JP2016512047A - アセチル補酵素a由来化合物を生産するためのホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの使用 - Google Patents
アセチル補酵素a由来化合物を生産するためのホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2016512047A JP2016512047A JP2016502782A JP2016502782A JP2016512047A JP 2016512047 A JP2016512047 A JP 2016512047A JP 2016502782 A JP2016502782 A JP 2016502782A JP 2016502782 A JP2016502782 A JP 2016502782A JP 2016512047 A JP2016512047 A JP 2016512047A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- host cell
- genetically modified
- coa
- modified host
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/02—Aldehyde-lyases (4.1.2)
- C12Y401/02009—Phosphoketolase (4.1.2.9)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
- C12P5/007—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons containing one or more isoprene units, i.e. terpenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/54—Acetic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/01008—Phosphate acetyltransferase (2.3.1.8)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
- C12Y301/03021—Glycerol-1-phosphatase (3.1.3.21)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
Abstract
Description
本開示は、工学的に操作された宿主細胞においてアセチルCoA由来化合物を産生するための組成物および方法に関する。
アセチル補酵素A(アセチルCoA)は、ポリケチド、脂肪酸、イソプレノイド、フェノール類、アルカロイド、ビタミン、およびアミノ酸を含めた必須の生物学的化合物の合成における重要な中間体である。アセチルCoAに由来する代謝産物の中には、工業的に有用な化合物を含めた一次代謝産物および二次代謝産物がある。酵母では、アセチルCoAはピルビン酸代謝で生合成される(図1)。しかし、この生合成経路では、ピルビン酸カルボキシラーゼおよび/またはピルビン酸デヒドロゲナーゼにより触媒される反応によってCO2が失われる。工業的な発酵環境において、ピルビン酸代謝に対する代替物をもたらし、解糖を減少させることの1つの利益は、ピルビン酸の脱カルボキシル化において産生されるCO2が減少し、したがって、最終産物においてより多くの炭素を捕捉し、それにより、最大理論収量を上昇させることができることである。第2の利益は、産生されるNADHが減少し、したがって、それを再酸化するために必要な酸素が著しく減少することである。これは、ホスホケトラーゼ(PK;EC4.1.2.9)とホスホアセチルトランスフェラーゼ(PTA;EC2.3.1.8)を併せて発現させることによって実現することができる。
本明細書では、工業的に有用な化合物を産生するためのホスホケトラーゼ(PK)およびホスホトランスアセチラーゼ(PTA)の利用を改善するための組成物および方法が提供される。これらの組成物および方法は、ホスホケトラーゼ経路に基づくアセテート蓄積が、PK触媒作用の産物であるアセチルホスフェートの酵素により触媒される加水分解に起因するという驚くべき発見に基づく。アセチルホスフェートの加水分解は、イソプレノイド、ポリケチド、および脂肪酸を含めたアセチルCoA由来の任意の種類の産物の産生に、炭素の枯渇によって負の影響を及ぼし得る望ましくない副反応である。アセチルホスフェート加水分解を触媒する宿主細胞内のネイティブな酵素を機能的に破壊することにより、アセテート蓄積が減少し、PK/PTA経路を通じたアセチルCoA産生への炭素フラックスが増大する。
5.1 用語
本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、通常は天然に見いだされないものを指す。「異種ヌクレオチド配列」という用語は、天然では所与の細胞において通常は見いだされないヌクレオチド配列を指す。このように、異種ヌクレオチド配列は、(a)その宿主細胞に対して外来(すなわち、その細胞に対して「外因性」)であるもの;(b)宿主細胞において天然に見いだされる(すなわち、「内因性」である)が、細胞内に天然ではない数量(すなわち、宿主細胞において天然に見いだされるよりも多いもしくは少ない数量)で存在するもの;または、(c)宿主細胞において天然に見いだされるが、その天然の遺伝子座以外に位置するものであり得る。「異種酵素」という用語は、天然では所与の細胞において通常は見いだされない酵素を指す。この用語は、(a)所与の細胞に対して外因性である(すなわち、宿主細胞に天然では存在しないまたは宿主細胞の所与の状況では天然には存在しないヌクレオチド配列によりコードされる)酵素;および(b)宿主細胞において天然に見いだされる(例えば、細胞に対して内因性のヌクレオチド配列によりコードされる酵素である)が、宿主細胞において天然ではない量(例えば、天然に見いだされるよりも多いまたは少ない量)で産生される酵素を包含する。
本明細書で提供される組成物および方法に有用な宿主細胞としては、古細菌細胞、原核生物細胞、または真核細胞が挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞におけるホスホケトラーゼ経路は、細胞を、ホスホケトラーゼ、および任意選択でホスホトランスアセチラーゼをコードするポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドを発現するように工学的に操作することよって活性化される。したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。他の実施形態、特に、ホスホケトラーゼ活性とは関係なく、アセチルホスフェートを代謝中間体として供給することができる実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、ホスホトランスアセチラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドと、ホスホトランスアセチラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドの両方を含む。
ホスホケトラーゼ(EC4.1.2.9)により、キシルロース5−ホスフェートからグリセルアルデヒド3−ホスフェートおよびアセチルホスフェートへの変換;ならびに/またはフルクトース−6−ホスフェートからエリトロース−4−ホスフェートおよびアセチルホスフェートへの変換が触媒される。ホスホケトラーゼ活性は、キシロースを唯一の炭素源として用いて成長するいくつかの酵母株において同定されているが、グルコースを用いて成長する酵母株では同定されていない(EvansおよびRatledge、Arch. Microbiol. 139巻:48〜52頁;1984年)。ホスホケトラーゼの阻害剤としては、これだけに限定されないが、エリトロース4−ホスフェートおよびグリセルアルデヒド3−ホスフェートが挙げられる。
0.1;Aspergillus oryzae RIB40)、(XP_001396306.1;Aspergillus niger)、(XP_001216075.1;Aspergillus terreus NIH2624)、(XP_002567130.1;Penicillium chrysogenum Wisconsin 54−1255)、(XP_002143851.1;Penicillium marneffei ATCC 18224)、(XP_002480216.1;Talaromyces stipitatus ATCC 10500)、(XP_001559949.1;Botryotinia fuckeliana B05.10)、(XP_001593100.1;Sclerotinia sclerotiorum 1980)、(XP_001932192.1;Pyrenophora triticirepentis Pt−lC−BFP)、(XP_001793729.1;Phaeosphaeria nodorum SN 15)、(XP_567776.1;Cryptococcus neoforrnans var. neoforrnans JEC21)、(XP_386504.1;Oibberella zeae PH−1)、(EEU46265.1;Nectria haematococca mp VI 77−13−4)、(AC024516.1;Metarhizium anisop1iae)、(XP_959985.1;Neurospora crassa OR74A)、(XP_001904686.1;Podospora anserine)、(YP_002220141.1;Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 53993)、(YP_001220128.1;Acidiphilium cryptum JF −5)、(YP_001471202.1;Thermotoga lettingae TMO)、(YP_002352287.1;Dictyoglomus turgidum DSM 6724)、(YP_571790.1;Nitrobacter hamburgensis X14)、(ZP_01092401.1;Blastopirellula marina DSM 3645)、(YP_001340809.1;Marinomonas sp. MWYLI)、(NP_866384.1;Rhodopirellula baltica SH 1)、(ZP_05108502.1;Legionella drancourtii LLAP 12)、(ZP_04995817.1;Streptomyces sp. Mg1)、(ZP_04023055.1;Lactobacillus reuteri SD2112)、(ZP_03960060.1;Lactobacillus vaginalis ATCC 49540)、(ZP_03073172.1;Lactobacillus reuteri 100−23)、(ZP_05553031.1;Lactobacillus coleohominis 101−4−CHN)、(ZP_05863347.1;Lactobacillus fermentum 28−3−CHN)、(ZP_04021289.1;Lactobacillus acidophilus ATCC 4796)、(ZP_03995194.1;Lactobacillus crispatus lV−VOl)、(ZP_04010922.1;Lactobacillus ultunensis DSM 16047)、(ZP_05549961.1;Lactobacillus crispatus 125−2−CRN)、(ZP_03951361.1;Lactobacillus gasseri lV−V03)、(ZP_05744515.1;Lactobacillus iners DSM 13335)、(YP_618635.1;Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC 11842)、(ZP_03955917.1;Lactobacillus jensenii lV−VI6)、(ZP_03942415.1;Lactobacillus buchneri ATCC 11577)、(ZP_01544800.1;Oenococcus oeni ATCC BAA−1163)、(NP_786060.1;Lactobacillus plantarum WCFSI)、(Q937F6;XPKA_LACPE)、(YP_394903.1;Lactobacillus sakei subsp. sakei 23K)、(YP_803891.1;Pediococcus pentosaceus ATCC 25745)、(BAI40727.1;Lactobacillus rhamnosus GG)、(ZP_03940142.1;Lactobacillus brevis subsp. Gravesensis ATCC 27305)、(ZP_04009273.1;Lactobacillus salivarius ATCC 11741)、(ZP_03958643.1;Lactobacillus ruminis ATCC 25644)、(ZP_04431433.1;Bacillus coagulans 36D1)、(ZP_04601906.1;Kingella oralis ATCC 51147)、(ZP_05736927.1;Granulicatella adiacens ATCC 49175)、(YP_001449631.1;Streptococcus gordonii str. Challis substr. CHI)、(NP_736274.1;Streptococcus agalactiae NEM316)、(ZP_04442854.1;Listeria grayi DSM 20601)、(ZP_05646360.1;Enterococcus casseliflavus EC30)、(ZP_05650322.1;Enterococcus gallinarum EG2)、(ZP_05675307.1;Enterococcus faecium Com12)、(BAH69929.1;Mycoplasma fermentans PG 18)、(YP_002000006.1;Mycoplasma arthritidis 15 8L3−1)、(YP_001256266.1;Mycoplasma agalactiae PG2)、(YP_001988835.1;Lactobacillus casei BL23)、(NP_786753.1;Lactobacillus plantarum WCFS 1)、(ZP_04009976.1;Lactobacillus salivarius ATCC 11741)、(YP_818922.1;Leuconostoc mesenteroides subsp. Mesenteroides ATCC 8293)、(YP_794669.1;Lactobacillus brevis ATCC 367)、(ZP_04782553.l;Weissella paramesenteroides ATCC 33313)、(YP_001727454.1;Leuconostoc citreum KM20)、(YP_819405.1;Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293)、(ABX75772.l;Lactococcus 1actis subsp. Lactis)、(YP_811314.1;Oenococcus oeni PSU−1)、(ZP_02951191.1;Clostridium butyricum 5521)、(ZP_05390294.1;Clostridium carboxidivorans P7)、(NP_347971.1;Clostridium acetobutylicum ATCC 824)、(ZP_03800296.1;Coprococcus comes ATCC 27758)、(ZP_04857624.1;Ruminococcus sp. 5_1_39B FAA)、(ZP_04743029.2;Roseburia intestinalis L 1−82)、(ZP_02038271.1;Bacteroides capillosus ATCC 29799)、(XP_002180542.1;Phaeodactylum tricomutum CCAP 1055/1)、(YP_568630.1;Rhodopseudomonas pa1ustris BisB5)、(YP_487462.1;Rhodopseudomonas palustris HaA2)、(NP_947019.1;Rhodopseudomonas palustris CGA009)、(YP_533660.1;Rhodopseudomonas palustris BisB18)、(YP_973512.1;Polaromonas naphthalenivorans CJ2)、(ZP_01464191.1;Stigmatella aurantiaca DW4/3−1)、(YP_001267778.1;Pseudomonas putida Fl)、(YP_829644.1;Arthrobacter sp. FB24)、(YP_002486392.1;Arthrobacter chlorophenolicus A6)、(ZP_05816651.1;Sanguibacter keddieii DSM 10542)、(YP_002883053.1;Beutenbergia cavemae DSM 12333)、(YP_003161540.1;Jonesia denitrificans DSM 20603)、(ZP_03911482.1;Xylanimonas cellulosilytica DSM 15894)、(CAJ57850.1;Cellulomonas flavigena)、(YP_001134605.1;Mycobacterium gilvum PYR−GCK)、(YP 953877.1;Mycobacterium vanbaalenii PYR−l)、(YP_003155611.1;Brachybacterium faecium DSM 4810)、(YP_003148127.1;Kytococcus sedentarius DSM 20547)、(YP_001221168.1;Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis NCPPB 382)、(YP_001158426.1;Sa1inispora tropica CNB−440)、(YP_001536420.1;Sa1inispora arenico1a CNS−205)、(ZP_04608302.1;Micromonospora sp. ATCC 39149)、(YP_887914.1;Mycobacterium smegmatis str. MC2 155)、(YP_639956.1;Mycobacterium sp. MCS)、(ZP_04749157.1;Mycobacterium kansasii ATCC 12478)、(YP_001851039.1;Mycobacterium marinumM)、(NP_960507.1;Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K−10)、(ZP_05224330.1;Mycobacterium intracellu1are ATCC 13950)、(YP_001703240.1;Mycobacterium abscessus)、(ZP_00995133.
