO及び延長鎖を模倣した合成延長鎖(Syn−ES)を用いて延長鎖及びIO間のハイブリッドの形成に及ぼすCTOの影響を調査した。Syn−ESは、その5’末端に蛍光レポーター分子(Quasar570)を有する。
Syn−ES 5’−[Quasar570]ACGACGGCTTGGCTGAGCGCTGGATACCCTGGACGATATG−3’(配列番号:7)
実施例2で示すように、延長鎖及びCTO間のハイブリッドの形成は、延長鎖及びIOのハイブリダイゼーションを抑制する。延長鎖がターゲット核酸配列の存在下で生成される場合、一本鎖状態の延長鎖の数の増加は、延長鎖及びIOのハイブリダイゼーションを向上させる。
Claims (37)
- 次の段階を含むPTOの切断及び延長−依存的固定化オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション(PCE−IH)分析によって固相で核酸試料内のターゲット核酸配列を検出する方法:
(a)前記ターゲット核酸配列を、アップストリームオリゴヌクレオチド及びプロービング・アンド・タギングオリゴヌクレオチド(PTO)とハイブリダイズさせる段階であって;
前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含み;
前記PTOは、(i)前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む3’−ターゲッティング部位、及び(ii)前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む5’−タギング部位を含み;
前記3’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、前記5’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず;
前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記PTOのアップストリームに位置し;
(b)前記PTOの切断のための条件下で、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階(a)の結果物を接触させる段階であって;
前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記PTOの切断を誘導し、このような前記切断は、前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部を含む断片を放出し;
(c)前記PTOから放出された前記断片を、キャプチャリング・アンド・テンプレーティングオリゴヌクレオチド(CTO)とハイブリダイズさせる段階であって;
前記CTOは、3’→5’方向に(i)前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び(ii)前記PTOの5’−タギング部位及び3’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み;
前記PTOから放出された前記断片は、前記CTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ;
(d)前記段階(c)の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を用いて延長反応を実施する段階であって;
前記CTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて前記CTOのテンプレーティング部位に相補的な延長配列を含む延長鎖を生成し、延長二量体を形成し;
前記延長鎖は、標識を含み;
(e)前記延長鎖を、固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド(IO)とハイブリダイズさせる段階であって;
前記IOは、前記延長鎖に相補的な配列を含み;
前記延長鎖及び前記IO間のハイブリダイゼーションは、前記固相基質上に検出可能なシグナルを提供し;及び
(f)前記延長鎖の存在を示す前記シグナルを検出する段階であって;
前記延長鎖の存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。 - 前記段階(e)は、前記延長鎖が一本鎖状態で前記IOとのハイブリダイゼーションに有利な条件下で実施され、これにより、前記延長鎖及び前記CTO間の前記延長二量体の形成による前記延長鎖及び前記IO間のハイブリダイゼーションの抑制が防止されることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記条件は、前記段階(e)で前記一本鎖状態の延長鎖の数を増加させることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記段階(e)で前記一本鎖状態の延長鎖の数を増加させる前記条件は、前記延長鎖及び前記IO間のハイブリダイゼーション前に前記延長二量体を変性させることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記段階(e)で前記一本鎖状態の延長鎖の数を増加させる前記条件は、前記延長鎖及び前記IO間のハイブリダイゼーション前に前記CTOを除去することを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記段階(e)で前記一本鎖形態の延長鎖の数を増加させる前記条件は、PTOのCTOに対するmol比が1超で前記PTO及び前記CTOを使うことを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記PTOのCTOに対するmol比は、1.2以上であることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 前記段階(e)は、前記延長鎖と前記IOとのハイブリダイゼーション競争力を、前記CTOと前記延長鎖とのハイブリダイゼーション競争力よりも向上させる条件下で実施されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記延長鎖と前記IOとのハイブリダイゼーション競争力を、前記CTOと前記延長鎖とのハイブリダイゼーション競争力よりも向上させる前記条件は、前記延長鎖及び前記IO間のハイブリッドのTm値及び前記CTO及び前記延長鎖間のハイブリッドのTm値を調節することを特徴とする請求項8に記載の方法。
- 前記IOは、(i)前記延長配列の全部または一部、及び(ii)前記延長鎖内の前記断片の一部に相補的な配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記延長鎖に含まれた前記標識は、(i)前記PTOから放出された前記断片に結合された単一標識、(ii)前記延長反応の間に前記延長鎖に挿入される標識、または(iii)前記断片に結合された前記単一標識及び前記延長反応の間に前記延長鎖に挿入される前記標識の組合せであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記単一標識は、単一蛍光標識であることを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 前記標識は、前記延長鎖に挿入される標識であり、
前記CTOのテンプレーティング部位は、第1非天然塩基を含むヌクレオチドを含み、
