JP2016523560A - Ｒｎａ誘導性遺伝子制御および編集のための直交性ｃａｓ９タンパク質 - Google Patents

Abstract

対応する遺伝子を同時に且つ独立して制御するため、または対応する遺伝子を同時に且つ独立して編集するために、複数種類のの直交性Ｃａｓ９タンパク質を使用することを含む、細胞において標的核酸の発現を調節する方法が提供される。

Description

関連出願データ
本願は、２０１３年７月１０日に提出された米国仮特許出願第６１／８４４，８４４号に基づく優先権を主張するものであり、あらゆる目的のため、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

政府利益の説明
本発明は、米国国立衛生研究所助成金番号Ｐ５０ＨＧ００５５５０号および米国エネルギー省助成金番号ＤＥ−ＦＧ０２−０２ＥＲ６３４４５の国庫助成により行われた。米国政府は本発明に関して一定の権利を有する。

細菌および古細菌のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成した短鎖ガイドＲＮＡに依存して、侵入する外来核酸中に存在する相補配列を分解する。Deltcheva, E. et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 471, 602-607 (2011); Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. & Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, E2579-2586 (2012); Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012); Sapranauskas, R. et al. The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic acids research 39, 9275-9282 (2011)；およびBhaya, D., Davison, M. & Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics 45, 273-297 (2011)を参照されたい。近年、ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのインビトロ再構成により、通常はトランスにコードされるｔｒａｃｒＲＮＡ（「トランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」）と融合したｃｒＲＮＡ（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」）が、そのｃｒＲＮＡに一致する標的ＤＮＡ配列をＣａｓ９タンパク質に配列特異的に切断させるのに十分であることが実証された。標的部位に相同なｇＲＮＡの発現により、Ｃａｓ９が動員され、標的ＤＮＡが分解される。H. Deveau et al, Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. Journal of Bacteriology 190, 1390 (Feb, 2008)を参照されたい。

本開示の態様は、ガイドＲＮＡと、ＤＮＡ結合タンパク質と、二本鎖ＤＮＡ標的配列との複合体に関するものである。

ある態様によれば、本開示の範囲内のＤＮＡ結合タンパク質には、ガイドＲＮＡとの複合体を形成するタンパク質が含まれ、このガイドＲＮＡは、この複合体を二本鎖ＤＮＡ配列にガイドし、そこでこの複合体はこのＤＮＡ配列に結合する。本開示のこの態様を、ＲＮＡとＤＮＡ結合タンパク質の二本鎖ＤＮＡへの共局在、またはＲＮＡとＤＮＡ結合タンパク質の二本鎖ＤＮＡとの共局在とも呼ぶことができる。このようにして、ＤＮＡ結合タンパク質−ガイドＲＮＡ複合体を用いて、標的ＤＮＡの発現を制御するために転写制御タンパク質またはドメインを標的ＤＮＡに局在させることができる。ある態様によれば、２種類以上または複数種類の直交性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質（orthogonal RNA guided DNA binding protein）、または一組の直交性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質を用いて、細胞においてＤＮＡ中の遺伝子が同時に且つ独立して制御され得る。ある態様によれば、２種類以上もしくは複数種類、または一組の直交性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質を用いて、細胞においてＤＮＡ中の遺伝子が同時に且つ独立して編集され得る。ＤＮＡ結合タンパク質またはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質に言及する場合は、直交性ＤＮＡ結合タンパク質または直交性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質が含まれると理解すべきである。そのような直交性ＤＮＡ結合タンパク質または直交性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有していてもよく、ニッカーゼ活性を有していてもよく、ヌクレアーゼ欠損（nuclease null）であってもよい。

ある態様によれば、
標的核酸を含むＤＮＡ（デオキシリボ核酸）に相補的である１種類または複数種類のＲＮＡ（リボ核酸）をコードする第１の外来核酸を細胞に導入すること、
前記ＤＮＡに結合し、且つ前記１種類または複数種類のＲＮＡによってガイドされる、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質をコードする第２の外来核酸を前記細胞に導入すること、および
転写制御タンパク質またはドメインをコードする第３の外来核酸を前記細胞に導入することを含み、
前記１種類または複数種類のＲＮＡ、前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、および前記転写制御タンパク質またはドメインが発現し、
前記１種類または複数種類のＲＮＡ、前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、および前記転写制御タンパク質またはドメインが、前記ＤＮＡに共局在し、
前記転写制御タンパク質またはドメインが前記標的核酸の発現を制御する、
細胞において標的核酸の発現を調節する方法が提供される。

ある態様によれば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質をコードする外来核酸は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質に融合した転写制御タンパク質またはドメインをさらにコードする。ある態様によれば、１種類または複数種類のＲＮＡをコードする外来核酸は、ＲＮＡ結合ドメインの標的をさらにコードし、転写制御タンパク質またはドメインをコードする外来核酸は、転写制御タンパク質またはドメインに融合したＲＮＡ結合ドメインをさらにコードする。

ある態様によれば、細胞は、真核細胞である。ある態様によれば、細胞は、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である。ある態様によれば、細胞は、哺乳動物細胞である。

ある態様によれば、ＲＮＡは約１０〜約５００ヌクレオチドである。ある態様によれば、ＲＮＡは約２０〜約１００ヌクレオチドである。

ある態様によれば、転写制御タンパク質またはドメインは、転写活性化因子である。ある態様によれば、転写制御タンパク質またはドメインは、標的核酸の発現を上方制御する。ある態様によれば、転写制御タンパク質またはドメインは、疾患または有害な健康状態（detrimental condition）を治療するために標的核酸の発現を上方制御する。ある態様によれば、標的核酸は、疾患または有害な健康状態と関連する。ある態様によれば、転写制御タンパク質またはドメインは、転写抑制因子である。ある態様によれば、転写制御タンパク質またはドメインは、標的核酸の発現を下方制御する。ある態様によれば、転写制御タンパク質またはドメインは、疾患または有害な健康状態を治療するために標的核酸の発現を下方制御する。ある態様によれば、標的核酸は、疾患または有害な健康状態と関連する。

ある態様によれば、１種類または複数種類のＲＮＡは、ガイドＲＮＡである。ある態様によれば、１種類または複数種類のＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ融合体である。

ある態様によれば、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである。

ある態様によれば、
標的核酸を含むＤＮＡ（デオキシリボ核酸）に相補的である１種類または複数種類のＲＮＡ（リボ核酸）をコードする第１の外来核酸を細胞に導入すること、
前記ＤＮＡに結合し、且つ前記１種類または複数種類のＲＮＡによってガイドされる、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質をコードする第２の外来核酸を前記細胞に導入すること、および
転写制御タンパク質またはドメインをコードする第３の外来核酸を前記細胞に導入することを含み、
前記１種類または複数種類のＲＮＡ、前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、および前記転写制御タンパク質またはドメインが発現し、
前記１種類または複数種類のＲＮＡ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、および前記転写制御タンパク質またはドメインがＤＮＡに共局在し、
前記転写制御タンパク質またはドメインが、前記標的核酸の発現を制御する、
細胞において標的核酸の発現を調節する方法が提供される。

ある態様によれば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質をコードする外来核酸は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質に融合した転写制御タンパク質またはドメインをさらにコードする。ある態様によれば、１種類または複数種類のＲＮＡをコードする外来核酸は、ＲＮＡ結合ドメインの標的をさらにコードし、転写制御タンパク質またはドメインをコードする外来核酸は、転写制御タンパク質またはドメインに融合したＲＮＡ結合ドメインをさらにコードする。

ある態様によれば、細胞は、真核細胞である。ある態様によれば、細胞は、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である。ある態様によれば、細胞は、哺乳動物細胞である。

ある態様によれば、ＲＮＡは約１０〜約５００ヌクレオチドである。ある態様によれば、ＲＮＡは約２０〜約１００ヌクレオチドである。

ある態様によれば、転写制御タンパク質またはドメインは、転写活性化因子である。ある態様によれば、転写制御タンパク質またはドメインは標的核酸の発現を上方制御する。ある態様によれば、転写制御タンパク質またはドメインは、疾患または有害な健康状態を治療するために標的核酸の発現を上方制御する。ある態様によれば、標的核酸は、疾患または有害な健康状態と関連する。

ある態様によれば、１種類または複数種類のＲＮＡは、ガイドＲＮＡである。ある態様によれば、１種類または複数種類のＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ融合体である。

ある態様によれば、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである。

ある態様によれば、
標的核酸を含むＤＮＡ（デオキシリボ核酸）に相補的である１種類または複数種類のＲＮＡ（リボ核酸）をコードする第１の外来核酸を細胞に導入すること、
前記ＤＮＡに結合し、且つ前記１種類または複数種類のＲＮＡによってガイドされる、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質をコードする第２の外来核酸を細胞に導入すること、および
転写制御タンパク質またはドメインをコードする第３の外来核酸を細胞に導入することを含み、
前記１種類または複数種類のＲＮＡ、前記ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質、および前記転写制御タンパク質またはドメインが発現し、
前記１種類または複数種類のＲＮＡ、前記ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質、および前記転写制御タンパク質またはドメインがＤＮＡに共局在し、
前記転写制御タンパク質またはドメインが前記標的核酸の発現を制御する、
細胞において標的核酸の発現を調節する方法が提供される。

ある態様によれば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質をコードする外来核酸は、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質に融合した転写制御タンパク質またはドメインをさらにコードする。ある態様によれば、１種類または複数種類のＲＮＡをコードする外来核酸は、ＲＮＡ結合ドメインの標的をさらにコードし、転写制御タンパク質またはドメインをコードする外来核酸は、転写制御タンパク質またはドメインに融合したＲＮＡ結合ドメインをさらにコードする。

ある態様によれば、細胞は、真核細胞である。ある態様によれば、細胞は、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である。ある態様によれば、細胞は、哺乳動物細胞である。

ある態様によれば、ＲＮＡは約１０〜約５００ヌクレオチドである。ある態様によれば、ＲＮＡは約２０〜約１００ヌクレオチドである。

ある態様によれば、転写制御タンパク質またはドメインは、転写活性化因子である。ある態様によれば、転写制御タンパク質またはドメインは、標的核酸の発現を上方制御する。ある態様によれば、転写制御タンパク質またはドメインは、疾患または有害な健康状態を治療するために標的核酸の発現を上方制御する。ある態様によれば、標的核酸は、疾患または有害な健康状態と関連する。

ある態様によれば、１種類または複数種類のＲＮＡは、ガイドＲＮＡである。ある態様によれば、１種類または複数種類のＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ融合体である。

ある態様によれば、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである。

ある態様によれば、
標的核酸を含むＤＮＡに相補的である１種類または複数種類のＲＮＡをコードする第１の外来核酸、
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質をコードする第２の外来核酸、および
転写制御タンパク質またはドメインをコードする第３の外来核酸を含み、
前記１種類または複数種類のＲＮＡ、前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、および前記転写制御タンパク質またはドメインが、前記標的核酸に対する共局在複合体の構成要素である、
細胞が提供される。

ある態様によれば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質をコードする外来核酸は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質に融合した転写制御タンパク質またはドメインをさらにコードする。ある態様によれば、１種類または複数種類のＲＮＡをコードする外来核酸は、ＲＮＡ結合ドメインの標的をさらにコードし、転写制御タンパク質またはドメインをコードする外来核酸は、転写制御タンパク質またはドメインに融合したＲＮＡ結合ドメインをさらにコードする。

ある態様によれば、細胞は、真核細胞である。ある態様によれば、細胞は、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である。ある態様によれば、細胞は、哺乳動物細胞である。

ある態様によれば、ＲＮＡは約１０〜約５００ヌクレオチドである。ある態様によれば、ＲＮＡは約２０〜約１００ヌクレオチドである。

ある態様によれば、転写制御タンパク質またはドメインは、転写活性化因子である。ある態様によれば、転写制御タンパク質またはドメインは、標的核酸の発現を上方制御する。ある態様によれば、転写制御タンパク質またはドメインは、疾患または有害な健康状態を治療するために標的核酸の発現を上方制御する。ある態様によれば、標的核酸は、疾患または有害な健康状態と関連する。

ある態様によれば、１種類または複数種類のＲＮＡは、ガイドＲＮＡである。ある態様によれば、１種類または複数種類のＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ融合体である。

ある態様によれば、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである。

ある態様によれば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質である。ある態様によれば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質はヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質である。

ある態様によれば、
ＤＮＡ標的核酸中の近接している部位にそれぞれ相補的である２種類以上のＲＮＡをコードする第１の外来核酸を細胞に導入すること、および
直交性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼであってもよい少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼをコードし、且つ前記２種類以上のＲＮＡによってガイドされる、第２の外来核酸を細胞に導入することを含み、
前記２種類以上のＲＮＡおよび前記少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが発現し、
前記少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが、前記２種類以上のＲＮＡと共に前記ＤＮＡ標的核酸に共局在し、前記ＤＮＡ標的核酸にニックを入れて２つ以上の近接するニックを生じさせる、
細胞においてＤＮＡ標的核酸を改変する方法が提供される。

ある態様によれば、
ＤＮＡ標的核酸中の近接している部位にそれぞれ相補的である２種類以上のＲＮＡをコードする第１の外来核酸を細胞に導入すること、および
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼをコードし、且つ２種類以上のＲＮＡによってガイドされる、第２の外来核酸を細胞に導入することを含み、
前記２種類以上のＲＮＡおよびＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの前記少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが発現し、
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの前記少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが、前記２種類以上のＲＮＡと共に前記ＤＮＡ標的核酸に共局在し、前記ＤＮＡ標的核酸にニックを入れて２つ以上の近接するニックを生じさせる、
細胞においてＤＮＡ標的核酸を改変する方法が提供される。

ある態様によれば、
ＤＮＡ標的核酸中の近接している部位にそれぞれ相補的である２種類以上のＲＮＡをコードする第１の外来核酸を細胞に導入すること、および
１つの不活性ヌクレアーゼドメインを有し、且つ２種類以上のＲＮＡによってガイドされる、少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッカーゼをコードする第２の外来核酸を細胞に導入することを含み、
前記２種類以上のＲＮＡおよび前記少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッカーゼが発現し、
前記少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッカーゼが、前記２種類以上のＲＮＡと共に前記ＤＮＡ標的核酸に共局在して、前記ＤＮＡ標的核酸にニックを形成することにより２つ以上の近接するニックを生じさせる、
細胞においてＤＮＡ標的核酸を改変する方法が提供される。

ＤＮＡ標的核酸を改変する方法によれば、２つ以上の近接するニックは二本鎖ＤＮＡの同じストランド上に存在する。ある態様によれば、２つ以上の近接するニックは二本鎖ＤＮＡの同じストランド上に存在して、相同組換えを引き起こす。ある態様によれば、２つ以上の近接するニックは二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在する。ある態様によれば、２つ以上の近接するニックは二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在して、二本鎖切断を生じさせる。ある態様によれば、２つ以上の近接するニックは二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在して、二本鎖切断を生じさせて非相同末端結合を引き起こす。ある態様によれば、２つ以上の近接するニックは、二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、且つ互いにオフセット（offset）である。ある態様によれば、２つ以上の近接するニックは、二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、互いにオフセットであり、且つ二本鎖ＤＮＡ切断を生じさせる。ある態様によれば、２つ以上の近接するニックは、二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、互いにオフセットであり、且つ二本鎖切断を生じさせて非相同末端結合を引き起こす。ある態様によれば、前記方法は、ドナー核酸配列をコードする第３の外来核酸を細胞に導入することをさらに含み、２つ以上のニックにより、ドナー核酸配列と標的核酸の相同組換えが引き起こされる。

ある態様によれば、
ＤＮＡ標的核酸中の近接している部位にそれぞれ相補的である２種類以上のＲＮＡをコードする第１の外来核酸を細胞に導入すること、および
少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼをコードし、且つ前記２種類以上のＲＮＡによってガイドされる、第２の外来核酸を前記細胞に導入することを含み、
前記２種類以上のＲＮＡおよび前記少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが発現し、
前記少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが前記２種類以上のＲＮＡと共にＤＮＡ標的核酸に共局在し、ＤＮＡ標的核酸にニックを入れて２つ以上の近接するニックを生じさせ、
２つ以上の近接するニックが、二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、二本鎖ＤＮＡ切断を生じさせて前記標的核酸の断片化を引き起こすことによって前記標的核酸の発現を妨げる、
細胞においてＤＮＡ標的核酸を改変する方法が提供される。

ある態様によれば、
ＤＮＡ標的核酸中の近接している部位にそれぞれ相補的である２種類以上のＲＮＡをコードする第１の外来核酸を細胞に導入すること、および
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼをコードし、且つ前記２種類以上のＲＮＡによってガイドされる、第２の外来核酸を細胞に導入することを含み、
前記２種類以上のＲＮＡおよびＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの前記少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが発現し、
前記ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの前記少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが、前記２種類以上のＲＮＡと共に前記ＤＮＡ標的核酸に共局在し、前記ＤＮＡ標的核酸にニックを入れて２つ以上の近接するニックを生じさせ、
前記２つ以上の近接するニックが、二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、二本鎖切断を生じさせて前記標的核酸の断片化を引き起こすことによって前記標的核酸の発現を妨げる、
細胞においてＤＮＡ標的核酸を改変する方法が提供される。

