JP2016511230A - 治療用組成物およびｍＲＮＡトランスフェクションを含む方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、腫瘍抑制および病原体による細胞の感染阻害に関与する組成物および方法を記載する。一般に、本組成物は、上皮細胞に導入された後に治療利益をもたらし得るｍＲＮＡカーゴを含む。いくつかの場合、前記ｍＲＮＡは、ポリペプチドをコードすることができる。いくつかの場合、前記ポリペプチドは、上皮細胞の増殖を抑制することができる。他の実施形態では、前記ポリペプチドは、自然免疫に関与し得る。種々の実施形態では、前記ポリペプチドは、カテリシジン抗菌タンパク質（ＣＡＭＰ）、カルプロテクチン、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、β−デフェンシン、Ｓ１００Ａ７、分泌型白血球阻害剤、リポカリン２、またはリゾチームを含み得る。いくつかの実施形態では、前記ｍＲＮＡは、例えば５’キャップまたは３’伸長部などの安定化部分を含み得る。

Description

政府出資
本発明は、ＮＩＨ／ＮＩＤＣＲにより授与された１Ｒ０１ＤＥ０２１２０６の下の政府支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１月１１日出願の米国仮特許出願第６１／７５１，５０４号の優先権を主張するものであり、この出願は引用することにより本明細書の一部とされる。

概要
本開示は、一態様において、細胞増殖を抑制する方法を記載する。一般に、本方法は、上皮細胞に細胞増殖の抑制に関与するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを導入することと、前記細胞に、前記細胞が足場非依存性環境で増殖する可能性を小さくするのに有効な量で前記ポリペプチドを発現させることを含む。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、カルプロテクチン（Ｓ１００Ａ８とＳ１００Ａ９の複合体；Ｓ１００Ａ８／Ａ９）、Ｓ１００Ａ８、またはＳ１００Ａ９を含み得る。

別の態様では、本開示は、細胞の感染を阻害する方法を記載する。一般に、本方法は、細胞に自然免疫に関与するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを導入することと、前記細胞に前記ポリペプチドを、前記細胞が病原体により感染を受ける可能性を小さくするのに有効な量で発現させることを含む。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、カテリシジン抗菌タンパク質（ＣＡＭＰ）、カルプロテクチン、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、β−デフェンシン、Ｓ１００Ａ７、分泌型白血球阻害剤、リポカリン２、またはリゾチームを含み得る。

上記で要約したいずれかの態様のいくつかの実施形態では、前記ｍＲＮＡは、例えば、５’キャップまたは３’伸長部などの安定化部分を含み得る。いくつかの実施形態では、前記細胞は粘膜上皮細胞であり得る。

別の態様では、本開示は、一般にポリペプチドをコードｍＲＮＡとイン・ビボ（in vivo）送達ビヒクルとを含む組成物を記載する。

いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、上皮細胞の増殖を抑制し得る。これらの実施形態のいくつかでは、前記ポリペプチドは、カルプロテクチン、Ｓ１００Ａ８、またはＳ１００Ａ９を含み得る。

他の実施形態では、前記ポリペプチドは、自然免疫に関与し得る。これらの実施形態のいくつかでは、前記ポリペプチドは、カテリシジン抗菌タンパク質（ＣＡＭＰ）、カルプロテクチン、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、β−デフェンシン、Ｓ１００Ａ７、分泌型白血球阻害剤、リポカリン２、またはリゾチームを含み得る。いくつかの実施形態では、前記ｍＲＮＡは、例えば５’キャップまたは３’伸長部などの安定化部分を含み得る。

上記の概要は、本発明の開示されている各実施形態または総ての実装形態を記載するものではない。以下の記載は、例示的実施形態をより詳しく示す。本出願のいくつかの場合では、どの例が種々の組合せで使用可能であるかという指針が例の一覧で示される。各場合において、列挙される一覧は単に代表群として示され、排他的一覧として解釈されるべきでない。

ＡＲＣＡキャップを有するＣＡＭＰ ｍＲＮＡまたはＣＥキャップを有するＣＡＭＰ ｍＲＮＡによるトランスフェクション後のＫＢ細胞によるＣＡＭＰタンパク質の発現。（Ａ）ＫＢ細胞がＡＲＣＡ、ＣＥ ｃａｐ０、またはｃａｐ１キャップを有するＣＡＭＰ ｍＲＮＡによるトランスフェクション後のＣＡＭＰタンパク質の発現。上、代表的ウエスタンブロット。下、８時間の時点のＡＲＣＡキャップ発現を１００とした場合の定量的解釈。材料および方法に記載の通りのＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ分析を用いた分析の後、数種のキャッピング法によるトランスフェクション後のタンパク質発現を１００に対して示した。（Ｂ）ＡＲＣＡキャップを有するＣＡＭＰによるトランスフェクション後のＣＡＭＰタンパク質の経時的発現。パネル（Ａ）と同様に、ＡＲＣＡキャップを有するＣＡＭＰ ｍＲＮＡトランスフェクション後のＣＡＭＰタンパク質の発現は、ウエスタンブロットを用いて検出し（上のパネル）、下のパネルに、１００とした８時間の時点のレベルに対して示した。パネル（Ａ）および（Ｂ）で、エラーバーは、３回〜６回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。 ＡＲＣＡキャップを有するＳ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ａ８−ＩＲＥＳ−Ａ９、およびＡ８−ｎＩＲＥＳ−Ａ９ ｍＲＮＡによるトランスフェクション後のＫＢ細胞によるＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９タンパク質の発現。（Ａ）ＫＢ細胞をＳ１００Ａ８ ｍＲＮＡでトランスフェクトした後に、ウエスタンブロットを用いて検出し（代表的画像を示す）、図１の通りに定量した場合のＳ１００Ａ８タンパク質の発現。同じ実験を、（Ｂ）Ｓ１００Ａ９タンパク質；（Ｃ）ＫＢ細胞をＳ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９ ｍＲＮＡで共トランスフェクトした後のＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９タンパク質；（Ｄ）ＫＢ細胞をＡ８−ＩＲＥＳ−Ａ９ ｍＲＮＡでトランスフェクトした後のＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９タンパク質；ならびに（Ｅ）ＫＢ細胞をＡ８−ｎＩＲＥＳ−Ａ９ ｍＲＮＡでトランスフェクトした後のＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９タンパク質の発現の経時的推移を決定するためにも行った。ｍＲＮＡトランスフェクション後８時間の時点のタンパク質発現を１００とする。エラーバーは、３回〜６回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。 ＣＡＭＰおよびカルプロテクチンｍＲＮＡは、リステリア菌属およびサルモネラ菌属の侵入に対する耐性を増す。単層を（Ａ）８時間、（Ｂ）２４時間、（Ｃ）４８時間、ｍＲＮＡでトランスフェクトし、次いで、ＭＯＩ １００：１でＬ．モノサイトゲネス(L. monocytogenes)ＡＴＣＣ １０４０３Ｓと、またはＭＯＩ １：１でネズミチフス菌(S. typhimurium)ＡＴＣＣ １４０２８とともに２時間インキュベートした。２４時間または４８時間のトランスフェクション後、８時間の時点、また、３２時間後にも細胞を分割し、その後、さらに１６時間インキュベートした。細胞内生菌を、ビヒクル（ＰＢＳ）でモックトランスフェクトしたＫＢ細胞のＣＦＵ（１００とする）に対して表した平均パーセンテージ±ＳＤとして報告する。エラーバーは、３回〜６回の独立した実験の８時間ビヒクル対照に対する平均±ＳＤを示す。^＊ｐ＜０．０５。 ｍＲＮＡ送達は、アポトーシスを誘発せずに細胞生存率を低下させる。（Ａ） 細胞生存率は、ＫＢ細胞へのｍＲＮＡ構築物のｍＲＮＡ送達後３日間の示された時点で、ＭＴＴアッセイを用いて決定した。ＰＢＳモックトランスフェクト細胞を対照として用い、それらの生存率を１とした。各実験は３反復で行い、少なくとも２回繰り返した。（Ｂ）ｍＲＮＡ構築物のｍＲＮＡ送達後の、ウエスタンブロットを用いたアポトーシス細胞の分析。フローサイトメトリーを用いたアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣにより陽性染色された細胞をアポトーシスと見なした。パネルＡおよびＢでは、エラーバーは、３回〜６回の独立した実験の平均±ＳＤ(the means ± SD or three to six independent experiments)を示す。^＊ｐ＜０．０５。Ｃ．ｍＲＮＡ構築物送達後のＰＡＲＰ切断のウエスタンブロット分析。ＰＢＳモックトランスフェクト（ビヒクル）細胞および非トランスフェクト細胞を対照として用いた。 抗菌ｍＲＮＡは、ＫＢにおいて最大３２時間持続する。ＲＮＡを、トリゾール試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、カールズバッド、ＣＡ）およびＲＮｅａｓｙ ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、ＣＡ）を用いて単離した。全ＲＮＡをスーパースクリプトＩＩＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、カールズバッド、ＣＡ）で逆転写した。定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を、ＰｒｉｍｅＴｉｍｅプレデザインｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ（ヒトＣＡＭＰに対してはＨｓ．ＰＴ．４２．１０７３７４７、ヒトＳ１００Ａ８に対してはＨｓ．ＰＴ．４２．３６８２１４１、ヒトＳ１００Ａ９に対してはＨｓ．ＰＴ．４２．３０８０６３５、ヒトＡＣＴＢに対してはＨｓ．ＰＴ．４５．２２７９７０．ｇ；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、コーラルビル、アイオワ州）を用いて行った。ＣＡＭＰ、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９ Ａ８−ＩＲＥＳ−Ａ９およびＡ８−ｎＩＲＥＳ−Ａ９ ｍＲＮＡの発現レベルをＡＣＴＢ（β−アクチン）ｍＲＮＡに対して正規化した。（Ａ）ＣＡＭＰ ｍＲＮＡトランスフェクション。（Ｂ）Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９ ｍＲＮＡ（ｍｏｌ／ｍｏｌ＝１：１）共トランスフェクション。（Ｃ）Ａ８−ＩＲＥＳ−Ａ９ ｍＲＮＡトランスフェクション。（Ｄ）Ａ８−ｎＩＲＥＳ−Ａ９ ｍＲＮＡトランスフェクション。Ａ８−ＩＲＥＳ−Ａ９およびＡ８−ｎＩＲＥＳ−Ａ９ ｍＲＮＡをＳ１００Ａ９プライマーにより検出した。ｍＲＮＡトランスフェクション後４時間の時点のｍＲＮＡ存在量を、１００％に対する任意の値に割り付けた。バーは、３回〜６回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。 ｍＲＮＡトランスフェクション後のタンパク質発現。（Ａ）ＥＧＦＰ ｍＲＮＡトランスフェクション１６時間、（Ｂ）ＣＡＭＰ ｍＲＮＡトランスフェクション１６時間、（Ｃ）Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９ ｍＲＮＡ（ｍｏｌ／ｍｏｌ＝１：１）共トランスフェクション１６時間、（Ｄ）Ａ８−ＩＲＥＳ−Ａ９およびＡ８−ｎＩＲＥＳ−Ａ９ ｍＲＮＡトランスフェクション４０時間の免疫蛍光顕微鏡画像。ビヒクル、ＰＢＳ。Ｂａｒ＝１０μＭ。実験は３回行い、代表的画像を示す。 ヒト頭頸部組織および癌腫細胞株におけるＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の発現。（Ａ）正常隣接組織（ＮＡＴ）およびＨＮＳＣＣ組織、ならびに（Ｂ）ＴＲ１４６ ＨＮＳＣＣおよびＫＢ細胞におけるＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９のｍＲＮＡ発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲにより測定してＧＡＰＤＨに対して正規化し、点線を検出閾値として示す。３名の各患者からの対応するＮＡＴ組織およびＨＮＳＣＣ組織から抽出した全ＲＮＡを遺伝子発現分析用に個別にプールした。標準的条件下で培養した細胞株を採取し、およそ７０％コンフルエントで分析した。データは平均±ＳＤとして表した（ｎ＝２）。野生型および陰性トランスフェクション対照と比較した、（Ｃ）ＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９トランスフェクト細胞におけるＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９（Ｄ）ＴＲ１４６−ｓｈＲＮＡ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９ノックダウン細胞の代表的な免疫ブロット。β−アクチンを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した免疫ブロット分析のローディング対照として用いた。 Ｓ１００Ａ８／Ａ９は、ＫＢ細胞の足場依存的および足場非依存的増殖を抑制した。（Ａ）ＫＢ−ＥＧＦＰ細胞およびＫＢ野生型対照細胞と比較した、ＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞の増殖曲線。細胞を、３日毎に、非発熱性ポリスチレン組織フラスコの、１０％ＦＢＳを添加した新鮮なＭＥＭ中で増殖させた。（Ｂ）ＫＢ細胞、ＫＢ−ＥＧＦＰ細胞およびＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞に関する軟寒天での足場非依存的増殖（平均±ＳＥＭ、^＊ｐ＜０．０３、ｎ＝４）。ＴＲ１４６ ＷＴおよびＴＲ１４６−ｓｈＲＮＡ対照細胞と比較した、ＴＲ１４６−ｓｈＲＮＡＳ１００Ａ８／Ａ９ＫＤ細胞の、（Ｃ）組織フラスコの完全培地での足場依存的増殖（平均±ＳＤ、^＊ｐ＜０．０２、ｎ＝３）および（Ｄ）軟寒天でのコロニー形成（平均±ＳＥＭ、^＊＊＊ｐ＜０．０００５、ｎ＝２）。 Ｓ１００Ａ８／Ａ９発現は細胞周期およびＧ２／Ｍにおける有糸分裂停止を誘導した。（Ａ）同調後のＫＢ細胞、ＫＢ−ＥＧＦＰ細胞およびＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞の細胞周期分析。標準的条件下で培養した細胞を一晩、血清飢餓状態とし、アフィジコリン処理によってＧ１／Ｓで同調化させ、再び細胞周期に入るように刺激した。同調化細胞をヨウ化プロピジウムＤＮＡ染色溶液で染色し、Ｇ１／Ｓ遮断の解除後のＤＮＡ含量の変化をフローサイトメトリーにより分析した。（Ｂ）ホスホヒストンＨ３（Ｓｅｒ１０）で染色した同調化細胞のフローサイトメトリーにより分析した有糸分裂分析。（Ｃ）Ｇ２／Ｍ期の細胞のパーセンテージ。ＫＢ細胞、ＫＢ−ＥＧＦＰ細胞およびＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞を同調後に経時的に分析し、平均±ＳＥＭして報告した；ｎ＝２回の独立した実験（各分析は２反復で行った）；^＊ｐ＜０．０５。（Ｄ）２回の独立した実験の平均に相当する同調後有糸分裂細胞のパーセンテージ。有糸分裂細胞が少ないほど低いホスホヒストンＨ３（Ｓｅｒ１０）染色により示されるＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞。 Ｓ１００Ａ８／Ａ９は、ＳＣＣにおいてＧ２／Ｍ細胞周期チェックポイント調節分子を調節する。細胞周期レギュレーターの発現およびリン酸化（活性化／不活性化）状態を免疫ブロット分析により示す。示されたデータは、複数回の独立した繰り返し実験に代表的なものである。ヤギ抗β−アクチンポリクローナルＩｇＧを、タンパク質ローディング対照としてのβ−アクチンを検出するために用いた。（Ａ）ＫＢ、ＫＢ−ＥＧＦＰおよびＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９におけるＧ１／Ｓ調節タンパク質、サイクリンＡ、サイクリンＥ、ｐ２１およびＲｂ、Ｃｈｋ２およびＣｄｃ２５Ｂの発現。Ｓ１００Ａ８／Ａ９の発現の無い細胞では、ｐ−Ｃｈｋ２のリン酸化（Ｔｈｒ６８）は検出できなかった（示されていない）。（Ｂ）Ｇ２／Ｍレギュレーター、Ｃｈｋ１／ｐ−Ｃｈｋ１（Ｓｅｒ３４５）、有糸分裂活性ｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ（Ｔｈｒ４８）、Ｃｄｃ２５Ｃ／ｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ（Ｓｅｒ２１６）、Ｃｄｃ２／ｐ−Ｃｄｃ２（Ｔｈｒ１４／Ｔｙｒ１５）、およびサイクリンＢ１の発現およびリン酸化状態。（Ｃ）ウサギ抗１４−３−３βポリクローナルＩｇＧで捕捉した１４−３−３βと共免疫沈降（ＩＰ）したＣｄｃ２５Ｃタンパク質の免疫ブロット（ＩＢ）。全１４−３−３βタンパク質の免疫ブロットも示す。（Ｄ）野生型ＴＲ１４６（ＴＲ１４６ＷＴ）、対照ｓｈＲＮＡトランスフェクタント（ＴＲ１４６−ｓｈＲＮＡ対照）およびｓｈＲＮＡ誘導Ｓ１００Ａ８／Ａ９ノックダウン（ＴＲ１４６−ｓｈＲＮＡ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９ＫＤ）細胞におけるＳ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｃｄｃ２およびＣｄｃ２−（Ｔｈｒ１４／Ｔｙｒ１５）のタンパク質レベル。 Ｓ１００Ａ８／Ａ９とＰＰ２Ａホスファターゼの相互作用は活性を増強する。（Ａ）免疫ブロット法（ＩＢ）により検出された、Ｓ１００Ａ８／Ａ９複合体（２７Ｅ１０抗体でのＩＰ）またはＳ１００Ａ９サブユニットのいずれかと共免疫沈降（ＩＰ）したＰＰ２ＡＡα／β（左のパネル）およびＰＰ２Ａ−Ａα／βサブユニットと共ＩＰしたＳ１００Ａ９（Ｓ１００Ａ８／Ａ９複合体マーカータンパク質として使用）。（Ｂ）ＩＢを用いて検出した、ＫＢ細胞、ＫＢ−ＥＧＦＰ細胞およびＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞において比較したＰＰ２Ａサブユニットタンパク質の発現、リン酸化およびメチル化。示されるブロットは、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した全タンパク質の複数回の繰り返し（ｎ≧３）の代表的なものである。β−アクチンをタンパク質ローディング対照として使用した。（Ｃ）ＫＢ−ＥＧＦＰ細胞およびＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞におけるＰＰ２Ａ−Ｃホスファターゼ活性を、Ａに示される検出可能な、Ｓ１００Ａ８／Ａ９と共免疫沈降した（２７Ｅ１０抗体）ＰＰ２Ａ−Ａα／βに対して正規化した後、さらにＫＢ−ＥＧＦＰレベルに対しても正規化した。データは、平均±ＳＥ（ｎ＝２）として示す。＃エラーバーは示さない。（Ｄ）１０ｎＭオカダ酸（ＯＡ）による、Ｓ１００Ａ８／Ａ９依存的ｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ（Ｓｅｒ２１６）リン酸化の阻害。ＩＢにより検出した、ＯＡ不在下（左のパネル）および存在下（右）でのｐ−Ｃｄｃ２５Ｃの発現。 提案されるＳ１００Ａ８／Ａ９（カルプロテクチン）により媒介されるＧ２／Ｍ細胞周期の調節。本報告において概要が示されるチェックポイントシグナル伝達経路。実線は直接的調節を表し、破線は未知の機構を表す。 Ｓ１００Ａ８／Ａ９の安定発現は、口腔底腫瘍増殖を低下させる。Ｓ１００Ａ８／Ａ９発現ＫＢ癌細胞およびＥＧＦＰのみを発現するシャムトランスフェクトＫＢ細胞を、実施例３に記載の通りに別群の健常マウスの口腔底に注射した。（Ａ）口腔底のＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞により形成された同所性腫瘍は、１７日までにＥＧＦＰ発現ＫＢ細胞よりも６５％小さくなった（ｐ＜０．０３）。（Ｂ）口腔底でＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞から形成された腫瘍はＫＢ−ＥＧＦＰ細胞腫瘍よりも著しく小さく、周囲組織への浸潤性が小さかった。（Ｃ）ＫＢ−ＥＧＦＰ細胞腫瘍は同等の大きさのＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞腫瘍よりも組織学的に（ヘマトキシリンおよびエオジンで染色）より脱分化され、壊死領域が大きかった。示されるデータは、各群３個体のマウスを用いた３回の独立した実験から得られたものである。 Ｓ１００Ａ８／Ａ９の安定なｓｈＲＮＡノックダウンは、より大きな口腔底腫瘍増殖と相関する。ＴＲ１４６口内癌細胞をｓｈＲＮＡでトランスフェクトし、内因性のＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の発現をノックダウンした。ノックダウンは、シャムトランスフェクト細胞（Ｎｅｇ３）よりもおよそ７０％低いＳ１００Ａ８／Ａ９タンパク質発現（Ａ８Ａ８ｃ１０細胞）をもたらした（データ示さず）。Ｓ１００Ａ８／Ａ９のｓｈＲＮＡノックダウンを有するＴＲ１４６細胞（Ａ８Ａ８ｃ１０細胞）は、１７日目までにシャムトランスフェクト（Ｎｅｇ３）細胞よりも２０％大きい同所腫瘍を形成する（ｐ＜０．２）。示されるデータは、各群３個体のマウスを用いた２回の独立した実験から得られたものである。 ＫＢ細胞へのＥＧＦＰ ｍＲＮＡ送達に及ぼす唾液濃度および処理時間の影響。細胞を３７℃で１０％、５０％または９０％唾液とともに（Ａ）１分間、（Ｂ）３分間、または（Ｃ）５分間インキュベートし、新鮮培地で３回洗浄した後、パッケージされている、ＥＧＦＰをコードしている改変ｍＲＮＡとともにインキュベートした。５０％唾液で処理したがｍＲＮＡ送達を行わなかった細胞を対照として使用した。 ＫＢ細胞へのＥＧＦＰ ｍＲＮＡ送達： 唾液処理の影響を逆転させるための洗浄頻度の効果。細胞を９０％唾液で３分間処理し、新鮮培地を用いて示された頻度で洗浄した後、ｍＲＮＡトランスフェクションを行った。