前記段階(d)の前記延長反応は、標識及び前記第1非天然塩基に対して特異的結合親和性を有する第2非天然塩基を含むヌクレオチドの存在下で実施され、これにより、前記延長鎖に前記標識が挿入されることを特徴とする請求項11に記載の方法。 - 前記標識は、前記断片に結合された前記単一標識及び前記延長反応の間に前記延長鎖に挿入される前記標識の組合せであり、前記単一標識及び前記挿入された標識は、受容体及び供与体の対を含む相互作用的二重標識であることを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 前記段階(e)の前記ハイブリダイゼーションは、インターカレーティング染料の存在下で実施され、前記延長鎖に含まれた前記標識は、前記インターカレーティング染料からのシグナルを受ける受容体であり、前記延長鎖及び前記IO間のハイブリッドに挿入されたインターカレーティング染料からのシグナルは、前記受容体に転移され、前記受容体は、検出可能なシグナルを提供することを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 前記PTO、前記CTO及び/または前記IOは、その延長が防止されるように、その3’末端がブロッキングされることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、アップストリームプライマーまたはアップストリームプローブであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記PTOの切断を誘導する程度に前記PTOに近接して位置することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記アップストリームプライマーは、その延長鎖を通じて前記5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記PTOの前記切断を誘導することを特徴とする請求項17に記載の方法。
- 前記CTOのキャプチャリング部位は、その5’末端の一部に前記PTOの3’−ターゲッティング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記PTOの3’−ターゲッティング部位の一部に相補的な前記ヌクレオチド配列は、1〜10ヌクレオチドの長さであることを特徴とする請求項20に記載の方法。
- 前記シグナルを検出するための前記段階(f)は、一定温度範囲で前記延長鎖及び前記IO間のハイブリッドをメルティングするか、または前記ハイブリッドをメルティングし、ハイブリダイズさせる過程で、前記固相基質上に提供されるシグナルを検出することで実施されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記方法は、反復サイクルの間に変性を含み、前記段階(a)〜(f)の全部または一部を繰り返す段階をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記段階(a)〜(f)は、1つの反応容器または個別反応容器で実施されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記段階(a)〜(d)及び(e)〜(f)は、互いに異なる2つの反応容器で実施されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記方法は、少なくとも2種のターゲット核酸配列を検出するために実施され;
前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、少なくとも2種のオリゴヌクレオチドを含み、前記PTOは、少なくとも2種のPTOを含み、前記CTOは、少なくとも2種のCTOを含み、前記IOは、少なくとも2種のIOを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、アップストリームプライマーであり、前記段階(b)で5’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素は、前記アップストリームプライマーの延長のための鋳型−依存的核酸重合酵素であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、5’ヌクレアーゼ活性を有する重合酵素またはFENヌクレアーゼであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記方法は、ダウンストリームプライマーの存在下で実施されることを特徴とする請求項1から29のいずれかに記載の方法。
- 次の段階を含むPTOの切断及び延長−依存的固定化オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション(PCE−IH)分析によって固相で核酸試料内のターゲット核酸配列を検出する方法:
(a)前記ターゲット核酸配列を、アップストリームプライマー及びダウンストリームプライマーを含むプライマー対及びプロービング・アンド・タギングオリゴヌクレオチド(PTO)とハイブリダイズさせる段階であって;
前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーのそれぞれは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含み;
前記PTOは、(i)前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む3’−ターゲッティング部位、及び(ii)前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む5’−タギング部位を含み;
前記3’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、前記5’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず;
前記PTOは、前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーの間に位置し;
前記PTOは、その延長が防止されるように、その3’末端がブロッキングされており;
(b)前記プライマーの延長及び前記PTOの切断のための条件下で、5’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素に前記段階(a)の結果物を接触させる段階であって;
前記PTOが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされれば、前記アップストリームプライマーは延長され、前記延長鎖は、前記5’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素による前記PTOの切断を誘導し、このような前記切断は、前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部を含む断片を放出し;
(c)前記PTOから放出された前記断片を、キャプチャリング・アンド・テンプレーティングオリゴヌクレオチド(CTO)とハイブリダイズさせる段階であって;
前記CTOは、3’→5’方向に(i)前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び(ii)5’−タギング部位及び3’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み;
前記PTOから放出された前記断片は、前記CTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ;
(d)前記段階(c)の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を用いて延長反応を実施する段階であって;
前記CTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて前記CTOのテンプレーティング部位に相補的な延長配列を含む延長鎖を生成し、延長二量体を形成し;
前記延長鎖は、標識を含み、
(e)前記延長鎖を、固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド(IO)とハイブリダイズさせる段階であって;
前記IOは、前記延長鎖に相補的な配列を含み;
前記延長鎖及び前記IO間のハイブリダイゼーションは、前記固相基質上に検出可能なシグナルを提供し;及び
(f)前記延長鎖の存在を示す前記シグナルを検出する段階であって;
前記延長鎖の存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。 - 次の段階を含むPTOの切断及び延長−依存的固定化オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション(PCE−IH)分析によって固相で核酸試料内のターゲット核酸配列を検出する方法:
(a)前記ターゲット核酸配列を、プロービング・アンド・タギングオリゴヌクレオチド(PTO)とハイブリダイズさせる段階であって;
前記PTOは、(i)前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む3’−ターゲッティング部位、及び(ii)前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む5’−タギング部位を含み;
前記3’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、前記5’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず;
(b)前記PTOの切断のための条件下で、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階(a)の結果物を接触させる段階であって;
前記PTOは、前記5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって切断され、このような前記切断は、前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部を含む断片を放出し;
(c)前記PTOから放出された前記断片を、キャプチャリング・アンド・テンプレーティングオリゴヌクレオチド(CTO)とハイブリダイズさせる段階であって;
前記CTOは、3’→5’方向に(i)前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び(ii)前記PTOの5’−タギング部位及び3’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み;
前記PTOから放出された前記断片は、前記CTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ;
(d)前記段階(c)の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を用いて延長反応を実施する段階であって;
前記CTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて前記CTOのテンプレーティング部位に相補的な延長配列を含む延長鎖を生成し、延長二量体を形成し;
前記延長鎖は、標識を含み、
(e)前記延長鎖を、固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド(IO)とハイブリダイズさせる段階であって;
前記IOは、前記延長鎖に相補的な配列を含み;
前記延長鎖と前記IOとの間のハイブリダイゼーションは、前記固相基質上に検出可能なシグナルを提供し;及び
(f)前記延長鎖の存在を示す前記シグナルを検出する段階であって;
前記延長鎖の存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。 - 次を含むPTOの切断及び延長−依存的固定化オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション(PCE−IH)分析によって固相で核酸試料内のターゲット核酸配列を検出するためのキット:
(a)アップストリームオリゴヌクレオチド;
前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含み;
(b)プロービング・アンド・タギングオリゴヌクレオチド(PTO);
前記PTOは、(i)前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む3’−ターゲッティング部位、及び(ii)前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む5’−タギング部位を含み;
前記3’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、前記5’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず;
前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記PTOのアップストリームに位置し;
前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記PTOの切断を誘導し、このような切断は、前記PTOの5’−タギング部位及び5’−タギング部位の一部を含む断片を放出し;
(c)キャプチャリング・アンド・テンプレーティングオリゴヌクレオチド(CTO);
前記CTOは、3’→5’方向に(i)前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び(ii)前記PTOの5’−タギング部位及び3’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み;
前記PTOから放出された前記断片は、前記CTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ;
前記CTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて前記CTOのテンプレーティング部位に相補的な延長配列を含む延長鎖を生成し、延長二量体を形成し;
前記延長鎖は、標識を含み;及び
(d)固定化オリゴヌクレオチド(IO);
前記IOは、固相基質上に固定化されており;
前記IOは、前記延長鎖に相補的な配列を含み;
前記延長鎖と前記IOとの間のハイブリダイゼーションは、前記固相基質上に検出可能なシグナルを提供する。 - 前記キットは、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素をさらに含むことを特徴とする請求項33に記載のキット。
- PTOのCTOに対するmol比が1超で前記PTO及びCTOを含むことを特徴とする請求項33に記載のキット。
- 前記IOは、(i)前記延長配列の全部または一部、及び(ii)前記延長鎖内の前記断片の一部に相補的な配列を含むことを特徴とする請求項33に記載のキット。
- 前記延長鎖に含まれた前記標識は、(i)前記PTOから放出された前記断片に結合された単一標識、(ii)前記延長反応の間に前記延長鎖に挿入される標識、または(iii)前記断片に結合された前記単一標識及び前記延長反応の間に前記延長鎖に挿入される前記標識の組合せであることを特徴とする請求項33に記載のキット。
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JPN6015037125; NATURE BIOTECHNOLOGY Vol.17, 1999, p.292-296 * |
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