JP2016522810A - 抗菌活性を有する細菌株およびそれを含む生物的防除組成物 - Google Patents

抗菌活性を有する細菌株およびそれを含む生物的防除組成物 Download PDF

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Abstract

本明細書には、病原性微生物によって引き起こされる感染を治療し、予防するための方法、病原性微生物によって引き起こされるかまたはそれに関連した疾患を治療または予防するための方法、ならびに微生物の成長を阻害するための方法であって、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、NMI受託番号V12/022850と命名された細菌株、およびNMI受託番号V12/022849と命名された細菌株の1つ以上の株を含む組成物の投与または適用を含む、方法が提供される。

Description

本開示は、一般に、抗菌活性を有する細菌株および生物的防除剤としてのその使用に関する。また、提供されるのは、特に微生物植物病原体を阻害するための、前記細菌株を含む生物的防除組成物である。
すべての植物は、微生物、例えば細菌および真菌による攻撃を受けやすい。果実、野菜、ならびに農作物および園芸作物の場合、病原性微生物およびそれによって引き起こされる疾患は、収穫前および収穫後の双方で、重大な作物被害、収穫高の低下および経済的損失をもたらし得る。病原性微生物によって引き起こされる疾患はまた、農産物の有効期間の低下および消費者における費用の増大をもたらし得る。
多数の真菌が、世界中で作物を害するかまたは破壊する多数の疾患を引き起こす既知の植物病原体である。大部分の植物病原性真菌は、子嚢菌類(ascomycetes)(フザリウム・エスピーピー(Fusarium spp.)、チエラビオプシス・エスピーピー(Thielaviopsis spp.)、ボトリティス・エスピーピー(Botrytis spp.)、バーティシリウム・エスピーピー(Verticillium spp.)、およびマグネポルテ・エスピーピー(Magnaporthe spp.)を含む)および担子菌類(basidiomycetes)(リゾクトニア・エスピーピー(Rhizoctonia spp.)、プッキニア・エスピーピー(Puccinia spp.)およびアルミラリア・エスピーピー(Armillaria spp.)を含む)である。特に懸念されるのは、土壌中に広く分布される糸状真菌である、フザリウム(Fusarium)属の真菌である。例えば、フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)などのいくつかのフザリウム(Fusarium)種は、維管束萎凋病、壊死、早期落葉および発育阻止などの症状を引き起こす青枯れ病(立ち枯れ病)により、トマト、メロン、ショウガ、バナナおよびマメ科を含む植物を冒す。ジャガイモのフザリウム乾腐病(Fusariumdry rot)は、フザリウム(Fusarium)属の数種によって引き起こされる。フザリウム乾腐病は、現場および貯蔵の双方において、ジャガイモにおける経済的に重要な問題であり、収穫後のジャガイモを失う主因の1つである。バナナにおいては、フザリウム(Fusarium)は、極めて破壊的なパナマ病の原因作用物質である。一旦プランテーションが感染すると、治療法は存在しない。フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)は、3種類の胞子、すなわち小分生子、大分生子、および厚膜胞子を介して伝播する、不完全な無性生殖的な真菌である。一旦フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)が土壌中で確立されると、厚膜胞子が休止状態を維持し、長年にわたって土壌に感染し得ることから、根絶が極めて困難であることが知られている。殺真菌薬の無効性に起因し、現在唯一利用可能な対応は、土壌滅菌であり、それは費用対効果が良くない。
植物病原性細菌はまた、植物における多くの有害でかつ経済的に重要な疾患を引き起こす。例として、エルウィニア属(Erwinia)、ペクトバクテリウム属(Pectobacterium)、パンテア属(Pantoea)、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)、シュードモナス属(Pseudomonas)、ラルストニア属(Ralstonia)、バークホルデリア属(Burkholderia)、アシドボラックス属(Acidovorax)、ザントモナス属(Xanthomonas)、クラビバクター属(Clavibacter)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、キシレラ属(Xylella)、スピロプラズマ属(Spiroplasma)、およびフィトプラズマ属(Phytoplasma)の種が挙げられる。植物病原性細菌は、虫こぶおよび過成長、しおれ、斑点病、小斑点および胴枯れ病、軟腐病、ならびに痂皮およびがん腫病を含む様々な症状を引き起こす。
ジャガイモそうか病は、ジャガイモ塊茎および他の根菜、例えばダイコン、テンサイ、ニンジンおよびパースニップに感染する疾患である。それは、塊茎表面に見苦しい壊死性病変を引き起こし、それは多大な経済的損失をもたらす。主要な原因病原体は、世界中のジャガイモが成長する領域の土壌中に見出され、大部分の固体培地上で灰色菌糸を生成するグラム陽性の好気性糸状性細菌であるジャガイモそうか病菌(Streptomyces scabies)である。栄養線維が切れると、胞子が形成され、細菌が長期間生存し、水、風および土壌を介して伝播することが可能になる。それは、土壌中で数年にもわたり長期間生存し、植物原料を崩壊させつつ生存し、また動物の消化管を通過して生存することができる。様々な手法を用いて疾患の重症度を低減しているが、現在、ジャガイモそうか病に対して利用可能である有効なコントロール法はない。
病原性微生物と戦う、またかかる病原体によって引き起こされる疾患を治療または予防することを目的とした植物に適用される殺真菌薬および他の駆除薬は、典型的には、天然(しばしば合成および非天然)の化学物質である。これらは、製造するのが高価であり、それらに伴い、動物への毒性を含む望ましくない副作用や、環境問題をもたらす可能性がある。代替手法の開発においては、明確かつ持続的なニーズが存在する。生物的防除剤および組成物は、魅力的な代替物であり、より安全であり、より生分解性が高く、かつ開発するのに大きな費用がかからない。
開示の概要
本開示の第1の態様は、病原性微生物による被験体の感染を治療または予防するための方法であって、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、およびラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の少なくとも1つの株、あるいは前記株が培養されている培地由来の培養上清または無細胞濾液を含む組成物の有効量を、被験体に投与する、またはその他として被験体に曝露するステップを含む、方法を提供する。
第2の態様は、病原性微生物によって引き起こされるか、またはそれに関連した、被験体における疾患を治療または予防するための方法であって、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、およびラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の少なくとも1つの株、あるいは前記株が培養されている培地由来の培養上清または無細胞濾液を含む組成物の有効量を、被験体に投与する、またはその他として被験体に曝露するステップを含む、方法を提供する。
上記態様によると、被験体を組成物に曝露するステップは、被験体を組成物に直接的または間接的に曝露するステップを含んでもよい。例として、被験体が植物である場合、植物は、植物の一部あるいは植物が成長しているかまたは植付されるべき土壌への組成物の適用により、組成物に曝露してもよい。また例として、被験体が動物である場合、動物は、牧草または動物が餌を食べる他の草(あるいは牧草または他の草が成長させられる土壌)への組成物の適用により、組成物に曝露してもよい。
本方法は、1つ以上の抗菌剤の有効量を、被験体に投与するか、またはその他として被験体に曝露するステップをさらに含む。
第3の態様は、微生物の成長を阻害するための方法であって、微生物、または微生物によってコロニー形成される環境またはコロニー形成され得る環境を、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、およびラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の少なくとも1つの株、あるいは前記株が培養されている培地由来の培養上清または無細胞濾液を含む組成物の有効量に曝露させるステップを含む、方法を提供する。
代表的な実施形態では、被験体は、植物である。さらなる代表的な実施形態では、被験体は、植物であり、かつ環境は、土壌、植物根および/または植物葉である。土壌は、植物の植付前、植付時または植付後、組成物で処置してもよい。同様に、植物根は、植物の植付前、植付時または植付後、組成物で処置してもよい。
本方法は、環境または被験体の組成物による1回の処置または複数回の処置を含んでもよい。
本方法は、微生物を1つ以上の抗菌剤の有効量に曝露させるステップをさらに含んでもよい。
第4の態様は、病原性微生物による被験体の感染を治療または予防するための生物的防除組成物であって、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、およびラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の少なくとも1つの株、あるいは前記株が培養されている培地由来の培養上清または無細胞濾液を含む、生物的防除組成物を提供する。
第5の態様は、病原性微生物による被験体の感染によって引き起こされるか、またはそれに関連した、被験体における疾患を治療または予防するための生物的防除組成物であって、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、およびラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の少なくとも1つの株、あるいは前記株が培養されている培地由来の培養上清または無細胞濾液を含む、生物的防除組成物を提供する。
第6の態様は、微生物の成長を阻害するための組成物であって、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、およびラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の少なくとも1つの株、あるいは前記株が培養されている培地由来の培養上清または無細胞濾液を含む、組成物を提供する。
あるいは、または上記態様に記載の組成物の成分に加えて、本明細書に開示される組成物は、受託番号V12/022847の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたラクトバチルス・ディオリボランス(Lactobacillus diolivorans)(N3)、受託番号V12/022848の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)(N11)、受託番号V12/022851の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)(TD)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、受託番号V12/022849の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託された「T9」と命名された株、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、および受託番号V12/022850の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託された本明細書中で「TB」と命名された株、のうちの1つ以上の株;あるいはこれらの株のうちの1つ以上が培養されている培地由来の培養上清または無細胞濾液、を含んでもよい。
また、本明細書に提供されるのは、病原性微生物による被験体の感染を治療または予防するための組成物の作製を意図した、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、およびラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の1つ以上の株の使用である。
また、本明細書に提供されるのは、病原性微生物による被験体の感染によって引き起こされるか、またはそれに関連した、被験体における疾患を治療または予防するための組成物の作製を意図した、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、およびラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の1つ以上の株の使用である。
また、本明細書に提供されるのは、微生物の成長を阻害するための組成物の作製を意図した、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、およびラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の1つ以上の株の使用である。
また、本明細書に提供されるのは、病原性微生物による被験体の感染を治療または予防するための組成物の作製を意図した、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、受託番号V12/022849の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託された本明細書中で「T9」と命名された株、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、および受託番号V12/022850の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託された本明細書中で「TB」と命名された株から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の1つ以上の株の使用である。
また、本明細書に提供されるのは、病原性微生物による被験体の感染によって引き起こされるか、またはそれに関連した、被験体における疾患を治療または予防するための組成物の作製を意図した、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、受託番号V12/022849の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託された本明細書中で「T9」と命名された株、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、および受託番号V12/022850の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託された本明細書中で「TB」と命名された株から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の1つ以上の株の使用である。
また、本明細書に提供されるのは、微生物の成長を阻害するための組成物の作製を意図した、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、受託番号V12/022849の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託された本明細書中で「T9」と命名された株、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、および受託番号V12/022850の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託された本明細書中で「TB」と命名された株から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の1つ以上の株の使用である。
また、本明細書に提供されるのは、病原性微生物による被験体の感染を治療または予防するため、病原性微生物による被験体の感染によって引き起こされるか、またはそれに関連した、被験体における疾患を治療または予防するため、あるいは微生物の成長を阻害するための組成物の作製を意図した、以下の株、すなわち、受託番号V12/022847の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたラクトバチルス・ディオリボランス(Lactobacillus diolivorans)(N3)、受託番号V12/022848の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)(N11)、受託番号V12/022851の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)(TD)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、受託番号V12/022849の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託された本明細書中で「T9」と命名された株、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、および受託番号V12/022850の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託された本明細書中で「TB」と命名された株、のうちの1つ以上の使用である。
以下の開示は、上記の態様および実施形態のすべてに関する。
ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)株は、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18であってもよい。特定の実施形態では、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)株は、受託番号V11/022945の下、2011年10月27日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18である。
ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)株は、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23であってもよい。特定の実施形態では、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)株は、受託番号V11/022946の下、2011年10月27日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23である。
ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)株は、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)Lr24であってもよい。特定の実施形態では、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)株は、受託番号V11/022947の下、2011年10月27日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)Lr24である。
ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)株は、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26であってもよい。特定の実施形態では、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)株は、受託番号V11/022948の下、2011年10月27日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26である。
本組成物は、アセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)の株をさらに含んでもよい。アセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)株は、アセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Afl5であってもよい。特定の実施形態では、アセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)株は、受託番号V11/022943の下、2011年10月27日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたアセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Afl5である。
本組成物は、酵母をさらに含んでもよい。酵母は、カンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)の株であってもよい。カンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)株は、カンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)Ce31であってもよい。特定の実施形態では、カンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)株は、受託番号V11/022944の下、2011年10月27日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたカンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)Ce31である。
本組成物は、前記乳酸桿菌(Lactobacillus)種のうちの2つ以上、前記乳酸桿菌(Lactobacillus)種のうちの3つ、または前記乳酸桿菌(Lactobacillus)種の全部を含んでもよい。本組成物は、前記乳酸桿菌(Lactobacillus)種のうちの2つ以上または3つ以上の共生の組み合わせを示し得る。
組成物中の株のうちの1つ以上は、被包してもよい。複数の株が被包される場合、株は、個別に被包させるかまたは単一のカプセル中で結合させてもよい。
本組成物は、1つ以上の抗菌剤をさらに含んでもよい。
被験体は、植物または動物であってもよい。特に代表的な実施形態では、被験体は植物である。例えば、植物は、農業作物種、園芸作物種または燃料もしくは医薬製品用の作物種であってもよい。別の代表的な実施形態では、被験体は、非ヒト動物、例えば泌乳哺乳動物(例えば、ウシまたはヤギ)である。
病原性微生物は、植物病または動物病の原因物質であってもよい。代表的な実施形態では、疾患は、腐敗、しおれ、さび病、斑点、胴枯れ病、がん腫病、ウドンコ病、カビ、虫こぶ、痂皮または乳腺炎から選択してもよい。
病原性微生物は、真菌または細菌であってもよい。
代表的な実施形態では、真菌は、フザリウム・エスピー(Fusarium sp.)、シュードセルコスポラ・エスピー(Pseudocercospora sp.)、フィアレモニウム・エスピー(Phialemonium sp.)、ボトリティス・エスピー(Botrytis sp.)またはリゾクトニア・エスピー(Rhizoctonia sp.)から選択してもよい。フザリウム・エスピー(Fusarium sp.)は、フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)、例えば、フザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・ジンギベリ(Fusarium oxysporum f.sp.zingiberi)、フザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・ニベウム(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)またはフザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・クベンセ(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)であってもよい。シュードセルコスポラ・エスピー(Pseudocercospora sp.)は、シュードセルコスポラ・マカダミア(Pseudocercospora macadamiae)であってもよい。フィアレモニウム・エスピー(Phialemonium sp.)は、フィアレモニウム・ジモルフォスポラム(Phialemonium dimorphosporum)であってもよい。ボトリティス・エスピー(Botrytis sp.)は、灰色かび病菌(Botrytis cinerea)であってもよい。リゾクトニア・エスピー(Rhizoctonia sp.)は、紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)であってもよい。当業者は、このリストが完全でないことを理解するであろう。さらなる適切な真菌種は、以下に開示される。
細菌は、グラム陽性またはグラム陰性であってもよい。代表的な実施形態では、細菌は、ストレプトマイセス・エスピー(Streptomyces sp.)、スタフィロコッカス・エスピー(Staphylococcus sp.)、エシュリキア・エスピー(Escherichia sp.)、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)、パントエア・エスピー(Pantoea sp.)、またはストレプトコッカス・エスピー(Streptococcus sp.)であってもよい。ストレプトマイセス・エスピー(Streptomyces sp.)は、ジャガイモそうか病菌(Streptomyces scabies)であってもよい。スタフィロコッカス・エスピー(Staphylococcus sp.)は、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)であってもよい。ストレプトコッカス・エスピー(Streptococcus sp.)は、ストレプトコッカス・ウベリス(S.uberis)であってもよい。エシュリキア・エスピー(Escherichia sp.)は、大腸菌(Escherichia coli)であってもよい。シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)は、シュードモナス・サバスタニ(Pseudomonas savastani)であってもよい。パントエア・エスピー(Pantoea sp.)は、パントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerons)であってもよい。当業者は、このリストが完全でないことを理解するであろう。さらなる適切な細菌種は、以下に開示される。
本開示の態様および実施形態は、あくまで非限定例として、以下の図面を参照して本明細書に記載される。
実施例3に記載のように、処置から3週間後のスイカ植物の根の高さ、草高および植物重量。各パラメーターについては、バーは、左から右へ、実験A、B、CおよびDからのスイカ苗を示す。
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解されているのと同等の意味を有する。本明細書に記載される場合に類似または同等の任意の方法および材料は、本開示を実行または試験する場合に使用することができるが、典型的な方法および材料が記載される。
冠詞「a」および「an」は、冠詞の文法的対象の1つまたは複数(すなわち、少なくとも1つ)を示すように本明細書で使用される。例として、「an element」は、1つの要素または複数の要素を意味する。
本明細書との関連で、用語「約」は、当業者が、同一の機能または結果を得るという状況で、列挙される値(recited value)に等価であると考えることになる数の範囲を示すように理解される。
以下に続く本明細書および特許請求の範囲の全体を通して、文脈上他の意味が求められない限り、用語「含む(comprise)」、および「含む(comprises)」または「含む(comprising)」などの変形は、記述された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループを含めるが、任意の他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループを除外しないことを意味することは理解されるであろう。
本明細書で使用される用語「抗菌剤」は、微生物の1つ以上の種の成長を殺滅または阻害することが可能な、単独での、または別の作用物質と組み合わせた任意の作用物質を示す。抗菌剤は、限定はされないが、抗生物質、洗剤、界面活性剤、酸化ストレスを誘発する作用物質、バクテリオシンおよび抗菌性酵素(例えば、リパーゼ、プロナーゼおよびリアーゼ)、ならびに様々な他のタンパク質分解酵素およびヌクレアーゼ、ペプチドおよびファージ、を含む。抗菌剤を参照することは、天然および合成抗菌剤の双方を参照することを含む。
本明細書で使用される用語「曝露する」は、一般に、接触状態にすることを意味する。被験体の本明細書に記載の組成物または作用物質への曝露は、被験体への組成物または作用物質の投与、あるいはその他として、組成物または作用物質を被験体と直接的または間接的のいずれかで接触状態にすることを含む。例えば、被験体を組成物または作用物質に曝露することは、組成物または作用物質を、被験体が存在する環境あるいは被験体に投与されるべき飼料、液体または他の栄養素組成物に、適用または投与することを含んでもよい。本開示では、用語「曝露する」、「投与する」および「接触する」ならびにそれらの変形は、文脈によっては交換可能に使用してもよい。
用語「阻害する(inhibiting)」ならびに「阻害(inhibition)」および「阻害する(inhibits)」などのその変形は、本明細書で微生物の成長に関して使用される場合、組成物または作用物質の任意の殺微生物(microcidal)または静微生物(microstatic)活性を示す。かかる阻害は、規模の違い、および/または、本質的に時間もしくは空間の違いであり得る。組成物または作用物質による細菌または真菌の成長の阻害は、微生物の成長を組成物または作用物質の存在下および不在下で測定することにより、評価することができる。微生物の成長は、組成物または作用物質により、組成物または作用物質に曝露されない場合に相当する微生物の成長に対して、少なくともまたは約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%またはより多く、阻害され得る。
用語「被験体」は、本明細書で使用される場合、病原性微生物による感染を受けたかまたは受けていると疑われる、あるいは病原性微生物からの感染を受けやすい、任意の植物または動物を示す。植物は、限定はされないが、果実、野菜、穀物、塊茎、豆類、花、および葉をもたらす植物、あるいは任意の他の経済的または環境的に重要な植物を含む。それ故、植物は、作物種であってもよい。用語「作物」は、本明細書で使用される場合、例えばヒト用食物、家畜飼料、燃料または医薬製品を含む任意の経済的目的のため、収穫または使用を意図して生育される任意の植物を示す(例えば、ポピー)。動物として、例えば、哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類、両生類、および任意の他の脊椎動物または無脊椎動物、例えば、経済的、環境的、および/または他のかなり重要な動物、が挙げられる。哺乳類として、限定はされないが、家畜(livestock)および他の家畜(farm animals)(ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタおよびニワトリなど)、パフォーマンス用動物(performance animal)(競走馬など)、コンパニオン動物(ネコおよびイヌなど)、実験室試験用動物およびヒト、が挙げられる。
本明細書で使用される用語「有効量」は、例えば植物の成長速度、作物収量、または土壌中の養分利用性の観点で、1つ以上の有利なまたは所望のアウトカムをもたらすのに十分な、土壌または植生の所与の領域に適用される微生物接種材料または肥料組成物の量を示す。「有効量」は、1回以上の投与において提供され得る。正確な必要量は、使用される個々の株の同一性および数、処置されている植物種、処置されるべき土壌の性質および状態、適用されるべき微生物接種材料または肥料組成物の正確な性質、接種材料または肥料が適用される形態およびその適用手段、ならびに適用を行う植物の生育期間における状態、などの要素に応じて変化することになる。したがって、正確な「有効量」を特定することは不可能である。しかし、任意の所与の場合においては、適切な「有効量」は、当業者が専らルーチン的な実験を用いることにより、決定することができる。
本明細書で使用される用語「処置する」、「処置」などは、感染または疾患あるいは感染または疾患の少なくとも1つの症状、の進行を治療する、あるいはその他として、阻害する、遅らせる、または食い止める(感染または疾患の重症度を低下させることを含む)ようなあらゆる適用を示す。したがって、処置は、被験体が、感染の完全な除去または疾患からの回復に至るまで処置されることを必ずしも意味しない。同様に、用語「予防する」、「予防」などは、感染または疾患の確立を予防する、あるいはその他として、感染または疾患を遅らせるようなあらゆる適用を示す。
用語「任意選択的に」は、後に説明される特徴が、存在または不在のいずれでもよいこと、あるいは後に説明される事象または状況が、発生または不発生のいずれでもよいことを意味するように本明細書で使用される。したがって、本明細書は、特徴が存在する場合の実施形態および特徴が存在しない場合の実施形態、ならびに事象または状況が発生する場合の実施形態および事象または状況が発生しない場合の実施形態を含み、包含することは理解されるであろう。
本明細書に提供されるのは、病原性微生物による被験体の感染を治療または予防するための方法であって、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、およびラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の少なくとも1つの株を含む組成物の有効量を、被験体に投与する、またはその他として被験体に曝露するステップを含む、方法である。
また、提供されるのは、病原性微生物によって引き起こされるか、またはそれに関連した、被験体における疾患を治療または予防するための方法であって、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、およびラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の少なくとも1つの株を含む組成物の有効量を、被験体に投与する、またはその他として被験体に曝露するステップを含む、方法である。
さらに、本明細書に提供されるのは、微生物の成長を阻害するための方法であって、微生物、または微生物によってコロニー形成される環境またはコロニー形成され得る環境を、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、およびラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の少なくとも1つの株を含む組成物の有効量に曝露させるステップを含む、方法である。
また、本明細書に提供されるのは、病原性微生物による被験体の感染を治療または予防するための方法であって、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、受託番号V12/022849の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託された本明細書中で「T9」と命名された株、および受託番号V12/022850の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託された本明細書中で「TB」と命名された株から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の少なくとも1つの株を含む組成物の有効量を、被験体に投与する、またはその他として被験体に曝露するステップを含む、方法である。
また、提供されるのは、病原性微生物によって引き起こされるか、またはそれに関連した、被験体における疾患を治療または予防するための方法であって、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、受託番号V12/022849の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託された本明細書中で「T9」と命名された株、および受託番号V12/022850の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託された本明細書中で「TB」と命名された株から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の少なくとも1つの株を含む組成物の有効量を、被験体に投与する、またはその他として被験体に曝露するステップを含む、方法である。
さらに、本明細書に提供されるのは、微生物の成長を阻害するための方法であって、微生物、または微生物によってコロニー形成される環境またはコロニー形成され得る環境を、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、受託番号V12/022849の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託された本明細書中で「T9」と命名された株、および受託番号V12/022850の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託された本明細書中で「TB」と命名された株から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の少なくとも1つの株を含む組成物の有効量に曝露させるステップを含む、方法である。
新規な生物的防除組成物はまた、病原性微生物によって引き起こされる感染、およびかかる感染によって引き起こされるか、またはそれに関連した疾患を治療し、予防するため、また微生物の成長を阻害するために提供される。
本開示によると、病原性微生物または微生物は、任意の植物種または動物種において感染させ、かつ/または疾患を引き起こす能力がある真菌または細菌病原体であってもよい。したがって、本開示の方法および組成物は、植物および動物の真菌性疾患、例えば、腐敗、しおれ、さび病、斑点、胴枯れ病、がん腫病、ウドンコ病およびカビの治療および予防において、用途が見出される。本開示の方法および組成物はまた、植物および動物の細菌性疾患、例えば、虫こぶ、痂皮および乳腺炎などの他の疾患の治療および予防において用途が見出される。
代表的な実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、フザリウム(Fusarium)乾腐、フザリウム(Fusarium)しおれ、黒色点、葉枯れ病、黒あざ病、リゾクトニア(Rhizoctonia)、紅腐れ病、輪紋、パナマ病、黄さび病(stripe rust)(黄さび病(yellow rust))、軟腐、黒さび病(stemrust)(黒さび病(black rust))、灰色かび病、疫病菌(Phytophthora)心腐れ、黒穂病、疫病菌(Phytophthora)腐敗、ピーナッツさび病(peanut rust)、リゾクトニア(Rhizoctonia)菌核病、根茎腐敗病、真菌性の外皮斑点病(husk spot)、幹潰瘍病(trunk canker)、白色根腐病(white root rot)、バーティシリウム(verticillium)萎凋病およびショウガ黄化病(Ginger yellows)から選択される真菌疾患、ならびにこれらの疾患の原因物質による感染の治療および予防において使用してもよい。被験体が植物の場合、疾患によって冒される植物は、例えば任意の果物、野菜、ナッツ、種子または穀物を生成する植物などの食用作物(ヒトまたは他の動物を対象)であってもよい。代表的な作物として、限定はされないが、塊茎および他の地下野菜(例えば、ジャガイモ、ビートの根、大根、ニンジン、タマネギなど)、地面に育つ(ground−growing)またはつる野菜(例えば、カボチャおよびカボチャファミリーの他のメンバ、豆、エンドウマメ、アスパラガスなど)、葉菜類(例えば、レタス、フダンソウ、ホウレンソウ、アルファルファなど)、他の野菜(例えば、トマト、ブロッコリー、アボカドなどを含むアブラナ属(Brassica)など)、果実(例えば、液果類、オリーブ、ネクタリンおよびモモを含む核果、マンゴおよびバナナを含むトロピカルフルーツ、リンゴ、セイヨウナシ、スイカ、マンダリン、オレンジ、マンダリン、キウイフルーツ、ココナツなど)、穀類(例えば、米、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、アワ、カラスムギ、ライ麦など)、ナッツ(例えば、マカダミアナッツ、ピーナッツ、ブラジルナッツ、ヘーゼルナッツ、クルミ、アーモンドなど)、ならびに他の経済的に貴重な作物および植物(例えば、ニンニク、ショウガ、サトウキビ、ダイズ豆、ヒマワリ、キャノーラ、モロコシ、牧草地、芝草など)、が挙げられる。
被験体が動物である場合、特定の代表的な実施形態では、動物は、本明細書に開示される組成物に、間接的には動物が摂食する牧草、草または他の植物への組成物の適用により、曝露してもよい。かかる実施形態では、代表的な動物は乳牛である。
代表的な実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、一般的な痂皮、斑点細菌病、細菌性斑点病、ジャガイモそうか病、細菌性軟腐病、クラウンゴール病および乳腺炎から選択される細菌性疾患、ならびにこれらの疾患の原因物質による感染の治療および予防において用いてもよい。
本明細書に開示される方法および組成物に見出される用途の真菌病原体として、限定はされないが、フザリウム・エスピーピー(Fusarium spp.)、例えばフザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)およびその特殊形態、例えば、フザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・ジンギベリ(Fusarium oxysporum f.sp.zingiberi)、フザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・ニベウム(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)、およびフザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・クベンセ(Fusarium oxysporum f.sp.cubense);ナス科炭疽病菌(Colletotrichum coccodes);フィトフトラ・エスピーピー(Phytophthora spp.)、例えば、フィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)、フィトフトラ・エリトロセプチカ(Phytophthora erythroseptica)、フィトフトラ・キナモミ(Phytophthora cinnamomi);紋枯病菌(Rhizoctonia solani);ナス黒枯病菌(Corynespora cassiicola);プッキニア・エスピーピー(Puccinia spp.)、例えば、プッキニア・アラキディス(Puccinia arachidis)、プッキニア・ストリホルミス(Puccinia striiformis)、プッキニア・グラミニス・エフ・エスピー・トリティキ(Pucciniagraminisf.sp.tritici);灰色かび病菌(Botrytis cinerea);リゾクトニア(Rhizoctonia);ピチウム・ミリオチルム(Pythium myriotylum);シュードセルコスポラ・マカダミア(Pseudocercospora macadamiae);ロゼリニア・ネカトリックス(Rosellinia necartrix);ベルチシリウム・エスピーピー(Verticillum spp.)、例えば、ベルチシリウム・デリリアエ(Verticillum deliliae);フィアレモニウム・ジモルフォスポラム(Phialemonium dimorphosporum);チエラビオプシス・エスピーピー(Thielaviopsis spp.);マグネポルテ・グリセア(Magnaporthe grisea)、が挙げられる。
本明細書に開示される方法および組成物に見出される用途の細菌病原体として、限定はされないが、ジャガイモそうか病菌(Streptomyces scabies);キサントモナス・エスピーピー(Xanthomonas spp.)、例えば、斑点細菌病菌(Xanthomonascampestris pv.Vesicatoria);シュードモナス・エスピーピー(Pseudomonas spp.)、例えば、シュードモナス・サバスタノイ(P.savastanoi)、シリンギ菌(P.syringae)、緑膿菌(P.aeruginosa)、および蛍光菌(P.fluorescens);大腸菌(E.Coli);リステリア菌(Listeriamonocytogenes);スタフィロコッカス・エスピーピー(Staphylococcus spp.)、例えば黄色ブドウ球菌(S. aureus);ストレプトコッカス・エスピーピー(Streptococcus spp.)、例えば、ストレプトコッカス・ウベリス(S.uberis);アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens);セパシア菌(Burkholderia cepacia);軟腐病菌(Erwinia carotovora);黒脚病菌(Erwinia chrysanthemi);パントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerons);青枯病菌(Ralstonia solanacearum);パントエア・ステワルティイ(Pantoea stewartii);アエロモナス・ハイドロフィラ(Aeromonas hydrophila);ビブリオ・エスピーピー(Vibrio spp.)、例えば、ビブリオ・アングイラルム(V.anguillarum)、ビブリオ・ハーベイ(V.harveyi)、ビブリオ・コレラ(V.cholera)、および腸炎ビブリオ(V.parahaemoliticus);アクチノバチルス・プルロニューモニア(Actinobacillus pleuropneumoniae);クロモバクテリウム・ビオラセウム(Chromobacter violaceum);コクシエラ・バーネッティイ(Coxiella burnetti);野兎病菌(Francisella tularensis);インフルエンザ菌(Haemophilus influenza);パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida);フレキシナ赤痢菌(Shigella flexneri);腸チフス菌(Salmonella typhi);ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium);ペスト菌(Yersinia pestis);および偽結核エルシニア菌(Yersinia pseudotuberculosis)、が挙げられる。
当業者は、本明細書に開示される真菌病原体および疾患、ならびに細菌病原体および疾患があくまで例示されるものであり、かつ本開示の範囲がそれらに限定されないことを理解するであろう。極めて多数の他の真菌病原体および疾患、ならびに細菌病原体および疾患は、当業者に既知なものとなり、かつ本開示の方法および組成物もまた、これらと戦うために使用してもよい。
本明細書に開示される特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)およびラクトバチルス・ディオリボランス(Lactobacillus diolivorans)から選択される1つ以上の細菌種の株を含む。代替的な実施形態では、組成物は、上記の参照された株が培養されている培地由来の培養上清または無細胞濾液を含んでもよい。代替的な実施形態では、本明細書に開示される組成物は、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、受託番号V12/022849の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託された本明細書中で「T9」と命名された株、および受託番号V12/022850の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託された本明細書中で「TB」と命名された株から選択される1つ以上の細菌種の株を含む。
ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)株は、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18であってもよい。特定の実施形態では、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)株は、受託番号V11/022945の下、2011年10月27日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18である。ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)株は、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23であってもよい。特定の実施形態では、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)株は、受託番号V11/022946の下、2011年10月27日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23である。ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)株は、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)Lr24であってもよい。特定の実施形態では、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)株は、受託番号V11/022947の下、2011年10月27日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)Lr24である。ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)株は、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26であってもよい。特定の実施形態では、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)株は、受託番号V11/022948の下、2011年10月27日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26である。
さらなる実施形態では、本明細書に開示される組成物は、受託番号V12/022847の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたラクトバチルス・ディオリボランス(Lactobacillus diolivorans)(N3)、受託番号V12/022848の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)(N11)、受託番号V12/022851の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)(TD)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、受託番号V12/022849の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託された本明細書中で「T9」と命名された株、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、および受託番号V12/022850の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託された本明細書中で「TB」と命名された株から選択される1つ以上の株;あるいはこれらの株のうちの1つ以上が培養されている培地由来の培養上清または無細胞濾液、を含んでもよい。
本開示の組成物は、アセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)の株、あるいはアセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)の株が培養されている培地由来の培養上清または無細胞濾液をさらに含んでもよい。アセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)株は、アセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Afl5であってもよい。特定の実施形態では、アセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)株は、受託番号V11/022943の下、2011年10月27日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたアセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Afl5である。組成物は、酵母、あるいは酵母が培養されている培地由来の培養上清または無細胞濾液をさらに含んでもよい。酵母は、カンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)の株であってもよい。カンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)株は、カンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)Ce31であってもよい。特定の実施形態では、カンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)株は、受託番号V11/022944の下、2011年10月27日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたカンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)Ce31である。
本明細書に開示される組成物に添加されるべき個々の微生物株の濃度は、使用される個々の株の同一性および数、病原性微生物、治療されるべき感染または疾患、組成物が適用される形態、および組成物が適用される手段を含む種々の要素に左右されることになる。任意の所与の場合においては、適切な濃度は、ルーチン的な実験のみを用いて、当業者によって判定することができる。あくまで例として、組成物中に存在する各株の濃度は、約1×10cfu/ml〜約1×1010cfu/mlであってもよく、また、約1×10cfu/ml、約2.5×10cfu/ml、約5×10cfu/ml、1×10cfu/ml、約2.5×10cfu/ml、約5×10cfu/ml、1×10cfu/ml、約2.5×10cfu/ml、約5×10cfu/ml、1×10cfu/ml、約2.5×10cfu/ml、約5×10cfu/ml、1×10cfu/ml、約2.5×10cfu/ml、約5×10cfu/ml、1×10cfu/ml、約2.5×10cfu/ml、約5×10cfu/ml、1×10cfu/ml、約2.5×10cfu/ml、または約5×10cfu/mlであってもよい。特定の代表的な実施形態では、乳酸桿菌(Lactobacillus)株の最終濃度は約2.5×10cfu/mlであり、アセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)の最終濃度は約1×10cfu/mlであってもよく、またカンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)の最終濃度は約1×10cfu/mlであってもよい。
また本開示によって検討されるのは、本明細書に記載の微生物株の変異体である。本明細書で使用される用語「変異体」は、本明細書に開示および例示の微生物株の、天然の変異体または突然変異体と特異的に開発された変異体または突然変異体の双方を示す。変異体は、本明細書に例示される特定の株と同一の特定的な(identifying)生物学的特性を、病原性微生物によって引き起こされる感染の治療または予防あるいは病原性微生物によって引き起こされるかまたはそれに関連した疾患の治療または予防という観点で同様の有利な特性を共有するという条件で、有してもまたは有しなくてもよい。本明細書に例示される微生物株の変異体を調製するのに適した方法の説明事例として、限定はされないが、例えば挿入要素もしくはトランスポゾンによるかまたは相同組換えによって媒介される遺伝子組込み技術、遺伝子を修飾、挿入、欠失、活性化またはサイレンシングするための他の組換えDNA技術、種内プロトプラスト融合、紫外線またはX線の照射による、またはニトロソグアニジン、メチルメタンスルホン酸、ナイトロジェンマスタードなどの化学変異原での処理による突然変異誘発、およびバクテリオファージ媒介形質導入、が挙げられる。適切な適用可能な方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、特に、J.H.Miller,Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1972);J.H.Miller,A Short Course in Bacterial Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1992);およびJ.Sambrook,D.Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)に記載されている。
また、本明細書で使用される用語「変異体」によって包含されるのは、本明細書に開示される株と系統学的に密接な関係がある微生物株、ならびに本明細書に開示される株と1つ以上の系統学的に有益なマーカー、例えば、rRNA遺伝子、伸長および開始因子遺伝子、RNAポリメラーゼサブユニット遺伝子、DNAジャイレース遺伝子、熱ショックタンパク質遺伝子およびrecA遺伝子において実質的な配列同一性を有する株である。例えば、本明細書で検討される「変異体」株の16S rRNA遺伝子は、本明細書に開示される株と、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%の配列同一性を共有し得る。
本開示の方法は、1つ以上の抗菌剤を、治療を必要とする被験者に投与する、またはその他として被験体に曝露するステップをさらに含んでもよい。本明細書に開示される組成物および抗菌剤の投与または曝露は、同時または様々な時刻、すなわち同時または逐次に行ってもよい。抗菌剤は、本方法で使用される微生物株と同時調合してもよい。したがって、本明細書に開示される組成物は、1つ以上の抗菌剤を含んでもよい。微生物株および抗菌剤が異なる組成物中で調合される場合、それらは、同じかまたは異なる経路または手段により、投与または送達することができる。
本明細書に記載の方法に適した代表的な抗菌剤は、限定はされないが、抗生物質、洗剤、界面活性剤、酸化ストレスを誘発する作用物質、バクテリオシンおよび抗菌性酵素(例えば、リパーゼ、プロナーゼおよびリアーゼ)、ならびに様々な他のタンパク質分解酵素およびヌクレアーゼ、ペプチドおよびファージを含む。抗菌剤は、天然または合成であってもよい。使用される抗菌剤は、個々の場合に応じて、本発明の特定の用途のために選択してもよく、当業者は、本発明の範囲が特定の抗菌剤の性質または同一性によって限定されないことを理解するであろう。抗菌剤の非限定例として、フルオロキノロン、アミノグリコシド、糖ペプチド、リンコサミド、セファロスポリンおよび関連のβラクタム、マクロライド、ニトロイミダゾール、ペニシリン、ポリミキシン、テトラサイクリン、およびそれらの任意の組み合わせ、が挙げられる。例えば、本発明の方法は、アセダプソン;アセトスルホンナトリウム;アラメシン(alamecin);アレキシジン;アムジノシリン;アムジノシリンピボキシル;アミサイクリン(amicycline);アミフロキサシン;メシル酸アミフロキサシン;アミカシン;硫酸アミカシン;アミノサリチル酸;アミノサリチル酸ナトリウム;アモキシシリン;アンホマイシン;アンピシリン;アンピシリンナトリウム;アパルシリンナトリウム;アプラマイシン;アスパルトシン;硫酸アストロマイシン;アビラマイシン(avilamycin);アボパルシン;アジスロマイシン;アズロシリン;アズロシリンナトリウム;塩酸バカンピシリン;バシトラシン;バシトラシンメチレンジサリチル酸塩;亜鉛バシトラシン;バンベルマイシン(bambermycins);ベンゾイルパスカルシウム;ベリスロマイシン(berythromycin);硫酸ベタマイシン(betamicin sulfate);ビアペネム;ビニラマイシン(biniramycin);塩酸ビフェナミン;ビスピリチオンマグスルフェクス;ブチカシン(butikacin);硫酸ブチロシン;硫酸カプレオマイシン;カルバドクス;カルベニシリン二ナトリウム;カルベニシリンインダニルナトリウム;カルベニシリンフェニルナトリウム;カルベニシリンカリウム;カルモナムナトリウム;セファクロール;セファドロキシル;セファマンドール;セファマンドールナフェート(cefamandole nafate);セファマンドールナトリウム;セファパロール(cefaparole);セファトリジン;セファザフルールナトリウム(cefazaflur sodium);セファゾリン;セファゾリンナトリウム;セフブペラゾン;セフジニル;セフェピム;塩酸セフェピム;セフェテコール;セフィキシム;塩酸セフメノキシム;セフメタゾール;セフメタゾールナトリウム;セフォニシド一ナトリウム;セフォニシドナトリウム;セフォペラゾンナトリウム;セフォラニド;セフォタキシムナトリウム;セフォテタン;セフォテタン二ナトリウム;塩酸セフォチアム;セフォキシチン;セフォキシチンナトリウム;セフピミゾール;セフピミゾールナトリウム;セフピラミド;セフピラミドナトリウム;硫酸セフピロム;セフポドキシムプロキセチル;セフプロジル;セフロキサジン;セフスロジンナトリウム;セフタジジム;セフチブテン;セフチゾキシムナトリウム;セフトリアキソンナトリウム;セフロキシム;セフロキシムアキセチル;セフロキシムピボキセチル;セフロキシムナトリウム;セファセトリルナトリウム;セファレキシン;塩酸セファレキシン;セファログリシン;セファロリジン;セファロチンナトリウム;セファピリンナトリウム;セフラジン;塩酸セトシクリン(cetocycline hydrochloride);セトフェニコール;クロラムフェニコール;パルミチン酸クロラムフェニコール;クロラムフェニコールパントテン酸複合体;コハク酸クロラムフェニコールナトリウム;ホスファニル酸クロルヘキシジン;クロロキシレノール;重硫酸クロルテトラサイクリン;塩酸クロルテトラサイクリン;シノキサシン;シプロフロキサシン;塩酸シプロフロキサシン;シロレマイシン(cirolemycin);クラリスロマイシン;塩酸クリナフロキサシン;クリンダマイシン;塩酸クリンダマイシン;塩酸パルミチン酸クリンダマイシン;リン酸クリンダマイシン;クロファジミン;クロキサシリンベンザチン;クロキサシリンナトリウム;クロルヘキシジン、クロキシキン;コリスチメタートナトリウム;硫酸コリスチン;クーママイシン;クーママイシンナトリウム;シクラシリン;シクロセリン;ダルホプリスチン;ダプソン;ダプトマイシン;デメクロサイクリン;塩酸デメクロサイクリン;デメサイクリン;デノフンギン;ジアベリジン;ジクロキサシリン;ジクロキサシリンナトリウム;硫酸ジヒドロストレプトマイシン;ジピリチオン;ジリスロマイシン;ドキシサイクリン;ドキシサイクリンカルシウム;ドキシサイクリンフォスファテックス;ドキシサイクリンヒクレート;ドロキサシンナトリウム;エノキサシン;エピシリン;塩酸エピテトラサイクリン;エリスロマイシン;エリスロマイシンアシストラート;エリスロマイシンエストレート;エチルコハク酸エリスロマイシン;エリスロマイシングルセプテート;エリスロマイシンラクトビオン酸塩;エリスロマイシンプロピオネート;エリスロマイシンステアレート;塩酸エタンブトール;エチオナミド;フレロキサシン;フロキサシリン;フルダラニン;フルメキン;ホスホマイシン;ホスホマイシントロメタミン;フモキシシリン;塩化フラゾリウム;酒石酸フラゾリウム;フシジン酸ナトリウム;フシジン酸;ガンシクロビルおよびガンシクロビルナトリウム;ゲンタマイシン硫酸塩;グロキシモナム;グラミシジン;ハロプロジン;ヘタシリン;ヘタシリンカリウム;ヘキセジン;イバフロキサシン;イミペネム;イソコナゾール;イセパマイシン;イソニアジド;ジョサマイシン;カナマイシン硫酸塩;キタサマイシン;レボフラルタドン;レボプロピルシリンカリウム;レキシスロマイシン;リンコマイシン;塩酸リンコマイシン;ロメフロキサシン;塩酸ロメフロキサシン;メシル酸ロメフロキサシン;ロラカルベフ;マフェニド;メクロサイクリン;メクロサイクリンスルホサリチラート;メガロマイシンカリウムフォスファート;メキドクス;メロペネム;メタサイクリン;塩酸メタサイクリン;メテナミン;ヒプル酸メテナミン;マンデル酸メテナミン;メチシリンナトリウム;メチオプリム;塩酸メトロニダゾール;リン酸メトロニダゾール;メズロシリン;メズロシリンナトリウム;ミノサイクリン;塩酸ミノサイクリン;ミリンカマイシン塩酸塩;モネンシン;モネンシンナトリウム(monensin sodiumr);ナフシリンナトリウム;ナリジクス酸ナトリウム;ナリジクス酸;ナタマイシン(natainycin);ネブラマイシン;パルミチン酸ネオマイシン;ネオマイシン硫酸塩;ウンデシレン酸ネオマイシン;ネチルマイシン硫酸塩;ノイトラマイシン;ニフイラデン(nifuiradene);ニフラルデゾン;ニフラテル;ニフラトロン;ニフルダジル;ニフリミド;ニフィウピリノール(nifiupirinol);ニフルキナゾール;ニフルチアゾール;ニトロシクリン;ニトロフラントイン;ニトロミド;ノルフロキサシン;ノボビオシンナトリウム;オフロキサシン;オンネトプリム(onnetoprim);オキサシリンおよびオキサシリンナトリウム;オキシモナム;オキシモナムナトリウム;オキソリン酸;オキシテトラサイクリン;オキシテトラサイクリンカルシウム;オキシテトラサイクリン塩酸塩;パルジマイシン;パラクロロフェノール;パウロマイシン;ペフロキサシン;メシル酸ペフロキサシン;ペナメシリン;ペニシリン、例えば、ペニシリンGベンザチン、ペニシリンGカリウム、ペニシリンGプロカイン、ペニシリンGナトリウム、ペニシリンV、ペニシリンVベンザチン、ペニシリンVヒドラバミン、およびペニシリンVカリウム;ペンチジドンナトリウム;アミノサリチル酸フェニル;ピペラシリンナトリウム;ピルベニシリンナトリウム;ピリジシリンナトリウム;塩酸ピルリマイシン;ピバンピシリン塩酸塩;ピバンピシリンパモ酸塩;ピバンピシリンプロベナート;ポリミキシンb硫酸塩;ポルフィロマイシン;プロピカシン;ピラジナミド;ピリチオン亜鉛;酢酸キンデカミン;キヌプリスチン;ラセフェニコール;ラモプラニン;ラニマイシン;レロマイシン;レプロマイシン;リファブチン;リファメタン;リファメキシル;リファミド;リファンピン;リファペンチン;リファキシミン;ロリテトラサイクリン;硝酸ロリテトラサイクリン;ロサラミシン;酪酸ロサラミシン;ロサミシンプロピオナート;ロサラミシンリン酸ナトリウム塩;ロサラミシンステアラート;ロソキサシン;ロキサルソン;ロキシスロマイシン;サンサイクリン;サンフェトリネムナトリウム;サルモキシシリン;サルピシリン;スコパフンギン;シソマイシン;硫酸シソマイシン;スパルフロキサシン;塩酸スペクチノマイシン;スピラマイシン;スタリマイシン塩酸塩;ステフィマイシン;硫酸ストレプトマイシン;ストレプトニコジド(streptonicozid);スルファベンズ;スルファベンズアミド;スルファセタミド;スルファセタミドナトリウム;スルファシチン;スルファジアジン;スルファジアジンナトリウム;スルファドキシン;スルファレン;スルファメラジン;スルファメータ;スルファメタジン;スルファメチゾール;スルファメトキサゾール;スルファモノメトキシン;スルファモキソール;スルファニラート亜鉛;スルファニトラン;スルファサラジン;スルファソミゾール;スルファチアゾール;スルファザメト;スルフイソキサゾール;アセチルスルフイソキサゾール;スルフィソキサゾールジオラミン(sulfisboxazole diolamine);スルホミキシン;スロペネム;スルタミシリン(sultamricillin);サンシリンナトリウム;塩酸タランピシリン;テイコプラニン;テマフロキサシン塩酸塩;テモシリン;テトラサイクリン;テトラサイクリン塩酸塩;テトラサイクリンリン酸複合体(tetracycline phosphate complex);テトロキソプリム;チアンフェニコール;チフェンシリンカリウム;チカルシリンクレシルナトリウム;チカルシリン二ナトリウム;チカルシリン一ナトリウム;チクラトン;塩化チオドニウム;トブラマイシン;硫酸トブラマイシン;トスフロキサシン;トリメトプリム;硫酸トリメトプリム;トリスルファピリミジン;トロレアンドマイシン;トロスペクトマイシン硫酸塩;チロトリシン;バンコマイシン;塩酸バンコマイシン;バージニアマイシン;ゾルバマイシン;およびこれらの組み合わせ、の使用が可能である。
本明細書に開示される組成物は、任意選択的に、1つ以上の追加的な微生物、例えば農学的に有利な微生物をさらに含んでもよい。かかる農学的に有利な微生物は、本開示の生物と相乗的にまたは協力して、あるいはそれ以外では連携して機能し得る。農学的に有利な微生物の例として、バチルス・エスピー(Bacillus sp.)、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)、リゾビウム・エスピー(Rhizobium sp.)、アゾスピリルム・エスピー(Azospirillum sp.)、アゾトバクター・エスピー(Azotobacter sp.)、光栄養およびセルロース分解細菌、クロストリジウム・エスピー(Clostridium sp.)、トリコデルマ・エスピー(Trichoderma sp.)などが挙げられる。当業者は、このリストが単にあくまで例示的なものであり、本明細書で提供される特定例を参照することによって制限されないことを理解するであろう。
土壌環境においては、接種細菌は、天然の競合生物および捕食生物の中での生存が困難であることは理解できる。環境内での適用時、本開示の組成物中に存在する微生物の生存に役立てるため、株の1つ以上は、例えば適切なポリマーマトリックスで被包してもよい。一例では、被包は、例えば、ヤング(Young)ら著、2006年、「腐植酸の場合に豊富に存在するアルギン酸ビーズでの植物成長促進細菌の被包(Encapsulation of plant growth−promoting bacteria in alginate beads enriched with humic acid)」、バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング(Biotechnology and Bioengineering)、第95巻:pp.76−83(その開示内容はその全体が参照により本明細書中に援用される)に記載されているアルギン酸ビーズを含んでもよい。当業者は、任意の適切な被包材料またはマトリックスの使用が可能であることを理解するである。被包は、当業者に既知の方法および技術を用いて行ってもよい。被包された微生物は、微生物に加えて、栄養分または組成物の他の成分を含み得る。
本明細書に開示される組成物は、処置を必要とする任意の植物または動物に、直接的または間接的に適用または投与してもよい。植物への適用の場合、組成物は、植物の部分(葉など)または種子に、あるいはその他として、植物が成長しているかまたは成長がなされるべき土壌、または種子が蒔かれているかまたは蒔かれるべき土壌に適用してもよい。適用は、任意の適切な手段を介してもよく、また任意の適切な規模であってもよい。例えば、適用は、注入、散布または噴霧、例えば、大規模あるいは大量の散布または噴霧、植付前の種子の浸漬、および/あるいは植付または植苗(seedlings)後の種子の浸漬を含んでもよい。当業者は、複数の適用手段の併用(例えば、植付前に種子の浸漬後、植えられた種子の浸漬、および/または苗または成熟植物の適用)が可能であることを理解するであろう。種子、苗または成熟植物は、必要に応じて多くの回数、処置してもよい。必要とされる適用の数は、当業者により、例えば、問題の植物、処置されるべき病原体または疾患、処置が開始される植物の発生の段階、植物の健康状態、植物が成長する上での成長、環境および/または気候条件、ならびに植物が成長する場合の目的に応じて、容易に判定することができる。
したがって、本開示によると、本明細書に開示される組成物は、組成物が土壌または植物種子もしくは植生に対して適用されるべき手段に応じて任意の適切な形態で調製してもよい。適切な形態は、例えば、スラリー、液体、および個体形態を含み得る。固体形態は、散剤、顆粒剤、より大きい微粒子形態およびペレットを含む。固体形態は、水溶性コーティング剤(例えば、染色または非染色のゼラチンスフィア(spheres)またはカプセル剤)で、持続放出コーティング剤で、あるいは、例えば、ゼラチン、ポリビニルアルコール、エチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、またはスチレン無水マレイン酸のうちの1つ以上を用いた自由流動性粉末(free−flowing powder)へのマイクロカプセル化により、被包することができる。液体は、水溶液および水性懸濁剤、および乳剤を含んでもよい。
本明細書に開示される組成物の環境中で有効な分散、接着および/あるいは保存または安定性を得るため、組成物を、分散、接着および保存/安定性を助ける適切な担体成分と調合することは有利であり得る。適切な担体は、当業者に既知であり、例えば、キトサン、バーミキュライト、コンポスト、タルク、脂粉乳、ゲルなどを含むことになる。
追加的な成分、例えば、フミン質、微量元素、有機材料、浸透剤、多量養素、微量栄養素および他の土壌および/または植物添加剤は、本開示の組成物中に組み込んでもよい。
組み込み可能な腐植質またはフミン質は、限定はされないが、例えば酸化された亜炭またはレオナルダイト由来の腐植酸、フルボ酸、およびフミン酸カリウムなどのフミン酸塩、を含んでもよい。
添加される有機材料は、限定はされないが、バイオソリッド、動物肥料、コンポストまたはコンポスト化有機副産物、活性化汚泥または加工された動物もしくは野菜副産物(血粉、羽毛粉、綿実粕、海洋ケルプ(ocean kelp meal)、海藻抽出物、魚乳液(fish emulsion)および魚粉を含む)を含んでもよい。
浸透剤は、限定はされないが、非イオン性浸潤剤、洗剤ベースの界面活性剤、シリコーン、および/または有機シリコーンを含む。適切な浸透剤は、当業者に既知であり、非限定例として、高分子ポリオキシアルキレン、アリノール(allinol)、ノキシノール、オクトキシノール、オキシカストロール(oxycastrol)、TRITON、TWEEN、Sylgard309、SilwetL−77、およびHerbex(シリコーン/界面活性剤混合物)、を含むことになる。
組成物中に封入される代表的な微量元素は、実施例3に提供される。しかし、当業者は、適切な微量元素がそれらに限定されず、また任意の微量元素(天然または合成)が使用可能であることを理解するであろう。
本開示の組成物に添加することができる任意選択的なさらなる土壌および/または植物添加剤として、例えば、水捕捉剤(water trapping agent)、例えば、ゼオライト、酵素、植物成長ホルモン、例えばジベレリン、ならびに防除剤、例えばアカラサイド(acaracide)、殺虫剤、殺真菌薬および抗線虫剤、が挙げられる。
被包された株を含む組成物を含む、本開示の組成物は、凍結乾燥することで、有効期間を延長し、および/またはフィールド散布(field dispersal)などの農業用途に役立てることが可能である。
任意の先行出版物(またはそれに由来する情報)、または既知の任意の事項への本明細書中での参照は、その先行出版物(またはそれに由来する情報)または既知の事項が本明細書が関係する注力分野における共通の一般的知識の一部を形成することの承認または許可または示唆の任意形式として解釈されないし、また解釈されるべきではない。
本開示はここで、以下の詳細な実施例を参照して説明されることになり、実施例は決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
以下の実施例は、本発明を例示するものであり、本明細書全体を通した説明の開示される一般的性質を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
実施例1 微生物株および株の組み合わせ
以下の微生物株および株の組み合わせは、本明細書に記載の実験において使用した。
ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18は、環境供給源(environmental source)から単離した。16S rRNAの部分配列決定によると、リスク群1(TRBA)を有するラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)AB262735に対する100%の類似性が示された。Lp18は、MRS培地上、34℃で嫌気的に3日間培養する場合、クリーム状で円形のわずかな光沢のある凸状の直径1〜2mmのコロニー(通性嫌気性菌)をもたらす。その顕微鏡での外観は、グラム陽性で非運動性の短桿菌であり、長方形で主に複相である。ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18は、受託番号V11/022945の下、2011年10月27日にオーストラリア国立標準研究所に寄託した。
ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23は、環境供給源から単離した。16S rRNAの部分配列決定によると、リスク群1(TRBA)を有するラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)AB429368に対する99%の類似性が示された。Lb23は、MRS培地上、34℃で嫌気的に4日間培養する場合、クリーム状で光沢のある凸状の直径1〜2mmのコロニー(通性嫌気性菌)をもたらす。その顕微鏡での外観は、グラム陽性で非運動性の鎖状桿菌である。ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23は、受託番号V11/022946の下、2011年10月27日にオーストラリア国立標準研究所に寄託した。
ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)Lr24は、環境供給源から単離した。16S rRNAの部分配列決定によると、リスク群1(DSMZ)を有するラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)AB366389に対する99%の類似性が示された。Lr24は、MRS培地上、34℃で嫌気的に4日間培養する場合、クリーム状で円形の光沢のある直径0.5mmのコロニー(通性嫌気性菌)をもたらす。その顕微鏡での外観は、グラム陽性で非運動性の短桿菌であり、単相または複相である。ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)Lr24は、受託番号V11/022947の下、2011年10月27日にオーストラリア国立標準研究所に寄託した。
API(登録商標)50CHストリップ(ビオメリュー(Biomerieux))の発酵結果によると、Lr24が、L−アラビノース、D−リボース、D−キシロース、D−フルクトース、およびエスクリンクエン酸第二鉄(Esculin ferric citrate)のみを発酵させることが示される。
ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26は、環境供給源から単離した。16S rRNAの部分配列決定によると、リスク群1(TRBA)を有するラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)AB008213.1に対する99%の類似性が示された。Lz26は、MRS培地上、34℃で嫌気的に48時間培養する場合、白色で円形の光沢のある凸状の直径1mmのコロニー(通性嫌気性菌)をもたらす。その顕微鏡での外観は、グラム陽性で非運動性の短桿菌であり、大部分が球菌様、複相であり、一部は鎖状である。ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26は、受託番号V11/022948の下、2011年10月27日にオーストラリア国立標準研究所に寄託した。
API(登録商標)50CHストリップ(ビオメリュー(Biomerieux))の発酵結果によると、Lz26が、D−アラビノース、D−リボース、D−アドニトール、D−ガラクトース、D−グルコース、D−フルクトース、D−マンノース、L−ラムノース、ズルシトール、イノシトール、D−マンニトール、D−ソルビトール、N−アセチルグルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリンクエン酸第二鉄、サリシン、D−セロビオース、D−ラクトース、D−トレハロース、D−メレジトース、ゲンチオビオース、D−ツラノース、D−タガトース、L−フコース、L−アラビトール、グルコン酸カリウム、および2−ケトグルコン酸カリウム(Potassium 2−Ketogluconate)、を発酵させることが示される。
アセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Af15は、環境供給源から単離した。16S rRNAの部分配列決定によると、リスク群1(DSMZ)を有するアセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)AM905849に対する100%の類似性が示された。AF15は、麦芽エキス培地上、34℃で3日間培養する場合、不透明で円形の光沢のある凸状の直径1mmのコロニー(好気性)をもたらす。その顕微鏡での外観は、グラム陰性の桿菌であり、単相または複相である。アセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Af15は、受託番号V11/022943の下、2011年10月27日にオーストラリア国立標準研究所に寄託した。
カンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)Ce31は、環境供給源から単離した。16SrRNAの部分配列決定は、カンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)AB534618に対する89%の類似性を示した。Ce31は、麦芽エキス培地上、34℃で2日間に培養する場合、クリーム状の平坦な鈍い色の丸みを帯びた直径2〜3mmのコロニー(好気性)をもたらす。その顕微鏡での外観は、発芽中の卵形の酵母である。カンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)Ce31は、受託番号V11/022944の下、2011年10月27日にオーストラリア国立標準研究所に寄託した。
本明細書に記載の実験において使用される他の株は、受託番号V12/022847の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託したラクトバチルス・ディオリボランス(Lactobacillus diolivorans)(N3);受託番号V12/022848の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託したラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)(N11);受託番号V12/022851の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託したラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)(TD);受託番号V12/022849の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託した本明細書で「T9」と命名した株;および受託番号V12/022850の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託した本明細書中で「TB」と命名した株、であった。
受託番号V12/022850の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託した本明細書で「TB」と命名した株は、小型16SリボソームRNA(rRNA)配列のSILVA BLASTアライメント探索(クワスト(Quast)ら著、2013年、「SILVAリボソームRNA遺伝子データベースプロジェクト:改善されたデータ処理およびウェブベースのツール(The SILVA ribosomal RNA gene database project:improved data processing and web−based tools.)」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucl.Acid Res.)、41(D1):D590−596)による判定では、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)に対して31.5%の全ゲノムのグローバルな類似性を有する。API(登録商標)50CHストリップ(ビオメリュー(Biomerieux))の発酵結果によると、TBが、D−ガラクトース、D−グルコース、D−フルクトース、D−マンノース、メチル−αD−マンノピラノシド、メチル−αD−グルコピラノシド、N−アセチルグルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリンクエン酸第二鉄、サリシン、D−セロビオース、D−マルトース、D−ラクトース、スクロース、D−メレジトース、D−ラフィノース、ゲンチオビオース、D−タガトースおよびグルコン酸カリウム、を発酵させることが示される。
受託番号V12/022849の下、2012年12月14日にオーストラリア国立標準研究所に寄託した本明細書で「T9」と命名した株は、SILVA BLASTアライメント探索による判定では、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)に対して95.3%の全ゲノムのグローバルな類似性を有する。API(登録商標)50CHストリップ(ビオメリュー(Biomerieux))の発酵結果によると、T9発酵物のD−リボース、D−ガラクトース、D−グルコース、D−フルクトース、D−マンノース、D−マンニトール、D−ソルビトール、メチル−αD−グルコピラノシド、N−アセチルグルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリンクエン酸第二鉄、サリシン、D−セロビオース、D−マルトース、スクロース、D−トレハロース、イヌリン、ゲンチオビオース、D−ツラノース、D−タガトース、L−アラビトール、グルコン酸カリウムおよび2−ケトグルコン酸カリウム、を発酵させることが示される。
上記微生物株の以下の組み合わせは、本明細書に後述される実験において使用した。
本明細書で後述される「GL組成物」と称される組成物は、上記の6つの微生物株(すなわち、アセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Af15、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)Lr24、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26およびカンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)Ce31)を、乳酸桿菌(Lactobacillus)株の各々に対して2.5×10cfu/ml、カンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)Ce31に対して1.0×10cfu/ml、およびアセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Af15に対して1.0×10cfu/mlといった最終濃度で含む。
本明細書で後述される「Mix G」と称される組成物は、上記の微生物株のうちの3つ、詳細にはラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26、TB株(NMI受託番号V12/022850)およびT9株(NMI受託番号V12/022849)を含む。新しい細菌の培養物は、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26が1×10cfu/ml、TBが1×10cfu/ml、およびT9が1×10cfu/mlといった各々の最終濃度で、2%の微量元素、0.3%のフミン質、4%の糖蜜および水の混合物に添加した。組成物は、リン酸を用いてpH3.8〜4.2に調整した。
本明細書で後述される「Mix I」と称される組成物は、上記の微生物株のうちの5つ、詳細にはラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18、カンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)Ce31、およびアセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Af15を含む。新しい細菌の培養物は、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26が1×10cfu/ml、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23が1×10cfu/ml、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18が1×10cfu/ml、カンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)Ce31が1×10cfu/ml、およびアセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Af15が1×10cfu/mlといった各々の最終濃度で、2%の微量元素、0.3%のフミン質、4%の糖蜜および水の混合物に添加した。組成物は、リン酸を用いてpH3.8〜4.2に調整した。
本明細書で後述される「Mix 2」と称される組成物は、上記の微生物株のうちの5つ、詳細にはラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)Lr24、およびアセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Af15を含む。新しい細菌の培養物は、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26が1×10cfu/ml、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18が1×10cfu/ml、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23が1×10cfu/ml、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)Lr24が1×10cfu/ml、およびアセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Af15が1×10cfu/mlといった各々の最終濃度で、2%の微量元素、3%の糖蜜および逆浸透水の滅菌混合物に添加した。
本明細書で後述される「Mix 3」と称される組成物は、上記の微生物株のうちの4つ、詳細にはラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23、およびラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)Lr24を含む。新しいラクトバチルス・エスピー(Lactobacillus sp.)の培養物は、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26が1×10cfu/ml、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18が1×10cfu/ml、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23が1×10cfu/ml、およびラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)Lr24が1×10cfu/mlの各々の最終濃度で、3%の糖蜜および逆浸透水の滅菌混合物に添加した。
培養物の維持
30%のグリセロールストックは、各分離株から作製し、長期の培養物保存用に、−80℃で維持した。短期間貯蔵の培養物は、寒天傾斜(3ケ月貯蔵)および寒天プレート(毎月継代培養する)上で4℃に維持した。分離株の初期特性を維持するため、3回のプレート継代培養後に、−80℃のストックから新たなプレートを作製する。
接種および成長培地
乳酸桿菌(Lactobacillus)株は、用途に応じて、MRS培養液(ディフコ(Difco))中またはMRS寒天プレート上のいずれかで、空気の存在下または不在下(ラクトバチルス・ラピ(L.rapi)は嫌気性を好む)で成長させた。培養物は、ルーチン的に、30〜34℃の中温度域で2日間成長させた。アセトバクター(Acetobacter)およびエタノリカ(Ethanolica)株は、用途に応じて、麦芽エキス培養液(オクソイド(Oxoid))中または麦芽エキス寒天プレート上のいずれかで好気的に成長させた。培養物は、ルーチン的に、30〜34℃の中温度域で2日間成長させた。
発酵槽「種子」の調製
個々の株においては、滅菌ニクロム線を使用して、単一のコロニーを、新しい培養プレートから除去し、15mLの滅菌培地を有するユニバーサルボトルに移す。瓶は、30℃、140rpm、48時間に設定した振盪培養器内に確実に配置する(ラクトバチルス・ラピ(L.rapi)は振盪しない)。インキュベーション後、混濁細菌成長は、可視化される必要がある。「種子」接種瓶は、必要になるまで(最大1週間)4℃で貯蔵する。
典型的には、5%細菌の接種が、発酵ランに必要である。貯蔵された15mlの培養種子は、全発酵槽実質容積の5%に相当する容積の滅菌培地を有するショット瓶(Schott bottle)に添加する。培養物は、15mlの種子の場合と同様に、インキュベートし、振盪する。大規模な自動発酵槽を使用し、各分離株の純培養物を成長させる。アルカリ、消泡剤およびグルコースを自動供給する。典型的には、温度は、30〜34℃、pH5.5で維持されるが、酸素および撹拌は、微生物に応じて変更する。
試料分析
分離株の各大規模培養後、試料は、無菌的に採取され、生存率カウントは、10倍連続希釈を用いて行う(層流フード内で実施)。湿ったスライドもまた調製し、純度を位相差顕微鏡を用いて観察し、培地上で存在し得るが成長することができない汚染物質について二重に検査する。48時間後、生存率用プレートは、純培養物(同じコロニー形態)について検査し、コロニーはカウントし、1mlあたりのコロニー形成単位(cfu/ml)値が得られる。グラム染色もまた、顕微鏡観察のため、実施する。
実施例2 フザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・ジンギベリ(Fusarium oxysporum f.sp.zingiberi)に対する活性
ショウガ黄化病は、1955年にクイーンズランド州で最初に報告された。それは、葉の黄変およびしおれやショウガの根茎腐敗をもたらす、フザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・ジンギベリ(Fusarium oxysporum f.sp.zingiberi)によって引き起こされる。この疾患は、オーストラリアのショウガ産業において重大な経済的損失を引き起こしている。
発明者は、植物病原菌フザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・ジンギベリ(Fusarium oxysporum f.sp.zingiberi)に実施例1に記載の個々の細菌株(以降「GL」株)を負荷し、それらがフザリウム(Fusarium)ショウガ病原体に対して拮抗的効果を示すか否かを判定する室内実験を実施した。
フザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・ジンギベリ(Fusarium oxysporum f.sp.zingiberi)(以降「foz」)の純粋な分離株は、ハーバリウム(Herbarium)(BRIP) クイーンズランド州第一次産業省(Queensland DPI)培養株保存機関から購入した。Fozは、室温で好気的にPDA固体培地上でルーチン的に成長させた。数日後、淡紅色の成長が見られ、約5日後、白色の気菌糸が発生する。それはまた、麦芽エキス(ME)およびMRS固体培地上で十分に成長する。ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)Lr24、およびラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26は、34℃、MRS培地上で嫌気的にルーチン的に成長させた。アセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Af15およびカンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)Ce31は、34℃、ME寒天上で好気的にルーチン的に成長させた。GL細菌株の抗真菌活性は、以下の実験プロトコルに従い、4つの異なる方法、ウェルプレート、クロスストリークプレート、二重プレート検査および培養物滴下方法を用いて測定された。
ウェルプレート
・2つの寒天プレートを、各病原体の成長要件に特化して調製した。
・1mlの滅菌チップの大きい方の末端を用いて、6つの9mm穴を一方のプレート内にカットし、7つの9mm穴を2番目のプレート内にカットした。
・滅菌した0.85%生理食塩水2.5mlを、滅菌ビジュー瓶(bijoux bottle)に添加した。火炎殺菌した(flamed)白金耳を用いて、2〜3のコロニー(または2本の白金耳で真菌菌糸成長)を、新規に成長させた病原体のプレートから取り出し、洗い落として生理食塩水に入れ、十分にボルテックスしたことで、溶液は、見かけ上0.5のマクファーランド標準に近かった。
・滅菌スワブを、生理食塩水/コロニー混合物に浸漬し、穏やかな圧力を用いて、ウェルを破壊しないように注意して、スワブをプレートに対してジグザグに横断させた。これを3回繰り返し、プレートを各回ごとに少し回転させた。
・試験対象の特定のGL株の新しく成長させた培養液(1〜3日)を、滅菌した0.45μmのフィルターを通して濾過し、微生物を除去した。濾液は回収し、滅菌ビジュー瓶に入れた。
・プレートの各ウェルは、試験対象のGL株の各々で標識した。80μlの濾液を各ウェルに添加した。
・プレートは放置し、最上部に蓋をし、室温でインキュベートした。
・24時間後、プレートを、病原体の成長について検査した。任意のクリアな阻害域の直径(9mmのウェル径を含む)を測定し、記録した。成長がほとんどないかまたは弱いと見られた場合、プレートは、良好な成長が見られるまで、より長い間インキュベーション状態で放置した。
クロスストリークプレート
本方法は、成長するGL株の、上清濾液ではなく病原体に対する、本質的効果を検討するために用いられた。
・火炎殺菌した白金耳を用いて、新しいGL培養物にいくつかの垂直なストリーク(約1cm幅)を、(細菌成長要件に関連して)寒天プレートの中央から下方に作成した。
・プレートは、適切な成長温度で一晩インキュベートし、GL分離株の良好な成長が得られた。
・病原体の新しいプレート培養物を用いて、一本のラインを、プレートの左から右へ水平に横切るように作成した。プレートは、再びインキュベートした。
・インキュベーションの24時間後、プレートの左側を、真菌病原体およびGL株接種ライン間の任意の成長阻害領域について観察した(右側は病原体とGL株の混合物である)。必要があれば、プレートは、病原体の良好な成長が見られるまで、より長期間インキュベーション状態で放置した。
二重プレート検査
本方法は、GL株および病原体の異なる成長要件に関連した困難を回避するため、開発した。検査は、2セクションのペトリ皿内で、1セクションあたり2つの異なる成長培地を用いて実施した。
・2セクションを有する滅菌ペトリ皿を用いて、GL細菌培養寒天培地を、両セクションに注入した。
・一旦乾燥させてセットすると、各セクションの半分を無菌的に切り離した。離した4分の1のセクションは、病原体成長培地で満たした。
・1〜3つの新しいGL株コロニーは、2.5mlの滅菌した0.85%生理食塩水に、0.5のマクファーランド標準と同様の密度になるまで添加した。
・滅菌スワブを用いて、4分の1のセクションにつき3つの塗抹物を作成した。プレートは、微生物に応じて好気的(または嫌気的)に34℃で24〜48時間インキュベートした。
・3本の滅菌白金耳のサイズのfoz群を、新しいプレートから切断し、5mlの滅菌ミリQ水で洗浄し、十分にボルテックスし、混合した。
・滅菌スワブを用いて、1つの塗抹物を、病原体寒天培地全体に、GL株に接近しても接触しないように注意して作成した。
・プレートは、二重にラップし、病原体の成長速度に応じて、適切な病原体の成長温度(一般に27℃)で1〜10日間インキュベートした。
・病原体成長およびGL株エッジの間の距離を測定し、記録した。
培養物滴下方法
これは、GL株の生培養物の病原体に対する直接的効果を観察するため、使用した。スワブによるfoz塗抹プレートを、上記のように調製した。10μlの新たに成長したGL株の一晩培養物を、foz塗抹プレートの最上部、マークしたスポット内に滴下した。プレートは、室温で一晩放置し、24および48時間の成長後、観察した。クリアな阻害域直径を記録した。
室内実験から得られた結果を表1に示す。活発に成長するラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)Lr24およびラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26が、fozの成長を最も阻害することを示した。これらの生物の成長培養物由来の無細胞濾液がfozの成長を阻害しなかったという事実は、細菌とフザリウム(Fusarium)病原体との間に相互作用が存在することを示唆する。アセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Af15およびカンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)Ce31は、fozの成長に対する阻害能がより低いことを示した。
また、活発に成長する株のラクトバチルス・ディオリボランス(Lactobacillus diolivorans)(N3)、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)(TD)、ならびにTB株およびT9株、ならびにN3、TB、T9、TDおよびラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)(N11)の培養物から抜かれた無細胞濾液は、fozに対して活性を示した。
実施例3 スイカ苗におけるフザリウム(Fusarium)の制御
感染苗
次いで、発明者は、実施例1に記載の細菌株を含む組成物の、ハンツマン(Huntsman)スイカ苗中の植物病原菌フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)に対する効果について検討した。フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)は、多数の特殊型(エフ・エスピー(f.sp))を有する。スイカを冒してつる割病を引き起こす型は、フザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・ニベウム(Fusarium oxysporum f.sp niveum)である。本試験で使用した苗は、フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)に感染され、(Jason Klotzによって提供された)土壌中に重要なフザリウム(Fusarium)問題を伴うスイカ農場から得た。
組成物(以降「GL組成物」と称される)は、実施例1に列挙された6つの微生物株(すなわち、アセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Af15、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)Lr24、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26、およびカンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)Ce31)を、乳酸桿菌(Lactobacillus)株の各々に対して2.5×10cfu/ml、カンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)に対して1.0×10cfu/ml、およびアセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)に対して1.0×10cfu/mlの最終濃度で含んだ。株は、実施例1に記載のように成長させ、2%の微量元素、0.3%のフミン酸塩(可溶性フミン酸塩、LawrieCo)、3%の糖蜜および0.1〜0.2%のリン酸と混合させた。リン酸は、pHが3.8〜4.0の範囲内の値になるまで添加した。微量元素成分は、典型的には以下を含んだ(1,000Lあたり)。
実験スキームを表3に示す。各実験は4回繰り返した。
フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)に感染されることが知られているハンツマン(Huntsman)スイカ苗を、鉢植えし、約28〜30℃で水耕光下に置いた。到着時、苗は淡黄色を呈した。鉢植えした苗を、水やりの上、表3に記載のように処置した。すべての鉢は、1日2回、スプレー缶を用いて水やりをした。植物が成長するにつれ、1植物あたりの水量を増やした。
植付から1週間後の最初の観察後、全植物は、対照実験(D)の場合を除き、40L/Ha、1:10GLで処置した。植物は、約3週にわたり、週1回の処置を受けた。
実験A、BおよびCにおいて最初の処置から7日後、植物がしおれて乾燥することが認められた。2回目の処置から48時間後、実験AおよびB(および実験Cにおける1つの鉢)における植物は、健康な様子であった。実験Cにおける3つの鉢内の植物および対照は、乾燥死状態であった。結果は、下記および図1中にまとめる。
実験A:4/4の植物が、フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)感染から生存した。植物は、他の処置と比較して、より大きく、より活発な葉を有した。植物は、はるかに頑丈な主茎を有した。根系は、全回において、著しく緻密で高密度であった。植物の平均重量は、最高であり、植物の成長全体が良好であることの現れであった。
実験B:3/4の植物が、フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)感染から生存した。1つの植物が、最初の1週間後、病原体に冒された。葉のサイズは平均であり、植物の健康は良好であった。根系は、Aの場合よりも低密度であった。全体的な植物の健康は十分なものであった。植物の主茎は頑丈であった。
実験C:1/4の植物が、フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)感染から生存した。全体的な植物の成長および健康は、極めて不良であった。
実験D:全回での植物が、フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)に冒され、1週間以内に死滅した。
要するに、結果によると、感染苗の根を植付前に30分間、1:10GL溶液に浸漬することが、他の処置やHO対照の場合と比べて最も奏功したことが示される。GL溶液中に存在する細菌を根の根圏に導入したことで、植物病原菌フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)に対する植物の生存機会が増大したことは明白である。
感染土壌中の苗の保護
次いで、発明者は、本明細書に記載の微生物株組成物が、フザリウム・エスピー(Fusarium sp.)感染土壌に対してスイカ苗を保護し得るか否かについて検討した。
実験1
24のセルトレイを有する小型の伝播温室を、実験に使用した。トレイは、スイカを攻撃するフザリウム(Fusarium)種に感染されることが知られている混合された畑土壌のウェルで満たした。「キャンディ・レッド(Candy red)」スイカ種子のうちの3つの種子を、各セルに蒔いた。1つの調合物/対照につき、3つのセルを用いた。各トリオは下を袋詰めし、ドレナージが流れ出ることによる調合物間の二次汚染を阻止した。セルセットは、水対照、オートクレーブした土壌対照(2日置きに3回のオートクレーブ)および微生物組成物Mix G(実施例1参照)を有した。2つのセルセット、すなわち浸漬種子と非浸漬種子を比較した。種子は、滅菌水またはMix G(10/1に希釈)のいずれかに1時間浸漬した。各種子は、同様の深さまで蒔き、種蒔き直後、各セルに、6mlの滅菌水または1mlのMix G(1:10)+5mlの滅菌水を投与した。伝播温室は、密封し、直射日光を避けて周囲温度で12日間放置した。
実験2
実験2は、2つの例外を伴うが基本的に実験1と同様に設定した。種子は30分間浸漬し、最初の微生物組成物用量は1/3に低下した(1:10に希釈した300μlのMix Gを3mlの滅菌水に添加した)が、1週間後繰り返した。3mlの滅菌水を、水対照に添加した。
実験1および実験2の結果は、表4に示す。Mix Gと浸漬した種子は、7日目にフォローアップとして2回目投与したことで、スイカ苗をフザリウム(Fusarium)感染に対して、12日間の成長期にわたって保護することに成功した。種子の浸漬時間は、発芽速度に影響した。実験2における浸漬時間の短縮化により、すべての苗の実生高が同等の非浸漬苗に対して改善された。興味深いことに、あらゆる生物学的活性が欠如したオートクレーブした土壌は、両実験において苗の成長を遅らせた。
実施例4 フザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・クベンセ(Fusarium oxysporum f.sp cubense)(栄養体親和性群(Vegetative Compatability Group)0120)受託番号24322に対する活性
フザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・クベンセ(Fusarium oxysporum f.sp cubense)(レース1〜4)は、バナナにおける破壊的なパナマ病の原因病原体である。厳格な検疫封じ込めに起因し、原因病原体は、実験室内で直接的に試験することができなかったが、毒性が低下した株が許可された(focの受託番号24322)。二重プレートアッセイを実施し、そこでは病原体を負荷によってGL組成物に対して成長させたが(実施例3参照)、個々のGL株については実施例1に記載した通りである。実験は、2通りに実施し、繰り返した。結果を表5に示す。結果によると、GL組成物がフザリウム(Fusarium)の成長を完全に阻害したことが示され、また、GL株のラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)(TD)、TBおよびT9からの強力な抗菌効果が示される。
実施例5 他の真菌種に対する活性
シュードセルコスポラ・マカダミア(Pseudocercospora macadamiae)は、マカダミアナッツの外皮斑点病の原因病原体である。それが原因でナッツが成熟前に木から落下し、それはマカダミア産業に多大な経済的損失をもたらす。マカダミアの木の一部の変種は、他種、例えばA16よりも感受性が高い。シュードセルコスポラ・マカダミア(Pseudocercospora macadamiae)の純粋な分離株は、クイーンズランド州第一次産業省(Queensland Department of PrimaryIndustries)培養株保存機関から得られた。実施例1に記載のGL株の、この真菌病原体の成長を阻害する能力を、実施例2に記載のように試験した。結果を下の表6に示す。ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)Lr24、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26、ラクトバチルス・ディオリボランス(Lactobacillus diolivorans)(N3)、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)(TD)、TBおよびT9は、活発に成長する培養物および成長培地(濾液)の双方を用いることで、病原体の成長を阻害することができた。
同様の実験を実施し、実施例1に記載のGL株の、真菌病原体の紋枯病菌(Rhizoctonia solani)(植物種の範囲内での根腐れ、襟腐病(collar rot)、立ち枯れ病およびワイヤーステム(wire stem)の原因物質)および灰色かび病菌(Botrytis cinerea)(ブドウ、トマトおよびストロベリーを含む多種多様な作物を冒す屍体栄養性真菌)の成長を阻害する能力を測定した。実施例2に記載のような二重プレート検査方法を用いたが、例外として、真菌マットの小片を、プレート全体に塗布するのではなく、プレートの最上部に直接置いた。結果を表7に示す。
同様の実験を、二重プレート検査方法を用いて実施し、実施例1に記載のGL株およびミックスの、真菌病原体のトマト輪紋病菌(Alternaria solani)、ナス科炭疽病菌(Colletrichum coccodes)、レプトスファエリア・マクランス(Leptosphaeria maculans)およびスクレロチニア・スクレロチオルム(Sclerotinia sclerotiorum)の成長を阻害する能力を測定した。結果を表8および表9に示す。
実施例6 ストレプトマイセス・スキャビーズ(Streptomyces scabies)に対する活性
発明者は、室内実験を実施し、実施例1に記載のGL株の、ジャガイモそうか病の原因物質であるグラム陽性細菌ストレプトマイセス・スキャビーズ(Streptomyces scabies)の成長を阻害する能力を測定した。
ストレプトマイセス・スキャビーズ(Streptomyces scabies)の純粋な分離株は、The Vegetable Centre,Tasmanian Institute of Agriculture,New Town,TasmaniaのAnabel Wilsonから得た。ストレプトマイセス・スキャビーズ(S.scabies)は、室温、PDA固体培地上で好気的にルーチン的に成長させた。数日後、白色の成長が認められ、約5日後、灰色の気菌糸が発生する。ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)Lr24、およびラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26は、34℃、MRS培地上で嫌気的にルーチン的に成長させた。アセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Af15およびカンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)Ce31は、34℃、ME寒天上で好気的にルーチン的に成長させた。細菌株の抗菌活性は、実施例2に記載のように、3つの異なる方法、ウェルプレート、クロスストリークプレートおよび二重プレートの方法を用いて測定した。
結果を下の表10に示す。活発に成長するラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23およびラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26およびTB株は、ストレプトマイセス・スキャビーズ(S.scabies)の成長阻害が最高であることを示した。これら生物の培養物由来の無細胞上清が、ストレプトマイセス・スキャビーズ(S.scabies)の成長を阻害しなかったという事実は、GL株と病原体との間に相互作用が存在することを示唆する。
実施例7 乳腺炎の原因物質に対する活性
臨床的乳腺炎は、乳業の中で重大な課題である。乳腺炎は、いくつかの異なる細菌種によって引き起こされる可能性があり、主要な原因種は、グラム陽性種の黄色ブドウ球菌(Staphylococcusaureus)およびストレプトコッカス・ウベリス(Streptococcusuberis)ならびにグラム陰性種の大腸菌(Escherichia coli)である。発明者は、実施例1に記載のGL株(単独および組み合わせ)の、大腸菌(Escherichia coli)の環境試料(分離株)、大腸菌(Escherichia coli)の実験室株(アメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)25922)ならびに黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)およびストレプトコッカス・ウベリス(Streptococcus uberis)の実験室株の成長を阻害する能力を検討した。
細菌培養濾液におけるMICの測定
個々の乳酸桿菌(Lactobacillus)GL株の新しい一晩培養物を成長させた。3mlの一晩培養物を、4,000rpmで10分間回転させた。上清をデカントし、0.45μlのシリンジフィルターユニットを通して濾過し、滅菌ビジュー瓶に移した。各細菌培養物からの滅菌濾液およびMRS成長培地の対照は、滅菌した0.85%生理食塩水を用いて、1:1、1:3、1:5、1:10に希釈した。1mlの滅菌チップの幅広い末端(wide end)を用いて、6つのウェルの間隔をあけ、新しい栄養寒天プレート内で穴をカットした。プレートは、(0.5のマクファーランド標準に希釈した)3つの乳腺炎病原体のうちの1つを3回塗布した。80ulの各希釈濾液(ならびに無希釈およびMRS)を、6つのウェルの各々に添加した。これを、各病原体および各細菌濾液に対して繰り返した。プレートを34℃で一晩インキュベートした。成長のクリアな阻害域の直径を測定し、記録した。
結果は、表11、表12および表13に示す。ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26、TBおよびT9からの成長培養濾液は、3つ全部の乳腺炎病原体に対して抗菌活性を示した。濾液は、1:3の希釈に至るまで有効なままであった。3つ全部の病原体は、GL株の不在下で十分に成長した。
病原体を阻害するのに必要とされる最小CFUの測定
6つの乳酸桿菌(Lactobacillus)GL株および2つの組成物(Mix 2およびMix 3;実施例1を参照)の各々の生存度を、実験開始時に測定した。各培養物の1mlあたりのコロニー形成単位(cfu/ml)の数を記録した(表14)。
各株(またはミックス)は、滅菌MRS培地中で1:100、1:1,000および1:10,000に希釈した。栄養寒天/MRSの二重プレートに注いだ(上記)。100μlの希釈培養液を、二重プレート(二つ組)の4分の1の各MRS上に塗抹した。小型ガラス「ホッケースティック(hockey stick)」を使用し、その100μlを培地上に塗抹した。プレートは、嫌気的に34℃で48時間インキュベートした。3つの病原体は、0.5のマクファーランド標準に希釈し、滅菌スワブを用いて、各々を、二重プレートの4分の1の両方の栄養寒天全体に塗布した。プレートは、34℃で2日間、再びインキュベートした。任意の成長のクリアゾーンを測定し、記録した。ゼロはゾーンがないこと(阻害されないこと)を示し、成長なしは病原体が成長しないこと(完全な阻害)を示した。各病原体の塗布ラインは、対照栄養寒天プレート全体に引き、GL株または組成物の不在下でのそれらの生存度が実証された。
結果は、表15、表16および表17に示す。T9およびMix 3の生培養物は、細菌種の原因となる3つ全部の乳腺炎に対する抑制効果をもたらすのに100未満のコロニーを必要とするものとして、最も有効であった。乳酸桿菌(Lactobacillus)Lz26、Lb23およびT9は、第3の抗乳腺炎混合物の調合に使用することになる。3つ全部の病原体は、GL株/組成物の不在下で十分に成長した。
細菌分離株の、GL株の添加から24時間後の成長の阻害域(mm)もまた、(上記実施例に記載のように)測定した。結果は、表18、表19および表20に示す。
実施例8 シュードモナス・サバスタノイ(Pseudomonas savastanoi)に対する活性
発明者はまた、実施例1に記載のGL株の、シュードモナス・サバスタノイ(Pseudomonas savastanoi)(特にオリーブのこぶ病(olive gall disease)の原因物質)の成長を阻害する能力を、実施例2に記載の二重プレート検査方法を用いて検討した。結果は、表21に示す。

Claims (65)

  1. 病原性微生物による被験体の感染を治療または予防するための方法であって、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、およびラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の少なくとも1つの株、あるいは前記株が培養されている培地由来の培養上清または無細胞濾液を含む組成物の有効量を、前記被験体に投与する、またはその他として前記被験体に曝露するステップを含む、方法。
  2. 病原性微生物によって引き起こされるか、またはそれに関連した、被験体における疾患を治療または予防するための方法であって、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、およびラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の少なくとも1つの株、あるいは前記株が培養されている培地由来の培養上清または無細胞濾液を含む組成物の有効量を、前記被験体に投与する、またはその他として前記被験体に曝露するステップを含む、方法。
  3. 1つ以上の抗菌剤の有効量を、前記被験体に投与するか、またはその他として前記被験体に曝露するステップをさらに含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
  4. 前記ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)株が、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)株が、受託番号V11/022945の下、2011年10月27日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18である、請求項4に記載の方法。
  6. 前記ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)株が、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)株が、受託番号V11/022946の下、2011年10月27日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23である、請求項6に記載の方法。
  8. 前記ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)株が、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)Lr24である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)株が、受託番号V11/022947の下、2011年10月27日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)Lr24である、請求項8に記載の方法。
  10. 前記ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)株が、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)株が、受託番号V11/022948の下、2011年10月27日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26である、請求項10に記載の方法。
  12. 前記組成物が、アセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)および/またはカンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)の株をさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記アセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)株が、アセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Afl5である、請求項12に記載の方法。
  14. 前記アセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)株が、受託番号V11/022943の下、2011年10月27日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたアセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Afl5である、請求項13に記載の方法。
  15. 前記カンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)株が、カンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)Ce31である、請求項12に記載の方法。
  16. 前記カンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)株が、受託番号V11/022944の下、2011年10月27日にオーストラリア国立標準研究所に寄託されたカンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)Ce31である、請求項15に記載の方法。
  17. 前記組成物中の前記株のうちの1つ以上が被包される、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記被験体が、植物である、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記植物が、作物種である、請求項18に記載の方法。
  20. 前記被験体が、動物である、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記動物が、他の家畜(farm animal)の家畜(livestock)である、請求項20に記載の方法。
  22. 前記病原性微生物が、植物病または動物病の原因物質である、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記疾患が、腐敗、しおれ、さび病、斑点、胴枯れ病、がん腫病、ウドンコ病、カビ、虫こぶ、痂皮または乳腺炎である、請求項2または請求項22に記載の方法。
  24. 前記病原性微生物が、真菌である、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記真菌が、フザリウム・エスピー(Fusariumsp.)である、請求項24に記載の方法。
  26. 前記フザリウム・エスピー(Fusarium sp.)が、フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)である、請求項25に記載の方法。
  27. 前記フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)が、フザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・ジンギベリ(Fusarium oxysporum f.sp.zingiberi)またはフザリウム・オキシスポラム・エフ・エスピー・ニベウム(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)である、請求項26に記載の方法。
  28. 前記真菌が、シュードセルコスポラ・マカダミア(Pseudocercospora macadamia)、フィアレモニウム・ジモルフォスポラム(Phialemonium dimorphosporum)、灰色かび病菌(Botrytis cinerea)および紋枯病菌(Rhizoctonia solani)から選択される、請求項24に記載の方法。
  29. 前記病原性微生物が、細菌である、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記病原菌が、ジャガイモそうか病菌(Streptomyces scabies)、ストレプトコッカス・ウベリス(Streptococcus uberis)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、大腸菌(Escherichia coli)、またはシュードモナス・サバスタニ(Pseudomonas savastani)である、請求項29に記載の方法。
  31. 前記被験体が植物であり、かつ、前記植物を前記組成物に曝露することは、前記植物が前記組成物とともに生育されるように土壌を処置するステップを含む、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記土壌が、前記植物、実生または植物種子の植付前、植付時あるいは植付後に処置される、請求項31に記載の方法。
  33. 前記被験体が植物であり、かつ、前記植物を前記組成物に曝露することは、植付前に植物根を処置するステップを含む、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
  34. 微生物の成長を阻害するための方法であって、前記微生物、あるいは前記微生物によってコロニー形成される環境またはコロニー形成され得る環境を、請求項1〜17のいずれか一項に定義される組成物の有効量に曝露させるステップを含む、方法。
  35. 前記微生物を1つ以上の抗菌剤の有効量に曝露させるステップをさらに含む、請求項34に記載の方法。
  36. 前記組成物の経時的な複数回の投与または適用を含む、請求項1〜34のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記組成物が、アセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Af15、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)Lr24、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26、およびカンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)Ce31を含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
  38. 前記組成物が、前記株を、前記乳酸桿菌(Lactobacillus)株の各々に対して2.5×10cfu/ml、カンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)Ce31に対して1.0×10cfu/ml、およびアセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Af15に対して1.0×10cfu/mlの最終濃度で含む、請求項37に記載の方法。
  39. 前記組成物が、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26、NMI受託番号V12/022850と命名された前記細菌株、およびNMI受託番号V12/022849と命名された前記細菌株を含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
  40. 前記組成物が、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18、カンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)Ce31、およびアセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Af15を含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
  41. 前記病原体が、フザリウム・エスピー(Fusarium sp.)であり、かつ、前記被験体は、スイカ種子または植物である、請求項39または請求項40に記載の方法。
  42. 前記組成物が、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)Lr24、およびアセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Af15を含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
  43. 前記組成物が、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23、およびラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)Lr24を含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
  44. 前記病原体が、乳腺炎の原因物質である、請求項42または請求項43に記載の方法。
  45. 病原性微生物による被験体の感染を治療または予防するための生物的防除組成物であって、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、およびラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の少なくとも1つの株、あるいは前記株が培養されている培地由来の培養上清または無細胞濾液を含む、生物的防除組成物。
  46. 病原性微生物による被験体の感染によって引き起こされるか、またはそれに関連した、前記被験体における疾患を治療または予防するための生物的防除組成物であって、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、およびラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の少なくとも1つの株、あるいは前記株が培養されている培地由来の培養上清または無細胞濾液を含む、生物的防除組成物。
  47. 微生物の成長を阻害するための組成物であって、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、およびラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の少なくとも1つの株、あるいは前記株が培養されている培地由来の培養上清または無細胞濾液を含む、組成物。
  48. 請求項45〜47のいずれか一項に記載の組成物であって、1つ以上の抗菌剤をさらに含む、組成物。
  49. アセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Af15、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)Lr24、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26、およびカンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)Ce31を含む、請求項45〜47のいずれか一項に記載の組成物。
  50. 前記株を、前記乳酸桿菌(Lactobacillus)株の各々に対して2.5×10cfu/ml、カンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)Ce31に対して1.0×10cfu/ml、およびアセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Af15に対して1.0×10cfu/mlの最終濃度で含む、請求項49に記載の組成物。
  51. ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26、NMI受託番号V12/022850と命名された細菌株、およびNMI受託番号V12/022849と命名された細菌株を含む、請求項45〜47のいずれか一項に記載の組成物。
  52. ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18、カンジダ・エタノリカ(Candida ethanolica)Ce31、およびアセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Af15を含む、請求項45〜47のいずれか一項に記載の組成物。
  53. ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)Lr24、およびアセトバクター・ファバルム(Acetobacter fabarum)Af15を含む、請求項45〜47のいずれか一項に記載の組成物。
  54. ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)Lz26、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)Lp18、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)Lb23、およびラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)Lr24を含む、請求項45〜47のいずれか一項に記載の組成物。
  55. 病原性微生物による被験体の感染を治療または予防するための組成物の作製を意図した、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、およびラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の1つ以上の株の使用。
  56. 病原性微生物による被験体の感染によって引き起こされるか、またはそれに関連した、前記被験体における疾患を治療または予防するための組成物の作製を意図した、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、およびラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の1つ以上の株の使用。
  57. 微生物の成長を阻害するための組成物の作製を意図した、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、およびラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の1つ以上の株の使用。
  58. 病原性微生物による被験体の感染を治療または予防するための方法であって、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)、NMI受託番号V12/022850と命名された細菌株、およびNMI受託番号V12/022849と命名された細菌株から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の少なくとも1つの株、あるいは前記株が培養されている培地由来の培養上清または無細胞濾液を含む組成物の有効量を、前記被験体に投与するか、またはその他として前記被験体に曝露するステップを含む、方法。
  59. 病原性微生物によって引き起こされるか、またはそれに関連した、被験体における疾患を治療または予防するための方法であって、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)、NMI受託番号V12/022850と命名された細菌株、およびNMI受託番号V12/022849と命名された細菌株から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の少なくとも1つの株、あるいは前記株が培養されている培地由来の培養上清または無細胞濾液を含む組成物の有効量を、前記被験体に投与するか、またはその他として前記被験体に曝露するステップを含む、方法。
  60. 病原性微生物による被験体の感染を治療または予防するための生物的防除組成物であって、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)、NMI受託番号V12/022850と命名された細菌株、およびNMI受託番号V12/022849と命名された細菌株から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の少なくとも1つの株、あるいは前記株が培養されている培地由来の培養上清または無細胞濾液を含む、生物的防除組成物。
  61. 病原性微生物による被験体の感染によって引き起こされるか、またはそれに関連した、前記被験体における疾患を治療または予防するための生物的防除組成物であって、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)、NMI受託番号V12/022850と命名された細菌株、およびNMI受託番号V12/022849と命名された細菌株から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の少なくとも1つの株、あるいは前記株が培養されている培地由来の培養上清または無細胞濾液を含む、生物的防除組成物。
  62. 微生物の成長を阻害するための組成物であって、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)、NMI受託番号V12/022850と命名された細菌株、およびNMI受託番号V12/022849と命名された細菌株から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の少なくとも1つの株、あるいは前記株が培養されている培地由来の培養上清または無細胞濾液を含む、組成物。
  63. 病原性微生物による被験体の感染を治療または予防するための組成物の作製を意図した、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)、NMI受託番号V12/022850と命名された細菌株、およびNMI受託番号V12/022849と命名された細菌株から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の1つ以上の株の使用。
  64. 病原性微生物による被験体の感染によって引き起こされるか、またはそれに関連した、前記被験体における疾患を治療または予防するための組成物の作製を意図した、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)、NMI受託番号V12/022850と命名された細菌株、およびNMI受託番号V12/022849と命名された細菌株から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の1つ以上の株の使用。
  65. 微生物の成長を阻害するための組成物の作製を意図した、ラクトバチルス・パラファラギニス(Lactobacillus parafarraginis)、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ラピ(Lactobacillus rapi)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス・ゼアエ(Lactobacillus zeae)、NMI受託番号V12/022850と命名された細菌株、およびNMI受託番号V12/022849と命名された細菌株から選択される乳酸桿菌(Lactobacillus)の1つ以上の株の使用。
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