1;Janibacter sp. HTCC2649)、(YP_291026.1;Thermobifida fusca YX)、(ZP_04031845.1;Thermomonospora curvata DSM 43183)、(ZP_04475514.1;Streptosporangium roseum DSM 43021)、(ZP_04335641.1;Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43111)、(ZP_04482201.1;Stackebrandtia nassauensis DSM 44728)、(YP_003099712.1;Actinosynnema mirum DSM 43827)、(NP_733508.1;Streptomyces coelicolor A3(2))、(CAJ88379.1;Streptomyces ambofaciens ATCC 23877)、(ZP_05536883.1;Streptomyces griseoflavus Tu4000)、(ZP_05020421.1;Streptomyces sviceus ATCC 29083)、(CBG67625.1;Streptomyces scabiei 87.22)、(NP_822448.1;Streptomyces avermitilis MA−4680)、(ZP_04689547.1;Streptomyces ghanaensis ATCC 14672)、(ZP_05530021.1;Streptomyces viridochromogenes DSM 40736)、(ZP_05512501.1;Streptomyces hygroscopicus ATCC 53653)、(ZP_05800927.1;Streptomyces flayogriseus ATCC 33331)、(YP_001828275.1;Streptomyces griseus subsp. griseus NBRC 13350)、(ZP_04705493.1;Streptomyces albus JI074)、(ZP_04996963.1;Streptomyces sp. Mgl)、(ZP_05485309.1;Streptomyces sp. SPB78)、(ZP_03860882.1;Kribbella flayida DSM 17836)、(YP_117539.1;Nocardia farcinica IFM 10152)、(YP_001505556.1;Frankia sp. EANlpec)、(YP_482627.1;Frankia sp. CcI3)、(YP_003116893.1;Catenulispora acidiphila DSM 44928)、(YP_872280.1;Acidothermus lolyticus lIB)、(YP_924807.1;Nocardioides sp. JS614)、(YP_001104157.1;Saccharopolyspora erythraea NRRL 2338)、(YP_002282673.1;Rhizobium leguminosarum by. trifolii WSM2304)、(YP_002977256.1;Rhizobium leguminosarum by. trifolii WSM1325)、(YP_001979796.1;Rhizobium etli CIAT 652)、(YP_470926.1;Rhizobium etli CFN 42)、(YP_002540633.1;Agrobacterium radiobacter K84)、(ZP_05182366.1;Brucella sp. 83/13)、(ZP_04683384.1;Ochrobactrum intermedium LMG 3301)、(YP_001373254.1;Ochrobactrum anthropi ATCC 49188)、(YP_001204109.1;Bradyrhizobium sp. ORS278)、(YP_001238418.l;Bradyrhizobium sp. BTAil)、(NP_769158.1;Bradyrhizobium japonicum USDA 110)、(YP_577164.1;Nitrobacter hamburgensis X14)、(YP_002961612.1;Methylobacterium extorquens AM 1)、(YP_674792.1;Mesorhizobium sp. BNCI)、(ZP_05813617.1;Mesorhizobium opportunistum WSM2075)、(YP_318559.1;Nitrobacter winogradskyi Nb−255)、(YP_001755280.1;Methylobacterium radiotolerans JCM 2831)、(YP_001753119.l;Methylobacterium radiotolerans JCM 2831)、(YP_003066011.1;Methylobacterium extorquens DM4)、(YP_002964777.1;Methylobacterium extorquens AM 1)、(YP_002501292.1;Methy1obacterium nodu1ans ORS 2060)、(YP_002495265.1;Methy1obacterium nodu1ans ORS 2060)、(YP_001770387.1;Methylobacterium sp.4−46)、(YP_002944712.1;Variovorax paradoxus S110)、(ZP_01156757.1;Oceanicola granulosus HTCC2516)、(ZP_01628787.1;Nodu1aria spumlgena CCY9414)、(YP_001865546.1;Nostoc punctiforme PCC 73102)、(YP_321015.1;Anabaena variabi1is ATCC 29413)、(ZP_03769140.1;Nostoc azollae’ 0708)、(NP_923943.1;Gloeobacter vio1aceus PCC 7421)、(YP_477385.1;Synechococcussp. JA−2−3B’a(2−13))、(YP_001328659.1;Sinorhizobium medicae WSM419)、(YP_765670.1;Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841)、(NP_384212.2;Sinorhizobium meliloti 1021)、(ZP_02928455.1;Verrucomicrobium spinosum DSM 4136)、(YP_001637539.1;Methylobacterium extorquens Pal)、(ZP_01045825.1;Nitrobacter sp. Nb−311A)、(ZP_02736602.1;Gemmata obscuriglobus UQM 2246)、(YP_003157871.1;Desulfomicrobium baculatum DSM 4028)、(ZP_03631304.1;bacterium Ellin514)、(ZP_04577558.1;Oxalobacter formigenes HOxBLS)、(ZP_04579712.1;Oxalobacter formigenes OXCC13)、(YP_826169.1;Solibacter usitatus Ellin6076)、(YP_002018753.1;Pelodictyon phaeoclathratiforme BU−1)、(YP_002016285.1;Prosthecochloris aestuarii DSM 271)、(YP_001943369.1;Chlorobium limicola DSM 245)、(NP_662409.1;Chlorobium tepidum TLS)、(ZP_01386179.1;Chlorobium ferrooxidans DSM 13031)、(YP_375422.1;Chlorobium luteolum DSM 273)、(YP_285277.1;Dechloromonas aromatica RCB)、(YP_314589.1;Thiobacillus denitrificans ATCC 25259)、(YP_545002.1;Methy1obacillus flagellatus KT)、(NP_842139.1;Nitrosomonas europaea ATCC 19718)、(YP_748274.1;Nitrosomonas eutropha C91)、(YP_411688.1;Nitrosospira multiformis ATCC 25196)、(YP_344700.1;Nitrosococcus oceani ATCC 19707)、(YP_007004.1;Candidatus Protochlamydia amoebophi1a UWE25)、(NP_435833.1;Sinorhizobium meliloti 1021)、(ZP_04421874.1;Sulfurospirillum de1eyianum DSM 6946)、(NP_107054.1;Mesorhizobium loti MAFF303099)、(YP_002289797.1;Oligotropha carboxidovorans OM5)、(YP_001833312.l;Beijerinckia indica subsp. indica ATCC 9039)が挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、ホスホトランスアセチラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。ホスホトランスアセチラーゼ(EC2.3.1.8)により、アセチルホスフェートがアセチルCoAに変換される。
evotella veroralis F0319)、(ZP_05916997.1;Prevotella sp. oral taxon 472 str. F0295)、(YP_002308782.1;Candidatus Azo bacteroides pseudotrichon ymphae genomovar. CFP2)、(YP_753459.1;Syntrophomonas wolfei subsp. wolfei str. Goettingen)、(ZP_01771389.1;Collinsella aerofaciens ATCC 25986)、(ZP_03296849.1;Collinsella stercoris DSM 13279)、(ZP_04445308.1;Collinsella ntestinalis DSM 13280)、(ZP_03567515.1;Atopobium rimaeATCC 49626)、(YP_003179667.1;Atopobium parvulum DSM 20469)、(ZP_03946133.1;Atopobium vaginae DSM 15829)、(ZP_03990654.1;Oribacterium sinus F0268)、(ZP_04450849.1;Abiotrophia defective ATCC 49176)、(ZP_05797601.1;Oribacterium sp. oral taxon 078 str. F0262)、(ZP_03730247.1;Clostridium sp. M62/1)、(ZP_04856252.1;Ruminococcus sp. 5_1_39BFAA)、(ZP_01966332.1;Ruminococcus obeum ATCC 29174)、(ZP_05345616.1;Bryantella formatexigens DSM 14469)、(ZP_03780829.1;Blautia hydrogenotro phica DSM 10507)、(ZP_03289360.1;Clostridium nexile DSM 1787)、(ZP_02042092.1;Ruminococcus gnavus ATCC 29149)、(ZP_03168112.1;Ruminococcus lactaris ATCC 29176)、(ZP_01968837.1;Ruminococcus torques ATCC 27756)、(ZP_02430426.1;Clostridium scindens ATCC 35704)、(ZP_03779744.1;Clostridium hylemonae DSM 15053)、(ZP_02234595.1;Dorea formicigenerans ATCC 27755)、(ZP_01994673.1;Dorea longicatena DSM 13814)、(YP_001558442.1;Clostridium phytofermentans ISDg)、(ZP_04667085.1;Clostridiales bacterium 1_7_47FAA)、(ZP_02085391.1;Clostridium bolteae ATCC BAA−613)、(ZP_05790853.1;Butyrivibrio crossotus DSM 2876)、(ZP_02026034.1;Eubacterium ventriosum ATCC 27560)、(YP_002930513.1;Eubacterium eligens ATCC 27750)、(ZP_04808213.1;Helicobacter pullorum MIT 98−5489)、(ZP_03656120.1;Helicobacter Canadensis MIT 98−5491)、(ZP_04583217.1;Helicobacter winghamensis ATCCBAA−430)、(NP_860840.1;Helicobacter hepaticus ATCC 51449)、(ZP_03657896.1;Helicobacter cinaedi CCUG 18818)、(ZP_02417779.1;Anaerostipes caccae DSM 14662)、(ZP_02437622.1;Clostridium sp. SS211)、(ZP_02205430.1;Coprococcus eutactus ATCC 27759)、(ZP_02692616.1;Epulopiscium sp. ‘N.t. morphotype B’)、(YP_003182082.1;Eggerthella lenta DSM 2243)、(YP_003151027.1;Cryptobacterium curtum DSM 15641)、(YP_003143601.1;Slackia heliotrinireducens DSM 20476)、(ZP_05498135.1;Clostridium papyrosolvens DSM 2782)、(ZP_03152606.1;Clostridium thermocellum JW20)、(YP_001180817.1;Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903)、(AAA72041.1;Methanosarcina thermophile)、(NP_618482.1;Methanosarcina acetivorans C2A)、(YP_305342.1;Methanosarcina barkeri str. Fusaro)、(ZP_02142278.1;Roseobacter litoralis Och 149)、(YP_681184.1;Roseobacter denitrificans OCh 114)、(YP_001533168.1;Dinoroseo bacter shibae DFL 12)、(ZP_05124935.1;Rhodobacteraceae bacterium KLH11)、(ZP_05786337.1;Silicibacter lacuscaerulensis ITI−1157)、(YP_001313586.1;Sinorhizobium medicae WSM419)、(NP_437512.1;Sinorhizobium meliloti 1021)、(ZP_04682129.1;Ochrobactrum intermedium LMG 3301)、(YP_001372036.1;Ochrobactrum anthropic ATCC 49188)、(YP_001888115.1;Burkholderia phytofirmans PsJN)、(YP_554613.1;Burkholderia xenovorans LB400)、(YP_001862297.1;Burkholderia phymatum STM815)、(YP_297974.1;Ralstonia eutropha JMP134)、(YP_002008219.1;Cupriavidus taiwanensis)、(YP_001584488.1;Burkholderia multivorans multivorans)、(YP_002233797.1;Burkholderia cenocepacia J2315)、(ZP_01220235.1;Photobacterium profundum 3TCK)、(ZP_03698361.1;Lutiella nitroferrum 2002)、(ZP_01811515.1;Vibrionales bacterium SWAT−3)、(ZP_00988349.1;Vibrio splendidus 12B01)、(ZP_01866234.1;Vibrio shilonii AK1)、(ZP_05885163.1;Vibrio coralliilyticus ATCCBAA−450)、(AAS78789.1;Paracoccus denitrificans)、(YP_345196.1;Rhodobacter sphaeroides 2.4.1)、(AAN08490.1;Castellaniella defragrans)、(ZP_00961345.1;Roseovarius nubinhibens ISM)、(YP_168755.1;Ruegeria pomeroyi DSS−3)、(ZP_01901193.1;Roseobacter sp. AzwK−3b)、(ZP_01752570.1;Roseobacter sp. SK209−2−6)、(ZP_02140073.1;Roseobacter litoralis Och 149)、(YP_510789.1;Jannaschia sp. CCS1)、(ZP_05073153.1;Rhodobacteral es bacterium HTCC2083)、(YP_822367.1;Candidatus Solibacter usitatus Ellin6076)、(ZP_01313101.1;Desulfuromon as acetoxidans DSM 684)、(YP_357950.1;Pelobacter carbinolicus DSM 2380)、(YP_002537084.1;Geobacter sp. FRC−32)、(YP_001232124.1;Geobacter uraniireducens Rf4)、(NP_953751.1;Geobacter sulfurreducens PCA)、(YP_384000.1;Geobacter metallireducens GS−15)、(YP_900968.1;Pelobacter propionicus DSM 2379)、(YP_001951452.1;Geobacter lovleyi SZ)、(ZP_05311922.1;Geobacter sp. M18)、(YP_003021758.1;Geobacter sp. M21)、(YP_358255.1;Pelobacter carbinolicus DSM 2380)、(ZP_03906856.1;Denitrovibrio acetiphilus DSM 12809)、(YP_001997093.1;Chloroherpeton thalassium ATCC 35110)、(ZP_01924858.1;Victivallis vadensis ATCCBAA−548)、(ZP_03439825.1;Helicobacter pylori 98−10)、(YP_003057614.1;Helicobacter pylori B38)、(YP_001910417.1;Helicobacter pylori Shi470)、(NP_223559.1;Helicobacter pylori J99)、(YP_665033.1;Helicobacter acinonychis str. Sheeba)、(ZP_01810337.1;Campylobacter jejuni subsp. jejuni CG8486)、(ZP_00366840.1;Campylobacter coli RM2228)、(ZP_00370527.1;Campylobacter upsaliensis RM3195)、(YP_002575219.1;Campylobacter lari RM2100)、(YP_001406718.1;Campylobacter hominis ATCCBAA− 381)、(ZP_05624820.1;Campylobacter gracilis RM3268)、(YP_891988.1;Campylobacter fetus subsp. fetus 82−40)、(YP_