ある態様によれば、
ＤＮＡ標的核酸中の近接している部位にそれぞれ相補的である２種類以上のＲＮＡをコードする第１の外来核酸を細胞に導入すること、および
１つの不活性ヌクレアーゼドメインを有する少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッカーゼをコードし、且つ前記２種類以上のＲＮＡによってガイドされる、第２の外来核酸を細胞に導入することを含み、
前記２種類以上のＲＮＡおよび前記少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッカーゼが発現し、
前記少なくとも１種類のＣａｓ９タンパク質ニッカーゼが、前記２種類以上のＲＮＡと共に前記ＤＮＡ標的核酸に共局在し、前記ＤＮＡ標的核酸にニックを入れて２つ以上の近接するニックを生じさせ、
前記２つ以上の近接するニックが、二本鎖ＤＮＡの異なるストランド上に存在し、二本鎖切断を生じさせて前記標的核酸の断片化を引き起こすことによって前記標的核酸の発現を妨げる、
細胞においてＤＮＡ標的核酸を改変する方法が提供される。

ある態様によれば、
ＤＮＡ標的核酸中の近接している部位にそれぞれ相補的である２種類以上のＲＮＡをコードする第１の外来核酸、および
少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼをコードする第２の外来核酸を含み、
前記２種類以上のＲＮＡおよび前記少なくとも１種類のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼが、前記ＤＮＡ標的核酸に対する共局在複合体の構成要素である、
細胞が提供される。

ある態様によれば、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼである。ある態様によれば、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼは、１つの不活性ヌクレアーゼドメインを有するＣａｓ９タンパク質ニッカーゼである。

ある態様によれば、細胞は、真核細胞である。ある態様によれば、細胞は、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である。ある態様によれば、細胞は、哺乳動物細胞である。

ある態様によれば、ＲＮＡは約１０〜約５００ヌクレオチドを含む。ある態様によれば、ＲＮＡは約２０〜約１００ヌクレオチドを含む。

ある態様によれば、標的核酸は疾患または有害な健康状態と関連する。

ある態様によれば、２種類以上のＲＮＡは、ガイドＲＮＡである。ある態様によれば、２種類以上のＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ融合体である。

ある態様によれば、ＤＮＡ標的核酸は、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである。

ある態様によれば、方法は、直交性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼ、直交性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼ、直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質の併用を含んでいてもよい。したがって、同一の細胞において、ＤＮＡのニック形成または切断および翻訳の仲介によって生じる改変がなされ得る。さらに、エレクトロポレーションなどの細胞に核酸を導入する当業者に公知の方法を用いて１種類以上または複数種類の外来性ドナー核酸を細胞に添加してもよく、相同組換えなどの組換えまたは当業者に公知のその他の機構により細胞のＤＮＡに１種類以上または複数種類の外来性ドナー核酸を導入してもよい。したがって、本明細書に記載されている複数の直交性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質の使用により、ニッキングまたは切断による単一細胞の改変、細胞中のＤＮＡへのドナー核酸の導入、遺伝子の転写制御が可能になる。

本発明の特定の実施形態のその他の特徴および利点は、以下の実施形態およびそれらの図面の説明において、および特許請求の範囲から、さらに十分に明らかになるであろう。

本実施形態の上記およびその他の特徴および利点は、添付されている図面と併せて、以下の例示的な実施形態の詳細な説明から、より十分に理解されるであろう。

ＲＮＡ誘導性転写活性化の模式図である。 ＲＮＡ誘導性転写活性化の模式図である。 レポーターコンストラクトのデザインである。 蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）および免疫蛍光アッセイ（ＩＦ）の両方によってアッセイした、Ｃａｓ９Ｎ−ＶＰ６４融合体がＲＮＡ誘導性転写活性化を示すことを表すデータを示す図である。 Ｃａｓ９Ｎ、ＭＳ２−ＶＰ６４、および適切なＭＳ２アプタマー結合部位を有するｇＲＮＡの存在下におけるレポーターコンストラクトのｇＲＮＡ配列特異的転写活性化を示すＦＡＣＳおよびＩＦによるアッセイデータを示す図である。 個々のｇＲＮＡおよび複数のｇＲＮＡによる転写誘導を表すデータを示す図である。 Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体およびＴＡＬＥによる標的化のランドスケープを評価する方法を示す図である。 Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体が平均してその標的配列中の１〜３個の変異に対して許容性があることを表すデータを示す図である。 Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体が、ＰＡＭ配列に局在するものを除いて、点変異にほとんど感受性がないことを表すデータを示す図である。 ２塩基のミスマッチの導入によってＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体活性が顕著に損なわれることを表すヒートプロットデータを示す図である。 １８塩基長のＴＡＬＥが平均してその標的配列中の１〜２個の変異に対して許容性があることを表すデータを示す図である。 １８塩基長のＴＡＬＥが、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と同様に、その標的中の１塩基のミスマッチにほとんど感受性がないことを表すデータを示す図である。 ２塩基のミスマッチの導入によって１８塩基長のＴＡＬＥの活性が顕著に損なわれることを表す、ヒートプロットデータを示す図である。 ガイドＲＮＡデザインの模式図である。 ５′オーバーハングを生じさせるオフセットニックおよび５′オーバーハングを生じさせるオフセットニックについての非相同末端結合の割合を表すデータを示す図である。 ５′オーバーハングを生じさせるオフセットニックおよび５′オーバーハングを生じさせるオフセットニックについての標的化の割合を表すデータを示す図である。 ＰＤＢ ＩＤ：４ＥＰ４（青）のＲｕｖＣのＤ７位の金属配位残基の模式図（左）、配位しているＭｇイオン（灰色の球）および３Ｍ７Ｋ由来のＤＮＡ（紫）を含むＰＤＢ ＩＤ：３Ｍ７Ｋ（オレンジ）およびＰＤＢ ＩＤ：４Ｈ９Ｄ（シアン）のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインの模式図（中央）、および分析した変異体のリスト（右）を示す図である。 ＣＡＳ９変異体ｍ３およびｍ４、ならびにそれら変異体のそれぞれとＶＰ６４との融合体のヌクレアーゼ活性が検出不能であることを表すデータを示す図である。 図４Ｂのデータの高分解能検査を示す図である。 Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ活性を決定するための相同組換えアッセイの模式図である。 ランダム配列挿入を有するガイドＲＮＡおよび相同組換えの割合を示す図である。 ＯＣＴ４遺伝子のガイドＲＮＡの模式図である。 プロモーター・ルシフェラーゼレポーターコンストラクトでの転写活性化を示す図である。 転写活性化を内在性遺伝子のｑＰＣＲにより示す図である。 ＲＥＸ１遺伝子用のガイドＲＮＡの模式図である。 プロモーター・ルシフェラーゼレポーターコンストラクトの転写活性化を示す図である。 ｑＰＣＲによって内在性遺伝子の転写活性化を示す図である。 標準化された発現レベルを算出するための多段階特異性分析処理フローを模式的に示す図である。 バイアスがかけられたコンストラクトライブラリー内に生じたミスマッチの数に対する結合部位の割合の分布データを示す図である。左：理論的分布。右：実際のＴＡＬＥコンストラクトライブラリーで観察された分布。 ミスマッチの数に対する、結合部位に集計したタグの数の割合の分布データを示す図である。左：陽性対照試料で観察された分布。右：対照でないＴＡＬＥが誘導された試料で観察された分布。 標的配列中の１〜３個の変異に許容性を示す、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の標的化グランドスケープの分析のデータを示す図である。 ＰＡＭ配列に局在しているものを除いて、点変異への感受性がないことを示すＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の標的化ランドスケープの分析データを示す図である。 ２塩基のミスマッチの導入により活性が顕著に損なわれることを示す、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の標的化ランドスケープの分析のヒートプロットデータを示す図である。 ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）のＣａｓ９の予想されるＰＡＭがＮＧＧであり、またＮＡＧであることを確認する、ヌクレアーゼ介在性ＨＲアッセイのデータを示す図である。 １８塩基長のＴＡＬＥがそれらの標的配列中の複数の変異に対して許容性があることを確認する、ヌクレアーゼ介在性ＨＲアッセイのデータを示す図である。 ３つの異なるサイズ（１８塩基長、１４塩基長、および１０塩基長）のＴＡＬＥの標的化ランドスケープの分析のデータを示す図である。 ほぼ１塩基ミスマッチの分解能を示す１０塩基長のＴＡＬＥのデータを示す図である。 ほぼ１塩基ミスマッチの分解能を示す１０塩基長のＴＡＬＥのヒートプロットデータを示す図である。 デザインされたガイドＲＮＡを示す図である。 種々のガイドＲＮＡの非相同末端結合のパーセンテージを示す図である。 推定上の直交性Ｃａｓ９タンパク質の比較および特徴を示す図である。図１２Ａ：ＳＰ、ＳＴ１、ＮＭ、およびＴＤの反復配列。保存度を示すように塩基が着色されている。 大腸菌中でのＣａｓ９タンパク質の特徴解析に用いたプラスミド。 スペーサーとプロトスペーサーがマッチする場合、Ｃａｓ９による切断によってライブラリーから機能性ＰＡＭが除去される。 標的化プラスミドのスペーサーとライブラリーのプロトスペーサーがマッチしない場合、Ｃａｓ９は切断しない。 非機能性のＰＡＭは切断または除去されない。 ＰＡＭを特定するための選択スキーム。Ｃａｓ９タンパク質および２つのスペーサー含有標的化プラスミドの一方を発現する細胞を、対応するプロトスペーサーを有する２つのライブラリーの一方で形質転換し、抗生物質選択を行った。生存している切断されなかったプラスミドのディープシークエンシングを行った。マッチしないプロトスペーサーライブラリーに対するマッチするプロトスペーサーライブラリー内の各配列の相対的存在量を比較することにより、Ｃａｓ９によるＰＡＭ除去を定量化した。 Ｃａｓ９タンパク質によるライブラリーからの機能性プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の除去を示す図である。マッチするスペーサー・プロトスペーサー対の各位置における各塩基の対数頻度が、スペーサーとプロトスペーサーがマッチしない対照条件に対してプロットされる。結果は、２つの別個のプロトスペーサー配列（図１３Ｄ）に基づいた、ＮＭによるライブラリーの平均除去を反映する。 Ｃａｓ９タンパク質によるライブラリーからの機能性プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の除去を示す図である。マッチするスペーサー・プロトスペーサー対の各位置における各塩基の対数頻度が、スペーサーとプロトスペーサーがマッチしない対照条件に対してプロットされる。結果は、２つの別個のプロトスペーサー配列（図１３Ｄ）に基づいた、ＳＴ１によるライブラリーの平均除去を反映する。 Ｃａｓ９タンパク質によるライブラリーからの機能性プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の除去を示す図である。マッチするスペーサー・プロトスペーサー対の各位置における各塩基の対数頻度が、スペーサーとプロトスペーサーがマッチしない対照条件に対してプロットされる。結果は、２つの別個のプロトスペーサー配列（図１３Ｄ）に基づいた、ＴＤによるライブラリーの平均除去を反映する。 各Ｃａｓ９タンパク質について、各プロトスペーサーに対する特異的配列の除去が独立してプロットされる。 各Ｃａｓ９タンパク質について、各プロトスペーサーに対する特異的配列の除去が独立してプロットされる。 各Ｃａｓ９タンパク質について、各プロトスペーサーに対する特異的配列の除去が独立してプロットされる。 ＮＭによる転写抑制を示す図である。抑制を定量化するために用いるレポータープラスミド。 ＮＭによる転写抑制を示す図である。マッチおよびミスマッチのスペーサー・プロトスペーサー対について標準化された細胞蛍光。エラーバーは５回反復実験の標準偏差を表す。 大腸菌中でのｃｒＲＮＡの直交認識を示す図である。Ｃａｓ９およびｃｒＲＮＡの全ての組合せを有する細胞を、マッチまたはミスマッチのプロトスペーサーおよび適切なＰＡＭを有するプラスミドに曝した。マッチするスペーサーとプロトスペーサーの対からコロニーが確実に得られるように十分な細胞をプレーティングし、全コロニー数を用いて除去倍率を算出した。 ヒト細胞におけるＣａｓ９による遺伝子編集を示す図である。相同組換えアッセイを用いて遺伝子編集効率を定量化した。Ｃａｓ９によるプロトスペーサー内のＤＮＡ二本鎖切断は、ドナー鋳型を用いて分断型ＧＦＰカセットの修復を促進し、完全な（intact）ＧＦＰを有する細胞が生じた。各Ｃａｓ９についての的確なＰＡＭを準備するために、３種類の異なる鋳型を用いた。 各Ｃａｓ９についての的確なＰＡＭを準備するために、３種類の異なる鋳型を用いた。蛍光細胞をフローサイトメトリーにより定量化した。それぞれについてのｓｇＲＮＡと組み合わせた、ＮＭ、ＳＴ１、およびＴＤの細胞選別の結果。各Ｃａｓ９に対するプロトスペーサーおよびＰＡＭ配列が各セットの上に示される。各プロットの右上隅に修復効率が示される。 ヒト細胞における転写活性化を示す図である。ｔｄＴｏｍａｔｏ誘導性（driving）ミニマルプロモーターを特徴とする転写活性化のためのレポーターコンストラクト。プロトスペーサーおよびＰＡＭ配列をミニマルプロモーターの上流に配置した。 プロトスペーサーへのヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９−ＶＰ６４融合タンパク質の結合により、転写が活性化し、蛍光が増大した。Ｃａｓ９活性化因子およびｓｇＲＮＡの全ての組合せで細胞に遺伝子導入し、ｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光を可視化した。それぞれのＣａｓ９が自身のｓｇＲＮＡと対になった場合にのみ転写が活性化された。

本明細書に列挙される補足文献は上付き数字で参照されることがある。上付き文字は、特定の記載を補足するために完全に記載されている場合と同様に、参照文献を参照するものであると理解されるべきである。

細菌および古細菌のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ウイルスＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡの断片のＣＲＩＳＰＲ座位への取り込み、転写されたｃｒＲＮＡを用いてヌクレアーゼをガイドして相同配列を分解することにより、獲得免疫を付与する^１、２。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムでは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化型ｃｒＲＮＡ）との三元複合体が、ｃｒＲＮＡスペーサーにマッチし且つ短いプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含むｄｓＤＮＡプロトスペーサー配列に結合して、これを切断する^３、４。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを融合することにより、Ｃａｓ９を標的とするのに十分な単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が生成する^４。

Ｃａｓ９は、ＲＮＡ誘導型のヌクレアーゼおよびニッカーゼとして、種々の生物における標的遺伝子の編集^５〜９および選択^１０用に適応されてきた。これらの成功例はほぼ間違いなく革新的であるが、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９変異体は、タンパク質およびＲＮＡをほぼ全ての一連のｄｓＤＮＡ配列に局在化させる能力のため、生物学的システムの制御のための多大な汎用性を提供するので^{１１〜１７}、制御目的のために有用である。細菌におけるプロモーターおよび５′ＵＴＲの妨害による標的遺伝子抑制に始まり^１８、Ｃａｓ９による制御は、ヒト細胞におけるＶＰ６４^１９動員による転写活性化にまで及んでいる^１９。ある態様によれば、直交性Ｃａｓ９タンパク質などの直交性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質を含む本明細書に記載のＤＮＡ結合タンパク質は、転写活性化因子、抑制因子、蛍光タンパク質標識、染色体連結（tether）、および当業者に公知の多くの他のツールと共に用いられてもよい。この態様によれば、直交性Ｃａｓ９の使用により、あらゆる転写活性化因子、抑制因子、蛍光タンパク質標識、染色体連結、および当業者に公知の多くの他のツールを用いた遺伝子修飾が可能になる。したがって、本開示の態様は、多重的なＲＮＡ誘導性の転写活性化、抑制、および遺伝子編集のための直交性Ｃａｓ９タンパク質の使用に関する。

本開示の実施形態は、細菌およびヒト細胞における複数のＣａｓ９タンパク質間の直交性の特徴解析および実証に関する。そのような直交性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質は、個々の細胞のＤＮＡ中の複数の遺伝子を同時に且つ独立して転写制御、標識、または編集するために、複数またはセットで使用され得る。

ある態様によれば、ＣＲＩＳＰＲシステムの単一のファミリー内から複数の直交性Ｃａｓ９タンパク質が特定される。ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）、ナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（S. thermophilus）、およびトレポネーマ・デンティコラ（T. denticola）由来の例示的Ｃａｓ９タンパク質は、明白に関係しているが、長さが３．２５ｋｂ〜４．６ｋｂであり、完全に異なるＰＡＭ配列を認識する。

本開示の実施形態は、標的核酸を制御するようにＤＮＡに転写制御タンパク質またはドメインを共局在化させるためのＤＮＡ結合タンパク質の使用に基づく。当業者には、種々の目的のためにＤＮＡに結合させるためのそのようなＤＮＡ結合タンパク質が容易に理解される。そのようなＤＮＡ結合タンパク質は天然のものであってよい。本開示の範囲に含まれるＤＮＡ結合タンパク質としては、本明細書中でガイドＲＮＡと呼ぶＲＮＡによってガイドされ得るタンパク質が挙げられる。この態様によれば、ガイドＲＮＡおよびＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡにおいて共局在複合体を形成する。ある態様によれば、ＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質であってもよい。この態様によれば、ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ結合タンパク質の改変または修飾によって生じたものであってもよい。ヌクレアーゼ活性を有するそのようなＤＮＡ結合タンパク質は、当業者に公知であり、例えばＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中に存在する、Ｃａｓ９タンパク質などのヌクレアーゼ活性を有する天然のＤＮＡ結合タンパク質が挙げられる。そのようなＣａｓ９タンパク質およびＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、当該技術分野で十分に裏付けられている。その全体が参照により援用される、全ての追加情報を含む、Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, Vol. 9, June 2011, pp. 467-477を参照されたい。

ある態様によれば、直交性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの直交性ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質、直交性ｃａｓ９タンパク質など、それぞれがヌクレアーゼ活性型またはヌクレアーゼ欠損型であってもよい、２種類以上もしくは複数種類、または一組の直交性ＤＮＡ結合タンパク質を特定する方法が提供される。ある態様によれば、２種類以上もしくは複数種類、または一組の直交性ＤＮＡ結合タンパク質は、同時に且つ独立して、細胞内の遺伝子を制御または核酸を編集するために、対応するガイドＲＮＡと共に用いられてもよい。ある態様によれば、２種類以上もしくは複数種類、または一組の直交性ＤＮＡ結合タンパク質、対応するガイドＲＮＡ、および２種類以上もしくは複数種類、または一組の対応する転写制御因子またはドメインをコードする核酸を細胞に導入してもよい。このようにして、同一細胞において並行して多くの遺伝子を制御または編集の標的とすることができる。ゲノムＤＮＡの編集方法は当業者に周知である。

ヌクレアーゼ活性を有する例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、二本鎖ＤＮＡにニックを形成するか、または二本鎖ＤＮＡを切断するように機能する。そのようなヌクレアーゼ活性は、ヌクレアーゼ活性を示す１つまたは複数のポリペプチド配列を有するＤＮＡ結合タンパク質から生じ得る。そのような例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、それぞれが二本鎖ＤＮＡの特定のストランドを切断すること、またはニックを形成することに関与する、２つの別個のヌクレアーゼドメインを有していてもよい。当業者に知られているヌクレアーゼ活性を有する例示的なポリペプチド配列としては、ＭｃｒＡ−ＨＮＨヌクレアーゼ関連ドメインおよびＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインが挙げられる。したがって、例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、ＭｃｒＡ−ＨＮＨヌクレアーゼ関連ドメインおよびＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインのうち１つまたは複数を含む天然タンパク質である。ある態様によれば、ＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を不活性化するために改変または修飾される。そのような改変または修飾には、ヌクレアーゼ活性またはヌクレアーゼドメインを不活性化するために１つまたは複数のアミノ酸の改変することが含まれる。そのような修飾には、ヌクレアーゼ活性を示す単数または複数のポリペプチド配列、すなわちヌクレアーゼドメインが、ＤＮＡ結合タンパク質に存在しないように、ヌクレアーゼ活性を示す単数または複数のポリペプチド配列、すなわちヌクレアーゼドメインを除去することが含まれる。ヌクレアーゼ活性を不活性化するためのその他の修飾は、本開示に基づき当業者に容易に明らかになるであろう。したがって、ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質には、ヌクレアーゼ活性を不活性化するように修飾されたポリペプチド配列、またはヌクレアーゼ活性を不活性化するために単数または複数のポリペプチド配列を除去することが含まれる。このヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性が不活性化されていても、ＤＮＡ結合能を保持している。したがって、ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡ結合に必要な単数または複数のポリペプチド配列を含んでいるが、ヌクレアーゼ活性を示すヌクレアーゼ配列のうちの１つ以上または全てを欠いていてもよい。したがって、ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡ結合に必要な単数または複数のポリペプチド配列を含んでいるが、不活性化されたヌクレアーゼ活性を示すヌクレアーゼ配列のうちの１つ以上または全てを有していてもよい。

ある態様によれば、２つ以上のヌクレアーゼドメインを有するＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼドメインのうちの１つを除いた全てが不活性化されるように修飾または改変されてもよい。そのような修飾または改変されたＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質が二本鎖ＤＮＡの一方のストランドのみを切断する、またはニックをいれるものである限り、ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼと呼ばれる。ＲＮＡによってＤＮＡにガイドされる場合、ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ニッカーゼと呼ばれる。

例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を欠いたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質である。例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質である。例示的なＤＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質ニッカーゼである。

ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）では、Ｃａｓ９は、タンパク質中の２つの触媒ドメイン、すなわちＤＮＡの相補鎖を切断するＨＮＨドメインおよび非相補鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインが介在するプロセスによって、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３ｂｐ上流に平滑末端二本鎖切断を形成する。その全体が参照により援用されるJinke et al., Science 337, 816-821 (2012)を参照されたい。Ｃａｓ９タンパク質は、Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology, Vol. 9, June 2011, pp. 467-477の補足情報で確認されている以下のものを含む、多数のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中に存在することが知られている。メタノコッカス・マリパルディス（Methanococcus maripaludis）Ｃ７株；コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Corynebacterium diphtheriae）；コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）ＹＳ−３１４株；コリネバクテリウム・グルタニカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２ Ｋｉｔａｓａｔｏ株；コリネバクテリウム・グルタニカム ＡＴＣＣ１３０３２ Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ株；コリネバクテリウム・グルタニカム Ｒ株；コリネバクテリウム・クロッペンステッティイ（Corynebacterium kroppenstedtii）ＤＳＭ４４３８５株；マイコバクテリウム・アブセサス（Mycobacterium abscessus）ＡＴＣＣ１９９７７株；ノカルディア・ファルシニカ（Nocardia farcinica）ＩＦＭ１０１５２株；ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）ＰＲ４株；ロドコッカス・ジョスティイ（Rhodococcus jostii）ＲＨＡ１株；ロドコッカス・オパカス（Rhodococcus opacus）Ｂ４ ｕｉｄ３６５７３株；アシドサーマス・セルロリティカス（Acidothermus cellulolyticus）１１Ｂ株；アルスロバクター・クロロフェノリカス（Arthrobacter chlorophenolicus）Ａ６株；クリベラ・フラビダ（Kribbella flavida）ＤＳＭ１７８３６ ｕｉｄ４３４６５株；サーモモノスポラ・カーバタ（Thermomonospora curvata）ＤＳＭ４３１８３株；ビフィドバクテリウム・デンティウム（Bifidobacterium dentium）Ｂｄ１株；ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）ＤＪＯ１０Ａ株；スラッキア・ヘリオトリニレデューセンス（Slackia heliotrinireducens）ＤＳＭ２０４７６株；パーセフォネラ・マリナ（Persephonella marina）ＥＸ Ｈ１株；バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）ＮＣＴＣ９４３４株；カプノサイトファガ・オクラセア（Capnocytophaga ochracea）ＤＳＭ７２７１株；フラボバクテリウム・サイクロフィルム（Flavobacterium psychrophilum）ＪＩＰ０２ ８６株；アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）ＡＴＣＣ ＢＡＡ８３５株；ロゼイフレクサス・キャステンホルツィイ（Roseiflexus castenholzii）ＤＳＭ１３９４１株；ロゼイフレクサス（Roseiflexus）ＲＳ１株；シネコシスティス（Synechocystis）ＰＣＣ６８０３株； エルシミクロビウム・ミヌトゥム（Elusimicrobium minutum）Ｐｅｉ１９１株；未培養細菌Ｔｅｒｍｉｔｅ ｇｒｏｕｐ１ ｐｈｙｌｏｔｙｐｅ Ｒｓ‐Ｄ１７；フィブロバクター・サクシノゲネス（Fibrobacter succinogenes）Ｓ８５株；バチルス・セレウス（Bacillus cereus）ＡＴＣＣ１０９８７株；リステリア・イノキュア（Listeria innocua）；ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）；ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）ＧＧ株；ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）ＵＣＣ１１８株；ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Streptococcus agalactiae）Ａ９０９株；ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Streptococcus agalactiae）ＮＥＭ３１６株；ストレプトコッカス・アガラクティアエ ２６０３株；ストレプトコッカス・ディスガテクティアエ亜種エクイシミリス（Streptococcus dysgalactiae equisimilis）ＧＧＳ１２４株；ストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス（Streptococcus equi zooepidemicus）ＭＧＣＳ１０５６５株；ストレプトコッカス・カプリナス（Streptococcus gallolyticus）ＵＣＮ３４ ｕｉｄ４６０６１；ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii）Ｃｈａｌｌｉｓ ｓｕｂｓｔ ＣＨ１株；ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）ＮＮ２０２５ ｕｉｄ４６３５３株；ストレプトコッカス・ミュータンス；ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Ｍ１ ＧＡＳ株；ストレプトコッカス・ピオゲネス ＭＧＡＳ５００５株；ストレプトコッカス・ピオゲネス ＭＧＡＳ２０９６株；ストレプトコッカス・ピオゲネス ＭＧＡＳ９４２９株；ストレプトコッカス・ピオゲネス ＭＧＡＳ１０２７０株；ストレプトコッカス・ピオゲネス ＭＧＡＳ６１８０株；ストレプトコッカス・ピオゲネス ＭＧＡＳ３１５株；ストレプトコッカス・ピオゲネス ＳＳＩ−１株；ストレプトコッカス・ピオゲネス ＭＧＡＳ１０７５０株；ストレプトコッカス・ピオゲネス ＮＺ１３１株；ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophiles）ＣＮＲＺ１０６６株；ストレプトコッカス・サーモフィラス ＬＭＤ−９株；ストレプトコッカス・サーモフィラス ＬＭＧ１８３１１株；クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）Ａ３ Ｌｏｃｈ Ｍａｒｅｅ株；クロストリジウム・ボツリヌム Ｂ Ｅｋｌｕｎｄ １７Ｂ株；クロストリジウム・ボツリヌム Ｂａ４ ６５７株；クロストリジウム・ボツリヌム Ｆ Ｌａｎｇｅｌａｎｄ株；クロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）Ｈ１０株；フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）ＡＴＣＣ２９３２８株；ユウバクテリウム・レクターレ（Eubacterium rectale）ＡＴＣＣ３３６５６株；マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma gallisepticum）；マイコプラズマ・モービレ（Mycoplasma mobile）１６３Ｋ株；マイコプラズマ・ペネトランス（Mycoplasma penetrans）；マイコプラズマ・シノビアエ（Mycoplasma synoviae）５３株；ストレプトバチルス・モニリフォルミス（Streptobacillus moniliformis）ＤＳＭ１２１１２株；ブラジリゾビウム（Bradyrhizobium）ＢＴＡｉｌ株；ニトロバクター・ハンブルゲンシス（Nitrobacter hamburgensis）Ｘ１４株；ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）ＢｉｓＢ１８株；ロドシュードモナス・パルストリス ＢｉｓＢ５株；パルビバクラム・ラバメンティボランス（Parvibaculum lavamentivorans）ＤＳ−１株；ディノロセオバクター・シバエ（Dinoroseobacter shibae）ＤＦＬ１２株；グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Gluconacetobacter diazotrophicus）Ｐａｌ５ ＦＡＰＥＲＪ株；グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス Ｐａｌ５ ＪＧＩ株；アゾスピリルム（Azospirillum）５１０ ｕｉｄ４６０８５株；ロドスピリラム・ルブラム（Rhodospirillum rubrum）ＡＴＣＣ１１１７０株；ディアフォロバクター（Diaphorobacter）ＴＰＳＹ ｕｉｄ２９９７５株；フェルミネフォロバクター・エイセニアエ（Verminephrobacter eiseniae）ＥＦ０１−２株；ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitides）０５３４４２株；ナイセリア・メニンジティディス ａｌｐｈａ １４株；ナイセリア・メニンジティディス Ｚ２４９１株；デスルホビブリオ・サレキシゲンス（Desulfovibrio salexigens）ＤＳＭ２６３８株；キャンピロバククー・ジェジュニ亜種ドイレイ（Campylobacter jejunidoylei）２６９ ９７株；キャンピロバククー・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）８１１１６株；キャンピロバククー・ジェジュニ；キャンピロバクター・ラリ（Campylobacter lari）ＲＭ２１００株；ヘリコバクター・ヘパティカス（Helicobacter hepaticus）；ウォリネラ・サクシノゲネス（Wolinella succinogenes）；トルモナス・アウエンシス（Tolumonas auensis）ＤＳＭ９１８７株；シュードアルテロモナス・アトランティカ（Pseudoalteromonas atlantica）Ｔ６ｃ株；シューワネラ・ペアレアナ（Shewanella pealeana）ＡＴＣＣ７００３４５株；レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）Ｐａｒｉｓ株；アクチノバチルス・サクシノゲネス（Actinobacillus succinogenes）１３０Ｚ株；パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）；フランシセラ・ツラレンシス亜種ノビシダ（Francisella tularensis novicida）Ｕ１１２株；フランシセラ・ツラレンシス亜種ハラークティカ（Francisella tularensis holarctica）；フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis）ＦＳＣ１９８株；フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis tularensis）；フランシセラ・ツラレンシス ＷＹ９６−３４１８株；およびトレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）ＡＴＣＣ３５４０５株。したがって、本開示の態様は、本明細書に記載されるようにヌクレアーゼ欠損にされたまたはニッカーゼにされた、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム中に存在するＣａｓ９タンパク質に関する。

Ｃａｓ９タンパク質は、文献中で当業者にＣｓｎ１と呼ばれることもある。本明細書に記載される実験の対象であるストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）のＣａｓ９タンパク質の配列を以下に示す。その全体が参照により援用されるDeltcheva et al., Nature 471, 602-607 (2011)を参照されたい。

本明細書に記載されるＲＮＡ誘導性ゲノム制御方法のある態様によれば、Ｃａｓ９は、ヌクレアーゼ活性を低下させるよう、実質的に低下させるよう、または除去するように改変される。そのようなＣａｓ９は、例えば２種類以上のＣａｓ９タンパク質が想定される場合は、直交性Ｃａｓ９であってもよい。この文脈では、２種類以上もしくは複数種類、または一組の直交性Ｃａｓ９タンパク質が、本明細書に記載の方法で使用されてもよい。ある態様によれば、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインまたはＨＮＨヌクレアーゼドメインを改変することによって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を低下させる、実質的に低下させる、または除去する。ある態様によれば、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインが不活性化される。ある態様によれば、ＨＮＨヌクレアーゼドメインが不活性化される。ある態様によれば、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインが不活性化される。別の態様によれば、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインが不活性化されたＣａｓ９タンパク質が提供される。別の態様によれば、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインが不活性化されている限りにおいて、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質が提供される。別の態様によれば、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインまたはＨＮＨヌクレアーゼドメインのいずれかが不活性化されることにより、残りのヌクレアーゼドメインのヌクレアーゼ活性が活性型のままである、Ｃａｓ９ニッカーゼが提供される。これにより、二本鎖ＤＮＡの一方のストランドだけが切断されるか、またはニック形成される。

別の態様によれば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質をもたらす、Ｃａｓ９中の１つまたは複数のアミノ酸が改変または除去された、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質が提供される。ある態様によれば、それらのアミノ酸にはＤ１０およびＨ８４０が含まれる。Jinke et al., Science 337, 816-821 (2012)を参照されたい。別の態様によれば、それらのアミノ酸にはＤ８３９およびＮ８６３が含まれる。ある態様によれば、Ｄ１０、Ｈ８４０、Ｄ８３９、およびＨ８６３のうちの１つ以上または全てが、ヌクレアーゼ活性を低下させるか、実質的に除去するか、または除去するアミノ酸で置換される。ある態様によれば、Ｄ１０、Ｈ８４０、Ｄ８３９、およびＨ８６３のうちの１つもしくは複数、または全てがアラニンで置換される。ある態様によれば、Ｄ１０、Ｈ８４０、Ｄ８３９、およびＨ８６３のうちの１つ以上または全てが、アラニンなど、ヌクレアーゼ活性を低下させるか、実質的に除去するか、または除去するアミノ酸で置換されたＣａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９またはＣａｓ９Ｎと呼ばれ、ヌクレアーゼ活性が低下している、または除去されているか、ヌクレアーゼ活性が検出レベル内にないか、または実質的にない。この態様によれば、Ｃａｓ９Ｎのヌクレアーゼ活性は、公知のアッセイを用いて検出出来ないことがある、すなわち公知のアッセイの検出レベル未満であり得る。

ある態様によれば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質には、ＤＮＡに結合し且つＲＮＡによってガイドされ、タンパク質の能力を保持している、そのホモログまたはオルソログが含まれる。ある態様によれば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質としては、ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）由来の天然Ｃｓａ９について記載されるような、Ｄ１０、Ｈ８４０、Ｄ８３９、およびＨ８６３のうちの１つもしくは複数、または全てがアラニンで置換された配列、およびその配列に対して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の相同性を有し、且つＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質などのＤＮＡ結合タンパク質である、タンパク質配列が挙げられる。

ある態様によれば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインのタンパク質配列を除いたストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）由来の天然Ｃａｓ９について記載されるような配列、およびさらにその配列に対して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の相同性を有し、且つＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質などのＤＮＡ結合タンパク質である、タンパク質配列を含む。これにより、本開示の態様は、例えばガイドＲＮＡとの共局在およびＤＮＡへの結合など、ＤＮＡ結合に関与するタンパク質配列およびその配列に相同なタンパク質配列を含む。本開示の態様は、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質を作製するためには、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインは不活性化されるか、または天然Ｃａｓ９タンパク質のタンパク質配列から除去されるかのいずれかであり得るので、（ＤＮＡ結合に必要とされない限り）これらのドメインを含む必要がない。

本開示の目的のために、Ｃａｓ９に対する相同性を有する公知のタンパク質構造中の金属配位残基を図４Ａに示す。Ｃａｓ９配列中の位置に基づいて残基が表示されている。左：ＰＤＢ ＩＤ：４ＥＰ４のＲｕｖＣ構造（青）。Ｃａｓ９配列中のＤ１０に対応する位置Ｄ７は、Ｍｇイオン配位位置で強調されている。中央：ＰＤＢ ＩＤ：３Ｍ７Ｋ（オレンジ）およびＰＤＢ ＩＤ：４Ｈ９Ｄ（シアン）のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインの構造であり、配位Ｍｇイオン（灰色の球）および３Ｍ７ＫのＤＮＡ（紫）を含む。３Ｍ７Ｋ中の残基Ｄ９２およびＮ１１３、ならびに４Ｈ９Ｄの位置Ｄ５３およびＮ７７は、Ｃａｓ９アミノ酸Ｄ８３９およびＮ８６３に対する配列相同性を有し、棒で示されている。右：ヌクレアーゼ活性について、作製されて分析された変異体のリストである。野生型Ｃａｓ９、Ｄ１０をアラニンで置換したＣａｓ９_ｍ１、Ｄ１０をアラニンで置換し、Ｈ８４０をアラニンで置換したＣａｓ９_ｍ２、Ｄ１０をアラニンで、Ｈ８４０をアラニンで、およびＤ８３９をアラニンで置換したＣａｓ９_ｍ３、ならびにＤ１０をアラニンで、Ｈ８４０をアラニンで、Ｄ８３９をアラニンで、およびＮ８６３をアラニンで置換したＣａｓ９_ｍ４。

図４Ｂに示されるように、Ｃａｓ９変異体：ｍ３およびｍ４、ならびにそれらのそれぞれとＶＰ６４との融合体は、標的座位についてのディープシークエンシングにより、検出不能なヌクレアーゼ活性が示された。ｇＲＮＡ標的を決定する赤色の線と共に、ゲノム上の位置に対する変異頻度をプロットで示す。図４Ｃは、図４Ｂのデータのより高分解能の試験を示す図であり、変異ランドスケープが非改変座位と同等のプロファイルを示すことが確認される。

ある態様によれば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９またはガイドＲＮＡのいずれかに転写活性化ドメインを連結（tether）することによってヒト細胞におけるＲＮＡ誘導性ゲノム制御を可能にする、改変されたＣａｓ９−ｇＲＮＡシステムが提供される。本開示のある態様によれば、１種類または複数種類の転写制御タンパク質またはドメイン（このような用語は互換的に使用される）が、ヌクレアーゼ欠損型Ｃａｓ９または１種類または複数種類のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と結合または接続される。これらの転写制御ドメインは標的座位に対応する。したがって、本開示の態様は、転写制御ドメインをＣａｓ９ＮまたはｇＲＮＡのいずれかに、融合、接続、または結合することによりそのようなドメインを標的座位に局在化させるための方法および材料を含む。

ある態様によれば、転写を活性化可能なＣａｓ９Ｎ融合タンパク質が提供される。ある態様によれば、ＶＰ６４活性化ドメイン（その全体が参照により援用されるZhang et al., Nature Biotechnology 29, 149-153 (2011)を参照のこと）が、Ｃａｓ９ＮのＣ末端に結合、融合、接続、または連結される。ある方法によれば、Ｃａｓ９Ｎタンパク質によって、標的ゲノムＤＮＡ部位に転写制御ドメインが提供される。ある方法によれば、転写制御ドメインに融合したＣａｓ９Ｎが、１種類または複数種類のガイドＲＮＡと共に細胞内に提供される。転写制御ドメインが融合したＣａｓ９Ｎは、標的ゲノムＤＮＡまたはその近くに結合する。１種類または複数種類のガイドＲＮＡは、標的ゲノムＤＮＡまたはその近くに結合する。転写制御ドメインは、標的遺伝子の発現を制御する。特定の態様によれば、Ｃａｓ９Ｎ−ＶＰ６４融合体は、プロモーター近辺の配列を標的とするｇＲＮＡと組み合わされた場合に、レポーターコンストラクトの転写を活性化して、ＲＮＡ誘導性転写を活性化した。

ある態様によれば、転写活性化可能なｇＲＮＡ融合タンパク質が提供される。ある態様によれば、ＶＰ６４活性化ドメインが、ｇＲＮＡに結合、融合、接続、または連結される。ある方法によれば、ｇＲＮＡによって、標的ゲノムＤＮＡの部位に転写制御ドメインが提供される。ある方法によれば、転写制御ドメインに融合したｇＲＮＡが、Ｃａｓ９Ｎタンパク質と共に細胞内に提供される。Ｃａｓ９Ｎは、標的ゲノムＤＮＡまたはその近くに結合する。転写制御タンパク質またはドメインが融合した１種類または複数種類のガイドＲＮＡが、標的ゲノムＤＮＡまたはその近くに結合する。転写制御ドメインは、標的遺伝子の発現を制御する。特定の態様によれば、転写制御ドメインが融合したｇＲＮＡおよびＣａｓ９Ｎタンパク質がレポーターコンストラクトの転写を活性化して、ＲＮＡ誘導型転写を活性化した。

転写を制御可能なｇＲＮＡ連結は、ランダム配列をｇＲＮＡに挿入し、Ｃａｓ９機能についてアッセイすることにより、そのｇＲＮＡのどの領域が修飾を許容するかを特定することによって構築された。キメラｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分の５′末端またはｔｒａｃｒＲＮＡ部分の３′末端のいずれかにランダム配列挿入を有するｇＲＮＡは機能を保持しており、一方、キメラｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡスキャフォールド部分への挿入は機能を喪失させる。ランダム塩基挿入に対するｇＲＮＡの柔軟性について要約した図５Ａ〜５Ｂを参照されたい。図５Ａは、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ活性を決定するための相同組換え（ＨＲ）アッセイの模式図である。図５Ｂに示されるように、キメラｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分の５′末端またはｔｒａｃｒＲＮＡ部分の３′末端のいずれかにランダム配列挿入を有するｇＲＮＡは機能性を保持しており、一方、キメラｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡスキャフォールド部分への挿入は機能を喪失させる。ｇＲＮＡ配列中の挿入の位置を赤いヌクレオチドで示す。科学的理論に拘束されることなく、５′末端でのランダム塩基挿入による活性の上昇は、ｇＲＮＡが長くなって半減期が延びたことによるものと考えられる。

ＶＰ６４をｇＲＮＡに結合させるために、２コピーのＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質結合性ＲＮＡステムループをｇＲＮＡの３′末端に付加した。その全体が参照により援用されるFusco et al., Current Biology: CB13, 161-167 (2003)を参照されたい。これらのキメラｇＲＮＡを、Ｃａｓ９ＮおよびＭＳ２−ＶＰ６４融合タンパク質と共発現させた。３成分全ての存在下で、レポーターコンストラクトの配列特異的転写活性化が観察された。

図１Ａは、ＲＮＡ誘導性転写活性化の模式図である。図１Ａに示されるように、転写を活性化可能なＣａｓ９Ｎ融合タンパク質を作製するために、ＶＰ６４活性化ドメインをＣａｓ９ＮのＣ末端に直接的に連結した。図１Ｂに示されるように、転写を活性化可能なｇＲＮＡテザーを作製するために、２コピーのＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質結合性ＲＮＡステムループをｇＲＮＡの３′末端に付加した。これらのキメラｇＲＮＡを、Ｃａｓ９ＮおよびＭＳ２−ＶＰ６４融合タンパク質と共発現させた。図１Ｃは、転写活性化のアッセイに用いるレポーターコンストラクトのデザインを示す。これら２種類のレポーターは、別個のｇＲＮＡ標的部位を有し、且つ、対照ＴＡＬＥ−ＴＦ標的部位を共有している。図１Ｄに示されるように、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）および免疫蛍光アッセイ（ＩＦ）の両アッセイにより、Ｃａｓ９Ｎ−ＶＰ６４融合体はＲＮＡ誘導性転写活性化を示す。具体的には、対照ＴＡＬＥ−ＴＦは両方のレポーターを活性化したが、Ｃａｓ９Ｎ−ＶＰ６４融合体はｇＲＮＡ配列特異的にレポーターを活性化する。図１Ｅに示されるように、３つの成分全て、すなわち、Ｃａｓ９Ｎ、ＭＳ２−ＶＰ６４、および適切なＭＳ２アプタマー結合部位を有するｇＲＮＡが存在する場合のみ、レポーターコンストラクトのｇＲＮＡ配列特異的転写活性化がＦＡＣＳおよびＩＦの両方によって観察された。

ある態様によれば、Ｃａｓ９Ｎ、種類または複数種類のｇＲＮＡ、および転写制御タンパク質またはドメインを用いて内在性遺伝子を制御する方法が提供される。ある態様によれば、内在性遺伝子は、任意の所望の遺伝子であってもよく、この遺伝子は本明細書では標的遺伝子と呼ばれる。ある例示的な態様によれば、制御の標的となる遺伝子には、いずれも多能性の維持に関与し、厳密に制御されている遺伝子であるＺＦＰ４２（ＲＥＸ１）およびＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ４）が含まれた。図１Ｆに示されるように、転写開始部位の上流の約５ｋｂ長のＤＮＡ鎖（ＤＮａｓｅ高感受性部位が緑色で強調されている）を標的とする１０種類のｇＲＮＡをＲＥＸ１遺伝子用にデザインした。プロモーター・ルシフェラーゼレポーターコンストラクトを用いて（その全体が参照により援用されるTakahashi et al., Cell 131 861-872 (2007)を参照のこと）、または内在性遺伝子のｑＰＣＲにより直接的に、転写活性化をアッセイした。

図６Ａ〜図６Ｄは、Ｃａｓ９Ｎ−ＶＰ６４を用いたＲＮＡ誘導性ＯＣＴ４制御に関する。図６Ａに示されるように、転写開始部位の上流の約５ｋｂ長のＤＮＡ鎖を標的とする２１種類のｇＲＮＡをＯＣＴ４遺伝子用にデザインした。ＤＮａｓｅ高感受性部位が緑色で強調されている。図６Ｂは、プロモーター・ルシフェラーゼレポーターコンストラクトを用いた転写活性化を示している。図６Ｃは、内在性遺伝子のｑＰＣＲにより直接的に転写活性化を示している。個々のｇＲＮＡの導入によって転写が中程度に促進されたが、複数のｇＲＮＡが相乗的に作用して堅固な数倍の転写活性化が促進された。

図７Ａ〜図７Ｃは、Ｃａｓ９Ｎ、ＭＳ２−ＶＰ６４、およびｇＲＮＡ＋２Ｘ−ＭＳ２アプタマーを用いたＲＮＡ誘導性ＲＥＸ１制御に関する。図７Ａに示されるように、転写開始部位の上流の約５ｋｂ長のＤＮＡ鎖を標的する１０種類のｇＲＮＡをＲＥＸ１遺伝子用にデザインした。ＤＮａｓｅ高感受性部位が緑色で強調されている。図７Ｂは、プロモーター・ルシフェラーゼレポーターコンストラクトを用いた転写活性化を示している。図７Ｃは、内在性遺伝子のｑＰＣＲにより直接的に転写活性化を示している。個々のｇＲＮＡの導入により転写が中程度に促進されたが、複数のｇＲＮＡが相乗的に作用して堅固な数倍の転写活性化が促進された。ある態様によれば、ｇＲＮＡ上に２Ｘ−ＭＳ２アプタマーが存在しないと、転写は活性化されない。それぞれその全体が参照により援用されるMaeder et al., Nature Methods 10, 243-245 (2013)およびPerez-Pinera et al., Nature Methods 10, 239-242 (2013)を参照されたい。

したがって、方法は、標的遺伝子の発現を制御するための、複数種類のガイドＲＮＡと共に、Ｃａｓ９Ｎタンパク質、および転写制御タンパク質またはドメインを使用することに関する。

Ｃａｓ９連結アプローチおよびｇＲＮＡ連結アプローチはいずれも効果的であり、前者が約１．５〜２倍高い有効性を示した。この差はおそらく、３成分複合体の集合体とは対照的に、２成分複合体の集合体の必要条件に起因するようである。しかし、ｇＲＮＡ連結アプローチは、各ｇＲＮＡが異なるＲＮＡ−タンパク質相互作用対を利用する限り、別個のｇＲＮＡにより様々なエフェクタードメインを動員することを原理的に可能にする。その全体が参照により援用されるKaryer-Bibens et al., Biology of the Cell / Under the Auspices of the European Cell Biology Organization 100, 125-138 (2008)を参照されたい。本開示のある態様によれば、特異的なガイドＲＮＡと包括的Ｃａｓ９Ｎタンパク質、すなわち異なる標的遺伝子に対して同一または類似のＣａｓ９Ｎタンパク質、とを用いて異なる標的遺伝子を制御することができる。ある態様によれば、同一または類似のＣａｓ９Ｎを用いた多重遺伝子制御方法が提供される。

本開示の方法はさらに、ヒト細胞の多重的な遺伝子的改変およびエピジェネティックな改変を提供するための、本明細書に記載のＣａｓ９Ｎのタンパク質およびガイドＲＮＡを用いた標的遺伝子の編集に関する。Ｃａｓ９−ｇＲＮＡによる標的化の問題に対処するため（その全体が参照により援用されるJiang et al., Nature Biotechnology 31, 233-239 (2013)を参照のこと）、非常に多様な標的配列のバリエーションに対するＣａｓ９のアフィニティーを徹底的に調査する方法を提供する。したがって、本開示の態様は、天然のヌクレアーゼ活性型Ｃａｓ９を用いた特異性試験によってもたらされるｄｓＤＮＡ切断毒性および突然変異原性修復による複雑な要因を回避しつつ、ヒト細胞におけるＣａｓ９標的化の直接的ハイスループット読取りを提供する。

本開示の別の態様は、標的遺伝子の転写制御のための、ＤＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合システム一般の使用に関する。当業者は、本開示に基づき、例示的なＤＮＡ結合システムを容易に特定するであろう。そのようなＤＮＡ結合システムは、天然Ｃａｓ９タンパク質と同様のヌクレアーゼ活性を有する必要がない。したがって、そのようなＤＮＡ結合システムは、ヌクレアーゼ活性が不活性化されている必要がない。例示的なＤＮＡ結合システムの１つはＴＡＬＥである。ある態様によれば、図２Ａに示される方法を用いてＴＡＬＥの特異性を評価した。ライブラリーの各要素がｄＴｏｍａｔｏ蛍光タンパク質を発現するミニマルプロモーターを含むコンストラクトライブラリーを設計する。転写開始部位ｍの下流に２４ｂｐの（Ａ／Ｃ／Ｇ）ランダム転写物タグ（random transcript tag）を挿入し、一方で２つのＴＦ結合部位をプロモーターの上流に配置する。２つのＴＦ結合部位の一方は全てのライブラリー要素に共有される一定のＤＮＡ配列であり、もう一方は「バイアスがかかった」結合部位ライブラリーを有する可変的特徴部であり、これららの結合部位はプログラム可能なＤＮＡ標的化複合体が結合するように設計された標的配列から離れて多くの変異の組合せを提示する配列の大きなコレクションに及ぶように改変されている。これは、標的配列ヌクレオチドが７９％の頻度で現れ、別の各ヌクレオチドが７％の頻度で現れるようなヌクレオチド頻度を各位置で有するように改変された縮重オリゴヌクレオチドを用いて達成される。その全体が参照により援用されるPatwardhan et al., Nature Biotechnology 30, 265-270 (2012)を参照されたい。次に、レポーターライブラリーを配列決定して、２４ｂｐのｄＴｏｍａｔｏ転写物タグとライブラリー要素中のそれらの対応する「バイアスがかかった」標的部位との関連を明らかにする。転写物タグの大きな多様性により、異なる標的間でのタグの共有が非常に少ないことを確実にし、標的配列のバイアスがかかった構成は、ほとんど変異を有しない部位がより多くの変異を有する部位よりも多くのタグと関連することを意味する。次に、共有ＤＮＡ部位に結合するように改変された対照ＴＦまたは標的部位に結合するように改変された標的ＴＦのいずれかによって、ｄＴｏｍａｔｏレポーター遺伝子の転写が促進される。促進された細胞についてＲＮＡ配列決定を行うことにより、発現された各転写物タグの存在量を各試料において測定し、次に、予め作成した関連表を用いてそれらの対応する結合部位に転写物タグをマッピングする。対照ＴＦは、その結合部位が全ライブラリー要素で共有されているので、全てのライブラリーの構成要素を等しく刺激すると予想され、一方、標的ＴＦは、それが選択的に標的とする構成要素に対して、発現構成要素の分布を歪めると予想される。この仮定をステップ５で用いて、標的ＴＦについて得られたタグ数を対照ＴＦについて得られたタグ数で除算することにより、各結合部位について標準化された発現レベルを計算する。

図２Ｂに示されるように、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の標的化ランドスケープが、この複合体が平均してその標的配列中の１〜３個の変異に対して許容性があることは明らかになる。図２Ｃに示されるように、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体はさらに、ＰＡＭ配列に局在する点変異を除いて、点変異にほとんど感受性がない。特に、このデータにより、ＮＧＧだけでなくＮＡＧもストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）のＣａｓ９の予想ＰＡＭであることが明らかになる。図２Ｄに示されるように、これらのミスマッチがｇＲＮＡ標的配列の３′末端に近い８〜１０塩基に局在する場合にのみ、２塩基のミスマッチの導入によってＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体の活性は顕著に損なわれる（ヒートプロットでは、標的配列の位置は５′末端から１〜２３と表示されている）。

本明細書に記載の転写特異性アッセイを用いて、別の広範に用いられているゲノム編集ツールであるＴＡＬＥドメインの変異許容性を決定した。図２Ｅに示されるように、１８塩基長のＴＡＬＥについてのＴＡＬＥオフターゲットデータにより、このＴＡＬＥが平均してその標的配列中の１〜２個の変異を許容可能であり、その標的中の３塩基ミスマッチ変異体の大部分を活性化できないことが明らかになる。図２Ｆに示されるように、１８塩基長のＴＡＬＥは、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体と同様に、その標的中の１塩基ミスマッチにほとんど感受性がない。図２Ｇに示されるように、２塩基ミスマッチの導入により１８塩基長のＴＡＬＥの活性は顕著に損なわれる。ＴＡＬＥ活性は、その標的配列の５′末端に近くなるほどミスマッチに対して感受性が高くなる（ヒートプロットでは、標的配列の位置は５′末端から１〜１８と表示されている）。

種々のサイズのＴＡＬＥによる標的化のランドスケープの評価に関する図１０Ａ〜図１０Ｄの対象である、ヌクレアーゼアッセイにおける標的実験を用いて結果を確認した。図１０Ａに示されるように、１８塩基長のＴＡＬＥがそれらの標的配列中の複数の変異を許容することが、ヌクレアーゼ介在性ＨＲアッセイを用いて確認された。図１０Ｂに示されるように、図２Ａに記載のアプローチを用いて、３つの異なるサイズ（１８塩基長、１４塩基長、および１０塩基長）のＴＡＬＥの標的化ランドスケープを分析した。ＴＡＬＥが短くなるほど（１４塩基長および１０塩基長）、標的化が次第に特異的となり、活性もほぼ一桁低下する。図１０Ｃおよび図１０Ｄに示されるように、１０塩基長のＴＡＬＥは、ほぼ１塩基ミスマッチの感度を示しつつ、２つのミスマッチを有する標的に対してほぼ全ての活性を失っている（ヒートプロットでは、標的配列の位置は５′末端から１〜１０と表示されている）。総合すると、これらのデータは、ゲノム改変用途において、より短いＴＡＬＥの改変ほど、より高い特異性を得ることができ、一方、ＴＡＬＥヌクレアーゼの用途におけるＦｏｋＩ二量体化の必要性は、オフターゲット作用を避けるために必須であることを意味している。各々その全体が参照により援用されるKim et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93, 1156-1160 (1996)、およびPattanayak et al., Nature Methods 8, 765-770 (2011)を参照されたい。

図８Ａ〜図８Ｃは、実験データから例証される標準化された発現レベルの算出のための多段階特異性分析処理フローに関する。図８Ａに示されるように、レポーター遺伝子転写産物に組み込まれるランダム配列２４ｂｐタグおよび分布にバイアスがかかった結合部位配列を用いてコンストラクトライブラリーを作製した（上段）。転写されたタグは高度に縮重しているので、それらはＣａｓ９またはＴＡＬＥ結合配列に多対１（many-to-one）でマッピングされるはずである。コンストラクトライブラリーを配列決定して（３段目、左）、どのタグがどの結合部位と同時に現れるかを確認して、結合部位と転写されたタグの関連表を作製する（４段目、左）。ライブラリーバーコード（ここでは、水色および薄い黄色で示されている）を用いて、異なる結合部位に対して構築された複数のコンストラクトライブラリーを一度に配列決定してもよい（１〜４段目、左）。次に、コンストラクトライブラリーを細胞集団に遺伝子導入し、様々な一組のＣａｓ９／ｇＲＮＡまたはＴＡＬＥ転写因子をそれらの集団の試料中で誘導する（２段目、右）。１つの試料は、コンストラクト内の一定の結合部位配列を標的とする一定のＴＡＬＥ活性化因子によって常に誘導され（最上段、緑色のボックス）、この試料は陽性対照として機能する（緑色試料、＋記号によっても示される）。次に、誘導した試料中のレポーターｍＲＮＡ分子から生じたｃＤＮＡを配列決定および分析して、試料中の各タグのタグ数を得る（３段目および４段目、右）。コンストラクトライブラリーの配列決定と同様に、試料バーコードを付加することにより陽性対照を含む複数の試料を同時に配列決定および分析する。ここで、薄い赤色は、陽性対照（緑色）と共に配列決定および分析された１つの非対照試料を示す。各リードには転写されたタグだけが現れ、コンストラクトの結合部位は現れないので、次に、コンストラクトライブラリーの配列決定から得られた結合部位とタグの関連表を用いて、各試料中の各結合部位から発現するタグの総数を計算する（５段目）。次に、各非陽性対照試料についての総計を陽性対照試料において得られた総計で除算すことにより、各非陽性対照試料についての総計を各結合部位についての標準化された発現レベルに変換する。ミスマッチの数ごとに標準化された発現レベルのプロットの例を、２Ｂおよび図２Ｅならびに図９Ａおよび図１０Ｂに示す。誤ったタグ、コンストラクトライブラリーに関連付けできないタグ、および明らかに複数の結合部位によって共有されるタグに対するフィルタリングのいくつかの段階は、この全体的処理フローに含まれていない。図８Ｂは、バイアスがかかったコンストラクトライブラリー内で生じたミスマッチの数に対する、結合部位の割合の分布例を示している。左：理論的分布。右：実際のＴＡＬＥコンストラクトライブラリーで観察された分布。図８Ｃは、ミスマッチの数に対する、結合部位に対する集計タグ数の割合の分布例を示している。左：陽性対照試料で観察された分布。右：非対照ＴＡＬＥが誘導された試料で観察された分布。陽性対照ＴＡＬＥはコンストラクト中の一定の部位に結合するので、集計したタグ数の分布は図８Ｂにおける結合部位の分布を厳密に反映しており、一方、ミスマッチが少ない部位ほど高い発現レベルを誘導するので、非対照ＴＡＬＥ試料では、その分布が左に歪んでいる。下：標的ＴＦについて得られたタグ数を対照ＴＦについて得られたタグ数で除算してこれらの間の相対的濃縮度を計算することによって、標的部位中の変異数に対する平均発現レベルが明らかになる。

これらの結果は、異なるＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を用いて作成した特異性データによってさらに再確認された。図９Ａに示されるように、異なるＣａｓ９−ｇＲＮＡ複合体は、その標的配列中の１〜３個の変異に対して許容性がある。図９Ｂに示されるように、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体はさらに、ＰＡＭ配列に局在する点変異を除いて、点変異にほとんど感受性がない。しかし、図９Ｃに示されるように、２塩基のミスマッチの導入により活性が顕著に損なわれる（ヒートプロットでは、標的配列の位置は、５′末端から１〜２３と表示されている）。図９Ｄに示されるように、ヌクレアーゼ介在性ＨＲアッセイを用いて、ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）のＣａｓ９の予想ＰＡＭがＮＧＧであり、またＮＡＧであることが確認された。

ある態様では、本明細書に記載の方法に従って結合特異性が増加する。複数の複合体間の相乗作用がＣａｓ９Ｎ−ＶＰ６４による標的遺伝子活性化の要因であり、個々のオフターゲット結合事象は最小限の影響しか与えないはずなので、Ｃａｓ９Ｎの転写制御用途は必然的に特異性が高い。ある態様によれば、ゲノム編集方法においてオフセットニックが用いられる。大部分のニックは、ＮＨＥＪ事象を引き起こすことはほとんどないので（その全体が参照により援用されるCerto et al., Nature Methods 8, 671-676 (2011)を参照のこと）、オフターゲットなニック形成の影響が最小限に抑えられる。対照的に、オフセットニックを誘導して二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせることは、遺伝子破壊の誘導に非常に効果的である。ある態様によれば、３′オーバーハングとは対照的に、５′オーバーハングは、より有意にＮＨＥＪ事象を引き起こす。同様に、３′オーバーハングでは、ＮＨＥＪ事象よりもＨＲ事象が多いが、ＨＲ事象の総数は５′オーバーハングが生じた場合より有意に少ない。したがって、相同組換えのためのニック、およびＣａｓ９−ｇＲＮＡのオフターゲット活性の影響を最小限に抑えるために二本鎖切断を生成するためのオフセットニックを用いる方法が提供される。

図３Ａ〜図３Ｃは、多重オフセットニック形成、およびガイドＲＮＡとのオフターゲット結合を減少させるための方法に関する。図３Ａに示されるように、ｔｒａｆｆｉｃ ｌｉｇｈｔレポーターを用いて、標的化ニックまたは標的化切断の導入時のＨＲ事象およびＮＨＥＪ事象を同時にアッセイした。ＨＤＲ経路により解消されたＤＮＡ切断事象はＧＦＰ配列を回復するが、変異原性ＮＨＥＪは、ＧＦＰを読み枠から外し、且つ下流のｍＣｈｅｒｒｙ配列を読み枠に入れる、フレームシフトを引き起こす。アッセイのために、２００ｂｐ長のＤＮＡ鎖を範囲とする１４種類のｇＲＮＡ、すなわち、センス鎖を標的とする７種類（Ｕ１〜７）、アンチセンス鎖を標的とする７種類（Ｄ１〜７）をデザインした。相補鎖にニックを形成するＣａｓ９Ｄ１０Ａ変異体を用い、異なる２通りのｇＲＮＡの組合せを用いて、一連のプログラムされた５′オーバーハングまたは３′オーバーハングを誘導した（１４種類のｇＲＮＡのニック形成部位を示す）。図３Ｂに示されるように、オフセットニックを誘導して二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成させることは、遺伝子破壊の誘導にとって非常に効果的である。特に、３′オーバーハングとは対照的に、５′オーバーハングを生じさせるオフセットニックは、より多くのＮＨＥＪ事象を引き起こす。図３Ｃに示されるように、３′オーバーハングの生成は、ＮＨＥＪ事象よりもＨＲ事象の割合が高いが、ＨＲ事象の総数は５′オーバーハングを生成した場合よりも著しく少ない。

図１１Ａ〜図１１Ｂは、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａニッカーゼ介在性ＮＨＥＪに関する。図１１Ａに示されるように、ｔｒａｆｆｉｃ ｌｉｇｈｔレポーターを用いて、標的化ニックまたは二本鎖切断の導入時のＮＨＥＪ事象をアッセイした。簡潔に述べると、ＤＮＡ切断事象の導入時に切断により変異原性ＮＨＥＪが誘発されると、ＧＦＰが読み枠から外れて翻訳され、且つ下流のｍＣｈｅｒｒｙ配列が読み枠に入って赤色蛍光が生じる。２００ｂｐ長のＤＮＡ鎖を範囲とする１４種類のｇＲＮＡ、すなわちセンス鎖を標的とする７種類（Ｕ１〜７）、アンチセンス鎖を標的とする７種類（Ｄ１〜７）をデザインした。図１１Ｂに示されるように、全ての標的についてＤＳＢと堅固なＮＨＥＪを生じさせる野生型Ｃａｓ９と異なり、（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ変異体を用いると）大半のニックはＮＨＥＪ事象をほとんど引き起こさないことが観察された。１４箇所の部位は全て、連続的な２００ｂｐ長のＤＮＡ鎖の範囲内に位置し、１０倍を超える標的化効率の差が観察された。

ある態様によれば、１種類以上、２種類以上、または複数種類の外来核酸を細胞に導入することを含む、細胞において標的核酸の発現を調節する方法が本明細書に記載される。細胞に導入される外来核酸は、１種類または複数種類のガイドＲＮＡ、１種類または複数種類のヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質、および転写制御タンパク質またはドメインをコードする。また、ガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質、および転写制御タンパク質またはドメインは、これらのガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質、および転写制御タンパク質またはドメインがＤＮＡに結合して標的核酸の発現を制御する限り、当業者によって理解されるように、共局在複合体と呼ばれる。別の態様によれば、細胞に導入される外来核酸は、１種類または複数種類のガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質ニッカーゼをコードする。また、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質ニッカーゼは、これらのガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質ニッカーゼがＤＮＡに結合して標的核酸にニックを形成する限り、当業者によって理解されるように、共局在複合体と呼ばれる。

本開示に係る細胞には、本明細書に記載されるように外来核酸を導入でき、発現させることができるあらゆる細胞が含まれる。本明細書に記載される本開示の基本的概念は細胞の種類によって限定されないと理解されるべきである。本開示に係る細胞には、真核細胞、原核細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、古細菌細胞、真正細菌細胞などが含まれる。細胞には、酵母細胞、植物細胞、および動物細胞などの真核細胞が含まれる。具体的な細胞としては、哺乳動物細胞が挙げられる。さらに、細胞には、標的核酸を制御するために有益であるか、または望ましい、任意の細胞が含まれる。そのような細胞には、疾患または有害な健康状態を引き起こす特定のタンパク質の発現が欠乏したものも含まれ得る。そのような疾患または有害な健康状態は当業者には容易に分かる。本開示によれば、本明細書に記載の方法および転写活性化因子によって特定のタンパク質の発現に関与する核酸が標的化され、その結果、標的核酸および対応する特定のタンパク質の発現が上方制御されてもよい。このようにして、本明細書に記載の方法により治療的処置が提供される。

標的核酸としては、本明細書に記載される共局在複合体が制御またはニック形成のいずれかに有用であり得る任意の核酸配列が挙げられる。標的核酸としては遺伝子が挙げられる。本開示の目的のために、二本鎖ＤＮＡなどのＤＮＡは標的核酸を含んでいてもよく、共局在複合体は、その共局在複合体が標的核酸に対する所望の影響を与えられ得るよう、その標的核酸において、またはその標的核酸に隣接して、またはその標的核酸の近傍で、ＤＮＡに結合、またはＤＮＡと共局在することができる。そのような標的核酸は、内在性の（または天然の）核酸および外来性の（または外来の）核酸を含んでいてもよい。当業者は、本開示に基づき、標的核酸を含むＤＮＡに共局在するガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質を容易に特定またはデザインすることができる。当業者はさらに、標的核酸を含むＤＮＡに同様に共局在する転写制御タンパク質またはドメインを特定することができる。ＤＮＡには、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡが含まれる。

外来核酸（すなわち、細胞の天然核酸組成物の一部でない核酸）は、当業者に公知の任意の導入方法を用いて細胞に導入されてもよい。そのような方法には、遺伝子導入法、形質導入法、ウイルス形質導入法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、ヌクレオフェクション法、ナノ粒子銃（nanoparticle bombardment）法、形質転換法、結合（conjugation）法などが含まれる。当業者は、容易に特定可能な文献資料を用いてそのような方法を容易に理解し、適用するであろう。

転写活性化因子である転写制御タンパク質またはドメインには、ＶＰ１６、ＶＰ６４、および本開示に基づいて当業者に容易に特定可能なその他のものが含まれる。

疾患および有害な健康状態は、特定のタンパク質の発現の異常な減少を特徴とするものである。そのような疾患または有害な健康状態は、特定のタンパク質の上方制御により治療され得る。したがって、本明細書に記載の共局在複合体が、標的核酸を含むＤＮＡに会合または結合し、共局在複合体の転写活性化因子が標的核酸の発現を上方制御する、疾患または有害な健康状態を治療する方法が提供される。例えば、褐色脂肪分化および代謝取込みの増加を促進するＰＲＤＭ１６および他の遺伝子の上方制御を用いて、メタボリックシンドロームまたは肥満を治療することができる。抗炎症遺伝子の活性化は自己免疫および循環器疾患において有用である。腫瘍抑制因子遺伝子の活性化は癌の治療において有用である。本開示に基づいて、当業者はそのような疾患および有害な健康状態を容易に特定するであろう。

以下の実施例は本開示の代表例として記載されるものである。本開示、図面、および添付の特許請求の範囲を考慮して、これらの実施形態および他の同等の実施形態が明らかになるので、これらの実施例は本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

