CN110100963B - 一种甘蔗尾叶的青贮方法 - Google Patents

一种甘蔗尾叶的青贮方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110100963B
CN110100963B CN201910366868.6A CN201910366868A CN110100963B CN 110100963 B CN110100963 B CN 110100963B CN 201910366868 A CN201910366868 A CN 201910366868A CN 110100963 B CN110100963 B CN 110100963B
Authority
CN
China
Prior art keywords
lactobacillus plantarum
aspergillus oryzae
ensiling
silage
aerobic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910366868.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110100963A (zh
Inventor
何仁春
周俊华
王启芝
邹彩霞
周志扬
罗鲜青
黄丽霞
梁琪妹
黄香
唐承明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangxi Zhuang Autonomous Region Institute of Animal Husbandry
Original Assignee
Guangxi Zhuang Autonomous Region Institute of Animal Husbandry
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangxi Zhuang Autonomous Region Institute of Animal Husbandry filed Critical Guangxi Zhuang Autonomous Region Institute of Animal Husbandry
Priority to CN201910366868.6A priority Critical patent/CN110100963B/zh
Publication of CN110100963A publication Critical patent/CN110100963A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110100963B publication Critical patent/CN110100963B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K30/00—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs
    • A23K30/10—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder
    • A23K30/15—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder using chemicals or microorganisms for ensilaging
    • A23K30/18—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder using chemicals or microorganisms for ensilaging using microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/02—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C12R2001/69—Aspergillus oryzae
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
    • Y02P60/80—Food processing, e.g. use of renewable energies or variable speed drives in handling, conveying or stacking
    • Y02P60/87—Re-use of by-products of food processing for fodder production

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及一种甘蔗尾叶的青贮方法，步骤包括有氧青贮发酵处理和厌氧青贮发酵处理；S1有氧青贮发酵处理：将新鲜甘蔗尾叶使用米曲霉XMS01进行有氧发酵1‑5天；S2厌氧青贮发酵处理：将经过有氧青贮发酵处理后的甘蔗尾叶使用植物乳杆菌XMS02和植物乳杆菌XMS03进行厌氧青贮发酵处理38‑48天，即可。本发明的优点：第一段喷洒米曲霉(XMS01)进行有氧发酵，积累许多种非淀粉多糖酶并实现萎焉青贮原料水分含量降低；第二段使用喷洒植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)厌氧青贮，促进发酵速度、降低青贮饲料的pH，同时利用有氧发酵阶段所积累的酶，达到提高甘蔗尾叶青贮品质。

Description

一种甘蔗尾叶的青贮方法
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种甘蔗尾叶的青贮方法。
背景技术
甘蔗是禾本科植物，是常见的温带和热带经济作物。甘蔗在广西的种植量已有相当大的规模，种植面积已达1400万亩。甘蔗尾叶是甘蔗收获后的废弃物，一般占甘蔗植株重量的 12-21％，利用率却达不到产量的20％。在我国热带地区，冬季饲料短缺，合理贮存加工的甘蔗尾叶能有效解决我国热带地区牧草、饲料不足的问题，促进热带地区畜牧业的发展。
青贮是一种保存粗饲料既经济又简便的方法，一般青贮后的粗饲料营养价值提高，保存时间长，提高了动物的适口性与消化率。但目前甘蔗尾叶的处理方法中公开也较多，但是甘蔗尾叶青贮品质的营养价值并未得到高效利用。本试验旨在研究处一种新的处理方案能够提高甘蔗尾叶青贮品质，为进一步提高甘蔗尾叶的利用率提供理论依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种甘蔗尾叶的青贮方法。本发明通过本研究室自主研发的米曲霉 (XMS01)先进行有氧发酵，能够积累多种非淀粉多糖酶，同时实现萎焉使青贮原料的水分含量降低；第二段以本研究室自主研发的植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)进行厌氧青贮，能有效的促进发酵速度、降低青贮饲料的pH值，同时利用有氧发酵阶段所积累的酶，从而达到提高甘蔗尾叶青贮品质。
本发明的发明内容：
一种甘蔗尾叶的青贮方法，步骤包括有氧青贮发酵处理和厌氧青贮发酵处理；
S1有氧青贮发酵处理：将新鲜甘蔗尾叶使用米曲霉(Aspergillus oryzae)XMS01进行有氧发酵1-5天；
S2厌氧青贮发酵处理：将经过有氧青贮发酵处理后的甘蔗尾叶使用植物乳杆菌XMS02 和植物乳杆菌XMS03进行厌氧青贮发酵处理38-48天，即可。
进一步说明，所述米曲霉(Aspergillus oryzae)XMS01，CCTCC NO：M 2018425；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学；中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年07月02日。
进一步说明，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XMS02，CCTCC NO：M2019002；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学；中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2019年01月 02日。
进一步说明，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XMS03，CCTCC NO：M2019003；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学；中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2019年01月 02日。
进一步说明，所述米曲霉(Aspergillus oryzae)XMS01在进行有氧青贮发酵处理前需要进行接种液制备具体方法是：使用高盐察氏培养基进行平面培养基活化处理，再采用MRS培养基配置好后高温灭菌30min，冷却至室温，按3％接种量接种米曲霉(Aspergillusoryzae)XMS01，拌后放置培养箱中培养2-3天，温度控制在37℃；
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XMS02和所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XMS03MRS在进行厌氧青贮发酵处理前需要进行接种液制备具体方法是：使用高盐察氏培养基进行平面培养基活化处理，再采用MRS培养基配置好后灭菌30min，冷却至室温，按3％接种量分别接种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XMS02、植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)XMS03MRS，摇拌后，温度控制在37℃、于二氧化碳培养箱中24 小时。
进一步说明，所述米曲霉(Aspergillus oryzae)XMS01进行有氧发酵可以高产非淀粉多糖酶；所述非淀粉多糖酶为木聚糖酶、β-葡聚糖和纤维素酶中的一种或一种以上的混合物；所述米曲霉(Aspergillus oryzae)XMS01经过发酵后上清液中木聚糖酶酶活200U/ml-250.6U/ml，β- 葡聚糖酶活46U/ml-67.0U/ml，纤维素酶酶活59.3U/ml-67.9U/ml。
进一步说明，所述青贮方法在有氧处理的步骤前还包括以下步骤：
1)原料收集：以甘蔗收获后的新鲜甘蔗尾为原料；
2)原料切碎：将新鲜甘蔗尾切碎至2-3cm备用；
所述青贮方法在厌氧处理的步骤后还包括以下步骤：
1)产品检测：发酵完成后现场依据中国现场感观评定进行感观评定并依据国内评定品质评定的得分，筛选出总得分达到良，品质评定达到优，有氧稳定性达到100小时以上的青贮甘蔗尾叶评定为合格青贮甘蔗尾叶；
2)保存：将上述得到的合格青贮甘蔗尾叶，密封保存，备用。
进一步说明，所述有氧青贮发酵处理的具体方法是将米曲霉XMS01喷洒在切碎的新鲜甘蔗尾叶上，使新鲜甘蔗尾叶中米曲霉XMS01含量不低于2.631×106cfu/g，将均匀喷洒有该米曲霉的新鲜甘蔗尾叶平铺于无其他杂菌污染的地面，有氧发酵1-5天；
所述厌氧青贮发酵处理的具体方法是：经有氧发酵的甘蔗尾叶，均匀喷洒植物乳杆菌 XMS02、植物乳杆菌XMS03，使甘蔗尾叶植物乳杆菌XMS02、植物乳杆菌XMS03含量分别不低于1.1×106cfu/g、1.3×106cfu/g，然后填充到密闭容器中，确保密度达到0.45kg/L以上，盖好盖子，再用封口膜密封；在23℃-27℃的温度条件下进行厌氧青贮发酵处理38-48天，即可。
命名为米曲霉(Aspergillus oryzae)XMS01，该菌株在PDA培养基生长良好；菌落生长较快，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿色；分生孢子头放射状，也有少数为疏松柱状，在pH4-6.5、20℃-30℃的环境下都能够生长。出发菌株是本实验室保存的一株米曲霉菌，出发菌株米曲霉发酵上清液中木聚糖酶酶活40.2u/mL，β-葡聚糖酶活12.4u/mL，纤维素酶酶活16.3u/mL。本发明的米曲霉(Aspergillus oryzae)XMS01经过摇瓶发酵的上清液中木聚糖酶酶活200U/ml，比出发菌株提高了397.5％，β-葡聚糖酶活46U/ml，比出发菌株提高了 271.1％，纤维素酶酶活59.3U/ml，比出发菌株提高了263.8％，本发明的米曲霉(Aspergillus oryzae)XMS01经过发酵罐发酵的上清液中木聚糖酶酶活250.6U/ml，比出发菌株提高了 523.3％，β-葡聚糖酶活67.0U/ml，比出发菌株提高了440.3％，纤维素酶酶活67.9U/ml，比出发菌株提高了316.5％。
有益效果：
本研究以新鲜甘蔗尾叶为原料，第一段喷洒米曲霉(XMS01)进行有氧发酵，积累木聚糖酶，β-葡聚糖酶，纤维素酶等多种非淀粉多糖酶及一些结构较为复杂的蛋白质，同时实现萎焉使青贮原料的水分含量降低；第二段厌氧青贮，使用喷洒植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03) 进行喷施作用，有效促进发酵速度、降低青贮饲料的pH，同时利用有氧发酵阶段所积累的酶，两步共同作用，相辅相成，从而达到提高甘蔗尾叶青贮品质。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例1
1米曲霉(Aspergillus oryzae)XMS01菌株获得及命名：
本发明是对实验室保存的一米曲霉的出发菌株进行诱变后得到一株米曲霉突变菌株，现已经经过微生物分类学鉴定并已经经过保藏：命名为米曲霉(Aspergillusoryzae)XMS01， CCTCC NO：M 2018425；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学；中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年07月02日。
本实验室的米曲霉的来源：出发菌株是本实验室保存的一株米曲霉菌，出发菌株米曲霉发酵上清液中木聚糖酶酶活40.2u/mL，β-葡聚糖酶活12.4u/mL，纤维素酶酶活16.3u/mL。
本发明的具有高产非淀粉多糖酶的米曲霉(Aspergillus oryzae)XMS01的形态特征为：菌落生长较快，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿色。分生孢子头放射状，也有少数为疏松柱状。
以一株实验室保存的米曲霉为出发菌株，经过平板活化后，将平面上的米曲霉孢子用适量的生理盐水洗脱，制作成孢子悬浮液，然后将孢子悬液接入基础产酶培养基，30℃摇瓶培养5天，酶液经6000转/分离心5min，取上清液。取稀释10倍的酶液200uL，分别加入到装有37℃预热的0.5％的木聚糖溶液、0.5％β-葡聚糖溶液、0.5％羧甲基纤维素钠溶液的试管中，摇混匀，37℃水浴酶解反应30分钟，然后加入DNS溶液3mL，沸水浴灭活5min，流动水冷却，加入5mL蒸馏水，震荡摇匀。空白对照是将相应酶液用缓冲液代替。在波长540nm处测吸光度。根据木聚糖酶、葡聚糖酶、纤维素酶的计算公式，计算出酶活力。得出，木聚糖酶酶活40.2u/mL，β-葡聚糖酶活12.4u/mL，纤维素酶酶活16.3u/mL。
从以上的测试结果可知：在基础产酶培养基上，测出了3种酶的酶活，降低了米曲霉产木聚糖酶和β-葡聚糖酶、纤维素酶的能力。因此，本申请人经过无数的设计后发现通过菌株的纯化和诱变来提高木聚糖酶和β-葡聚糖酶的酶活力。具体操作如下：
1.1菌种的平板初筛
将出发菌株经过平板活化后，挑取12个单菌落分别点植于鉴别培养基为木聚糖和β-葡聚糖上，置于30℃培养箱，培养6天，通过计算HC值(透明圈直径与菌落直径之比)，选出1#、 3#、6#、8#、12#。
1#、3#、6#、8#、12#五只斜面菌株转接于斜面培养基进行30℃、35℃、40℃、45℃温度梯度驯化培养，通过比较HC值和摇瓶培养测酶活，得出在30℃下，12#斜面菌株无论是在HC值和酶活都优于其它的菌株。因此将12#菌株进行下一步紫外诱变与筛选。
1.2菌种的紫外诱变与筛选
单孢子悬浮液的制备：将12#斜面菌株用无菌水洗脱孢子。经玻璃珠打散后，脱脂棉过滤，得单孢子悬浮液。
诱变处理：30W波长为253.7nm的紫外灯预热20min。吸取5mL单孢子悬浮液于直径9cm 的培养皿中，置于紫外灯30cm处，开盖振荡照射不同时间。盖上皿盖，在暗室梯度稀释。
突变株的分离：将诱变后的孢子悬浮液分别涂布在鉴别培养基上，置于30℃培养箱，培养6天，生长出的菌落并且HC值比较大的即为突变菌株，编号为YY01。
摇瓶初筛：将YY01突变菌株转接至摇瓶(1000mL摇瓶装培养基100mL)，30℃下150r/min 振荡培养5d。取上清液检测酶活。
摇瓶复筛：取初筛活性比出发菌株提高20％以上的菌株进行二级摇瓶发酵复筛，得出两株比出发菌株提高26％的菌株，编号分别为YY01-1、YY01-2。
1.3菌株的硫酸二乙脂(DES)诱变与筛选
分别取YY01-1、YY01-2菌株的24h培养液4mL、硫酸二乙脂(DES)0.3mL及0.1mol/L乙酸缓冲液(Ph5.5)16mL混合，振荡一定时间，加入终止试剂25％硫代硫酸钠0.8mL，终止诱变。将上述经诱变处理的菌悬浮液稀释后，涂布培养皿，每个样加0.1mL，涂匀，30℃培养箱，培养6天，挑取突变菌株(菌落直径大、表面湿润、颜色白)的单个菌落转接至摇瓶(1000mL摇瓶瓶装培养基100mL)，30℃下150r/min振荡培养5d。取上清液检测酶活，木聚糖酶和β-葡聚糖酶的酶活分别比出发菌株提高400％、283％以上，纤维素酶的酶活比出发菌株降低100％的菌株即为目标菌株，编号为XMS01(该菌株的木聚糖酶和β-葡聚糖酶的酶活比大约为4:1，为了便于简述该菌株的酶活)。结果见表1。
表1纯化前后摇瓶酶活的对比
Figure RE-GDA0002092693670000051
Figure RE-GDA0002092693670000061
1.4 XMS01突变菌株的稳定性
将XMS01突变菌株，连续传代和发酵5代，结果如表2所示。发酵液颜色白，吸光值OD70.0-70.6，最终pH值稳定在5.0-5.2，木聚糖酶的酶活为190-200u/mL。由此可见突变菌株 XMS01是稳定的。
表2突变菌株XMS01发酵性能稳定性
Figure RE-GDA0002092693670000062
2植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XMS02菌株获得及命名：
用接种环挑取青贮甘蔗尾取样，在添加0.5％CaCO3和添加0.001％(g/100ml)纳它霉素的MRS固体培养基平板上长出来的植物乳杆菌菌落，随机挑选表面光滑、形态呈圆形、乳白或灰白色、有明显钙溶圈的菌落，然后，分别进行过氧化氢酶检测(取一块预先清洗干净的载玻片一块，滴加一滴3％的过氧化氢，用接种环蘸取菌落于过氧化氢液体中，观察是否有气泡产生，有气泡产生为阳性，无气泡产生为阴性)和革兰氏染色镜检；挑选过氧化氢酶为阴性，革兰氏染色为阳性的细菌菌落；用接种环挑取植菌落在MRS固体培养基平板上再次画线纯化，纯化两次后，在纯化后的细菌平板上挑取菌落接种于MRS液体培养基中，扩大培养，培养24h后，挑选出细菌菌落即可。
将细菌送至武汉大学的中国典型培养物保藏中心进行菌种保藏，确定该菌株为：
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XMS02，CCTCC NO：M 2019002；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学；中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2019年01月02日
3植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XMS03菌株获得及命名：
用接种环挑取青贮甘蔗尾取样，在添加0.5％CaCO3和添加0.001％(g/100ml)纳它霉素的MRS固体培养基平板上长出来的植物乳杆菌菌落，随机挑选表面光滑、形态呈圆形、乳白或灰白色、有明显钙溶圈的菌落，然后，分别进行过氧化氢酶检测(取一块预先清洗干净的载玻片一块，滴加一滴3％的过氧化氢，用接种环蘸取菌落于过氧化氢液体中，观察是否有气泡产生，有气泡产生为阳性，无气泡产生为阴性)和革兰氏染色镜检；挑选过氧化氢酶为阴性，革兰氏染色为阳性的细菌菌落；用接种环挑取植菌落在MRS固体培养基平板上再次画线纯化，纯化两次后，在纯化后的细菌平板上挑取菌落接种于MRS液体培养基中，扩大培养，培养24h后，放于4℃冰箱中。
挑选出细菌菌落即可。
将细菌送至武汉大学的中国典型培养物保藏中心进行菌种保藏，确定该菌株为：
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XMS03，CCTCC NO：M 2019003；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学；中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2019年01月02日。
实施例2
一种甘蔗尾叶的青贮方法，具体步骤如下：
第一步：将米曲霉(Aspergillus oryzae)XMS01在进行有氧青贮发酵处理前需要进行接种液制备具体方法是：使用高盐察氏培养基进行平面培养基活化处理，再采用MRS培养基配置好后高温灭菌30min，冷却至室温，按3％接种量接种米曲霉(Aspergillusoryzae)XMS01，拌后放置培养箱中培养2天，温度控制在37℃；
将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XMS02和所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XMS03MRS在进行厌氧青贮发酵处理前需要进行接种液制备具体方法是：使用高盐察氏培养基进行平面培养基活化处理，再采用采用MRS培养基配置好后高温灭菌30min，冷却至室温，按3％接种量分别接种植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)XMS02、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XMS03MRS，摇拌后，温度控制在37℃、于二氧化碳培养箱中 24小时。
第二步原料收集：以甘蔗收获后的新鲜甘蔗尾为原料；
第三步原料切碎：将新鲜甘蔗尾切碎至3cm备用；
第四步有氧青贮发酵处理：将步骤一培养后的米曲霉XMS01喷洒在切碎的新鲜甘蔗尾叶上，使新鲜甘蔗尾叶中米曲霉XMS01含量不低于2.631×106cfu/g，将均匀喷洒有该米曲霉的新鲜甘蔗尾叶平铺于无其他杂菌污染的地面，有氧发酵1天；
第五步厌氧青贮发酵处理：经有氧发酵的甘蔗尾叶，均匀喷洒步骤一培养后的植物乳杆菌XMS02、步骤一培养后的植物乳杆菌XMS03，使甘蔗尾叶植物乳杆菌XMS02、植物乳杆菌XMS03含量分别不低于1.1×106cfu/g、1.3×106cfu/g，然后填充到密闭容器中，确保密度达到0.45kg/L以上，盖好盖子，再用封口膜密封；在27℃的温度条件下进行厌氧青贮发酵处理 38天，即可。
第六步产品检测：发酵完成后现场依据中国现场感观评定进行感观评定并依据国内评定品质评定的得分，筛选出总得分达到良，品质评定达到优，有氧稳定性达到100小时以上的青贮甘蔗尾叶评定为合格青贮甘蔗尾叶；
第七步保存：将上述得到的合格青贮甘蔗尾叶，密封保存，备用。
实施例3
一种甘蔗尾叶的青贮方法，具体步骤如下：
第一步：将米曲霉(Aspergillus oryzae)XMS01在进行有氧青贮发酵处理前需要进行接种液制备具体方法是：使用高盐察氏培养基进行平面培养基活化处理，再采用MRS培养基配置好后高温灭菌30min，冷却至室温，按3％接种量接种米曲霉(Aspergillusoryzae)XMS01，拌后放置培养箱中培养2.5天，温度控制在37℃；
将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XMS02和所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XMS03MRS在进行厌氧青贮发酵处理前需要进行接种液制备具体方法是：使用高盐察氏培养基进行平面培养基活化处理，再采用采用MRS培养基配置好后高温灭菌30min，冷却至室温，按3％接种量分别接种植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)XMS02、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XMS03MRS，摇拌后，温度控制在37℃、于二氧化碳培养箱中 24小时。
第二步原料收集：以甘蔗收获后的新鲜甘蔗尾为原料；
第三步原料切碎：将新鲜甘蔗尾切碎至2-3cm备用；
第四步有氧青贮发酵处理：将步骤一培养后的米曲霉XMS01喷洒在切碎的新鲜甘蔗尾叶上，使新鲜甘蔗尾叶中米曲霉XMS01含量不低于2.631×106cfu/g，将均匀喷洒有该米曲霉的新鲜甘蔗尾叶平铺于无其他杂菌污染的地面，有氧发酵5天；
第五步厌氧青贮发酵处理：经有氧发酵的甘蔗尾叶，均匀喷洒步骤一培养后的植物乳杆菌XMS02、步骤一培养后的植物乳杆菌XMS03，使甘蔗尾叶植物乳杆菌XMS02、植物乳杆菌XMS03含量分别不低于1.1×106cfu/g、1.3×106cfu/g，然后填充到密闭容器中，确保密度达到0.45kg/L以上，盖好盖子，再用封口膜密封；在27℃的温度条件下进行厌氧青贮发酵处理 48天，即可。
第六步产品检测：发酵完成后现场依据中国现场感观评定进行感观评定并依据国内评定品质评定的得分，筛选出总得分达到良，品质评定达到优，有氧稳定性达到100小时以上的青贮甘蔗尾叶评定为合格青贮甘蔗尾叶；
第七步保存：将上述得到的合格青贮甘蔗尾叶，密封保存，备用。
实施例4
1材料和方法
1.1试验材料
本试验所用甘蔗尾叶取自广西崇左扶绥甘蔗种植区，人工收割，切碎至2cm备用。米曲霉(XMS01)、植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)均为本实验室自主选育。
表3新鲜甘蔗尾叶常规营养成分(％DM)
Figure RE-GDA0002092693670000091
1.2培养基配置
高盐察氏培养基及MRS培养基用于米曲霉(XMS01)、植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌 (XMS03)活化及菌落计数。
1.3菌落计数
植物乳杆菌接种液：采用平板计数法，将植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)菌种培养至第二代进行甘蔗尾青贮接种，用无菌水对其接种菌液逐级稀释，对10-5、10-6、10-7 三个稀释梯度进行平板涂布，每个梯度三个重复，37℃厌氧培养48h计数。
米曲霉接种液：在接种液中加入玻璃球，用振荡器震荡后3层纱布过滤，用无菌水对所得孢子悬浮液逐级稀释，采用血球计数法计算米曲霉孢子浓度。
1.4试验设计及青贮方法
试验设4个组，空白对照组、试验I组、试验II组、试验III组，每组3个重复，分两个阶段进行。第一阶段有氧发酵，空白对照组、试验I组、试验II组、试验III组每千克样品分别喷洒100ml无菌水、10ml米曲霉菌液+90ml无菌水、20ml米曲霉菌液+80ml无菌水、30ml米曲霉菌液+70ml无菌水，在无菌室室温下，有氧发酵48h。第二阶段无氧青贮，空白对照组：每千克样品喷洒100ml无菌水，试验I组、试验II组、试验III组：每千克样品均喷洒10ml植物乳杆菌XMS02菌液+10ml植物乳杆菌XMS03菌液+80ml无菌水，青贮原料与添加剂充分混匀，打包密封青贮45d，取样分析。米曲霉(XMS01)菌液浓度为8.77×107cfu/ml，植物乳杆菌(XMS02)菌液浓度为1.1×108cfu/ml，植物乳杆菌(XMS03)菌液浓度为1.3×108cfu/ml。
1.5测定项目及方法
各试验组样品经风干、粉碎过1mm网筛处理后，储存于样品袋中，以备分析。干物质(DM)、粗蛋白(CP)、粗脂肪(EE)、粗灰分(ASH)依照AOCO(1980)的方法进行测定。中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、酸性洗涤不溶蛋白(ADIP)、中性洗涤不溶蛋白(NDIP)、木质素(LIGNIN)依照Van Soest(1981)方法进行测定，可溶性粗蛋白(SCP)依照Krishnamoorthy等(1983)的方法进行测定。
1.5.1CNCPS碳水化合物的计算公式(Sniffen等，1992)
CHO(％DM)＝100-CP(％DM)-FAT(％DM)-ASH(％DM)
CB1(％CHO)＝(STRACH(％NSC)×(100-CB2(％CHO)-CC(％CHO))/100
CB2(％CHO)＝100×(NDF(％DM)-NDIP(％CP)×0.01×CP(％DM)-NDF(％DM)×0.01×LIGNIN( ％NDF)×2.4)/CHO(％DM)
CA(％CHO)＝(100-STARCH(％NSC))×(100-CB2(％CHO))-CC(％CHO))/100
CC(％CHO)＝100×(NDF(％DM)×0.01×LIGNIN(％NDF)×2.4)/CHO(％DM)
NSC(％CHO)＝100-CB2(％CHO)-CC(％CHO)
上述公式中，DM为干物质，CHO为总碳水化合物，CP、FAT、ASH、STRACH、LIGNIN、 NDF分别为粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、淀粉、木质素、中性洗涤纤维，CB1为中速降解碳水化合物部分，CB2为缓慢降解碳水化合物，CA为快速降解碳水化合物，CC为不可利用碳水化合物组分(木质素×2.4)，NSC为非结构性碳水化合物。
1.5.2CNCPS蛋白质组分的计算公式(Sniffen等，1992)
PA(％CP)＝NPN(％SOLP)×0.01×SOLP(％CP)
PB1(％CP)＝SOLP(％CP)-PA(％CP)
PB2(％CP)＝100―PA(％CP)-PB1(％CP)-PB3(％CP)-PC(％CP)
PB3(％CP)＝NDIP(％CP)-ADIP(％CP)
PC(％CP)＝ADIP(％CP)
上述公式中，NDIP(％CP)为中性洗涤不溶蛋白质，ADIP(％CP)为酸性洗涤不溶蛋白， PA(％CP)快速降解蛋白即非蛋白氮(NPN)，PB2(％CP)溶于缓冲溶液的真蛋白可快速降解， PB3(％CP)中性洗涤可溶的中速降解蛋白部分，PC(％CP)与单宁、木质素结合不能被机体消化利用的蛋白质部分，SOLP为可溶性粗蛋白。
1.5.3青贮饲料品质评定
青贮结束后，按照德国农业协会青贮品质感官评分标准、日本粗饲料V-scoer评分体系、Kaiser青贮品质评定、中国青贮饲料品质评定和Flieg青贮品质评定方法对青贮结束后的甘蔗尾进行青贮品质的评定。
1.5.4有氧稳定性的测定
青贮结束后，每瓶取样取约200g左右置于封口袋中压实，并用牙签扎数个小孔，再套上一个宽松不封口的塑料袋，防止交叉污染和减少水分损失，在青贮封口袋中心插入一个高灵敏高精度的水银温度计测定温度变化。处理好的封口袋都放置于背光的房间中，每8h记录一次室温和样品中心温度的变化，当青贮样品的中心温度超过环境温度2℃时，停止记录。
1.5.5发酵产物的测定
发酵指标：pH、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸和氨态氮。
青贮的甘蔗尾开瓶以后将样品混合均匀，每瓶取35g样品，放入250mL广口瓶中，并添加150mL超纯水，置于4℃冰箱中，每个几小时摇匀一次；经过24h后，用4层纱布进行过滤并分装样液，分别用于pH、乳酸、氨态氮和挥发性脂肪酸(VFA)的测定。
pH采用pH计测定。乳酸采用试剂盒(南京建成)进行测定，按照其操作说明书进行乳酸的测定。氨态氮采用比色的法，使用紫外可见分光光度计(济南海能)进行测定。挥发性脂肪酸采用气相色谱仪(岛津2014C)进行测定.
1.6数据分析
数据采用EXCEL软件进行初步处理，应用SPSS 16.0软件进行单因子方差分析，同时进行Duncan多重比较。
2.结果与分析
2.1米曲霉(XMS01)、植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)两段青贮对甘蔗尾叶常规营养成分的影响。
由表4可知，各组间干物质DM(％)水平差异不显著，但各试验组较对照组均有提高。粗蛋白(CP)，各组间差异显著(P<0.05，下同)，试验I组、试验III组显著高于对照组，而试验II组显著低于对照组。粗脂肪(EE)，试验组间差异不显著，但各试验组均显著高于对照组。中性洗涤纤维(NDF)，各组间差异不显著(P>0.05，下同)，但各试验组较对照组均有降低。酸性洗涤纤维(ADF)，试验I组、对照组差异不显著，试验II组、试验III组显著低于对照组及试验I组。酸性不溶灰分(ASH)，各试验组与对照组差异显著，试验I组、试验III组差异不显著，但显著低于对照组，试验II组显著高于其他组。CP是衡量青贮饲料营养价值的重要指标之一。青贮过程中，蛋白质在植物酶的作用下降解为氨基酸、多肽等非蛋白氮，非蛋白氮在微生物作用下，进一步降解为氨，进而影响青贮饲料的营养价值。本试验中，米曲霉(XMS01)、植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)两段青贮甘蔗尾叶，试验I组、试验III组CP水平较对照组均显著提高。可能是青贮过程中植物乳杆菌分泌有机酸，致使pH值降低，从而抑制植物酶的活性。张宁等(2012)研究报道乳酸菌剂可提高青贮水稻秸的CP水平。赖玉娇等(2014) 研究发现乳酸菌剂较对照组可提高青贮苜蓿的CP水平。本试验结果与张宁等、赖玉娇等研究结果一致。动物机体利用纤维很大程度上是利用微生物酶的分解产物或微生物的代谢产物。日粮纤维素水平增高，加快食糜在消化道中的流通，影响机体对淀粉、蛋白质、脂肪等营养物质的吸收，降低饲粮可利用能值，但同时纤维是反刍动物的一种必要营养素。NRC推荐泌乳牛饲粮中ADF水平至少为19％～21％或NDF水平为25％～28％，且日粮中NDF总量中的 75％必须由粗饲料提供(杨凤，2000)。纤维素酶降解植物的半纤维素、纤维素，增加青贮发酵的底物，提高青贮饲料的消化率及采食量(庄益芬等，2009)。本试验，试验组与对照组间NDF含量差异不显著，但各试验组较对照组均有降低；ADF，试验I组、对照组差异不显著，但试验I组较对照组有所降低，试验II组、试验III组显著低于对照组及试验I组；说明米曲霉(XMS01)、植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)两段青贮在一定程度上可降低青贮甘蔗尾叶NDF、ADF水平，可能是米曲霉(XMS01)分泌积累非淀粉多糖酶及三种菌的互作效应提高了青贮甘蔗尾叶适口性及营养价值。
表4米曲霉(XMS01)、植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)两段青贮对甘蔗尾常规营养成分的影响
Figure RE-GDA0002092693670000131
注:同列字母不同表示差异显著(P<0.05)，下同.
2.2米曲霉(XMS01)、植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)两段青贮对甘蔗尾叶CNCPS 营养指标的影响
由表5可知，可溶性粗蛋白(SCP(％CP))各组间差异显著，试验I组、试验II组显著高于对照组，试验III组显著低于对照组，试验I组显著高于试验II组、试验III组。非蛋白氮(NPN)，试验II组、试验III组显著低于试验I组、对照组，试验I组显著高于对照组。酸性洗涤不溶蛋白 (ADIP)，试验III组与对照组差异不显著，试验I组、试验II组显著低于对照组、试验III组。中性洗涤不溶蛋白(NDIP)，各组间差异显著，试验组均显著高于对照组，试验III组显著高于试验I组、试验II组。木质素(LIGNIN)，各组间均差异显著，试验组显著低于对照组，且试验III组含量最低。淀粉(STARCH)，对照组与试验I组差异不显著，试验III组显著高于对照组、试验I组，试验II组显著低于对照组、试验III组。动植物体中的非蛋白氮(NPN)包括酰胺类、游离氨基酸、生物碱、铵盐、含氮的糖苷及脂肪、硝酸盐、甜菜碱、胆碱等(杨凤，2000)。NPN在反刍动物营养中具有重要意义，但对于非反刍动物基本上没有利用价值。本试验中，试验I组显著高于对照组，试验II组、试验III组差异不显著，但显著低于对照组，说明试验II组、试验III组可改善青贮甘蔗尾叶营养价值。STARCH是瘤胃内产生挥发性脂肪酸的主要底物，且高水平的STARCH含量有利于瘤胃微生物发酵产生挥发性脂肪酸，试验III组STARCH含量显著高于其他组，可见试验III组可为反刍动物提供较多的能量来源。
饲料中蛋白质肽链上的氨基酸残基与碳水化合物中的半纤维素结合生成聚合物，该聚合物含有11％的氮，但完全不能被瘤胃微生物分解，该聚合物分析与酸性洗涤纤维相同，其所含氮被称为“酸性洗涤不溶氮”，70％的相对湿度及60℃的温度是酸性洗涤不溶氮生成的最适宜的环境，时间越久，越严重。本试验中，ADIP，试验I组、试验II组显著低于对照组，可能是试验过程中青贮原料填充的紧密程度造成相对湿度及温度有偏差所致。LIGNIN是植物生长成熟后才出现在细胞壁中的物质，动物机体所分泌的酶均不能使其降解(杨凤，2000)。本试验中，各试验组木质素含量显著低于对照组，且试验III组含量最低，可能是米曲霉(XMS01) 分泌降解酶或三种菌本身消化分解青贮甘蔗尾叶的木质素。
表5米曲霉(XMS01)、植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)两段青贮对甘蔗尾叶CNCPS 营养指标的影响
Figure RE-GDA0002092693670000141
2.3米曲霉(XMS01)、植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)两段青贮对甘蔗尾叶CNCPS 碳水化合物组分的影响
由表6可知，碳水化合物(CHO)，试验III组显著高于对照组、试验I组、试验II组，试验 I组、试验II组差异不显著，试验II组较对照组有所增加，而试验I组低于对照组。非结构性碳水化合物(NSC)，试验III组显著高于对照组、试验I组、试验II组；试验I组、试验II组差异不显著，但均显著高于对照组。快速降解糖类(CA)，各组间差异显著，试验I组、试验II组、试验III组显著高于对照组，试验III组显著高于试验I组、试验II组。中速降解淀粉及果胶(CB1)，试验III组显著高于对照组、试验I组、试验II组，对照组、试验I组差异不显著，试验II组显著低于对照组、试验I组。慢速降解有效细胞壁成分(CB2)，各组间差异显著，试验III组显著高于对照组、试验I组、试验II组，试验I组、试验II组显著高于对照组。不可利用细胞壁成分 (CC)，各组间差异显著，试验III组显著低于对照组、试验I组、试验II组，对照组显著高于试验I组、试验II组。碳水化合物是多羟基的酮、醛或其简单衍生物及能水解产生上述的化合物的总称(杨凤，2000)。碳水化合物是一类重要的营养素，占动物饲粮的50％以上。依照 CNCPS将CHO划分为非结构性碳水化物(non-structural carbohydrate，NSC)及结构性碳水化合物(structural carbohydrate，SC)。其中CB2及CC划分为SC，CA、CB1划分为NSC。 SC是反刍动物重要的碳架及能量来源，NSC可影响反刍动物瘤胃能氮代谢及瘤胃发酵。本试验中，CHO，试验III组显著高于其他组，试验I组、试验II组均与对照组差异不显著。NSC，试验III组显著高于其他组，试验I组、试验II组差异不显著，但两组均显著高于对照组。CA、 CB1、CB2均为试验III组显著高于试验I组、试验II组及对照组，而CC则为试验III组显著低于试验I组、试验II组及对照组。可知，试验III组CNCPS碳水化合物组分最优，可能是随着米曲霉(XMS01)添加量的增加，纤维素酶、木聚糖酶等积累的越多，同时米曲霉(XMS01)、植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)自身的消化代谢促使试验III组CNCPS碳水化合物组分最优。目前，针对添加剂对青贮饲料CNCPS碳水化合物组分的研究较少，而两段青贮对青贮甘蔗尾叶CNCPS碳水化合物组分的研究尚未有报道，两段青贮的机理有待进一步研究。
表6米曲霉(XMS01)、植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)两段青贮对甘蔗尾叶CNCPS 碳水化合物组分的影响
Figure RE-GDA0002092693670000151
2.4米曲霉(XMS01)、植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)两段青贮对甘蔗尾叶CNCPS 蛋白质组分的影响
由表7可知，快速降解非蛋白氮(PA)，试验II组、试验III组显著低于对照组、试验I组，试验I组显著高于对照组，试验II组、试验III组差异不显著。快速降解真蛋白(PB1)，试验I 组、试验II组差异不显著，试验II组显著高于对照组、试验I组、试验III组。中速降解真蛋白(PB2)，试验II组、试验III组差异不显著，对照组显著高于试验I组、试验II组、试验III组，试验I组显著高于试验II组、试验III组。慢速降解真蛋白(PB3)，各组间差异显著，试验II组著高于对照组、试验I组、试验III，试验I组、试验II组、试验III均显著高于对照组。不可利用蛋白(PC)，对照组显著高于各试验组，试验II组、试验III组差异不显著且均显著高于试验I组。CNCPS依据蛋白质在瘤胃内的降解特性，将蛋白质划分为PA(非蛋白氮)、PB(真蛋白质)、PC(结合蛋白) 三部分。其中PB又被划分为PB1(快速降解蛋白，可溶于缓冲溶液)、PB2(中速降解蛋白)、 PB3(慢速降解蛋白)三部分。PC包括与木质素结合的蛋白质、单宁蛋白质复合物及高度抵抗微生物及哺乳动物酶类的蛋白质。PC在实验室分析过程中不被酸性洗涤剂溶解，在瘤胃中瘤胃微生物无法降解，动物机体不能消化吸收。青贮饲料中梭菌等有害菌的活动及蛋白质水解酶的作用，可引起青贮饲料中蛋白质的变化。饲料中PC含量越低，其蛋白质生物学效价越高。PB2、PB3在反刍动物瘤胃中的降解速率分别为中速、慢速，部分可进入小肠形成瘤胃蛋白，对提高反刍动物生产性能具有显著作用(Anil等，2000)。本试验中，PA(％CP)、PB2(％CP) 对照组及试验各组间差异不显著，PB1(％CP)、PB3(％CP)各试验组显著高于对照组；PC(％CP) 试验II组、试验III组差异不显著，但显著低于对照组，试验I组显著高于试验II组、试验III组。在本试验第二阶段厌氧青贮，植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)厌氧环境下大量繁殖，产生有机酸使青贮的pH下降，抑制梭菌等有害菌的活动及青贮原料自身所带蛋白酶的活性，减少其对蛋白质的破坏。由上述结果可知，各试验组蛋白质生物学效价均高于对照组，米曲霉(XMS01)、植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)两段青贮可提高甘蔗尾叶CNCPS蛋白质品质。
表7米曲霉(XMS01)、植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)两段青贮对甘蔗尾叶CNCPS 蛋白质组分的影响
Figure RE-GDA0002092693670000161
Figure RE-GDA0002092693670000171
2.5米曲霉(XMS01)、植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)两段青贮对甘蔗尾发酵品质的影响
由表8可以看出，与对照组相比，各试验组pH均低于对照组。试验III组乳酸含量显著高于对照组，与对照组相比提高了24.30％(P＜0.05)。在本试验中，各试验组乙酸含量与对照组相比，除了试验组Ⅱ外，其它各试验组乙酸含量差异显著(P＜0.05)。与对照组相比，各试验组中丙酸含量，除了试验组Ⅹ低于对照组外，其它各试验组均高于对照组；在本试验中，只在对照组和试验组Ⅰ中检测到含有丁酸，其它各试验组中均未检测到丁酸，表明其它各试验组的丁酸含量低于检测值，差异显著(P＜0.05)。与对照组相比，各试验组中氨态氮含量均低于对照组，氨态氮/总氮比值显著降低(P＜0.05)。
青贮饲料中pH的高低取决于青贮饲料中各有机酸含量的高低，一般认为当青贮饲料中 pH低于3.8时，青贮饲料就已达到能够长期保存的状态。本试验中，对照组和添加乳酸菌的各试验组中pH均低于3.8，各试验组的pH与对照相比，均有所降低，表明这几组中有机酸含量相对较高，对微生物的抑制作用更强。乳酸和乙酸是青贮饲料中最主要的有机酸，它们含量的高低决定着青贮饲料pH的高低；它们含量越高，青贮饲料pH越低，青贮饲料品质就会越好，保存的时间就会越长。丁酸是青贮饲料中丁酸梭菌和酪酸菌等腐败菌发酵饲料原料的产物，青贮饲料中丁酸含量的多少往往反映青贮饲料品质的优劣，丁酸含量越少，表明青贮饲料发酵品质越高。在本次试验中丁酸只在对照组和试验组Ⅰ中检测到，对照组中丁酸含量显著高于其它各试验组，表明各试验组的青贮发酵品质优于对照组。青贮饲料中氨态氮含量、氨态氮/总氮比值是评定青贮饲料品质最重要的指标之一，氨态氮主要由梭菌等腐败微生物分解原料中粗蛋白产生，所以氨态氮含量越低的青贮饲料，其发酵品质和营养价值就越高。在本次试验中，各试验组中氨态氮含量均低于对照组，说明添加乳酸菌青贮能够降低青贮原料中粗蛋白被破坏分解的程度，改善甘蔗尾青贮饲料的发酵品质。
表8米曲霉(XMS01)、植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)两段青贮对甘蔗尾青贮发酵品质的影响(mmol.kg-1)
Figure RE-GDA0002092693670000181
2.6米曲霉(XMS01)、植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)两段青贮对甘蔗尾青贮有氧稳定性的影响
由表9中可知，甘蔗尾青贮结束后，对照组有氧稳定性均低于各试验组的有氧稳定性。青贮饲料开窖后，由于与空气的接触，青贮饲料环境的改变，青贮饲料中受到抑制作用的酵母菌增殖活动增强，使青贮饲料产热增加，pH升高；酵母菌是导致青贮饲料发生有氧变质主要的微生物，同时，其它一些的好氧微生物和有害霉菌的活动也开始逐渐增强，进而导致青贮饲料加速变质和发霉，因此，青贮饲料开窖后，其有氧稳定性的高低也是评价青贮饲料品质的重要因素之一。
在本试验中，添加乳酸菌各试验组有氧稳定性均高于对照组，表明本试验中米曲霉和植物乳杆菌两段式发酵均能提高甘蔗尾青贮有氧稳定性，但提高效果不同。乙酸具有抑制真菌生长的作用，能够有效提高青贮料与氧气接触后的有氧稳定性，这与本试验各试验组中乙酸均高于对照组乙酸含量，同时有氧稳定性也均高于对照组的研究结果相似。
表9米曲霉(XMS01)、植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)两段青贮对甘蔗尾青贮有氧稳定性的影响(h)
Figure RE-GDA0002092693670000182
2.7米曲霉(XMS01)、植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)两段青贮甘蔗尾后的饲料品质评定
表10是根据德国农业青贮感官评定标准和我国青贮饲料现场感官评定标准，对甘蔗尾青贮饲料进行感官评定的结果。由表10可知，本次甘蔗尾青贮试验结束后，对照组和各试验组的感官评定结果都处于良好与优的等级内；其中，各试验组的两种感官评定结果总得分均高于对照组。另外，各试验组两种感官评定等级具有一定的差异性，说明感官评定具有一定的偏差，需要对青贮饲料进行进一步实验室的青贮品质评定。
表10米曲霉(XMS01)、植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)两段青贮甘蔗尾的感官评定
Figure RE-GDA0002092693670000191
表11是采用日本青贮饲料V-score评定方法、国内青贮饲料评定方法、Kaiser青贮饲料评定方法和Flieg青贮饲料品质评定的方法，对本次甘蔗尾青贮饲料，进行青贮发酵品质的评定结果。从表10可以看出，各种青贮饲料实验室评定方法对本次甘蔗尾青贮饲料的青贮品质评定等级均为良好或优级等级。与对照组总得分相比，除了采用Kaiser青贮品质评定方法的各试验组中总得分与对照组一致之外；各试验组采用其它实验室青贮饲料品质评定方法的总得分均高于对照组，说明米曲霉和植物乳杆菌两段式发酵甘蔗尾叶具有一定的改善作用。各青贮饲料品质评定方法所评定的青贮指标有所不同，使得各试验组的总得分也具有一定的差异。
表11米曲霉(XMS01)、植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)两段青贮甘蔗尾的品质评定
Figure RE-GDA0002092693670000192
Figure RE-GDA0002092693670000201
3.结论
本研究以新鲜甘蔗尾叶为原料，第一段喷洒米曲霉(XMS01)进行有氧发酵，积累葡聚糖酶、木聚糖酶等多种非淀粉多糖酶及一些结构较为复杂的蛋白质，同时实现萎焉使青贮原料的水分含量降低；第二段厌氧青贮，喷洒植物乳杆菌(XMS02)、植物乳杆菌(XMS03)，以促进发酵速度、降低青贮饲料的pH值，同时利用有氧发酵阶段所积累的酶。综合考虑本试验各项指标，试验III组效果最好，即每千克新鲜甘蔗尾叶喷洒30ml米曲霉(XMS01)菌液+10ml植物乳杆菌 (XMS02)10ml+10ml植物乳杆菌(XMS03)进行两段式青贮，效果最佳。
虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限制本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许的修改和完善，因此本发明的保护范围当以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一种甘蔗尾叶的青贮方法，其特征在于：步骤包括有氧青贮发酵处理和厌氧青贮发酵处理；
S1有氧青贮发酵处理：将新鲜甘蔗尾叶使用米曲霉(Aspergillus oryzae)XMS01进行有氧发酵1-5天；每千克新鲜甘蔗尾叶喷洒30ml米曲霉(XMS01)菌液；
S2厌氧青贮发酵处理：将经过有氧青贮发酵处理后的甘蔗尾叶使用植物乳杆菌XMS02和植物乳杆菌XMS03进行厌氧青贮发酵处理38-48天，即可；所述每千克新鲜甘蔗尾叶喷洒10ml植物乳杆菌(XMS02)10ml+10ml植物乳杆菌(XMS03)；
所述米曲霉(Aspergillus oryzae)XMS01，CCTCC NO：M 2018425；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学；中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年07月15日；所述米曲霉(Aspergillus oryzae)XMS01经过发酵后上清液中木聚糖酶酶活200U/ml-250.6U/ml，β-葡聚糖酶活46U/ml-67.0U/ml，纤维素酶酶活59.3U/ml-67.9U/ml；
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XMS02，CCTCC NO：M 2019002；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学；中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2019年01月17日；
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XMS03，CCTCC NO：M 2019003；保藏地点为：中国，武汉，武汉大学；中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2019年01月17日。
2.如权利要求1所述的青贮方法，其特征在于：所述米曲霉(Aspergillus oryzae)XMS01在进行有氧青贮发酵处理前需要进行接种液制备具体方法是：使用高盐察氏培养基进行平面培养基活化处理，再采用MRS培养基配置好后高温灭菌30min，冷却至室温，按3％接种量接种米曲霉(Aspergillus oryzae)XMS01，拌后放置培养箱中培养2-3天，温度控制在37℃；
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XMS02和所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XMS03MRS在进行厌氧青贮发酵处理前需要进行接种液制备具体方法是：使用高盐察氏培养基进行平面培养基活化处理，再采用MRS培养基配置好后高温灭菌30min，冷却至室温，按3％接种量分别接种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XMS02、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XMS03MRS，摇拌后，温度控制在37℃、于二氧化碳培养箱中24小时。
3.如权利要求1所述的青贮方法，其特征在于：所述米曲霉(Aspergillus oryzae)XMS01进行有氧发酵可以高产非淀粉多糖酶；所述非淀粉多糖酶为木聚糖酶、β-葡聚糖酶和纤维素酶中的一种或一种以上的混合物。
4.如权利要求1所述的青贮方法，其特征在于：所述青贮方法在有氧处理的步骤前还包括以下步骤：
1)原料收集：以甘蔗收获后的新鲜甘蔗尾为原料；
2)原料切碎：将新鲜甘蔗尾切碎至2-3cm备用；
所述青贮方法在厌氧处理的步骤后还包括以下步骤：
1)产品检测：发酵完成后现场依据中国现场感观评定进行感观评定并依据国内评定品质评定的得分，筛选出总得分达到良，品质评定达到优，有氧稳定性达到100小时以上的青贮甘蔗尾叶评定为合格青贮甘蔗尾叶；
2)保存：将上述得到的合格青贮甘蔗尾叶，密封保存，备用。
5.如权利要求1所述的青贮方法，其特征在于：所述有氧青贮发酵处理的具体方法是将米曲霉XMS01喷洒在切碎的新鲜甘蔗尾叶上，使新鲜甘蔗尾叶中米曲霉XMS01含量不低于2.631×106cfu/g，将均匀喷洒有该米曲霉的新鲜甘蔗尾叶平铺于无其他杂菌污染的地面，有氧发酵1-5天；
所述厌氧青贮发酵处理的具体方法是：经有氧发酵的甘蔗尾叶，均匀喷洒植物乳杆菌XMS02、植物乳杆菌XMS03，使甘蔗尾叶植物乳杆菌XMS02、植物乳杆菌XMS03含量分别不低于1.1×106cfu/g、1.3×106cfu/g，然后填充到密闭容器中，确保密度达到0.45kg/L以上，盖好盖子，再用封口膜密封；在23℃-27℃的温度条件下进行厌氧青贮发酵处理38-48天，即可。
CN201910366868.6A 2019-05-05 2019-05-05 一种甘蔗尾叶的青贮方法 Active CN110100963B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910366868.6A CN110100963B (zh) 2019-05-05 2019-05-05 一种甘蔗尾叶的青贮方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910366868.6A CN110100963B (zh) 2019-05-05 2019-05-05 一种甘蔗尾叶的青贮方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110100963A CN110100963A (zh) 2019-08-09
CN110100963B true CN110100963B (zh) 2022-08-30

Family

ID=67488184

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910366868.6A Active CN110100963B (zh) 2019-05-05 2019-05-05 一种甘蔗尾叶的青贮方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110100963B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111096392A (zh) * 2019-12-12 2020-05-05 广西壮族自治区水牛研究所 一种甘蔗尾叶的全混青贮饲料及其应用
CN113969243B (zh) * 2020-07-23 2023-05-16 中国农业大学 一株可降解单宁的植物乳杆菌及其应用
CN112205517A (zh) * 2020-09-30 2021-01-12 广西壮族自治区农业科学院 一种提高产蛋率的鸡饲料及其制备方法
CN113995052B (zh) * 2021-07-12 2023-11-17 广西壮族自治区水牛研究所 象草甘蔗尾叶青贮饲料及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103621766A (zh) * 2013-12-25 2014-03-12 田子罡 具有营养免疫活性的生物饲料伴侣的制备方法及其应用
CN104351588A (zh) * 2014-11-11 2015-02-18 广西壮族自治区水牛研究所 用布氏乳杆菌和植物乳杆菌制备甘蔗尾青贮饲料的方法
CN104431648A (zh) * 2014-11-28 2015-03-25 广西壮族自治区水牛研究所 用黑曲霉、热带假丝酵母、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌制备甘蔗尾青贮的方法
CN104996722A (zh) * 2015-08-13 2015-10-28 江南大学 一种多菌种两步联合发酵饲料的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103621766A (zh) * 2013-12-25 2014-03-12 田子罡 具有营养免疫活性的生物饲料伴侣的制备方法及其应用
CN104351588A (zh) * 2014-11-11 2015-02-18 广西壮族自治区水牛研究所 用布氏乳杆菌和植物乳杆菌制备甘蔗尾青贮饲料的方法
CN104431648A (zh) * 2014-11-28 2015-03-25 广西壮族自治区水牛研究所 用黑曲霉、热带假丝酵母、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌制备甘蔗尾青贮的方法
CN104996722A (zh) * 2015-08-13 2015-10-28 江南大学 一种多菌种两步联合发酵饲料的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
青贮微生物及其对青贮饲料有氧;黄峰，等;《动物营养学报》;20190131;第31卷(第1期);82-89 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110100963A (zh) 2019-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110100963B (zh) 一种甘蔗尾叶的青贮方法
CN106376725B (zh) 一种生物发酵饲料及其制备方法
CN102640885B (zh) 一株植物乳杆菌在全株小麦青贮中的应用
CN108157673A (zh) 一种发酵对虾配合饲料的制备方法
CN103875893A (zh) 多菌种复合微生物饲料添加剂及其制备方法
CN109897803A (zh) 一种水产益生菌剂及其制备方法和应用
CN105002116A (zh) 一种微生物秸秆饲料菌剂及其制备方法
CN102286376A (zh) 一种高效发酵床用微生物菌剂及其制备方法
CN113273645B (zh) 一种饲料桑类青绿饲料的青贮方法
CN106173225A (zh) 一种固态发酵植物性蛋白饲料制备蛋白饲料添加剂的方法
CN108060104A (zh) 一种植物乳杆菌及其应用、筛选检定方法
CN114586890A (zh) 一种利用菌草制作复合菌群饲料的方法
CN114921385A (zh) 一种枯草芽孢杆菌及其在饲料添加和无抗养殖中的应用
CN103642709B (zh) 一株乳酸链球菌及在微生物发酵制备饲料添加剂中的应用
CN111748490A (zh) 一种清酒乳杆菌及其应用
CN108060102A (zh) 一种食窦魏斯氏菌及其应用、筛选检定方法
CN101965906A (zh) 柱花草生物饲料的制备方法
CN113897312B (zh) 一种动物饲喂菌剂制备及其应用
CN110819555A (zh) 一种木质纤维高效降解耐高温罗伊氏短芽孢杆菌njau-n20及其应用
CN111690573B (zh) 一种可用于动物肠道益生菌的希氏乳杆菌及其发酵制备的酵素和应用
CN106615609B (zh) 一种可提高饲料青贮品质的布氏乳杆菌及其应用
CN114591862A (zh) 一种提高玉米秸秆黄贮品质的犏牛瘤胃自然共培养物及其应用
CN110771723A (zh) 一种木薯渣生物饲料及其发酵方法与应用
CN110144309A (zh) 一株低温高产酸乳酸菌
CN112899197B (zh) 复合微生物菌剂及其制备和在饲料添加剂中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant