ES2959503T3 - Cepa bacteriana que presenta actividad antimicrobiana utilizada en plantas - Google Patents

Abstract

En el presente documento se proporcionan métodos para tratar y prevenir infecciones causadas por patógenos microbianos, métodos para tratar o prevenir enfermedades causadas por, o asociadas con, patógenos microbianos, y métodos para inhibir el crecimiento de microorganismos, comprendiendo los métodos la administración o aplicación de composiciones una o más cepas de Lactobacillus parafarraginis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus rapi, Lactobacillus zeae, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, la cepa bacteriana denominada Número de acceso de NMI V12/022850 y la cepa bacteriana denominada Número de acceso de NMI V12/022849. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Cepa bacteriana que presenta actividad antimicrobiana utilizada en plantas

Campo de la técnica

La presente exposición se refiere a una cepa bacteriana que se utiliza en un método para inhibir los patógenos microbianos de plantas.

Antecedentes

Todas las plantas son susceptibles de ser atacadas por microorganismos, tales como bacterias y hongos. En el caso de los frutos, hortalizas y cultivos agrícolas y hortícolas, los patógenos microbianos y las enfermedades causadas por ellos pueden resultar en un daño significativo a los cultivos, y pérdidas de rendimiento y económicas tanto antes como después de la cosecha. Las enfermedades causadas por los patógenos microbianos también pueden conducir a un tiempo de almacenamiento reducido del producto y a costes más altos para el consumidor.

Muchos hongos son patógenos vegetales conocidos que provocan muchas enfermedades que dañan o destruyen los cultivos en todo el mundo. La mayoría de hongos patogénicos de las plantas son ascomicetos (incluyendo especies deFusarium, Thielaviopsis, Botrytis, VerticilliumyMagnaporthe)y basidiomicetos (incluyendo especies deRhizoctonia, PucciniayArmillaria).Son especialmente preocupantes los hongos del géneroFusarium,que son hogos filamentosos de amplia distribución en el suelo. Por ejemplo, varias especies deFusarium,tal comoFusarium oxysporum,afectan a plantas, incluyendo tomates, melones, jengibre, plátanos y leguminosas con una enfermedad de marchitamiento (marchitamiento porFusarium)que causa síntomas tales como el marchitamiento vascular, necrosis, caída prematura de las hojas y retraso del crecimiento. La podredumbre seca porFusariumde las patatas está causada por varias especies del géneroFusarium.La podredumbre seca deFusariumes un problema económicamente importante en las patatas, tanto en el campo como durante el almacenamiento, y es una de las causas principales de pérdidas posteriores a la cosecha en las patatas. En los plátanos,Fusariumes el agente causante de la altamente destructiva enfermedad de Panamá. Una vez está infectada una plantación, no hay cura.Fusarium oxysporumes un hongo asexual imperfecto que se disemina mediante tres tipos de esporas: microconidios, macroconidios y clamidosporas. Una vez se ha establecidoFusarium oxysporumen el suelo, es conocido que resulta extremadamente difícil de erradicar debido a que las clamidosporas pueden mantenerse quiescentes e infectar el suelo durante muchos años. Debido a la ineficacia de los fungicidas, la única respuesta disponible actualmente es la esterilización del suelo, lo que no resulta eficaz en relación a los costes.

Las bacterias patogénicas vegetales también causan muchas enfermedades dañinas y económicamente significativas en plantas. Entre los ejemplos se incluyen especies deErwinia, Pectobacterium, Pantoea, Agrobacterium, Pseudomonas, Ralstonia, Burkholderia, Acidovorax, Xanthomonas, Clavibacter, Streptomyces, Xylella, SpiroplasmayPhytoplasma.Las bacterias patogénicas vegetales causan un abanico de síntomas, incluyendo agallas y tumores, marchitamientos, manchas en las hojas, manchas y quemaduras, podredumbres blandas, así como costras y cancros.

La sarna de la patata es una enfermedad que infecta los tubérculos de la patata, así como otros cultivos de tubérculos, tales como rábano, remolacha, zanahoria y chirivía. Provoca lesiones necróticas de mal aspecto sobre la superficie del tubérculo, resultando en enormes pérdidas económicas. El patógeno causante más importante esStreptomyces scabies,que se encuentra en el suelo de las zonas de crecimiento de la patata en todo el mundo, una bacteria filamentosa aeróbica Gram-positiva que produce micelios grises sobre la mayoría de medios sólidos. Los filamentos vegetativos se desprenden, formando esporas, permitiendo que las bacterias sobrevivan largos periodos de tiempo y se expanda a través del agua, el viento y el suelo. Es capaz de sobrevivir periodos de tiempo prolongados, incluso años, en el suelo, sobreviviendo sobre material vegetal en descomposición, así como sobreviviendo al paso por los tractos digestivos de los animales. Se han utilizado diversos enfoques para reducir la gravedad de la enfermedad; sin embargo, actualmente no se dispone de ningún control eficaz para la sarna de la patata.

Los fungicidas y otros pesticidas aplicados en las plantas para combatir los microorganismos patogénicos y para tratar o prevenir enfermedades causadas por dichos patógenos habitualmente son de naturaleza química (con frecuencia sintéticos y no de origen natural). Pueden ser caros de fabricar y comportan efectos secundarios no deseados, incluyendo toxicidad en animales, y problemas medioambientales. Existe una clara y constante necesidad de desarrollar enfoques alternativos. Los agentes y composiciones de control biológico son una alternativa atractiva, ya que son más seguros, más biodegradables y menos caros de desarrollar. El documento n.° US 4591499 A se refiere a un método para tratar la mastitis en rumiantes mediante la administración de lactobacilos no patogénicos. El documento n.° CN 102851 232 a se refiere a una cepa deLactobacillus,que esLactobacillus parafarraginisZH1, y a una aplicación de la misma. El documento n.° WO 94/19950 A1 se refiere a un agente de control biológico que incluye o se deriva de una formulación iniciadora de masa madre que comprende un cultivo mixto del componente levadura, un componente bacteriano y un sustrato para el cultivo mixto. El documento n.° KR 2012 0022291 A se refiere a un aditivo alimentario para estimular el crecimiento de animales domésticos para fermentar la biotita utilizando agua, microorganismos y nutrientes seleccionados de entre salvado de trigo, salvado de arroz o melaza. El documento n.° WO 97/36603 se refiere a una cepa deLactobacillus caseique resulta eficaz en el tratamiento de las infecciones fúngicas. El documento n.° WO 2008/049230 A1 se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada codificante de una proteína inhibidora de especies deSclerotinia.Salvetti et al. (2012), Antimicro. 4: 217-226, se refieren a la clasificación taxonómica de bacterias del géneroLactobacillus.

Sumario de la exposición

La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas y se refiere a un método de tratamiento o prevención de la infección de una planta por un patógeno fúngico o bacteriano. Realizaciones de la invención tal como se describen en los párrafos numerados siguientes:

(1) Un método de tratamiento o prevención de la infección de una planta por un patógeno fúngico o bacteriano, en el que el método comprende la administración en la planta, o alternativamente, la exposición de la planta a, una cantidad eficaz de una composición que comprende la cepaLactobacillus parafarraginisLp18, depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 27 de octubre de 2011 bajo el número de acceso V11/022945, o un sobrenadante de cultivo o filtrado libre de células derivado de medio de cultivo en el que se ha cultivado dicha cepa deLactobacillus parafarraginis,en el que el patógeno fúngico o bacteriano se selecciona de entrePseudocercospora macadamiae, Botrytis cinerea, Streptomyces scabiesyPseudomonas savastanoi.(2) El método según el párrafo 1, en el que se encapsulaLactobacillus parafarraginis.

(3) El método según el párrafo 1 o el párrafo 2, en el que la planta es una especie de cultivo.

La presente exposición proporciona, además, un método para el tratamiento o la prevención de la infección de un sujeto por un patógeno microbiano, en el que el método comprende administrar en el sujeto, o alternativamente, exponer el sujeto a una cantidad eficaz de una composición que comprende por lo menos una cepa deLactobacillusseleccionada de entreLactobacillus parafarraginis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus rapiyLactobacillus zeae,o un sobrenadante de cultivo o filtrado libre de células derivado de medio de cultivo en el que se ha cultivado dicha cepa, en el que la materia comprendida fuera del alcance de la invención tal como se ha descrito anteriormente se proporciona con fines ilustrativos.

La presente exposición proporciona, además, un método para el tratamiento o la prevención de una enfermedad en un sujeto causada o asociada a un patógeno microbiano, en el que el método comprende administrar en el sujeto, o alternativamente, exponer el sujeto a una cantidad eficaz de una composición que comprende por lo menos una cepa deLactobacillusseleccionada de entreLactobacillus parafarraginis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus rapiyLactobacillus zeae,o un sobrenadante de cultivo o filtrado libre de células derivado de medio de cultivo en el que se ha cultivado dicha cepa, en el que la materia comprendida fuera del alcance de la invención tal como se ha descrito anteriormente se proporciona con fines ilustrativos.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la exposición del sujeto a la composición puede comprender exponer directa o indirectamente el sujeto a la composición. A título de ejemplo, en el caso de que el sujeto sea una planta, la planta puede exponerse a la composición mediante la aplicación de la composición en una parte de la planta o en el suelo en el que está creciendo o donde se plantará la planta. También a título de ejemplo, en el caso de que el sujeto sea un animal, el animal puede exponerse a la composición mediante la aplicación de la composición en pasto u otra hierba (o en el suelo en el que crece el pasto u otra hierba) de la que se alimenta el animal.

El método puede comprender, además, la administración en el sujeto, o alternativamente la exposición del sujeto, de una cantidad eficaz de uno o más agentes antimicrobianos.

En la presente memoria se proporciona, aunque no se reivindica, un método para la inhibición del crecimiento de un microorganismo, en donde el método comprende exponer el microorganismo, o un medio colonizado, o que puede ser colonizado, por el microorganismo, a una cantidad eficaz de una composición que comprende por lo menos una cepa deLactobacillusseleccionada de entreLactobacillus parafarraginis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus rapiyLactobacillus zeae,o un sobrenadante de cultivo en el que se ha cultivado dicha cepa.

En opciones ejemplares, el sujeto es una planta. En opciones ejemplares adicionales, el sujeto es una planta y el medio es suelo, raíces de planta y/o follaje de planta. El suelo puede tratarse con la composición antes del plantado de la planta, en el momento del plantado o después del plantado. De manera similar, las raíces de las plantas pueden tratarse con la composición antes del plantado de la planta, en el momento del plantado o después del plantado.

El método puede comprender un tratamiento o múltiples tratamientos del medio o del sujeto con la composición.

El método puede comprender, además, la exposición del microorganismo a una cantidad eficaz de uno o más agentes antimicrobianos.

En la presente memoria se proporciona una composición de control biológico para el tratamiento o la prevención de la infección de un sujeto por un patógeno microbiano, en donde la composición comprende por lo menos una cepa deLactobacillusseleccionada de entreLactobacillus parafarraginis, Lactobacillus buchneri, LactobacillusrapiyLactobacillus zeae,o un sobrenadante de cultivo o filtrado libre de células derivado de medio de cultivo en el que se ha cultivado dicha cepa.

En la presente memoria se da a conocer, además, aunque no se reivindica, una composición de control biológico para el tratamiento o la prevención de una enfermedad en un sujeto causada o asociada a la infección del sujeto por un patógeno microbiano, en donde la composición comprende por lo menos una cepa deLactobacillusseleccionada de entreLactobacillus parafarraginis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus rapiyLactobacillus zeae,o un sobrenadante de cultivo o filtrado libre de células derivado de medio de cultivo en el que se ha cultivado dicha cepa.

En la presente memoria se da a conocer, además, aunque no se reivindica, una composición para la inhibición del crecimiento de un microorganismo, en donde la composición comprende por lo menos una cepa deLactobacillusseleccionada deLactobacillus parafarraginis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus rapiyLactobacillus zeae,o un sobrenadante de cultivo o filtrado libre de células a partir de medio de cultivo en el que se ha cultivado dicha cepa.

Además de los componentes de las composiciones descritas en los aspectos anteriores, las composiciones dadas a conocer en la presente memoria pueden comprender una o más cepas deLactobacillus diolivorans(N3), depositadas en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022847;Lactobacillus parafarraginis(N11), depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022848,Lacwbacillus brevis(TD), depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022851;Lactobacillus paracasei,cepa designada "T9", depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022849;Lactobacillus caseiy la cepa designada en la presente memoria 'TB', depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022850; o un sobrenadante de cultivo o filtrado libre de células derivado de medio de cultivo en el que se ha cultivado una o más de dichas cepas.

Se proporciona en la presente memoria, además, aunque no se reivindica, la utilización de una o más cepas deLactobacillus,en la queLactobacillusse selecciona de entreLactobacillus parafarraginis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus rapiyLactobacillus zeae,para la preparación de una composición para el tratamiento o la prevención de infección de un sujeto por un patógeno microbiano.

Se proporciona en la presente memoria, además, aunque no se reivindica, la utilización de una o más cepas deLactobacillus,en la queLactobacillusse selecciona de entreLactobacillus parafarraginis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus rapiyLactobacillus zeae,para la preparación de una composición para el tratamiento o la prevención de una enfermedad en un sujeto causada o asociada a la infección del sujeto por un patógeno microbiano.

Se proporciona en la presente memoria, además, aunque no se reivindica, la utilización de una o más cepas deLactobacillus,en la queLactobacillusse selecciona de entreLactobacillus parafarraginis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus rapiyLactobacillus zeae,para la preparación de una composición para la inhibición del crecimiento de un microorganismo.

Se proporciona en la presente memoria, además, aunque no se reivindica, la utilización de una o más cepas deLactobacillus,en la queLactobacillusse selecciona de entreLactobacillus parafarraginis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus rapi, Lactobacillus zeae y Lactobacillus paracasei,cepa designada en la presente memoria "T9", depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022849,Lactobacillus easely la cepa designada en la presente memoria "TB", depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022850, para la preparación de una composición para el tratamiento o la prevención de un sujeto por un patógeno microbiano.

Se proporciona en la presente memoria, además, aunque no se reivindica, la utilización de una o más cepas deLactobacillus,en la queLactobacillusse selecciona de entreLactobacillus parafarraginis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus rapi, Lactobacillus zeae, Lactobacillus paracasei,cepa designada en la presente memoria "T9", depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022849;Lactobacillus caseiy la cepa designada en la presente memoria "TB", depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022850, para la preparación de una composición para el tratamiento o la prevención de una enfermedad en un sujeto causada o asociada a la infección del sujeto por un patógeno microbiano.

Se proporciona en la presente memoria, además, aunque no se reivindica, la utilización de una o más cepas deLactobacillus,en la queLactobacillusse selecciona de entreLactobacillus parafarraginis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus rapi, Lactobacillus zeae, Lactobacillus paracasei,cepa designada en la presente memoria "T9", depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022849;Lactobacillus caseiy la cepa designada en la presente memoria "TB", depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2014 con el número de acceso V12/022850, para la preparación de una composición para la inhibición del crecimiento de un microorganismo.

En la presente memoria se proporciona, además, aunque no se reivindica, la utilización de una o más de las cepas siguientes para la preparación de una composición para el tratamiento o la prevención de la infección de un sujeto por un patógeno microbiano, para el tratamiento o la prevención de una enfermedad en un sujeto causada o asociada a la infección del sujeto por un patógeno microbiano, o para la inhibición del crecimiento de un microorganismo:Lactobacillus diolivorans(N3) depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022847;Lactobacillus parafarraginis(N11), depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022848;Lactobacillus brevis(TD) depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022851;Lactobacillus paracasei,cepa designada en la presente memoria "T9", depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022849;Lactobacillus caseiy la cepa designada en la presente memoria "TB", depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre con el número de acceso V12/022850.

La exposición siguiente se refiere a la totalidad de los aspectos y opciones anteriormente indicados.

Según la invención reivindicada, la cepa deLactobacillus parafarraginisesLactobacillus parafarraginisLp18 depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 27 de octubre de 2011 con el número de acceso V11/022945.

Tal como se da a conocer en la presente memoria, aunque no se reivindica, la cepa deLactobacillus buchneripuede serLactobacillus buchneriLb23. En una opción particular, la cepa deLactobacillus buchneriesLactobacillus buchneriLb23 depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 27 de octubre de 2011 con el número de acceso V11/022946.

Tal como se da a conocer en la presente memoria, aunque no se reivindica, la cepa deLactobacillus rapipuede serLactobacillus rapiLr24. En una opción particular, la cepa deLactobacillus rapiesLactobacillus rapiLr24 depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 27 de octubre de 2011 con el número de acceso V11/022947.

Tal como se da a conocer en la presente memoria, aunque no se reivindica, la cepa deLactobacillus zeaepuede serLactobacillus zeaeLz26. En una opción particular, la cepa deLactobacillus zeaeesLactobacillus zeaeLz26, depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 27 de octubre de 2011 con el número de acceso V11/022948.

La composición puede comprender, además, una cepa deAcetobacter fabarum.La cepa deAcetobacter fabarumpuede serAcetobacter fabarumAfl5. En una opción particular, la cepa deAcetobacter fabarumesAcetobacter fabarumAfl5, depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 27 de octubre de 2011 con el número de acceso V11/022943.

La composición puede comprender, además, una levadura. La levadura puede ser una cepa deCandida ethanolica.La cepa deCandida ethanolicapuede serCandida ethanolicaCe31. En una opción particular, la cepa deCandida ethanolicaesCandida ethanolicaCe31, depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 27 de octubre de 2011 con el número de acceso V11/022944.

La composición puede comprender dos o más de dichas especies deLactobacillus, tres de dichas especies deLactobacilluso la totalidad de dichas especies deLactobacillus. La composición puede representar una combinación simbiótica de dos o más, o tres o más, de dichas especies deLactobacillus.

Puede encapsularse una o más de las cepas en la composición. En el caso de que se encapsulen múltiples cepas, las cepas pueden encapsularse individualmente o combinarse en una única encapsulación.

La composición puede comprender, además, uno o más agentes antimicrobianos.

El sujeto es una planta según la invención reivindicada. Por ejemplo, la planta puede ser una especie de cultivo agrícola, una especie de cultivo hortícola o una especie de cultivo para combustible o la producción farmacéutica. En otra opción ejemplar no comprendida dentro del alcance de la invención reivindicada, el sujeto es un animal, particularmente un animal no humano, tal como un mamífero productor de leche (por ejemplo, una vaca o una cabra).

El patógeno microbiano puede ser un agente causativo de una enfermedad vegetal o una enfermedad animal. En opciones ejemplares, la enfermedad puede seleccionarse de entre una podredumbre, verticilosis, mancha, marchitamiento, cancro, enmohecimiento, moho, agalla, costra o mastitis.

El patógeno microbiano es un hongo o bacteria según la invención reivindicada.

Según la invención reivindicada, el patógeno seleccionado se selecciona de entrePseudocercospora macadamiaeyBotrytis cinerea.En algunos otros ejemplos, que podrían no estar comprendidos dentro del alcance de la invención, el hongo puede seleccionarse de entreFusariumsp., aPseudocercosporasp., aPhialemoniumsp, aBotrytissp. oRhizoctoniasp. La especieFusariumsp. puede serFusarium oxysporum,tal comoFusarium oxysporumf. sp.zingiberi, Fusarium oxysporumf.sp.niveumoFusarium oxysporumf. sp.cubense.La especiePseudocercosporasp. puede serPseudocercospora macadamiae.La especiePhialemoniumsp. puede serPhialemonium dimorphosporum.La especieBotrytissp. puede serBotrytis cinerea.La especieRhizoctoniasp. puede serRhizoctoniasolani.El lector experto apreciará que esta lista no es exhaustiva. Se dan a conocer especies fúngicas adecuadas adicionales posteriormente en la presente memoria.

Las bacterias pueden ser Gram-positivas o Gram-negativas. Según la invención reivindicada, el patógeno bacteriano se selecciona de entreStreptomyces scabiesyPseudomonas savastani.En algunos otros ejemplos que podrían no estar comprendidos dentro del alcance de la invención, las bacterias pueden ser una especie deStreptomycessp.,Staphylococcussp.,Escherichiasp.,Pseudomonassp.,Pantoeasp. oStreptococcussp. La especie deStreptomycessp. puede serStreptomyces scabies.La especie deStaphylococcussp. puede serStaphylococcus aureus.La especie deStreptococcussp. puede serS. uberis.La especie deEscherichiasp. puede serEscherichia coli.La especie dePseudomonassp. puede serPseudomonas savastani.La especie dePantoeasp. puede serPantoea agglomerons.El lector experto apreciará que esta lista no es exhaustiva. Se dan a conocer especies bacterianas adecuadas adicionales posteriormente en la presente memoria.

Breve descripción de los dibujos

En la presente memoria se describen aspectos y realizaciones de la presente exposición, a título de ejemplo no limitativo únicamente, en referencia a los dibujos siguientes.

Figura 1. Altura de raíz, altura de planta y peso de plantas de sandía tras tres semanas de tratamiento tal como se describe en el Ejemplo 3. Para cada parámetro, las columnas representan, de izquierda a derecha, semillas de sandía de los experimentos A, B, C y D.

Descripción detallada

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente tienen el mismo significado según entiende comúnmente el experto ordinario en la materia a la que se refiere la exposición. Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los indicados en la presente memoria pueden utilizarse en la práctica o ensayo de la presente exposición, se describen métodos y materiales típicos.

Los artículos "un" y "una", y "el" y "la" se refieren a uno o más de uno (es decir, por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo. A título de ejemplo, "un elemento" se refiere a un elemento o a más de un elemento.

En el contexto de la presente especificación, el término "aproximadamente" se entiende que se refiere a un intervalo de números que el experto en la materia consideraría equivalentes al valor indicado en el contexto de conseguir la misma función o resultado.

A lo largo de toda la presente especificación y las reivindicaciones siguientes, a menos que el contexto indique lo contrario, el término "comprende" y variaciones, tales como "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de un número o etapa indicado, o grupo de números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro número entero, etapa, grupo de enteros o etapa.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "agente antimicrobiano" se refiere a cualquier agente que, solo o en combinación con otro agente, es capaz de eliminar o inhibir el crecimiento de una o más especies de microorganismo. Entre los agentes antimicrobianos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, antibióticos, detergentes, tensioactivos, agentes que inducen estrés oxidativo, bacteriocinas y enzimas antimicrobianos (p. ej., lipasas, pronasas y liasas) y otros diversos enzimas proteolíticos y nucleasas, péptidos y fagos. La referencia a un agente antimicrobiano incluye la referencia a agentes antimicrobianos tanto naturales como sintéticos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "exponer" se refiere de manera general a poner en contacto con. La exposición de un sujeto a una composición o agente tal como se describe en la presente memoria incluye la administración de la composición o agente en el sujeto, o alternativamente poner la composición o agente en contacto con el sujeto, sea directa o indirectamente. Por ejemplo, exponer un sujeto a una composición o agente puede incluir aplicar o administrar la composición o agente en un medio habitado por el sujeto o a un alimento, líquido u otra composición nutricional que debe administrarse en el sujeto. En la presente exposición, los términos "exponer", "administrar" y poner en contacto", y variaciones de los mismos, pueden, en algunos contextos, utilizarse intercambiablemente.

El término "inhibir" y variaciones del mismo, tales como "inhibición" e "inhibe", tal como se utilizan en la presente memoria en relación al crecimiento microbiano se refieren a cualquier actividad microcida o microstática de una composición o agente. Dicha inhibición puede variar en magnitud, y/o ser de naturaleza temporal o espacial. La inhibición del crecimiento de bacterias u hongos por una composición o agente puede evaluarse mediante la medición del crecimiento microbiano en la presencia o ausencia de la composición o agente. El crecimiento microbiano puede inhibirse con la composición o agente en por lo menos o aproximadamente 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %. o 95 % o más en comparación con el crecimiento del mismo microbio no expuesto a la composición o agente.

El término "sujeto" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier planta o animal infectado o que se sospecha que está infectado, o que es susceptible de infección por, un patógeno microbiano. Entre las plantas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, plantas que producen frutos, vegetales, cereales, tubérculos, legumbres, flores y hojas, o cualquier otra planta económica o medioambientalmente importante. De esta manera, la planta puede ser una especie de cultivo. El término "cultivo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier planta cultivada para su recolección o utilizada con cualquier propósito económico, incluyendo, por ejemplo, alimentos humanos, pienso para ganado, combustible o producción farmacéutica (p. ej., amapolas). Entre los animales se incluyen, por ejemplo, mamíferos, aves, peces, reptiles, anfibios y cualesquiera otro vertebrados o invertebrados, tales como aquellos de importancia económica, medioambiental y/o de otra importancia significativa. Entre los mamíferos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, ganado y otros animales de granja (tales como vacas, cabras, ovejas, caballos, cerdos y pollos), animales de competición (tales como caballos de carreras), animales de compañía (tales como gatos y perros), animales de ensayo de laboratorio y seres humanos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de inoculante microbiano o composición fertilizante aplicada en una zona dada de suelo o vegetación que resulta suficiente para producir uno o más resultados beneficiosos o deseados, por ejemplo, en términos de tasas de crecimiento vegetal, rendimientos del cultivo o disponibilidad de nutrientes en el suelo. Una "cantidad eficaz" puede proporcionarse en una o más administraciones. La cantidad exacta requerida variará dependiendo de factores tales como la identidad y el número de cepas individuales utilizados, las especies vegetales en tratamiento, la naturaleza y estado del suelo que debe tratarse, la naturaleza exacta del inoculante microbiano o composición fertilizante que debe aplicarse, la forma en que se aplica el inoculante o fertilizante, y los medios mediante los que se aplica, y el estadio de la estación de crecimiento vegetal durante el que tiene lugar la aplicación. De esta manera, no resulta posible especificar una "cantidad eficaz" exacta. Sin embargo, para cualquier caso dado, una "cantidad eficaz" apropiada puede ser determinada por el experto ordinario en la materia utilizando únicamente experimentación rutinaria.

Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "tratar", "tratamiento" y similares se refieren a cualquier aplicación y a todas las aplicaciones que remedian, o de otro modo dificultan, retrasan o revierten la progresión de una infección o enfermedad, o por lo menos un síntoma de una infección o enfermedad, incluyendo la reducción de la gravedad de una infección o enfermedad. De esta manera, el tratamiento no implica necesariamente que un sujeto se trate hasta la eliminación completa de la infección o la recuperación de una enfermedad. De manera similar, los términos "prevenir", "prevención" y similares se refieren a todas y cada una de las aplicaciones que evitan el establecimiento de una infección o enfermedad, o que, de otro modo, retrasan la aparición de una infección o enfermedad.