実施例Ｉ
Ｃａｓ９変異体
Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインの天然の活性を除去することができるＣａｓ９中の変異候補を特定するために、既知の構造を有するＣａｓ９と相同な配列を検索した。ＨＨｐｒｅｄ（ワールドワイドウェブサイト：ｔｏｏｌｋｉｔ．ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ．ｍｐｇ．ｄｅ／ｈｈｐｒｅｄ）を用いて、全長タンパク質データバンク（２０１３年１月）に対してＣａｓ９の全長配列をクエリ配列とした。この検索によって、Ｃａｓ９のＨＮＨドメインに対する有意な配列相同性を有する２つの異なるＨＮＨエンドヌクレアーゼである、ＰａｃＩおよび推定エンドヌクレアーゼ（それぞれＰＤＢ ＩＤ：３Ｍ７ＫおよびＰＤＢ ＩＤ：４Ｈ９Ｄ）が得られた。これらのタンパク質を調べて、マグネシウムイオンの配位に関与する残基を見出した。次に、Ｃａｓ９への配列アラインメントにより対応する残基を特定した。Ｃａｓ９中の同じ種類のアミノ酸とアライメントされた、各構造中の２つのＭｇ配位側鎖を特定した。これらは３Ｍ７ＫのＤ９２およびＮ１１３、ならびに４Ｈ９ＤのＤ５３およびＮ７７である。これらの残基は、Ｃａｓ９のＤ８３９およびＮ８６３に対応していた。さらに、ＰａｃＩ残基Ｄ９２およびＮ１１３のアラニンへの変異によりヌクレアーゼが触媒的に欠損した状態となることが報告された。この分析に基づいて、Ｃａｓ９変異Ｄ８３９ＡおよびＮ８６３Ａが作製された。さらに、ＨＨｐｒｅｄにより、Ｃａｓ９とサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）のＲｕｖＣ（ＰＤＢ ＩＤ：４ＥＰ４）のＮ末端との間の相同性も予測される。この配列アラインメントは、Ｃａｓ９中のＲｕｖＣドメインの機能を除去する、以前に報告された変異Ｄ１０Ａを含む。この変異が適切な変異であることを確認するために、前述のように金属結合残基を決定した。４ＥＰ４では、Ｄ７がマグネシウムイオンの配位を補助する。この位置はＣａｓ９のＤ１０に対応する配列相同性を有することから、この変異が金属結合の除去を補助し、結果としてＣａｓ９のＲｕｖＣドメインからの触媒活性の除去を補助することが確認される。

実施例ＩＩ
プラスミド構築
Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅキット（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてＣａｓ９変異体を作製した。標的ｇＲＮＡ発現コンストラクトは、（１）個々のｇＢｌｏｃｋｓとしてＩＤＴ社に直接注文し、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔｌｌ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングされたか、（２）Ｇｅｎｅｗｉｚ社によってカスタム合成されたか、または（３）オリゴヌクレオチドのギブソン・アセンブリによって、ｇＲＮＡクローニングベクター（プラスミド＃４１８２４）中へ構築された。終止コドンを有するＧＦＰ配列と、Ａｄｄｇｅｎｅ社のＥＧＩＰレンチベクター（プラスミド＃２６７７７）中に構築された適切な断片との融合ＰＣＲアセンブリにより、破壊されたＧＦＰを含むＨＲレポーターアッセイ用ベクターを構築した。次に、これらのレンチベクターを用いてＧＦＰレポーター安定発現株を樹立した。この実験に用いたＴＡＬＥＮは、標準的なプロトコルを用いて構築された。その全体が参照により援用されるSanjana et al., Nature Protocols 7, 171-192 (2012)を参照されたい。標準的なＰＣＲ融合プロトコルの手法を用いて、Ｃａｓ９ＮとＭＳ２ ＶＰ６４との融合を行った。ＯＣＴ４およびＲＥＸ１用のプロモータールシフェラーゼコンストラクトはＡｄｄｇｅｎｅ社から入手した（プラスミド＃１７２２１およびプラスミド＃１７２２２）。

実施例ＩＩＩ
細胞培養および遺伝子導入
１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、および非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加した高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養した。加湿恒温器中、３７℃、５％ＣＯ_２で細胞を維持した。

ヌクレアーゼアッセイに関連する遺伝子導入は以下の通りであった。製造業者のプロトコルに従いＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて、０．４×１０^６個の細胞に２μｇのＣａｓ９プラスミド、２μｇのｇＲＮＡ、および／または２μｇのＤＮＡドナープラスミドを遺伝子導入した。遺伝子導入の３日後に細胞を回収し、ＦＡＣＳで分析するか、ゲノム切断の直接的アッセイのためにＤＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて約１×１０^６個の細胞のゲノムＤＮＡを抽出した。これらのために、ＰＣＲを行ってこれら細胞に由来するゲノムＤＮＡを用いて標的とする領域を増幅し、増幅産物をＭｉＳｅｑ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）により２００，０００リードを超えるカバー率（coverage）でディープシークエンシングを行った。シークエンシングデータを分析してＮＨＥＪ効率を評価した。

転写活性化アッセイに関連する遺伝子導入では、０．４×１０^６個の細胞に、（１）２μｇのＣａｓ９Ｎ−ＶＰ６４プラスミド、２μｇのｇＲＮＡ、および／または０．２５μｇのレポーターコンストラクト、または（２）２μｇのＣａｓ９Ｎプラスミド、２μｇのＭＳ２−ＶＰ６４、２μｇのｇＲＮＡ−２ＸＭＳ２アプタマー、および／または０．２５μｇのレポーターコンストラクトを遺伝子導入した。遺伝子導入の２４〜４８時間後に細胞を回収し、ＦＡＣＳまたは免疫蛍光法を用いてアッセイするか、またはそれらの全ＲＮＡを抽出した後、ＲＴ−ＰＣＲによりこれらを分析した。ＯＣＴ４およびＲＥＸ１については、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の標準的なｔａｑｍａｎプローブを用いて、ＧＡＰＤＨに対して各試料を標準化した。

Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体およびＴＡＬＥの特異性プロファイルを得るための転写活性化アッセイに関連する遺伝子導入では、０．４×１０^６個の細胞に、（１）２μｇのＣａｓ９Ｎ−ＶＰ６４プラスミド、２μｇのｇＲＮＡ、および０．２５μｇのレポーターライブラリー、（２）２μｇのＴＡＬＥ−ＴＦプラスミドおよび０．２５μｇのレポーターライブラリー、または（３）２μｇの対照ＴＦプラスミドおよび０．２５μｇのレポーターライブラリーを遺伝子導入した。遺伝子導入の２４時間後に（レポーターの刺激が飽和モードになるのを回避するため）細胞を回収した。ＲＮＡｅａｓｙ−ｐｌｕｓキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて全ＲＮＡを抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ−ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて標準的ＲＴ−ｐｃｒを行った。転写物タグの標的化ｐｃｒ増幅により次世代シークエンシング用のライブラリーを作製した。

実施例ＩＶ
Ｃａｓ９−ＴＦおよびＴＡＬＥ−ＴＦレポーターの発現レベルを計算するためのコンピュータ分析および配列分析
この処理の多段階論理フローは図８Ａに示されており、その他の詳細がここに記載される。コンストラクトライブラリーの組成の詳細については図８Ａ（１段目）および図８Ｂを参照されたい。

配列決定：Ｃａｓ９実験については、コンストラクトライブラリー（図８Ａ、３段目、左）およびレポーター遺伝子のｃＤＮＡ配列（図８Ａ、３段目、右）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ上で１５０ｂｐの重複するペアエンドリードとして得、ＴＡＬＥ実験については、対応する配列を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ上で５１ｂｐの重複しないペアエンドリードとして得た。

コンストラクトライブラリー配列の処理：アラインメント：Ｃａｓ９実験については、ｎｏｖｏａｌｉｇｎ Ｖ２．０７．１７（ワールドワイドウェブサイト：ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍ／ｍａｉｎ／ｉｎｄｅｘ／ｐｈｐ）を用いて、一組の８ｂｐライブラリーバーコードに挟まれる２３４ｂｐのコンストラクトに対応する一組の２５０ｂｐの参照配列に対してペアリードをアライメントした（図８Ａ、３段目、左参照）。ｎｏｖｏａｌｉｇｎに提供された参照配列では、２３ｂｐの縮重Ｃａｓ９結合部位領域および２４ｂｐの縮重転写物タグ領域（図８Ａ、１段目参照）をＮと指定し、一方、コンストラクトライブラリーのバーコードは明瞭に規定した。ＴＡＬＥ実験については、参照配列の長さが２０３ｂｐであり、縮重結合部位領域の長さが２３ｂｐに対して１８ｂｐであったこと以外は、同じ方法を用いた。

妥当性（validity）検査：各リードペアの左のリードと右のリードがそれぞれ参照配列に対してアライメントされた構成ファイルをｎｏｖｏａｌｉｇｎでアウトプットした。両方が参照配列とユニークにアライメントされたリードペアのみが追加の妥当性条件の対象とされ、これらの条件全部に合格したリードペアのみが保持された。妥当性条件には以下が含まれた。

（ｉ）２つのコンストラクトライブラリーバーコードの各々が、参照配列バーコードと少なくとも４つの位置でアライメントされなければならず、それら２つのバーコードは同じコンストラクトライブラリーのバーコード対でなければならない。（ｉｉ）参照配列のＮ領域に対してアライメントされる全ての塩基がｎｏｖｏａｌｉｇｎによって、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴと分類されなければならない。Ｃａｓ９実験およびＴＡＬＥ実験のいずれにおいても、参照Ｎ領域中で左のリードと右のリードは重複しないので、これらのＮ塩基の曖昧なｎｏｖｏａｌｉｇｎ分類の可能性は生じなかったことに留意されたい。（ｉｉｉ）同様に、ｎｏｖｏａｌｉｇｎに分類される挿入または欠失がこれらの領域中に現れてはならない。（ｉｖ）（これらのランダム配列はＡ、Ｃ、およびＧのみから作製されたため）転写物タグ領域にＴが現れてはならない。これらの条件のいずれか１つを満たさなかったリードペアを、不合格リードペアファイル（rejected read pair file）に収集した。これらの妥当性検査は、自作のｐｅｒｌスクリプトを用いて実行した。

誘導された試料レポーター遺伝子ｃＤＮＡ配列の処理：アラインメント：まず、ＳｅｑＰｒｅｐ（ワールドワイドウェブサイト：ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｊｓｔｊｏｈｎ／ＳｅｑＰｒｅｐからダウンロード）を用いて、重複するリードペアを７９ｂｐの共通セグメントまでマージし、次に、ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（上記バージョン）を用いて、これらの７９ｂｐ共通セグメントを、ペアではない単一のリードとして、（コンストラクトライブラリー配列決定については）２４ｂｐ縮重転写物タグはＮと指定し、試料バーコードは明瞭に規定された、一組の参照配列とアライメントした（図８Ａ、３段目、右参照）。ＴＡＬＥおよびＣａｓ９のｃＤＮＡ配列領域はいずれも、一組の８ｂｐ試料バーコード配列によって挟まれる同一の６３ｂｐｃのＤＮＡ領域に対応していた。

妥当性検査：（ａ）これまでにＳｅｑＰｒｅｐでリードペアをマージしているので、妥当性処理は、１つのリードペア中の両方のリードのユニークなアラインメントについてフィルタリングする必要はなく、マージしたリードのユニークなアラインメントについてのみフィルタリングする必要があること、および（ｂ）ｃＤＮＡ配列リード中には転写物タグのみが現れたので、妥当性処理は参照配列のこれらのタグ領域のみに適用し、別個の結合部位領域には適用しなかったことを除き、コンストラクトライブラリーの配列決定（上記参照）と同じ条件を適用した。

結合部位と転写物タグの関連表のアセンブリ：自作のｐｅｒｌを用いて、検証されたコンストラクトライブラリー配列からこれらの表を作成した（図８Ａ、４段目、左）。Ａ、Ｃ、およびＧの塩基から構成される２４ｂｐタグ配列は、コンストラクトライブラリーの全体にわたって基本的にユニークなはずであるが（共有確率＝約２．８ｅ−１１）、結合部位とタグの関連の初期分析により、実際には無視できない割合のタグ配列が複数の結合配列に共有されていることが明らかになり、これはおそらく主に結合配列中の配列エラーの組合せ、またはコンストラクトライブラリーの作製に用いたオリゴ中のオリゴ合成エラーの組み合わせによるものである。タグの共有に加え、検証されたリードペア中の結合部位と関連することが明らかになったタグが、バーコードのミスマッチに起因して、どのコンストラクトライブラリーにそれらのタグが由来し得るのか明確でなかった場合に、コンストラクトライブラリーのリードペア不合格ファイル中にも見出される可能性があった。最後に、タグ配列自体が配列エラーを含む可能性があった。これらのエラー原因に対処するため、タグを以下の３つの属性に分類した。（ｉ）セーフ（safe）対アンセーフ（unsafe）：アンセーフは、タグがコンストラクトライブラリーの不合格リードペアファイル中に見出され得ることを意味する。共有対非共有：共有は、タグが複数の結合部位配列と関連して見出されることを意味する。２＋対１のみ：２＋は、検証されたコンストラクトライブラリー配列中に少なくとも２回タグが現れ、したがって配列エラーを含む可能性がより低いと推定されることを意味する。これら３つの基準を組み合わせて、各結合部位に関連する８クラスのタグが得られ、最も確実な（secure）（しかし最も少ない）クラスは、セーフ、非共有、２＋タグのみを含み、最も確実でない（しかし、最も多い）クラスは、安全性、共有、または発生数に関係なく全てのタグを含む。

標準化された発現レベルの計算：自作のｐｅｒｌコードを用いて、図８Ａの５〜６段目に示されているステップを実行した。まず、コンストラクトライブラリーについて予め計算された結合部位と転写物タグの表を用いて、各誘導試料で得られたタグ数を各結合部位について集計した（図８Ｃ参照）。次に、各試料について、各結合部位について集計されたタグ数を陽性対照試料について集計されたタグ数で除算して、標準化された発現レベルを得た。これらの計算と関連するその他の考慮すべき事項には以下が含まれる。

１．各試料について、妥当性検査されたｃＤＮＡ遺伝子配列の中に、結合部位と転写物タグの関連表に見られなかった「新規な」タグのサブセットが見出された。これらのタグはその後の計算では無視された。

２．上記のタグ数の集計は、結合部位と転写物タグの関連表中の前述した８クラスのタグのそれぞれについて行った。コンストラクトライブラリー中の結合部位は、中心となる配列と類似している配列が高い頻度で生成するが、ミスマッチの数が多い配列ほど少なくなるようにバイアスがかかっていたので、ミスマッチがほとんどない結合部位では一般的に多数のタグが集計され、一方、ミスマッチが多い結合部位ほど集計は少なくなる。したがって、最も確実なタグのクラスを使用することが一般的には望ましいが、２つ以上のミスマッチを有する結合部位の評価は、結合部位あたり少数のタグに基づくことなり、タグ自体の信頼性が高い場合であっても、確実な数および割合の統計的信頼性は低くなる。そのような場合には、全てのタグを用いた。この考慮事項に対する補償は、ｎ箇所のミスマッチ位置について、別個の集計されたタグの数は、以下のミスマッチ位置の組合せ数と共に増加し、ｎと共に劇的に増加するという事実から得られるものであり、したがって、種々のミスマッチ数ｎについての集計されたタグ数の平均（図２Ｂ、図２Ｅ、図９Ａ、図１０Ｂに示される）は、ｎ≧２について統計的に非常に大きな集合の集計タグ数に基づいている。

３．最後に、ＴＡＬＥコンストラクトライブラリー中に構築された結合部位は１８ｂｐであり、タグとの関連はこれらの１８ｂｐ配列に基づいて指定されたが、いくつかの実験は、１８ｂｐのコンストラクト結合部位領域内の中央の１４ｂｐまたは１０ｂｐの領域に結合するように作製されたＴＡＬＥを用いて行われた。これらのＴＡＬＥの発現レベルの計算では、関連表中の１８ｂｐの結合部位の対応する領域に基づいて結合部位についてタグを集計することにより、この領域の外側にある結合部位のミスマッチが無視されるようにした。

実施例Ｖ
ベクターおよび株の構築
ストレプトコッカス・サーモフィラス（S. thermophilus）、ナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）、およびトレポネーマ・デンティコラ（T. denticola）のＣａｓ９配列をＮＣＢＩから入手し、ＪＣＡＴ（ワールドワイドウェブサイト：ｊｃａＴ．ｄｅ）^２７を用いてヒトコドン最適化し、ＤＮＡ合成および大腸菌中での発現が容易になるように改変した。階層的オーバーラップＰＣＲおよび等温アセンブリ^２４によって、５００ｂｐのｇＢｌｏｃｋｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、アイオワ州、コーラルヴィル）を連結した。得られた全長産物を細菌発現ベクターおよびヒト発現ベクターにサブクローニングした。これらの鋳型から標準的な方法によりヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９カセット（ＮＭ：Ｄ１６Ａ Ｄ５８７Ａ Ｈ５８８Ａ Ｎ６１１Ａ、ＳＰ：Ｄ１０Ａ Ｄ８３９Ａ Ｈ８４０Ａ Ｎ８６３Ａ、ＳＴ１：Ｄ９Ａ Ｄ５９８Ａ Ｈ５９９Ａ Ｎ６２２Ａ、ＴＤ：Ｄ１３Ａ Ｄ８７８Ａ Ｈ８７９Ａ Ｎ９０２Ａ）を構築した。

実施例ＶＩ
細菌プラスミド
中程度の強度のｐｒｏＣ構成的プロモーターを用いてｃｌｏＤＦ１３／ａａｄＡプラスミド骨格からＣａｓ９を細菌中で発現させた。天然細菌座位に由来するプロモーターおよびターミネーターを含むｔｒａｃｒＲＮＡカセットをｇＢｌｏｃｋｓとして合成し、強力なｔｒａｃｒＲＮＡ産生のために各ベクターのＣａｓ９コード配列の下流に挿入した。ｔｒａｃｒＲＮＡカセットが反対方向のプロモーターをさらに含むことが予想される場合は、ｃａｓ９転写への干渉を防ぐためにラムダｔ１ターミネーターを挿入した。細菌標的化プラスミドは、ＳＰを用いて機能することが以前に判明している、強力なＪ２３１００プロモーターおよびそれに続く２種類の２０塩基対スペーサー配列のうちの一方（図１３Ｄ）を有するｐ１５Ａ／ｃａｔ骨格をベースにした。スペーサー配列のすぐ後に、図１２Ａに示される３種類の３６塩基対の反復配列のうちの１つが続く。ＹＦＰレポーターベクターは、ＧＦＰを発現させるｐＲプロモーターおよびＥＹＦＰコード配列に先行するＴ７ ｇ１０ ＲＢＳを有するｐＳＣ１０１／ｋａｎ骨格をベースとしており、５′ＵＴＲ中の非鋳型鎖にプロトスペーサー１およびＰＡＭであるＡＡＡＡＧＡＴＴが挿入されている。細菌中での直交性試験のための基質プラスミドは、ライブラリープラスミド（以下参照）と同じであるが、以下のＰＡＭを有する：ＧＡＡＧＧＧＴＴ（ＮＭ）、ＧＧＧＡＧＧＴＴ（ＳＰ）、ＧＡＡＧＡＡＴＴ（ＳＴ１）、ＡＡＡＡＡＧＧＧ（ＴＤ）。

実施例ＶＩＩ
哺乳動物ベクター
哺乳動物Ｃａｓ９発現ベクターは、Ｃ末端ＳＶ４０ ＮＬＳを有するｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯをベースにした。各Ｃａｓ９に対するｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ反復配列をｔｒａｃｒＲＮＡとアライメントし、Ｃａｓ９相互作用^２５のための安定なステムが残るように５′ｃｒＲＮＡ反復配列を３′ｔｒａｃｒＲＮＡと融合することによりデザインした。ｓｇＲＮＡ発現コンストラクトは、４５５ｂｐのｇＢｌｏｃｋｓをｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター骨格にクローニングすることにより作製された。スペーサーは以前の研究^８で使用されたものと同じであった。破壊型ＧＦＰ ＨＲレポーターアッセイ用のレンチベクターを以前に報告されているものから改変して、各Ｃａｓ９に対する適切なＰＡＭ配列が含まれるようにし、ＧＦＰレポーター安定発現株の確立に用いた。

ＶＰ６４活性化因子に融合したヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質、およびミニマルプロモーターにより発現されるｔｄＴｏｍａｔｏを有する対応するレポーターコンストラクトからなるＲＮＡ誘導型転写活性化因子を構築した。

実施例ＶＩＩＩ
ライブラリー構築および形質転換
プロトスペーサーライブラリーは、２種類のプロトスペーサー配列のうちの一方およびそれに続く８個のランダムな塩基をコードするプライマー（ＩＤＴ社、アイオワ州、コーラルヴィル）を用いてｐＺＥ２１ベクター（ＥｘｐｒｅｓｓＳｙｓ社、ドイツ、リュルツハイム）を増幅し、標準的な等温法^２４によりアセンブルすることによりを構築した。ライブラリーアセンブリを最初にＮＥＢＴｕｒｂｏ細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州、イプスウィッチ）に形質転換し、希釈プレーティングでライブラリー当たり１Ｅ８個以上のクローンを得て、Ｍｉｄｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州、カールズバッド）で精製した。Ｃａｓ９発現プラスミド（ＤＳ−ＮＭｃａｓ、ＤＳ−ＳＴ１ｃａｓ、またはＤＳ−ＴＤｃａｓ）および標的化プラスミド（ＰＭ−ＮＭ！ｓｐ１、ＰＭ−ＮＭ！ｓｐ２、ＰＭ−ＳＴ１！ｓｐ１、ＰＭ−ＳＴ１！ｓｐ２、ＰＭ−ＴＤ！ｓｐ１、またはＰＭ−ＴＤ！ｓｐ２）を含むエレクトロコンピテントなＮＥＢＴｕｒｂｏ細胞を、２００ｎｇの各ライブラリーで形質転換し、３７℃で２時間回復させた後、スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）、およびカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含む培地で希釈した。段階希釈物をプレーティングして形質転換後のライブラリーサイズを推定した。全てのライブラリーは約１Ｅ７クローンを超えており、これは、６５５３６個のランダムＰＡＭ配列を完全にカバーしていることを示している。

実施例ＩＸ
ハイスループットシークエンシング
１２時間の抗生物質選択後にスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州、カールズバッド）でライブラリーＤＮＡを回収した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ上で重複する２５ｂｐのペアエンドリードから得られた配列、およびバーコード化したプライマーを用いて、インタクトなＰＡＭを増幅した。ＭｉＳｅｑにより、１８，４１１，７０４の合計リードまたは９，２０５，８５２個のペアエンドリードが生じ、各ライブラリーについての平均品質スコアは＞３４であった。ペアエンドリードをマージし、お互いとの、それらのプロトスペーサーとの、およびプラスミド骨格との完全なアラインメントについてフィルタリングした。残りの７，６５２，４５４個のマージされたフィルタリング済みリードをトリミングしてプラスミド骨格およびプロトスペーサー配列を除去した後、これを用いて各ＰＡＭライブラリーについての位置特異的重み行列（position weight matrix）を作製した。各ライブラリー組合せにより、少なくとも４５０，０００の高品質リードを得た。

実施例Ｘ
配列処理
各候補ＰＡＭの除去倍率を計算するために、本発明者らは、２種類のスクリプトを用いてデータをフィルタリングした。ｐａｔｔｅｒｎＰｒｏｐ（ｕｓａｇｅ：ｐｙｔｈｏｎ ｐａｔｔｅｒｎＰｒｏｐ．ｐｙ ［ＰＡＭ］ ｆｉｌｅ．ｆａｓｔｑ）により、指示されたＰＡＭの各１塩基誘導体にマッチするリードの数および割合が得られる。ｐａｔｔｅｒｎＰｒｏｐ３により、ライブラリーのリードの総数に対する各１塩基誘導体にマッチするリードの割合が得られる。計算された各ＰＡＭの除去の割合を詳細に示すスプレッドシートを用いて、全ての１塩基誘導体における最小の除去倍率を特定することによりＰＡＭを分類した。

実施例ＸＩ
細菌における抑制アッセイおよび直交性アッセイ
ＮＭ発現プラスミドおよびＹＦＰレポータープラスミドを、２種類の対応する標的化プラスミドの各々で形質転換することにより、Ｃａｓ９による抑制をアッセイした。マッチするまたはミスマッチのスペーサーおよびプロトスペーサーを有するコロニーを選び、９６ウェルプレート中で成長させた。Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ社、バーモント州、ウィヌースキー）を用いて４９５／５２８ｎｍの蛍光および６００ｎｍの吸収を測定した。

Ｃａｓ９と標的化プラスミドとの全ての組合せを有するエレクトロコンピテントなＮＥＢＴｕｒｂｏ細胞を調製し、それらを各Ｃａｓ９に対する適切なＰＡＭを有するマッチまたはミスマッチする基質プラスミドで形質転換することにより直交性試験を行った。Ｃａｓ９またはｃｒＲＮＡの変異による不活性化により通常生じる、正しいＣａｓ９＋標的化＋マッチするプロトスペーサーの組合せにおいても少なくともいくつかのコロニーが確実に現れるように、十分な細胞および希釈物をプレーティングした。コロニーを数え、それぞれについて除去倍率を計算した。

実施例ＸＩＩ
細胞培養および遺伝子導入
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、および非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を補充した高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で培養した。加湿恒温器中で細胞を３７℃、５％ＣＯ_２に維持した。

ヌクレアーゼアッセイと関連する遺伝子導入は以下の通りであった。製造業者のプロトコルに従いＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて、０．４×１０^６個の細胞に、２μｇのＣａｓ９プラスミド、２μｇのｇＲＮＡ、および／または２μｇのＤＮＡドナープラスミドを遺伝子導入した。遺伝子導入の３日後に細胞を回収し、ＦＡＣＳにより分析するか、またはゲノム切断の直接的アッセイのためにＤＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて約１×１０^６個の細胞のゲノムＤＮＡを抽出した。

転写活性化アッセイに関連する遺伝子導入については、０．４×１０^６個の細胞に、２μｇのＣａｓ９_Ｎ−ＶＰ６４プラスミド、２μｇのｇＲＮＡ、および／または０．２５μｇのレポーターコンストラクトを遺伝子導入した。遺伝子導入の２４〜４８時間後に細胞を回収し、ＦＡＣＳまたは免疫蛍光法を用いてアッセイするか、またはそれらの全ＲＮＡを抽出した後、これらをＲＴ−ＰＣＲにより分析した。

実施例ＸＩＩＩ
推定直交性Ｃａｓ９タンパク質の選択
ｃｒＲＮＡ中の３６塩基対の反復配列により、Ｃａｓ９のＲＮＡ結合およびｓｇＲＮＡの特異性をまず決定する。既知のＣａｓ９遺伝子を、それらの隣接ＣＲＩＳＰＲ座位中の高度に多様性を有する反復配列について調べた。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）およびストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）のＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９タンパク質（ＳＰおよびＳＴ１）^６、２２、およびその座位が互いに、且つＳＰおよびＳＴ１の座位と、少なくとも１３ヌクレオチドが異なっている反復配列を有するナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）（ＮＭ）およびトレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）（ＴＤ）に由来する２つの別のＣａｓ９タンパク質を選択した（図１２Ａ）。

実施例ＸＩＶ
ＰＡＭの特徴解析
Ｃａｓ９タンパク質は、目的のＣａｓ９に特異的な３′ＰＡＭ配列が隣接しているｄｓＤＮＡ配列のみを標的とする。４つのＣａｓ９変異体のうち、ＳＰのみが実験により特徴解析されたＰＡＭを有しているが、ＳＴ１のＰＡＭ、およびごく最近になってＮＭのＰＡＭが、バイオインフォマティクスにより推定された。ＳＰは、ＮＧＧという短いＰＡＭに起因して標的化が容易である^１０が、ＳＴ１およびＮＭは、ＰＡＭがそれぞれＮＮＡＧＡＡＷおよびＮＮＮＮＧＡＴＴであるので、それほど容易に標的化できない^{２２、２３}。バイオインフォマティクスによるアプローチにより、スペーサー獲得ステップに起因して、エフェクター切断の実験的必要条件と比較して、より厳密なＣａｓ９活性に対するＰＡＭ必要条件が推定された。ＰＡＭ配列はエスケープファージ（escape phage）中の変異の最も頻度の高い標的であるので、獲得されたＰＡＭ中の重複性（redundancy）により抵抗性が排除されるであろう。ライブラリーに基づくアプローチを採用して、ハイスループットシークエンシングを用いて細菌中のこれらの配列を網羅的に特徴解析した。

合成断片からＳＴ１、ＮＭ、およびＴＤをコードする遺伝子をアセンブルし、それらの関連するｔｒａｃｒＲＮＡと共に細菌発現プラスミドにクローニングした（図１２Ｂ）。６つの標的化プラスミドへの組込みのため、２つのＳＰ機能性スペーサーを選択した。各標的化プラスミドは、２つのスペーサーのうちの１つの後にＣａｓ９タンパク質に特異的な３６塩基対の反復配列が続く、構成的に発現するｃｒＲＮＡをコードする（図１２Ｂ）。これら２つのプロトスペーサーのうちの１つとそれに続く全ての可能な８塩基対ＰＡＭ配列とを含むプラスミドライブラリーを、ＰＣＲおよびアセンブリにより作製した^２４。各ライブラリーを、Ｃａｓ９タンパク質、スペーサー、およびプロトスペーサーの計１２通りの組み合せについて、Ｃａｓ９発現プラスミドおよび標的化プラスミドを有する大腸菌細胞にエレクトロポレーションした。生存したライブラリープラスミドをバーコードＰＣＲにより選択的に増幅し、ＭｉＳｅｑで配列決定して、スペーサーとプロトスペーサーがマッチする場合にのみ除去される機能性ＰＡＭ配列（図１２Ｃ〜図１２Ｄ）を、除去されない非機能性ＰＡＭ（図１２Ｄ〜図１２Ｅ）と区別した。全位置での各ヌクレオチドの重要性をグラフで表すために、対応するミスマッチの場合と比較した、マッチしたスペーサー・プロトスペーサー対についての各塩基の対数相対的頻度をプロットした（図１３Ａ〜図１３Ｆ）。

ＮＭおよびＳＴ１は、過去のバイオインフォマティクスによる予想と比較して、あまり厳密ではなく、より複雑なＰＡＭを認識し、このことは、スペーサー獲得の必要条件が、エフェクター切断に対する必要条件よりも厳密であることを示唆している。ＮＭは主にプロトスペーサーの３′末端から５塩基目に位置する１個のＧヌクレオチドを必要とし（図１３Ａ）、一方、ＳＴ１およびＴＤはそれぞれ、少なくとも３個の特異的塩基を必要とする（図５ｂ〜図５ｃ）。位置で結果をソートすることにより、各プロトスペーサーライブラリーからの任意のＰＡＭ配列の除去を定量化することができた（図１３Ｄ〜図１３Ｆ）。３つの酵素は全て、ほぼ全てのＰＡＭについて、プロトスペーサー１と比較して、プロトスペーサー２をより効果的に切断し、ＳＴ１が約１０倍の差を示した。しかし、この相互作用にはＰＡＭ依存的ばらつきも大きかった。例えば、プロトスペーサー１およびプロトスペーサー２の後にＴＮＮＮＧＮＮＮにマッチする配列が続く場合、ＮＭはこれらをほぼ等しく切断したが、ＰＡＭがＡＮＮＮＧＮＮＮにマッチした場合、プロトスペーサー２の切断活性は１０倍高かった。

結果は、所与のＣａｓ９に対して単一の許容可能なＰＡＭを決定することの難しさを強調している。活性レベルがプロトスペーサー配列に依存するだけでなく、主な塩基要件が満たされた場合であっても、望ましくないＰＡＭ塩基の特異的組合せにより顕著に活性が低下し得る。本発明者らは、最初に、より活性の低いプロトスペーサー１で平均して１００倍超の除去を受け、且つ一定の１個の塩基を付加的に有する全ての誘導体で５０倍超の除去を受けたパターンとして、ＰＡＭを特定した（表１、プレーンテキスト）。これらのレベルはおそらく細菌中での標的に対する防御には十分であるものの、有害な変異の特定の組合せにより活性が劇的に低下した。例えば、ＮＭは、ＮＣＣＡＧＧＴＮにマッチする配列を４倍しか除去しなかった。マッチする配列の５００倍超の除去、且つ１塩基誘導体の２００倍超の除去を要求する、より厳密な閾値を、高い親和性が要求される適用について規定した（表１、太字）。

実施例ＸＶ
細菌における転写制御
ＳＰのヌクレアーゼ欠損変異体は、標的化プロトスペーサーおよびＰＡＭの位置に依存した有効性で、細菌中の標的遺伝子を抑制することが示されている^１８。ＮＭのＰＡＭは、ＳＰのＰＡＭより高い頻度で現れるので、ヌクレアーゼ欠損型が同様に標的抑制可能である。ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインの触媒残基を配列相同性によって特定し、不活性化して、推定ヌクレアーゼ欠損ＮＭを作製した。好適なレポーターを作成するために、プロトスペーサー１を適切なＰＡＭと共に、ＹＦＰレポータープラスミドの５′ＵＴＲ内の非鋳型鎖に挿入した（図１４Ａ）。大腸菌を、以前に用いられた２つのＮＭ標的化プラスミドのそれぞれと共にこれらのコンストラクトで同時形質転換し、それらの相対的蛍光を測定した。マッチするスペーサーおよびプロトスペーサーを有する細胞は、対応するミスマッチの場合より、約２２倍弱い蛍光を示した（図１４Ｂ）。これらの結果は、ＮＭが標的化容易なリプレッサーとして機能して細菌中で転写を制御することができ、これにより、Ｃａｓ９による抑制の対象となり得る内在性遺伝子の数が実質的に増加することを示唆している。

実施例ＸＶＩ
細菌中での直交性
Ｃａｓ９タンパク質のセットを、それらとは異種のｃｒＲＮＡ反復配列について選択した。これらのＣａｓ９タンパク質が実際に直交性であることを検証するために、スペーサー２を含む４つの標的化プラスミドの全てと共に各Ｃａｓ９発現プラスミドで同時形質転換した。これらの細胞を、プロトスペーサー１またはプロトスペーサー２のいずれかと好適なＰＡＭとを含む基質プラスミドで形質転換した。各Ｃａｓ９が自身のｃｒＲＮＡと対を形成した場合にのみプラスミドの除去が観察され、このことは、４つのコンストラクト全てが実際に細菌中で直交性であることを示している（図１５）。

