CN114480158B - 一种戊糖片球菌及其在棉酚降解中的应用 - Google Patents

一种戊糖片球菌及其在棉酚降解中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种戊糖片球菌及其在棉酚降解中的应用，属于微生物菌株技术领域，所述的戊糖片球菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2021369；所述戊糖片球菌与过氧化氢酶协同作用用来降解棉籽饼粕中游离棉酚和结合棉酚。具体方法包括：在浓度为0U/L～9000U/L的过氧化氢酶水溶液中添加2%~4%的戊糖片球菌菌液，将过氧化氢酶水溶液和戊糖片球菌混匀，制成菌酶混合溶液；将菌酶混合溶液通过喷洒添加到粉碎后的棉籽饼粕中并混合均匀发酵后得到降解了游离棉酚和结合棉酚的棉籽饼粕。本发明提高棉籽饼粕在单胃动物和幼年反刍动物的使用比例，制作简单，可操作性强，成本低廉，效果明显。

Description

一种戊糖片球菌及其在棉酚降解中的应用
技术领域
本发明属于棉酚降解技术领域，具体涉及一种戊糖片球菌及其在棉酚降解中的应用。
背景技术
过氧化氢酶(catalase，CAT)是一种广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶，是由4个相同肽链亚基组成的四聚体血红素酶，具有保守的活化中心和铁血红蛋白结合位点，主要存在于过氧化氢酶体、乙醛酸循环体和细胞质中，部分分布于线粒体和叶绿体内。过氧化氢酶是在生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关键酶之一，主要功能是清除过量的过氧化氢对细胞起保护作用。棉酚(gossypol)是一种黄色多酚羟基双萘醛类化合物，为2.2′联二萘-8,8′二羟基醛-1,1′，6.6′7.7′六羟基-5,5′二异丙基-3-3′二甲基，分子量518.54。其主要存在于锦葵植物棉花的根、茎、叶和种子内，棉籽仁中含量最高。棉酚是锦葵科植物草棉、树棉或陆地棉成熟种子、根皮中提取的一种多元酚类物质，具有抑制精子发生和精子活动的作用。棉酚的化学结构由Adams等于1938年阐明，棉酚有两种光学异构体，先从棉簇植物中分离出消旋体，然后从桐棉植物中分离出右旋体，再从海岛棉提出左旋体。研究提示消旋棉酚对黑色素瘤细胞系SK-mel-19和SK-mel-28作用相等，IC50＝22μmol/L。左旋棉酚IC50＝4μmol/L，对细胞的敏感性是消旋棉酚的5倍多。右旋棉酚无生物活性，消旋棉酚的细胞杀伤作用可能在左旋的异构体部分，左旋棉酚效果好，毒副反应小。棉酚口服后仅部分被肾和小肠上皮吸收。吸收后大部分于胆汁分泌，其主要代谢场所是肝脏。同位素标记棉酚的生物半衰期为48小时，心、脾、肾、肾上腺、垂体、肌肉和睾丸等组织放射高峰见于4～9天。给药后1天，组织积贮总量为投入剂量的12.5％，此时除肠道内容物所含放射性最高外，各组织活性依次为：胃、肠道、肝、心、肾、脾、肺、血、肌肉、脂肪、睾丸和脑。我国棉籽饼粕年产量超出600万吨以上，但由于棉籽饼粕中棉酚的存在，致使这种高蛋白饲料未能物尽其用，特别是阻碍其在单胃动物中大量使用。棉酚包括结合棉酚和游离棉酚两种。游离棉酚进入动物体内后形成铁-棉酚和蛋白-棉酚化合物，是机体细胞，血管，神经性的毒物，最终危害动物的生长和生产，严重甚至会导致动物中毒死亡。过量结合棉酚也会给动物造成不良影响。如何给棉籽饼粕脱毒是影响其在单胃中或幼年反刍动物中使用的关键。传统棉籽饼粕脱毒主要是借助一些物理或化学方法来使棉粕的毒性降低。物理脱毒法是利用热处理、高温膨化或机溶剂萃取等方法来消除棉籽饼粕中游离棉酚。化学脱毒法是使用化学脱毒剂，使游离棉酚与脱毒剂反应生成不被动物体吸收或是无毒的化合物来达到脱毒的目的。