001466901.1;Campylobacter concisus 13826)、(YP_001408221.1;Campylobacter curvus 525.92)、(ZP_05363348.1;Campylobacter showae RM3277)、(ZP_03742933.1;Bifidobacterium pseudocatenulatum DSM 20438)、(ZP_02918887.1;Bifidobacterium dentium ATCC 27678)、(ZP_02028883.1;Bifidobacterium adolescentis L2−32)、(ZP_04448100.1;Bifidobacterium angulatum DSM 20098)、(ZP_03618886.1;Bifidobacterium breve DSM 20213)、(ZP_03976084.1;Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 55813)、(YP_002323183.1;Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697)、(ZP_03646187.1;Bifidobacterium bifidum NClMB 41171)、(ZP_03937611.1;Gardnerella vaginalis ATCC 14019)、(ZP_02962869.1;Bifidobacterium animalis subsp. lactis HN019)、(ZP_05965185.1;Bifidobacterium gallicum DSM 20093)、(ZP_02043408.1;Actinomyces odontolyticus ATCC 17982)、(ZP_03925176.1;Actinomyces coleocanis DSM 15436)、(NP_601948.1;Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)、(NP_739201.1;Corynebacteriurn efficiens YS−314)、(NP_940379.1;Corynebacterium diphtheria NCTC 13129)、(ZP_04835255.1;Corynebacteriurn glucuronolyticum ATCC 51867)、(ZP_05708623.1;Corynebacteriurn genitalium ATCC 33030)、(ZP_03977910.1;Corynebacterium lipophiloflavum DSM 44291)、(ZP_03932064.1;Corynebacterium accolens ATCC 49725)、(ZP_05366890.1;Corynebacterium tuberculostearicum SK141)、(YP_002835817.1;Corynebacterium aunmucosum ATCC 700975)、(YP_250020.1;Corynebacterium jeikeium K411)、(YP_001801132.1;Corynebacterium urealyticum DSM 7109)、(YP_002906954.1;Corynebacterium kroppenstedtii DSM 44385)、(ZP_03393297.1;Corynebacterium amycolatum SK46)、(ZP_03718987.1;Neisseria flavescens NRL30031/H 210)、(ZP_05318956.1;Neisseria sicca ATCC 29256)、(YP_001598731.1;Neisseria meningitides 053442)、(ZP_04602977.1;Kingella oralis ATCC 51147)、(YP_426466.1;Rhodospirillum rubrum ATCC 11170)、(NP_871183.1;Wigglesworthia glossinidia endosymbiont of Glossina brevipalpis)、(NP_777793.1;Buchnera aphidicola str. Bp(Baizongia pistaciae))、(YP_003249406.1;Fibrobacter succmogenes subsp. succmogenes S85)、(ZP_03535302.1;Mycobacterium tuberculosis T17)、(ZP_04056438.1;Capnocytophaga gingivalis ATCC 33624)、(YP_003108500.1;Candidatus Sulcia muelleri SMDSEM)、(P77844;Corynebacterium glutamicum)、(ZP_03994160.1;Mobiluncus mulieris ATCC 35243)、(ZP_03922640.1;Mobiluncus curtisii ATCC 43063)、(ZP_03716209.1;Eubacterium hallii DSM 3353)、(ZP_03718143.1;Eubacterium hallii DSM 3353)、(ZP_05614434.1;Faecalibacteri um prausnitzii A2−165)、(ZP_02034852.1;Bacteroides capillosus ATCC 29799)、(ZP_03753543.1;Roseburia inulinivorans DSM 16841)、(ZP_04745275.2;Roseburia intestinalis Ll−82)、(YP_002937332.1;Eubacterium rectale ATCC 33656)、(ZP_02074244.1;Clostridium sp. L2−50)、(ZP_04455374.1;Shuttleworthia satelles DSM 14600)、(ZP_03488480.1;Eubacterium biforme DSM 3989)、(ZP_02078327.1;Eubacterium dolichum DSM 3991)、(ZP_02077559.1;Eubacterium dolichum DSM 3991)、(ZP_03305532.1;Anaerococcus hydrogenalis DSM 7454)、(ZP_05473291.1;Anaerococcus vaginalis ATCC 51170)、(ZP_03931050.1;Anaerococcus tetradius ATCC 35098)、(YP_003153463.1;Anaerococcus prevotii DSM 20548)、(ZP_03916048.1;Anaerococcus lactolyticus ATCC 51172)、(NP_607213.1;Streptococcus pyogenes MGAS8232)、(AAK34003.1;Streptococcus pyogenes M1GAS)、(YP_002562185.1;Streptococcus uberis 01401)、(YP_002744451.1;Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus)、(BAH88016.1;Streptococcus mutans NN2025)、(ZP_02920305.1;Streptococcus infantarius subsp. infantarius ATCCBAA−102)、(YP_329798.1;Streptococcus agalactiae A909)、(ZP_04061789.1;Streptococcus salivarius SK126)、(YP_139881.1;Streptococcus thermophiles LMG 18311)、(ZP_04525024.1;Streptococcus pneumomae CCRI 1974)、(ZP_06060573.1;Streptococcus sp. 2_1_36FAA)、(YP_001198423.1;Streptococcus suis 05ZYH33)、(NP_964739.1;Lactobacillus johnsonii NCC 533)、(YP_193610.1;Lactobacillus acidophilus NCFM)、(ZP_04011019.1;Lactobacillus ultunensis DSM 16047)、(ZP_03995297.1;Lactobacillus crispatus JV− VOl)、(ZP_05752753.1;Lactobacillus helveticus DSM 20075)、(ZP_03956024.1;Lactobacillus jensenii JV−V16)、(ZP_04645187.1;Lactobacillus jensenii 269−3)、(YP_618719.1;Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC 11842)、(ZP_05744366.1;Lactobacillus iners DSM 13335)、(NP_391646.1;Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168)、(YP_001423045.1;Bacillus amyloliquefaciens FZB42)、(YP_081073.1;Bacillus licheniformis ATCC 14580)、(ZP_03055101.1;Bacillus pumilus ATCC 7061)、(YP_002317098.1;Anoxybacillus flavithermus WKI)、(YP_002951270.1;Geobacillus sp. WCH70)、(YP_001127443.1;Geobacillus thermodenitrificans NG80−2)、(YP_149268.1;Geobacillus kaustophilus HTA426)、(ZP_01861251.1;Bacillus sp. SG−l)、(ZP_03228176.1;Bacillus coahuilensis m4−4)、(ZP_01173945.1;Bacillus sp. NRRLB−14911)、(NP_693944.1;Oceanobacillus iheyensis HTE831)、(ZP_04314753.1;Bacillus cereus BGSC 6E1)、(YP_014727.1;Listeria monocytogen es str. 4b F2365)、(ZP_04443757.1;Listeria grayi DSM 20601)、(NP_244690.1;Bacillus halodurans C−125)、(YP_177402.1;Bacillus clausii KSM−K16)、(YP_002885816.1;Exiguo bacteriumsp. AT1b)、(YP_001812721.1;Exiguo bacterium sibiricum 255−15)、(ZP_02169346.1;Bacillus selenitireducens MLS10)、(ZP_04818386.1;Staphylococcus epidermidis M23864:W1)、(ZP_03612973.1;Staphylococcus capitis SK14)、(ZP_04677798.1;Staphylo
coccus wameri L37603)、(NP_763914.1;Staphylococcus epidermidis ATCC 12228)、(ZP_05685678.1;Staphylococcus aureus A9635)、(YP_254319.1;Staphylococcus haemolyticus JCSC1435)、(ZP_04059818.1;Staphylococcus hominis SKl19)、(ABR57177.1;Staphylococcus xylosus)、(YP_302214.1;Staphylococcus saprophyticus subsp. saprophyticus ATCC 15305)、(YP_002633340.1;Staphylococcus camosus subsp. camosus TM300)、(YP_002561236.1;Macrococcus caseolyticus JCSC5402)、(ZP_03944466.1;Lactobacillus fermentum ATCC 14931)、(ZP_05553502.1;Lactobacillus coleohominis 101−4−CHN)、(ZP_03959629.1;Lactobacillus vaginalis ATCC 49540)、(YP_001271004.1;Lactobacillus reuteri DSM 20016)、(ZP_05745668.1;Lactobacillus antri DSM 16041)、(YP_818931.1;Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293)、(YP_001727831.1;Leuconostoc citreum KM20)、(ZP_04782044.1;Weissella paramesentero ides ATCC 33313)、(ZP_01544468.1;Oenococcus oeniATCC BAA−1163)、(ZP_05737294.1;Granulicatella adiacens ATCC 49175)、(ZP_05851915.1;Granulicatella elegans ATCC 700633)、(ZP_02183965.1;Camobacterium sp.AT7)、(ZP_05649755.1;Enterococcus gallinarum EG2)、(ZP_03947918.1;Enterococcus faecalis TX0104)、(ZP_03982224.1;Enterococcus faecium TX1330)、(YP_395954.1;Lactobacillus sakei subsp. sakei 23K)、(ZP_04449762.1;Catonella morbi ATCC 51271)、(YP_001032100.1;Lactococcus lactis subsp. cremons MG1363)、(YP_806234.1;Lactobacillus casei ATCC 334)、(NP_784550.1;Lactobacillus plantarum WCFS1)、(YP_794848.1;Lactobacillus brevis ATCC 367)、(ZP_03954831.1;Lactobacillus hilgardii ATCC 8290)、(BABI9267.1;Lactobacillus sanfranciscensis)、(ZP_03958288.1;Lactobacillus ruminis ATCC 25644)、(YP_536042.1;Lactobacillus salivarius UCC118)、(ZP_05747635.1;Erysipelothrix rhusiopathiae ATCC 19414)、(YP_803875.1;Pediococcus pentosaceus ATCC 25745)、(ZP_02093784.1;Parvimonas micraATCC 33270)、(YP_001692923.1;Finegoldia magnaATCC 29328)、(ZP_04431499.1;Bacillus coagulans 36Dl)、(ZP_04775813.1;Gemella haemolysans ATCC 10379)、(YP_001360609.1;Kineococcus radiotolerans SRS30216)、(ZP_01115869.1;Reinekea blandensis MED297)、(YP_003074238.1;Teredinibac turnterrae T7901)、(YP_958411.1;Marinobacter quaeolei VT8)、(YP_435580.1;Hahella chejuensis KCTC 2396)、(YP_001189125.1;Pseudomonas mendocina ymp)、(YP_792443.1;Pseudomonas aerugmosa UCBPP−PA14)、(NP_791001.1;Pseudomonas synngae pv. tomato str. DC3000)、(YP_258069.1;Pseudomonas fluorescens Pf−5)、(YP_606637.1;Pseudomonas entomophila L48)、(YP_002800579.1;Azotobacter vinelandii DJ)、(YP_001171663.1;Pseudomonas stutzeri A1501)、(NP_840385.1;Nitrosomonas europaea ATCC 19718)、(YP_002801221.1;Azotobacter vinelandii DJ)、(YP_002787111.1;Deinococcus deserti VCDl15)、(YP_603523.1;Deinococcus geothermalis DSM 11300)、(NP_293799.1;Deinococcus radiodurans R1)、(YP_521550.1;Rhodoferax ferrireducens T118)、(YP_530962.1;Rhodopseudo monas palustris BisB18)、(YP_531882.1;Rhodopseudo monas palustris BisA53)、(ZP_02367347.1;Burkholderia oklahomensis C6786)、(YP_428079.1;Rhodospirillum rubrum ATCC 11170)、(YP_530535.1;Rhodopseudo monas palustris BisB18)、(NP_901200.1;Chromobacterium violaceum ATCC 12472)、(ZP_03698345.1;Lutiella nitroferrum 2002)、(YP_001279250.1;Psychrobacter sp. PRwf−1)、(YP_579484.1;Psychrobacter cryohalolentis K5)、(ZP_05618978.1;Enhydrobacter aerosaccus SK60)、(ZP_05362319.1;Acinetobacter radioresistens SK82)、(YP_045288.1;Acinetobacter sp. ADP1)、(ZP_05823314.1;Acinetobacter sp. RUH2624)、(ZP_03824416.1;Acinetobacter sp. ATCC 27244)、(YP_001380280.1;Anaeromyxobacter sp. Fw109−5)、(YP_466103.1;Anaeromyxobacter dehalogenans 2CP−C)、(YP_088190.1;Mannheimia succiniciproducens MBEL55E)、(YP_001344949.1;Actinobacillus succmogenes 130Z)、(YP_003007411.1;Aggregatibacter aphrophilus NJ8700)、(ZP_01788798.1;Haemophilus influenzae 3655)、(YP_719012.1;Haemophilus somnus 129PT)、(NP_245642.1;Pasteurella multocida subsp. multocida str. Pm70)、(ZP_05920444.1;Pasteurella dagmatis ATCC 43325)、(ZP_00133992.2;Actinobacillus pleuropneumoniae serovar 1 str. 4074)、(ZP_04753547.1;Actinobacillus minor NM305)、(NP_873873.1;Haemophilus ducreyi 35000HP)、(ZP_04978908.1;Mannheimia haemolytica PHL213)、(YP_002475022.1;Haemophilus parasuis SH0165)、(ZP_05730581.1;Pantoea sp. At−9b)、(YP_001907133.1;Erwinia tasmaniensis Et1/99)、(YP_455287.1;Sodalis glossinidius str. ‘morsitans’)、(ZP_05723922.1;Dickeya dadantii Ech586)、(YP_003258889.1;Pectobacterium wasabiae WPP163)、(YP_002988159.1;Dickeya dadantii Ech703)、(NP_668938.1;Yersinia pestis KIM 10)、(YP_001479543.1;Serratia proteamaculans 568)、(YP_002934098.1;Edwardsiella ictaluri 93−146)、(YP_002151502.1;Proteus mirabilis HI4320)、(NP_930328.1;Photorhabdus luminescens subsp. laumondii TTO1)、(YP_002920553.1;Klebsiella pneumomae NTUH−K2044)、(YP_001177557.1;Enterobacter sp.638)、(YP_003211286.1;Cronobacter turicensis)、(BAA04663.1;Escherichia coli)、(YP_002924403.1;Candidatus Hamiltonella defensa 5AT(Acyrthosiphon pisum))、(ZP_03827735.1;Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis PBR1692)、(ZP_01159282.1;Photobacterium sp. SKA34)、(YP_130973.1;Photobacterium profundum SS9)、(ZP_06052481.1;Grimontia hollisae CIP 101886)、(ZP_05877035.1;Vibrio fumissii CIP 102972)、(ZP_05881960.1;Vibrio metschnikoyii CIP 69.14)、(ZP_05881960.1;Vibrio metschnikoyii CIP 69.1
4)、(ZP_02196748.1;Vibrio sp.および4)、(NP_934927.1;Vibrio vulnificus YJ016)、(ZP_01866446.1;Vibrio shilonii AKI)、(YP_002416612.1;Vibrio splendidus LGP32)、(YP_002263486.1;Aliiyibrio salmonicida LFI1238)、(ZP_04415114.1;Vibrio cholerae by. albensis VL426)、(YP_001143125.1;Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida A449)、(YP_002892091.1;Tolumonas auensis DSM 9187)、(ZP_01215350.1;Psychromonas sp. CNPT3)、(YP_944598.1;Psychromonas ingrahamii 37)、(YP_001473443.1;Shewanella sediminis HAW−EB3)、(YP_001761257.1;Shewanella woodyi ATCC 51908)、(YP_001094519.1;Shewanella loihica PV −4)、(YP_001674811.1;Shewanella halifaxensis HAW−EB4)、(YP_869191.1;Shewanella sp. ANA−3)、(YP_927371.1;Shewanella amazonensis SB2B)、(YP_751160.1;Shewanella frigidimarina NClMB 400)、(YP_563413.1;Shewanella denitrificans OS217 )、(YP_001475272.1;Shewanella sediminis HAW−EB3)、(YP_001674949.1;Shewanella halifaxensis HAW−EB4)、(ZP_04716660.1;Alteromonas macleodii ATCC 27126)、(YP_662160.1;Pseudoalteromonas atlantica T6c)、(ZP_01612225.1;Alteromonadales bacterium TW−7)、(ZP_01134640.1;Pseudoalteromonas tunicate D2)、(YP_269873.1;Colwellia psychrerythrae a 34H)、(YP_001341167.1;Marinomonas sp. MWYL1)、(ZP_01077352.1;Marinomonas sp. MEDl21)、(YP_001209362.1;Dichelobacter nodosus VCS1703A)、(ZP_05705193.1;Cardiobacterium hominis ATCC 15826)、(EEY62817.1;Phytophthora infestans T30−4)、(EEY62816.1;Phytophthora infestans T30−4)、(XP 001694504.1;Chlamydomonas reinhardtii)、(XP 001753120.1;Physcomitrella patens subsp. Patens)、(YP_001804510.1;Cyanothece sp. ATCC 51142)、(ZP_01729220.1;Cyanothece sp. CCY0110)、(YP_003138337.1;Cyanothece sp. PCC 8802)、(YP_002380034.1;Cyanothece sp. PCC 7424)、(YP_001661110.1;Microcystis aerugmosa NIES−843)、(YP_002485151.1;Cyanothece sp. PCC 7425)、(NP_441027.1;Synechocystis sp. PCC 6803)、(ZP_01061171.1;Leeuwenhoeki ella blandensis MED217)、(YP_001195862.1;Flavobacterium johnsoniae UW101)、(YP_003194927.1;Robiginitalea biformata HTCC2501)、(ZP_01107792.1;Flavobacteriales bacterium HTCC2170)、(ZP_01051731.1;Polaribacter sp. MED152)、(ZP_01119204.1;Polaribacter irgensii 23−P)、(ZP_03390929.1;Capnocytophaga sputigena ATCC 33612)、(YP_003141977.1;Capnocytophaga ochracea DSM 7271)、(YP_012240.1;Desulfovibrio vulgaris str. Hildenborough)、(YP_002436276.1;Desulfovibrio vulgaris str. ‘Miyazaki F’)、(YP_389730.1;Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans str. G20)、(YP_002992165.1;Desulfovibrio salexigens DSM 2638)、(YP_003197901.1;Desulfohalobium retbaense DSM 5692)、(YP_003157577.1;Desulfomicrobium baculatum DSM 4028)、(ZP_03737911.1;Desulfonatronospira thiodismutans AS03−1)、(YP_002990332.1;Desulfovibrio salexigens DSM 2638)、(ZP_03312237.1;Desulfovibrio piger ATCC 29098)、(YP_002478890.1;Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans str. ATCC 27774)、(YP_064294.1;Desulfotalea psychrophila LSv54)、(YP_594656.1;Lawsonia intracellularis PHE/MN1−00)、(ZP_01621820.1;Lyngbya sp. PCC 8106)、(ZP_03272899.1;Arthrospira maxima CS−328)、(YP_845596.1;Syntrophobacter fumaroxidans MPOB)、(ZP_04773932.1;Allochromatium vinosum DSM 180)、(NP_869002.1;Rhodopirellula baltica SH 1)、(YP_392571.1;Sulfurimonas denitrificans DSM 1251)、(ZP_05071717.1;Campylobacterales bacterium GD 1)、(ZP_04421899.1;Sulfurospirillum deleyianum DSM 6946)、(YP_001359295.1;Sulfurovum sp. NBC37−1)、(YP_951544.1;Mycobacterium vanbaalenii PYR−1)、(YP_001131488.1;Mycobacterium gilvum PYR−GCK)、(YP_637714.1;Mycobacterium sp. MCS)、(YP_885188.1;Mycobacterium smegmatis str. MC2 155)、(YP_001704953.1;Mycobacterium abscessus)、(ZP_04747529.1;Mycobacterium kansasii ATCC 12478)、(YP_001849024.1;Mycobacterium marinum M)、(NP_214922.1;Mycobacterium tuberculosis H37Rv)、(NP_962819.1;Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K−10)、(ZP_05223872.1;Mycobacterium intracellulare ATCC 13950)、(YP_002764919.1;Rhodococcus erythropolis PR4)、(YP_702162.1;Rhodococcus jostii RHAI)、(YP_121562.1;Nocardia farcinica IFM 10152)、(ZP_04025361.1;Tsukamurella paurometabola DSM 20162)、(YP_003275431.1;Gordonia bronchialis DSM 43247)、(YP_003160610.1;Jonesia denitrificans DSM 20603)、(ZP_05816650.1;Sanguibacter keddieii DSM 10542)、(ZP_04368027.1;Cellulomonas flavigena DSM 20109)、(YP_002883054.1;Beutenbergia cavemae DSM 12333)、(ZP_03911481.1;Xylanimonas cellulosilytica DSM 15894)、(YP_924143.1;Nocardioides sp.1S614)、(ZP_03864789.1;Kribbella flavida DSM 17836)、(ZP_01131057.1;marine actinobacterium PHSC20C1)、(YP_001708941.1;Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus)、(YP_061462.1;Leifsonia xyli subsp. xyli str. CTCB07)、(YP_748183.1;Nitrosomonas eutropha C91)、(YP_003116892.1;Catenulispora acidiphila DSM 44928)、(YP_003199983.1;Nakamurella muitipartita DSM 44233)、(YP_003154321.1;Brachybacterium faecium DSM 4810)、(ZP_03927492.1;Actinomyces urogenitalis DSM 15434)、(YP_003148931.1;Kytococcus sedentarius DSM 20547)、(ZP_05803950.1;Streptomyces flavogriseus ATCC 33331)、(YP_001823623.1;Streptomyces griseus subsp. griseus NBRC 13350)、(ZP_05002693.1;Streptomyces clavuligerus ATCC 27064)、(ZP_05015493.1;Streptomyces sviceus ATCC 29083)、(ZP_05538660.1;Streptomyces griseoflavus Tu4000)、(ZP_04685789.1;Streptomyces ghanaensis ATCC 14672)、(ZP_05534308.1;Streptomyces viridochromogenes DSM 40736)、(ZP_05523554.1;
Streptomyces lividans TK24)、(NP_823999.1;Streptomyces avermitilis MA−4680)、(CBG69921.1;Streptomyces scabiei 87.22)、(ZP_04704905.1;Streptomyces albus 11074)、(ZP_04997745.1;Streptomyces sp. Mgl)、(ZP_05509147.1;Streptomyces sp. C)、(ZP_05514718.1;Streptomyces hygroscopicus ATCC 53653)、(ZP_04994290.1;Streptomyces sp. SPB74)、(ZP_04474082.1;Streptosporangium roseum DSM 43021)、(YP_001160501.1;Salinispora tropica CNB−440)、(YP_001538853.1;Salinispora arenicola CNS−205)、(ZP_04605575.1;Micromonospora sp. ATCC 39149)、(YP_832716.1;Arthrobacter sp. FB24)、(ABR13603.1;Arthrobacter oxydans)、(YP_002956296.1;Micrococcus luteus NCTC 2665)、(ZP_05367249.1;Rothia mucilaginosa ATCC 25296)、(YP_001854004.1;Kocuria rhizophila DC2201)、(ZP_04984463.1;Francisella tularensis subsp. holarctica FSC022)、(YP_001677422.1;Francisella philomiragia subsp. philomiragia ATCC 25017)、(YP_588827.1;Baumannia cicadellinicola str. Hc(Homalodisca oagulata))、(NP_240007.1;Buchnera aphidicola str. APS(Acyrthosiphonpisum))、(ZP_05057494.1;Verrucomicrobiae bacterium DG1235)、(ZP_02930252.1;Verrucomicrobium spinosum DSM 4136)、(ZP_01452386.1;Mariprofundus ferrooxydans PV−l)、および(ZP_01307392.1;Bermanella marisrubri)が挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、アセチルホスフェートをアセテートに変換する酵素的機能の破壊を含む。一部の実施形態では、酵素は宿主細胞のネイティブなものである。
グリセロール−1−ホスフェート+H2O⇔グリセロール+ホスフェート
代表的なSaccharomyces cerevisiaeのGPP1/RHR2ヌクレオチド配列としては、受託番号NM_001179403.1、および本明細書で提供される配列番号5が挙げられる。代表的なSaccharomyces cerevisiaeのGpp1/Rhr2タンパク質配列としては、受託番号NP_012211、および本明細書で提供される配列番号6が挙げられる。
5.5.1 ADA
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ(あるいは「アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセチル化」、「アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アシル化」、またはADAと称される(EC1.2.1.10))をコードする1種または複数種の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
(1)アセチルCoAからアセトアルデヒドへの可逆的な変換、およびその後のアセトアルデヒドからエタノールへの可逆的な変換を触媒する二機能性タンパク質。この種類のタンパク質の例は、E.coliにおけるAdhEタンパク質(Gen Bank No:NP_415757)である。AdhEは、遺伝子融合の進化的な産物であると思われる。AdhEタンパク質のNH2末端領域はアルデヒド:NAD+オキシドレダクターゼと高度に相同であり、COOH末端領域はFe2+依存性エタノール:NAD+ オキシドレダクターゼのファミリーと相同である(Membrillo−Hernandezら、(2000年)J. Biol. Chem. 275巻:33869〜33875頁)。E.coli AdhEは金属に触媒される酸化を受け、したがって、酸素感受性である(Tamaritら(1998年)J. Biol. Chem. 273巻:3027〜32頁)。
アセチルCoAは、ミトコンドリアにおいてPDH複合体により触媒されるピルビン酸の酸化的脱カルボキシル化によって形成され得る。しかし、S.cerevisiaeはアセチルCoAをミトコンドリアの外に輸送することができないので、PDHバイパスは、細胞質ゾル区画内にアセチルCoAをもたらすことにおいて重要な役割を果たし、ピルビン酸をアセチルCoAに変換するためのPDH反応に対する代替の経路をもたらす。PDHバイパスには、酵素であるピルビン酸デカルボキシラーゼ(PDC;EC4.1.1.1)、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ACDH;EC1.2.1.5およびEC1.2.1.4)、およびアセチルCoAシンテターゼ(ACS;EC6.2.1.1)が関与する。ピルビン酸デカルボキシラーゼにより、ピルビン酸からアセトアルデヒドおよび二酸化炭素への脱カルボキシル化が触媒される。アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼにより、アセトアルデヒドが酢酸に酸化される。S.cerevisiaeでは、アルデヒドデヒドロゲナーゼのファミリーは5種のメンバーを含有する。ALD2(YMR170c)、ALD3(YMR169c)、およびALD6(YPL061w)は細胞質ゾル内アイソフォームに対応し、ALD4(YOR374w)およびALD5(YER073w)はミトコンドリア内の酵素をコードする。主要な細胞質ゾル内アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアイソフォームは、ALD6によりコードされる。アセテートからのアセチルCoAの形成はACSにより触媒され、ATPの加水分解を伴う。ACSは2つの構造遺伝子、ACS1およびACS2によりコードされる。
一部の実施形態では、宿主細胞におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ACDH)活性をコードする1種または複数種の遺伝子を機能的に破壊する。一部の実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼは、ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6、ならびにそのホモログおよびバリアントからなる群から選択される遺伝子によりコードされる。
一部の実施形態では、宿主細胞におけるアセチルCoAシンテターゼ(ACS)活性をコードする1種または複数種の遺伝子を機能的に破壊する。一部の実施形態では、アセチルCoAシンテターゼは、ACS1、ACS2、ならびにそのホモログおよびバリアントからなる群から選択される遺伝子によりコードされる。
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、MEV経路の1種または複数種の異種酵素を含む。一部の実施形態では、MEV経路の1種または複数種の酵素は、アセチルCoAとマロニルCoAを縮合させてアセトアセチルCoAを形成する酵素を含む。一部の実施形態では、MEV経路の1種または複数種の酵素は、2分子のアセチルCoAを縮合させてアセトアセチルCoAを形成する酵素を含む。一部の実施形態では、MEV経路の1種または複数種の酵素は、アセトアセチルCoAとアセチルCoAを縮合させてHMG−CoAを形成する酵素を含む。一部の実施形態では、MEV経路の1種または複数種の酵素は、HMG−CoAをメバロネートに変換する酵素を含む。一部の実施形態では、MEV経路の1種または複数種の酵素は、メバロネートをメバロネート5−ホスフェートにリン酸化する酵素を含む。一部の実施形態では、MEV経路の1種または複数種の酵素は、メバロネート5−ホスフェートをメバロネート5−ピロホスフェートに変換する酵素を含む。一部の実施形態では、MEV経路の1種または複数種の酵素は、メバロネート5−ピロホスフェートをイソペンテニルピロホスフェートに変換する酵素を含む。
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、2分子のアセチル補酵素Aを縮合させてアセトアセチルCoAを形成することができる酵素、例えばアセチルCoAチオラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、(NC_000913 REGION:2324131.2325315;Escherichia coli)、(D49362;Paracoccus denitrificans)、および(L20428;Saccharomyces cerevisiae)が挙げられる。
一部の実施形態では、宿主細胞は、アセトアセチルCoAとアセチルCoAの別の分子を縮合させて3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル−CoA(HMG−CoA)を形成することができる酵素、例えばHMG−CoAシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、(NC_001145.complement 19061.20536;Saccharomyces cerevisiae)、(X96617;Saccharomyces cerevisiae)、(X83882;Arabidopsis thaliana)、(AB037907;Kitasatospora griseola)、(BT007302;Homo sapiens)、および(NC_002758、Locus tag SAV2546、GeneID 1122571;Staphylococcus aureus)が挙げられる。
一部の実施形態では、宿主細胞は、HMG−CoAをメバロネートに変換することができる酵素、例えばHMG−CoAレダクターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、HMG−CoAレダクターゼは、NADH使用ヒドロキシメチルグルタリル−CoAレダクターゼ−CoAレダクターゼである。HMG−CoAレダクターゼ(EC1.1.1.34;EC1.1.1.88)は、(S)−HMG−CoAから(R)−メバロネートへの還元的脱アシル化を触媒するものであり、クラスI HMGrおよびクラスII HMGrの2つのクラスにカテゴリー化することができる。クラスIは真核生物および大多数の古細菌由来の酵素を含み、クラスIIはある特定の原核生物および古細菌のHMG−CoAレダクターゼを含む。配列の相違に加えて、この2つのクラスの酵素は、これらの補因子特異性に関しても異なる。NADPHを排他的に利用するクラスI酵素とは異なり、クラスII HMG−CoAレダクターゼは、NADPHとNADHを識別するその能力が変動する。例えば、Hedlら、Journal of Bacteriology 186巻(7号):1927〜1932頁(2004年)を参照されたい。クラスII HMG−CoAレダクターゼを選択するための補因子特異性が以下に提供される。
一部の実施形態では、宿主細胞は、メバロネートをメバロネート5−ホスフェートに変換することができる酵素、例えば、メバロン酸キナーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、(L77688;Arabidopsis thaliana)、および(X55875;Saccharomyces cerevisiae)が挙げられる。
一部の実施形態では、宿主細胞は、メバロネート5−ホスフェートをメバロネート5−ピロホスフェートに変換することができる酵素、例えばホスホメバロン酸キナーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、(AF429385;Hevea brasiliensis)、(NM_006556;Homo sapiens)、および(NC_001145.相補体 712315.713670;Saccharomyces cerevisiae)が挙げられる。
一部の実施形態では、宿主細胞は、メバロネート5−ピロホスフェートをイソペンテニルジホスフェート(IPP)に変換することができる酵素、例えばメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、(X97557;Saccharomyces cerevisiae)、(AF290095;Enterococcus faecium)、および(U49260;Homo sapiens)が挙げられる。
一部の実施形態では、宿主細胞は、MEV経路により生成したIPPをジメチルアリルピロホスフェート(DMAPP)に変換することができる酵素、例えばIPPイソメラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、(NC_000913、3031087.3031635;Escherichia coli)、および(AF082326;Haematococcus pluvialis)が挙げられる。
一部の実施形態では、宿主細胞は、IPP分子および/またはDMAPP分子を縮合させて炭素を6つ以上含有するポリプレニル化合物を形成することができるポリプレニルシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
一部の実施形態では、宿主細胞は、ポリプレニルを修飾してヘミテルペン、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、ポリテルペン、ステロイド化合物、カロテノイド、または修飾されたイソプレノイド化合物を形成することができる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
(AJ457070;Cinnamomum tenuipilum)、(AY362553;Ocimum basilicum)、(DQ234300;Perilla frutescens 1864株)、(DQ234299;Perilla citriodora 1861株)、(DQ234298;Perilla citriodora 4935株)、および(DQ088667;Perilla citriodora)が挙げられる。
別の態様では、本明細書では、イソプレノイドを産生するための方法であって、(a)イソプレノイドを産生することができる本明細書に記載の遺伝子改変宿主細胞のいずれかの集団を、炭素源を含む培地中、イソプレノイド化合物を作製するのに適した条件下で培養するステップ、および(b)前記イソプレノイド化合物を培地から回収するステップを含む方法が提供される。
微生物培養物を維持し、成長させるための材料および方法は微生物学または発酵科学の当業者に周知である(例えば、Baileyら、Biochemical Engineering Fundamentals、第2版、McGraw Hill、New York、1986年を参照されたい)。宿主細胞、発酵、およびプロセスの特定の必要条件に応じて、好気性条件、微好気性条件、または嫌気性条件について適切な培養培地、pH、温度、および必要条件を考察しなければならない。
イソプレノイドが宿主細胞によって産生されたら、それを、その後の使用のために、当技術分野で公知の任意の適切な分離および精製方法を使用して回収または単離することができる。一部の実施形態では、イソプレノイドを含む有機相を発酵物から遠心分離によって分離する。他の実施形態では、イソプレノイドを含む有機相を発酵物から自然に分離させる。他の実施形態では、イソプレノイドを含む有機相を発酵物から解乳化剤および/または造核剤を発酵反応物に添加することによって分離する。解乳化剤の実例としては、凝集剤および凝固薬が挙げられる。造核剤の実例としては、イソプレノイド自体の液滴ならびにドデカン、ミリスチン酸イソプロピル(isopropyl myristrate)、およびオレイン酸メチルなどの有機溶媒が挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、アセチルCoAからポリケチドを産生することができる。ポリケチドは、協調した活性部位の群を含有する大きな多酵素タンパク質複合体である、ポリケチドシンターゼ(PKS)と称される酵素活性の集合により触媒される逐次的な反応によって合成される。ポリケチド生合成は、アセチルCoA、プロピオニルCoA、ブチリルCoAなどの単純な2炭素構成要素、3炭素構成要素、4炭素構成要素およびそれらの活性化された誘導体であるマロニルCoA、メチルマロニルCoAおよびエチルマロニルCoAから始まり、主にクライゼン縮合反応によるマロニルCoA由来単位の脱炭酸縮合を通じて段階的に進行する。PKS遺伝子は通常、細菌において、および真核生物における遺伝子クラスターにおいて1つのオペロン内に組織化されている。3つの型のポリケチドシンターゼが特徴付けられている:I型ポリケチドシンターゼは、大きな、高度なモジュラータンパク質であり、2つのクラス:1)ドメインを周期的に再使用する反復PKSおよび2)別々のモジュール配列を含有し、ドメインを繰り返さないモジュラーPKSに細分される。II型ポリケチドシンターゼは、単機能性タンパク質の凝集体であり、III型ポリケチドシンターゼはアシル担体タンパク質ドメインを使用しない。
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、アセチルCoAおよびマロニルCoAの少なくとも1つをアシル担体タンパク質と縮合させることができる酵素、例えばアシル−トランスフェラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、アセチルCoAから脂肪酸を産生することができる。脂肪酸は、脂肪酸シンターゼにより触媒されるアセチルCoAおよびマロニルCoAからの一連の脱炭酸クライゼン縮合反応によって合成される。ポリケチドシンターゼと同様に、脂肪酸シンターゼは単一の酵素ではなく、272kDaの多機能性ポリペプチドで構成され、基質が1つの機能性ドメインから次の機能性ドメインに渡される酵素系である。2つの主要なクラスの脂肪酸シンターゼが特徴付けられている:I型脂肪酸シンターゼは、哺乳動物および真菌(しかし真菌のシンターゼと哺乳動物のシンターゼの構造的配置は異なる)および細菌のCMN群(コリネバクテリア、マイコバクテリア、およびノカルジア)に共通する単一の多機能性ポリペプチドである。古細菌および真正細菌に見いだされるII型シンターゼは、脂肪酸の合成に関与する一連の別個の単機能性酵素である。シンターゼの2つのクラスにおける脂肪酸の伸長および還元の機構は、これらの触媒事象に関与する酵素ドメインの大部分が2つのクラスの間で相同であるので、同じである。
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞(例えば、PK/PTAおよびアセチルホスファターゼ活性、例えば、RHR2、HOR2またはその相同体をコードするポリペプチドの機能的破壊を含む宿主細胞)を、米国特許出願公開第20120156735号に記載の通り、細胞内ピルビン酸から開始されて、例えば、2,3−ブタンジオール、2−ブタノール、2−ブタノン、バリン、ロイシン、乳酸、リンゴ酸塩、イソアミルアルコール、およびイソブタノールが産生される生合成経路が発現されるように工学的に操作する。生合成経路による産物形成へのピルビン酸の利用可能性を増大させるために、ピルビン酸を利用する生合成経路を発現するように工学的に操作された組換え宿主細胞における酵素ピルビン酸デカルボキシラーゼ(PDC)の破壊が使用されている。ピルビン酸を利用する生合成経路の産物を産生するためにPDC−KO組換え宿主細胞を使用することができるが、PDC−KO組換え宿主細胞はそれらが成長するために、外因性炭素基質の補充(例えば、エタノールまたはアセテート)を必要とする。特に、2種の外因性炭素基質が必要であり、そのうちの一方が所望の産物に変換され、他方は成長するためにこのような補充を必要とする組換え宿主細胞によって完全にまたは部分的にアセチルCoAに変換される。しかし、異種ホスホケトラーゼ経路の発現により、異種PK/PTAでないPDC−KO細胞と比較して、その成長のためにこれらの外因性炭素基質をもたらす必要性が低下するまたは排除される。したがって、アセチルホスフェートのアセテートへの加水分解を触媒することができるRHR2、HOR2またはその相同体の追加の機能的破壊により、これらの細胞において細胞の成長のために利用可能な基質としてのアセチルCoAの供給を増大させるPK/PTAの能力がさらに改善されることが予想される。
本明細書では、上記の改変のうちの1つまたは複数、例えば、PK、PTA、および/または、例えばアセチルCoA由来化合物の生合成経路の酵素をコードする1種または複数種の異種核酸を含むように遺伝子操作された宿主細胞を作出するための方法も提供される。宿主細胞における異種酵素の発現は、酵素をコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞における発現を可能にする調節エレメントの制御下で含む核酸を宿主細胞に導入することによって実現することができる。一部の実施形態では、核酸は、染色体外プラスミドである。他の実施形態では、核酸は、ヌクレオチド配列を宿主細胞の染色体に組み込むことができる染色体内組み込みベクターである。
6.1 実施例1:
PKおよびPTAを発現する宿主細胞におけるアセテート産生
この実施例では、ホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼを異種発現する酵母株におけるアセテートの産生を記載している。
6.1.1.1 株の工学的操作
6.1.1.1.1 Y967およびY968
Y967およびY968は野生型原栄養Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2であり、Y967はMatAであり、Y968はMatalphaである。Y12869、Y12746、およびこれらの誘導体の全ての出発株はSaccharomyces cerevisiae Y003株(CEN.PK2、Matアルファ、ura3−52、trp1−289、leu2−3,122、his3^1)であった。S.cerevisiaeのDNA媒介性形質転換は全て、Gietz RWおよびWoods RA、Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology. Part B. San Diego、CA: Academic Press Inc.87〜96頁(2002年)に記載されている通り標準の酢酸リチウム手順を使用して行い、全ての場合において、構築物の組み込みをゲノムDNAのPCR増幅によって確認した。
Y12869を、Y003への3回の連続的な組み込みによって生成した。まず、導入することによりACS2遺伝子座の上流のヌクレオチドの配列からなる配列と下流のヌクレオチドの配列からなる配列に挟まれたネイティブなS.cerevisiae LEU2遺伝子からなる組み込み構築物(i2235;配列番号27)を導入することによって遺伝子ACS2を欠失させた。この構築物は、S.cerevisiae宿主細胞に導入されると、相同組換えによってゲノムのACS2遺伝子座に組み込まれ、その組み込み配列でACS2コード配列が置き換えられることによってACS2が機能的に破壊され得る。形質転換体を、2%EtOHを唯一の炭素源として含有するCSM−leuプレートにプレーティングし、PCR増幅によって確認した。生じた株はY4940であった。
Y12745を、Y4940への3回の連続的な組み込みによって生成した。まず、Y4940を以下に示されている組み込み構築物(i73830;配列番号30)で形質転換した。
Y12746を、Y4940への3回の連続的な組み込みによって生成した。まず、Y4940を以下に示されている組み込み構築物(i73830;配列番号30)で形質転換した。
Y19390は、Y12869の直接の派生物である。Y12869のウラシル要求性誘導体を以下に示されている組み込み構築物MS49253(配列番号36)で形質転換した:
Y19391は、Y12869の直接の派生物である。Y12869のウラシル要求性誘導体を以下に示されている組み込み構築物MS49298(配列番号37)で形質転換した:
Y967、Y12869、Y12745、Y12746、Y19390およびY19391の種菌培養物を、単一のコロニーから、50mMのコハク酸、pH5.0、および20g/Lのスクロースを伴うシード培地5ml中、30℃、200rpmで一晩成長させた(15g/Lの硫酸アンモニウム、8g/Lのリン酸カリウム、6.1g/Lの硫酸マグネシウム、150mg/LのEDTA、57.5mg/Lの硫酸亜鉛、4.8mg/Lの塩化コバルト、3.24mg/Lの塩化マンガン、5mg/Lの硫酸銅、29.4mg/Lの塩化カルシウム、27.8mg/Lの硫酸鉄、4.8mg/L モリブデン酸ナトリウム、0.6mg/Lのビオチン、12mg/Lのパントテン酸カルシウム、12mg/Lのニコチン酸、30mg/Lのイノシトール、12mg/Lの塩酸チアミン、12mg/Lの塩酸ピリドキシン、0.24mg/Lのパラアミノ安息香酸)。次いで、前培養物を、50mMのコハク酸pH5.0、および40g/Lのスクロースを伴うシード培地25mlを含む125mlのフラスコに接種し、最初のOD600を0.1にし、30℃、200rpmで成長させた。
全細胞ブロス1mlを1.5mlのエッペンドルフチューブに移し、卓上遠心分離機を使用して13,000RPMで1分回転させて上清を清澄化することによってアセテートおよび糖(フルクトース、グルコース、スクロース)を定量化した。次いで、上清を8mMの硫酸で希釈し(1:1v/v)、ボルテックスし、再度遠心分離した後に、1.8mlのバイアルに移した。BioRad Aminex HPX−87H 300mm×7.8mmカラムを使用して、可変性の波長および屈折率検出を伴うAgilent 1200 HPLCを用いて試料を分析した。移動相は4mMの硫酸であり、カラム温度は40℃であり、流速は毎分0.5mlであった。
図3Bには、野生型Cen.PK2、Y967がバッチ確定スクロース振とうフラスコ培養物中での成長中にアセテートを産生することが示されている。PDH−バイパスの欠失(acs1Δ acs2Δ ald6Δ)を含み、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアシル化(Dz.eutE)を異種発現するY12869により産生されるアセテートは、PDH−バイパスを使用する野生型対照よりもはるかに少なく、これはアセトアルデヒドをアセテートに変換する細胞質ゾル内アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼであるALD6の欠失に起因する可能性がある。PDH−バイパスの欠失を含み(acs1Δ acs2Δ ald6Δ)、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアシル化(Dz.eutE)ならびにホスホケトラーゼ(Lm.PK)およびホスホトランスアセチラーゼ(Ck.PTA)を異種発現するY12746株では、アセテートの大きな増大が観察され、野生型Y967によって産生される量に勝る。Y12869での結果により、acs1Δ acs2Δ ald6Δであり、細胞質ゾル内アセチルCoAにフラックスを持っていくためにADAを使用する株ではアセテートのベースラインレベルが非常に低いことが示される。全ての場合において、糖消費の速度は同等であり(本明細書では、糖とは、培地中のスクロース、グルコース、およびフルクトースの合計と定義される)、これにより、アセテートレベルの差異がフィードストックの示差的な消費に起因するものではないことが例証される(図3A)。これらの結果により、Y12746におけるアセテートの増大は、ホスホケトラーゼおよび/またはホスホトランスアセチラーゼの存在に起因することが示唆される。ホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの両方の触媒活性によりアセチルホスフェートが産生される。したがって、Y12746における自発的なまたは触媒されるアセチルホスフェートの加水分解からアセテート蓄積が生じ得る。
Saccharomyces cerevisiaeにおける主要なアセチルホスファターゼの同定
この実施例では、酵母においてアセチルホスフェートを加水分解することができる酵素の同定を記載している。
6.2.1.1 細胞培養
所与の酵母株の単一のコロニーを、2%デキストロースを伴う酵母抽出物ペプトン培地(YPD)5mL中で一晩発端培養として培養した。翌日、YPD50mlをこの発端培養物に接種し、OD600を0.2にした。別段の指定がない限り、フラスコを30℃、200RPMで振とうしながら24時間インキュベートした。
細胞培養物を15mLのファルコンチューブ3つに分け、4000×gで5分遠心分離することによって収集した。次いで、上清を廃棄し、氷冷した緩衝液W(100mMのTris−HCl、pH8.0、150mMのNaCl、10%グリセロール)10mLに再懸濁させ、その後、4000xgで5分遠心分離することによって細胞を洗浄した。上清を廃棄し、細胞を溶解緩衝液(100mMのTris−HCl、pH8.0、150mMのNaCl、10%グリセロール、1mMのDTT、10mL当たり1つのEDTAフリープロテアーゼインヒビター錠(Roche))1mLに再懸濁させた。次いで、細胞を、Oリングキャップを伴う2mLのプラスチックスクリューキャップ微量遠心チューブ(Fisher Brand 520−GRD)に移し、破壊ビーズ(Disruption beads、0.5Mm、Fisher)およびビーズビーターを使用して、6M/Sで1分間にわたって細胞を溶解させた。チューブをすぐに氷水浴に入れ、少なくとも5分置いた。次いで、チューブを再度ビージビーターに戻し、6M/Sで1分置き、氷浴に戻して5分置いた。チューブを最低でも16000×gで20分回転させて細胞片をペレット化した。次いで、上清を新しい低温チューブに移した。タンパク質の濃度を、タンパク質についての典型的なBradfordアッセイを使用して測定した(Bradford MM A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein−dye binding. Anal. Biochem 72巻、248〜254頁(1976年))。
アセチルホスファターゼ活性アッセイを、30℃、100mMのTris−HCl、pH7.5、150mMのNaCl、および1mMのMgCl2+からなる反応緩衝液中で行った。アセチルホスフェートを、示されている通り5mMまたは10mMのいずれかの出発濃度になるまで添加した。無細胞抽出物を示されている量で添加することによって反応を開始させた。ホスファターゼ阻害について試験するために、選択のためにフッ化ナトリウムをウェルに30mMの濃度で添加した。密閉した96ウェルプレートで反応を行い、反応生成物の総体積は250μlであった。アセチルホスフェート濃度を、LipmannおよびTuttle(Lipmann F、Tuttle LC、J. Biol. Chem. 159巻、21〜28頁(1945年))により開発された方法によって測定した。反応混合物50μlを2Mのヒドロキシルアミン、pH6.8、50μlに添加し、十分に混合し、室温で少なくとも10分インキュベートした。次いで、15%トリクロロ酢酸34μlを添加し、混合し、その後、4NのHCl、34μl、および5%FeCl3、34μlをそれぞれ添加した後に十分に混合した。次いで、プレートを、スイングバケットローターJS−5.3を伴うBeckman遠心分離機J−Eにおいて、3000rpmで5分遠心分離して沈殿したタンパク質をペレット化した。次いで、次いで、上清150μlを新鮮な96ウェル透明平底プレート(Greiner Bio−One Cat.−No.:655161)に移した。プレートを、Molecular Devices SpectraMax M5プレートリーダーによって505nmの波長において読み取った。
所与の酵母株の単一のコロニーを、2%デキストロースを伴う酵母抽出物ペプトン培地(YPD)5mL中で一晩発端培養として培養した。翌日、500mlのYPDを伴う2.8Lのフェルンバッハフラスコ2つにこの発端培養物を接種し、OD600を0.2にした。フラスコを、30℃、160RPMで振とうしながら24時間インキュベートした。培養物を、4000xgで5分遠心分離することによって収集した。細胞ペレットを滅菌水500mLで洗浄し、4000xgで5分遠心分離した。次いで、細胞ペレットを、氷冷した溶解緩衝液(100mMのTris−HCl、pH8.0、150mMのNaCl、10%グリセロール、1mMのDTT、10mL当たり1つのEDTAフリープロテアーゼインヒビター錠(Roche))50mLに再懸濁させた。細胞浮遊液を、破砕ビーズ(Disruption beads、0.5Mm、Fisher)5mLを満たした15mLのファルコンチューブ6つに分割した。次いで、チューブをビーズビーターに入れ、6M/Sで45秒置いた。チューブをすぐに氷水浴に入れ、少なくとも5分置いた。ビーズビーティングをさらに3回繰り返し、各破砕セグメントの間に氷水浴に少なくとも5分入れた。チューブを、4℃に冷却したJA−20ローター内のBeckman遠心分離機J−Eで16,000rpm(30,966×g)で30分回転させて、細胞片をペレット化した。細胞溶解物を、Saltら(Selective flocculation of cellular contaminants from soluble proteins using polyethyleneimine: A study of several organisms and polymer molecular weights. Enzyme and Microbial Technology 17巻、107〜113頁(1995年))に記載されている選択的フロキュレーション法によって以下の通りさらに清澄化した:無細胞溶解物を、5mMのNaOHストック溶液を添加することによってpH7.4に調整した。次いで、等体積のPEI/Borax溶液(0.5MのNaCl、0.25%PEI、100mMのBorax)を細胞溶解物に添加し、十分に混合した。次いで、混合物を、4℃、2,500×gで30分遠心分離した。次いで、硫酸アンモニウムを80%の飽和濃度に達するまで絶えず撹拌しながらゆっくりと添加することによってタンパク質沈殿させた。撹拌をさらに10分継続し、次いで、Beckman JA−20ローターにおいて4℃、15,000rpmで10分遠心分離することによって沈殿したタンパク質を収集した。上清を除去し、タンパク質を緩衝液A(20mMのTris−Cl、pH7、10%グリセロール)に穏やかに再懸濁させた。次いで、タンパク質を、3,500Da分子量カットオフ透析カセット(Pierce#66300)0.5〜3mLに添加し、1.5Lの緩衝液A中、4℃で一晩透析した。透析した試料を16000×gで10分遠心分離して、沈殿したタンパク質をペレット化した。タンパク質の濃度を、タンパク質についての典型的なBradfordアッセイを使用して測定した(Bradford MM、A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein−dye binding. Anal. Biochem 72巻、248〜254頁(1976年))。タンパク質20mgをGE AKTAexplorer FPLCのSource 15Q 4.6/100 PE陰イオン交換カラムにローディングした。緩衝液B(20mMのTris−Cl、pH7、1MのNaCl、10%グリセロール)の0〜100%勾配を30カラム体積にわたって毎分0.5mLの流速で用いてタンパク質を溶出し、試料1mLを採取した。各画分の活性をアッセイするために、各画分75μLを、100mMのTris−Cl、pH7、150mMのNaCl、1mMのMgCl2を含有する反応物250μL中8mMのACPに添加し、上記の通りアッセイした。この分離からの活性な画分を緩衝液Aに対して一晩、再度透析した。次いで、試料全体を同じSource 15Q 4.6/100 PE陰イオン交換カラムにローディングし、0〜45%緩衝液Bの勾配を30カラム体積にわたって毎分0.5mLの流速で用いて溶出し、試料1mLを採取した。試料を活性について上記の通りアッセイした。
タンパク質画分を、基準ゲル電気泳動系を使用して分析した。画分10μLを、5%v/v2−メルカプトエタノールを伴う2×Laemmli試料緩衝液(BioRad Cat番号161−0737)10μLに添加し、10分煮沸した。次いで、試料を短時間遠心分離し、15μlを26ウェル4〜15%Criterion(商標)TGX(商標)Precast Gelにローディングし、1×Tris−グリシン−SDS緩衝液(BioRadにより調製されたもの、10×Tris/Glycine/SDS#161−0732)に130ボルトで50分流した。ゲルを脱イオン水200mLで3回、それぞれ5分すすいだ。次いで、SimplyBlue(商標)SafeStain(Life Technologies Cat番号LC6060)をゲルに添加してゲルを完全に覆い、次いで、室温で1時間、穏やかにゆすりながらインキュベートした。次いで、SafeStainを廃棄し、ゲルを、脱イオン水200mLを用いて1時間ゆすりながら洗浄した。
タンパク質消化およびペプチドの分離
総タンパク質100μgを、その後にLC−MS/MSによって同定するためにトリプシンによるタンパク質分解に供した。総タンパク質100μgを、Tris−カルボキシエチルホスフィン(4mM)を用いて37℃で30分還元し、次いで、ヨードアセトアミド(15mM)を用いて暗闇中、RTで30分アルキル化した。トリプシン5μgを消化混合物に添加し、37℃で12時間にわたって完全に消化した。0.1%ギ酸を用いて反応をクエンチし、Ascentis Peptide express column(5cmx2.1mm ID、粒子サイズ2.1um)に注射し、0.1%ギ酸を修飾因子として使用し、低アセトニトリルから高アセトニトリルまでの90分の勾配にわたって分離した。LCポンプは、Shimadzu CBM20A LC Controllerにより作動する2台のShimadzu LC20ADであった。
QTRAP 4000ハイブリッドトリプル四重極リニアイオントラップ質量分析計を使用して、カラムから溶出するペプチドを同定した。IDAパラメータは以下の通りであった:選択イオン、350〜1300da;電荷の状態を決定するために使用するERスキャン;1+イオン拒絶、未知許容;回転衝突エネルギー:あり(qtrap4000のAB SCIEX標準);各MS/MSの最大充填時間:950ms。
Matrix ScienceによるMascotを使用し以下のパラメータを用いてCENPK2配列データベースからペプチドを同定した。固定修飾(Fixed modifications):カルバミドメチル。可変修飾(Variable modifications):脱アミド(NQ)、酸化(MW)。前駆体質量許容差(Precursor mass tolerance):0.5da。生成物質量許容差(Product mass tolerance):1.0da。切断ミス最大数(Missed cleavages allowed):1。
機能的URA3遺伝子を欠くY968のバージョンを、RHR2をノックアウトするためにms59858を用いて、またはHOR2をノックアウトするためにms59971を用いて形質転換した。構築物は米国特許第8,221,982号に記載の方法を使用して組み立てた。2%グルコースを伴うCSM−URAプレート上で形質転換体を選択し、PCR増幅によって確認した。この構築物中のURA3マーカーは直接反復配列に挟まれており、それにより、当該マーカーの再利用が容易になる。URA3マーカーを再利用するために、細胞をYPD中で一晩成長させ、次いで、5’FOAにプレーティングした。URA3のループアウトをPCR増幅、およびCSM−URAプレートで成長できないことによって確認した。次いで、Y968.ms59858のura−バージョンをms59971で形質転換して、2重RHR2およびHOR2ノックアウトY968.ms59858.ms59971株を生成した。
6.2.2.1 アセチルホスフェートの加水分解は酵素により触媒され、熱および広範なスペクトルのホスファターゼ阻害剤により阻害される
図4に示されている通り、野生型S.cerevisiae Y967株由来の無細胞抽出物の添加により、アセチルホスフェートの加水分解が触媒され、加水分解の速度は、添加する無細胞抽出物の量に左右される。無細胞抽出物の量を増大することにより、加水分解の速度が上昇する。無細胞抽出物を煮沸すると、漸増量の無細胞抽出物を添加することによりもはやアセチルホスフェートの加水分解速度は影響を受けず、これにより、反応性成分が熱により失活したことが示される。同様に、30mMの、広範なスペクトルのホスファターゼ阻害剤であるフッ化ナトリウムを添加することにより、アセチルホスフェートの加水分解時の無細胞抽出物の効力がなくなる。これらの結果により、ホスファターゼがアセチルホスフェート加水分解の触媒作用に関与する可能性があることが示唆される。
陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して無細胞抽出物中の可溶性タンパク質を分離した。図5Aには、ホスファターゼ活性のほぼ全てが1つの画分に濃縮され、残りの活性がその画分の付近にあったことが示されている。これにより、無細胞抽出物中のこの活性に関与する酵素が、単一のタンパク質、または陰イオン交換クロマトグラフィーによって分離した際に一緒に溶出する、同様のイオン性相互作用を有するタンパク質のいずれかであることが示される。
Rhr2および/またはHor2がS.cerevisiaeにおいて観察されるホスファターゼ活性に関与するかどうかを決定するために、RHR2またはHOR2のいずれかを欠く新しい株、およびRHR2とHOR2を両方とも欠く1つの株を創出した。これらの株を以前に記載されている通り培養し、無細胞抽出物を調製し、アセチルホスファターゼ活性について試験した。図7に示されている通り、RHR2の欠失によりホスファターゼ活性が劇的に低下するが、HOR2の欠失にはアセチルホスフェートの加水分解の速度に対する効果はない。しかし、すでにRHR2が欠失している株ではHOR2の欠失によりアセチルホスフェートの加水分解が低下する。これは、RHR2の欠失後にHor2の発現が上方制御されることが示されている公開された研究と一致する(DeLunaら、Need−Based Up−Regulation of Protein Levels in Response to Deletion of Their Duplicate Genes、PLOS Biol.、8巻、e10000347頁(2010年))。図7に示されている通り、これらのホスファターゼを両方とも排除することにより、ほぼバックグラウンドレベルのアセチルホスフェート加水分解がもたらされる。これらの結果により、グリセロール−1−ホスファターゼであるRhr2およびHor2がS.cerevisiaeにおける大多数のアセチルホスファターゼ活性に関与することが確認される。
アセチルホスフェートホスファターゼの欠失により、アセテート分泌が低下し、アセチルCoAに由来する化合物の産生が改善される
6.3.1 材料および方法
6.3.1.1 株の構築
Y968、Y12869、およびY12746、機能的URA3遺伝子を欠くバージョンを、ファルネセン産生体に変換するために、ms63907またはms63909のいずれかを用いて、およびms64472を用いて形質転換した。
単一のコロニーを96ウェルプレートのウェル中のシード培地(実施例1に記載されている)360μlに接種し、34℃で3日間、1000rpmで振とうすることにより成長させた。次いで、培養物14.4μlを50mMのコハク酸pH5.0および40g/Lガラクトースを伴うシード培地360μl中に継代培養し、34℃で2日間、1000rpmで振とうすることによって成長させた。
アセテートおよびグリセロールを定量化した 全細胞ブロス1mlを1.5mlのエッペンドルフチューブに移し、卓上遠心分離機を使用して13,000RPMで1分回転させて上清を清澄化することによって。次いで、上清を8mMの硫酸で希釈し(1:1v/v)、ボルテックスし、再度遠心分離した後に、1.8mlのバイアルに移した。BioRad Aminex HPX−87H 300mm×7.8mmカラムを使用して、可変性の波長および屈折率検出を伴うAgilent 1200 HPLCを用いて試料を分析した。移動相移動相は4mMの硫酸であり、カラム温度は40℃であり、流速は毎分0.5mlであった。
34℃で2日間のインキュベーションの最後に、全細胞ブロス98μlをナイルレッド溶液(DMSO中100μg/ml)2μlと混合して平底96ウェルアッセイプレート(Costar 3916)に入れ、96ウェルプレート振とう機で30秒混合した。次いでプレートをBeckman M5プレートリーダーにおいて500nmにおける励起および550nmにおける放出を用いて読み取った。
96ウェルアッセイプレートにおいて、培養物8μlと希釈剤(20%PEG200、20%エタノール、2%トリトンX−114)92μlを混合し、室温で30分インキュベートした。アッセイプレートをボルテックスした後、Beckman M5プレートリーダーでOD600を測定した。
図8Aには、PDH−バイパスの欠失(acs1Δ acs2Δ ald6Δ)を含み、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアセチル化(Dz.eutE)ならびにホスホケトラーゼ(Lm.PK)およびホスホトランスアセチラーゼ(Ck.PTA)を異種発現し、かつファルネセン産生経路内の遺伝子を過剰発現するY12746.ms63909.ms64472株により、RHR2遺伝子が欠失したY12746.ms63909.ms64472バージョンよりも多くのアセテートが分泌されることが示されている。図8Bに示されている通り、Y12746.ms63909.ms64472 rhr2^のグリセロールレベルはY12746.ms63909.ms64472と比較して大きく変化しないので、RHR2の欠失によるグリセロール産生に対する影響はない。図8Cに示されている通り、Y12746.ms63909.ms64472 rhr2^におけるアセテートの実質的なレベルの低下は、細胞密度はRHR2+集団とrhr2^集団のどちらについても同様であるので、細胞の成長の低下に起因するものではない。これらの結果により、無細胞抽出物におけるアセチルホスフェートホスファターゼ活性に関与するRhr2が、in vivoにおけるアセチルホスフェートのアセテートへの加水分解の主な原因でもあることが実証される。
Claims (47)
- (a)ホスホケトラーゼ(PK;EC4.1.2.9)をコードする異種核酸、および
(b)アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊
を含む遺伝子改変宿主細胞。 - ホスホトランスアセチラーゼ(PTA;EC2.3.1.8)をコードする異種核酸をさらに含む、請求項1に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- (a)ホスホトランスアセチラーゼ(PTA;EC2.3.1.8)をコードする異種核酸、および
(b)アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊
を含む遺伝子改変宿主細胞。 - ホスホケトラーゼ(PK;EC4.1.2.9)をコードする異種核酸をさらに含む、請求項3に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- アセチルホスフェートをアセテートに変換する前記酵素がグリセロール−1−ホスファターゼ(EC3.1.3.21)である、請求項1から4までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- 前記グリセロール−1−ホスファターゼが、GPP1/RHR2、GPP2/HOR2、ならびにその相同体およびバリアントから選択される、請求項5に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- GPP1/RHR2またはその相同体もしくはバリアントが機能的に破壊されている、請求項6に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- GPP2/HOR2またはその相同体もしくはバリアントが機能的に破壊されている、請求項6に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- GPP1/RHR2とGPP2/HOR2の両方、またはGPP1/RHR2の相同体もしくはバリアントとGPP2/HOR2の相同体もしくはバリアントの両方が機能的に破壊されている、請求項6に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- イソプレノイドを産生することができる、請求項1から9までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- イソペンテニルピロホスフェートを作製するためのメバロン酸(MEV)経路の1種または複数種の酵素をコードする1種または複数種の異種核酸を含む、請求項10に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- 前記MEV経路の1種または複数種の酵素が、NADH使用HMG−CoAレダクターゼを含む、請求項11に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- 前記MEV経路の1種または複数種の酵素が、2分子のアセチルCoAを縮合させてアセトアセチルCoAを形成する酵素を含む、請求項11に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- 前記MEV経路の1種または複数種の酵素が、アセトアセチルCoAとアセチルCoAを縮合させてHMG−CoAを形成する酵素を含む、請求項11に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- 前記MEV経路の1種または複数種の酵素が、HMG−CoAをメバロネートに変換する酵素を含む、請求項11に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- 前記MEV経路の1種または複数種の酵素が、メバロネートをメバロネート5−ホスフェートにリン酸化する酵素を含む、請求項11に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- 前記MEV経路の1種または複数種の酵素が、メバロネート5−ホスフェートをメバロネート5−ピロホスフェートに変換する酵素を含む、請求項11に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- 前記MEV経路の1種または複数種の酵素が、メバロネート5−ピロホスフェートをイソペンテニルピロホスフェートに変換する酵素を含む、請求項11に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- 前記MEV経路の1種または複数種の酵素が、HMG−CoAシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼおよびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼから選択される、請求項11に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- 前記MEV経路の酵素の全てをコードする複数の異種核酸を含む、請求項11に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- 前記MEV経路の1種または複数種の酵素をコードする前記1種または複数種の異種核酸が単一の転写調節因子の制御下にある、請求項11に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- 