実施例ＸＶＩＩ
ヒト細胞におけるゲノム編集
次いで、これらのＣａｓ９変異体を用いてヒト細胞を改変した。２つのより小さいＣａｓ９オルソログであるＮＭおよびＳＴ１について、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの相補的領域を調べ^２５、ＳＰについて作成されたｓｇＲＮＡのものと類似した種々の融合結合部でステムループを介して２つの配列を融合することにより、対応するｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡから単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を構築した。複数連続するウラシルにより発現系でＰｏｌ ＩＩＩ終結が引き起こされた特定の場合には、複数の一塩基変異体を作製した。短縮型は有害であることが知られているので、完全な３′ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を常に含めた^８。以前に記載されている２９３細胞における相同組換えアッセイ^８を用いて、対応するＣａｓ９タンパク質と共に、全てのｓｇＲＮＡの活性をアッセイした。簡潔に述べると、終止コドン、および機能性ＰＡＭを有するプロトスペーサー配列をコードする挿入物によってＧＦＰコード配列が分断された、ゲノムに組み込まれた非蛍光ＧＦＰレポーター系統を各Ｃａｓ９タンパク質について構築した。Ｃａｓ９タンパク質および対応するｓｇＲＮＡをコードする発現ベクターを、ヌクレアーゼ誘導性相同組換えにより蛍光を回復させることができる修復ドナーと共にレポーター系統に遺伝子導入した（図１６Ａ）。ＳＰによって誘導される編集に匹敵するレベルで、ＳＴ１による編集およびＮＭによる編集が観察された。５個の連続するウラシルを有するＳＴ１ ｓｇＲＮＡは効率的に機能し、このことは、活性を損なうのに十分なレベルではＰｏｌ ＩＩＩ終結が起こらなかったことを示唆している。全長ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ融合体は、全ての例で活性であり、キメラｓｇＲＮＡデザインに有用である。ＮＭおよびＳＴ１はいずれも、キメラガイドＲＮＡを用いたヒト細胞において、効率的に遺伝子を編集することが可能である。

実施例ＸＶＩＩＩ
哺乳動物細胞におけるＣａｓ９直交性
ヒト細胞におけるＮＭおよびＳＴ１の活性に非常に効果的なｓｇＲＮＡが見出されたので、３つのタンパク質がいずれも、他のｓｇＲＮＡによって誘導されないことを立証した。同様の相同組換えアッセイを用いて、３つのｓｇＲＮＡの各々と組み合わせたＮＭ、ＳＰ、およびＳＴ１の相対的効率を測定した。３種類のＣａｓ９タンパク質の全てが互いに完全に直交性であることが確定され、これらが同一細胞において別個の、且つ重複しない配列セットを標的化可能であることが示された（図１６Ｂ）。直交標的化におけるｓｇＲＮＡおよびＰＡＭの役割を対比するために、種々の下流のＰＡＭ配列をＳＰおよびＳＴ１ならびにそれらそれぞれのｓｇＲＮＡと共に試験した。マッチするｓｇＲＮＡおよび有効なＰＡＭの両方が活性に必要であり、対応するＣａｓ９に対する特異的なｓｇＲＮＡ親和性によってほぼ完全に直交性が確認された。

実施例ＸＩＸ
ヒト細胞における転写活性化
ＮＭおよびＳＴ１はヒト細胞において転写活性化を仲介する。ＳＰ活性化因子をモデルにして、ヌクレアーゼ欠損のＮＭ遺伝子およびＳＴ１遺伝子のＣ末端にＶＰ６４活性化ドメインを融合して、推定ＲＮＡ誘導型活性化因子を作製した。活性化のためのレポーターコンストラクトは、ｔｄＴｏｍａｔｏコード領域の上流に挿入されたプロトスペーサーおよび適切なＰＡＭから構成された。ＲＮＡ誘導型転写活性化因子、ｓｇＲＮＡ、および適切なレポーターを発現するベクターを同時遺伝子導入し、転写活性化の程度をＦＡＣＳで測定した（図１７Ａ）。いずれの場合にも、３種類のＣａｓ９変異体の全てにおいて強力な転写活性化が観察された（図１７Ｂ）。各Ｃａｓ９活性化因子は、その対応するｓｇＲＮＡと対を形成した場合にのみ転写を促進した。

実施例ＸＸ
考察
網羅的なＰＡＭ特徴解析に２種類の別個のプロトスペーサーを用いることにより、プロトスペーサーとＰＡＭの認識を決定する複雑性を調べることが可能となった。プロトスペーサー切断効率の差により、オルソログ間で差の大きさはかなり異なってはいるが、多様なＣａｓ９タンパク質にわたって一定の傾向が示された。このパターンから、Ｄループの形成または安定化における配列依存的な差が、各プロトスペーサーの基本的標的化効率を決定しているが、付加的なＣａｓ９または反復配列依存的因子もまた関与していることが示唆される。同様に、多くの要因により、単一配列モチーフを用いてＰＡＭ認識を説明しようとする試みが妨げされる。主なＰＡＭ認識決定因子に隣接する個々の塩基を組み合わせることで、全体の親和性を劇的に低下し得る。実際、特定のＰＡＭは、スペーサーまたはプロトスペーサーと非線形に相互作用して全体的な活性を決定しているようである。さらに、異種細胞間での別個の活性に対しては、異なる親和性レベルが必要とされ得る。最後に、実験により特定されたＰＡＭには、バイオインフォマティクス分析から推定されたものよりも少ない塩基が必要であったことから、スペーサー獲得の必要条件はエフェクター切断の必要条件とは異なることが示唆される。

この差はナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）由来のＣａｓ９タンパク質について最も顕著であり、このＣａｓ９タンパク質は、バイオインフォマティクス的予測および現在一般的なストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）由来のＣａｓ９のいずれと比較しても、ＰＡＭの必要条件が少ない。この発見により、Ｃａｓ９タンパク質で容易に標的化できる配列の数がかなり拡張される。さらに、長さが３．２５ｋｂｐとＳＰより８５０ｂｐ小さく、遺伝子送達能が制限的である場合にかなりの利点である。特に注目すべきは、ＮＭおよびＳＴ１はいずれも治療用途のＡＡＶベクターに適合するほど十分小さく、ＮＭは、ＰＡＭの認識または特異性を改変させるようにデザインされる、指向性進化法（directed evolution）の試みのためのより好適な出発点となり得る。

以下の参照文献は、あらゆる目的のためにその全体を参照により援用する。

参照文献
1. Bhaya, D., Davison, M. & Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics 45, 273-297 (2011).
2. Wiedenheft, B., Sternberg, S.H. & Doudna, J.A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature 482, 331-338 (2012).
3. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. & Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109, E2579-2586 (2012).
4. Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012).
5. Cho, S.W., Kim, S., Kim, J.M. & Kim, J.S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature biotechnology 31, 230-232 (2013).
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8. Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013).
9. Wang, H. et al. One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell 153, 910-918 (2013).
10. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F. & Marraffini, L.A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239 (2013).
11. Boch, J. et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science 326, 1509- 1512 (2009).
12. Gaj, T., Gersbach, C.A. & Barbas, C.F., 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology (2013).
13. Hockemeyer, D. et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature biotechnology 27, 851-857 (2009).
14. Kim, Y.G., Cha, J. & Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93, 1156- 1160 (1996).
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16. Porteus, M.H. & Carroll, D. Gene targeting using zinc finger nucleases. Nature biotechnology 23, 967-973 (2005).
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20. Podgornaia, A.I. & Laub, M.T. Determinants of specificity in two-component signal transduction. Current opinion in microbiology 16, 156-162 (2013).
21. Purnick, P.E. & Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nature reviews. Molecular cell biology 10, 410-422 (2009).
22. Horvath, P. et al. Diversity, activity, and evolution of CRISPR loci in Streptococcus thermophilus. Journal of bacteriology 190, 1401-1412 (2008).
23. Zhang, Y. et al. Processing-Independent CRISPR RNAs Limit Natural Transformation in Neisseria meningitidis. Molecular cell 50, 488-503 (2013).
24. Gibson, D.G. et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature methods 6, 343-345 (2009).
25. Deltcheva, E. et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 471, 602-607 (2011).
26. Bondy-Denomy, J., Pawluk, A., Maxwell, K.L. & Davidson, A.R. Bacteriophage genes that inactivate the CRISPR/Cas bacterial immune system. Nature 493, 429-432 (2013).
27. Grote, A. et al. JCat: a novel tool to adapt codon usage of a target gene to its potential expression host. Nucleic acids research 33, W526-531 (2005).

Claims (40)

1. ２種類以上の標的核酸に相補的である２種類以上のＲＮＡをコードする第１の外来核酸を細胞に導入すること、
   前記２種類以上の標的核酸にそれぞれ結合し、且つ前記２種類以上のＲＮＡによってそれぞれガイドされる２種類以上の直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損（nuclease-null）ＤＮＡ結合タンパク質をコードする第２の外来核酸を前記細胞に導入すること、および
   ２種類以上の転写制御タンパク質またはドメインをコードする第３の外来核酸を前記細胞に導入することを含み、
   前記複数種類のＲＮＡ、前記複数種類の直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、および前記複数種類の転写制御タンパク質またはドメインが発現し、
   ＲＮＡと、直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質と、転写制御タンパク質またはドメインと、標的核酸との共局在複合体が２種類以上形成され、該転写制御タンパク質またはドメインが該標的核酸の発現を制御する、
   細胞において２種類以上の標的核酸の発現を調節する方法。
2. 直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質をコードする前記外来核酸が、該直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質に融合した前記転写制御タンパク質またはドメインをさらにコードする、請求項１に記載の方法。
3. ２種類以上のＲＮＡをコードする前記外来核酸が、ＲＮＡ結合ドメインの標的をさらにコードし、前記転写制御タンパク質またはドメインをコードする前記外来核酸が、前記転写制御タンパク質またはドメインに融合したＲＮＡ結合ドメインをさらにコードする、請求項１に記載の方法。
4. 前記細胞が真核細胞である、請求項１に記載の方法。
5. 前記細胞が、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である、請求項１に記載の方法。
6. 前記ＲＮＡが約１０ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
7. 前記ＲＮＡが約２０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
8. 前記転写制御タンパク質またはドメインが転写活性化因子である、請求項１に記載の方法。
9. 前記転写制御タンパク質またはドメインが、前記標的核酸の発現を上方制御する、請求項１に記載の方法。
10. 前記転写制御タンパク質またはドメインが、前記標的核酸の発現を上方制御して疾患または有害な健康状態を治療する、請求項１に記載の方法。
11. 前記転写制御タンパク質またはドメインが転写抑制因子である、請求項１に記載の方法。
12. 前記転写制御タンパク質またはドメインが、前記標的核酸の発現を下方制御する、請求項１に記載の方法。
13. 前記転写制御タンパク質またはドメインが、前記標的核酸の発現を下方制御して疾患または有害な健康状態を治療する、請求項１に記載の方法。
14. 前記標的核酸が疾患または有害な健康状態と関連する、請求項１に記載の方法。
15. 前記１種類または複数種類のＲＮＡがガイドＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
16. 前記１種類または複数種類のＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ融合体である、請求項１に記載の方法。
17. 前記ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
18. 第１の標的核酸が活性化され、第２の標的核酸が抑制される、請求項１に記載の方法。
19. 複数種類の第１の標的核酸が抑制され、複数種類の第２の標的核酸が抑制される、請求項１に記載の方法。
20. １種類または複数種類の第１の標的核酸が活性化され、１種類または複数種類の第２の標的核酸が抑制される、請求項１に記載の方法。
21. 細胞において１種類または複数種類の標的核酸の発現を制御すると同時に、細胞において１種類または複数種類の標的核酸を改変する方法であって、
    少なくとも１種類のＲＮＡが前記改変される１種類または複数種類の標的核酸に相補的であり、少なくとも１種類のＲＮＡが前記制御される１種類または複数種類の標的核酸に相補的である、２種類以上のＲＮＡをコードする第１の外来核酸を前記細胞に導入すること、
    （１）１つの不活性ヌクレアーゼドメインを有し、且つ前記改変される１種類または複数種類の標的核酸に相補的である前記１種類または複数種類のＲＮＡによってガイドされる、１種類の直交性ＲＮＡ誘導型タンパク質ニッカーゼ、および（２）前記制御される標的核酸に相補的である前記１種類または複数種類のＲＮＡに結合し且つガイドされる、１種類または複数種類の直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、をコードする第２の外来核酸を前記細胞に導入すること、および
    １種類または複数種類の転写制御タンパク質またはドメインをコードする第３の外来核酸を前記細胞に導入することを含み、
    前記複数種類のＲＮＡ、前記直交性ＲＮＡ誘導型タンパク質ニッカーゼ、前記複数種類の直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、および前記複数種類の転写制御タンパク質またはドメインが発現し、
    ＲＮＡと、直交性ＲＮＡ誘導型タンパク質ニッカーゼと、および改変される標的核酸との共局在複合体が少なくとも１種類形成され、該タンパク質ニッカーゼが、該改変される標的核酸にニックを入れ、
    ＲＮＡと、直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質と、転写制御タンパク質またはドメインと、制御される標的核酸との共局在複合体が少なくとも１種類形成され、該転写制御タンパク質またはドメインが、該制御される標的核酸の発現を制御する、方法。
22. 細胞において１種類または複数種類の標的核酸の発現を制御すると同時に細胞において１種類または複数種類の標的核酸を改変する方法であって、
    少なくとも１種類のＲＮＡが前記改変される１種類または複数種類の標的核酸に相補的であり、少なくとも１種類のＲＮＡが前記制御される１種類または複数種類の標的核酸に相補的である、２種類以上のＲＮＡをコードする第１の外来核酸を前記細胞に導入すること、
    （１）前記改変される１種類または複数種類の標的核酸に相補的である前記１種類または複数種類のＲＮＡによってガイドされる、１種類の直交性ＲＮＡ誘導型タンパク質ヌクレアーゼ、および（２）前記制御される標的核酸に相補的である前記１種類または複数種類のＲＮＡに結合し且つガイドされる、１種類または複数種類の直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、をコードする第２の外来核酸を前記細胞に導入すること、および
    １種類または複数種類の転写制御タンパク質またはドメインをコードする第３の外来核酸を前記細胞に導入することを含み、
    前記複数種類のＲＮＡ、前記直交性ＲＮＡ誘導型タンパク質ヌクレアーゼ、前記複数種類の直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、および前記複数種類の転写制御タンパク質またはドメインが発現し、
    ＲＮＡと、直交性ＲＮＡ誘導型タンパク質ヌクレアーゼと、および改変される標的核酸との共局在複合体が少なくとも１種類形成され、該ヌクレアーゼが、該改変される標的核酸を切断し、
    ＲＮＡと、直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質と、転写制御タンパク質またはドメインと、制御される標的核酸との共局在複合体が少なくとも１種類形成され、該転写制御タンパク質またはドメインが、該制御される標的核酸の発現を制御する、方法。
23. ２種類以上の標的核酸のそれぞれに相補的である２種類以上のＲＮＡをコードする第１の外来核酸、
    ２種類以上のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質をコードする第２の外来核酸、および
    ２種類以上の転写制御タンパク質またはドメインをコードする第３の外来核酸を含み、
    各ＲＮＡ、直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質、および転写制御タンパク質またはドメインが、各標的核酸に対する共局在複合体の構成要素である細胞。
24. 直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質をコードする前記外来核酸が、該直交性ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質に融合した前記転写制御タンパク質またはドメインをさらにコードする、請求項２３に記載の細胞。
25. １種類または複数種類のＲＮＡをコードする前記外来核酸が、ＲＮＡ結合ドメインの標的をさらにコードし、前記転写制御タンパク質またはドメインをコードする前記外来核酸が、前記転写制御タンパク質またはドメインに融合したＲＮＡ結合ドメインをさらにコードする、請求項２３に記載の細胞。
26. 前記細胞が真核細胞である、請求項２３に記載の細胞。
27. 前記細胞が、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である、請求項２３に記載の細胞。
28. 前記ＲＮＡが約１０ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の細胞。
29. 前記ＲＮＡが約２０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の細胞。
30. 前記転写制御タンパク質またはドメインが転写活性化因子である、請求項２３に記載の細胞。
31. 前記転写制御タンパク質またはドメインが、前記標的核酸の発現を上方制御する、請求項２３に記載の細胞。
32. 前記転写制御タンパク質またはドメインが、前記標的核酸の発現を上方制御して疾患または有害な健康状態を治療する、請求項２３に記載の細胞。
33. 前記標的核酸が疾患または有害な健康状態と関連する、請求項２３に記載の細胞。
34. 前記１種類または複数種類のＲＮＡがガイドＲＮＡである、請求項２３に記載の細胞。
35. 前記１種類または複数種類のＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ融合体である、請求項２３に記載の細胞。
36. 前記ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または外来性ＤＮＡである、請求項２３に記載の細胞。
37. 前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＤＮＡ結合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
38. 前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質が、直交性ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１に記載の方法。
39. 前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＤＮＡ結合タンパク質である、請求項２３に記載の細胞。
40. 前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ欠損ＤＮＡ結合タンパク質が、直交性ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質である、請求項２３に記載の細胞。