但这些传统的脱毒方法在脱毒同时也破坏了棉籽饼粕中大量的营养成分，生产成本高，环境污染大，同时会生成大量结合棉酚。但生物发酵棉籽饼粕脱毒的方法却既可以降解游离棉酚又可以降解结合棉酚，避免了上述传统脱毒方法带来的弊端，同时提高发酵后棉籽饼粕的营养成分。微生物发酵脱毒法是我国从事棉籽饼粕脱毒研究方面的独特方法，处于国际领先地位，国外相关报道极少。生物发酵法就是将特定微生物接种到棉籽饼粕培养基中，在一定的条件下利用微生物在棉籽饼粕中的生长繁殖和新陈代谢，棉酚被降解从而达到脱毒的目的。但棉酚与微生物接触时，产生大量过氧化物，破坏微生物的细胞膜通透性，致使细胞内容物流出，从而影响微生物在含有棉酚培养基中的存活和繁殖，进而影响微生物对棉酚的降解及利用效果。但研究表明过氧化氢酶可缓解过氧化物的毒性，保护微生物的细胞膜，降低棉酚对微生物的损伤，利用过氧化氢酶和微生物协同作用，可以提高微生物降解棉酚的效果。因此应用过氧化氢酶和微生物协同降解棉籽饼粕中棉酚提高微生物降解棉酚的效果成为急需解决的一大难题。
发明内容
本发明的目的提供一种戊糖片球菌，该菌株为圆形菌落，乳白色，光滑，凸起，边缘整齐，不透明，革兰氏阳性，片球菌。最适生长温度37℃，最高生长温度45-47℃。
该菌株从牛瘤胃中筛选得到的，不但可以降解游离棉酚还可以降解结合棉酚的戊糖片球菌，已于2021年4月20日保藏于在中国典型培养物保藏中心，该戊糖片球菌的保藏号为：CCTCC No：M2021369，拉丁名：Pediococcus pentosaceus，地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，电话：027-68754052。其菌落状态和革兰氏染色图见图1和图2。
本发明还提供了一种降解棉籽饼粕中游离棉酚和结合棉酚的方法，包括以下步骤：
(1)在浓度为0U/L～9000U/L的过氧化氢酶水溶液中添加2％～4％的戊糖片球菌菌液，将过氧化氢酶水溶液和戊糖片球菌混匀，制成菌酶混合溶液；
(2)将菌酶混合溶液通过喷洒添加到粉碎后的棉籽饼粕中并混合均匀，在10～35℃的条件下发酵5～15天，得到降解了游离棉酚和结合棉酚的棉籽饼粕。
其中，在1～5分钟内将所述过氧化氢酶水溶液和戊糖片球菌混匀。
其中，所述菌酶混合溶液和棉籽饼粕的添加比例为1:5～5:5。
其中，戊糖片球菌的保藏号为：CCTCC No：M2021369。
有益效果
本发明团队从动物肠道中首次筛选得到一株不但可以降解游离棉酚还可以降解结合棉酚的戊糖片球菌，现保存在中国典型培养物保藏中心(菌株保藏号：CCTCC No：M2021369)。戊糖片球菌属于乳酸菌，是一类对人体、动物体有益的细菌，其被广泛应用于生物工程、食品安全以及生命健康领域。
本发明团队首次发现该菌可以对棉籽饼粕中的棉酚进行降解，同时利用过氧化氢酶协同保护该菌不受棉籽饼粕中棉酚损伤，极大提高该戊糖片球菌对棉酚降解的效果。该菌在对棉籽饼粕发酵过程中不但降解了游离棉酚和结合棉酚，同时将棉籽饼粕中的蛋白质降解为动物可快速吸收利用的酸溶蛋白，丰富了棉籽饼粕中酸溶蛋白、乳酸和益生菌等营养物质，利用乳酸的酸甜口味改善发酵棉粕适口性并刺激动物采食量，提高棉籽饼粕在单胃动物和幼年反刍动物的使用比例。最终达到应用过氧化氢酶和戊糖片球菌协同降解棉籽饼粕中棉酚提高微生物降解棉酚的效果的目的。
本发明使用戊糖片球菌对棉籽饼粕中的游离棉酚和结合棉酚进行降解，同时利用过氧化氢酶降低戊糖片球菌受损程度，极大提高戊糖片球菌对棉酚降解的效果。棉酚降解菌在对棉籽饼粕发酵过程中不但降解了游离棉酚和结合棉酚，同时将棉籽饼粕中的蛋白质降解为动物可快速吸收利用的酸溶蛋白，丰富了棉籽饼粕中酸溶蛋白、乳酸和益生菌等营养物质，改善发酵棉粕适口性并刺激动物采食量，提高棉籽饼粕在单胃动物和幼年反刍动物的使用比例。本发明制作简单，可操作性强，成本低廉，效果明显。
附图说明
图1为本发明戊糖片球菌的菌落形态图。
图2为本发明戊糖片球菌革兰氏染色图。
图3为本发明实施例2的棉酚降解数据图。
图4为本发明实施例3的棉酚降解数据图。
图5为本发明实施例4的棉酚降解数据图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明进行详细说明。所有方法及技术，如无特别说明，均为常规方法和技术。
本发明中，各指标的检测方法如下：粗蛋白(CP):GB/T 6432-94；酸溶蛋白(TCA-N)：NY/T 3801-2020；乳酸(LA):GB 5009.157-2016；游离棉酚(FG):ISO 6866-1985；结合棉酚(BG)：ISO 6866-1985。
实施例1
本实施例提供一种戊糖片球菌，已经于2021年4月20日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC No：M2021369。该菌株为圆形菌落，乳白色，光滑，凸起，边缘整齐，不透明，革兰氏阳性，片球菌。最适生长温度37℃，最高生长温度45-47℃。保藏中心的地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，电话：027-68754052。
实施例2
本实施例提供一种利用戊糖片球菌降解棉籽粕中游离棉酚和结合棉酚的方法，具体步骤如下：
(1)在500升干净水中加入酶活为20万U/g的过氧化氢酶12.5克，得到过氧化氢酶浓度为5000U/L的水酶混合溶液，在上述水酶混合溶液中按照体积比添加4％戊糖片球菌菌液混匀，得到菌酶混合溶液。其中，戊糖片球菌菌液的菌落数在1.6～2.0*10^9cfu/mL之间。
(2)将上述500升菌酶混合溶液喷洒到1000公斤棉籽饼粕中，混合均匀后装袋密封发酵，得到戊糖片球菌、过氧化氢酶、水和棉籽饼粕混合物，并将其放置在30℃的条件下发酵5天，处理完成后取出，得到降解了游离棉酚和结合棉酚的棉籽粕。
检测本实施例棉籽粕中的游离棉酚降解率达到83.3％，结合棉酚降解率达58％，其他营养成分含量变化测定结果如图3所示，结果见下表。其中，对照组是经过纯净水处理后存放相同时间的棉籽饼粕的各项数据，菌组为只采用本发明保藏的戊糖片球菌菌液处理，酶组是只采用过氧化氢酶处理，菌酶組为本实施例。
CP TCA-N FG BG LA
对照组 42.23 3.17 0.48 1.93 0.09
菌组 42.96 6.48 0.23 1.28 0.21
酶组 42.51 6.13 0.31 1.67 0.14
菌酶组 43.05 14.83 0.08 0.81 0.39
实施例3
(1)在500升干净水中加入酶活为20万U/g的过氧化氢酶10克，可得到过氧化氢酶浓度为4000U/L的水酶混合溶液，在上述水酶混合溶液中按照体积比添加3％戊糖片球菌菌液混匀，得到菌酶混合溶液。其中，戊糖片球菌菌液的菌落数在2.7～3.2*10^9cfu/mL之间。
(2)将上述500升菌酶混合溶液喷洒到1000公斤棉籽饼粕中，混合均匀后装袋密封发酵，得到戊糖片球菌、过氧化氢酶、水和棉籽饼粕混合物，并将其放置在20℃的条件下发酵10天，处理完成后取出，得到降解了游离棉酚和结合棉酚的棉籽粕。
检测本实施例棉籽粕中的游离棉酚降解率达到81.25％，结合棉酚降解率达55.6％，其他营养成分含量变化测定结果如图4所示，结果见下表。其中，对照组是经过纯净水处理后存放相同时间的棉籽饼粕的各项数据，菌组为只采用本发明保藏的戊糖片球菌菌液处理，酶组是只采用过氧化氢酶处理，菌酶組为本实施例。
CP TCA-N FG BG LA
对照组 42.23 3.17 0.48 1.93 0.09
菌组 42.83 6.41 0.24 1.37 0.18
酶组 41.76 6.13 0.34 1.75 0.14
菌酶组 42.96 14.41 0.09 0.85 0.36
实施例4
(1)在500升干净水中加入酶活为20万U/g的过氧化氢酶7.5克，可得到过氧化氢酶浓度为3000U/L的水酶混合溶液，在上述水酶混合溶液中按照体积比添加2％戊糖片球菌菌液混匀，得到菌酶混合溶液。其中，戊糖片球菌菌液1.0～1.4*10^9cfu/mL。经过测试，只要戊糖片球菌菌液中的菌落数大于等于1*10^9cfu/mL，均可以实施本发明。
(2)将上述500升菌酶混合溶液喷洒到1000公斤棉籽饼粕中，混合均匀后装袋密封发酵，得到戊糖片球菌、过氧化氢酶、水和棉籽饼粕混合物，并将其放置在10℃的条件下发酵处理15天，处理完成后取出，得到降解了游离棉酚和结合棉酚的棉籽粕。
检测本实施例棉籽粕中的游离棉酚降解率达到77％，结合棉酚降解率达54.4％，其他营养成分含量变化测定结果如图5所示，结果见下表。其中，对照组是经过纯净水处理后存放相同时间的棉籽饼粕的各项数据，菌组为只采用本发明保藏的戊糖片球菌菌液处理，酶组是只采用过氧化氢酶处理，菌酶組为本实施例。
CP TCA-N FG BG LA
对照组 42.23 3.17 0.48 1.93 0.09
菌组 42.81 6.37 0.2 1.35 0.19
酶组 41.58 6.01 0.3 1.71 0.15
菌酶组 42.94 13.46 0.11 0.88 0.37
实施例5
(1)在500L纯净水中按照体积比添加2％戊糖片球菌菌液混匀，得到戊糖片球菌溶液。其中，戊糖片球菌菌液浓度大于1*10^9cfu/mL。
(2)将上述500升戊糖片球菌溶液喷洒到1000公斤棉籽饼粕中，混合均匀后装袋密封发酵，得到戊糖片球菌、水和棉籽饼粕混合物，并将其放置在30℃的条件下发酵处理15天，处理完成后取出，得到降解了游离棉酚和结合棉酚的棉籽粕。
检测本实施例棉籽粕中的游离棉酚降解率在列表中的菌组，其降解率在50-58.3％之间，结合棉酚降解率在29～33.67％之间。

Claims (7)

1.一种戊糖片球菌，其特征在于：所述戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC No:M 2021369。
2.一种权利要求1所述的戊糖片球菌的用途，其特征在于：所述戊糖片球菌用于降解棉籽饼粕中游离棉酚和结合棉酚。
3.一种权利要求2所述的戊糖片球菌的用途，其特征在于：所述戊糖片球菌与过氧化氢酶协同作用降解棉籽饼粕中游离棉酚和结合棉酚。
4.一种降解棉籽饼粕中游离棉酚和结合棉酚的方法，其特征在于，包括以下步骤 ：
（1）在浓度为3000U/L～9000U/L的过氧化氢酶水溶液中添加戊糖片球菌菌液，混匀，制成菌酶混合溶液；所述戊糖片球菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC No:M 2021369；所述戊糖片球菌菌液浓度大于1×10^9 cfu/mL；
（2）将菌酶混合溶液均匀添加到粉碎后的棉籽饼粕中，发酵后得到低游离棉酚和结合棉酚的棉籽饼粕。
5.根据权利要求4所述的降解棉籽饼粕中游离棉酚和结合棉酚的方法，其特征在于，所述戊糖片球菌菌液的添加量按照体积比为：2%~4%。
6.根据权利要求4所述的降解棉籽饼粕中游离棉酚和结合棉酚的方法，其特征在于，所述将菌酶混合溶液均匀添加到粉碎后的棉籽饼粕中，发酵的具体条件为：在10～35℃的条件下发酵5~15 天。
7.根据权利要求4所述的降解棉籽饼粕中游离棉酚和结合棉酚的方法，其特征在于，在1~5分钟内将所述过氧化氢酶水溶液和戊糖片球菌混匀。
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