CN104328063A - 一株来源于反刍动物瘤胃的棉酚降解菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物领域，尤其是一株来源于反刍动物瘤胃的棉酚降解菌株及其应用，该菌株于2013年8月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.8069。本发明以棉酚为唯一碳源，从反刍动物瘤胃中分离，筛选，纯化和培育出对棉酚具有较高降解活性的新菌株，经形态学及分子生物学鉴定，确定菌株RBS为枯草杆菌属(Bacillus subtilis)，与Bacillus tequilensis strain KM34同源性98％。该菌株来源于活体反刍动物瘤胃，避开了土壤或其他自然环境来源微生物毒理的不确定性，小鼠毒理试验表明该菌不具有毒性。液态发酵降解棉酚率达94.74％，使用该菌种发酵棉粕，液相色谱(HPLC)测定其发酵后棉粕中游离棉酚降解率达到近80％。

Description

一株来源于反刍动物瘤胃的棉酚降解菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，尤其是一株来源于反刍动物瘤胃的棉酚降解菌株及其应用。 

背景技术

随着畜牧业的发展，我国蛋白饲料的缺口日趋严峻。为此，需通过开发非常规性蛋白质饲料解决。棉粕因其蛋白含量达到44％而成为关注对象，其蛋白含量仅次于豆粕，我国每年棉粕产量约800万吨，占国内蛋白饲料产量11％左右，但由于棉粕中抗营养因子的存在，特别是游离棉酚影响了其在单胃动物饲养中的广泛使用。 

棉酚(Gossypol)，俗称棉毒素，是锦葵科棉属植物色素腺体产生的多酚二萘衍生物，主要存在于棉花的根、茎、和籽实中。棉酚在棉粕中以结合和游离两种形式存在，结合棉酚是指棉酚与氨基酸或其他物质的结合物，在动物体内不易被消化道吸收，可忽略其毒性。游离棉酚是指具有活性羟基和活性醛基棉酚这些含有活性基团的棉酚进入动物体内后形成铁-棉酚和蛋白-棉酚化合物，是机体细胞，血管，神经性的毒物，最终危害动物的生产和生长，严重甚至会导致动物中毒死亡。 

目前市场上脱毒工艺多样，采用生物、物理、化学、水洗等方法的棉籽脱毒工艺相对于传统工艺，脱毒效果不佳，而且成本太大，无法在饲料工业及养殖业中普遍应用，未脱毒棉籽饼粕依然是主要的棉籽饼粕来源，存在安全风险。 

为此，解决棉粕中游离棉酚问题是利用棉粕作为蛋白质饲料的根本所 在。动物营养与饲料科学家正寻求能降低棉粕棉酚的毒性，以提高棉粕在单胃动物中的使用，使用生物方法降解棉酚是目前很热门的研究方向之一。 

自然环境中，如土壤中存在可以降解棉酚的微生物，但来源于土壤的微生物大部分不能确定其毒性，一般不能直接作为动物饲料添加剂使用。 

棉籽饼粕在反刍动物饲料中应用最为广泛，主要是由于反刍动物瘤胃内微生物的存在，微生物将棉粕中的游离棉酚转化为无毒的代谢物。但是虽然反刍动物瘤胃具有解毒作用，使得游离棉酚对反刍动物的毒性较单胃动物小很多，反刍动物饲喂棉籽饼粕依然存在安全风险，生产实践中也时常发生反刍动物棉酚中毒的例子。湖北省某奶牛场1991年春购回大批未脱壳、未去毒处理的棉籽饼，将乳牛混合饲料内的棉籽饼的比例由15％增加到20％，饲喂40天使出生2～5天的犊牛发生棉籽饼中毒8例，死亡5例；黄克和等对上海及安徽省的全椒、和县、来安和江苏省的南通、海安、如东、海门、泅洪等地调查发现，这些地区均有因饲喂棉籽饼而引起尿石症的病例。饲喂棉饼引起尿石症的机理可能是因肾脏受棉酚的毒害发生炎症，引起代谢障碍，从而为磷酸盐的沉积提供了条件。一般认为，棉酚对反刍动物有毒性，虽然在瘤胃内的游离棉酚能与可溶性蛋白结合，减少进入肠道的游离棉酚，但仍有63％的棉酚通过瘤胃，结合的棉酚在十二指肠又被释放，这就有可能使反刍动物摄入的棉酚像单胃动物一样被吸收。 

欧盟对反刍动物日粮中游离棉酚允许量，其成年牛、山羊、绵羊≤500mg/kg，犊牛≤100mg/kg，其他不含棉籽饼粕饲料和配合饲料120mg/kg。美国针对反刍动物游离棉酚限量有着更详细的规定：日粮中游离棉酚含量0～3周龄时为100mg/kg，3～24周龄时为200mg/kg，大于24周龄时母畜为600mg/kg，育种公畜为200mg/kg。 

所以本试验通过在反刍动物瘤胃中筛选菌种、选育，以期得到棉酚降解率更高的无毒菌株，为棉籽饼粕的广泛安全使用提供基础，为单胃动物及反刍动物的蛋白质饲料开辟新的来源。 

发明内容

为克服现有技术的不足之处，本发明提供一株安全无毒、能够充分降解棉酚的棉酚降解菌株(枯草杆菌属，Bacillus subtilis)，本发明另一目的是提供该棉酚降解菌株的应用。 

本发明所采用的技术方案是：本发明所述的棉酚降解菌RBS，该菌株于2013年8月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.8069。 

所述棉酚降解菌RBS系从反刍动物瘤胃中分离，筛选，纯化和培育出来，经形态学及分子生物学鉴定，确定该菌株为枯草杆菌属，与Bacillus te-quilensis strain KM34同源性98％。 

所述棉酚降解菌RBS主要形态学特性为：菌落粗糙，污白色，中心起褶皱，不易挑起；形状不规则，有花瓣形，有近圆形；菌落正反面，中间边缘颜色质地不一致。 

有益效果：本发明以棉酚为唯一碳源，从反刍动物瘤胃中中分离筛选对棉酚具有降解作用的菌株，避开了土壤微生物来源的毒理不确定性，得到具有较高降解活性的菌株RBS，所述棉酚降解菌RBS在实验室三角瓶培养条件下，对棉粕进行固态发酵，液相色谱(HPLC)测定发酵后棉粕中的游离棉酚降解率达到近85.25％，该菌液态发酵，确定其对棉酚降解率达到94.74％。虽然该菌株来源于活体反刍动物瘤胃，避开了土壤或其他自然环境来源微生物毒理的不确定性，但为确保RBS菌株能在生产中应用，本试验同时对该菌进行小鼠毒理试验，结果表明该菌不具有毒性(如图8、9所示)，属于安全菌株。 

附图说明

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。 

图1A为棉酚降解细菌RBS菌落形态特征； 

图1B为棉酚降解细菌RBS显微镜形态特征； 

图1C为棉酚降解细菌RBS电子显微镜形态特征； 

图2棉酚降解菌RBS的PCR产物电泳图谱； 

图3为棉酚降解菌RBS16S序列； 

图4为棉酚降解菌RBS的16S rDNA序列系统发育树； 

图5为棉酚含量标准曲线； 

图6为液态发酵中棉酚降解菌RBS的生物量与棉酚降解率； 

图7A为棉粕发酵前游离棉酚含量色谱图； 

图7B为棉粕发酵后游离棉酚含量色谱图； 

图7C为棉粕发酵前后棉粕中游离棉酚含量； 

图8为棉酚降解菌RBS的毒理实验报告第一页； 

图9为棉酚降解菌RBS的毒理实验报告第二页。 

具体实施方式：

1.材料与方法 

1.1材料 

瘤胃液取自于牛的胃液。LB培养基，无碳基础培养基，无氮基础培养基，棉酚基础培养基在无碳培养基灭菌后，无菌条件下加入适量醋酸棉酚。 

1.2方法 

1.2.1菌种筛选 

从动物瘤胃中取样，将1g左右样品在dd H2O中稀释，涂布在含有醋酸棉酚基础培养基平板上，39℃恒温培养24h。挑取单菌落，液体培养基中进一步分离，并在含有0.2％醋酸棉酚的无碳基础培养基平板上反复筛选，直至菌落形态均一保种备用。 

1.2.2形态学鉴定 

采用稀释平板法，培养适当时间获得单菌落，观察其菌落特征。再用平板划线法培养6h后，通过革兰氏染色，16×100倍显微镜下观察。 

1.2.3分子生物学鉴定 

1.2.3.1细菌基因组DNA的提取 

采用SDS蛋白酶K法，具体步骤如下： 

1)取1.5mL菌液，10000g离心1min，弃上清。 

2)加40μL溶菌酶，80μL无菌水，涡旋振荡混匀，37℃水浴30min。 

3)加150μL10％的SDS溶液，70μL10mg·mL-1蛋白酶K，37℃水浴30min。 

4)转入75℃水浴5min，加入5mol·L-1醋酸钾溶液0.3mL，混匀，冰上放置30min，并不时混匀。 

5)10000g离心10min，将上清转入一干净无菌离心管，弃沉淀，重复操作。 

6)将上清转入另一干净无菌离心管，加入两倍体积的无水乙醇，10000g离心10min，加40μL TE缓冲液溶解。 

1.2.3.2 16S rDNA的扩增 

PCR扩增，产物割胶回收，与pMD19-T Vecter连接及转化参考。 

1.2.3.3菌落PCR鉴定参照 

1.2.3.4 16S rDNA序列测定与分析 

菌落PCR阳性菌落转接到LB液体培养基，37℃培养12-15h后，送上海生工进行测序，将测序结果用bioedit去除载体序列后，登陆NCBI，应用Blast-N软件进行同源搜索，并利用MEGA5.1建立同源对比进化树。 

1.2.4棉酚含量标准曲线绘制-间苯三酚法 

(1)棉酚标准容液的制备精密称取0.0050g棉酚纯品，用70％丙酮溶液溶解，并定容到50mL，此溶液相当于每毫升含棉酚0.1mg。 

(2)显色剂配制：用100mL量筒量取16.6mL浓盐酸(12.0mol·L-1)，加95％乙醇至100mL刻度，倒入100mL三角瓶中，摇匀，再加入1g间苯三酚，溶解后混合置于棕色瓶中放入冰箱备用。 

(3)标准曲线的绘制：精密吸取0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL棉酚标准液并依次编号为1-10号放入10mL试管中，再依次分别加入1mL、0.9mL、0.8mL、0.7mL、0.6mL、0.5mL、0.4mL、0.3mL、0.2mL的70％丙酮溶液，各试管中再加入2mL的显色剂，摇匀，在55℃恒温水浴箱中加热5min，用70％丙酮溶液调零，在550nm波长处测定吸光度值。 

1.2.5生物量及降解率测定 

将一环菌接于100mL的LB培养基中，培养8h后作为种子液(冰箱保存)。取1mL种子液接入盛有40mL无碳基础培养基(以0.2％醋酸棉酚为碳源)的容量为150mL三角瓶中，39℃，150r·min-1振荡培养，再12h后将另一组相同处理，两组都每隔2h从中取出100μL样品，涂于LB平板，再无菌水稀释10倍，涂于LB平板，各连续测定12h，37℃培养箱中培养24h后观察菌落数，将两组数据连起来绘制生长曲线。 

同时在每次取样时取出300μL样品，取样时，确保摇匀，并用枪头尖已剪掉的枪头，使取样尽量均匀。平行取3组样品，各加入700μL丙酮，各加入2mL的显色剂，摇匀，在55℃恒温水浴箱中加热5min，用70％丙酮溶液调零，在550nm波长处测定吸光度值。记录并根据棉酚标准曲线计算降解率，绘制降解率变化图。 

2.结果 

2.1形态学鉴定 

如图1A所示，菌落粗糙，污白色，中心起褶皱，不易挑起。形状不规则，有花瓣形，有近圆形。菌落正反面，中间边缘颜色质地不一致。如图1B所示，培养6h，革兰氏染色程紫色，为革兰氏阳性菌，菌体呈杆状。图1C为棉酚 降解细菌RBS电子显微镜形态特征。根据《伯杰细菌鉴定手册》第九版，鉴定与枯草芽孢杆菌属菌株形态相似。 

2.2分子生物学鉴定 

2.2.1基因组提取及PCR扩增结果 

棉酚降解菌BS-1采用SDS蛋白酶K法提取效果较好，片段在23kb左右，质量较好，可以满足PCR扩增要求。PCR扩增产物电泳结果如图2所示，有一条大小约为1500bp的条带，与预期扩增大小一致。 

2.2.2序列分析 

如图3所示，所获得的棉酚降解菌16S rDNA序列经测序后，与NCBI中相关数据库进行相似性分析。其系统发育树参见图4，结果显示，RBS与Bacillus tequilensis strain KM34同源性98％，推定BS-1属于枯草芽孢杆菌。分子生物学鉴定结果与形态学观察结果一致。 

2.2.3棉酚标准曲线 

根据棉酚含量与吸光度值进行回归计算，得y＝17.520x+0.0068，并绘制标准曲线，如图5所示。R2＝0.9988，比较可信。 

2.3.4生物量与降解率 

如图6所示，在棉酚液体培养基中，随着菌体生物量的增加，降解率也不断升高。在对数生长期菌体生物量增长最快，降解率也增加最快；而随着生物量的减少，降解率增加速度变慢。生物量与降解率关系密切，最初40mL棉酚培养基中加入的80mg棉酚，培养24h后棉酚含量为11.8mg，即该菌株24h的棉酚最大降解率达94.7％。 

如图7A、图7B和图7C所示，液相色谱(HPLC)测定所述菌株发酵后棉粕中游离棉酚降解率达到近80％。 

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行 多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。 

Claims (3)

1.棉酚降解菌RBS，该菌株于2013年8月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.8069。 

2.根据权利要求1所述的棉酚降解菌RBS在生物降解游离棉酚中的应用。 

3.根据权利要求1所述的棉酚降解菌RBS在降低棉籽粕的游离棉酚含量中的应用。