El término "opcionalmente" se utiliza en la presente memoria para referirse a que la característica indicada seguidamente puede estar o no presente, o que el suceso o característica indicado seguidamente puede ocurrir o no. Por lo tanto, se entenderá que la especificación incluye y comprende opciones en las que está presente la característica y opciones en las que no está presente la característica, y opciones en las que el suceso o circunstancia ocurre, así como opciones en las que no ocurre.

En la presente memoria se proporcionan, aunque no necesariamente comprendidos dentro de la invención reivindicada a menos que se haya descrito anteriormente, métodos para el tratamiento o la prevención de infección en un sujeto por un patógeno microbiano, que comprende la administración en el sujeto, o alternativamente, la exposición del sujeto a, una cantidad eficaz de una composición que comprende por lo menos una cepa deLactobacillusseleccionada de entreLactobacillus parafarraginis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus rapiyLactobacillus zeae.

Se proporcionan, además, métodos para el tratamiento o la prevención de una enfermedad en un sujeto causada o asociada a un patógeno microbiano, en el que el método comprende administrar en el sujeto, o alternativamente, exponer el sujeto a, una cantidad eficaz de una composición que comprende por lo menos una cepa deLactobacillusseleccionada de entreLactobacillus parafarraginis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus rapiyLactobacillus zeae,en la que las realizaciones comprendidas fuera del alcance de la invención reivindicada se proporcionan a modo de ejemplos.

Se proporciona adicionalmente en la presente memoria, aunque no forma parte de la invención reivindicada, métodos para la inhibición del crecimiento de un microorganismo, en el que el método comprende exponer el microorganismo, o un medio colonizado o capaz de ser colonizado por el microorganismo, a una cantidad eficaz o a una composición que comprende por lo menos una cepa deLactobacillusseleccionada de entreLactobacillus parafarraginis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus rapiyLactobacillus zeae.

Se proporcionan, además, en la presente memoria, métodos para el tratamiento o la prevención de infección en un sujeto por un patógeno microbiano, que comprende administrar en el sujeto, o alternativamente, exponer al sujeto a, una cantidad eficaz de una composición que comprende por lo menos una cepa deLactobacillusseleccionada deentreLactobacillus parafarraginis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus rapi, Lactobacillus zeae, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei,cepa designada en la presente memoria "T9", depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022849;Lactobacillus caseiy la cepa designada en la presente memoria "TB", depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2014 con el número de acceso V12/022850, en la que las realizaciones comprendidas fuera del alcance de la invención reivindicada se proporcionan a modo de ejemplos.

Se proporcionan, además, métodos para el tratamiento o la prevención de una enfermedad en un sujeto causada o asociada a un patógeno microbiano, en el que el método comprende administrar en el sujeto, o alternativamente, exponer al sujeto a, una cantidad eficaz de una composición que comprende por lo menos una cepa deLactobacillusseleccionada de entreLactobacillus parafarraginis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus rapi, Lactobacillus zeae, Lactobacillus casei y Lactobacillus paracasei,cepa designada en la presente memoria "T9", depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022849; y la cepa designada en la presente memoria "TB", depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2014 con el número de acceso V12/022850, en la que las realizaciones comprendidas fuera del alcance de la invención reivindicada se proporcionan a modo de ejemplos.

Se proporciona adicionalmente en la presente memoria, aunque no forma parte de la invención reivindicada, métodos para la inhibición del crecimiento de un microorganismo, en el que el método comprende exponer el microorganismo, o un medio colonizado o capaz de ser colonizado por el microorganismo, a una cantidad eficaz o a una composición que comprende por lo menos una cepa deLactobacillusseleccionada de entreLactobacillus parafarraginis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus rapi, Lactobacillus zeae, Lactobacillus caseiyLactobacillus paracasei,cepa designada en la presente memoria "T9", depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022849, y la cepa designada en la presente memoria "TB", depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2014 con el número de acceso V12/022850.

Se proporcionan, además, nuevas composiciones de control biológico para el tratamiento o la prevención de infecciones causadas por patógenos microbianos y enfermedades causadas o asociadas a dichas infecciones, y para la inhibición del crecimiento de microorganismos, aunque no forman parte de la invención reivindicada.

Según la presente exposición, el patógeno o microorganismo microbiano puede ser un patógeno fúngico o bacteriano capaz de infectar y/o causar una enfermedad en cualquier especie vegetal o animal. Por lo tanto, los métodos y composiciones de la presente exposición encuentran aplicación en el tratamiento y la prevención de enfermedades fúngicas en plantas y animales, tales como podredumbres, verticilosis, royas, manchas, marchitamientos, cancros, enmohecimientos y mohos. Los métodos y composiciones de la presente exposición también encuentran aplicación en el tratamiento y la prevención de enfermedades bacterianas en plantas y animales, incluyendo agallas, costras y otras enfermedades, tales como mastitis.

En opciones ejemplares, los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria pueden utilizarse en el tratamiento y la prevención de enfermedades fúngicas seleccionadas de entre la podredumbre seca porFusarium,la podredumbre porFusarium,el punteado negro, el tizón tardío, el cancro negro porRhizoctonia,la podredumbre rosada, mancha foliar, enfermedad de Panamá, roya estriada (roya amarilla), podredumbre blanda, roya del tallo (roya negra), moho gris, podredumbre del corazón dePhytophthora,tizón, podredumbre dePhytophthora,roya del cacahuete, roya del tallo porRhizoctonia,roya del rizoma, mancha fúngica de cáscara, cancro del tronco, podredumbre blanca de raíz, marchitamiento porVerticilliumy podredumbre del jengibre, y/o infecciones por los agentes causantes de estas enfermedades. En donde el sujeto es una planta, la planta afectada por la enfermedad puede ser, por ejemplo, un cultivo alimentario (para seres humanos u otros animales), tal como cualquier planta productora de fruta, hortalizas, frutos secos o cereales. Entre las plantas de cultivo ejemplares se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, tubérculos y otras hortalizas de crecimiento bajo el suelo (tales como patatas, remolachas, rábanos, zanahorias, cebollas, etc.), hortalizas de crecimiento a nivel de suelo y de enredadera (tales como berenjenas y otros miembros de la familia de las cucurbitáceas, alubias, guisantes, espárragos, etc.), hortalizas foliosas (tales como lechugas, acelgas, espinacas, alfalfa, etc.), otras hortalizas (tales como tomates,Brassica,incluyendo brócoli, aguacates, etc.), frutas (tales como bayas, olivas, frutos de hueso, incluyendo nectarinas y melocotones; frutos tropicales, incluyendo mangos y bananas; manzanas, peras, melón, mandarinas, naranjas, mandarinas, kiwis, coco, etc.), cereales (tales como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, avena, centeno, etc.), frutos secos (tales como nueces de Macadamia, cacahuetes, nueces de Brasil, avellanas, nueces de nogal, almendras, etc.) y otros cultivos y plantas económicamente valiosos (tales como ajo, jengibre, caña de azúcar, soja, girasol, colza, sorgo, pastos, césped, etc.).

En el caso de que el sujeto sea un animal, en opciones ejemplares particulares no comprendidas dentro del alcance según las reivindicaciones, el animal puede exponerse a una composición dada a conocer en la presente memoria indirectamente mediante aplicación de la composición en pasto, hierba u otra planta de la que se alimenta el animal. En dichas opciones, los animales ejemplares son vacas lecheras.

En opciones ejemplares, los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria pueden utilizarse en el tratamiento y la prevención de enfermedades bacterianas seleccionadas de entre roña de la patata, manchas bacterianas, sarna de la patata, podredumbre blanda bacteriana, enfermedad de la agalla de la corona y mastitis, y de infecciones por los agentes causantes de dichas enfermedades.

Entre los patógenos fúngicos contra los que encuentran aplicación los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitarse a ellos,especies deFusarium,tales comoFusarium oxysporumy formas especiales de la misma, incluyendoFusarium oxysporum f. sp. zingiberi, Fusarium oxysporumf.sp.niveumyFusarium oxysporumf.sp.cubense; Collectotrichum coccodes; Phytophthora spp.,tales comoPhytophthora infestans, Phytophthora erythroseptica, Phytophthora cinnamomi; Rhizoctonia solani; Corynespora cassiicola; Puccinia spp.,tales comoPuccinia arachidus, Puccinia striiformis, Puccinia graminis f. sp. tritici; Botrytis cinerea; Rhizoctonia; Pythium myriotylum; Pseudocercospora macadamiae; Rosellinia necartrix;especies deVerticillum, tales comoVerticillum deliliae; Phialemonium dimorphosporum; Thielaviopsis spp.; Magnaporthe grisea.

Entre los patógenos bacterianos contra los que encuentran aplicación métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitarse a ellos,Streptomyces scabies; Xanthomonasspp., tales comoXanthomonascampestris pv. Vesicatoria; Pseudomonas spp.,tales comoP. savastanoi, P. syringae, P. aeruginosayP. fluorescens; E. coli; Listeriamonocytogenes; Staphylococcus spp.,tales como S.aureus; Streptococcus spp.,tales como S.uberis; Agrobacterium tumefaciens; Burkholderia cepacia; Erwinia carotovora; Erwinia chrysanthemi; Pantoea agglomerons; Ralstonia solanacearum; Pantoea stewartii; Aeromonas hydrophila; Vibrio spp.,tales comoY. anguillarum, V. harveyi, Y. cholerayY. parahaemoliticus; Actinobacillus pleuropneumoniae;Chromobacter violaceum; Coxiella burnetti; Francisella tularensis; Haemophilus influenza; Pasteurella multocida; Shigella flexneri; Salmonella typhi; Salmonella typhimurium; Yersinia pestisyYersinia pseudotuberculosis.

El experto en la materia reconocerá que los patógenos y enfermedades fúngicas, y los patógenos y enfermedades bacterianas dados a conocer en la presente memoria son solo ejemplares, y el alcance de la presente exposición no se encuentra limitado a ellos. El experto en la materia conocerá numerosos otros patógenos y enfermedades fúngicas, y patógenos y enfermedades bacterianas, y los métodos y composiciones de la presente exposición también pueden utilizarse para combatirlos.

Según la invención reivindicada, la composición comprendeLactobacillus parafarraginisLp18, depositado en el National Measurement Institute, Australia, el 27 de octubre de 2011 con el número de acceso V11/022945. En opciones particulares dadas a conocer en la presente memoria, aunque no forman parte necesariamente de la invención reivindicada, las composiciones dadas a conocer en la presente memoria comprenden cepas de una o más especies bacterianas seleccionadas de entreLactobacillus parafarraginis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus rapi, Lactobacillus zeae, Lactobacillus brevisyLactobacillus diolivorans.En opciones alternativas, las composiciones pueden comprender un sobrenadante de cultivo o filtrado libre de células derivado de medio de cultivo en el que se han cultivado las cepas anteriormente referenciadas. En opciones alternativas, las composiciones dadas a conocer en la presente memoria comprenden cepas de una o más especies bacterianas seleccionadas de entreLactobacillus parafarraginis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus rapi, Lactobacillus zeae, Lactobacillus caseiyLactobacillus paracasei,cepa designada en la presente memoria "T9", depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022849, y la cepa designada en la presente memoria "TB", depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2014 con el número de acceso V12/022850.

La cepa deLactobacillus parafarraginisde acuerdo con la invención reivindicada esLactobacillus parafarraginisLp18 depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 27 de octubre de 2011 con el número de acceso V11/022945. En otras opciones dadas a conocer en la presente memoria, pero que no forman parte de la invención reivindicada, la cepa deLactobacillus buchneripuede serLactobacillus buchneriLb23. En una opción particular, la cepa deLactobacillus buchneriesLactobacillus buchneriLb23 depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 27 de octubre de 2011 con el número de acceso V11/022946. La cepa deLactobacillus rapipuede serLactobacillus rapiLr24. En una opción particular, la cepa deLactobacillus rapiesLactobacillus rapiLr24 depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 27 de octubre de 2011 con el número de acceso V11/022947. La cepa deLactobacillus zeaepuede serLactobacillus zeaeLz26. En una opción particular, la cepa deLactobacillus zeaeesLactobacillus zeaeLz26, depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 27 de octubre de 2011 con el número de acceso V11/022948.

En opciones adicionales, las composiciones dadas a conocer en la presente memoria pero que no forman parte de la invención reivindicada pueden comprender una o más cepas seleccionadas deLactobacillus diolivorans(N3) depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022847;Lactobacillus parafarraginis(N11), depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022848;Lactobacillus brevis(TD) depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022851;Lactobacillus paracasei,cepa designada en la presente memoria "T9", depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022849;Lactobacillus caseiy la cepa designada en la presente memoria "TB", depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre con el número de acceso V12/022850, o un sobrenadante de cultivo o filtrado libre de células derivado de medio de cultivo en el que se ha cultivado una o más de dichas cepas.

Las composiciones de la presente exposición pueden comprender, además, una cepa deAcetobacter fabarum,o un sobrenadante de cultivo o filtrado libre de células derivado de un medio de cultivo en el que se ha cultivado una cepa deAcetobacter fabarum.La cepa deAcetobacter fabarumpuede serAcetobacter fabarumAfl5. En una realización particular, la cepa deAcetobacter fabarumesAcetobacter fabarumAfl5, depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 27 de octubre de 2011 con el número de acceso V11/022943. Las composiciones pueden comprender, además, una levadura o un sobrenadante de cultivo o filtrado libre de células a partir de medio de cultivo en el que se ha cultivado una levadura. La levadura puede ser una cepa deCandida ethanolica.La cepa deCandida ethanolicapuede serCandida ethanolicaCe31. En una realización particular, la cepa deCandida ethanolicaesCandida ethanolicaCe31, depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 27 de octubre de 2011 con el número de acceso V11/022944.

Las concentraciones de cepas microbianas individuales que deben añadirse a las composiciones dadas a conocer en la presente memoria dependerán de una diversidad de factores, incluyendo la identidad y número de cepas individuales utilizadas, el patógeno microbiano, la infección o enfermedad que debe tratarse, la forma en la que se aplica la composición y los medios mediante los que se aplica. Para cualquier caso dado, las concentraciones adecuadas podrán ser determinadas por el experto ordinario en la materia utilizando únicamente experimentación rutinaria. A título de ejemplo, la concentración de cada cepa presente en la composición puede ser de entre aproximadamente 1*102 ufc/ml y aproximadamente 1*1010 ufc/ml, y puede ser aproximadamente 1*103 ufc/ml, aproximadamente 2,5*103 ufc/ml, aproximadamente 5*103 ufc/ml, 1*104 ufc/ml, aproximadamente 2,5*104 ufc/ml, aproximadamente 5*104 ufc/ml, 1 * 105 ufclml, aproximadamente 2,5*105 ufc/ml, aproximadamente 5*105 ufc/ml, 1*106 ufc/ml, aproximadamente 2,5*106 ufc/ml, aproximadamente 5*106 ufc/ml, 1*107 ufc/ml, aproximadamente 2,5*107 ufc/ml, aproximadamente 5*107 ufc/ml, 1*108 ufc/ml, aproximadamente 2,5*108 ufc/ml, aproximadamente 5*108 ufc/ml, 1*109 ufc/ml, aproximadamente 2,5*109 ufc/ml, o aproximadamente 5*109 ufc/ml. En realizaciones ejemplares particulares, la concentración final de las cepas deLactobacilluses de aproximadamente 2,5x105 ufc/ml. La concentración final deAcetobacter fabarumpuede ser de aproximadamente 1x106 ufc/ml y la concentración final deCandida ethanolicapuede ser de aproximadamente 1x105 ufc/ml.

También se encuentran contempladas en la presente exposición, pero no forman parte de la invención, variantes de las cepas microbianas indicadas en la presente memoria. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "variante" se refiere a variantes tanto naturales como desarrolladas específicamente, o mutantes de las cepas microbianas dadas a conocer y ejemplificadas en la presente memoria. Las variantes pueden presentar o no las mismas características biológicas identificativas de las cepas específicas ejemplificadas en la presente memoria, con la condición de que compartan propiedades ventajosas similares en términos de tratamiento o prevención de infecciones causadas, o de tratamiento o prevención de enfermedades causadas o asociadas con, patógenos microbianos. Entre los ejemplos ilustrativos de métodos adecuados para la preparación de variantes de las cepas microbianas ejemplificadas en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, técnicas de integración, tales como aquellas medidas por elementos de inserción o transposones, o mediante recombinación homóloga, otras técnicas de ADN recombinante para modificar, insertar, delecionar, activar o silenciar genes, fusión intraespecífica de protoplastos, mutagénesis por radiación con luz ultravioleta o rayos X, o mediante el tratamiento con un mutágeno químico, tal como nitrosoguanidina, metanosulfonato de metilo, mostaza nitrogenada y similares, y la transducción mediada por bacteriófagos. Se describen métodos adecuados y aplicables que son bien conocidos de la técnica en, por ejemplo, J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1972); J. H. Miller. A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1992) y J. Sambrook, D. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), entre otros.

También se encuentran comprendidas en el término "variante" tal como se utiliza en la presente memoria, cepas microbianas filogenéticamente relacionadas estrechamente con cepas dadas a conocer en la presente memoria, y cepas que poseen una identidad sustancial de secuencia con las cepas dadas a conocer en la presente memoria en uno o más marcadores filogenéticamente informativos, tales como genes de ARNr, genes de factor de elongación e inicio, genes de subunidad de ARN polimerasa, genes de ADN girasa, genes de proteína de choque térmico y genesrecA.Por ejemplo, los genes de ARNr 16S de una cepa "variante" tal como se contempla en la presente memoria puede compartir una identidad de secuencia de aproximadamente 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con una cepa dada a conocer en la presente memoria.

Los métodos de la presente exposición pueden comprender, además, la administración en el sujeto que requiere de tratamiento, o alternativamente la exposición del sujeto, con uno o más agentes antimicrobianos. La administración o exposición a una composición dada a conocer en la presente memoria y un agente antimicrobiano puede ser simultáneamente o en tiempos diferentes, es decir, simultánea o secuencial. Los agentes antimicrobianos pueden coformularse con cepas microbianas utilizadas en los métodos. Por lo tanto, las composiciones dadas a conocer en la presente memoria pueden comprender uno o más agentes antimicrobianos. En los casos en que las cepas microbianas y los agentes antimicrobianos se formulen en composiciones diferentes, pueden administrarse o entregarse por las mismas vías o medios por vías o medios diferentes.

Entre los agentes antimicrobianos ejemplares adecuados para los métodos descritos en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, antibióticos, detergentes, tensioactivos, agentes que inducen estrés oxidativo, bacteriocinas y enzimas antimicrobianos (p. ej., lipasas, pronasas y liasas) y otros diversos enzimas proteolíticos y nucleasas, péptidos y fagos. Los agentes antimicrobianos pueden ser naturales o sintéticos. El agente antimicrobiano utilizado puede seleccionarse para la aplicación particular de la invención caso por caso, y el experto en la materia apreciará que el alcance de la presente invención no se encuentra limitado por la naturaleza o identidad del agente antimicrobiano particular. Entre los ejemplos no limitativos de agentes antimicrobianos se incluyen fluoroquinolonas, aminoglucósidos, glucopéptidos, lincosamidas, cefalosporinas y beta-lactamos relacionados, macrólidos, nitroimidazolas, penicilinas, polimixinas, tetraciclinas y cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, los métodos de la presente invención pueden utilizar acedapsona; acctosulfona sódica, alamecina, alexidina, amdinocilina, amdinocilina pivoxilo, amiciclina, amifloxacino, mesilato de amifloxacino, amicacina, sulfato de amicacina, ácido aminosalicílico, aminosalicilato sódico, amoxicilina, anfomicina, ampicilina, ampicilina sódica, apalcilina sódica, apramicina, aspartocina, sulfato de astromicina, avilamicina, avoparcina, azitromicina, aziocilina, azlocilina sódica, hidrocloruro de bacampicilina, bacitracina, bacitracina metileno disalicilato, bacitracina zinc, bambermicinas, benzoilpas calcio, beritromicina, sulfato de betamicina, biapenem, biniramicina, hidrocloruro de bifenamina, bispiritiona magsulfex, butikacina, sulfato de butirosina, sulfato de capreomicina, carbadox, carbenicilina disódica, carbenicilina indanil sódica, carbenicilina fenil sódica, carbenicilina potasio, carumonam sodio, cefaclor, cefadroxilo, cefamandol, nafato de cefamandol, cefamandol sodio, cefaparol, cefatrizina, cefazaflur sodio, cefazolina, cefazolina sodio, cefbuperazona, cefdinir, cefepima, hidrocloruro de cefepima, cefetecol, cefixima, hidrocloruro de cefmenoxima, cefmetazol, cermetazol sodio, cefonicida monosodio, cefonicida sodio, cefoperazona sodio, ceforanida, cefotaxima sodio, cefotetán, cefotetán disodio, hidrocloruro de cefotiam, cefoxitina, cefoxitina sodio, cefpimizol, cefpimizol sodio, cefpiramida, cefpiramida sodio, sulfato de cefpiroma, cefpodoxima proxctilo, cefprozilo, cefroxadina, cefsulcxina sodio, ceftazidima, ceftibuteno, ceftizoxima sodio, ceftriaxona sodio, cefuroxima, cefuroxima axetilo, cefuroxima pivoxetilo, cefuroxima sodio, cefacetrilo sodio, cefalexina, hidrocloruro de cefalexina, cefaloglicina, cefaloridina, cefalotina sodio, cefapirina sodio, cefradina, hidrocloruro de cetociclina, cetofenicol, cloranfenicol, palmitato de cloranfenicol, complejo de cloranfenicol pantotenato, cloranfenicol sodio succinato, fosfanilato de clorhexidina, cloroxilenol, bisulfato de clortetraciclina, hidrocloruro de clortetraciclina, cinoxacina, ciprofloxacino, hidrocloruro de ciprofloxacino, cirolcmicina, claritromicina, hidrocloruro de clinailoxacino, clindamicina, hidrocloruro de clindamicina, palmitato de clindamicina hidrocloruro, fosfato de clindamicina, clofazimina, cloxacilina benzatina, cloxacilina sodio, clorhexidina, cloxiquina, colistimetato sodio, sulfato de colistina, coumermicina, coumermicina sodio, ciclacilina, cicloserina, dalfopristina, dapsona, daptomicina, demcclociclina, hidrocloruro de democlociclina, demeciclina, denofungina, diaveridina, dicloxacilina, dicloxacilina sodio, sulfato de dihidrostreptomicina, dipiritiona, diritromicina, doxiciclina, doxiciclina calcio, doxiciclina fosfatox, hiclato de doxiciclina, droxacina sodio, enoxacina, epicilina, hidrocloruro de epitetraciclina, eritromicina, acistrato de eritromicina acistrato, estolato de eritromicina, etilsuccinato de eritromicina, gluceptato de eritromicina, lactobionato de eritromicina, propionato de eritromicina, estearato de eritromicina, hidrocloruro de etambutol, etionamida, fleroxacino, floxacilina, fludalanina, flumequina, fosfomicina, fosfomicina trometamina, fumoxicilina, cloruro de furazolio, tartrato de furazolio, fusidato sodio, ácido fusídico, ganciclovir y ganciclovir sodio, sulfato de gentamicina, gloximonam, gramicidina, haloprogina, hetacilina, hetacilina potasio, hexedina, ibafloxacino, imipenem, isoconazol, isepamicina, isoniazida, josamicina, sulfato de kanamicina, kitasamicina, levofuraltadona, levopropilcilina potasio, lexitromicina, lincomicina, hidrocloruro de lincomicina, lomefloxacino, hidrocloruro de lomefloxacino, mesilato de lomefloxacino, loracarbef, mafenida, meclociclina, sulfosalicilato de meclociclina, fosfato de megalomicina potasio, mequidox, meropenem, metaciclina, hidrocloruro de metaciclina, metenamina, hipurato de metenamina, mandelato de metenamina, meticilina sodio, metioprim, hidrocloruro de metronidazol, fosfato de metronidazol, mezlocilina, mezlocilina sodio, minociclina, hidrocloruro de minociclina, hidrocloruro de mirincamicina, monansina, monansina sodio, nafcilina sodio, nalidixato sódico, ácido nalidíxico, natainicina, nebramicina, palmitato de neomicina, sulfato de neomicina, undecilenato de neomicina, sulfato de netilmicina, neutramicina, nifuiradeno, nifuraldezona, nifuralel, nifuratronc, nifurdazilo, nifurimida, nifiupirinol, nifurquinazol, nifurtiazol, nitroxiclina, nitrofurantoína, nitromida, norfloxacino, novobiocina sodio, ofloxacino, onnetoprim, oxacilina y oxacilina sodio, oximonam, oximonam sodio, ácido oxolínico, oxitetraciclina, oxitetraciclina calcio, hidrocloruro de oxitetraciclina, paldimicina, paraclorofenol, paulomicina, pefloxacino, mesilato de pefloxacino, penamecilina, penicilinas, tales como penicilina G benzatina, penicilina G potasio, penicilina G procaína, penicilina G sodio, penicilina V, penicilina V benzatina, penicilina V hidrabamina y penicilina V potasio, pcntizidona sodio, fenil aminosalicilato, piperacilina sodio, pirbenicilina sodio, piridicilina sodio, hidrocloruro de pirlimicina, hidrocloruro de pivampicilina, pamoato de pivampicilina, probenato de pivampicilina, sulfato de polimixina b, porfiromicina, propikacina, pirazinamida, piritiona zinc, acetato de quindecamina, quinupristina, racefenicol, ramoplanina, ranimicina, relomicina, repromicina, rifabutina, rifametano, rifamexilo, rifamida, rifampina, rifapentina, rifaximina, rolitelraciclina, nitrato de rolitetraciclina, rosaramicina, butirato de rosaramicina, propionato de rosaramicina, fosfato de rosaramicina sodio, estearato de rosaramicina, rosoxacina, roxarsona, roxitromicina, sanciclina, sanfetrinem sodio, sarmoxicilina, sarpicilina, escopafungina, sisomicina, sulfato de sisomicina, esparfloxacino, hidrocloruro de espectinomicina, espiramicina, hidrocloruro de estalimicina, estefimicina, sulfato de estreptomicina, estreptonicozid, sulfabenz, sulfabenzamida, sulfacetamida, sulfacetamida sodio, sulfacitina, sulfadiazina, sulfadiazina sodio, sulfadoxina, sulfaleno, sulfamerazina, sulfameter, sulfametazina, sulfametizol, sulfametoxazol, sulfamonometoxina, sulfamoxol, sulfanilato de zinc, sulfanitrán, sulfasalazina, sulfasomizol, sulfatiazol, sulfazamet, sulfisoxazol, sulfisoxazol acetilo, sulfisboxazol diolamina, sulfomixina, sulopenem, sultamricilina, suncilina sodio, hidrocloruro de talampicilina, teicoplanina, hidrocloruro de temafloxacino, temocilina, tetraciclina, hidrocloruro de tetraciclina, complejo de fosfato de tetraciclina, tetroxoprim, tiamfenicol, tifencilina potasio, ticarcilina cresilo sodio, ticarcilina disodio, ticarcilina monosodio, ticlatona, cloruro de tiodonio, tobramicina, sulfato de tobramicina, tosufloxacino, trimetoprim, sulfato de trimetoprim, trisulfapirimidinas, troleandomicina, sulfato de; trospectomicina, tirotricina, vancomicina, hidrocloruro de vancomicina, virginiamicina, zorbamicina, y combinaciones de los mismos.

Las composiciones dadas a conocer en la presente memoria pueden comprender opcionalmente, además, uno o más organismos microbianos adicionales, por ejemplo, microorganismos agronómicamente beneficiosos. Dichos microorganismos agronómicamente beneficiosos pueden actuar sinérgicamente o en concierto con, o alternativamente cooperar con, los organismos de la presente exposición. Entre los ejemplos de microorganismos agronómicamente beneficiosos se incluyenBacillussp.,Pseudomonassp.,Rhizobiumsp.,Azospirillumsp.,Azotobactersp., bacterias fototróficas y degradadoras de la celulosa.Clostridiumsp.,Trichodermasp. y similares. El experto en la materia apreciará que esta lista es solo meramente ejemplar y no se encuentra limitada por la referencia a los ejemplos específicos proporcionados en la presente memoria.

En el medio del suelo, las bacterias inoculadas pueden encontrar difícil la supervivencia entre los organismos competidores y depredadores naturales. Para ayudar a la supervivencia de los microorganismos presentes en las composiciones de la presente exposición tras la aplicación en el medio ambiente, pueden encapsularse una o más de las cepas en, por ejemplo, una matriz polimérica adecuada. En un ejemplo, la encapsulación puede comprender perlas de alginato, tal como se ha descrito en Young et al., 2006, Encapsulation of plant growth-promoting bacteria in alginate beads enriched with humic acid. Biotechnology and Bioengineering 95:76-83. El experto en la materia apreciará que puede utilizarse cualquier material o matriz de encapsulación adecuado. La encapsulación puede llevarse a cabo utilizando métodos y técnicas conocidos por el experto en la materia. Los microorganismos encapsulados pueden incluir nutrientes u otros componentes de la composición además de los microorganismos.

Las composiciones dadas a conocer en la presente memoria pueden aplicarse o administrarse directa o indirectamente en cualquier planta o animal que requiera de tratamiento. En el caso de la aplicación en plantas, las composiciones pueden aplicarse en partes vegetales (tales como follaje) o semillas, o alternativamente puede aplicarse en suelo en el que estén creciendo o vayan a crecer las plantas, o donde se hayan sembrado o vayan a sembrar semillas. La aplicación puede ser mediante cualquier medio adecuado y puede llevarse a cabo a cualquier escala adecuada. Por ejemplo, la aplicación puede comprender verter, esparcir o pulverizar, incluyendo el esparcido o pulverización a gran escala o en masa, la inmersión de las semillas antes de la plantación, y/o el empapamiento de las semillas después de la plantación o en el estadio de plántula. El experto en la materia apreciará que pueden utilizarse múltiples medios de aplicación en combinación (por ejemplo, la inmersión de las semillas antes de la plantación, seguido del empapamiento de las semillas plantadas y/o la aplicación en plántulas o plantas maduras). Las semillas, plántulas o plantas maduras pueden tratarse tantas veces como resulte apropiado. El número de aplicaciones requerido podrá ser fácilmente determinado por el experto en la materia basándose en, por ejemplo, la planta en cuestión, el patógeno o enfermedad que debe tratarse, el estadio de desarrollo de la planta en el que se inicia el tratamiento, el estado de salud de la planta, el crecimiento, las condiciones medioambientales y/o climáticas bajo las que se cultiva la planta, y el propósito para el que se cultiva la planta.

De esta manera, de acuerdo con la presente exposición, pueden prepararse composiciones dadas a conocer en la presente memoria en cualquier forma adecuada dependiendo de los medios mediante los que se aplica la composición en el suelo o en las semillas de la planta o en la vegetación. Entre las formas adecuadas pueden incluirse, por ejemplo, suspensiones, líquidos y formas sólidas. Entre las formas sólidas se incluyen polvos, gránulos, formas particuladas más grandes y pellets. Las formas sólidas pueden encapsularse en recubrimientos solubles en agua (por ejemplo, esferas o cápsulas de gelatina pigmentada o no pigmentada), recubrimientos de liberación prolongada, o mediante microencapsulación de polvos de flujo libre utilizando uno o más de entre, por ejemplo, gelatina, alcohol polivinílico, etilcelulosa, ftalato de acetato de celulosa o estireno-anhídrido maleico. Entre los líquidos pueden incluirse soluciones acuosas y suspensiones acuosas, y concentrados emulsionables.

Con el fin de conseguir una dispersión, adhesión y/o conservación eficaz, o estabilidad en el medio, de la composición dada a conocer en la presente memoria, puede resultar ventajoso formular las composiciones con componentes portadores adecuados que ayuden a la dispersión, adhesión y conservación/estabilidad. Los portadores adecuados serán conocidos por el experto en la materia y entre ellos se incluyen, por ejemplo, quitosano, vermiculita, compost, talco, leche en polvo, geles y similares.

Pueden incorporarse componentes adicionales en las composiciones de la presente exposición, tales como sustancias húmicas, elementos traza, material orgánico, penetrantes, macronutrientes, micronutrientes y otros aditivos de suelo y/o vegetales.

Entre las sustancias del humus o húmicas que pueden incorporarse pueden incluirse, aunque sin limitarse a ellos, ácido húmico derivado de, por ejemplo, lignita oxidada o leonardita, ácido fúlvico y humatos, tales como el humato potásico.

El material orgánico añadido puede incluir, aunque sin limitación, sólidos biológicos, estiércol animal, compost o productos secundarios orgánicos compostados, lodo activado o productos secundarios animales o vegetales procesados (incluyendo harina de sangre, harina de plumas, harina de semillas de algodón, harina de algas marinas, extracto de algas marinas, emulsiones de pescado y harina de pescado).

Entre los penetrantes se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, agentes humectantes no iónicos, tensioactivos a base de detergentes, siliconas y/o organosiliconas. Los penetrantes adecuados serán conocidos por el experto en la materia, y entre los ejemplos no limitativos se incluyen polioxialquilenos poliméricos, alinol, nonoxinol, octoxinol, oxicastrol, TRITON, TWEEN, Sylgard 309, Silwet L-77 y Herbex (combinación de silicona/tensioactivo).

Los oligoelementos ejemplares para la inclusión en las composiciones se proporcionan en el Ejemplo 3. Sin embargo, el experto en la materia reconocerá que los elementos traza adecuados no se encuentran limitados a ellos, y que pueden utilizarse cualesquiera elementos traza (naturales o sintéticos).

Entre los aditivos adicionales para suelo y/o planta opcionales que pueden añadirse a las composiciones de la presente exposición se incluyen, por ejemplo, agentes de atrapamiento de agua, tales como zeolitas, enzimas, hormonas de crecimiento vegetal, tales como giberelinas, y agentes de control de plagas, tales como acaracidas, insecticidas, fungicidas y nematocidas.

Las composiciones de la presente exposición, incluyendo composiciones que comprenden cepas encapsuladas, pueden liofilizarse para ampliar su vida útil y/o para ayudar en las aplicaciones agrícolas, tales como la dispersión en el campo.

A continuación, se describe la presente exposición en referencia a los ejemplos específicos siguientes, que no deberían interpretarse en modo alguno como limitativos del alcance de la invención.

Ejemplos

Solo los ejemplos que comprenden la cepaLactobacillus parafarraginisLp18 son ilustrativos de la invención. Los ejemplos no deberían interpretarse como limitativos en modo alguno de la naturaleza general de la exposición de la descripción a lo largo de toda la presente especificación.

Ejemplo 1. Cepas microbianas y combinaciones de cepas.

Se utilizaron las cepas microbianas y combinaciones de cepas siguientes en los experimentos descritos en la presente memoria.

Se aislóLactobacillus parafarraginisLp18 a partir de una fuente ambiental. La secuenciación parcial del ARNr 16S indicó una similitud de 100 % respecto aLactobacillus parafarraginisAB 262735, que se encuentra en el grupo de riesgo 1 (TRBA). Al cultivarlo en medio MRS durante 3 días a 34 °C anaeróbicamente, Lp18 produjo colonias cremosas, redondas, ligeramente lustrosas y convexas de 1 a 2 mm de diámetro (anaerobio facultativo). Su apariencia microscópica es Gram-positiva, no mótil, cilindros cortos rectangulares, principalmente diploide. Se depositóLactobacillus parafarraginisLp18 en el National Measurement Institute, Australia, el 27 de octubre de 2011 con el número de acceso V11/022945.

Se aislóLactobacillus buchnerisLb23 a partir de una fuente ambiental. La secuenciación parcial del ARNr 16S indicó una similitud de 99 % respecto aLactobacillus buchneriAB 429368, que se encuentra en el grupo de riesgo 1 (TRBA). Al cultivarlo en medio MRS durante 4 días a 34 °C anaeróbicamente, Lb23 produjo colonias cremosas, brillantes, convexas de 1 a 2 mm de diámetro (anaerobio facultativo). Su apariencia microscópica es Gram-positiva, no motil, cilindros en cadenas. Se depositóLactobacillus buchneriLb23 en el National Measurement Institute, Australia, el 27 de octubre de 2011 con el número de acceso V11/022946.

Se aislóLactobacillus rapiLr24 a partir de una fuente ambiental. La secuenciación parcial del ARNr 16S indicó una similitud de 99% respecto aLactobacillus rapiAB 366389, que se encuentra en el grupo de riesgo 1 (DSMZ). Al cultivarlo en medio MRS durante 4 días a 34 °C anaeróbicamente, Lr24 produjo colonias cremosas, redondas y brillantes, de 0,5 mm de diámetro (anaerobio facultativo). Su apariencia microscópica es Gram-positiva, no motil, cilindros cortos monoploides o diploide. Se depositóLactobacillus rapiLr24 en el National Measurement Institute, Australia, el 27 de octubre de 2011 con el número de acceso V11/022947.

Los resultados de fermentación de tiras de API® 50 CH (Biomerieux) mostraban que Lr24 solo fermenta L-arabinosa, D-ribosa, D-xilosa, D-fructosa y esculina-citrato férrico.

Se aislóLactobacillus zeaeLz26 a partir de una fuente ambiental. La secuenciación parcial del ARNr 16S indicó una similitud de 99% respecto aLactobacillus zeaeAB 008213,1, que se encuentra en el grupo de riesgo 1 (TRBA). Al cultivarlo en medio MRS durante 48 horas a 34 °C anaeróbicamente Lz26 produce colonias blancas, redondas, brillantes y convexas con un diámetro de 1 mm (anaerobio facultativo). Su apariencia microscópica es Gram-positiva, no motil, cilindros cortos, prácticamente cocoides, diploide y algunas cadenas. Se depositóLactobacillus zeaeLz26 en el National Measurement Institute, Australia, el 27 de octubre de 2011 con el número de acceso V11/022948.

Los resultados de fermentación de tiras de API® 50 CH (Biomerieux) mostraban que Lz26 fermenta L-arabinosa, D-ribosa, D-adonitol, D-galactosa, D-glucosa, D-fructosa, D-manosa, L-ramnosa, dulcitol, inositol, D-manitol, D-sorbitol, N-acetilglucosamina, amigdalina, arbutina, esculina-citrato férrico, salicina, D-celobiosa, D-lactosa, D-trehalosa, D-melezitosa, gentiobiosa, D-turanosa, D-tagatosa, L-fucosa, L-arabitol, gluconato potásico y 2-cetogluconato potásico.

Se aislóAcetobacter fabarumAf15 a partir de una fuente ambiental. La secuenciación parcial del ARNr 16S indicó una similitud de 100 % respecto aAcetobacter fabarumAM 905849, que se encuentra en el grupo de riesgo 1 (DSMZ). Al cultivarlos sobre medio de extracto de malta durante 3 días a 34 °C, AF15 produce colonias opacas, redondas, brillantes y convexas de 1 mm de diámetro (aerobios). Su apariencia microscópica es de cilindros Gram-negativos, monoploides o diploides. Se depositóAcetobacter fabarumAf15 en el National Measurement Institute, Australia, el 27 de octubre de 2011 con el número de acceso V11/022943.

Se aislóCandida ethanolicaCc31 a partir de una fuente ambiental. La secuenciación parcial del ARNr 16S indicó una similitud de 89 % respecto aCandida ethanolicaAB534618. Al cultivarlos sobre medio de extracto de malta durante 2 días a 34 °C, Ce31 produce colonias cremosas, planas, mate, redondeadas y de 2 a 3 mm de diámetro (aerobios). Su apariencia microscópica es de levadura ovoide en gemación. Se depositóCandida ethanolicaCe31 en el National Measurement Institute, Australia, el 27 de octubre de 2011 con el número de acceso V111022944.

Otras cepas utilizadas en los experimentos descritos en la presente memoria fueron:Lactobacillus diolivorans(N3) depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022847;Lactobacillus parafarraginis(N11), depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022848;Lactobacillus brevis(TD) depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022851; cepa designada en la presente memoria "T9", depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022849; y la cepa designada en la presente memoria "TB", depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre con el número de acceso V12/022850.

La cepa designada en la presente memoria como "TB", depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/U2285U, presenta una similitud genómica global de 31,5 % respecto aLactobacillus casei,según se determinó mediante una búsqueda de alineación en SILVA BLAST de las secuencias de ARN ribosómico (ARNr) 16S pequeño (Quastet al.2013. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools.Nucl. Acid Res.41(D1):D590-596). Los resultados de fermentación de tiras de API® 50 CH (Biomerieux) mostraban que TB fermenta D-galactosa, D-glucosa, D-fructosa, D-manosa, metil-aD-manopiranósido, metil-aD-glucopiranósido, N-acetilglucosamina, amigdalina, arbutina, esculinacitrato férrico, salicina, D-celobiosa, D-maltosa, D-lactosa, sucrosa, D-melezitosa, D-rafinosa, gentiobiosa, D-tagatosa y gluconato potásico.

La cepa designada en la presente memoria como "T9'", depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 14 de diciembre de 2012 con el número de acceso V12/022849, presenta una similitud genómica global de 95,3 % respecto aLactobacillus paracasei,según se determinó mediante una búsqueda de alineación de SILVA BLAST. Los resultados de fermentación de tiras API® 50 CH (Biomerieux) mostraron que T9 fermenta D-ribosa, D-galactosa, D-glucosa, D-fructosa, D-manosa, D-manitol, D-sorbitol, metil-aD-glucopiranósido, N-acetilglucosamina, amigdalina, arbutina, esculina-citrato férrico, salicina, D-celobiosa, D-maltosa, sucrosa, D-trehalosa, inulina, gentiobiosa, D-turanosa, D-tagatosa, arabitol, gluconato potásico y 2-cetoglutonato potásico.

Las combinaciones siguientes de las cepas microbianas anteriormente indicadas se utilizaron en los experimentos descritos posteriormente en la presente memoria.

La composición a la que se hace referencia posteriormente en la presente memoria como "composición GL" comprende seis cepas microbianas indicadas anteriormente (es decir,Acetobacter fabarumAf15,Lactobacillus parafarraginisLp18,Lactobacillus buchneriLb23,Lactobacillus rapiLr24,Lactobacillus zeaeLz26 yCandida ethanolicaCe31) a concentraciones finales de 2,5*105 ufc/ml para cada una de las cepas deLactobacillus,1,0*105 ufc/ml paraCandida ethanolicaCe31 y 1,0*106 ufc/ml paraAcetobacter fabarumAf15.

La composición a la que se hace referencia posteriormente en la presente memoria como "mezcla G" comprende tres de las cepas microbianas indicadas anteriormente, específicamenteLactobacillus zeaeLz26 cepa TB (NMI número de acceso V12/022850) y T9 (NMI número de acceso V12/022849). Se añadieron cultivos recientes de bacterias a las concentraciones finales respectivas 1*107 ufc/mlLactobacillus zeaeLz26,1*107 ufc/ml TB y 1*107ufc/ml T9, a una mezcla de 2 % de elementos traza, 0,3 % ácido húmico, 4 % melazas y agua. Se ajustó el pH de la composición a 3,8 4,2 con ácido fosfórico.

La composición a la que se hace referencia posteriormente en la presente memoria como "mezcla 1" comprende cinco de las cepas microbianas indicadas anteriormente, específicamenteLactobacillus zeaeLz26,Lactobacillus buchneriLb23,Lactobacillus parafarraginisLp18,Candida ethanolicaCe31 yAcetobacter fabarumAf15. Se añadieron cultivos recientes de bacterias a las concentraciones finales respectivas 1*107ufc/mlLactobacilluszeaeLz26, 1*107 ufc/mlLactobacillus buchneriLb2.3, 1*107 ufc/mlLactobacillus parafarraginisLp18, 1*105 ufc/mlCandida ethanolicaCe31 y 1*106 ufc/mlAcetobacter fabarumAf15, a una mezcla de 2%de elementos traza, 0,3 % ácido húmico, 4 % melazas y agua. Se ajustó el pH de la composición a 3,8-4,2 con ácido fosfórico.

La composición a la que se hace referencia posteriormente en la presente memoria como "mezcla 2" comprende cinco de las cepas microbianas indicadas anteriormente, específicamenteLactobacillus zeaeLz26,Lactobacillus parafarraginisLp18,Lactobacillus buchneriLb23,Lactobacillus rapiLr24 yAcetobacter fabarumAf15. Se añadieron cultivos recientes de bacterias a las concentraciones finales respectivas 1*107 ufc/mlLactobacillus zeaeLz26,1*106 ufc/mlLactobacillus parafarraginisLp18,1*106 ufc/mlLactobacillus buchneriLb23, 1*106 ufc/mlLactobacillus rapiLr24 y 1*106 ufc/mlAcetobacter fabarumAf15, a una mezcla estéril de 2 % de elementos traza, 3 % de melazas y agua RO.

La composición a la que se hace referencia posteriormente en la presente memoria como "mezcla 3" comprende cuatro de las cepas microbianas indicadas anteriormente, específicamenteLactobacillus zeaeLz26,Lactobacillus parafarraginisLpl8,Lactobacillus buchneriLb23 yLactobacillus rapiLr24. Se añadieron cultivos recientes de Lactobacillus sp. a las concentraciones finales respectivas 1*107 ufc/mlLactobacillus zeaeLz26, 1*106 ufc/mlLactobacillus parafarraginisLp18, 1*106 ufc/mlLactobacillus buchneriLb23 y 1*106 ufc/mlLactobacillus rapiLr24, a una mezcla estéril de 3 % de melazas y agua RO.

Mantenimiento de cultivos.

Se prepararon reservas de glicerol al 30 % a partir de cada aislado y se conservaron a -80 °C para el almacenamiento del cultivo a largo plazo. El almacenamiento a corto plazo de los cultivos se mantuvo a 4 °C en tubos inclinados con agar (almacenamiento durante 3 meses) y en placas de agar que se subcultivaron cada mes. Para mantener los rasgos originales de los aislados, se preparó una placa nueva a partir de la reserva a -80 °C tras tres subcultivos de placa.

Inóculo y medios de crecimiento.

Se cultivaron las cepas deLactobacilluscon o sin aire(L. rapiprefiere condiciones anaeróbicas), en caldo MRS (Difco) o en placas de agar MRS, según la aplicación. Los cultivos se cultivaron rutinariamente durante 2 días a una temperatura mesofílica de entre 30 °C y 34 °C. Las cepas deAcetobacteryEthanolicase cultivaron aeróbicamente en caldo de extracto de malta (Oxoid) o en placas de agar con extracto de malta, según la aplicación. Los cultivos se cultivaron rutinariamente durante 2 días a una temperatura mesofílica de entre 30 °C y 34 °C.

Preparación "de siembra" del fermentador.

Para las cepas individuales, utilizando un alambre Nicrom estéril, se extrajo una única colonia de una placa de cultivo nueva y se transfirió a una botella universal que contenía 15 ml de medio estéril. La botella se introdujo con seguridad en un incubador bajo agitación a 30 °C, a 140 rpm durante 48 h(L. rapino se somete a agitación). Tras la incubación, debería observarse un crecimiento bacteriano turbio. Las botellas de inoculación de "siembra" se almacenaron a 4 °C hasta requerirse (máximo: 1 semana).

Normalmente se requiere una inoculación bacteriana de 5 % para una tanda de fermentación. El cultivo de siembra de 15 ml almacenado se añadió a una botella de Schott que contenía un volumen de medio estéril que era 5 % del volumen de trabajo total del fermentador. Se incubó el cultivo de la misma manera que la preparación de siembra de 15 ml. Se utilizaron fermentadores automáticos de gran escala para el cultivo de cultivos puros de cada aislado. Se utilizó la alimentación automática de álcali, antiespumante y glucosa. Normalmente la temperatura se mantiene entre 30 °C y 34 °C, pH 5,5, aunque el oxígeno y la agitación varían según el microorganismo.

Análisis de muestras.

Tras cada cultivo a gran escala de un aislado, se extrajo asépticamente una muestra y se llevó a cabo un recuento de viabilidad utilizando diluciones en serie de 10 veces, realizados en una campana de flujo laminar. También se preparó un portaobjetos húmedo y se observó la pureza utilizando un microscopio con contraste de fases para verificar por duplicado la presencia o no de contaminantes que podrían estar presentes, pero no ser capaces de crecer en los medios de cultivo. Tras 48 horas, se comprobaron las placas de viabilidad para un cultivo puro (misma morfología de las colonias) y se contaron las colonias para producir un valor de unidades formadoras de colonias por ml (ufc/ml). Se llevó a cabo, además, una tinción Gram para la observación microscópica.

Ejemplo 2. Actividad contra Fusarium oxysporumf.spzingiberi.

Las podredumbres del jengibre fueron informadas por primera vez en Queensland en 1955. Están causadas porFusarium oxysporumf. spzingiberi,que provoca amarillamiento y marchitamiento de las hojas y podredumbre del rizoma del jengibre. Esta enfermedad ha provoca graves pérdidas económicas en la industria australiana del jengibre.

Los inventores llevaron a cabo un experimento de laboratorio en el que el patógeno vegetalFusarium oxysporumf.

spzingiberise retó con cepas bacterianas individuales descritas en el Ejemplo 1 (en lo sucesivo, cepas "GL") para determinar si mostraban un efecto antagónico contra el patógeno del jengibreFusarium.

Se adquirió un aislado puro deFusarium oxysporumf. spzingiberi(en lo sucesivo,"foz")de la colección de cultivos de ensayo en placa de difusión (EPD) del Herbario (BRIP) de Queensland. Se cultivó rutinariamenteFozsobre medio sólido PDA aeróbicamente a temperatura ambiente. T ras unos cuantos días, se observó una tumoración rosada y tras aproximadamente 5 días, se desarrolló un micelio aéreo blanco. También crece bien sobre extracto de malta (Em ) y medio sólido MRS.Lactobacillus parafarraginisLp18,Lactobacillus buchneriLb23.Lactobacillus rapiLr24 yLactobacillus zeaeLz26 se cultivaron rutinariamente bajo condiciones anaeróbicas sobre medio MRS a 34 °C. Se cultivaronAcetobacter fabarumAf15 yCandida ethanolicaCe31 rutinariamente bajo condiciones aeróbicas sobre agar EM a 34 °C. Se determinó la actividad antifúngica de las cepas bacterianas GL utilizando cuatro métodos diferentes: placas de pocillos, placas de estriado, un cribado de doble placa y un método de gota colgante de acuerdo con los protocolos experimentales siguientes.

Placas de pocillos

•Se prepararon dos placas de agar específicas según los requisitos de crecimiento de cada patógeno.

• Utilizando el extremo grande de una punta estéril de 1 ml, se practicaron seis orificios de 9 mm en una placa y siete orificios de 9 mm en la segunda placa.

• Se añadieron 2,5 ml de solución salina al 0,85 % estéril a una botella Bijou estéril. Mediante la utilización de un asa pasada por llama, se extrajeron 2 o 3 colonias (o 2 asas de crecimiento de hifas fúngicas) de una placa de patógenos recién cultivada, y se desprendieron mediante lavado en solución salina y se agitaron bien con vórtex, de manera que la solución presentase una apariencia similar a un estándar 0,5 de MacFarland.

• Se sumergió un hisopo estéril en la mezcla de solución salina/colonias y utilizando presión suave, se hisopó la placa en zigzag, cuidando de no destruir los pocillos. Se repitió esta operación tres veces, girando la placa ligeramente cada vez.

• Un caldo recién cultivado (1 a 3 días) de la cepa GL específica que debía someterse a ensayo se filtró a través de un filtro estéril de 0,45 pm para eliminar los microbios. Se recogió el filtrado en una botella Bijou estéril.

• Cada pocillo de la placa se etiquetó con cada una de las cepas GL que debía someterse a ensayo. Se añadieron 80 pl del filtrado a cada pocillo.

• Se dejaron las placas con la tapa hacia arriba y se incubaron a temperatura ambiente.

• Tras 24 horas, se verificaron las placas para crecimiento de patógenos. Se midieron y registraron los diámetros de cualesquiera zonas claras de inhibición (incluyendo el diámetro del pocillo de 9 mm). En el caso de que se observase un crecimiento débil o nulo, se dejaron incubar las placas durante más tiempo, hasta observar un buen crecimiento.

Placas de estría cruzada

Se utilizó este método para investigar el efecto de las cepas GL en crecimiento de por sí sobre la patógeno en lugar de un filtrado de sobrenadante.

• Mediante la utilización de un asa pasada por la llama se realizaron varias estrías verticales (de ~1 cm de anchura) por el centro de una placa de agar (respecto a los requisitos de crecimiento bacteriano).

• Las placas se incubaron durante la noche a la temperatura de crecimiento relevante a fin de conseguir un buen crecimiento del aislado de cepa GL.

• Utilizando un cultivo de placa fresco del patógeno, se trazó una única línea horizontalmente cruzando la placa de izquierda a derecha. La placa se incubó nuevamente.

• Tras 24 horas de incubación, se observaron las partes izquierdas de las placas para detectar cualquier zona de inhibición del crecimiento entre las líneas inoculadas de patógeno fúngico y cepa Gl (las partes derechas eran una mezcla de patógeno y cepa GL). En caso necesario, las placas se dejaron bajo incubación durante más tiempo, hasta observar un buen crecimiento de patógeno.

Cribado de doble placa

Se desarrolló este método para evitar las dificultades asociadas a los diferentes requisitos de crecimiento de las cepas GL y de los patógenos. Se llevó a cabo el cribado en una placa Petri de dos zonas utilizando dos medios de crecimiento diferentes en cada zona. •

• Utilizando placas Petri estériles con dos zonas, se vertió el agar de cultivo de bacterias GL en ambas zonas. • Una vez seco y gelificado, se recortó asépticamente la mitad de cada zona. Los cuatros extraídos se llenaron con el medio de crecimiento de patógeno.

• Se añadieron 1 a 3 colonias de cepa GL frescas a 2,5 ml de solución salina al 0,85 % estéril hasta una densidad similar al estándar de McFarland 0,5.

• Utilizando un hisopo estéril, se realizaron tres siembras por extensión en cada zona de cuarto. Las placas se incubaron durante 24 a 48 horas a 34 °C bajo condiciones aeróbicas (o anaeróbicas), según el microorganismo.

• Se recortaron tres trozos del tamaño de un asa de siembra, de foz, a partir de una placa nueva, y se lavaron en 5 ml de agua miliQ estéril y se sometieron a agitación con vórtex a fondo para mezclarlos.

• Mediante la utilización de un hisopo estéril se realizó una siembra por extensión cruzando el agar con patógeno procurando acercarse, pero sin tocar la cepa GL.

• Se envolvieron doblemente las placas y se incubaron a la temperatura adecuada de crecimiento del patógeno (generalmente 27 °C) durante 1 a 10 días, según la tasa de crecimiento del patógeno.

• Se midió y registró la distancia entre el crecimiento del patógeno y el borde de la cepa GL.

Método de cultivo por goteo.

Se utilizó este método para averiguar el efecto de un cultivo viable de cepas GL directamente sobre el patógeno. Se preparó una placa sembrada por extensión defoztal como se ha indicado anteriormente. Se hicieron caer 10 pl de un cultivo recién cultivado durante la noche de una cepa GL sobre la placa sembrada por extensión defozen puntos marcados. Las placas se dejaron a temperatura ambiente durante la noche y se observaron tras 24 y 48 horas de crecimiento. Se registraron os diámetros de las zonas de clara inhibición.

Los resultados de los experimentos de laboratorio se muestran en la Tabla 1. El crecimiento activo de las cepasLactobacillus parafarraginisLp18,Lactobacillus buchneriLb23,Lactobacillus rapiLr24 yLactobacillus zeaeLz26 mostró la mejor inhibición del crecimiento defoz.El hecho de que el filtrado libre de células derivado de cultivos de crecimiento de estos organismos no inhibiese el crecimiento defozsugiere una interacción entre las bacterias y el patógenoFusarium.Las cepasAcetobacter fabarumAf15 yCandida ethanolicaCe31 mostraron una capacidad menor de inhibir el crecimiento defoz.

También activas contrafozeran las cepas de crecimiento activoLactobacillus diolivorans(N3),Lactobacillus brevis(TD), y las cepas TB y T9, así como los filtrados libres de células extraídos del cultivo de N3, TB, T9, TD yLactobacillus parafarraginis(N11).

Tabla 1. Zona de inhibición del crecimiento (mm) deFusarium oxysporumf.spzingiberi24 horas después de la adición de cepas GL a 27 °C.

Valores medios calculados a partir de experimentos repetidos.

1 15,Acetobacter fabarumAf15; 18,Lactobacillus parafarraginisLp18; 23,Lactobacillus buchneriLb23; 24,Lactobacillus rapiLr24; 26,Lactobacillus zeaeLz26; 31,Candida ethanolicaCe31; N3,Lactobacillus diolivorans(V12/022847); N11,Lactobacillus parafarraginis(V12/022848); TB (V12/022850); TD,Lactobacillus brevis(V12/022851); T9 (V12/022849).

Ejemplo 3. Control de Fusarium en plántulas de sandía.

Plántulas infectadas.

A continuación, los inventores investigaron el efecto de una composición que comprendía las cepas bacterianas indicadas en el Ejemplo 1 sobre el patógeno vegetalFusarium oxysporumen plántulas de sandía de Huntsman.Fusarium oxysporumpresenta muchas formas especializadas (f. sp). La forma que afecta a las sandías causando la podredumbre porFusariumesFusarium oxysporumf. spniveum.Las plántulas utilizadas en el presente estudio se infectaron conFusarium oxysporumy se obtuvieron de una granja de sandías con un problema significativo deFusariumen el suelo (proporcionadas por Jason Klotz).

La composición (denominada posteriormente "composición GL") comprendía seis cepas microbianas indicadas en el Ejemplo 1 (es decir,Acetobacter fabarumAf15,Lactobacillus parafarraginisLp18,Lactobacillus buchneriLb23,Lactobacillus rapiLr24.Lactobacillus zeaeLz26 yCandida ethanolicaCe31) a concentraciones finales de 2,5*105 ufc/ml para cada una de las cepas deLactobacillus,1,0*105 ufc/ml paraCandida ethanolicay 1,0*106 ufc/ml paraAcetobacter fabarum.Las cepas se cultivaron tal como se indica en el Ejemplo 1 y se mezclaron con 2 % de oligoelementos, 0,3 % de humato (humato soluble, LawrieCo.), 3 % de melazas y 0,1 % a 0,2 % de ácido fosfórico. El ácido fosfórico se añadió en el punto en que el pH estaba comprendido en el intervalo de entre 3,8 y 4,0. El componente oligoelementos normalmente comprendía lo siguiente (por cada 1.000 l):

Tabla 2. Componente de oligoelementos de la composición GL.

Se muestra el esquema experimental en la Tabla 3. En cada experimento había cuatro réplicas.

Tabla 3

1 Para el experimento A, se pesaron 2000 g de suelo y se trataron con composición GL a razón de 40 l/Ha en una bolsa de cierre hermético 48 horas antes de la plantación y se mezcló a fondo. A continuación, se repartió el contenido equitativamente entre 4 macetas.

Se plantaron en macetas plántulas de melón de Huntsman que se sabía que estaban infectadas porFusarium oxysporumy se colocaron bajo luces hidropónicas a una temperatura de ~28-30 °C. Al llegar, las plántulas tenían un aspecto pálido y amarillento. Las plántulas en las macetas se regaron y trataron tal como se indica en la Tabla 3. Todas las macetas se regaron utilizando un pulverizador dos veces al día. A media que crecían las plantas, se incrementó la cantidad de agua por planta.

Tras las observaciones iniciales una semana después de la plantación, todas las plantas excepto aquellas en el experimento de control (D) fueron tratadas con 1:10 GL a razón de 40 l/ha. Las plantas recibieron un tratamiento una vez a la semana durante aproximadamente tres semanas.

Siete días después del tratamiento inicial para los experimentos A, B y C, se observó que las plantas estaban marchitas y secas. Cuarenta y ocho horas después del segundo tratamiento, las plantas en los experimentos A y B (y una maceta en el experimento C) tenían una apariencia saludable. Las plantas en 3 macetas del experimento C y el control siguieron presentando una apariencia seca y muerta. Los resultados se resumen a continuación y en la figura 1.

Experimento A: 4 de 4 plantas sobrevivieron a la infección porFusarium oxysporum.Las plantas presentaban hojas más grandes y más radiantes que en los demás tratamientos. Las plantas presentaban un tallo principal más fuerte. El sistema radicular era significativamente compacto y denso en todas las réplicas. El peso medio de las plantas era el más elevado y era una buena indicación del crecimiento global de la planta.

Experimento B: 3 de 4 plantas sobrevivieron a la infección porFusarium oxysporum.Una planta resultó afectada por el patógeno después de la primera semana. El tamaño foliar era medio y la salud de las plantas era buena. El sistema radicular era menos denso que en A. La salud global de las plantas era satisfactoria. El tallo principal de las plantas era fuerte.

Experimento C: 1 de 4 plantas sobrevivieron a la infección porFusarium oxysporum.El crecimiento global de las plantas y su salud eran muy malos.

Experimento D: todas las réplicas resultaron afectadas porFusarium oxysporumy murieron en máximo una semana.

En resumen, los resultados indican que el empapamiento de las raíces de las plántulas infectadas durante 30 minutos en solución 1:10 GL antes de la plantación tuvo más éxito que los demás tratamientos y que el control de H<2>O. Resulta evidente que la introducción de las bacterias presentes en la solución GL en la rizosfera de las raíces incrementó la probabilidad de supervivencia de las plantas frente al patógeno vegetalFusarium oxysporum.

Protección de las plántulas en suelo infectado

A continuación, los inventores investigaron si una composición de cepa microbiana descrita en la presente memoria podía proteger las plántulas de sandía frente al suelo infectado porFusariumsp.

Experimento 1

Para el experimento se utilizaron pequeños invernaderos para la propagación que contenían bandejas de 24 celdas. Las bandejas se llenaron con un suelo de campo bien mezclado que se sabía que estaba infectado por una especie deFusariumque ataca a la sandía. Se plantaron tres semillas de sandía "Candy red" en cada celda. Había tres celdas por formulación/control. Cada trío se contuvo dentro de una bolsa en la parte inferior para evitar la contaminación cruzada por drenado entre formulaciones. Un juego de celdas contenía un control con agua, un control de suelo esterilizado (3 esterilizaciones en autoclave separadas por 2 días) y la mezcla G de composición microbiana (ver el Ejemplo 1). Se compararon dos juegos de celdas: semillas empapadas y semillas no empapadas. Las semillas se empaparon durante 1 hora en agua estéril o en mezcla G (diluida 1 en 10). Se plantó cada semilla a una profundidad similar e inmediatamente después de la plantación cada celda recibió una dosis de 6 ml de agua estéril o 1 ml de mezcla G (1:10) más 5 ml de agua estéril. Se sellaron los recintos de propagación y se dejaron a temperatura ambiente fuera de la luz solar directa durante 12 días.

Experimento 2

El diseño del experimento 2 era esencialmente el mismo que el del experimento 1, con dos excepciones: Las semillas se sumergieron durante 30 minutos y la composición microbiana inicial se redujo en un tercio (300 pl de mezcla G diluida 1:10 añadida a 3 ml de agua estéril), aunque se repitió después de 1 semana. Se añadieron 3 ml de agua estéril a los controles de agua.

Se muestran los resultados de los experimentos 1 y 2 en la Tabla 4. Las semillas sumergidas en mezcla G, con una segunda dosis de refuerzo 7 días después, permitieron proteger con éxito las plántulas de sandía frente a la infección porFusariumdurante el periodo de crecimiento de 12 días. El tiempo de inmersión de las semillas afectó a la tasa de germinación. El tiempo de inmersión más corto del experimento 2 mejoró la altura de las plántulas en todos los casos, en comparación con plántulas no sumergidas comparables. Cabe destacar que el suelo esterilizado en autoclave, falto de toda actividad biológica, retrasó el crecimiento de las plantas en ambos experimentos.

Tabla 4. Protección de las plántulas de sandía.

(continuación)

Ejemplo 4.Actividad contraFusarium oxysporumf.spcúbense(grupo de compatibilidad vegetativa 0120) número de acceso 24322.

La cepaFusarium oxysporumf. spcúbense (razas 1 a 4)es el patógeno causante de la destructiva enfermedad de Panamá en la banana. Debido al estricto confinamiento en cuarentena, el patógeno causante no pudo someterse a ensayo directo en el laboratorio; sin embargo, sí se permitió el uso de una cepa menos virulenta (foc n.° de acceso 24322). Se llevó a cabo el ensayo de doble placa, que retó el crecimiento del patógeno contra la composición GL (ver el Ejemplo 3) y las cepas GL individuales indicadas en el Ejemplo 1. El experimento se llevó a cabo por duplicado y se repitió. Se muestran los resultados en la Tabla 5. Los resultados muestran que la composición GL inhibió por completo el crecimiento deFusariumy también mostró un fuerte efecto antimicrobiano de las cepas GLLactobacillus zeaeLz26,Lactobacillus brevis(TD), TB y T9.

Tabla 5. Zona en placa doble de inhibición del crecimiento (mm) deFusarium oxysporumf. spcubenseVCG 0120 en diversos tiempos de incubación después de la adición de cepas GL.

Los valores medios se calcularon a partir de experimentos repetidos.

1 15,Acetobacter fabarumAf15; 18,Lactobacillus parafarraginisLp18; 23,Lactobacillus buchneriLb23; 24,Lactobacillus rapiLr24; 26,Lactobacillus zeaeLz26; 31,Candida ethanolicaCe31; N3,Lactobacillus diolivorans(V12/022847); N11,Lactobacillus parafarraginis(V12/022848); TB (V12/022850); TD,Lactobacillus brevis(V12/022851); T9 (V12/022849).

Ejemplo 5. Actividad contra otras especies fúngicas.

Pseudocercospora macadamiaees el patógeno causante de la mancha fúngica de la cáscara de las nueces de Macadamia. Provoca que las nueces caigan prematuramente de los árboles, provocando grandes pérdidas económicas a la industria de la nuez de Macadamia. Algunas variedades de árbol de Macadamia son más susceptibles que otras, tal como A16. Se adquirió un aislado puro dePseudocercospora macadamiaede la colección de cultivos de Queensland Department of Primary Industries. Se sometió a ensayo la capacidad de las cepas GL indicadas en el Ejemplo 1, de inhibir el crecimiento de dicho patógeno fúngico, tal como se indica en el Ejemplo 2. Se muestran los resultados a continuación, en la Tabla 6.Lactobacillus parafarraginisLp18,Lactobacillus buchneriLb23,Lactobacillus rapiLr24,Lactobacillus zeaeLz26,Lactobacillus diolivorans(N3),Lactobacillus brevis(TD), TB y T9 fueron capaces de inhibir el crecimiento del patógeno, utilizando tanto un cultivo en crecimiento activo y un medio de crecimiento (filtrado).

Tabla 6. Zona de inhibición del crecimiento (mm) dePseudocercospora macadamiaedespués de 5 días a 27 °C.

Valores medios calculados a partir de experimentos repetidos.

1 15,Acetobacter fabarumAf15; 18,Lactobacillus parafarraginisLp18; 23,Lactobacillus buchneriLb23; 24,Lactobacillus rapiLr24; 26,Lactobacillus zeaeLz26; 31,Candida ethanolicaCe31; N3,Lactobacillus diolivorans(V12/022847); N11,Lactobacillus parafarraginis(V12/022848); TB (V12/022850); TD,Lactobacillus brevis(V12/022851); T9 (V12/022849).

Se llevaron a cabo experimentos similares para determinar la capacidad de las cepas GL indicadas en el Ejemplo 1 de inhibir el crecimiento de los patógenos fúngicosRhizoctonia solani(agente causante de la podredumbre de las raíces, la pudrición del collar, la podredumbre de las plántulas y el tallo de alambre en un abanico de especies vegetales) yBotrytis cinerea(un hongo necrotrófico que afecta a una amplia diversidad de cultivos, incluyendo la viña, la tomatera y el fresal). Se utilizó el método de cribado en doble placa tal como se describe en el Ejemplo 2, con la excepción de que se colocó un pequeño fragmento de matriz fúngica sobre la placa en lugar de hisopar la placa. Se muestran los resultados en la Tabla 7.

Tabla 7. Inhibición del crecimiento deRhizoctonia solaniyBotrytis cinerea.

1 15,Acetobacter fabarumAf15; 18,Lactobacillus parafarraginisLp18; 23,Lactobacillus buchneriLb23; 24,Lactobacillus rapiLr24; 26,Lactobacillus zeaeLz26; 31,Candida ethanolicaCe31; N3,Lactobacillus diolivorans(V12/022847); N11,Lactobacillus parafarraginis(V12/022848); TB (V12/022850); TD,Lactobacillus brevis(V12/022851); T9 (V12/022849).

Se llevaron a cabo experimentos similares utilizando el método de cribado de doble placa para determinar la capacidad de las cepas y mezclas de GL indicadas en el Ejemplo 1 para inhibir el crecimiento de los patógenos fúngicosAlternaria solani, Colletrichum coccodes, Leptosphaeria maculansySclerotinia sclerotiorum.Se muestran los resultados en las Tablas 8 y 9.

Tabla 8. Inhibición del crecimiento deAlternaría solaniyColletotrichum coccodes.

Tabla 9. Inhibición del crecimiento deLeptosphaeria maculansySclerotinia sclerotiorum.

Ejemplo 6. Actividad contra Streptomyces scabies.

Los inventores llevaron a cabo un experimento de laboratorio para determinar la capacidad de las cepas GL indicadas en el Ejemplo 1 de inhibir el crecimiento de la bacteria Gram-positivaStreptomyces scabies,el agente causante de la sarna de la patata.

Se obtuvo un aislado puro deStreptomyces scabiesgracias a Anabel Wilson, de The Vegetable Centre, Tasmanian Institute of Agriculture, New Town, Tasmania. Se cultivó del modo habitual S.scabiessobre medio sólido PDA bajo condiciones aeróbicas a temperatura ambiente. Tras unos cuantos días, se observó una tumoración blanca y tras aproximadamente 5 días, se desarrolló un micelio aéreo gris.Lactobacilius parafarraginisLp18,Lactobacillus buchneriLb23,Lactobacillus rapiLr24 yLactobacillus zeaeLz26 se cultivaron del modo habitual bajo condiciones aeróbicas sobre medio MRS a 34 °C. Se cultivaron del modo habitualAcetobacter fabarumAf15 yCandida ethanolicaCe31 bajo condiciones aeróbicas sobre agar ME a 34 °C. Se determinó la actividad antibacteriana de las cepas bacterianas utilizando tres métodos diferentes: placas de pocillos, placas de siembra por estría cruzada y un método de placa doble tal como se describe en el Ejemplo 2.

Se muestran los resultados posteriormente, en la Tabla 10. Las cepas en crecimiento activoLactobacillus parafarraginisLp18,Lactobacillus buchneriLb23 yLactobacillus zeaeLz26 y la cepa TB mostró la mejor inhibición del crecimiento de S.scabies.El hecho de que el sobrenadante libre de células derivado de cultivos de dichos organismos no inhibiese el crecimiento de S.scabiessugiere una interacción entre las cepas GL y el patógeno.

Tabla 10. Zona de inhibición del crecimiento (mm) deStreptomyces scabies24 horas después de la adición de las cepas GL.

(continuación)

1 18,Lactobacillus parafarraginisLp18; 23,Lactobacillus buchneriLb23; 24,Lactobacillus rapiLr24; 26,Lactobacillus zeaeLz26; 31,Candida ethanolicaCe31; N3,Lactobacillus diolivorans(V12/022847); N11,Lactobacillus parafarraginis(V12/022848); TB (V12/022850); TD,Lactobacillus brevis(V12/022851); T9 (V12/022849).

Ejemplo 7. Actividad contra los agentes causantes de la mastitis.

La mastitis clínica es un problema grave en la industria láctea. La mastitis puede estar causada por varias especies bacterianas diferentes; las especies causantes más importantes son las especies Gram-positivasStaphylococcus aureusyStreptococcus uberisy la especie Gram-negativaEscherichia coli.Los inventores investigaron la capacidad de las cepas GL indicadas en el Ejemplo 1 (solas y en combinación) de inhibir el crecimiento de una muestra (aislado) ambiental deEscherichia coli,una cepa de laboratorio deEscherichia coli(ATCC 25922) y las cepas de laboratorioStaphylococcus aureusyStreptococcus uberis.

Determinación de las concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) para filtrados de cultivo bacteriano.

Se cultivaron cultivos recientes durante la noche de cepas GL individuales deLactobacillus.Se centrifugaron 3 ml del cultivo de la noche a 4.000 rpm durante 10 minutos. Se decantó el sobrenadante y se filtró a través de una unidad de filtro de jeringa de 0,45 pl hacia el interior de una botella Bijou estéril. El filtrado estéril de cada cultivo bacteriano, así como un control de medio de cultivo MRS, se diluyeron 1:1, 1:3, 1:5 y 1:10 utilizando solución salina al 0,85 % estéril. Utilizando el extremo ancho de una punta de 1 ml estéril, se realizaron seis orificios bien espaciados en una placa de agar nutritivo fresca. La placa se hisopó tres veces con uno de los tres patógenos de mastitis (diluido hasta estándar de MacFarland 0,5). Se añadieron 80 pl de cada filtrado diluido (así como no diluido y MRS) a cada uno de los seis pocillos. Se repitió lo anterior para cada patógeno y para cada filtrado bacteriano. Las placas se incubaron durante la noche a 34 °C. Se midió y registró el diámetro de las zonas claras de crecimiento inhibido.

Se muestran los resultados en las Tablas 11, 12 y 13. Los filtrados de cultivo de crecimiento deLactobacillus zeaeLz26, TB y T9 mostraron actividad antimicrobiana contra los tres patógenos de mastitis. Los filtrados mantuvieron su eficacia hasta una dilución de 1:3. Los tres patógenos crecieron bien en ausencia de cepas GL.

Tabla 11. Inhibición del crecimiento deE. coli.

Tabla 12. Inhibición del crecimiento de S.aureus.

1 las zonas eran de crecimiento reducido (no completamente claras).

Tabla 13. Inhibición del crecimiento de S.uberis.

Determinación de las unidades formadoras de colonia (ufc) requeridas para inhibir los patógenos.

Se determinó la viabilidad de cada una de las seis cepas GL deLactobacillusy de dos composiciones (mezcla 2 y mezcla 3; ver el Ejemplo 1) al inicio del experimento. Se registró el número de unidades formadoras de colonia por ml (ufc/ml) de cada cultivo (Tabla 14).

Tabla 14.

Cada cepa (o mezcla) se diluyó en medio MRS estéril 1:100, 1:1.000 y 1:10.000. Se vertieron placas dobles de agar nutritivo/MRS (descritas anteriormente). Se extendieron 100 pl del cultivo diluido sobre cada cuatro de MRS de la placa doble (por duplicado). Se utilizó una pequeña espátula de Drigalski de vidrio para extender los 100 pl sobre los medios. Las placas se incubaron bajo condiciones anaeróbicas a 34 °C durante 48 horas. Los tres patógenos se diluyeron hasta un estándar de MacFarland de 0,5 y utilizando un hisopo estéril, se hisopó cada uno cruzando ambos cuartos de agar nutritivo de la placa doble. Se incubaron nuevamente las placas durante 2 días a 34 °C. Se midieron y registraron cualesquiera zonas de crecimiento. "Cero" indica ninguna zona (inhibición nula) y "crecimiento nulo" indica la ausencia de crecimiento del patógeno (inhibición completa). Se trazó una línea de hisopado de cada patógeno cruzando la placa de agar nutritivo de control a fin de demostrar su viabilidad en ausencia de la cepa o composición GL.

Se muestran los resultados en las Tablas 15, 16 y 17. Los cultivos viables de T9 y la mezcla 3 fueron los más eficaces, requiriendo menos de 100 colonias para causar un efecto de inhibición de la totalidad de las tres especies bacterianas causantes de mastitis. Se utilizóLactobacillusLz26, Lb23 y T9 para formular una tercera mezcla antimastitis. La totalidad de los tres patógenos creció bien en ausencia de cepas/composiciones GL.

Tabla 15.

Tabla 16.

Tabla 17.

También se determinaron las zonas de inhibición del crecimiento (mm) de los aislados bacterianos 24 horas después de la adición de cepas GL (tal como se ha indicado en los ejemplos anteriores). Se muestran los resultados en las Tablas 18, 19 y 20.

Tabla 18.

1 18,Lactobacillus parafarraginisLp18; 23,Lactobacillus buchneriLb23; 24,Lactobacillus rapiLr24; 26,Lactobacillus zeaeLz26; 31,Candida ethanolicaCe31; N3,Lactobacillus diolivorans(V12/022847); N11,Lactobacillus parafarraginis(V12/022848); TB (V12/022850); TD,Lactobacillus brevis(V12/022851); T9 (V12/022849).

Tabla 19.

(continuación)

18,Lactobacillus parafarraginisLp18; 23,Lactobacillus buchneriLb23; 24,Lactobacillus rapiLr24; 26,Lactobacillus zeaeLz26; 31,Candida ethanolicaCe31; N3,Lactobacillus diolivorans(V12/022847); N11,Lactobacillus parafarraginis(V12/022848); TB (V12/022850); TD,Lactobacillus brevis(V12/022851); T9 (V12/022849).

Tabla 20.

1 18,Lactobacillus parafarraginisLp18; 23,Lactobacillus buchneriLb23; 24,Lactobacillus rapiLr24; 26,Lactobacillus zeaeLz26; 31,Candida ethanolicaCe31; N3,Lactobacillus diolivorans(V12/022847); N11,Lactobacillus parafarraginis(V12/022848); TB (V12/022850); TD,Lactobacillus brevis(V12/022851); T9 (V12/022849).

Ejemplo 8. Actividad contra Pseudomonas savastanoi.

Los inventores investigaron, además, la capacidad de las cepas GL indicadas en el Ejemplo 1 de inhibir el crecimiento dePseudomonas savastanoi(agente causante de, entre otros, la agalla del olivo) utilizando el método de cribado en placa doble tal como se ha descrito en el Ejemplo 2. Se muestran los resultados en la Tabla 21.

Tabla 21. Inhibición del crecimiento dePseudomonas savastanoi.

(continuación)

15,Acetobacter fabarumAf15; 18,Lactobacillus parafarraginisLp18; 23,Lactobacillus buchneriLb23; 24,Lactobacillus rapiLr24; 26,Lactobacillus zeaeLz26; 31,Candida ethanolicaCe31; N3,Lactobacillus diolivorans(V12/022847); N11,Lactobacillus parafarraginis(V12/022848); TB (V12/022850); TD,Lactobacillus brevis(V12/022851); T9 (V12/022849).

Claims (3)

REIVINDICACIONES

1. Método de tratamiento o prevención de la infección de una planta por un patógeno fúngico o bacteriano, en el que el método comprende la administración, o alternativamente la exposición, en la planta de una cantidad eficaz de una composición que comprende la cepaLactobacillus parafarraginisLp18, depositada en el National Measurement Institute, Australia, el 27 de octubre de 2011 bajo el número de acceso V1 1/022945, o un sobrenadante de cultivo o filtrado libre de células derivado de medio de cultivo en el que se ha cultivado dicha cepa deLactobacillus parafarraginis,en el que el patógeno fúngico o bacteriano se selecciona de entrePseudocercospora macadamiae, Botrytis cinerea, Streptomyces scabiesyPseudomonas savastanoi.

2. Método según la reivindicación 1 en el que se encapsulaLactobacillus parafarraginis.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, en el que la planta es una especie de cultivo.