例示的実施形態の詳細な説明
本開示は、細胞が機能に異常を来すおよび／または病原体による感染に感受する可能性および／または程度を引き下げ得る１種類以上のポリペプチドを発現するように、細胞にｍＲＮＡを導入することを含む、組成物および方法に関する。よって、本方法および組成物は、例えば、感染性疾患およびある種の新生物を含む、感染から生じる病態に対する療法を提供し得る。ひと度、細胞に導入されると、本ポリペプチドは、そのｍＲＮＡが標的細胞内で翻訳されさえすれば発現され、すなわち、発現が恒久的でなく一過性であってもよい。それらの細胞がアクセス可能な標的組織を形成する場合、前記ｍＲＮＡは持続的な治療利益のために繰り返し再導入することができる。

粘膜上皮は、微生物の侵入に対して第１の防御線を提供する。口腔粘膜およびその他の粘膜の上皮細胞は、サイトゾル内のカルプロテクチン（Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９ヘテロ二量体）およびエンドソーム内のカテリシジン抗菌タンパク質（ＣＡＭＰ）の、２つのエフェクター抗菌ペプチド（ＡＭＰ）を用いた細胞自律的機構を介して、細菌の侵入からの保護を与える。自然免疫が温和に増大され得るかどうか知見を得るため、本発明者らは、上皮細胞をＣＡＭＰ、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９オープンリーディングフレーム、Ａ８−ＩＲＥＳ−Ａ９（融合物）、またはＡ８−ｎＩＲＥＳ−Ａ９（融合物、天然ＩＲＥＳ）のいずれかを含有するｍＲＮＡ構築物で一過性にトランスフェクトした。このｍＲＮＡの安定性を維持するために、アンチリバースキャップアナログ(anti-reverse cap analogue)（ＡＲＣＡ）でキャップされたＣＡＭＰ ｍＲＮＡは、キャッピング酵素（ＣＥ） ｃａｐ ０またはＣＥ １よりも有効であった。ＣＡＭＰ、Ｓ１００Ａ８、およびＳ１００Ａ９タンパク質レベルは一般に、ｍＲＮＡトランスフェクション後１６時間にピークがあった。対照的に、Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９での共トランスフェクションは、２４時間で最大のタンパク質発現を生じた。タンデムｍＲＮＡ（Ａ８−ＩＲＥＳ−Ａ９およびＡ８−ｎＩＲＥＳ−Ａ９）でのトランスフェクション後では、Ｓ１００Ａ８タンパク質レベルは１６時間で最大であったが、Ｓ１００Ａ９は３２時間〜４０時間にピークがあった。個々のｍＲＮＡによるトランスフェクションでは、ＣＡＭＰおよびカルプロテクチンはそれぞれ、最大４８時間、リステリア菌属(Listeria)およびサルモネラ菌属(Salmonella)による侵入に対する上皮細胞の耐性を有意に高め、Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９の共トランスフェクションは、タンデム構築物よりも有効であった。これらのトランスフェクションは４８時間後の細胞生存率を２０％低下させ、アポトーシスへの寄与は２％に過ぎなかった。これらの結果を考え合わせると、侵入病原体に対する上皮細胞の耐性は上皮細胞への抗菌ｍＲＮＡの一時的トランスフェクションにより増強され得ることが示唆される。

ヒトＣＡＭＰは、多くの種で発現される、細菌、真菌、およびエンベロープウイルスに対して広域活性を有し、かつ、免疫調節作用も示すカチオン性抗菌ペプチドの大ファミリーのメンバーである(Zanetti, 2004. J. Leukoc. Biol. 75: 39-48; Bucki et al., 2010. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 58: 15-25; Strandberg et al., 2012. Infect. Immun. 80: 3930-3938; Burton et al., 2009. Nat. Prod. Rep. 26: 1572-1584)。シグナルペプチドが切り出された後、セリンプロテアーゼであるプロテイナーゼ３による切断を介して活性化されるまで、ＣＡＭＰによりコードされているヒトＣＡＰ−１８前駆体は好中球顆粒および上皮細胞で保存される(Sorensen et al., 2001. Blood 2001, 97: 3951-3959)。３７残基の活性ペプチド（ＬＬ−３７）は、例えば、微生物の直接的死滅、走化性およびケモカイン誘導、炎症性応答の調節、ならびにアジュバント作用、血管新生作用、および創傷治癒作用などの広範な生物学的応答を媒介する(Nijnik et al., 2009. Curr. Opin. Hematol. 16: 41-47)。ＬＬ−３７は、好中球およびマクロファージのファゴリソソーム内ならびに急性炎症部位で直接的に抗菌性を示すと思われ(Nijnik et al., 2009. Curr. Opin. Hematol. 16: 41-47)、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)(Larrick et al., 1995. Immunotechnology 1: 65-72)、およびＡ群、Ｂ群およびＣ群連鎖球菌(Streptococcus) (Dorschner et al., 2001. J. Invest. Dermatol. 117: 91-97)に対して広域抗菌活性を示す。ＣＡＭＰ発現は、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３(Wang et al., 2004. J. Immunol. 173: 2909-2912)、病原体(Midorikawa et al., 2003. Infect. Immun. 71: 3730-3739; Nijnik et al., 2009. Curr. Opin. Hematol. 16: 41-47)またはリポ多糖類（ＬＰＳ）(Nell et al., 2004. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 42: 225-231)により誘導され得る。ＣＡＭＰ／ＬＬ−３７産生の低下には、例えば、コストマン病およびパピヨン・ルフェーヴル症候群(Carlsson et al., 2006. J. Periodontol. 77: 744-751; de Haar et al., 2006. Infect. Immun. 74: 5284-5291)、クローン病(Schauber et al., 2006. Mol. Nutr. Food Res. 50: 1006-1012)およびアトピー性皮膚炎(Ong et al., 2002. N. Engl. J. Med. 347: 1151-1160)などの疾患で上皮細胞における病原体の侵入およびコロニー形成が伴う。

カルプロテクチンは、カルシウム結合タンパク質Ｓ１００Ａ８（ＭＲＰ８またはカルグラニュリンＡ、１０．８ｋＤａ）およびＳ１００Ａ９（ＭＲＰ１４またはカルグラニュリンＢ、１３．２ｋＤａ）のヘテロ二量複合体である(Champaiboon et al., 2009. J. Biol. Chem. 284:7078-90)。Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９は、Ｓ１００タンパク質ファミリーのメンバーである。ファミリーメンバーは２つのＥＦ−ハングカルシウム結合モチーフを含み、これらのタンパク質は、細胞増殖、細胞分化、細胞周期進行、細胞生存、タンパク質のリン酸化、転写、癌発生および炎症性疾患に関与する(Donato, 2001. Int. J. Biochem. Cell Biol. 33: 637-668; Santamaria-Kisiel et al., 2006. Biochem. J. 396: 201-14; Khammanivong et al., 2013. PLoS One 8: e 69395)。これらのカルシウム結合モチーフは、細菌の侵入に対する上皮細胞耐性に関与すると思われる(Champaiboon et al., 2009. J. Biol. Chem. 284:7078-90)。カルプロテクチンは、粘膜および表皮カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)ならびにカプノサイトファガ・スプティゲナ(Capnocytophaga sputigena)、大腸菌(Escherichia coli)、表皮ブドウ状球菌(Staphylococcus epidermis)、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、およびポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)を含む細菌に対して広域の抗菌活性を示す(Champaiboon et al., 2009. J. Biol. Chem. 284:7078-90; Miyasaki et al., 1993. J. Dent. Res. 72: 517-523; Sohnle et al., 1991. J. Infect. Dis. 163: 187 -192; Steinbakk et al., 1990. Lancet 336: 763-765; Nisapakultorn et al., 2001. Infect. Immun. 69: 4242-4247)。リステリア菌は、侵入に成功した後に上皮内での生存を容易にするために、カルプロテクチンを動員して細胞質の微小管と共局在し、抗リステリア活性および自律的細胞性免疫を覆すと思われる(Zaia et al., 2009. Mucosal Immunol. 2: 43-53)。

従って、粘膜上皮細胞は、大方はエンドソーム内のＣＡＭＰ／ＬＬ−３７(Chamilos et al., 2012. Blood 120: 3699-3707)とサイトゾル内のカルプロテクチン（Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９）(Champaiboon et al., 2009. J. Biol. Chem. 284:7078-90)の２つの抗菌エフェクターを主要に用いて侵入病原体からの保護および抑制を可能とする。本発明者らは、本明細書で、侵入微生物性病原体に対する上皮細胞内耐性が特定の抗菌エフェクターｍＲＮＡ（例えば、ＣＡＭＰ、Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９）の一過性送達によって増強され得る様式を記載する。治療目的のｍＲＮＡトランスフェクションは、全身投与またはｅｘ ｖｉｖｏ投与を介してタンパク質の発現を復帰または増強することができる(Tavernier et al., 2011. J. Control. Release. 150: 238-47)。このアプローチは、ＤＮＡによるトランスフェクションと、それに伴う、例えば宿主細胞への不正確な突然変異誘発挿入を含むチャレンジを回避する。粘膜の自然免疫を増強する目的で、本発明者らは、ヒト上皮細胞へのＣＡＭＰおよびＳ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９ ｍＲＮＡの送達とそのようなトランスフェクションの機能的抗菌作用を報告する。

ｍＲＮＡ安定性の最適化
ｍＲＮＡの５’末端におけるキャッピングは、発現されるメッセージの安定性を増す。ＡＲＣＡは、最大８０％の有効性でキャップすることができ、このキャッピング酵素（ＣＥ）は、キャッピング効率を１００％に高めることができる(Zhao et al., 2010. Cancer Res. 70: 9053-9061)。キャッピング戦略を最適化するために、本発明者らは、ＡＲＣＡキャップを有するｍＲＮＡを生じるｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）Ｔ７ Ｕｌｔｒａ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、カールズバッド、ＣＡ）とキャッピング酵素（ＣＥ）および２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼキャッピング酵素を用いてｃａｐ ０またはｃａｐ １を生じるｍＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＮＡシステム（Ｃｅｌｌ Ｓｃｒｉｐｔ Ｉｎｃ．、マディソン、ＷＩ）を比較した。ＣＡＭＰ ｍＲＮＡを、異なるキャッピングシステムを用いて合成し、ＫＢ細胞に送達し、タンパク質発現をウエスタンブロット分析により検出した。ＡＲＣＡキャップを有するｍＲＮＡによるトランスフェクション後、８時間、２４時間、および４８時間で、ＫＢ細胞は、ＣＥ ｃａｐ ０よりも高かったＣＥ ｃａｐ １によるトランスフェクション後よりも多くのＣＡＭＰタンパク質を発現した（図１Ａ）。ＣＡＭＰタンパク質レベルは約１６時間にピークがあり、ＡＲＣＡキャップを有するｍＲＮＡ送達後４０時間〜４８時間では約５０％低下した（図１Ｂ）。その後、ＡＲＣＡキャッピングを総ての実験に用いた。本発明者らはまた、６４Ａおよび１５０Ａの３’伸長部とともに発現された場合のｍＲＮＡの安定性も比較した。これらにはほとんど差はなく（データ示さず）、本発明者らはその後の総ての実験で１５０Ａを用いた。

アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）でキャップされたｍＲＮＡの安定性
ＫＢ細胞が天然に発現するＣＡＭＰ、Ｓ１００Ａ８、およびＳ１００Ａ９のｍＲＮＡは検出レベル未満である（データ示さず）。従って、ＫＢ細胞において発現される内因性Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、およびＣＡＭＰ ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャップを有するｍＲＮＡによるトランスフェクション後の二次的レベルにほとんど寄与しない。Ｓ１００Ａ８とＳ１００Ａ９の両方を含む融合ｍＲＮＡを合成するために、Ｋｏｚａｋ配列を含有するＳ１００Ａ８ ＯＲＦをｐＩＲＥＳ ＭＣＳ Ａにクローニングし、Ｓ１００Ａ９をＭＣＳ Ｂにクローニングした。ｐＩＲＥＳによる下流翻訳の減弱を無くすために、天然ＩＲＥＳ（ｎＩＲＥＳ）を構築し、Ｓ１００Ａ８ ＯＲＦとＳ１００Ａ９ ＯＲＦの間に挿入した。総ての必須エレメントを含有する配列をｐＧＥＭ４Ｚ．２ｂｇＵＴＲ．１５０Ａにクローニングした後、Ａ８−ＩＲＥＳ−Ａ９ ｍＲＮＡおよびＡ８−ｎＩＲＥＳ−Ａ９ ｍＲＮＡを合成した。イン・ビトロ（in vitro）で転写されたＡＲＣＡキャップを有するＣＡＭＰ、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ａ８−ＩＲＥＳ−Ａ９、およびＡ８−ｎＩＲＥＳ−Ａ９ ｍＲＮＡのトランスフェクションを、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した（図５）。各ｍＲＮＡトランスフェクション後４時間で、特定の細胞内ｍＲＮＡは、最高測定レベルであった。トランスフェクション後１６時間〜２０時間では、ＣＡＭＰ ｍＲＮＡレベルは４時間時点のおよそ半分であったが、このことはＫＢ細胞での半減期は１２時間〜１６時間の間であったことを示す（図５Ａ）。これに対して、Ｓ１００Ａ８ ｍＲＮＡの共トランスフェクションでは、ｍＲＮＡの半減期は１２時間〜１６時間となり、Ｓ１００Ａ９ ｍＲＮＡの共トランスフェクションでは、ｍＲＮＡの半減期は８時間〜１２時間となった（図５Ｂ）。タンデムｍＲＮＡがトランスフェクトされた場合には、Ａ８−ＩＲＥＳ−Ａ９の半減期は１２時間〜１６時間であり、Ａ８−ｎＩＲＥＳ−Ａ９ ｍＲＮＡの半減期は８時間〜１２時間であった（図６Ｃ、６Ｄ）。これらのｍＲＮＡの半減期はＫＢ細胞では８時間〜１６時間であった。

Ｓ１００Ａ８とＳ１００Ａ９の共トランスフェクションは各タンパク質の安定性を増す
ＫＢ細胞に送達した後に、Ｓ１００Ａ８（図２Ａ）、Ｓ１００Ａ９（図２Ｂ）、およびカルプロテクチン（１：１ｍｏｌ／ｍｏｌ Ｓ１００Ａ８＋Ｓ１００Ａ９）（図２Ｃ）の場合のＡＲＣＡキャップを有するｍＲＮＡを、タンパク質発現に関して比較した。Ｓ１００Ａ８タンパク質単独の発現は１６時間で最大であり、約２８時間の時点でほぼ半減し（図２Ａ）、Ｓ１００Ａ９タンパク質は１６時間で最大であり、約４０時間〜４８時間の時点で半減した（図２Ｂ）。これに対し、Ｓ１００Ａ８ ｍＲＮＡとＳ１００Ａ９ ｍＲＮＡの共トランスフェクション（各半量がＳ１００Ａ８またはＳ１００Ａ９のいずれかによるトランスフェクションに匹敵）は、各ペプチドの安定性を増すと思われた。例えばＳ１００Ａ８とは異なり（図２Ａ）、各タンパク質は時間経過中、終始、発現された（図２Ｃ、２Ｄ）。Ｓ１００Ａ８では、タンパク質は２４時間の時点で最大であり、約７２時間の時点で半減した（図２Ｃ）。Ｓ１００Ａ８と共トランスフェクトした場合にも、Ｓ１００Ａ９タンパク質は２４時間の時点で最大であり、約４８時間〜７２時間の時点で半減した（図２Ｃ）。Ｓ１００Ａ８ ｍＲＮＡとＳ１００Ａ９ ｍＲＮＡの共トランスフェクションは各ペプチドの安定性の増強をもたらし、カルプロテクチンヘテロ二量体の形成が好ましいことが示唆された。

タンデム構築物を用いたＳ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９タンパク質の発現
Ａ８−ＩＲＥＳ−Ａ９ ｍＲＮＡのトランスフェクション後、Ｓ１００Ａ８タンパク質の発現は１６時間で最大となり、２４時間〜３２時間の時点で半減し（図２Ｄ）、Ｓ１００Ａ９タンパク質は３２時間で最大となり、約４８時間〜７２時間の時点半減した（図２Ｄ）。Ａ８−ｎＩＲＥＳ−Ａ９ ｍＲＮＡのトランスフェクションでは、Ｓ１００Ａ８タンパク質の発現は１６時間の時点で最大であり、２４時間〜３２時間の時点で半減し（図２Ｅ）、Ｓ１００Ａ９タンパク質は４０時間の時点で最大であり、約４０時間〜４８時間の時点で半減した（図２Ｅ）。Ｓ１００Ａ８をＳ１００Ａ９と共発現させた場合（図２Ｃ）、タンデムｍＲＮＡ構築物の使用は一般に、Ｓ１００Ａ８ ｍＲＮＡのみのトランスフェクションに比べてタンパク質サブユニットを安定化させると思われた（図２Ａ）。

ＣＡＭＰおよびカルプロテクチンの細胞内提示
ｍＲＮＡトランスフェクションの後、ＣＡＭＰおよびカルプロテクチンはまた、ＫＢ細胞で、免疫蛍光を用いても検出された。内因性ＣＡＭＰ、Ｓ１００Ａ８、およびＳ１００Ａ９タンパク質レベルは検出限界以下であり、モックトランスフェクションではバックグラウンドを超える蛍光は検出されなかった（図６）。ＥＧＦＰ、ＣＡＭＰ、またはカルプロテクチンに関するｍＲＮＡ（Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９）の送達後１６時間に有意な蛍光が検出されたが、これはｍＲＮＡの送達が、ＥＧＦＰ、ＣＡＭＰ、およびカルプロテクチンタンパク質発現（図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ）を増強することが示唆される。Ａ８−ＩＲＥＳ−Ａ９ ｍＲＮＡおよびＡ８−ｎＩＲＥＳ−Ａ９ ｍＲＮＡによるトランスフェクション後１６時間の時点では、有意な蛍光は検出されなかった（データ示さず）。しかしながら、ｍＲＮＡトランスフェクション後４０時間の時点で、カルプロテクチンの蛍光シグナルは検出されなかった（図６Ｃ）。これらの結果はウエスタンブロット分析と一致する（図１Ｂ、図２Ｄ、２Ｅ）。

ＣＡＭＰまたはカルプロテクチンｍＲＮＡのトランスフェクションは細菌侵入に対するＫＢ細胞の耐性を増す
本発明者らは、上皮細胞へのｍＲＮＡのトランスフェクション後に産生された抗菌タンパク質の選択が細菌病原体による侵入に対する耐性に影響を及ぼしたかどうかを判定した。総てのＣＡＭＰおよびカルプロテクチンｍＲＮＡ構築物によるトランスフェクション後、リステリア菌属およびサルモネラ菌属による侵入に対する上皮細胞の耐性は、８時間（図３Ａ）、２４時間（図３Ｂ）、および４８時間（図３Ｃ）で有意に高まった。耐性は、トランスフェクション後８時間の時点で最大であると思われた。ＣＡＭＰおよびＳ１００Ａ８＋Ｓ１００Ａ９ ｍＲＮＡトランスフェクションスキームは、タンデムｍＲＮＡ構築物よりも有効に耐性を増すと思われた。しかしながら、タンデム構築物に含まれる、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９ ｍＲＮＡのモル当量はＳ１００Ａ８＋Ｓ１００Ａ９よりも少ない。従って、タンデム構築物は、共トランスフェクションと同様の有効性がある可能性がある。

ＴｒａｎｓＩＴ−ｍＲＮＡ送達系はアポトーシスを誘発せずに細胞生存率を低下させる
ＴｒａｎｓＩＴ−ｍＲＮＡトランスフェクション試薬によって送達されたこれらのｍＲＮＡの細胞致死性を、ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存率を測定することにより、また、フローサイトメトリーおよびＰＡＲＰ切断によりアポトーシス細胞を定量することより分析した。非トランスフェクト細胞に比べて、ビヒクル、ＣＡＭＰ、Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９、Ａ８−ＩＲＥＳ−Ａ９、またはＡ８−ｎＩＲＥＳ−Ａ９ ｍＲＮＡによる細胞のトランスフェクションは、４８時間後および７２時間後に細胞生存率を有意に低下させた（図４Ａ）。非トランスフェクト細胞に比べて、ビヒクル、ＣＡＭＰ、Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９、Ａ８−ＩＲＥＳ−Ａ９またはＡ８−ｎＩＲＥＳ−Ａ９ ｍＲＮＡの送達は、アポトーシスに影響を及ぼさなかった（図４Ｂ）。各トランスフェクション後７２時間のアポトーシス細胞の小さな増加が、非トランスフェクト細胞から差別化された。ＫＢ細胞のアポトーシス状態のさらなる分析では、カスパーゼ活性化の指標としてのポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）切断のウエスタンブロット分析を用いた(Taylor et al., 2008. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 9: 231-241)。ＰＡＲＰ切断は、ｍＲＮＡのトランスフェクション後３２時間で上昇した（図４Ｃ）。非トランスフェクト細胞と比べた場合、前記ｍＲＮＡの送達後に切断されたＰＡＲＰのパターンは類似していた（図４Ｃ）。

本発明者らは、侵入病原体に対する上皮細胞の耐性がイン・ビトロにおいて抗菌ＣＡＭＰおよびカルプロテクチンをコードするｍＲＮＡ（Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９、Ａ８−ＩＲＥＳ−Ａ９およびＡ８−ｎＩＲＥＳ−Ａ９）を用いた一過性トランスフェクションによって増強され得ることを初めて示す。ｍＲＮＡカーゴを備えた遺伝子導入ビヒクルは、トランスフェクトされたｍＲＮＡの合成および安定性の容易さは有用なタンパク質産物を生じるには不十分であることの証明となるのではなないか(Tavernier et al., 2011. J. Control. Release. 150: 238-47)という持続的な懸念にも関わらず、疾患の治療用ＤＮＡを送達するビヒクルの魅力的な代替となると思われる。ｍＲＮＡの送達は抗原の総てのエピトープの同時発現を助け、操作および精製もむしろ簡単である。

本発明者らが粘膜面もしくは表皮面または接近可能な組織に対する潜在的治療薬の開発のためにこのアプローチを考える場合、ｍＲＮＡの送達は、ＤＮＡ遺伝子導入技術を超えるいくつかの利点を持つ。ｍＲＮＡはゲノムに組み込まれず、トランスフェクションは一過性に留まるので、ｍＲＮＡトランスフェクションの薬学的安全性は、ＤＮＡ遺伝子導入療法よりも大きい。粘膜免疫を増強する治療薬を開発する目的で、本発明者らは、イン・ビトロで転写され、キャップされ、かつポリアデニル化された、抗菌タンパク質を指定するｍＲＮＡのヒト上皮細胞への送達と、相当する機能的効果を初めて示す。

アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）による５’キャッピングを介して改善されたイン・ビトロ翻訳により合成されたｍＲＮＡカーゴの安定性、およびタンパク質発現は、シスおよびトランスでポリ（Ａ）鎖を使用する３’ｍＲＮＡキャッピングによっては高めることができる(Mockey et al., 2006. Biochem. Biophys. Res. Commun. 340: 1062-1068)。よって、特定のｍＲＮＡ修飾がｍＲＮＡの安定性を改善する。しかしながらやはり、特定のｍＲＮＡカーゴ、翻訳されるタンパク質の安定性、および標的細胞は総て、動態および新たなタンパク質発現の効率に影響を及ぼす。

本発明者らの研究では、種々のｍＲＮＡを比較した。ＣＡＭＰ、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９タンパク質は、ｍＲＮＡトランスフェクション後１６時間にピークがあった（図１Ｂ、２Ａ、２Ｂ）。Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９ ｍＲＮＡの共トランスフェクション後、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９タンパク質は２４時間にピークがあり、Ｓ１００Ａ８ ｍＲＮＡまたはＳ１００Ａ９ ｍＲＮＡによる単独トランスフェクションに比べてゆっくり低下した（図２Ｃ）。Ｓ１００Ａ８とＳ１００Ａ９は自発的にヘテロ二量体を形成するので(Hsu et al., 2009. Antiinflamm. Antiallergy Agents Med. Chem. 8: 290-305)、共トランスフェクション後の二量体化は、各サブユニットの分解を阻害することが示唆される。

Ｓ１００Ａ８とＳ１００Ａ９のヘテロ二量複合体であるカルプロテクチンは、上皮細胞の細胞質の自然免疫を高め、リステリア種およびサルモネラ種を含む侵入細菌に対する耐性を増す。Ｓ１００Ａ８ ｍＲＮＡとＳ１００Ａ９ ｍＲＮＡの両方での共トランスフェクションは、ＫＢ細胞においてＳ１００Ａ８／Ａ９の産生を誘導した（図６Ｃ）。カルプロテクチンの翻訳のためのトランスフェクションプロセスを簡単にするために、本発明者らは、同じ二シストロン性ｍＲＮＡ転写産物から２つの遺伝子の高レベル発現を可能とする哺乳動物発現ベクターを構築するためにｐＩＲＥＳを用いた。このベクターは、２つの多重クローニング部位（ＭＣＳ ＡおよびＢ）により挟み込まれた脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む(Bochkov et al., 2006. Biotechniques 41: 283-284, 286, 288)。第１のシストロンは、キャップ依存的スキャニング機構により翻訳され、第２のシストロンは、キャップ非依存的ＩＲＥＳエレメント開始機構により翻訳される(Bochkov et al., 2006. Biotechniques 41: 283-284, 286, 288)。ｐＩＲＥＳは、ＭＣＳ Ａに比べてＭＣＳ Ｂにクローニングされた遺伝子の翻訳率を低減する部分的に無能化されたＩＲＥＳ配列を含む(Rees et al., 1996. Biotechniques 20: 102-110)。単独トランスフェクション構築物からのカルプロテクチンの翻訳を促進するために、Ｓ１００Ａ８ ＯＲＦとＳ１００Ａ９ ＯＲＦをｐＩＲＥＳベクターにクローニングし、そのプラスミドをＫＢ細胞にトランスフェクトした。ｐＩＲＥＳとタンデムにクローニングされたｃＤＮＡを用い、カルプロテクチン（Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９二量体）の形成を観察することができる(Champaiboon et al., 2009. J. Biol. Chem. 284:7078-90)。本発明者らがｐＩＲＥＳとのタンデムｍＲＮＡをクローニングした時にはカルプロテクチン二量体も見られ（図６Ｄ）、これらのシグナルはＳ１００Ａ８ ｍＲＮＡとＳ１００Ａ９ ｍＲＮＡでの共トランスフェクションと類似していた（図６Ｃ）。

ｐＩＲＥＳとともにＭＣＳ Ｂ部位にクローニングされたＳ１００Ａ９ ｍＲＮＡは翻訳の減弱を示すと予想されることから、本発明者らはまた天然型（ｎ、非減弱）ＩＲＥＳを有するベクターも構築した。ｐＩＲＥＳおよびｎＩＲＥＳを伴うカルプロテクチンタンパク質発現は類似していた（図６Ｄ、上および下；図２Ｄ、２Ｅ）。同濃度のｍＲＮＡベクターを細胞に送達したので、これらのタンデム構築物はＳ１００Ａ８またはＳ１００Ａ９単独よりも効率的に翻訳を行うと思われるが、定量的比較は行えない。同様に、ＣＡＭＰ ｍＲＮＡのトランスフェクションおよび翻訳も首尾よく行えたが、本発明者らはカルプロテクチンと効率を比較することができない。しかしながら、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９タンパク質の発現は、共トランスフェクトされた場合、またはＡ８−ＩＲＥＳ−Ａ９もしくはＡ８−ｎＩＲＥＳ−Ａ９ ｍＲＮＡが送達された場合により安定であったのは明らかである（図２Ｄ、２Ｅ）。Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９、Ａ８−ＩＲＥＳ−Ａ９およびＡ８−ｎＩＲＥＳ−Ａ９ ｍＲＮＡに関するいくつかの構築物は異なる翻訳動態をもたらし、ｐＩＲＥＳ（図２Ｄ）およびｎＩＲＥＳ（図２Ｅ）近位のＭＣＳ Ｂ部位挿入は遅延を示したことが明らかである。特定の理論に縛られることを望むものではないが、ＫＢ細胞において、ＭＣＳ Ｂ部位のｍＲＮＡは効率の低いキャップ非依存性ＩＲＥＳ機構によってスキャンされて翻訳が開始され得る。

本発明者らの結果は、ＫＢ細胞におけるトランスフェクション後のＡＲＣＡキャップを有するＣＡＭＰ、Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９、Ａ８−ＩＲＥＳ−Ａ９、およびＡ８−ｎＩＲＥＳ−Ａ９ ｍＲＮＡの半減期が８時間〜１６時間の間であったことを示した（図６Ａ〜Ｄ）。これらの半減期を引き上げるために、これらのｍＲＮＡ構築物は、２つの連続するヒトβ−グロビンＵＴＲを含んだ。これらのトランスフェクトｍＲＮＡの安定性の違いは、ｍＲＮＡの二次構造によるものであり得るが、それはＲＮＡ分解酵素およびＲＮＡ分解の調節に関連する補助タンパク質による認識に影響を及ぼし得る。ｍＲＮＡの半減期の違いは、リポソーム送達後の細胞質分解および翻訳から隔離されているまたはそれらに曝されているプールの割合を反映し得るが(Barreau et al., 2006. RNA 12: 1790-1793)、この現象が本発明者らの結果を説明するとは思えない。本発明者らのトランスフェクションでは、市販の非リポソーム、カチオン性ポリマー／脂質形成（ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ｍＲＮＡトランスフェクションキット、Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ、マディソン ＷＩ）を使用した。早期終止コドンを有するｍＲＮＡは、ナンセンス変異依存分解経路を介して、全長メッセージの翻訳を妨げ、全長タンパク質の産生を妨げることができるが(Apcher et al., 2011. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108: 11572-11577)、この機構が、本発明者らの細胞におけるｍＲＮＡ半減期およびタンパク質翻訳の変動を説明できるかどうかはまだ明らかでない。

以下により詳細に記載するように、ｍＲＮＡは１以上の改変塩基を含むように構築することができる。このような改変ｍＲＮＡは、安定性の増大および／または免疫応答の可能性の低減を示し得る(Kormann et al, 2011, Nat Biotechnol 29(2):154-157)。

最後に、ｍＲＮＡトランスフェクション効率に関する試験は、新規ないし拡張機能であり、関連する細胞傷害性またはアポトーシス誘導は最小である。本発明者らのデータは、ＣＡＭＰ ｍＲＮＡまたはカルプロテクチンｍＲＮＡいずれの送達もリステリア菌属およびサルモネラ菌属による侵入に対する上皮細胞の耐性を有意に増すことができることを示した（図３Ａ〜３Ｃ）。これらの実験を行うために、本発明者らは、ＴｒａｎｓＩＴ−ｍＲＮＡトランスフェクション試薬（６０〜９０％）の最適使用に必要な細胞集密度の違いを調整し、抗生物質保護アッセイの最適実施のための細胞のコンフルエントを４０〜６０％とした(Champaiboon et al., 2009. J. Biol. Chem. 284:7078-90; Nisapakultorn et al., 2001. Infect. Immun. 69: 4242-4247; Nisapakultorn et al., 2001. Infect. Immun. 69, 3692-3696)。最適トランスフェクション後に抗生物質保護アッセイを行うために、トランスフェクション後８時間および３２時間の時点で細胞を分割し、次に、細胞を、細菌侵入のために細胞のコンフルエントを４０％〜６０％に調整するためにさらに１６時間インキュベートした。ｍＲＮＡのトランスフェクション後２４時間および４８時間の時点の抗菌活性は、トランスフェクション後８時間の時点より低く（図３Ａ〜３Ｃ）、経時的な細胞分裂（および継代）が細胞内ＣＡＭＰまたはカルプロテクチンタンパク質レベルを引き下げた。しかしながらやはり、残留するＬＬ−３７およびカルプロテクチンレベルは、トランスフェクション後、最大４８時間まで侵入病原体に対する耐性を統計的に有意に提供するのに十分であった。

本発明者らは、いずれのカーゴ（cargo）ｍＲＮＡのｍＲＮＡ送達またはそれらの翻訳されたタンパク質産物もアポトーシスを誘導することを示す証拠を認めなかった。ビヒクル対照はｍＲＮＡ送達と同等の生存率低下を示したことから、本発明者らは、経時的な生存率の若干の低下はタンパク質発現よりもむしろＴｒａｎｓＩＴ−ｍＲＮＡ送達系に帰し得ると結論づけた。非トランスフェクト細胞と比べると、抗菌タンパク質ｍＲＮＡ（ＣＡＭＰ、Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９、Ａ８−ＩＲＥＳ−Ａ９、およびＡ８−ｎＩＲＥＳ−Ａ９）送達および細胞内タンパク質産生はアポトーシスを有意に誘発しなかった。これらのデータを考え合わせると、ＴｒａｎｓＩＴ−ｍＲＮＡ送達系は細胞生存率を低下させるが、アポトーシスを誘発しないことが示唆される。この試薬による生存率の低下は、イン・ビボにおいて必然であるとは考えられない。全身投与は免疫細胞の活性化を引き起こさず(Kariko et al., 2011. Nucl. Acids Res. 39: e142)、この試薬は毒性が低いと思われ、エレクトロポレーションよりも高いトランスフェクション効率を示す(Gonzalez et al., 2007. J. Virol. Methods. 145: 14-21)。最も重要なこととしては、アポトーシス結果はビヒクル対照と同等であったので（図３、４Ａ）、トランスフェクションから生じる細胞生存率の低下は、侵入データに影響を及ぼすとは思えなかった。これらのデータは、ｍＲＮＡ送達系が粘膜感染の治療または管理のためのＤＮＡ遺伝子療法アプローチの有効な代替となり得ることを示す。粘膜感染における治療目的でのこのアプローチの使用は、ｍＲＮＡの安定性を増し、免疫の活性化を最小化し、かつ／または、より具体的には、粘膜上皮細胞を標的とするｍＲＮＡパッケージング系を用いた場合に増進され得る。

口腔粘膜表面の唾液の存在は、治療目的の局所的ｍＲＮＡトランスフェクションの障壁となり得る。唾液は高分子量ムチンおよび口腔内の上皮細胞の表面に拡散性の障壁を形成し得る他の多くのタンパク質を含有する。加えて、唾液は、治療用ｍＲＮＡを分解し得るＲＮアーゼも含有する。

この可能性を調べるために、本発明者らは、イン・ビトロで上皮細胞を標的化するために唾液を加え、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡでのトランスフェクションを試み、緑色蛍光の放出によるＥＧＦＰの翻訳に関して調べた。本発明者らはまた、ｍＲＮＡのヌクレオチド組成物を、その安定性を増し、かつ、潜在的免疫原性を低減するように改変した(Kormann et al, 2011, Nat Biotechnol 29(2):154-157)。この改変により、シチジンの２５％がメチルシチジンに置き換わり、ウリジンの２５％が２−チオウリジンに置き換わる。アデニンおよびグアノシンは不変である。

唾液添加を行わない場合（０％唾液）、トランスフェクトされた上皮細胞はＥＧＦＰを産生し、トランスフェクションを行わなければ、唾液が存在しても存在しなくても緑色蛍光は見られなかった（図１５Ａ〜Ｃ）。細胞を漸増時間の間（最大５分）漸増量の唾液で前処理すると、緑色蛍光の産生は無効となった。細胞を新鮮培養培地で反復頻度を増しつつ洗浄すると、ｍＲＮＡトランスフェクションが緑色蛍光を産生できないことが明らかになった（図１６）。５回の細胞洗浄がｍＲＮＡトランスフェクション成功の回収率を最大化したが、その効率は唾液の不在下よりも低かった。

イン・ビトロにおいて唾液処理した上皮を洗浄すると、ｍＲＮＡトランスフェクションアプローチが阻害されることが明らかになった。臨床現場では、粘膜上皮を洗浄し、唾液への再暴露を防ぐと、トランスフェクションに対する唾液障壁が克服される一助となり、トランスフェクション効率を高めることができる。さらに、唾液は、特に、組成および粘度に関しては粘液の代表的モデルである。従って、図１５および図１６に示される唾液洗浄結果は、表面から粘液を洗い流すことによる粘膜表面の前処理は、他の粘膜上皮、例えば、生殖器系、眼の粘膜上皮、または他の扁平粘膜の形質転換効率を高め得ることを示す。

本発明者らはまた、上皮癌、例えば、子宮頸癌および頭頸部癌に直接接種した際に腫瘍抑制性であり得る２つのタンパク質（抗菌性である）の複合体を発現させるためのｍＲＮＡトランスフェクションの使用を裏付けるデータを提供する(Khammanivong et al., 2013. PLoS One 8:e69395. Doi: 10.1371/journal.pone.0069395)。増殖抑制の欠如は癌のホールマークの１つであり(Hanahan and Weinberg, 2011. Cell 144: 646-674)、悪性化および腫瘍形成に寄与する。異常な細胞周期調節および増殖をもたらす分子機構は、癌のタイプが異なれば異なり、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）では未解明なままである。カルプロテクチンは、ＨＮＳＣＣおよび他の扁平上皮癌（ＳＣＣ）における増殖調節および腫瘍形成に関与している可能性がある。Ｓ１００Ａ８／Ａ９は、口腔および中咽頭の健康な扁平上皮細胞の細胞質で構成的に発現される(Ross et al., 2001. Infect Immun 69: 3248-3254; Hitomi et al., 1998. Arch Histol Cytol 61: 163-178)。染色体座１ｑ２１上のヒト上皮分化複合体にマッピングされるコード領域にコードされているＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９は、細胞分化、細胞周期の進行および増殖のカルシウム依存性制御に関与する２つのカノニカルのＥＦハンドカルシウム結合モチーフを含むＳ１００ファミリーのタンパク質のメンバーであり(Itou et al., 2002. J Mol Biol 316: 265-276)、癌の発生および他の炎症性疾患に関連付けられている。癌では、一般に浸潤性の多形核白血球およびマクロファージの細胞質から放出される細胞外Ｓ１００Ａ８／Ａ９は(Hessian et al., 2001. Eur J Biochem 268: 353-363; Hsu et al., 2009. Antiinflamm Antiallergy Agents Med Chem 8: 290-305)、炎症および疾病の進行に関連している(Gebhardt et al., 2002. Oncogene 21: 4266-4276)。放出されると、Ｓ１００Ａ８／Ａ９は、終末糖化産物(advanced glycation end products) （ＲＡＧＥ）の受容体および／またはＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）を介してシグナルを伝達し、腫瘍関連炎症および進行した病期の腺癌および大腸炎関連癌の進行を促進し得る(Hermani et al., 2006. Exp Cell Res 312: 184-197; Gebhardt et al., 2006. Biochem Pharmacol 72: 1622-1631; Ehrchen et al., 2009. J Leukoc Biol 86: 557-566; Turovskaya et al., 2008. Carcinogenesis 29: 2035-2043)。しかしながら、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の細胞内での役割およびそのタンパク質複合体が癌細胞でどのように機能を調節するかについてはほとんど分かっていない。

細胞内Ｓ１００Ａ８／Ａ９の発現は細胞特異的かつ組織特異的であると思われ、異なる悪性腫瘍で差次的に調節されている可能性がある。Ｓ１００Ａ８／Ａ９レベルは、皮膚(Gebhardt et al., 2002. Oncogene 21: 4266-4276)、乳房(Arai et al., 2008. Curr Cancer Drug Targets 8: 243-252;Moon et al., 2008. Mol Cancer Res 6: 1544-1553)、甲状腺(Ito et al., 2009. Anticancer Res 29: 4157-4161)、肝臓(Nemeth et al., 2009. Hepatology 50: 1251-1262)、胃粘膜(Yong et al., 2007. Arch Pharm Res 30: 75-81)、前立腺(Hermani et al., 2006. Exp Cell Res 312: 184-197)、卵巣(Odegaard et al., 2008. Am J Obstet Gynecol 198: 418 e411-417)、膀胱(Yao et al., 2007. Anticancer Res 27: 3051-3058)および肺(Arai et al., 2001. Oncol Rep 8: 591-596)などの、通常タンパク質を発現しない組織に起源するヒト原発腫瘍で異常な上昇を見せることがある。これらの組織では、増強されたＳ１００Ａ８／Ａ９レベルが腫瘍形成に対する応答であるか、実際に腫瘍発生および進行を駆動するかは明らかでない。対照的に、Ｓ１００Ａ８／Ａ９発現は、頭頸部（口腔、鼻咽頭および口咽頭を含む）(Melle et al., 2004. Cancer Res 64: 4099-4104; Gonzalez et al., 2003. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 129: 754-759; Fung et al., 2000. Life Sci 67: 923-936)、食道(Kong et al., 2004. World J Gastroenterol 10: 1093-1097; Wang et al., 2004. Cell Res 14: 46-53) および子宮頸(Tugizov et al., 2005. J Virol 79: 1099-1112; Coleman et al., 1994. Hum Pathol 25: 73-79) ＳＣＣなどの、通常、タンパク質複合体を構成的に発現する扁平上皮細胞起源のヒト腫瘍で低下していることもある。これらの扁平上皮癌では、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の低下が、分化の低下、増殖および浸潤性の増大と相関している。逆に、Ｓ１００Ａ８／Ａ９発現ＳＣＣは、悪性度の低さを表す。従って、本発明者らは、Ｓ１００Ａ８／Ａ９がＳＣＣにおいて増殖調節因子として機能するかどうかを決定しようとした。

Ｓ１００Ａ８／Ａ９陰性癌腫細胞におけるレスキューによるＳ１００Ａ８／Ａ９の調節的役割を調べるため、本発明者らは、Ｓ１００Ａ８／Ａ９タンパク質複合体を発現するようにＫＢ細胞を安定的にトランスフェクトした。ＫＢ細胞におけるＳ１００Ａ８／Ａ９の安定な発現は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９依存的なＧ２／Ｍ細胞周期の停止ならびに軟寒天中での足場非依存的増殖およびコロニー形成の低下をもたらす。Ｓ１００Ａ８／Ａ９レベルの低下の影響を判定するため、ＴＲ１４６細胞において、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を用いてＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９をサイレンシングした。ＴＲ１４６細胞において、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９発現のサイレンシングは、増殖およびクローン形成能に対する抑制作用を逆転させ、Ｇ２／Ｍチェックポイント制御の欠如に関連しているものと思われる。Ｇ１／ＳおよびＧ２／Ｍの両細胞周期チェックポイントは癌においては調節を欠き、制御されない細胞成長および増殖をもたらす。ＫＢ細胞におけるＳ１００Ａ８／Ａ９による増殖調節は、Ｇ１、Ｇ１／ＳチェックポイントまたはＳ期を介したものであるとは判明しなかった。代わりに、Ｓ１００Ａ８／Ａ９発現は、見かけ上、タンパク質−タンパク質相互作用を介してタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）活性を増強し、これはＧ２／Ｍチェックポイントシグナル伝達の調節および回復、ならびに癌増殖の低減に関与すると思われる。

ＰＰ２Ａは、Ｇ２／Ｍ特異的Ｃｄｃ２５Ｃを標的として、有糸分裂の終了および細胞分裂を阻害するＴｈｒ４８における脱リン酸化により不活性化することで細胞周期のチェックポイントを調節することが知られているセリンおよびスレオニン（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）タンパク質ホスファターゼである(Forester et al., 2007. Proc Natl Acad Sci USA 104: 19867-19872; Margolis et al., 2006. Cell 127: 759-773)。ＰＰ２Ａは広域のリンタンパク質を標的とし、また、細胞生存経路および増殖経路のＡＫＴおよびＣ−ＭＹＣを阻害することにより、また、細胞周期の停止を誘導することにより、抗腫瘍活性を発揮することも示されている(Guenin et al., 2008. Int J Oncol 32: 49-57)。ＰＰ２Ａは、Ｓ１００Ａ８／Ａ９［Ｂ３０］と相互作用すると、活性化されて、Ｇ２／Ｍチェックポイントにおいて細胞周期進行に調節的役割を発揮し得る。従って、Ｓ１００Ａ８／Ａ９およびＰＰ２Ａは、有糸分裂を調節し、細胞増殖を制御するための相互作用相手として働き得る。癌における（例えば、ＨＮＳＳＣにおける）Ｓ１００Ａ８／Ａ９の低下は、ＰＰ２Ａのホスファターゼ活性の低下および増殖および腫瘍形成の増大をもたらし得る。

正常サンプルとＳＣＣサンプルにおけるｑＲＴ−ＰＣＲにおるＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９遺伝子発現
Ｓ１００Ａ８／Ａ９タンパク質発現は、ＨＮＳＣＣにおいては低下している(Driemel et al., 2007. Proteomics Clin Appl 1: 486-493; Roesch et al., 2005. Eur J Cell Biol 84: 431-444)。本発明者らは、対応するＨＮＳＣＣ組織および正常隣接(normal adjacent)（ＮＡＴ）組織におけるＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９サブユニット遺伝子の発現を、リアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いて比較した。発現分析は、内部対照および全ＲＮＡローディング対照としてのＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。ＨＮＳＣＣ組織およびＮＡＴ組織からの全ＲＮＡをステージＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶＡ腫瘍を有する３名の異なる患者から個別にプールし、差次的ｍＲＮＡ発現を分析した。ｑＲＴ−ＰＣＲを用い、本発明者らは、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の発現が、ＨＮＳＣＣでは、正常組織対照としてのＮＡＴのおよそ１０分の１であることを見出した（図７Ａ）。

本発明者らはまた、３５を超える臨床例のＨＮＳＣＣと１１の健康な口腔粘膜サンプルにおけるＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９発現のレベル、マイクロアレイ遺伝子発現プロファイリングを用いて検討し、これらのタンパク質の発現も正常対照組織に比べて抑制されていたことを見出した（非公開データ）。ＴＲ１４６細胞およびＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞におけるＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の発現は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９陰性ＫＢ細胞およびＫＢ−ＥＧＦＰ細胞の場合のおよそ１ｌｏｇ〜２ｌｏｇ倍高かった（図７Ｂ；点線は検出閾値として示される）。ＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９を過剰発現するようにトランスフェクトされたＳ１００Ａ８／Ａ９陰性ＫＢ細胞であり、一方、ＫＢ−ＥＧＦＰ細胞は、シャムトランスフェクトされた対照である。ＫＢ野生型細胞およびシャムトランスフェクトＫＢ−ＥＧＦＰ細胞では、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現はかろうじて検出可能であったが、トランスフェクトＫＢＳ１００Ａ８／Ａ９およびＴＲ１４６細胞はＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９タンパク質発現を明らかに示した（図７Ｃ、７Ｄ）。ＴＲ１４６細胞のＳ１００Ａ８特異的、およびＳ１００Ａ９特異的安定ｓｈＲＮＡトランスフェクションは、内因性のＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９タンパク質をかろうじて検出可能なレベルにまで低下させた（図７Ｄ）。Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９タンパク質レベルは、免疫ブロットにより示されるように異なると思われる（図７Ｃ、７Ｄ）。このような違いは、現実のものかもしれないし、または使用した一次抗体の感受性の違いを反映しているかもしれない。ゆえに、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９のレベルは互いに直接比較することはできなかった。

Ｓ１００Ａ８／Ａ９に抑制された癌細胞の足場依存的および非依存的増殖
Ｓ１００Ａ８／Ａ９の細胞増殖調節能は、足場依存性（接着性）に関しては非発熱性ポリスチレン組織培養フラスコ上の、また、足場非依存的増殖条件に関しては軟寒天中の、トランスフェクトＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞で試験した。悪性度の高い細胞は、足場非依存的に生存し、コロニー形成し、増殖することができ、通常、軟寒天で試験される。ＫＢ野生型細胞またはＫＢ−ＥＧＦＰ細胞と比較すると、ＫＢＳ１００Ａ８／Ａ９細胞は、イン・ビトロにおいておよそ２分の１の足場依存的増殖を示した（図８Ａ）。Ｓ１００Ａ８／Ａ９の異所発現は、標準的な接着条件下で増殖させた場合、切断されたカスパーゼ１も切断されたカスパーゼ３も免疫ブロットにより検出できなったことから、ＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞においてアポトーシスを誘導するとは思われなかったが、ＫＢ野生型細胞、ＫＢ−ＥＧＦＰ細胞およびＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞は、同等の合計カスパーゼ１およびカスパーゼ３レベルを示した（データ示さず）。軟寒天中での足場非依存的増殖の際、ＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞の増殖は低くＫＢ細胞およびＫＢ−ＥＧＦＰ細胞よりも小さくかつ少ないコロニーしか形成しない（図８Ｂ）。細胞増殖に及ぼすＳ１００Ａ８／Ａ９の影響を確認するために、ＴＲ１４６−ｓｈＲＮＡ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９ＫＤ細胞において内因性Ｓ１００Ａ８／Ａ９発現をノックダウンしたところ、ノックダウン陰性対照細胞（ＴＲ１４６−ｓｈＲＮＡ−対照）に比べて増大した足場依存的増殖（図８Ｃ）および足場非依存的増殖（図８Ｄ）が示された。

Ｓ１００Ａ８／Ａ９はＧ２／Ｍ細胞周期チェックポイントの停止を誘導する
Ｓ１００Ａ８／Ａ９が細胞周期を調節することにより癌細胞増殖を抑制するかどうかを決定するために、本発明者らは、Ｓ１００Ａ８／Ａ９発現ＫＢ細胞および非発現ＫＢ細胞において細胞周期分析を行った。癌腫などの急速分裂細胞は、正常細胞よりも高速で細胞周期を回す。細胞のＤＮＡ含量変化は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって経時的に測定することができる。細胞周期の進行の違いを判定するために、癌細胞を、一晩血清飢餓状態とした後に、通常の増殖培地中にてアフィジコリンで１２時間処理することによって、Ｇ１／Ｓ期で同調化した。アフィジコリンにより誘導されたＧ１／Ｓ遮断から離脱した後、ＫＢ野生型細胞、ＫＢ−ＥＧＦＰ細胞およびＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞は、ＤＮＡのＰＩ染色により判定したところ、およそ同じ速度でＧ１／Ｓ期を経てＧ２／Ｍ期に入った（図９Ａ、９Ｃ）。ＫＢ細胞およびＫＢ−ＥＧＦＰ細胞は、１１時間までにＧ２／Ｍ期を出、このＧ２／Ｍ細胞集団は、同調後１３時間までにバックグラウンドレベルに戻った。しかしながら、ＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞は、少なくとも３時間、Ｇ２／Ｍ期で停止すると思われた。これらの所見と一致して、ＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞は、同調後９時間で有糸分裂細胞をほとんど示さず、ＫＢ−ＥＧＦＰ細胞よりも長く中期に留まった（図９Ｂ、９Ｄ）。

Ｓ１００Ａ８／Ａ９はＧ２／Ｍシグナル伝達経路を調節する
Ｓ１００Ａ８／Ａ９がＧ２／Ｍチェックポイントを調節するかどうかを確認するために、本発明者らは、タンパク発現ならびにＧ１／ＳおよびＧ２／Ｍ細胞周期チェックポイントレギュレーターの活性化状態を免疫ブロット法によって調べた。ＫＢ細胞、ＫＢ−ＥＧＦＰ細胞およびＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞は、同等レベルの細胞周期レギュレーターサイクリンＡ、サイクリンＥ、ｐ２１、Ｒｂ、Ｃｈｋ２、およびＣｄｃ２５Ｂを発現し（図１０Ａ）、Ｇ１／ＳチェックポイントがＳ１００Ａ８／Ａ９発現により影響を受けなかったことが示唆される。有糸分裂に入る際のサイクリン依存性キナーゼ１（Ｃｄｃ２）活性に必要とされるＧ２／ＭチェックポイントレギュレーターであるサイクリンＢ１(Soni et al., 2008. Cell Cycle 7: 1285-1300)は、ＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞ではＫＢおよびＫＢ−ＥＧＦＰ細胞よりも低いｍＲＮＡ（データ示さず）およびタンパク質（図１０Ｂ）レベルを示した。より重要なこととしては、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の発現は、ＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９においてＧ２／Ｍ関連チェックポイントキナーゼｐ−Ｃｈｋ１（Ｓｅｒ３４５）、ホスファターゼｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ（Ｓｅｒ２１６）およびｐ−Ｃｄｃ２（Ｔｈｒ１４／Ｔｙｒ１５）のリン酸化を増強したが、これらのタンパク質の発現レベルは変化させなかった（図１０Ｂ）。Ｓ１００Ａ８／Ａ９はまた、有糸分裂活性型のｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ（Ｔｈｒ４８）を低下させた（図１０Ｂ）。ＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞で、本発明者らは、Ｃｄｃ２５Ｃの１４−３−３βとのより強い共免疫沈降を見出し（図１０Ｃ）、Ｃｄｃ２５Ｃと１４−３−３βの間の相互作用の増強が示唆される。全体的な１４−３−３βタンパク質発現は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の発現によって影響を受けなかった。ＴＲ１４６−ｓｈＲＮＡ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９ＫＤ細胞におけるＳ１００Ａ８／Ａ９のノックダウンは、ｐ−Ｃｄｃ２ （Ｔｈｒ１４／Ｔｙｒ１５）のリン酸化を低下させた（図１０Ｄ）。本発明者らの結果を考え合わせると、Ｓ１００Ａ８／Ａ９は、Ｇ２／Ｍチェックポイント遅延の維持に一致して、カノニカルなＧ２／Ｍシグナル伝達経路を調節することが示唆される。

Ｓ１００Ａ８／Ａ９はＰＰ２Ａホスファターゼと相互作用して活性を増強する
Ｓ１００Ａ８／Ａ９と直接相互作用し得る候補細胞周期レギュレーターを同定するために、既知および推定タンパク質−タンパク質相互作用相手の精選データベース（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｉｎｃ．，サンフランシスコ，ＣＡ）を検索した。本発明者らは、Ｓ１００Ａ８／Ａ９が、既知の細胞周期レギュレーターであるタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）の結合相手であり得、かつ、その活性のモジュレーターであり得ることを見出した。ＰＰ２Ａは、構造タンパク質サブユニットＡ、調節サブユニットＢ、および触媒サブユニットＣという３つのサブユニットを有する、ヘテロ三量体ホロ酵素である。ＰＰ２Ａ−Ｃの触媒活性は、Ｔｙｒ３０７のリン酸化によって負の調節を受け、Ｃ末端Ｌｅｕ３０９のメチル化が全体的なホスファターゼ活性に不可欠である。ＰＰ２Ａ−Ｂ ５６δアイソフォーム がＣｄｃ２５ＣおよびＧ２／Ｍ細胞周期チェックポイント活性を制御することが報告されている(Guenin et al., 2008. Int J Oncol 32: 49-57; Perrotti et al., 2008. Cancer Metastasis Rev 27: 159-168)。Ｓ１００Ａ８／Ａ９のＰＰ２Ａへの結合は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９複合体またはＰＰ２Ａに対する抗体を用いた共免疫沈降アッセイによって確認された。ＰＰ２Ａは、２７Ｅ１０抗体（Ｓ１００Ａ８／Ａ９複合体に特異的）で捕捉された場合に、Ｓ１００Ａ８／Ａ９と共免疫沈降した（図１１Ａ）。相互作用はまた、ＰＰ２Ａ−Ａα／β抗体で捕捉された場合に、Ｓ１００Ａ９（Ｓ１００Ａ８／Ａ９複合体のマーカーとして使用）の検出でも確認された。ＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞におけるＳ１００Ａ８／Ａ９発現は、免疫ブロット分析を用いた場合、ＰＰ２Ａサブユニットタンパク質レベル（サブユニットＡα／β、Ｂ５６δおよびＣα／β）に影響を及ぼさなかったが、サブユニットＣα／β（Ｔｙｒ３０７）のリン酸化には低下が見られた（図１１Ｂ）。抗メチル化ＰＰ２Ａ−Ｃ（Ｌｅｕ３０９）抗体によって同定したところでは、Ｃ末端メチル化はＳ１００Ａ８／Ａ９発現によって影響を受けないと思われた。

ＰＰ２Ａホスファターゼ活性を決定するために、ＰＰ２Ａ−Ｃ触媒サブユニットに対する抗体を用いて、Ｓ１００Ａ８／Ａ９発現を伴う、または伴わない細胞溶解液からホロ酵素を免疫沈降させた。次に、免疫沈降したＰＰ２Ａのホスファターゼ活性を、ホスホペプチド基質からの無機リン酸基（Ｐｉ）の放出レベルを測定することによって決定した。同調後７時間まで、ＰＰ２Ａホスファターゼ活性は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の存在下では、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の不在下（ＫＢ−ＥＧＦＰ細胞）でのおよそ５倍高く、同調後１２時間では７分の１まで低下する。ホスファターゼ活性は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９（２７Ｅ１０抗体）と共免疫沈降した検出可能なＰＰ２Ａ−Ａα／βレベルに対して正規化した（図１１Ｃ）。従って、ＫＢ細胞におけるＰＰ２Ａ活性のＳ１００Ａ８／Ａ９依存的調節は、細胞周期の相に依存すると思われる。ＫＢ−ＥＧＦＰからの溶解液を１μｇの精製Ｓ１００Ａ８／Ａ９とともにプレインキュベートした際にも、ＰＰ２Ａ活性に同様の変化が見られた（データ示さず）。ＰＰ２Ａ阻害剤であるオカダ酸（ＯＡ）で処理したＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞は、ＫＢ細胞およびＫＢ−ＥＧＦＰ細胞と同等レベルのｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ（Ｓｅｒ２１６）を示し、Ｓ１００Ａ８／Ａ９が媒介するｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ（Ｓｅｒ２１６）のリン酸化の増加が阻害されたことが示唆される（図１１Ｄ）。

よって、複合体（Ｓ１００Ａ８／Ａ９、またはカルプロテクチン）中の、Ｓ１００タンパク質ファミリーのメンバーとしてのＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９は、細胞周期の進行に調節的役割を持つと考えられる。本研究では、本発明者らは、Ｓ１００Ａ８／Ａ９は、ＫＢ細胞およびＴＲ１４６ヒト癌細胞において、Ｇ２／Ｍ細胞周期の停止を誘導することによりって細胞分裂および増殖の負のレギュレーターとして働くことを見出した。ＫＢ細胞は、この癌細胞株がｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方でＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の発現を欠くことから、機能獲得型研究のイン・ビトロモデルとして使用した。ＴＲ１４６は、利用可能な他の細胞株に比べて、検出可能なＳ１００Ａ８／Ａ９発現を有する、より分化したＨＮＳＣＣ細胞株である。Ｓ１００Ａ８とＳ１００Ａ９の比率は、ＴＲ１４６細胞およびＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞において比較することはできないが、Ｇ２／Ｍチェックポイントの制御における帰属された役割は同じであると思われる。ゆえに、個々のサブユニットがいずれかの細胞株に過剰に存在するならば、このような食い違いはＳ１００Ａ８／Ａ９の主張されている細胞内機能を説明するものではない。従って、今般の本発明者らの発見から、Ｓ１００Ａ８／Ａ９レベルの低下および結果としての機能欠失は、ＳＣＣにおいて増殖を脱調節し、発癌に寄与し得る。炎症性または過増殖性口腔病変およびＨＮＳＣＣ組織では、Ｓ１００Ａ８／Ａ９複合体は、正常粘膜に比べてｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方で著しくダウンレギュレートされている（扁平癌細胞では、Ｓ１００Ａ８／Ａ９は一般に検出できない）。さらに、本発明者らは、ＨＮＳＣＣがＮＡＴのおよそ１０分の１のＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９遺伝子発現しか示さないことを見出した。ＮＡＴにおけるＳ１００Ａ８／Ａ９レベルは、広域発癌(field cancerization)を反映している可能性がある。癌を持たない個体の粘膜組織におけるＳ１００Ａ８／Ａ９遺伝子発現はずっと高いものであり得るが、Ｓ１００Ａ８／Ａ９発現レベルの低下が発癌に明らかに関連している。

ＨＮＳＣＣにおけるＳ１００Ａ８／Ａ９の調節不全が癌表現型の原因であるか影響であるかを判定するために、本発明者らは、細胞周期の調節における役割を決定しようとした。Ｓ１００Ａ８／Ａ９タンパク質は細胞質に見られ、細胞増殖の状態に応じて核(www.proteinatlas.orgでアクセス可能なThe Human Protein Atlas database)または核周辺領域(Champaiboon et al., 2009. J Biol Chem 284: 7078-7090)に局在すると思われる。細胞分裂中およびＧ２／Ｍチェックポイントを制御している際は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９は、紡錘体の極にある微小管重合中心に局在する。Ｇ２／Ｍチェックポイントは、チェックポイントキナーゼＣｈｋ１／２の制御下にある(Agarwal et al., 2003. Oncogene 22: 8271-8282; Taylor et al., 2001. Oncogene 20: 1803-1815)。Ｃｈｋ１／２は、サイクリンＢ／サイクリン依存性キナーゼ１（ＣＤＫ１、Ｃｄｃ２としても知られる）複合体の活性化および有糸分裂の開始に必要とされるタンパク質ホスファターゼＣｄｃ２５を不活性化する(Agarwal et al., 2003. Oncogene 22: 8271-8282; Taylor et al., 2001. Oncogene 20: 1803-1815)。Ｓ１００Ａ８／Ａ９の存在下で、本発明者らは、ｐ−Ｃｈｋ１（Ｓｅｒ３４５）の活性型リン酸化のレベルが上昇したことを見出した。同様に、ｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ（Ｓｅｒ２１６）およびｐ−Ｃｄｃ２（Ｔｈｒ１４／Ｔｙｒ１５）の阻害型リン酸化も上昇していた。Ｇ２／Ｍ特異的キナーゼｐ−Ｃｈｋ１のＳｅｒ３４５高リン酸化は、ｐ−Ｃｈｋ１（Ｓｅｒ３４５）が未知の機構を介してＳ１００Ａ８／Ａ９によって活性化される可能性がある(Shiromizu et al., 2006. Genes Cells 11: 477-485)ことを示唆する。共免疫沈降法により、Ｓ１００Ａ８／Ａ９とＣｈｋ１の間のタンパク質−タンパク質相互作用を判定する試みは首尾よくいかなかった（データ示さず）。カノニカルなＧ２／Ｍチェックポイントシグナル伝達経路では、活性化されたｐ−Ｃｈｋ１（Ｓｅｒ３４５）は、Ｓｅｒ２１６においてＧ２／Ｍ特異的ホスファターゼＣｄｃ２５Ｃをリン酸化し、その分子シャペロン１４−３−３βへの結合を促進する(Peng et al., 1997. Science 277: 1501-1505; Peng et al., 1998. Cell Growth Differ 9: 197-208)（図１２参照）。１４−３−３βへの結合は、ｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ（Ｓｅｒ２１６）を不活性化して、そのサイトゾル蓄積を促進する(Graves et al., 2001. Oncogene 20: 1839-1851)。あるいは、活性型のｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ（Ｔｈｒ４８）はｐ−Ｃｄｃ２の阻害性残基Ｔｈｒ１４およびＴｙｒ１５を脱リン酸化し、Ｃｄｃ２／サイクリンＢ１複合体を活性化し、有糸分裂の開始をもたらす(Ozen et al., 2005. Clin Cancer Res 11: 4701-4706)。ＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞におけるＳ１００Ａ８／Ａ９発現は、阻害性のｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ（Ｓｅｒ２１６）、Ｃｄｃ２５Ｃ／１４−３−３β複合体、およびｐ−Ｃｄｃ２（Ｔｈｒ１４／Ｔｙｒ１５）のレベルに顕著な増大を誘導した。有糸分裂的に活性なｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ（Ｔｈｒ４８）およびサイクリンＢ１のレベルは、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の存在下では大幅に低下した。これらの結果は、Ｃｄｃ２５Ｃの不活性化および有糸分裂停止をもたらす、Ｇ２／Ｍ ＤＮＡ損傷チェックポイントのＳ１００Ａ８／Ａ９依存的活性化を示す。

Ｇ２／Ｍ細胞周期の進行に負の調節を行うための、Ｓ１００Ａ８／Ａ９により誘導されるＣｄｃ２５ＣおよびサイクリンＢ１／Ｃｄｃ２複合体の不活性化は、癌増殖を低下させることが示唆され、腫瘍形成を阻害し得る。実際に、Ｓ１００Ａ８／Ａ９を発現するＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞およびＴＲ１４６細胞は両方とも、Ｓ１００Ａ８／Ａ９陰性細胞またはＳ１００Ａ８／Ａ９ノックダウン細胞と比べた場合に、増殖およびクローン形成能に有意な低下を示した。ＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞は、ＮＡＴにより代表される正常組織よりもＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の発現が少ないが（細胞内対照としてのＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子に対して）、異所発現は実質的増殖抑制を生じた。ＴＲ１４６細胞におけるＳ１００Ａ８／Ａ９のノックダウンは、軟寒天において増殖およびコロニー形成に顕著な増加をもたらしたことから、本発明者らのデータは、癌細胞増殖およびクローン形成能に対するＳ１００Ａ８／Ａ９の濃度依存的効果を強く示唆する。さらに、組織におけるＳ１００Ａ８／Ａ９発現の欠如は、ＨＮＳＣＣにおいて腫瘍増殖および悪性化を加速化すると予想される。

Ｇ１／ＳおよびＧ２／Ｍの両チェックポイントの欠損が癌腫における成長および増殖の増大に必要とされるが、Ｇ２／ＭチェックポイントのＳ１００Ａ８／Ａ９依存的誘導は、ＫＢ細胞の有糸分裂活性および増殖の抑制に有意に寄与した。Ｓ１００Ａ８／Ａ９の発現は、ＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞を停止させ、Ｇ２／Ｍに蓄積させ、Ｇ１／ＳからＧ２／Ｍへの遷移率に影響を及ぼすことなく有糸分裂への進行を阻害する。全体的に見れば、Ｓ１００Ａ８／Ａ９のこの増殖阻害作用は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の異所的一過性発現が細胞分裂および増殖を抑制したという表皮ケラチノサイトにおける報告(Voss et al., 2011. FEBS Lett 585: 440-446)と一致する。本発明者らの実験では、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９遺伝子の配列分析が、カノニカル分泌に必要とされる上流シグナルペプチドを示さないことから、この癌増殖に対する作用は、細胞外Ｓ１００Ａ８／Ａ９タンパク質に帰することはできなかった。さらに、本発明者らの手では、ＴＲ１４６またはトランスフェクトＫＢ由来の細胞外Ｓ１００Ａ８／Ａ９は、特異的ＥＬＩＳＡを用いて調べたところ、検出可能なレベルに満たなかった（データ示さず）。ゆえに、検討しているＳ１００Ａ８／Ａ９はサイトゾルタンパク質複合体であり、通常増殖条件下では上皮によって細胞外間隙へ分泌されるとは思えない。Ｓ１００Ａ８／Ａ９発現はまた、Ｇ１／Ｓ関連下流レギュレータータンパク質のレベルに明白な効果を持たず、Ｇ１／Ｓ期およびＳ期のＳ１００Ａ８／Ａ９陽性細胞および陰性細胞のパーセンテージは、同調化から離脱した後は同等であった。Ｇ１／Ｓの欠陥は厳密に排除されていなかったが、Ｓ１００Ａ８／Ａ９が媒介する細胞周期の調節はＧ２／Ｍに影響を及ぼすことが強く示唆される。

本発明者らはここで、Ｓ１００Ａ８／Ａ９がＣｄｃ２５Ｃの不活性化およびＧ２／Ｍ細胞周期停止の誘導にいかにしてシグナルを伝達するかを説明する初めての推定機構を報告する。おそらく有糸分裂性ｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ（Ｔｈｒ４８）リンタンパク質の減少が、Ｓｅｒ／Ｔｈｒタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）による脱リン酸化を介してシグナルを伝達する。ＰＰ２Ａは、ｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ（Ｔｈｒ４８）を標的とし、これを脱リン酸化することによって細胞周期の停止を誘導することが報告されており(Forester et al., 2007. Proc Natl Acad Sci USA 104: 19867-19872; Margolis et al., 2006. Cell 127: 759-773; Guenin et al., 2008. Int J Oncol 32: 49-57)、これにより、Ｃｄｃ２５Ｃは、上記のような不活性化と核輸送のためにｐ−Ｃｈｋ１（Ｓｅｒ３４５）によりＳｅｒ２１６においてリン酸化可能となる。

ＰＰ２Ａ−Ｃα／βサブユニットはＰＰ２Ａの酵素活性部位であり、そのホスファターゼ活性はＴｙｒ３０７のリン酸化およびＬｅｕ３０９のメチル化によって制御され、これもまたホロ酵素集合に必須である。ＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞では、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の発現は、ＰＰ２Ａ−Ａα／βサブユニット、ＰＰ２Ａ−Ｂ５６δサブユニット（Ｃｄｃ２５Ｃのシグナル標的として知られる調節サブユニット）またはＰＰ２Ａ−Ｃα／βサブユニットのタンパク質レベルに影響を及ぼさなかった。また、ＰＰ２Ａ−Ｃ（メチル−ＰＰ２Ａ−Ｃ）サブユニットのＬｅｕ３０９メチル化レベルも、ＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞、ＫＢ−ＥＧＦＰ細胞および野生型対照細胞で同等であった。これらのデータは、ＫＢ細胞ではＳ１００Ａ８／Ａ９がＰＰ２Ａ発現またはホロ酵素集合に調節的作用を持っていないことを示唆する。しかしながら、ＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞では、ＰＰ２Ａ−ＣのＴｙｒ３０７阻害性残基のリン酸化レベルは低下しており、この酵素のホスファターゼ活性の増強が示唆される。

Ｓ１００Ａ８／Ａ９の発現は、ＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９トランスフェクト細胞において有糸分裂前のＰＰ２Ａホスファターゼ活性を増強した。精製したＳ１００Ａ８／Ａ９タンパク質をＫＢ−ＥＧＦＰ溶解液（Ｓ１００Ａ８／Ａ９を欠く）とともにインキュベートすると、ＰＰ２Ａ活性は同様に調節された。ゆえに、Ｓ１００Ａ８／Ａ９は、ＰＰ２Ａの脱リン酸化および活性化に直接シグナルを伝達すると思われる。有糸分裂後のＰＰ２Ａホスファターゼ活性は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の発現によって顕著に抑制され、Ｓ１００Ａ８／Ａ９による二相性の細胞周期依存的調節が示唆される。ＰＰ２Ａホスファターゼ活性は、同調後時間＝０で著しく上昇した。ｔ＝０でのレベルはＧ１／Ｓ中の活性を反映したものであり得る。ＰＰ２Ａはまた、Ｇ２／Ｍチェックポイントシグナル伝達経路に非依存的にＧ１／Ｓ細胞周期停止にも役割を果たす(Pitre et al., 2012. Mol Biol Cell 23: 1243-1253; Hofstetter et al., 2012. PLoS One 7: e30059)。ｔ＝０で見られたＰＰ２Ａホスファターゼ活性の増強はおそらく、細胞をＧ１／Ｓで同調させるために用いたアフィジコリンによる一過性のＧ１／Ｓ遮断によるものである。Ｓ１００Ａ８／Ａ９はＧ１からＳへの細胞周期の進行を変更しなかったが、Ｇ１／ＳのＳ１００Ａ８／Ａ９非依存的阻害（この場合、アフィジコリンによる薬理学的なもの）はＰＰ２Ａの活性化にシグナルを伝達できた。最も重要なこととしては、ＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞においては、Ｇ１／ＳにおけるＰＰ２Ａホスファターゼ活性は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の発現に依存するか、またはそれにより増強され、本発明者らのさらなる研究でさらに検討される。興味深いことに、ＰＰ２ＡとＳ１００Ａ８／Ａ９は、共免疫沈降実験に直接基づいて相互作用すると思われ、Ｓ１００Ａ８／Ａ９タンパク質複合体によるＰＰ２Ａ活性化の可能性の機構が示唆される。

Ｓ１００Ａ８／Ａ９による誘導されるＣｄｃ２５Ｃの不活性化がＰＰ２Ａ活性に依存していたというさらなる証拠を得るために、ＰＰ２Ａ活性を特異的に阻害するオカダ酸処理が、発現されたＳ１００Ａ８／Ａ９の存在下でｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ（Ｓｅｒ２１６）のリン酸化を低下させ得ることを示した。Ｓｅｒ２１６リン酸化（Ｃｈｋ１による）を介したＣｄｃ２５Ｃの不活性化は、ＰＰ２Ａの既知の基質であるＣｄｃ２５ＣのＴｈｒ４８での脱リン酸化を必要とすることから、この知見は、文献と一致している(Zhou et al., 2000. Mol Cell 6: 873-883)。従って、オカダ酸処理は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９により誘導されるＰＰ２Ａ依存的な阻害性ｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ（Ｓｅｒ２１６）のリン酸化を阻害した。従って、通常の増殖条件下で、Ｓ１００Ａ８／Ａ９は、Ｇ２／ＭチェックポイントのＰＰ２Ａ再活性化および細胞周期遅延を媒介する。

本研究で示される、サイクリンＢ１の発現およびｐ−Ｃｄｃ２（Ｔｈｒ１４／Ｔｙｒ１５）の高リン酸化におけるＳ１００Ａ８／Ａ９依存的低下はまた、癌腫において一般に報告されているようなＣｄｃ２不活性化およびＧ２／Ｍチェックポイント停止とも一致する(Yang et al., 2010. Free Radic Res 44: 792-802; Maalouf et al., 2009. Int J Radiat Oncol Biol Phys 74: 200-209; Wang et al., 2008. J Cell Biochem 104: 1181-1191)。ＴＲ１４６ ＨＮＳＣＣ細胞におけるｓｈＲＮＡによるＳ１００Ａ８／Ａ９のノックダウンで見られるように、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の低下は、ｐ−Ｃｄｃ２（Ｔｈｒ１４／Ｔｙｒ１５）の低リン酸化に関連して、軟寒天での増殖およびコロニー形成を有意に増大させた。Ｇ２／ＭチェックポイントのＳ１００Ａ８／Ａ９依存的調節の欠如、Ｇ２からＭへの遷移のシグナル伝達の増強、および構成的に脱調節されたＧ１／Ｓチェックポイントは、ＴＲ１４６細胞の増殖速度に増大を生じることが強く示唆された。

要約すると、本発明者らは、ＰＰ２Ａ依存的経路を介したＧ２／Ｍ細胞周期チェックポイントおよび有糸分裂停止の誘導における重要なシグナル伝達メディエーターとして、現在のところＳ１００Ａ８／Ａ９を含むモデルを提案する（図１２）。Ｓ１００Ａ８／Ａ９の発現は、おそらくは直接的タンパク質−タンパク質相互作用および触媒サブユニットＰＰ２Ａ−Ｃの阻害性残基Ｔｙｒ３０７の脱リン酸化を介して、ＰＰ２Ａホスファターゼ活性を増強し、ＰＰ２Ａの活性化を増強する。活性化されたＰＰ２Ａは、ｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ（Ｔｈｒ４８）を標的としてそれを脱リン酸化し、これにより、Ｃｄｃ２５ＣはＣｈｋ１により阻害性残基Ｓｅｒ２１６でリン酸化可能となるとの仮説が立てられる(Perry et al., 2007. Cell division 2: 12)。癌細胞では、Ｇ２／Ｍ細胞周期チェックポイントは脱調節され、その結果、ｐ−Ｃｄｃ２５ＣのＴｈｒ４８のリン酸化が増強され、細胞増殖が加速化される。Ｓ１００Ａ８／Ａ９はＰＰ２Ａを介してＧ２／Ｍチェックポイントを活性化し、ｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ（Ｔｈｒ４８）のレベルを低下させることによって、また、ｐ−Ｃｈｋ１（Ｓｅｒ３４５）およびｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ（Ｓｅｒ２１６）のレベルを上昇させることによって、有糸分裂停止（および増殖の低下）を誘導する。Ｃｈｋ１キナーゼ（Ｓｅｒ３４５でのリン酸化による）およびＧ２／Ｍチェックポイントの活性化が直接的にＳ１００Ａ８／Ａ９発現によってシグナルが伝達されるのかＣｄｃ２５ＣのＴｈｒ４８でのＰＰ２Ａ脱リン酸化によってシグナルが伝達されるのかはまだ明らかでないが、Ｃｄｃ２５ＣのＴｈｒ４８残基とＳｅｒ２１６残基は同時にリン酸化されることはできない。リン酸化されたｐ−Ｃｄｃ２５Ｃ（Ｓｅｒ２１６）は１４−３−３βによって標的とされ、これと結合し、Ｃｄｃ２５Ｃの不活性化とサイトゾル蓄積がもたらされる。結果として、サイクリンＢ１／ｐ−Ｃｄｃ２（Ｔｈｒ１４／Ｔｙｒ１５）複合体は不活性化され、細胞周期はＧ２／Ｍチェックポイントで停止する。他の有糸分裂チェックポイント阻害剤は影響を受けない。従って、Ｓ１００Ａ８／Ａ９（またはカルプロテクチン）は、扁平上皮細胞において腫瘍サプレッサーとして機能する可能性があり、発現の低下は疾病進行の指標として役立ち得る。よって、ＨＮＳＣＣおよび他のＳＣＣにおけるＳ１００Ａ８／Ａ９の細胞内発現の人為的増強は、有効な治療戦略であることが分かるであろう。

例えば、細胞内Ｓ１００Ａ８／Ａ９は、マウスにおいて口腔底腫瘍（同所性）形成を低下させる。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、ＣＡ）に懸濁させた腫瘍細胞を、確立されたプロトコールを用いて、ｎｕ／ｎｕマウスの口腔底に接種した(Henson B. et al., 2007. J Oral Pathol Med. 36:363-370)。Ｓ１００Ａ８／Ａ９を発現するＫＢ細胞は、１７日までに、対照シャムトランスフェクトＫＢ細胞（ＥＧＦＰを発現する）よりも６５％小さな（ｐ＜０．０２）同所性腫瘍を形成する（図１３Ａ）。Ｓ１００Ａ８／Ａ９発現は、より離散した浸潤性の低い腫瘍（図１３Ｂ）、狭い壊死領域、および低悪性度の組織学的表現型（図１３Ｃ）と相関していた。逆に、ＴＲ１４６口腔細胞は、ＴＲ１４６細胞においてシャムノックダウン後に形成された腫瘍よりも２０％大きい口腔底（同所性）腫瘍を形成した（図１４）。これらのデータは、腫瘍細胞におけるＳ１００Ａ８／Ａ９の発現が、口腔底を形成する腫瘍の体積および見かけの浸潤性を軽減することを示す。

よって、本発明者らは、口腔底腫瘍（同所性）の癌腫細胞によるＳ１００Ａ８／Ａ９の発現が、形成する腫瘍の大きさに逆相関することを示した。ゆえに、Ｓ１００Ａ８／Ａ９は、腫瘍サプレッサーとして機能し得る。Ｓ１００Ａ８／Ａ９の発現の増強をもたらす方法は、限定されるものではないが、口腔底の腫瘍を含め、例えば、頭頸部癌などの上皮細胞の新生物を含む特定の癌の治療方法として使用可能である。このような方法は、細胞がＳ１００Ａ８／Ａ９の産生を増大するように、細胞に、成分Ｓ１００Ａ８／Ａ９をコードする１以上のｍＲＮＡポリヌクレオチドを導入することを含み得る。別の実施形態では、本方法は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の発現に増強をもたらす１または有効な薬剤(one or active agents)を対象に投与することを含み得る。有効薬剤の例としては、例えば、ＩＬ−１α、ケラチノサイト増殖因子併用ＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＣＸＣＬ８併用および非併用ＩＬ−８、ＩＬ−２２、ＴＮＦα、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＣＬ２０などの調節サイトカインが挙げられる。有効薬剤の例としてはまた、例えば、ミリスチン酸酢酸ホルボールなどの、Ｓ１００Ａ８／Ａ９をアップレギュレートする化合物が挙げられる。

よって、一態様において、本開示は、病原性微生物による粘膜上皮の感染の可能性および／または重篤度を軽減するための方法を記載する。本方法は一般に、細胞に自然免疫に関与するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを導入することと、前記細胞に前記ポリペプチドを、前記細胞が病原体により感染を受ける可能性を小さくするのに有効な量で発現させることを含む。別の態様では、本開示は、上皮細胞増殖の可能性または程度を引き下げる方法を記載する。本方法は一般に、上皮細胞に細胞増殖の抑制に関与するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを導入することと、前記細胞に、前記細胞が足場非依存性環境で増殖する可能性を小さくするのに有効な量で前記ポリペプチドを発現させることを含む。本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、配列の長さにかかわらず、アミノ酸残基の配列を意味する。従って、用語「ポリペプチド」は、少なくとも２個のアミノ酸を有するアミノ酸配列を意味し、全長タンパク質を含む。

種々の実施形態では、本方法は、イン・ビトロまたはイン・ビボで行ってよい。ｍＲＮＡはいずれの好適な方法によって細胞に導入してもよい。イン・ビボにおいてｍＲＮＡを導入する場合には、一般に、イン・ビボ送達ビヒクルの補助で細胞にｍＲＮＡを導入することができる。イン・ビボ送達ビヒクルの例としては、例えば、ＴｒａｎｓＩＴ−ｍＲＮＡおよびＴｒａｎｓＩＴ−ｍＲＮＡブースト試薬（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ、マディソン ＷＩ）などの成分が挙げられる。

いくつかの実施形態では、細胞は、上皮細胞、例えば、粘膜上皮の細胞であり得るか、またはそれに由来し得る。よって、本方法のイン・ビボ実施形態では、例示的細胞としては癌細胞が含まれる。例示的細胞としてはさらに、口腔粘膜、膣粘膜、生殖器粘膜、扁桃上皮、中咽頭、鼻咽頭、肺、胃腸管粘膜、または眼の周囲の粘膜上皮の細胞が含まれる。結果として、本方法は、例えば、癌腫、歯肉炎、歯周炎、口腔カンジダ症、連鎖球菌性咽喉痛、粘膜炎、細菌性気管支炎、細菌性肺炎、膣症、他の膣および頸膣感染、膣酵母感染、消化管感染（例えば、リステリアおよびサルモネラＧＩ感染）、眼の感染、粘膜および／または周囲粘膜感染を含む病態に対する療法として使用可能である。本方法は、ｍＲＮＡを粘膜および関連上皮に導入して、腫瘍サプレッサーまたは創傷治癒を改善するためのタンパク質などの予防的または治療的価値があり得る任意のタンパク質を実質的に一過性発現させることに一様に従う。例えば、難治性の皮膚創傷の治癒を改善し得る、基底細胞癌、扁平上皮癌および黒色腫などの皮膚癌に拮抗し得る、瘢痕化およびケロイド形成を予防し得る、または表皮母斑の血管新生プロセスを逆転させ得るタンパク質を、ｍＲＮＡトランスフェクションを用いて発現させることができる。

本方法のイン・ビトロ実施形態では、細胞は、すぐ上で特定したイン・ビボいずれの細胞種であってもよく、またはいずれの細胞種に由来してもよい。あるいは、細胞は、例えば、ヒトＫＢ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７）などの、いずれの好適な上皮細胞株であってもよく、またはいずれの好適な上皮細胞株に由来してもよい。

ｍＲＮＡは、自然免疫に関与するポリペプチドをコードする。自然免疫に関与する例示的ポリペプチドとしては、例えば、カテリシジン抗菌タンパク質（ＣＡＭＰ）、カルプロテクチン、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、任意のα−デフェンシン、β−デフェンシン、Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ１２、分泌型白血球阻害剤、リポカリン２、およびリゾチームが含まれる。ｍＲＮＡはまた、自然免疫に関与する２以上のポリペプチドの任意の組合せをコードすることもできる。本明細書で使用する場合、「自然免疫に関与するポリペプチド」は、全長ポリペプチド、その有効フラグメント、または全長ポリペプチドもしくは有効フラグメントの前駆体を意味する。例えば、ＣＡＭＰ ｍＲＮＡは、セリンプロテアーゼとしてのプロテイナーゼ３により活性化されてＬＬ−３７となる前駆体であるＣＡＰ−１８をコードすることができる。自然免疫の他、ｍＲＮＡカーゴは、任意の機能を導入、置換、または増強するために事実上いずれの宿主ポリペプチドもコードすることができる。

本方法は、病原体による感染の可能性および／または程度を引き下げるために使用可能である。病原体は、その細胞が感染の標的となるいずれの病原体であってもよい。病原体の例としては、例えば、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アシネトバクター・バウマニー(Acinetobacter baumannii)、またはアスペルギルス種(Aspergillus spp.)などの真菌、ならびにカプノサイトファガ・スプティゲナ(Capnocytophaga sputigena)、大腸菌(Escherichia coli)、ブドウ状球菌種（Staphylococcus spp.）（例えば、黄色ブドウ球菌(S. aureus)および表皮ブドウ状球菌(S.epidermis)）、連鎖球菌種（Streptococcus spp.）（例えば、肺炎連鎖球菌(S. pneumonia)、Ａ群連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、およびＣ群連鎖球菌）、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)、タンネレラ・フォーサイシア(Tannerella forsythia)、トレポネーマ・デンティコラ(Treponema denticola)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、クラミジア種(Chlamydia spp.)、ナイセリア種(Neisseria spp.)、ガードネレラ種(Gardnerella spp.)、およびトリコモナス種(Trichomonas spp.)などの細菌が含まれる。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、そのｍＲＮＡがひと度細胞内に導入されればｍＲＮＡの半減期を延長する安定化部分を含み得る。安定化部分は、例えば、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）または７−メチルグアニレート（ｍ^７Ｇ）キャップなどの５’キャップを含み得る。いくつかの実施形態では、安定化部分は、３’ポリ（Ａ）伸長部を含み得る。例示的ポリ（Ａ）伸長部としては、任意の数のアデニン残基を含み得る。特定の実施形態では、ポリ（Ａ）伸長部は、６４アデニン残基または１５０アデニン残基を含むことができ、ｍＲＮＡの半減期に見かけの違いはほとんど無い。安定化はまた、ｍＲＮＡ構築物を合成する際に修飾塩基を使用することも含み得る。

いくつかの実施形態では、本方法は、病原体を、ｍＲＮＡが導入された細胞に接触させることをさらに含み得る。

イン・ビボ法では、ｍＲＮＡが導入される細胞は、病原体による感染によって引き起こされる病態を有する、または有するリスクのある対象の細胞であり得る。本明細書で使用する場合、病原体による感染によって引き起こされる病態を有する対象とは、前記病態の１以上の症状または臨床徴候を呈する対象を意味する。「症状」とは、疾患または患者の病態の任意の自覚的エビデンスを意味する。「徴候」または「臨床徴候」とは、患者以外の者によって見出され得る特定の病態に関する他覚的身体所見を意味する。本明細書で使用する場合、用語「リスクのある」とは、記載のリスクを実際に有するかもしれないし、有さないかもしれない対象を意味する。よって、例えば、感染性病態の「リスクのある」対象は、前記動物が不顕性量の微生物を保有している可能性があるかどうかに関わらず、他の個体が感染性病態を有すると同定され、かつ／または前記対象が前記微生物による感染の検出可能ないずれの徴候も顕していなくとも、感染性病原体に曝された可能性のあるエリアにいた対象である。

よって、本ｍＲＮＡの導入は、対象が最初に病態の症状または臨床徴候を呈する前、呈している際、もしくは呈した後、または感染性病態の場合には、対象が最初に感染性病原体と接触する前、接触している際、接触した後に行うことができる。対象が最初に前記病態に関連する症状または臨床徴候を呈した後に開始される処置、すなわち、治療的処置は、組成物が投与されない動物に比べて、前記病態の症状および／もしくは臨床徴候の重篤度の軽減、前記病態の完全な消散、ならびに／または前記病態の臨床エビデンスを受ける可能性の低減をもたらし得る。同様に、対象が最初に前記病態に関連する症状または臨床徴候を呈する前に開始される処置、すなわち、予防的処置は、組成物が投与されない動物に比べて、前記病態の症状および／もしくは臨床徴候の重篤度の軽減、前記病態の完全な消散、ならびに／または前記病態の臨床エビデンスを受ける可能性の低減をもたらし得る。

本方法は、有効量の組成物を、特定の病態を有する、または有するリスクのある対象に投与することを含む。本発明のこの態様において、「有効量」とは、前記病態に関連する症状または臨床徴候を任意の程度まで、軽減する、進行を制限する、改善する、または消散するのに有効な量である。

前記ｍＲＮＡを含有する処方物は、限定されるものではないが、液剤、懸濁剤、エマルション、スプレー、エアゾール、または任意の混合物の形態を含む、任意の好適な形態で提供され得る。本組成物は、薬学的に許容可能な任意の賦形剤、担体、またはビヒクルを伴う処方物で送達することができる。本処方物は、例えば、アジュバントまたは不活性担体（例えば、ナノ粒子）などを含む１以上の添加剤をさらに含んでよい。

対象に投与されるｍＲＮＡの量は、限定されるものではないが、対象の体重、健康状態、および／もしくは齢、投与経路、特定のｍＲＮＡカーゴ、ならびに／または生じるタンパク質発現の安定性を含む、種々の因子によって異なり得る。よって、所与の単位投与形に含まれるｍＲＮＡの絶対量は幅広く異なってよく、ｍＲＮＡカーゴ、治療効能、対象の種、齢、体重および／または健康状態、ならびに投与方法などの因子によって決まる。よって、可能性のある総ての適用に有効なｍＲＮＡの量を構成する量を一般的に示すことは現実的でない。しかしながら、当業者ならば、このような因子を正当に考慮した上で適当な量を容易に決定することができる。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、例えば、１回用量から複数用量で投与してよい。前記ｍＲＮＡは対象のゲノムに組み込まれないので、対象の細胞にｍＲＮＡを導入するという治療および／または予防効果は、経時的に自然に消散する。従って、対象の細胞にｍＲＮＡを導入することを含む治療または予防計画は、複数回の処置を含み得る。

別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるような自然免疫に関与するポリペプチドをコードするｍＲＮＡとイン・ビボ送達ビヒクルを含む組成物を記載する。本組成物は、抗腫瘍活性、抗菌活性、および／または抗真菌活性を持ち得、従って、抗腫瘍薬、抗菌薬、および／または抗真菌薬となり得る。

本明細書に記載のｍＲＮＡは、「担体」とともに組成物として処方することができる。本明細書で使用する場合、「担体」は、任意の溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗菌剤、および／または抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、バッファー、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体および／または薬剤の使用は当技術分野で周知である。従来の任意の媒体または薬剤が有効成分と不適合である場合を除き、治療組成物中でのその使用が企図される。補足的有効成分も本組成物に配合可能である。

「薬学的に許容可能な」とは、生物学的にまたはそれ以外の点で望ましくないものではない材料を意味し、すなわち、その材料は、ｍＲＮＡとともに、いずれの望ましくない生物作用を生じることなく、またはそれが含まれる医薬組成物の他のいずれの成分とも有害な様式で相互作用せずに、個体に投与され得る。

本ｍＲＮＡは、医薬組成物中に処方してもよい。医薬組成物は、好ましい投与経路に適合した種々の形態で処方することができる。よって、組成物は、例えば、経口、非経口経路（例えば、皮内、経皮、皮下など）、または局所経路（例えば、鼻腔内、肺内、乳房内、腟内、子宮内、皮内、経皮、直腸など）を含む、既知の経路を介して投与することができる。組成物は、例えば、膣、鼻腔、または呼吸器系粘膜（例えば、スプレーまたはエアゾール）への投与によるなどで、粘膜表面に投与することができると予測される。組成物はまた、持続的放出または遅延放出によって投与することもできる。

処方物は好都合には単位投与形で提供することができ、製薬分野で周知の方法により調製することができる。組成物を薬学的に許容可能な担体とともに調製する方法は、ｍＲＮＡを含有するベクターを、１以上の補助成分を構成する担体と会合させる工程を含む。一般に、処方物は、有効化合物を液体担体、微粉固体担体、またはその両方と均一、かつ／または緊密に会合させ、次に、必要に応じて、前記生成物を成形して所望の処方物とすることによって調製することができる。

以上の記載では、特定の実施形態を理解しやすいように個別に記載されている。特定の実施形態の特徴が別の実施形態の特徴と適合しないことが特段に明示されない限り、ある特定の実施形態は、１以上の実施形態に関して本明細書に記載される、適合する特徴の組合せを含み得る。

独立した複数の工程を含む本明細書に開示されるいずれの方法についても、それらの工程は実現可能ないずれの順序で行ってもよい。また、適当であれば、２つ以上の工程の任意の組合せを同時に行うこともできる。

用語「および／または」は、列挙されている用組成物の１つもしくは総て、または列挙されている用組成物のいずれか２つ以上の組合せを意味し；用語「含んでなる」およびその変形形態は、これらの用語が明細書および特許請求の範囲に見られる場合には、限定の意味を持たず；特に断りのない限り、「１つの(a)」、「１つの(an)」、「その(the)」および「少なくとも１つの」は互換的に使用され、１または１を超える、を意味し；また、終点による数値範囲の列挙は、その範囲内に包含される総ての数値を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。

本発明を以下の実施例により説明する。特定の実施例、材料、量、および手順は、本明細書に示される本発明の範囲および趣旨に従って広義に解釈されるものと理解されるべきである。

実施例１
細胞培養
ヒトＫＢ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７）は、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターにて、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した改変イーグル培地（ＭＥＭ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ、ハーンドン、ＶＡ）中で培養した。

細菌
リステリア菌ＡＴＣＣ １０４０３Ｓおよび腸チフス菌(S. enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium))ＡＴＣＣ １４０２８は、３７℃にて、ブレインハートインフュージョン培地（ＤＩＦＣＯ、ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、スパークス、ＭＤ）中、およびトリプチックソイ寒天（ＤＩＦＣＯ、ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、スパークス、ＭＤ）上で増殖させた。リステリア菌およびサルモネラ菌細胞をそれぞれ対数増殖期および定常期から、６２０ｎｍでの吸光度０．４〜０．６で採取し、ＫＢ細胞の感染に使用した。

プラスミドの構築
ｐＧＥＭ４Ｚ．ｓｓ１ｂｂｚ．２ｂｇＵＴＲ．１５０Ａ（ペンシルバニア大学Prof. Carl H. June & Dr. Yangbing Zhaoにより提供）を、ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、挿入部を除去した(Zhao et al.,. 2010. Cancer Res. 70: 9053-9061.)。次に、Ｋｏｚａｋ配列を含むＥＧＦＰ（プライマー対はＰ１とＰ２）、ヒトＣＡＭＰ（プライマー対はＰ３とＰ４）、Ｓ１００Ａ８（プライマー対はＰ５とＰ６）およびＳ１００Ａ９（プライマー対はＰ７とＰ８）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をｐＧＥＭ４Ｚ．２ｂｇＵＴＲ．１５０Ａにクローニングした（表１）。他方、Ｋｏｚａｋ配列を含むＳ１００Ａ８ ＯＲＦを、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩを介して、ｐＩＲＥＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、マウンテンビュー、ＣＡ）の第１の多重クローニング部位（ＭＣＳ）に、クローニングした（プライマー対はＰ１１とＰ１２）。ＳＫｏｚａｋ配列を含む１００Ａ９ ＯＲＦを、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩを介して、第２のＭＣＳにクローニングした（プライマー対はＰ１３とＰ１４）（表１）。次に、Ａ８−ＩＲＥＳ−Ａ９断片を増幅し（プライマー対はＰ９とＰ１０）、これもまたｐＧＥＭ４Ｚ．２ｂｇＵＴＲ．１５０Ａにクローニングし、プラスミドｐＧＥＭ４Ｚ．Ａ８−ＩＲＥＳ−Ａ９．２ｂｇＵＴＲ．１５０Ａを作製した（表１）。

ｐＩＲＥＳベクターのＩＲＥＳは、部分的に無能化された配列である(Rees et al., 1996. Biotechniques 20: 102-110; Bochkov et al., 2006. Biotechniques 41: 283-284, 286, 288 passim)。２つのＭＣＳの間に天然ＩＲＥＳ（ｎＩＲＥＳ）を構築するため、ｐＧＥＭ４Ｚ．Ａ８−ＩＲＥＳ−Ａ９．２ｂｇＵＴＲ．１５０Ａベクターを鋳型として用い、プライマー対5’-AAACGTCTAGGCCCCCCGAACC-3’／5’-TTTAACCTCGACTAAACACATGTAAAGCATGTGC-3’を用いて増幅した。これらの生成物を精製し、自己ライゲーションを行ってプラスミドｐＧＥＭ４Ｚ．Ａ８−ＩＲＥＳ／ｍｕｔ１−Ａ９．２ｂｇＵＴＲ．１５０Ａを作製した。ｐＧＥＭ４Ｚ．Ｓ１００Ａ８−ＩＲＥＳ／ｍｕｔ１−Ｓ１００Ａ９．２ｂｇＵＴＲを鋳型として用い、プライマー対5’-ACCATGACTTGCAAAATGTCGCAGCTG-3’／5’-ATTATCATCGTGTTTTTCAAAGGAAAACCAC-3’を用いて増幅した後、断片を精製し、自己ライゲーションを行ってプラスミドｐＧＥＭ４Ｚ．Ａ８−ｎＩＲＥＳ−Ａ９．２ｂｇＵＴＲ．１５０Ａを作製した。

イン・ビトロ転写
鋳型を対応するプラスミド構築物から増幅し、ゲルから抽出した。精製した断片を５０℃にて３０分間、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌプロテアーゼＫで処理し、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）、次いで、クロロホルムで抽出した。エタノール沈殿の後、鋳型を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに溶かし、−８０℃で保存した。ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｕｌｔｒａキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、カールズバッド、ＣＡ）またはＳｃｒｉｐｔキャップＴＭ ｍ７Ｇ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ／ＳｃｒｉｐｔＣａｐＴＭ ２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼキット（Ｃｅｌｌ Ｓｃｒｉｐｔ、マディソン、ＷＩ）を用い、ｍＲＮＡを合成し、次いで、ＭＥＧＡｃｌｅａｒキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、カールズバッド、ＣＡ）を用いて精製した後、エタノール沈殿を行った。

ｍＲＮＡトランスフェクション
およそ６０％〜９０％コンフルエントで、ＴｒａｎｓＩＴ−ｍＲＮＡキット試薬（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏｌ ＬＬＣ、マディソン、ＷＩ）を製造者の説明書に従って用い、細胞をｍＲＮＡでトランスフェクトした。

ウエスタンブロット分析
Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ−ＰＥ ＬＢＴＭバッファー(G-Biosciences、セントルイス、ＭＯ）を用いて細胞を抽出した。抽出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜に転写し、下記のもの：ウサギ抗β−アクチン（ＤＢ０７０、Ｄｅｌｔａ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＬＬＣ、ギルロイ、ＣＡ）、マウス抗ＬＬ３７（ｓｃ−１６６７７０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、サンタクルーズ、ＣＡ）、マウス抗Ｓ１００Ａ８（ｓｃ−４８３５２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、サンタクルーズ、ＣＡ）、ウサギ抗Ｓ１００Ａ９（ｓｃ−２０１７３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、サンタクルーズ、ＣＡ）、ウサギ抗ＰＡＲＰ（＃９５４２Ｓ、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とともにインキュベートした。次に、ウサギ一次抗体をセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＰ）結合ヤギ抗ウサギ抗体とともにインキュベートし、マウス一次抗体はＨＰ結合ヤギ抗マウス抗体（二次抗体、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、サンタクルーズ、ＣＡ）とともにインキュベートした。免疫反応を、ＳｕｐｅｒＳｉｏｇｎａｌＷｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，ウォルサム、ＭＡ）を用いて可視化し、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬフィルム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ピスカタウェイ、ＮＪ）に露光した。タンパク質バンドをＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ分析（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ハーキュリーズ、ＣＡ）により定量した。

細菌侵入アッセイ
細菌侵入は、抗生物質保護アッセイで決定した(Champaiboon et al., 2009. J. Biol. Chem. 284:7078-90; Nisapakultorn et al., 2001. Infect. Immun. 69: 3692-3696)。簡単に述べれば、ＫＢ細胞（１．０〜１．２×１０^５細胞）を２４ウェルプレート内に一晩播種した。次に、細胞をリステリア菌ＡＴＣＣ １０４０３Ｓまたは腸チフス菌ＡＴＣＣ １４０２８とともに、それぞれ多重感染度（ＭＯＩ）１００：１および１：１でインキュベートした。２時間のインキュベーションの後、単層をＤＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）で洗浄し、１００μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）を含有する、１０％ＦＢＳを添加したＭＥＭ中で１．５時間インキュベートし、無菌蒸留水とともに１５分間インキュベートすることにより細胞を溶解させた。放出された細菌を希釈し、スパイラルプレーター（Ｓｐｉｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ベセスダ、ＭＤ）を用いて播種し、３７℃で一晩インキュベートした後、細胞内細菌のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数をコロニーカウンター（Ｃ−１１０、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、エンフィールド、ＣＴ）で数えた。

イン・ビトロ毒性アッセイ
イン・ビトロにおけるｍＲＮＡ送達の毒性作用を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ（イン・ビトロ毒性アッセイキット、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）を用いて細胞生存率を定量的に決定することによって分析した。簡単に述べれば、ＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を培養培地容量の１０％に相当する量で各ウェルに加えた。次に、細胞を３７℃で２時間インキュベートし、５７０ｎｍの波長で吸光度を測定し、生細胞のパーセンテージを、トランスフェクト細胞と非トランスフェクト細胞の吸光度の比として計算した。

アポトーシスの分析
細胞のアポトーシスの状態を評価するために、トランスフェクト細胞を、上記のようにウエスタンブロットでウサギ抗ＰＡＲＰを用い、アネキシンＶ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キット（ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐ、ウォータータウン、ＭＡ）を製造者の推奨に従って用いたフローサイトメトリーにより、ＰＡＲＰ切断に関して評価した。トランスフェクション後最大７２時間の時点で、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳ中２．５％のＦＢＳで洗浄し、結合バッファー中、アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウムとともに室温、暗所で５分間インキュベートした。染色された細胞を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、ＣＡ）をＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアとともに用い、ＦＩＴＣシグナルをＦＬ１に置き、ヨウ化プロピジウムシグナルをＦＬ２に置いて分析した。アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣで陽性染色された細胞をアポトーシスと見なした(Pelicano et al., 2003. J. Biol. Chem. 278: 37832-37839)。

統計分析
各条件について、少なくとも３回〜６回の独立した実験を行って分析した。平均値の差を分析するために、Ｅｘｃｅｌソフトウエア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、レドモンド、ＷＡ）を用いてスチューデントのｔ検定を適用した。

定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応分析
トリゾール試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、カールズバッド、ＣＡ）およびＲＮｅａｓｙ ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、ＣＡ）を用い、全ＲＮＡを単離し、スーパースクリプトＩＩＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、カールズバッド、ＣＡ）を用いて逆転写した。定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、ＰｒｉｍｅＴｉｍｅプレデザインｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ（ヒトＣＡＭＰの場合にはＨｓ．ＰＴ．４２．１０７３７４７、ヒトＳ１００Ａ８の場合にはＨｓ．ＰＴ．４２．３６８２１４１、ヒトＳ１００Ａ９の場合にはＨｓ．ＰＴ．４２．３０８０６３５、ヒトＡＣＴＢの場合にはＨｓ．ＰＴ．４５．２２７９７０．ｇ； Integrated Device Technology, San Jose, CA)を用いて行った。ＣＡＭＰ、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９ Ａ８−ＩＲＥＳ−Ａ９およびＡ８−ｎＩＲＥＳ−Ａ９ ｍＲＮＡの発現レベルをＡＣＴＢ ｍＲＮＡに対して正規化した。

免疫蛍光
１６時間のＣＡＭＰ、Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９ ｍＲＮＡトランスフェクションの後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、次いで、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１０分間透過処理を施した。ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０中１％のＢＳＡで１時間ブロッキングし、ＰＢＳで３回すすいだ後に、細胞をマウス抗カルプロテクチン（ｍＡｂ ２７Ｅ１０、ｓｃ−３３７１４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、サンタクルーズ、ＣＡ）またはマウス抗ＬＬ３７（ｓｃ−１６６７７０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、サンタクルーズ、ＣＡ）とともに１時間、次いで、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８結合ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、カールズバッド、ＣＡ）とともに１時間インキュベートした。ＥＧＦＰ ｍＲＮＡトランスフェクションの場合、抗体インキュベーションは必要としなかった。核をＤＡＰＩで染色した。落射蛍光顕微鏡システムを用いて蛍光画像を取り込んだ。４０時間のＡ８−ＩＲＥＳ−Ａ９およびＡ８−ｎＩＲＥＳ−Ａ９ ｍＲＮＡトランスフェクションも行った。

実施例２
細胞株および培養条件
Ｓ１００Ａ８／Ａ９発現陰性のヒト癌細胞株ＫＢ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７）を最小必須培地（ＭＥＭ）で培養した。内因的にＳ１００Ａ８／Ａ９を発現するヒトＨＮＳＣＣ細胞株ＴＲ１４６は、ダルベッコの改変イーグル培地／ハムＦ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）で培養した。ＴＲ１４６細胞は、原初は高分化型口内癌の子宮頸リンパ節転移に由来し(Rupniak et al., 1985. J Natl Cancer Inst 75: 621-635)、テキサス大学、Ｍ．Ｄ．アンダーソン癌センター、ヒューストン、ＴＸのＤｒ． Ｒｅｕｂｅｎ Ｌｏｔａｎから提供されたものであった(Eicher et al., 1996. Clin Cancer Res 2: 1659-1664)。ＭＥＭおよびＤＭＥＭ／Ｆ−１２培養培地に１０％熱失活ウシ胎児血清を添加し（完全培地）、細胞を５％ＣＯ_２中、３７℃で維持した。各細胞株は使用前にｑＰＣＲによってマイコプラズマ陰性であることを確認した。

ヒト癌細胞株におけるＳ１００Ａ８／Ａ９の安定発現
Ｓ１００Ａ８／Ａ９（ＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９、旧称ＫＢ−ＭＲＰ８／１４としても知られる）を発現するように安定トランスフェクトした癌細胞またはシャム対照ベクター（ＫＢ−ＥＧＦＰ）を、従前に報告されているように(Nisapakultorn et al., 2001. Infect Immun 69: 4242-4247)、ＫＢ細胞から作製した。簡単に述べれば、ＫＢ細胞を、Ｓ１００Ａ８（ＭＲＰ８）またはＳ１００Ａ９（ＭＲＰ１４）サブユニット遺伝子を含む哺乳動物発現ベクターｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、ＣＡ）と、選択マーカーｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｇ４１８スルフェート耐性マーカー遺伝子）とで共トランスフェクトした。得られた細胞株ＫＢＳ１００Ａ８／Ａ９は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９タンパク質複合体を発現する。ＫＢ−ＥＧＦＰシャムトランスフェクション対照は、挿入の無いｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰとｐＳＶ２−ｎｅｏの共トランスフェクションにより作製した。ＫＢＳ１００Ａ８／Ａ９およびＫＢ−ＥＧＦＰは両方とも７００μｇ／ｍｌのＧ４１８スルフェート（ジェネティシン、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、マナサス、ＶＡ）中で維持した。トランスフェクト細胞のサイトゾルのＳ１００Ａ８／Ａ９発現は、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および抗Ｓ１００Ａ８／Ａ９ヘテロ二量体特異的モノクローナル抗体２７Ｅ１０（Ｂａｃｈｅｍ、キング・オブ・プルシア、ＰＡ）を用いた間接的免疫蛍光の両方によって確認した。また、タンパク質複合体の形成を確認するために共免疫沈降も行った。

リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現分析
Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９発現を、それぞれ舌、喉頭および唾液腺に起源するステージＩＩ（Ｔ２Ｎ０Ｍ０）、ＩＩＩ（Ｔ３Ｎ０Ｍ０）およびＩＶＡ（Ｔ４Ｎ０Ｍ０）腫瘍を有する３名の患者から切除したヒト頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）ならびにその対応するＮＡＴの臨床検体で分析した。３名のＨＮＳＣＣ患者からのＨＮＳＣＣ腫瘍組織および腫瘍細胞のエビデンスを示さないＮＡＴは、インフォームド・コンセントを得て商業的組織バンク（ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ，Ｉｎｃ．、カルバーシティー、ＣＡ)から入手した。腫瘍およびＮＡＴは切除後３０分以内に急速冷凍し、切片を採り、新生細胞に関して分析した。少なくとも７０％の腫瘍細胞およびＮＡＴを含むＨＮＳＣＣ検体の領域から、トリゾールを用いてＲＮＡを抽出し、品質管理のためにＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００を用いて分析した。各患者からの腫瘍およびＮＡＴの全ＲＮＡをそれぞれプールし、逆転写し、リアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）をＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎとともに用いて定量した。

別の実験で、ＫＢおよびＴＲ１４６細胞から、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキットを用いて全ＲＮＡを抽出し、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いて定量し、上記のようにリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲを用いて、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９特異的ｍＲＮＡを定量した。

ヒトＨＮＳＣＣ細胞株におけるＳ１００Ａ８／Ａ９の安定なノックダウン
従前に記載されたような(Sorenson et al., 2012. Mucosal Immunol. 5: 66-75) Ｓ１００Ａ８／Ａ９ノックダウンクローン（ＴＲ１４６−ｓｈＲＮＡ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９ＫＤ）を作製するために、ＴＲ１４６細胞（内因性Ｓ１００Ａ８／Ａ９発現を伴う）を、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９遺伝子転写産物に対する干渉ｓｈＲＮＡを産生するためのオリゴ配列を含有するＧｅｎｅＥｒａｓｅｒ短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）哺乳動物発現ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、シダークリーク、ＴＸ）ｐＧＥ−１でトランスフェクトした。Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９遺伝子サイレンシングクローンの陰性対照（ＴＲ１４６−ｓｈＲＮＡ−対照）を作製するために、一部の細胞を、スクランブルｓｈＲＮＡを含むｐＧＥ−１対照ベクターでトランスフェクトした。２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８スルフェートの存在下で増殖させたクローンを選択した。Ｓ１００Ａ８／Ａ９遺伝子およびタンパク質発現をｑＲＴ−ＰＣＲおよび免疫ブロットによって定量した。

Ｓ１００Ａ８／Ａ９陽性細胞および陰性細胞の増殖
足場依存的増殖率を測定するために、腫瘍細胞を非発熱性ポリスチレン組織培養フラスコの完全培地（上記参照）中で培養し、トリプシン処理により採取し、トリパンプルー排除により計数した。総数はＶｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存率分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、フラートン、ＣＡ）を用いて確認した。足場非依存的増殖は、標準的な軟寒天培地（０．５％固形寒天の上にプレーティングした完全培地中０．２５％の寒天）で、５％ＣＯ_２、３７℃にて、最大２．５週間増殖させた後に、細胞コロニーを数えることによって決定した。

細胞の同調化および細胞周期の分析
ＫＢ細胞、ＫＢ−ＥＧＦＰ細胞およびＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞を１×１０^５細胞／ｍｌの密度で播種し、上記のように完全培地中で培養した。Ｇ１／Ｓで同調させるために、７０％コンフルエントの細胞（約４８時間培養）を一晩血清飢餓状態とし、次いで、完全培地中で１２時間、３μｇ／ｍｌのアフィジコリンで遮断した。Ｇ１／Ｓ遮断から離脱させて細胞周期への再進入を促すため、同調化した細胞を、カルシウムおよびマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で３回洗浄してアフィジコリンを除去し、１０％ＦＢＳを含有する新鮮培地中で培養した。Ｇ１／Ｓ遮断から離脱した後の細胞を種々の時点で採取し、７０％氷冷エタノール中で固定し、３７℃にて３０分間、２５μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液（ＤＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍｌのＲＮアーゼおよび０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有）でＤＮＡを染色した。ＰＩ染色されたＤＮＡの含量を、フローサイトメトリーを用いて分析した。また、同調培養物中の有糸分裂細胞も、ホスホヒストンＨ３（Ｓｅｒ１０）特異的ポリクローナル抗体（ＰＥ結合二次抗体により検出され、他所に記載されるようにフローサイトメトリーにより分析される）を用いた免疫染色により数えた(Krutzik et al., 2003. Cytometry A 55: 61-70)。

細胞の溶解およびタンパク質の抽出
単層培養した癌細胞をトリプシン処理によって採取し、ＤＰＢＳで２回洗浄し、新鮮なプロテアーゼ阻害剤カクテル（カタログ番号Ｐ８３４０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、セントルイス、ＭＯ）を１：１００希釈で添加した免疫沈降溶解（ＩＰ）バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、２ｍＭ ＮａＦ）を用い、氷上で２時間溶解させた。不溶性材料を４℃、１５，０００ｘｇで１０分間の遠心分離によって除去し、上清を回収し、ＢＣＡＴＭタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、ロックフォード、ＩＬ）によりタンパク質濃度を決定した。

免疫ブロット分析
タンパク質サンプルを１×サンプルバッファー（１２．５％グリセロール、０．００５％ブロモフェノールブルーおよび２．５％βメルカプトエタノールを含む３１．２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８中１％ＳＤＳ）中で５分間煮沸した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに、示されたように総タンパク質５０〜１００μｇ／ウェルをロードし、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ハーキュリーズ、ＣＡ）セミドライ式タンパク質転写装置によってＰＶＤＦ膜またはニトロセルロース膜に転写し、ＴＢＳ−Ｔバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中５％スキムミルクで一晩ブロッキングし、ブロッキングバッファー中、１：１０００希釈した一次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。次に、これらのブロットをＴＢＳ−Ｔで各５分間３回洗浄し、ブロッキングバッファー中で１：３０００希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体とともにさらに１時間インキュベートした。ホスホＰＰ２Ａ−Ｃ（Ｔｙｒ３０７）ウサギモノクローナル抗体（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、バーリンゲーム、ＣＡ）を除き、細胞周期レギュレーターを検出するための抗体は総てＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（サンタクルーズ、ＣＡ）から購入した。最終洗浄をＴＢＳ−Ｔで３回行った後、これらのブロットをＥＣＬウエスタンブロッティング検出基質（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ピスカタウェイ、ＮＪ）中でインキュベートした。化学発光バンドを記録し、コダックＸＡＲ−５Ｘ線フィルムに露光することにより分析した。

共免疫沈降法
各細胞株からの等量の溶解液タンパク質を、Ｅｚｖｉｅｗ ＲｅｄプロテインＡアフィニティーゲル（プロテインＡゲル、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とともにインキュベートして非特異的結合を最小化した（プレクリア(pre-clear)）。次に、プレクリアした溶解液に５μｇの捕捉抗体を混合し、ＴＢＳで容量を１ｍｌに調整した。この混合物を穏やかに回転させながら４℃で１時間インキュベートした後、２５μｌのプロテインＡゲルを加え、穏やかに回転させながら４℃でさらに１時間インキュベートした。次に、プロテインＡ−抗体−タンパク質複合体を冷免疫沈降溶解バッファーで３回洗浄し、１×サンプルバッファー（上記の通り）でプロテインＡゲルから溶出させた。軽く遠心分離した後、上清を沸騰水中で５分間インキュベートし、免疫ブロット法によって分析した。１４−３−３β：Ｃｄｃ２５Ｃ相互作用研究では、マウス抗１４−３−３βを共ＩＰ捕捉抗体として用い、ウサギ抗Ｃｄｃ２５Ｃ免疫ブロット検出に用いた。Ｓ１００Ａ８／Ａ９とＰＰ２Ａを共免疫沈降させるためには、マウス抗Ｓ１００Ａ８／Ａ９抗体２７Ｅ１０または抗Ｓ１００Ａ９およびヤギ抗ＰＰ２Ａ−Ａα抗体を用いた。抗体は総てＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃから購入した。

オカダ酸処理によるＰＰ２Ａ阻害
ＫＢ細胞、ＫＢ−ＥＧＦＰ細胞およびＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９細胞を３×１０^５細胞／ウェルの密度で播種し、上記のように完全培地中で一晩培養した。培養細胞を１０ｎＭオカダ酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）またはビヒクル対照（ＤＭＳＯ）を含有する新鮮培地とともに２４時間インキュベートした。冷ＤＰＢＳで２回洗浄することによって細胞を採取し、氷上で、そのままウェル内で、ホスファターゼ溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＳＤＳ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、２ｍＭ ＮａＦおよび１０％プロテアーゼ阻害剤）を用いて溶解させた。溶解液に対して−８０℃での凍結−融解サイクルを２回行い、４℃で遠心分離し、ＢＣＡおよび免疫ブロットによるタンパク質定量のために上清を回収した。

ＰＰ２Ａホスファターゼ活性アッセイ
ホスファターゼ活性は、免疫沈降ホスファターゼアッセイキット（カタログ番号１７−３１３、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビレリカ、ＭＡ）を用いて行った。同調化した細胞を採取し、ＤＰＢＳで２回洗浄し、ペレットとし、上記のように新鮮なプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加し、ホスファターゼ阻害剤、Ｎａ_３ＶＯ_４およびＮａＦを含まないＩＰ溶解バッファーに再懸濁させた。各反応で新鮮な溶解液を用いた。ＰＰ２Ａホスファターゼ活性は製造者のプロトコールに従って測定した。簡単に述べれば、１００μｇの総タンパク質（濃度はＩＰ溶解バッファーで調整）に２μｇのマウスモノクローナル捕捉抗体（ＰＰ２Ａ、Ｃサブユニットクローン１Ｄ６、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を混合し、アイソタイプマウスＩｇＧ２ｂを対照として用い、容量をｐＮＰＰ Ｓｅｒ／Ｔｈｒアッセイバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１００μＭ ＣａＣｌ_２）で５００μｌに調整した後に４℃で１時間、絶えず揺動させながらインキュベートした。インキュベーション後、２５μｌのプロテインＡアガロースビーズを各反応混合物に加え、絶えず揺動させながら４℃でさらに１時間インキュベーションを続けた。次に、これらのビーズをＴＢＳで３回洗浄し、次いで、Ｓｅｒ／Ｔｈｒアッセイバッファーで１回洗浄し、Ｓｅｒ／Ｔｈｒアッセイバッファーで希釈した７５０μＭのスレオニンホスホペプチド（Ｋ−Ｒ−ｐＴ−Ｉ−Ｒ−Ｒ）溶液中、３０℃で１０分間、絶えず振盪しながらインキュベートした。放出された総無機リン酸（Ｐｉ）を、マラカイトグリーンリン酸検出溶液（キット内に含まれている）を用いて測定した。

実施例３
細胞株
カルプロテクチン（ＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９、旧称ＫＢ−ＭＲＰ８／１４としても知られる）を発現するように安定トランスフェクトされた上皮細胞またはシャム対照ベクター（ＫＢ−ＥＧＦＰ）をＫＢ細胞から、従前に報告されている通りに(Nisapakultorn et al., 2001. Infect. Immun. 69: 3692-3696)作出した。簡単に述べれば、ＫＢ細胞をＳ１００Ａ８（ＭＲＰ８）およびＳ１００Ａ９（ＭＲＰ１４）カルプロテクチンサブユニットコード領域を含有する哺乳動物発現ベクターｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、ＣＡ）と選択マーカーｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｇ４１８スルフェート耐性マーカー）とで共トランスフェクトした。得られた細胞株ＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９はカルプロテクチン複合体を発現する。ＫＢ−ＥＧＦＰシャムトランスフェクション対照は、挿入の無いｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰとｐＳＶ２−ｎｅｏの共トランスフェクションにより作製した。ＫＢ−Ｓ１００Ａ８／Ａ９およびＫＢ−ＥＧＦＰは両方とも、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加し、５％ＣＯ_２、３７℃で維持したＭＥＭ（ＣＥＬＬＧＲＯ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、マナサス、ＶＡ）中、７００μｇ／ｍｌのＧ４１８スルフェート（ジェネティシン、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、マナサス、ＶＡ）で維持した。総ての実験前の２日間、細胞はＧ４１８を含まず１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ（完全培地）中で維持した。

ＴＲ１４６細胞は、ＭＤアンダーソン癌センター、ヒューストン、ＴＸのＤｒ．Ｒｅｕｂｅｎ Ｌｏｔａｎから入手した口内癌細胞株である。細胞はＧ４１８を用いずに上記の通りに培養した。一部の細胞は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の発現および産生を抑制するためにｓｈＲＮＡで、または標準的な方法を用いたモックトランスフェクション対照で安定トランスフェクトした。

口腔底腫瘍形成の動物モデル
６〜８週齢の雌０１Ｎ７０［Ｃｒ：ＮＩＨ（Ｓ）−ｎｕ／ｎｕ Ｎｕｄｅ］系統マウスを、１２時間の明暗周期を用い、特定病原体不在条件下、マイクロアイソレーターケージで飼育し、食物と水は自由に摂らせた。動物を、Ｏ_２ ２Ｌ ｍｉｎ^−１中５％のイソフルオランを用いて麻酔し、ＫＢ（１×１０^５）細胞またはＴＲ１４６（５×１０^４）細胞またはトランスフェクト誘導体を１００μｌ １：１ ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）／マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、ＣＡ）中に懸濁し、口腔底に同所注入した。歩行できるまで動物を監視し、試験中、毎日確認した。注射後１７日目に、マウスをＣＯ_２で安楽死させた。腫瘍を含む口腔組織を回収し、ＤＰＢＳですすぎ、パラフィン包埋した１０％ホルマリン溶液中で保存し、組織学的分析のためにヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈｉｓｔｏｓｅｒｖ Ｉｎｃ、ジャーマンタウン、ＭＤ）で染色した。
結果を図１３に示す。

実施例４
鋳型をｐＧＥＭ４Ｚ．２ｂｇＵＴＲ．１５０Ａから、５％２−チオウリジンを加え、２５％５−メチルシチジンを加えて、実施例１に記載の通りに増幅し、ｍＲＮＡは、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ｕｌｔｒａキット（Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、グランドアイランド、ＮＹ，）をＡＲＣＡキャッピングとともに用いて合成した。細胞を、ＴｒａｎｓＩＴ−ｍＲＮＡキット（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ、マディソン、ＷＩ）を用いてトランスフェクトした。唾液をトランスフェクション試験の直前に３名のドナーから採取し、プールし、１２，０００×ｇで５分間遠心分離して粒子を除去し、その唾液上清を総ての試験に用いた。

用量反応相関を示すように唾液を希釈し、上皮細胞培養物とともに１分間、３分間、または５分間インキュベートした。いくつかの試験では、唾液処理細胞を洗浄して処理を元に戻した。唾液処理直後に、洗浄して、また、洗浄せずに、細胞をＥＧＦＰ ｍＲＮＡでトランスフェクトした。ｍＲＮＡトランスフェクション１６時間後に、細胞を４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、核をＤＡＰＩで洗浄した。蛍光画像を落射蛍光顕微鏡で取り込んだ。結果を図１５および図１６に示す。

実施例５
歯周炎動物モデルおよびＳ１００Ａ８／Ａ９ ｍＲＮＡ処置の有効性
Ｐ．ジンジバリス誘発歯周炎に対する感受性を、Ｓ１００Ａ８／Ａ９−／−である野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ヒトＳ１００Ａ８／Ａ９の上皮組織特異的発現を有するＳ１００Ａ８／Ａ９−／−マウス、または歯肉上皮へのＳ１００Ａ８／Ａ９ ｍＲＮＡトランスフェクションの局所適用を受けたＳ１００Ａ８／Ａ９−／−マウスにおいて評価した。

Ｐ．ジンジバリスによる口腔感染
Ｐ．ジンジバリスＡＴＣＣ ５３９７７（Ａ７Ａ１−２８）(Costalonga, et al., 2009, J Periodontal Res 44:537-542)は、他のＰ．ジンジバリスよりも大きな骨破壊を誘導する(Baker, et al., 2000, Oral Microbiol Immunol 15:27-32)。口腔感染を作り出すために、マウスを抗生物質で前処理し、２％カルボキシメチルセルロース中の４×１０^９ＣＦＵのＰ．ジンジバリスまたは対照Ｌ．ムリヌス(L. murinus)を従前に記載されているように(Costalonga, et al., 2009, J Periodontal Res 44:537-542)、強制経口投与により、４日あけて６エピソード与える。Ｌ．ムリヌスは歯槽骨欠損または炎症を生じない。Ｐ．ジンジバリスおよびＬ．ムリヌスのコロニー形成は、最初の強制経口投与前と５０日後にマウスの口腔をサンプリングすることにより試験する。

使用動物
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、バーハーバー、ＭＥ）に、強制経口投与により、Ｐ．ジンジバリスＡＴＣＣ ５３９７７を接種する。総てのマウスを特定病原体不在（ＳＰＦ）ＡＡＡＬＡＣ承認施設で飼育する。事前の検出力の計算に基づけば、各処置または対照（シャム）を受ける２１個体のマウスは、Ｐ．ジンジバリスＡＴＣＣ ５３９７７感染マウスとシャム感染マウスの間の骨周囲の骨破壊の程度に９０％の検出力で１０〜１５％の違いを検出するのに十分である（αを０．０５に設定した場合）。

炎症の測定
記載されているように(Costalonga, et al., 2009, J Periodontal Res 44:537-542)、上顎および下顎を０日目および５０日目に採取し、切開し、正中で分離して４検体を得る。各試験群または処理からの１４の右側の下顎半体および上顎半体のうち７つを４％パラホルムアルデヒドで固定し、ｐＨ８の１０％ＥＤＴＡ中で１週間脱灰する。検体を記載のように(Sato, et al., 1986, Am J Pathol 125:431-435)パラフィンに包埋し、ヘマトキシリン−エオジンで染色するか、またはＯＣＴにて凍結させ、免疫細胞の免疫蛍光同定向けに処理する。

隣接歯間組織の細胞充実度を特徴付けるために、３本の臼歯総ての検体の、根尖−歯冠方向に近遠心断７μｍの切片をとった(sectioned meso-distally cutting 7 μm apico-coronally)。炎症の存在および接着の欠如を、それぞれ炎症核の優位性およびセメントエナメル境から根尖側への接合上皮の移動によって同定した。

顎からの細菌の回収
採取直後に、１４の右側の下顎半体および上顎半体のうち他方の７つを用いて、組織を骨から剥離するか、またはディスパーゼで結合組織から表皮層を消化する処理を行うことにより、歯肉上皮から細菌を回収する。あるいは、顎を予め還元した培養培地中でホモジナイズする。一部を好気性チャンバー内の血液寒天培地に播種し、ＣＦＵを数える。また、アリコートを用いて、ホモジネートに対してｑＰＣＲを用い、Ｐ．ジンジバリスおよびＬ．ムリヌスのレベルを評価する。

歯槽骨欠損の判定
左側の下顎半体および上顎半体を、メスを用いて力をかけずに除肉する。顎を蒸留水で１０分間煮沸し、１Ｎ ＮａＯＨ中で３時間置いて、残留している角質化した歯肉を除去し、最後に、１％メチレンブルーで１分間染色する。除肉した下顎半体および上顎半体を軟質モールドに舌側を上にしてマウントし、記載のように(Costalonga, et al., 2009, J Periodontal Res 44:537-542)デジタルカメラが装備された実体顕微鏡下にて倍率４０×で撮影する。サンプル−対物角(sample-objective angle)に関連する画像のゆがみを最小とするために、下顎半体および上顎半体の舌側画像を頬側咬頭中央部の遠心端と舌側咬頭中央部の遠心端の間の投影領域が１０，０００±５００画素となるように標準化する。撮影した顎で、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、サンノゼ、ＣＡ）の標準化グリッドを用いて、３本の各臼歯のセメントエナメル境(cementum-enamel junction)（ＣＥＪ）から歯槽頂までを測定する。歯槽骨のレベル変化は、従前に記載されているように(Costalonga, et al., 2009, J Periodontal Res 44:537-542)、見えている根幹の表面積における画素数として間接的に測定する。

さらに、一部の顎で、マイクロコンピューター断層撮影法（ＣＴ）を用いて評価を行う。

分析
Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＳ１００Ａ８／Ａ９−／−マウスにおける４つの独立した群（Ｐ．ジンジバリス感染対照、Ｌ．ムリヌス感染対照）の骨面積測定値の平均を、分散分析の従属変数として使用する。本測定方法の感度では、検出率９０％で歯槽頂骨レベルの１０％の変化の検出が可能である。

同様に、一般に細菌、具体的には、Ｐ．ジンジバリスおよび対照Ｌ．ムリヌスの、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の存在下および不在下での増殖を比較する。

炎症は、半定量的に評価する。

Ｃ５７ＢＬ／６野生型およびヒトＳ１００Ａ８／Ａ９の上皮特異的レスキューを伴うＳ１００Ａ８／Ａ９−／−マウスにおける歯周炎に対する感受性を評価するために、Ｐ．ジンジバリスまたは対照Ｌ．ムリヌスを用いて、野生型Ｃ５７ＢＬ／６（ネズミＳ１００Ａ８／Ａ９＋／＋）マウス、Ｓ１００Ａ８／Ａ９−／−マウス、およびヒト上皮特異的Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９のノックインによってレスキューしたＳ１００Ａ８／Ａ９−／−マウスに感染させる。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのマウスにおけるＳ１００Ａ８／Ａ９のヌル突然変異は、トランスポゾン組み込みが可能な多重遺伝子ベクター(Moriarity et al., 2013, Nucleic Acids Res 41:e92)を用いて複数の遺伝子をマウスに導入する系を用いてレスキューする。この系を用いれば、ＲＯＳＡ２６遺伝子座(Soriano, P.. 1999, Nature Genetics 21:70-71)を、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９のコード領域を含有する多重遺伝子ベクターでターゲッティングし、Ｋ１４プロモーターをノックインすることができる。ゆえに、このノックインは、上皮細胞でのみ発現される。ヒトＳ１００Ａ９の発現は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９−／−マウスにおけるマウスＳ１００Ａ８の翻訳を可能とするが、これはマウスＳ１００Ａ８がヒトＳ１００Ａ９と複合体を形成してハイブリッドヘテロ二量体を形成することがないためである(Propper et al., 1999, J Biol Chem 274:183-188)。

３系統のマウスを、病原体としてのＰ．ジンジバリスと共生、非病原性対照としてのＬ．ムリヌスを用いて、上記のように歯周炎の発現に関して比較する。歯周炎は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６（ネズミＳ１００Ａ８／Ａ９＋／＋）系統とヒト上皮特異的ノックイン（Ｓ１００Ａ８／Ａ９−／−バックグラウンド）系統に同等に発現される。Ｓ１００Ａ８／Ａ９−／−マウスは、より多量の歯槽骨欠損を示す。

この試験は、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９のコード領域が歯周炎耐性における自然免疫因子であることを示す。歯周炎が確立される前と確立された後のこれら３系統の軟組織の組織病理を比較すると、歯肉上皮におけるヒトおよびネズミＳ１００Ａ８／Ａ９の局在およびＳ１００Ａ８／Ａ９−／−マウスにおける感染後の上皮の健全性の喪失が確認される。

ヒト上皮特異的Ｓ１００Ａ８／Ａ９のノックイン
上皮特異的Ｓ１００Ａ８／Ａ９を、ＲＯＳＡ２６遺伝子座を標的とする組み込み可能な多重遺伝子ベクター(Moriarity et al., 2013, Nucleic Acids Res 41:e92)を用いてＳ１００Ａ８／Ａ９−／−ＥＳ細胞にノックインする。ｌｏｘ−ｓｔｏｐ−ｌｏｘカセットがＫ１４プロモーターとヒトＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９コード領域を含有する多重遺伝子ベクターの間に置かれる（ヒトＳ１００Ａ８／Ａ９は上皮細胞内で自発的に複合体として形成(Champaiboon et al., 2009, J Biol Chem 284:7078-7090)）。ケラチン１４−ＣＲＥおよび多重遺伝子（Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９）^ｃｒｅコンディショナルアレルに関して同型接合のマウスを交配させて試験マウスを作出する。交配に成功したマウスは上皮組織でＳ１００Ａ８／Ａ９を発現する。本明細書にＳ１００Ａ８／Ａ９−／−として記載されるマウスは、実際には、Ｓ１００Ａ９−／−であり、Ｓ１００Ａ８ ｍＲＮＡを発現するがＳ１００Ａ８タンパク質は発現しない(Hobbs et al., 2003, Mol Cell Biol 23:2564-2576; Manitz et al., 2003, Mol Cell Biol 23:1034-1043)。ネズミＳ１００Ａ８／Ａ９は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９過剰発現がｆｌｏｘｅｄ型のヒトタンパク質だけに由来するのでなお健全である。

歯周炎の評価
上記の方法およびアプローチを用い、炎症を評価し、Ｐ．ジンジバリス感染した、野生型、Ｓ１００Ａ８／Ａ９−／−およびヒトＳ１００Ａ８／Ａ９ノックイン（Ｓ１００Ａ８／Ａ９−／−バックグラウンド）における上皮のＰ．ジンジバリス感染および歯槽骨レベルを、試験の開始時と最初の接種後５０日目に測定する。データを各バックグラウンドのＬ．ムリヌス感染（対照）マウスと比較し、Ｐ．ジンジバリス感染に対する耐性におけるＳ１００Ａ８／Ａ９の役割を決定する。

分析
骨面積測定値の平均を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、Ｓ１００Ａ８／Ａ９−／−マウス、およびＳ１００Ａ８／Ａ９−／−バックグラウンドのヒトＳ１００Ａ８／Ａ９レスキューマウスの、６つの独立した群（Ｐ．ジンジバリス感染、Ｌ．ムリヌス感染対照）における分散分析の従属変数として使用する。本測定方法の感度では、検出率９０％で歯槽頂骨レベルの１０％の変化の検出が可能である。同様に、一般に上皮での細菌、具体的には、Ｐ．ジンジバリスおよび対照Ｌ．ムリヌスの、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の存在下および不在下での増殖を比較する。

炎症は、半定量的に評価する。

歯肉にＳ１００Ａ８／Ａ９ ｍＲＮＡを局所適用した、およびしないＣ５７ＢＬ／６ Ｓ１００Ａ８／Ａ９−／−マウスにおける歯周炎に対する感受性を評価するために、Ｐ．ジンジバリスまたは対照Ｌ．ジンジバリスを用いて、野生型（ネズミＳ１００Ａ８／Ａ９＋／＋）マウス、Ｓ１００Ａ８／Ａ９−／−マウス、およびパッケージされたヒトＳ１００Ａ８／Ａ９ ｍＲＮＡの局所適用によりレスキューしたＳ１００Ａ８／Ａ９−／−マウスに感染させる。上皮細胞をＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９に特異的なｍＲＮＡでトランスフェクトし、両タンパク質を発現させ、抗菌Ｓ１００Ａ８／Ａ９複合体を形成するようにすることができる(Zou et al., 2013, Infect Immun 81:3975-3983)。トランスフェクション系は本質的に局所的である。パッケージされたｍＲＮＡを上皮表面に直接加えると、ｍＲＮＡは上皮細胞に取り込まれ、新たなＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９タンパク質が同細胞で共発現され、侵入細菌病原体に対する耐性が増す。

イン・ビボ試験では、マウス口腔上皮から唾液を洗い流し、パッケージされたｍＲＮＡの取り込みに対する唾液の障壁を取り除く。上皮を風乾した後、本質的に肺における使用に関して記載されているように(Kormann et al., 2011, Nature Biotechnology 29:154-157; Mays et al., 2013, J Clin Invest 123:1216-1228)、ハイインテンシティーアトマイザーを用いて、パッケージされたｍＲＮＡを歯と歯肉の界面に直接適用する。このアトマイザーは、ＲＮＡを意図した界面に指向することを可能とするように細孔ニードルが取り付けられている。

Ｓ１００Ａ８／Ａ９ ｍＲＮＡは、どのプロトコールを用いる場合でも干渉を最小とするためにＰ．ジンジバリスの各適用１日前に歯肉に適用する。３つの条件のマウスを、病原体としてのＰ．ジンジバリスおよび共生非病原性対照としてのＬ．ムリヌスを用いて上記のように、歯周炎の発現に関して比較する。歯周炎は、野生型（ネズミＳ１００Ａ８／Ａ９＋／＋）およびパッケージされたヒトＳ１００Ａ８／Ａ９ ｍＲＮＡの局所適用によりレスキューしたＳ１００Ａ８／Ａ９−／−マウスにおいて同様に明白である。Ｓ１００Ａ８／Ａ９−／−マウスは、より多量の歯槽骨欠損を示す。

本試験により、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９が歯周炎に対する歯肉上皮耐性における自然免疫因子であることが確認される。歯周炎が確立される前と確立された後のこれら３条件のマウスの軟組織の組織病理を比較すると、歯肉上皮におけるヒトおよびネズミＳ１００Ａ８／Ａ９の局在およびＳ１００Ａ８／Ａ９−／−マウスにおける感染後の上皮の健全性の喪失が確認される。

分析
骨面積測定値の平均を、野生型（ネズミＳ１００Ａ８／Ａ９＋／＋）マウス、Ｓ１００Ａ８／Ａ９−／−マウス、およびパッケージされたヒトＳ１００Ａ８／Ａ９ ｍＲＮＡの局所適用によりレスキューしたＳ１００Ａ８／Ａ９−／−マウスの、６つの独立した群（Ｐ．ジンジバリス感染、Ｌ．ムリヌス感染対照）における分散分析の従属変数として使用する。分析は上記の通りである。

例示的実施形態
実施形態１ 上皮細胞に細胞増殖の抑制に関与するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを導入することと、
前記細胞に、前記細胞が足場非依存性環境で増殖する可能性を小さくするのに有効な量で前記ポリペプチドを発現させること
を含んでなる方法。

実施形態２ 前記ポリペプチドがカルプロテクチン、Ｓ１００Ａ８、またはＳ１００Ａ９を含んでなる、実施形態１に記載の方法。

実施形態３ 細胞に自然免疫に関与するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを導入することと、
細胞に、前記細胞が病原体により感染を受ける可能性を小さくするのに有効な量で前記ポリペプチドを発現させること
を含んでなる方法。

実施形態４ 前記ポリペプチドがカテリシジン抗菌タンパク質（ＣＡＭＰ）、カルプロテクチン、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、β−デフェンシン、Ｓ１００Ａ７、分泌型白血球阻害剤、リポカリン２、またはリゾチームを含んでなる、実施形態３に記載の方法。

実施形態５ 前記ｍＲＮＡが安定化部分を含んでなる、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の方法。

実施形態６ 前記安定化部分が５’キャップを含んでなる、実施形態５に記載の方法。

実施形態７ 前記安定化部分が３’伸長部を含んでなる、実施形態５に記載の方法。

実施形態８ 前記細胞が粘膜上皮細胞である、実施形態１〜７のいずれか一項に記載の方法。

実施形態９ 前記細胞を病原体に暴露させることをさらに含んでなる、実施形態３〜８のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１０ 前記病原体が細菌を含んでなる、実施形態３〜９のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１１ 前記細菌がカプノシトファガ・スプティゲナ、大腸菌、ブドウ状球菌種、連鎖球菌種、リステリア菌、ネズミチフス菌、ボレリア・ブルグドルフェリ、ポルフィロモナス・ジンジバリス、タンネレラ・フォーサイシア、トレポネーマ・デンティコラ、緑膿菌、クラミジア種、ナイセリア種、ガードネレラ種、またはトリコモナス種を含んでなる、実施形態１０に記載の方法。

実施形態１２ 前記病原体が真菌を含んでなる、実施形態３〜９のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１３ 前記真菌がカンジダ・アルビカンス、アシネトバクター・バウマニー、またはアスペルギルス種の真菌を含んでなる、実施形態１２に記載の方法。

実施形態１４ 前記細胞が、前記病原体による感染により引き起こされる病態を有する、または有するリスクのある対象の細胞である、実施形態３〜１３のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１５ 前記病態が癌腫を含んでなる、実施形態１４に記載の方法。

実施形態１６ 前記細胞にｍＲＮＡを導入する前に、前記細胞を洗浄して細胞から粘液を除去することをさらに含んでなる、実施形態１〜１５のいずれか一項に記載の方法。

実施形態１７ 前記粘液が唾液を含んでなる、実施形態１６に記載の方法。

実施形態１８ 上皮細胞の細胞増殖を抑制するポリペプチドをコードするｍＲＮＡと、
イン・ビボ送達ビヒクルと
を含んでなる、組成物。

実施形態１９ 前記ポリペプチドがカルプロテクチン、Ｓ１００Ａ８、またはＳ１００Ａ９を含んでなる、実施形態１８に記載の組成物。

実施形態２０ 前記上皮細胞を足場非依存性環境で増殖させる場合に、前記ポリペプチドが前記上皮細胞の細胞増殖を抑制する、実施形態１８または実施形態１９に記載の組成物。

実施形態２１ 自然免疫に関与するポリペプチドをコードするｍＲＮＡと、
イン・ビボ送達ビヒクルと
を含んでなる、組成物。

実施形態２２ 前記ポリペプチドがカテリシジン抗菌タンパク質（ＣＡＭＰ）、カルプロテクチン、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、β−デフェンシン、Ｓ１００Ａ７、分泌型白血球阻害剤、リポカリン２、またはリゾチームを含んでなる、実施形態２１に記載の組成物。

実施形態２３ 前記ｍＲＮＡが安定化部分を含んでなる、実施形態１８〜２２のいずれか一項に記載の組成物。

実施形態２４ 前記安定化部分が５’キャップを含んでなる、実施形態２３に記載の組成物。

実施形態２５ 前記安定化部分が３’伸長部を含んでなる、実施形態２３に記載の組成物。

本明細書に引用されている総ての特許、特許出願、および刊行物の全開示、ならびに電子的に利用可能な素材（例えば、例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列提出物、および例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢにおけるアミノ酸配列提出物、およびＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおける注釈コード領域からの翻訳を含む）は、それらの総てが引用することにより本明細書の一部とされる。本出願の開示と引用することにより本明細書の一部とされるいずれかの文献の開示の間に何らかの不一致が存在する場合、本出願の開示が基準となるものとする。以上の詳細な説明および例は単に明瞭な理解のために示したものである。そこから不必要な制限がなされるべきではない。本発明は示され、記載されている厳密な詳細に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって定義される本発明内には当業者に自明な変形形態が含まれる。

特に断りのない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される成分の量、分子量などを顕す数値は総て、総ての場合において、「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。よって、そうではないことが示されない限り、本明細書および特許請求の範囲において示される数値パラメーターは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて異なり得る近似値である。少なくとも、特許請求の範囲に対する均等論を限定しようとするものではないが、各数値パラメーターは少なくとも報告されている有効桁数に照らして、また、通常の丸め技法を適用することによって解釈されるべきである。

本発明の広い範囲を示す数値範囲およびパラメーターは近似値ではあるが、具体例に示される数値はできる限り厳密に報告されている。しかしながら、総ての数値はそれらの個々の試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じるある範囲を内包する。

総ての見出しは読者の便宜のためであり、特に断りのない限り、見出しに続くテキストの意味を限定するために使用されるべきではない。

Claims (25)

1. 上皮細胞に細胞増殖の抑制に関与するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを導入することと、
   前記細胞に、前記細胞が足場非依存性環境で増殖する可能性を小さくするのに有効な量で前記ポリペプチドを発現させること
   を含んでなる方法。
2. 前記ポリペプチドがカルプロテクチン、Ｓ１００Ａ８、またはＳ１００Ａ９を含んでなる、請求項１に記載の方法。
3. 細胞に自然免疫に関与するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを導入することと、
   細胞に、前記細胞が病原体により感染を受ける可能性を小さくするのに有効な量で前記ポリペプチドを発現させること
   を含んでなる方法。
4. 前記ポリペプチドがカテリシジン抗菌タンパク質（ＣＡＭＰ）、カルプロテクチン、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、β−デフェンシン、Ｓ１００Ａ７、分泌型白血球阻害剤、リポカリン２、またはリゾチームを含んでなる、請求項３に記載の方法。
5. 前記ｍＲＮＡが安定化部分を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記安定化部分が５’キャップを含んでなる、請求項５に記載の方法。
7. 前記安定化部分が３’伸長部を含んでなる、請求項５に記載の方法。
8. 前記細胞が粘膜上皮細胞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記細胞を病原体に暴露させることをさらに含んでなる、請求項３〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記病原体が細菌を含んでなる、請求項３〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記細菌がカプノシトファガ・スプティゲナ、大腸菌、ブドウ状球菌種、連鎖球菌種、リステリア菌、ネズミチフス菌、ボレリア・ブルグドルフェリ、ポルフィロモナス・ジンジバリス、タンネレラ・フォーサイシア、トレポネーマ・デンティコラ、緑膿菌、クラミジア種、ナイセリア種、ガードネレラ種、またはトリコモナス種を含んでなる、請求項１０に記載の方法。
12. 前記病原体が真菌を含んでなる、請求項３〜９のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記真菌がカンジダ・アルビカンス、アシネトバクター・バウマニー、またはアスペルギルス種の真菌を含んでなる、請求項１２に記載の方法。
14. 前記細胞が、前記病原体による感染により引き起こされる病態を有する、または有するリスクのある対象の細胞である、請求項３〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記病態が癌腫を含んでなる、請求項１４に記載の方法。
16. 前記細胞にｍＲＮＡを導入する前に、前記細胞を洗浄して細胞から粘液を除去することをさらに含んでなる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記粘液が唾液を含んでなる、請求項１６に記載の方法。
18. 上皮細胞の細胞増殖を抑制するポリペプチドをコードするｍＲＮＡと、
    イン・ビボ送達ビヒクルと
    を含んでなる、組成物。
19. 前記ポリペプチドがカルプロテクチン、Ｓ１００Ａ８、またはＳ１００Ａ９を含んでなる、請求項１８に記載の組成物。
20. 前記上皮細胞を足場非依存性環境で増殖させる場合に、前記ポリペプチドが前記上皮細胞の細胞増殖を抑制する、請求項１８または請求項１９に記載の組成物。
21. 自然免疫に関与するポリペプチドをコードするｍＲＮＡと、
    イン・ビボ送達ビヒクルと
    を含んでなる、組成物。
22. 前記ポリペプチドがカテリシジン抗菌タンパク質（ＣＡＭＰ）、カルプロテクチン、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、β−デフェンシン、Ｓ１００Ａ７、分泌型白血球阻害剤、リポカリン２、またはリゾチームを含んでなる、請求項２１に記載の組成物。
23. 前記ｍＲＮＡが安定化部分を含んでなる、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
24. 前記安定化部分が５’キャップを含んでなる、請求項２３に記載の組成物。
25. 前記安定化部分が３’伸長部を含んでなる、請求項２３に記載の組成物。

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