前記MEV経路の1種または複数種の酵素をコードする前記1種または複数種の異種核酸が複数の異種性転写調節因子の制御下にある、請求項11に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- イソペンテニルピロホスフェート(IPP)をジメチルアリルピロホスフェート(DMAPP)に変換することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む、請求項11に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- IPP分子および/またはDMAPP分子を縮合させてポリプレニル化合物を形成することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む、請求項11に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- IPPまたはポリプレニルを修飾してイソプレノイド化合物を形成することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む、請求項11に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- IPPまたはポリプレニルを修飾してイソプレノイド化合物を形成することができる前記酵素が、カレンシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、リナロールシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、オシメンシンターゼ、α−ピネンシンターゼ、β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、β−ファルネセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、パチョロールシンターゼ、ノートカトンシンターゼ、およびアビエタジエンシンターゼからなる群から選択される、請求項25に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- 前記イソプレノイドが、ヘミテルペン、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン、およびポリテルペンからなる群から選択される、請求項10に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- 前記イソプレノイドがC5〜C20イソプレノイドである、請求項10に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- 前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレン、およびバレンセンからなる群から選択される、請求項10に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- 細菌細胞、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞からなる群から選択される、請求項1から29までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- 酵母細胞である、請求項1から29までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- 前記酵母がSaccharomyces cerevisiaeである、請求項31に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊を含まない酵母細胞と比較して増大した量のアセチルCoA由来化合物を産生する、請求項1から32までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
- イソプレノイドを産生するための方法であって、
(a)請求項10から33までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞の集団を、炭素源を含む培地中、前記イソプレノイド化合物を作製するのに適した条件下で培養するステップ、および
(b)前記イソプレノイド化合物を前記培地から回収するステップ
を含む、方法。 - 宿主細胞におけるアセチルCoAまたはアセチルCoA由来化合物の産生を増大させるための方法であって、
(a)前記宿主細胞においてホスホケトラーゼ(PK;EC4.1.2.9)をコードする異種核酸を発現させるステップ、および
(b)アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素を機能的に破壊するステップ
を含む、方法。 - 前記宿主細胞においてホスホトランスアセチラーゼ(PTA;EC2.3.1.8)をコードする異種核酸を発現させるステップをさらに含む、請求項35に記載の方法。
- 宿主細胞におけるアセチルCoAの産生を増大させるための方法であって、
(a)前記宿主細胞においてホスホトランスアセチラーゼ(PTA;EC2.3.1.8)をコードする異種核酸を発現させるステップ、および
(b)アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素を機能的に破壊するステップ
を含む、方法。 - 前記宿主細胞においてホスホケトラーゼ(PK;EC4.1.2.9)をコードする異種核酸を発現させるステップをさらに含む、請求項37に記載の方法。
- アセチルホスフェートをアセテートに変換する前記酵素がグリセロール−1−ホスファターゼ(EC3.1.3.21)である、請求項35から38までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記グリセロール−1−ホスファターゼがGPP1/RHR2、GPP2/HOR2、ならびにその相同体およびバリアントから選択される、請求項39に記載の方法。
- GPP1/RHR2またはその相同体もしくはバリアントが機能的に破壊されている、請求項40に記載の方法。
- GPP2/HOR2またはその相同体もしくはバリアントが機能的に破壊されている、請求項40に記載の方法。
- GPP1/RHR2とGPP2/HOR2の両方、またはGPP1/RHR2の相同体もしくはバリアントとGPP2/HOR2の相同体もしくはバリアントの両方が機能的に破壊されている、請求項40に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、細菌細胞、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞からなる群から選択される、請求項35から43までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項35から43までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵母がSaccharomyces cerevisiaeである、請求項45に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊を含まない酵母細胞と比較して増大した量のアセチルCoAまたはアセチルCoA由来化合物を産生する、請求項35から46までのいずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361800356P | 2013-03-15 | 2013-03-15 | |
US61/800,356 | 2013-03-15 | ||
PCT/US2014/028421 WO2014144135A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-03-14 | Use of phosphoketolase and phosphotransacetylase for production of acetyl-coenzyme a derived compounds |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019175333A Division JP2019213558A (ja) | 2013-03-15 | 2019-09-26 | アセチル補酵素a由来化合物を生産するためのホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの使用 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016512047A true JP2016512047A (ja) | 2016-04-25 |
JP2016512047A5 JP2016512047A5 (ja) | 2017-04-20 |
JP6595449B2 JP6595449B2 (ja) | 2019-10-23 |
Family
ID=50391556
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016502782A Active JP6595449B2 (ja) | 2013-03-15 | 2014-03-14 | アセチル補酵素a由来化合物を生産するためのホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの使用 |
JP2019175333A Pending JP2019213558A (ja) | 2013-03-15 | 2019-09-26 | アセチル補酵素a由来化合物を生産するためのホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの使用 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019175333A Pending JP2019213558A (ja) | 2013-03-15 | 2019-09-26 | アセチル補酵素a由来化合物を生産するためのホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの使用 |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9410214B2 (ja) |
EP (1) | EP2971027B1 (ja) |
JP (2) | JP6595449B2 (ja) |
KR (1) | KR102159691B1 (ja) |
CN (1) | CN105189772B (ja) |
AU (1) | AU2014227811C1 (ja) |
BR (1) | BR112015023089A2 (ja) |
CA (1) | CA2903053C (ja) |
ES (1) | ES2721920T3 (ja) |
MX (1) | MX364748B (ja) |
MY (1) | MY171958A (ja) |
WO (1) | WO2014144135A2 (ja) |
ZA (1) | ZA201506406B (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018079619A1 (ja) * | 2016-10-28 | 2018-05-03 | 積水化学工業株式会社 | 組換え細胞、並びに、イソプレン又はテルペンの生産方法 |
JP2019041712A (ja) * | 2017-09-05 | 2019-03-22 | 株式会社デンソー | 組み換え体及びスクアレンの製造方法 |
Families Citing this family (38)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BR112014008278A2 (pt) | 2011-10-07 | 2017-04-18 | Danisco Us Inc | utilização de fosfocetolase na produção de mevalonato, precursores isoprenoides e isopreno |
BR112015011544B1 (pt) | 2012-11-20 | 2022-08-16 | Lallemand Hungary Liquidity Management Llc | Microrganismo recombinante, composição compreendendo o mesmo, método de produção de etanol e co-cultura |
US9580758B2 (en) | 2013-11-12 | 2017-02-28 | Luc Montagnier | System and method for the detection and treatment of infection by a microbial agent associated with HIV infection |
PL3077501T3 (pl) | 2013-12-03 | 2022-01-31 | Genomatica, Inc. | Mikroorganizmy i sposoby poprawy wydajności produktu na metanolu z użyciem syntezy acetylo-coa |
EP3741865B1 (en) * | 2014-09-18 | 2024-03-13 | Genomatica, Inc. | Non-natural microbial organisms with improved energetic efficiency |
CN104372017B (zh) * | 2014-11-05 | 2017-06-30 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种提高基因工程菌异戊二烯及其衍生物产量的方法及应用 |
WO2017051930A1 (en) * | 2015-09-25 | 2017-03-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing isoprenoid compound |
MX2018002533A (es) | 2015-09-29 | 2018-06-27 | Kimberly Clark Co | Composicion sinergica para el mantenimiento de un equilibrio saludable de la microflora. |
MY190296A (en) | 2015-10-29 | 2022-04-12 | Firmenich Incorporated | High intensity sweeteners |
US10612032B2 (en) | 2016-03-24 | 2020-04-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Inducible production-phase promoters for coordinated heterologous expression in yeast |
MX2019005701A (es) * | 2016-11-16 | 2019-10-07 | Univ Leland Stanford Junior | Sistemas y metodos para identificar y expresar agrupaciones de genes. |
CN110366594B (zh) * | 2016-12-16 | 2023-12-15 | 丹尼斯科美国公司 | 双功能磷酸转酮酶-磷酸转乙酰酶融合多肽 |
US11946087B2 (en) | 2017-01-25 | 2024-04-02 | Amyris Bio Products Portugal, Unipessoal, Lda | Co-production of a sesquiterpene and a carotenoid |
CN110431224A (zh) * | 2017-03-13 | 2019-11-08 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 锌双核簇转录调控因子缺陷型菌株 |
MX2019012940A (es) | 2017-05-03 | 2019-12-16 | Firmenich Incorporated | Metodos para producir edulcorantes de alta intensidad. |
EP3665292B1 (en) | 2017-08-07 | 2024-03-06 | Total Raffinage Chimie | Process for recovering isoprenoids produced by microorganisms |
WO2019030007A1 (en) | 2017-08-07 | 2019-02-14 | Total Raffinage Chimie | PROCESS FOR RECOVERING FERMENTATION PRODUCTS |
CN111655855A (zh) | 2017-09-14 | 2020-09-11 | 生命明疗法股份有限公司 | 人治疗靶标及其调节剂 |
EP3720944A1 (en) | 2017-12-07 | 2020-10-14 | Zymergen Inc. | Engineered biosynthetic pathways for production of (6e)-8-hydroxygeraniol by fermentation |
CN111868047A (zh) | 2017-12-21 | 2020-10-30 | 齐默尔根公司 | 荆芥内半缩醛氧化还原酶、荆芥内半缩醛合酶和能够产生荆芥内酯的微生物 |
US11447783B2 (en) | 2018-03-06 | 2022-09-20 | Danisco Us Inc. | Reduction in acetate production by yeast over-expressing PAB1 |
WO2019173217A1 (en) * | 2018-03-06 | 2019-09-12 | Danisco Us Inc | Compositions and methods for increasing ethanol production by yeast using gcy1 and dak1 |
MX2021000053A (es) | 2018-07-12 | 2021-03-25 | Amyris Inc | Metodos para controlar velocidades de alimentacion de la fermentacion. |
CN111378588A (zh) * | 2018-12-29 | 2020-07-07 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌及其应用 |
CA3138030A1 (en) * | 2019-05-08 | 2020-11-12 | Auxolytic Ltd | Auxotrophic selection methods |
WO2021022097A1 (en) * | 2019-08-01 | 2021-02-04 | Danisco Us Inc | Over-expression of adh5p for increased ethanol production by yeast |
CN110628806B (zh) * | 2019-09-23 | 2021-09-21 | 华南理工大学 | 一种高产β-紫罗兰酮基因工程菌及其构建方法和应用 |
CN111763662B (zh) * | 2019-11-29 | 2023-12-19 | 上海京新生物医药有限公司 | 酮还原酶及其在替格瑞洛中间体合成中的应用 |
CN112342163A (zh) * | 2020-11-13 | 2021-02-09 | 华中农业大学 | 一种伯克霍尔德菌及其应用 |
WO2022133188A1 (en) | 2020-12-17 | 2022-06-23 | Debut Biotechnology, Inc. | Dehydratase variants with improved specific activity for the production of pyruvate from glycerate |
JP2024500848A (ja) * | 2020-12-18 | 2024-01-10 | デビュー バイオテクノロジー, インコーポレイテッド | 無細胞製造システムにおけるグリセロールからのゲラニルピロリン酸の無細胞生成 |
CN113430215B (zh) * | 2021-06-03 | 2023-04-18 | 昆明理工大学 | 乙酰CoA合成酶基因RKACS1及其应用 |
CN114480158B (zh) * | 2021-09-15 | 2023-02-03 | 安徽农业大学 | 一种戊糖片球菌及其在棉酚降解中的应用 |
WO2023244843A1 (en) | 2022-06-16 | 2023-12-21 | Amyris, Inc. | HIGH pH METHODS AND COMPOSITIONS FOR CULTURING GENETICALLY MODIFIED HOST CELLS |
NL2032683B1 (en) * | 2022-07-18 | 2024-01-26 | Sestina Bio Llc | Bioproduction of isoprenoids |
CN115305226B (zh) * | 2022-09-22 | 2023-06-16 | 郑州轻工业大学 | 一株降解烟碱并产氢的抗辐射不动杆菌zj-22及其应用 |
CN116926092B (zh) * | 2022-10-28 | 2024-04-26 | 昆明理工大学 | 一种泛酸激酶基因RkPank及其应用 |
CN116064266A (zh) * | 2022-11-01 | 2023-05-05 | 四川大学 | 盐胁迫抗性增强的重组酿酒酵母菌及其构建方法与应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012098662A1 (ja) * | 2011-01-20 | 2012-07-26 | トヨタ自動車株式会社 | 組換え酵母及びこれを用いた物質生産方法 |
US20120276587A1 (en) * | 2011-04-29 | 2012-11-01 | Danisco Us Inc. | Recombinant microorganisms for enhanced production of mevalonate, isoprene, and isoprenoids |
EP2546336A1 (en) * | 2011-07-11 | 2013-01-16 | DSM IP Assets B.V. | Yeast strains that consume uronic acids and produce fermentation products such as ethanol |
Family Cites Families (36)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4703009A (en) | 1983-03-08 | 1987-10-27 | Merck & Co., Inc. | RDNA cloning vector pVE1, deletion and hybrid mutants and recombinant derivatives thereof products and processes |
DE3477936D1 (en) | 1983-03-08 | 1989-06-01 | Merck & Co Inc | Recombinant dna cloning vector pve1, deletion and hybrid mutants, and recombinant derivatives thereof, products and processes |
US5272065A (en) | 1983-10-20 | 1993-12-21 | Research Foundation Of State University Of New York | Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA |
US5672497A (en) | 1986-03-21 | 1997-09-30 | Eli Lilly And Company | Method for increasing the antibiotic-producing ability of antibiotic-producing microorganisms |
IL81892A (en) | 1986-03-21 | 1995-10-31 | Lilly Co Eli | Recombinant AND molecule containing a sequence encoding O-methyltransfer macrocin |
US5098837A (en) | 1988-06-07 | 1992-03-24 | Eli Lilly And Company | Macrolide biosynthetic genes for use in streptomyces and other organisms |
US5149638A (en) | 1988-09-29 | 1992-09-22 | Eli Lilly And Company | Tylosin biosynthetic genes tylA, tylB and tylI |
US5252474A (en) | 1989-03-31 | 1993-10-12 | Merck & Co., Inc. | Cloning genes from Streptomyces avermitilis for avermectin biosynthesis and the methods for their use |
US5824513A (en) | 1991-01-17 | 1998-10-20 | Abbott Laboratories | Recombinant DNA method for producing erythromycin analogs |
US6060234A (en) | 1991-01-17 | 2000-05-09 | Abbott Laboratories | Polyketide derivatives and recombinant methods for making same |
WO1993013663A1 (en) | 1992-01-17 | 1993-07-22 | Abbott Laboratories | Method of directing biosynthesis of specific polyketides |
CA2175461A1 (en) | 1993-11-02 | 1995-05-11 | Victor A. Vinci | Dna encoding triol polyketide synthase |
US5716849A (en) | 1994-06-08 | 1998-02-10 | Novartis Finance Corporation | Genes for the biosynthesis of soraphen |
CA2197160C (en) | 1996-02-22 | 2007-05-01 | Stanley Gene Burgett | Platenolide synthase gene |
CA2197524A1 (en) | 1996-02-22 | 1997-08-22 | Bradley Stuart Dehoff | Polyketide synthase genes |
DE69736673T2 (de) | 1996-08-20 | 2007-09-13 | Novartis Ag | Rifamycin biosynthese genkluster |
KR100674074B1 (ko) * | 1996-11-13 | 2007-01-26 | 이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니 | 재조합 유기체에 의한 글리세롤의 생산 방법 |
WO1999005283A2 (fr) | 1997-07-25 | 1999-02-04 | Hoechst Marion Roussel | Genes de biosynthese et de transfert des 6-desoxyhexoses chez saccharopolyspora erythraea et chez streptomyces antibioticus et leur utilisation |
US6090601A (en) | 1998-01-23 | 2000-07-18 | Kosan Bioscience | Sorangium polyketide synthase |
US6143526A (en) | 1998-03-09 | 2000-11-07 | Baltz; Richard H. | Biosynthetic genes for spinosyn insecticide production |
JP2002516090A (ja) | 1998-05-28 | 2002-06-04 | コーサン バイオサイエンシーズ, インコーポレイテッド | 組換えナルボノライドポリケチドシンターゼ |
NZ508326A (en) | 1998-06-18 | 2003-10-31 | Novartis Ag | A polyketide synthase and non ribosomal peptide synthase genes, isolated from a myxobacterium, necessary for synthesis of epothiones A and B |
US6265202B1 (en) | 1998-06-26 | 2001-07-24 | Regents Of The University Of Minnesota | DNA encoding methymycin and pikromycin |
NZ510819A (en) | 1998-10-02 | 2004-03-26 | Kosan Biosciences Inc | Polyketide synthase enzymes and recombinant DNA constructs therefor |
CA2347412A1 (en) | 1998-10-29 | 2000-05-11 | Kosan Biosciences, Inc. | Recombinant oleandolide polyketide synthase |
KR100716272B1 (ko) | 1998-11-20 | 2007-05-09 | 코산 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 | 에포틸론 및 에포틸론 유도체의 생산을 위한 재조합 방법 및 물질 |
US7192751B2 (en) | 2001-12-06 | 2007-03-20 | The Regents Of The University Of California | Biosynthesis of amorpha-4,11-diene |
US7253001B2 (en) | 2002-03-19 | 2007-08-07 | Forskarpatent I Syd Ab | Metabolic engineering for improved xylose utilisation of Saccharomyces cerevisiae |
BRPI0813710B1 (pt) | 2007-07-23 | 2018-10-09 | Dsm Ip Assets Bv | método de identificar um polipeptídeo heterólogo tendo atividade enzimática para converter piruvato, acetaldeído ou acetato em acetil-coa no citosol de uma célula de levedura, vetor para a expressão de polipeptídeos heterólogos em levedura, célula de levedura recombinante e método de produzir um produto de fermentação |
BRPI0922187B1 (pt) | 2008-11-19 | 2021-05-04 | Amyris, Inc | Métodos para gerar um polinucleotídeo e para gerar uma célula hospedeira |
JP4760951B2 (ja) | 2009-05-08 | 2011-08-31 | トヨタ自動車株式会社 | ブタノール生産能を有する組換え微生物及びブタノールの製造方法 |
MX352610B (es) | 2009-08-04 | 2017-11-30 | Evogene Ltd | Polinucleótidos y polipéptidos aislados, y métodos para utilizarlos para mejorar la tolerancia al estrés abiótico, rendimiento,tasa de crecimiento, vigor, biomasa, contenido de aceite y/o eficacia en el uso de nitrógeno de las plantas. |
JP5056897B2 (ja) | 2010-05-14 | 2012-10-24 | トヨタ自動車株式会社 | 2−ブタノールの製造方法及び2−ブタノール生産能を有する組換え微生物 |
US8871488B2 (en) | 2010-06-18 | 2014-10-28 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Recombinant host cells comprising phosphoketolases |
US8415136B1 (en) | 2011-11-09 | 2013-04-09 | Amyris, Inc. | Production of acetyl-coenzyme a derived isoprenoids |
US9163263B2 (en) * | 2012-05-02 | 2015-10-20 | The Goodyear Tire & Rubber Company | Identification of isoprene synthase variants with improved properties for the production of isoprene |
-
2014
- 2014-03-14 MX MX2015012365A patent/MX364748B/es active IP Right Grant
- 2014-03-14 CN CN201480025977.7A patent/CN105189772B/zh active Active
- 2014-03-14 ES ES14714149T patent/ES2721920T3/es active Active
- 2014-03-14 US US14/214,062 patent/US9410214B2/en active Active
- 2014-03-14 WO PCT/US2014/028421 patent/WO2014144135A2/en active Application Filing
- 2014-03-14 BR BR112015023089A patent/BR112015023089A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2014-03-14 AU AU2014227811A patent/AU2014227811C1/en active Active
- 2014-03-14 JP JP2016502782A patent/JP6595449B2/ja active Active
- 2014-03-14 CA CA2903053A patent/CA2903053C/en active Active
- 2014-03-14 MY MYPI2015703178A patent/MY171958A/en unknown
- 2014-03-14 KR KR1020157028637A patent/KR102159691B1/ko active IP Right Grant
- 2014-03-14 EP EP14714149.3A patent/EP2971027B1/en active Active
-
2015
- 2015-09-01 ZA ZA2015/06406A patent/ZA201506406B/en unknown
-
2019
- 2019-09-26 JP JP2019175333A patent/JP2019213558A/ja active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012098662A1 (ja) * | 2011-01-20 | 2012-07-26 | トヨタ自動車株式会社 | 組換え酵母及びこれを用いた物質生産方法 |
US20120276587A1 (en) * | 2011-04-29 | 2012-11-01 | Danisco Us Inc. | Recombinant microorganisms for enhanced production of mevalonate, isoprene, and isoprenoids |
EP2546336A1 (en) * | 2011-07-11 | 2013-01-16 | DSM IP Assets B.V. | Yeast strains that consume uronic acids and produce fermentation products such as ethanol |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018079619A1 (ja) * | 2016-10-28 | 2018-05-03 | 積水化学工業株式会社 | 組換え細胞、並びに、イソプレン又はテルペンの生産方法 |
JP2019041712A (ja) * | 2017-09-05 | 2019-03-22 | 株式会社デンソー | 組み換え体及びスクアレンの製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20150132310A (ko) | 2015-11-25 |
CA2903053A1 (en) | 2014-09-18 |
MX2015012365A (es) | 2016-04-15 |
ES2721920T3 (es) | 2019-08-06 |
JP2019213558A (ja) | 2019-12-19 |
US20140273144A1 (en) | 2014-09-18 |
AU2014227811C1 (en) | 2018-09-27 |
AU2014227811B2 (en) | 2018-03-22 |
WO2014144135A2 (en) | 2014-09-18 |
BR112015023089A2 (pt) | 2017-11-21 |
CN105189772A (zh) | 2015-12-23 |
CN105189772B (zh) | 2019-09-13 |
KR102159691B1 (ko) | 2020-09-24 |
JP6595449B2 (ja) | 2019-10-23 |
ZA201506406B (en) | 2017-01-25 |
US9410214B2 (en) | 2016-08-09 |
CA2903053C (en) | 2023-01-17 |
AU2014227811A1 (en) | 2015-09-24 |
EP2971027B1 (en) | 2019-01-30 |
MY171958A (en) | 2019-11-08 |
MX364748B (es) | 2019-05-06 |
WO2014144135A3 (en) | 2014-10-23 |
EP2971027A2 (en) | 2016-01-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6595449B2 (ja) | アセチル補酵素a由来化合物を生産するためのホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの使用 | |
US20210230234A1 (en) | Maltose dependent degrons, maltose-responsive promoters, stabilization constructs, and their use in production of non-catabolic compounds | |
JP6461208B2 (ja) | アセチル−補酵素a誘導イソプレノイドの生産 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170313 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170313 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180301 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20180531 |
|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20180531 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20180725 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20180727 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180711 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180903 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190115 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190412 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190828 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190926 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6595449 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |