CN105473163A - 涉及mRNA转染的治疗组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本公开内容描述涉及肿瘤抑制和抑制细胞被病原体感染的组合物和方法。一般而言,所述组合物包含在被引入上皮细胞之后能提供治疗性益处的mRNA货物。在一些情况中,所述mRNA可编码多肽。在一些情况中,所述多肽可抑制上皮细胞增殖。在其它实施方式中,所述多肽可能参与先天免疫。在不同的实施方式中,所述多肽可包括普抑素抗微生物蛋白(CAMP)、钙卫蛋白、S100A8、S100A9、β-防御素、S100A7、分泌性白细胞抑制剂、脂质运载蛋白2或溶菌酶。在一些实施方式中,所述mRNA可包括稳定化部分,例如,5ˊ帽或3ˊ延伸。
Description
政府基金
本发明在NIH/NIDCR资助的基金号1R01DE021206的政府支持下完成。政府享有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年1月11日提交的美国临时专利申请系列号61/751,504的优先权,其通过引用纳入本文。
发明内容
在一个方面,本公开内容描述一种抑制细胞增殖的方法。一般而言,所述方法包括:将参与抑制细胞增殖的多肽的编码mRNA引入上皮细胞,并允许所述细胞足量表达所述多肽到能有效降低所述细胞在锚着非依赖性环境中增殖的可能性。在一些实施方式中,所述多肽可包括:钙卫蛋白(与S100A9复合的S100A8;S100A8/A9)、S100A8或S100A9。
在另一个方面,本公开文本描述一种抑制细胞感染的方法。一般而言,所述方法包括将参与先天免疫中的多肽的编码mRNA引入细胞,并允许所述细胞足量表达所述多肽到能有效降低所述细胞被病原体感染的可能性。在一些实施方式中,所述多肽可包括普抑素(cathelicin)抗微生物蛋白(CAMP)、钙卫蛋白、S100A8、S100A9、β-防御素、S100A7、分泌性白细胞抑制剂、脂质运载蛋白2或溶菌酶。
在上文概述的某一方面的一些实施方式中,所述mRNA可包括稳定化部分,例如,5'帽或3'延伸。在一些实施方式中,所述细胞可以是粘膜上皮细胞。
在另一个方面,本公开内容描述一种组合物,所述组合物一般包含编码多肽的mRNA和体内递送载剂。
在一些实施方式中,所述多肽可抑制上皮细胞增殖。在这些实施方式的一些中,所述多肽可包括钙卫蛋白、S100A8或S100A9。
在其它实施方式中,所述多肽可参与先天免疫。在这些实施方式的一些中,所述多肽可包括普抑素抗微生物蛋白(CAMP)、钙卫蛋白、S100A8、S100A9、β-防御素、S100A7、分泌性白细胞抑制剂、脂质运载蛋白2或溶菌酶。在一些实施方式中,所述mRNA可包括稳定化部分,例如,5'帽或3'延伸。
上述归纳并不意在描述本发明的各个公开的实施方式或各个实现方式。下文的说明内容更具体地例举说明性实施方式。在贯穿本申请的一些内容处,通过一系列示例来提供指导,这些示例可以不同组合应用。在每种情况中,所述的列表仅表示代表性的组,并不应被解释为穷举列表。
附图简要说明
图1.用ARCA-加帽的CAMPmRNA或CE加帽的CAMPmRNA转染后的KB细胞的CAMP蛋白表达。(A)KB细胞用ARCA、CE帽0或帽1-加帽的CAMPmRNA转染后的CAMP蛋白表达。上图,代表性的Western印迹。下图,定量说明,其中,八小时的ARCA帽表达设置为100。采用材料和方法中描述的QuantityOne分析法进行分析之后,采用若干加帽法转染后的蛋白质表达以相对于100的方式表示。(B)在用ARCA-加帽的CAMP转染后,随时间变化的CAMP蛋白表达。如图(A)中所示,ARCA-加帽的CAMPmRNA转染之后的CAMP蛋白表达采用Western印迹(上图)检测,并在下图中以相对于八小时的水平(设为100)的方式表示。图(A)和(B)中,误差线显示3~6个独立实验的平均值±SD。
图2.KB细胞用ARCA-加帽的S100A8、S100A9、A8-IRES-A9和A8-nIRES-A9mRNA转染后的S100A8和S100A9蛋白质表达。(A)用S100A8mRNA转染后的KB细胞S100A8蛋白质表达,采用Western印迹检测(显示代表性图像)并如图1中那样定量。进行相同的实验以确定:用S100A8/S100A9mRNA共转染后的KB细胞的(B)S100A9蛋白;(C)S100A8和S100A9蛋白的表达时程;用A8-IRES-A9mRNA转染后的KB细胞的(D)S100A8和S100A9蛋白质的表达时程;和用A8-nIRES-A9mRNA转染后的(E)S100A8和S100A9蛋白的表达时程。将mRNA转染后8小时的蛋白质表达设置为100。误差线显示3~6个独立实验的平均值±SD。
图3.CAMP和钙卫蛋白mRNA增加对李斯特菌(Listeria)和沙门氏菌(Salmonella)侵入的抗性。单层细胞用mRNA转染(A)8小时、(B)24小时,(C)48小时,然后用单核细胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)ATCC10403S以MOI100:1或鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)ATCC14028以MOI1:1孵育两小时。在24-小时或48-小时转染之后,在八小时分传细胞,并在32小时之后再次分传细胞,然后再孵育16小时。活的胞内细菌的报告表示为相对用载剂(PBS)拟转染的KB细胞中的CFU(设为100%)的百分数平均值±SD。误差线表明3~6个独立实验相对于八小时载剂对照的平均值±SD。*p<0.05。
图4.mRNA递送降低细胞活力,但不触发凋亡。(A)将mRNA构建体mRNA递送至KB细胞之后的三天里,在指示时刻采用MTT试验测定细胞活力。采用PBS拟转染的细胞作为对照,其活力设为1。各实验一式三份进行,重复至少两次。(B)在mRNA递送mRNA构建体之后采用Western印迹分析凋亡细胞。通过流式细胞术显示膜联蛋白-V-FITC染色呈阳性的细胞被视为凋亡的。在组A和B中,误差线显示3~6个独立实验的平均值±SD。*p<0.05。C.在递送mRNA构建体之后对PARP切割的Western印迹分析。采用PBS拟转染的(载剂)细胞和未转染的细胞作为对照。
图5.KB细胞中的抗微生物mRNA持续最长达32小时。RNA采用Trizol试剂(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(LifeTechnologiesCorp.))和RNeasyplus小试剂盒(加利福尼亚州瓦伦西亚的凯杰公司(Qiagen))分离。总RNA用SuperscriptIII(加利福尼亚卡尔斯巴德的生命技术公司)逆转录。采用PrimeTime预设计的qRT-PCR试验进行定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)(Hs.PT.42.1073747用于人CAMP,Hs.PT.42.3682141用于人S100A8,Hs.PT.42.3080635用于人S100A9,Hs.PT.45.227970.g用于人ACTB;爱荷华州科拉尔维尔的综合DNA技术公司(IntegratedDNATechnologies))。CAMP、S100A8、S100A9A8-IRES-A9和A8-nIRES-A9mRNA的表达水平对ACTB(β-肌动蛋白)mRNA进行标准化。(A)CAMPmRNA转染。(B)S100A8/S100A9mRNA(mol/mol=1:1)共转染。(C)A8-IRES-A9mRNA转染。(D)A8-nIRES-A9mRNA转染。A8-IRES-A9和A8-nIRES-A9mRNA用S100A9引物检测。mRNA转染之后4小时的mRNA丰度被指为选定值100%。短线显示3~6个独立实验的平均值±SD。
图6.mRNA转染之后的蛋白质表达。(A)EGFPmRNA转染16小时的免疫荧光显微镜图像。(B)CAMPmRNA转染16小时的免疫荧光显微镜图像。(C)S100A8/S100A9mRNA(mol/mol=1:1)共转染16小时,(D)A8-IRES-A9和A8-nIRES-A9mRNA转染40小时的免疫荧光显微镜图像。载剂,PBS。标尺=10μM。实验进行三次,显示代表性图像。
图7.人头颈组织和癌细胞系中的S100A8和S100A9的表达。(A)正常癌旁组织(NAT)和HNSCC组织,和(B)TR146HNSCC和KB细胞中的S100A8和S100A9的mRNA表达水平由qRT-PCR检测,并对GAPDH进行标准化;点线显示检测阈值。分别汇集自三位患者中每一位的匹配NAT和HNSCC组织提取的总RNA,用于基因表达分析。在约70%融合度时收获并分析标准条件下培养的细胞系。数据以平均值±SD表示(n=2)。与野生型和阴性转染对照做比较的(C)KB-S100A8/A9转染细胞中的S100A8和S100A9的代表性免疫印迹,和(D)TR146-shRNA-S100A8/A9敲减细胞中的S100A8和S100A9的代表性免疫印迹。采用β-肌动蛋白作为上样对照,用于在10%SDS-PAGE凝胶中分离的免疫印迹分析。
图8.S100A8/A9抑制KB细胞的锚着依赖性生长和锚着非依赖性生长。(A)与KB-EGFP和KB野生型对照细胞相比较的KB-S100A8/A9细胞的生长曲线。每三天使细胞在无热原聚苯乙烯组织培养瓶上于补充有10%FBS的新鲜MEM中生长。(B)KB、KB-EGFP和KB-S100A8/A9细胞在软琼脂中的锚着非依赖性生长(平均值±SEM,*p<0.03,n=4)。TR146-shRNAS100A8/A9KD细胞相比TR146WT和TR146-shRNA-对照细胞的(C)组织培养瓶的完全培养基中的锚着依赖性生长(平均值±SD,*p<0.02,n=3)和(D)软琼脂上的集落形成(平均值±SEM,***p<0.0005,n=2)。
图9.S100A8/A9表达诱导的细胞周期和G2/M期的有丝分裂阻滞。(A)同步后的KB、KB-EGFP和KB-S100A8/A9细胞的细胞周期分析。使标准条件下培养的细胞经历血清饥饿过夜,通过阿非迪霉素处理同步在G1/S,并刺激以重新进入细胞周期。同步的细胞用碘化丙啶DNA染色溶液染色,并通过流式细胞术分析G1/S阻滞释放后的DNA含量的变化。(B)同步的细胞用磷酸化组蛋白H3(Ser10)染色并通过流式细胞术分析来进行有丝分裂分析。(C)处于G2/M期细胞的百分比。分析KB、KB-EGFP和KB-S100A8/A9细胞同步后随时间的变化,并以平均值±SEM报告;n=2个独立实验(各分析一式两份进行);*p<0.05。(D)同步后的有丝分裂细胞百分比,以两个独立重复实验的平均值显示。KB-S100A8/A9细胞显示较少的有丝分裂细胞,因为其显示较低的磷酸化组蛋白H3(Ser10)染色。
图10.S100A8/A9在SCC中调节G2/M细胞周期检验点的调控分子。通过免疫印迹分析显示细胞周期调控子的表达和磷酸化(活化/失活)状态。显示的数据代表多个独立重复实验。山羊抗β-肌动蛋白多克隆IgG用来检测β-肌动蛋白作为蛋白质上样对照。(A)KB、KB-EGFP和KB-S100A8/A9中G1/S调控蛋白、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白E、p21和Rb、Chk2和Cdc25B的表达。在有或没有S100A8/A9表达的任何细胞中均未检测到p-Chk2的磷酸化(Thr68)(未显示)。(B)G2/M调控子、Chk1/p-Chk1(Ser345)、有丝分裂活性p-Cdc25C(Thr48)、Cdc25C/p-Cdc25C(Ser216)、Cdc2/p-Cdc2(Thr14/Tyr15)和细胞周期蛋白B1的表达和磷酸化状态。(C)用兔抗14-3-3β多克隆IgG捕获的与14-3-3β免疫共沉淀(IP)的Cdc25C蛋白的免疫印迹(IB)。还显示总14-3-3β蛋白的免疫印迹。(D)野生型TR146(TR146WT)、对照shRNA转染子(TR146-shRNA-对照)和shRNA-诱导的S100A8/A9敲减(TR146-shRNA-S100A8/A9KD)细胞中的S100A8、S100A9、Cdc2和Cdc2-(Thr14/Tyr15)的蛋白质水平。
图11.S100A8/A9与PP2A磷酸酶的相互作用增加活性。(A)通过免疫印迹(IB)检测,PP2AAα/β与S100A8/A9复合物免疫共沉淀(IP)(与27E10抗体IP)或与S100A9亚基免疫共沉淀(IP)(左图),和S100A9(用作S100A8/A9复合物标志物蛋白)与PP2A-Aα/β亚基免疫共沉淀。(B)采用IB检测的,KB、KB-EGFP和KB-S100A8/A9细胞中的PP2A亚基蛋白质表达、磷酸化和甲基化的比较。显示的印迹是10%SDS-PAGE凝胶中分离总蛋白裂解物的多个重复(n≥3)的代表。采用β-肌动蛋白作为蛋白质上样对照。
(C)KB-EGFP和KB-S100A8/A9细胞中的PP2A-C磷酸酶活性对A中所示与S100A8/A9(27E10抗体)免疫共沉淀的可检测PP2A-Aα/β进行标准化,然后进一步对KB-EGFP水平进行标准化。数据显示为平均值±SE(n=2)。
#表示误差线不可见。(D)用10nM冈田酸(OA)抑制S100A8/A9-依赖性的p-Cdc25C磷酸化(Ser216)。由IB检测的无OA(左图)和有OA(右图)存在下的p-Cdc25C表达。
图12.如本报告中归纳提出的S100A8/A9(钙卫蛋白)-介导的G2/M细胞周期检验点信号转导通路的调控。实线表示直接调控;虚线表示未知机制。
图13.S100A8/A9的稳定表达能减少口底肿瘤的生长。如实施例3中所述,将表达S100A8/A9的KB癌细胞和仅表达EGFP的伪转染的KB-细胞注入不同组的健康小鼠的口底。(A)截至第17天,由KB-S100A8/A9细胞在口底上形成的原位肿瘤比表达EGFP的KB细胞小65%(p<0.03)。(B)相较于KB-EGFP细胞肿瘤,由KB-S100A8/A9细胞在口底上形成的肿瘤显著较小,并且对周围组织的侵入性较低。(C)相较于类似尺寸的KB-S100A8/A9细胞肿瘤,KB-EGFP细胞肿瘤在组织学上(用苏木精和曙红染色)去分化程度更高,并且具有较大面积的坏死。显示的数据来自三个单独实验,其中每组三只小鼠。
图14.S100A8/A9的稳定shRNA敲减与较大口底肿瘤生长相关联。TR146口腔癌细胞用shRNA转染以稳定敲减内源性S100A8和S100A9的表达。相较于伪转染的细胞(Neg3),敲减导致S100A8/A9蛋白表达减少约70%(A8A8c10细胞)(数据未显示)。截至第17天,用shRNA敲减S100A8/A9的TR146细胞(A8A8c10细胞)形成的常位肿瘤比伪转染的(Neg3)细胞大20%(p<0.2)。显示的数据来自两个单独实验,其中每组三只小鼠。
图15.唾液浓度和处理时间对EGFPmRNA递送进入KB细胞的作用。细胞在37℃用10%、50%或90%唾液孵育(A)1分钟,(B)3分钟,或(C)5分钟,用新鲜培养基清洗三次,然后与包装的、修饰的编码EGFP的mRNA孵育。用50%唾液处理但未递送mRNA的细胞用作对照。
图16.EGFPmRNA递送进入KB细胞:清洗频率对唾液处理的反作用的影响。细胞用90%唾液处理3分钟,以指示频率用新鲜培养基清洗,然后进行mRNA转染。
说明性实施方式的详述
本公开内容涉及的组合物和方法参与将mRNA引入细胞使得所述细胞表达一种或多种多肽,所述一种或多种多肽能降低该细胞功能异常和/或易于受病原体感染的可能性和/或程度。因此,所述方法和组合物能够提供针对因感染所致的病症(包括,例如,感染性疾病和某些肿瘤)的治疗。一旦被引入细胞,只有所述mRNA能在目标细胞中被翻译时所述多肽才得以表达——即,表达是瞬时的,不是永久的。如果所述细胞形成可被接触的目标组织,则可重复地重新引入所述mRNA,以实现持续的治疗益处。
粘膜上皮细胞提供抵御微生物侵入的第一道防线。口腔和其它粘膜上皮细胞通过细胞自发机制来提供抵抗侵入性细菌的保护,所述细胞自发机制利用两种效应子抗微生物肽(AMP):胞浆中的钙卫蛋白(S100A8/S100A9杂二聚体)和内含体中的普抑素抗微生物蛋白(CAMP)。为了研究先天免疫是否有可能被良性增强,我们用优化的mRNA构建体瞬时转染上皮细胞,所述mRNA构建体包含CAMP、S100A8和S100A9开放阅读框,A8-IRES-A9(融合),或A8-nIRES-A9(融合,天然IRES)。为了维持mRNA的稳定性,用抗反向帽类似物(ARCA)加帽的CAMPmRNA比加帽酶(CE)帽0或CE1更加有效。CAMP、S100A8和S100A9蛋白质水平一般在mRNA转染后16小时成峰。相比地,用S100A8/S100A9共转染导致的最大蛋白质表达在24小时。在用串联mRNA(A8-IRES-A9和A8-nIRES-A9)转染之后,S100A8蛋白质水平在16小时最大,而S100A9在32小时~40小时成峰。用相应的mRNA转染之后,CAMP和钙卫蛋白各自显著增加上皮细胞抵御李斯特菌和沙门氏菌侵入的抗性长达48小时;S100A8/S100A9的共转染比串联构建体更为有效。所述转染使细胞活力在48小时之后降低20%,其中仅有2%归因于凋亡。总体来看,这些结果表明,上皮细胞对于侵入性病原体的抵抗可通过瞬时转染抗微生物mRNA进入上皮细胞来增强。
人CAMP是表达于多个物种中的阳离子抗微生物肽的大家族中的成员,其针对细菌、真菌和包膜病毒具有广谱活性,并且还显示免疫调节作用(Zanetti,2004.J.Leukoc.Biol.75:39-48;Bucki等,2010.Arch.Immunol.Ther.Exp.(Warsz).15-25;Strandberg等,2012.Infect.Immun.80:3930-3938;Burton等,2009.Nat.Prod.Rep.26:1572-1584)。在截除信号肽之后,由CAMP编码的人CAP-18前体被储存在嗜中性颗粒和上皮细胞中,直到通过蛋白酶3(丝氨酸蛋白酶)切割而被激活(等,2001.Blood2001,97:3951-3959)。该37个残基的活性肽(LL-37)介导多种生物反应,例如,微生物的直接杀伤、趋化现象和趋化因子诱导、炎性反应的调节,以及佐剂、血管生成和创伤愈合作用(Nijnik等,2009.Curr.Opin.Hematol.16:41-47)。LL-37在嗜中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬溶酶体中,和急性炎症位点处,看来具有直接抗微生物作用(Nijnik等,2009.Curr.Opin.Hematol.16:41-47),显示具有针对以下微生物的广谱抗微生物活性:单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)(Turner等,1998.Antimicrob.AgentsChemother.42:2206-2214)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)(Larrick等,1995.Immunotechnology1:65-72),和A、B和C组链球菌(Streptococcus)(Dorschner等,2001.J.Invest.Dermatol.117:91-97)。CAMP表达可由如下因素诱导:1,25-二羟基维生素D3(Wang等,2004.J.Immunol.173:2909-2912)、病原体(Midorikawa等,2003.Infect.Immun.71:3730-3739;Nijnik等,2009.Curr.Opin.Hematol.16:41-47),或脂多糖(LPS)(Nell等,2004.FEMSImmunol.Med.Microbiol.42:225-231)。CAMP/LL-37生成的减少伴以疾病中上皮细胞中病原体的侵入和定殖增加,所述疾病例如,疾病性科氏和帕-勒氏综合征(Carlsson等,2006.J.Periodontol.77:744-751;deHaar等,2006.Infect.Immun.74:5284-5291)、克罗恩氏病(Schauber等,2006.Mol.Nutr.FoodRes.50:1006-1012)和特应性皮炎(Ong等,2002.N.Engl.J.Med.347:1151-1160)。
钙卫蛋白是钙结合蛋白S100A8(MRP8或钙粒蛋白A,10.8kDa)和S100A9(MRP14或钙粒蛋白B,13.2kDa)的异质二聚体复合物(Champaiboon等,2009.J.Biol.Chem.284:7078-90)。S100A8和S100A9是蛋白质S100家族的成员。家族成员包含两个EF-手型钙结合基序,并且所述蛋白质参与细胞生长、细胞分化、细胞周期进程、细胞存活、蛋白质磷酸化、转录、癌症发展和炎性疾病(Donato,2001.Int.J.Biochem.CellBiol.33:637-668;Santamaria-Kisiel等,2006.Biochem.J.396:201-14;Khammanivong等,2013.PLoSOne8:e69395)。所述钙结合基序看来参与上皮细胞对细菌侵入的抵抗(Champaiboon等,2009.J.Biol.Chem.284:7078-90)。钙卫蛋白显示针对粘膜和表皮的白色念珠菌(Candidaalbicans)和细菌的广谱抗微生物活性,所述细菌包括:生痰二氧化碳噬纤维菌(Capnocytophagasputigena)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermis)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)和牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)(Champaiboon等,2009.J.Biol.Chem.284:7078-90;Miyasaki等,1993.J.Dent.Res.72:517-523;Sohnle等,1991.J.Infect.Dis.163:187-192;Steinbakk等,1990.Lancet336:763-765;Nisapakultorn等,2001.Infect.Immun.69:4242-4247)。为了促进成功侵入之后在上皮内的存活,李斯特菌调动钙卫蛋白至与胞质微管共定位(co-localize),这看来扰乱了抗李斯特菌活性和自发细胞免疫(Zaia等,2009.MucosalImmunol.2:43-53)。
因此,粘膜上皮细胞主要利用两个抗微生物效应子系统来保护抵抗和抑制侵入性病原体:主要位于内含体中的CAMP/LL-37(Chamilos等,2012.Blood120:3699-3707)和胞浆中的钙卫蛋白(S100A8/S100A9)(Champaiboon等,2009.J.Biol.Chem.284:7078-90)。本文中,描述了一种方法,其中可通过瞬时递送特定抗微生物效应子mRNA(例如,CAMP、S100A8/S100A9)来增加上皮内细胞对于侵入性微生物病原体的抗性。用于治疗目的的mRNA转染可通过系统性或离体给予来代替或增加蛋白质表达(Tavernier等,2011.J.对照.Release.150:238-47)。该方法避免了采用DNA的转染和相应产生的问题,包括,例如,在宿主细胞中的不准确、致变性插入。出于增强粘膜先天免疫的目的,我们报告了将CAMP和S100A8/S100A9mRNA递送进入人上皮细胞,以及这些转染的功能性抗微生物作用。
优化mRNA稳定性
在mRNA的5'端加帽可增加所表达信息的稳定性。ARCA可以高达80%的效率加帽,而加帽酶(CE)可将加帽效率增加至100%(Zhao等,2010.CancerRes.70:9053-9061)。为了优化加帽策略,我们比较了mMESSAGET7Ultra(加利福尼亚卡尔斯巴德的生命技术公司),其生成ARCA-加帽的mRNA,和mScriptTMRNA系统(威斯康星州麦迪逊的赛尔斯科公司(CellScriptInc.)),其采用加帽酶(CE)和2'-O-甲基转移酶加帽酶以产生帽0或帽1。采用不同加帽系统合成CAMPmRNA,递送进入KB细胞,并通过western印迹分析检测蛋白质表达。在用ARCA-加帽的mRNA转染后8小时、24小时和48小时,KB细胞表达的CAMP蛋白多于用CE帽1转染后的情况,其高于CE帽0(图1A)。CAMP蛋白水平在ARCA加帽mRNA递送后约16小时成峰,并在40小时~48小时减少约50%(图1B)。之后,将ARCA加帽应用于所有实验。我们还比较了以64A和150A的3'延伸表达时的mRNA稳定性。几乎无差异(数据未显示),从而我们采用150A用于所有后续实验。
用抗反向帽类似物加帽的mRNA的稳定性(ARCA)
KB细胞天然表达检测水平之下的CAMP、S100A8和S100A9的mRNA(数据未显示)。因此,KB细胞中表达的内源性S100A8、S100A9和CAMPmRNA对用ARCA加帽的mRNA转染之后的后续水平几乎没有作用。为了合成同时包含S100A8和S100A9的融合mRNA,将包含Kozak序列的S100A8ORF克隆进入pIRESMCSA,并且将S100A9克隆进入MCSB。为了消除采用pIRES的下游翻译的减弱,构建了天然IRES(nIRES)并将其插在S100A8和S100A9ORF之间。将包含所有必要要素的序列克隆入pGEM4Z.2bgUTR.150A,然后合成A8-IRES-A9和A8-nIRES-A9mRNA。采用qRT-PCR分析体外转录的ARCA-加帽的CAMP、S100A8、S100A9、A8-IRES-A9和A8-nIRES-A9mRNA的转染(图5)。在各mRNA转染之后4小时,特定胞内mRNA处于检测到的最高水平。在转染后的16小时~20小时,CAMPmRNA水平是4小时的约一半,指示KB细胞中的半衰期在12小时~16小时之间(图5A)。相比地,S100A8mRNA的共转染导致12小时~16小时的mRNA半衰期,而S100A9mRNA的共转染导致8小时~12小时的mRNA半衰期(图5B)。当转染串联mRNA时,A8-IRES-A9的半衰期是12小时~16小时,而A8-nIRES-A9mRNA的半衰期是8小时~12小时(图6C、6D)。在KB细胞中,这些mRNA的半衰期是8小时~16小时。
S100A8和S100A9的共转染提高各蛋白质的稳定性
比较S100A8(图2A)、S100A9(图2B)和钙卫蛋白(1:1mol/molS100A8+S100A9)(图2C)的ARCA-加帽的mRNA在递送进入KB细胞之后的蛋白质表达。单独S100A8蛋白质的表达在16小时最多,并在约28小时减少至约一半(图2A),而S100A9蛋白在16小时最高,并在约40小时~48小时减少至约一半(图2B)。相比地,S100A8和S100A9mRNA的共转染(各自的量为采用S100A8或S100A9转染时的一半)看来提高了各肽的稳定性。不同于S100A8,例如(图2A),各蛋白质贯穿时程均有表达(图2C、2D)。对于S100A8,蛋白质在24小时最多,并在约72小时减少一半(图2C)。当与S100A8共转染时,S100A9蛋白也在24小时最多,并在约48小时~72小时减少至一半(图2C)。S100A8和S100A9mRNA的共转染导致各肽的稳定性提高,表明优选形成钙卫蛋白异质二聚体。
采用串联构建体的S100A8/S100A9蛋白表达
在A8-IRES-A9mRNA转染之后,S100A8蛋白质表达在16小时最多,并在24小时~32小时减少至一半(图2D),而S100A9蛋白在32小时最多,并在约48小时~72小时减少至一半(图2D)。对于A8-nIRES-A9mRNA转染,S100A8蛋白质的表达在16小时最多,并在24小时~32小时减少至一半(图2E),而S100A9蛋白在40小时最多,并在约40小时~48小时减少至一半(图2E)。如同S100A8与S100A9共同表达时(图2C),与采用S100A8mRNA单独转染相比,采用串联mRNA构建体总体看来使蛋白质亚基稳定(图2A)。
CAMP和钙卫蛋的胞内呈现
在mRNA转染之后,还采用免疫荧光检测了KB细胞中的CAMP和钙卫蛋白。内源性CAMP、S100A8和S100A9蛋白水平处于或低于检测阈值,并且采用拟转染并没有检测到高于背景的荧光(图6)。在递送EGFP、CAMP或钙卫蛋白(S100A8/S100A9)的mRNA之后16小时,检测到显著荧光,表明mRNA递送增强了EGFP、CAMP和钙卫蛋白的蛋白质表达(图6A、6B、6C)。在采用A8-IRES-A9和A8-nIRES-A9mRNA转染后16小时,没有检测到显著荧光(数据未显示)。然而,在mRNA转染后40小时,检测到钙卫蛋白的荧光信号(图6C)。这些结果与western印迹分析一致(图1B、图2D、2E)。
CAMP或钙卫蛋白mRNA转染提高KB细胞对细菌侵入的抵抗
我们测定了在mRNA转染进入受感染的上皮细胞之后产生的所选抗微生物蛋白质是否影响对于细菌病原体侵入的抵抗。在采用所有CAMP和钙卫蛋白mRNA构建体转染之后,上皮细胞对李斯特菌和沙门氏菌的侵入的抵抗在8小时(图3A)、24小时(图3B)和48小时(图3C)显著提高。抵抗似乎在转染后8小时最强。CAMP和S100A8+S100A9mRNA转染方案似乎比串联mRNA构建体更有效地增加抵抗。然而,串联构建体包含的S100A8和S100A9mRNA的摩尔当量少于S100A8+S100A9。因此,该串联构建体可能与共转染同样有效。
TransIT-mRNA递送系统降低细胞活力但不触发凋亡。
通过采用MTT试验检测细胞活力,并通过流式细胞术和PARP切割来定量凋亡细胞,来分析由TransIT-mRNA转染试剂递送这些mRNA的细胞致死性(cytolethality)。当与未转染的细胞相比较时,用载剂、CAMP、S100A8/S100A9、A8-IRES-A9或A8-nIRES-A9mRNA转染的细胞在48小时和72小时之后显著减少细胞活力(图4A)。当与未转染的细胞相比较时,载剂、CAMP、S100A8/S100A9、A8-IRES-A9或A8-nIRES-A9mRNA的递送不影响凋亡(图4B)。各转染之后72小时的凋亡细胞的小量增加与未转染的细胞无法区分。采用western印迹分析聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)切割,一种半胱天冬酶活化指标(Taylor等,2008.NatureRev.Mol.CellBiol.9:231-241),对KB细胞的凋亡状态进行进一步分析。PARP切割在mRNA转染后32小时提升(图4C)。当与未转染的细胞比较时,mRNA递送之后的切割的PARP具有相似模式(图4C)。
我们首次显示采用编码抗微生物CAMP和钙卫蛋白(S100A8/S100A9、A8-IRES-A9和A8-nIRES-A9)的mRNA的瞬时转染能够增强上皮细胞对侵入性病原体的抵抗(体外)。采用mRNA货物的基因转移载剂似乎是用于治疗疾病的DNA递送载剂的具有吸引力的替代物,尽管人们一直担忧mRNA合成的难易程度和转染mRNA的稳定性将不足以产生有用的蛋白质产物(Tavernier等,2011.J.对照.Release.150:238-47)。mRNA递送促进了抗原的所有表位的同时表达,并且,操作和纯化相当简单。
当我们考虑将该方法用于开发对粘膜或上皮表面或进入可接触的组织的潜在治疗剂时,mRNA递送具有优于DNA基因转移技术的若干优势。因为mRNA不会整合进入基因组,并且转染保持为瞬时,mRNA转染的药物安全性大于DNA基因转移治疗。为了开发增强粘膜免疫性的疗法,我们首次显示将指定抗微生物蛋白质的体外转录、加帽和聚腺苷酸化的mRNA递送进入人上皮细胞,以及相应的功能效果。
采用抗反向帽类似物(ARCA)5'加帽来提高通过体外翻译合成的mRNA货物的稳定性,并且,可通过采用顺式和反式的聚(A)链的3'mRNA加帽来增加蛋白质表达(Mockey等,2006.Biochem.Biophys.Res.Commun.340:1062-1068)。因此,某些mRNA修饰能提高该mRNA的稳定性。不过,特定mRNA货物、所翻译蛋白质的稳定性和目标细胞均会影响新蛋白质表达的动力学和功效。
在我们的研究中,比较不同的mRNA。CAMP、S100A8和S100A9蛋白在mRNA转染后16小时成峰(图1B、2A、2B)。相较于采用S100A8或S100A9mRNA单独转染,在S100A8/S100A9mRNA共转染之后,S100A8和S100A9蛋白在24小时成峰然后缓慢降低(图2C)。由于S100A8和S100A9自发形成异质二聚体(Hsu等,2009.Antiinflamm.AntiallergyAgentsMed.Chem.8:290-305),认为共转染之后的二聚体化抑制各亚基的降解。
钙卫蛋白,S100A8和S100A9的异质二聚体复合物,增加上皮细胞的胞质先天免疫,提高针对侵入性细菌(包括李斯特菌和沙门氏菌)的抵抗。同时采用S100A8和S100A9mRNA的共转染诱导KB细胞中S100A8/A9的生成(图6C)。为了简化供钙卫蛋白翻译的转染过程,我们采用pIRES来构建哺乳动物表达载体,该表达载体允许高水平表达来自相同双顺反子mRNA转录本的两种基因。该载体包含脑心肌炎病毒(ECMV)内核糖体进入位点(IRES),其侧接两个多克隆位点(MCSA和B)(Bochkov等,2006.Biotechniques41:283-284,286,288)。第一个顺反子通过加帽依赖性搜索机制翻译,而第二个顺反子通过加帽非依赖性IRES元件起始机制翻译(Bochkov等,2006.Biotechniques41:283-284,286,288)。pIRES包含部分失效的IRES序列,其减小克隆入MCSB的基因相对于MCSA的翻译率(Rees等,1996.Biotechniques20:102-110)。为了促进从单一转染构建体翻译钙卫蛋白,将S100A8和S100A9ORF克隆进入pIRES载体,并将该质粒转染进入KB细胞。采用与pIRES串联克隆的cDNA,能观察到钙卫蛋白(S100A8/S100A9二聚体)的形成(Champaiboon等,2009.J.Biol.Chem.284:7078-90)。当我们采用pIRES克隆串联mRNA时,也观察到了钙卫蛋白二聚体(图6D),并且该信号与采用S100A8和S100A9mRNA的共转染类似(图6C)。
由于预期采用pIRES将S100A9mRNA克隆进入MCSB位点将显示减弱的翻译,我们还采用天然(n,非减弱)IRES构建了载体。采用pIRES和nIRES,钙卫蛋白的蛋白质表达相似(图6D,顶图和底图;图2D,2E)。由于将同等浓度的mRNA载体递送至细胞,串联构建体的翻译效率似乎高于单独S100A8或S100A9,但无法进行定量比较。同样地,CAMPmRNA转染和翻译也成功进行,但我们无法将其效率与钙卫蛋白比较。然而,很明显,共转染时,或者递送A8-IRES-A9或A8-nIRES-A9mRNA时,S100A8和S100A9蛋白表达更加稳定(图2D、2E)。S100A8/S100A9、A8-IRES-A9和A8-nIRES-A9mRNA的若干构建体导致不同的翻译动力学,并且明显显示接近pIRES(图2D)和nIRES(图2E)的MCSB位点插入显示延迟。不希望受任何具体理论限制,MCSB位点中的mRNA可能在KB细胞中由低效率、加帽非依赖性IRES机制扫描并起始翻译。
我们的结果显示,在转染进入KB细胞之后,ARCA加帽的CAMP、S100A8/S100A9、A8-IRES-A9和A8-nIRES-A9mRNA的半衰期是8小时~16小时(图6A-D)。为了延长半衰期,这些mRNA构建体包括两个连续的人β-球蛋白UTR。这些转染的mRNA的稳定性差异可归因于mRNA二级结构,其可影响RNA降解酶的识别和与RNA降解的调节相关联的辅助蛋白质的识别。鉴于mRNA之间的半衰期差异可反映脂质体递送后,隔离或暴露至胞质降解和翻译的集群(pool)的比例(Barreau等,2006.RNA12:1790-1793),该现象未必能解释我们的结果。我们的转染采用市售可得的非脂质体、阳离子聚合物/脂质配方(转染试剂盒,威斯康星州麦迪逊的Mirus生物公司(MirusBioLLC))。尽管采用提前终止密码子的mRNA能防止翻译全长信使并防止通过无义介导的延迟通路生成全长蛋白质(Apcher等,2011.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.108:11572-11577),并不清楚该机制是否能够解释本研究细胞中mRNA半衰期和蛋白质翻译上的差异性。
如下文更详细地描述,可构建mRNA以包含一个或多个经修饰的碱基。所述经修饰的mRNA可显示稳定性的提高和/或免疫反应可能性的减小(Kormann等,2011,NatBiotechnol29(2):154-157)。
最终,对于mRNA转染效率的测试是新的或加强的功能,并且最小的相关细胞毒性或凋亡诱导。我们的数据显示,CAMP或钙卫蛋白mRNA递送可显著增加上皮细胞针对李斯特菌和沙门氏菌的侵入的抵抗(图3A-3C)。为进行这些实验,我们调和了TransIT-mRNA转染试剂的最优应用所需的细胞融合(60-90%)与抗生性保护试验的最优性能所需的40-60%细胞融合度的差异(Champaiboon等,2009.J.Biol.Chem.284:7078-90;Nisapakultorn等,2001.Infect.Immun.69:4242-4247;Nisapakultorn等,2001.Infect.Immun.69,3692-3696)。为了在最优转染之后进行抗生性保护试验,使细胞在转染后8小时和32小时分传,然后使细胞再孵育16小时以将细胞融合度调节至40%~60%以供细菌侵入。mRNA转染后24小时和48小时的抗微生物活性比转染后8小时低(图3A-3C);细胞随时间的分裂(和传代培养)降低了胞内CAMP或钙卫蛋白的蛋白质水平。不过,剩余的LL-37和钙卫蛋白水平足以在转染后长达48小时使针对侵入性病原体的抵抗具有统计学显著的增加。
我们发现,没有证据指示任何货物mRNA的mRNA递送或其翻译的蛋白质产物会诱导凋亡。由于载剂对照显示与mRNA递送相似的活力减少,我们的结论是,活力随时间的小幅减少可归因于TransIT-mRNA递送系统而非蛋白质表达。当与未转染的细胞比较时,抗微生物蛋白质mRNA(CAMP、S100A8/S100A9、A8-IRES-A9和A8-nIRES-A9)递送和胞内蛋白质生成并不显著触发凋亡。总体而言,数据表明,TransIT-mRNA递送系统降低细胞活力但不触发凋亡。不认为该试剂所致的活力损失在体内有继发性。系统性给予并不造成免疫细胞活化(Karikó等,2011.Nucl.AcidsRes.39:e142),并且,该试剂与电穿孔相比看来毒性较小并且显示较高转染效率(Gonzalez等,2007.J.Virol.Methods.145:14-21)。更重要的是,由转染造成的细胞活力的损失看来不影响侵入数据,因为凋亡结果与载剂对照相似(图3、4A)。这些数据显示,mRNA递送系统可以是用于治疗或控制粘膜感染的DNA基因疗法的有效代替物。该方法用于治疗粘膜感染的应用可采用mRNA包装系统来强化,该包装系统能提高mRNA稳定性,使免疫活化作用最小化,和/或更加特异性地靶向粘膜上皮细胞。
口腔粘膜表面上存在的唾液可能是所述用于治疗性目的的mRNA转染的屏障。唾液含有高分子量的粘蛋白,以及能够在口中上皮细胞表面处形成扩散屏障的许多其它蛋白质。此外,唾液还包含RNA酶,其能够降解所述治疗性mRNA。
为测试该可能性,我们向体外目标上皮细胞添加唾液,尝试用EGFPmRNA进行转染,然后通过发出的绿色荧光来测试EGFP的翻译。我们还修饰了mRNA的核苷酸组成,以增加其稳定性并降低可能的免疫原性(Kormann等,2011,NatBiotechnol29(2):154-157)。所述修饰用甲基胞嘧啶核苷替代了25%的胞嘧啶核苷,并用2-硫脲核苷替代了25%的尿嘧啶核苷。腺嘌呤核苷和鸟嘌呤核苷保持不变。
在不存在添加的唾液(0%唾液)的情况下,转染的上皮细胞生成EGFP;未转染时,含有或不含唾液的情况中均未观察到绿色荧光(图15A-C)。用递增量的唾液预处理细胞递增的时间(至多五分钟)消除了绿色荧光的生成。以递增重复频率(至多清洗五次)用新鲜培养基清洗细胞逆转了mRNA转染不能产生绿色荧光的情况(图16)。对细胞清洗五次以最大程度恢复了成功mRNA转染,尽管其效率低于没有唾液存在的情况。
经唾液处理的上皮细胞的体外清洗逆转了对mRNA转染法的抑制。在临床设置中,清洗粘膜上皮细胞并防止与唾液的重新接触有助于克服唾液对转染的屏障并提高转染效率。此外,唾液,特别是在组成和粘度方面,是粘膜液体的代表性模型。因此,图15和图16中所示的唾液清洗结果指示,通过从表面清洗粘膜液体来对粘膜表面进行预处理,能够提高其它粘膜上皮细胞(例如泌尿生殖系统、眼睛或其它鳞状粘膜的粘膜上皮细胞)的转化效率。
我们还提供数据支持采用mRNA转染以表达两种蛋白质(均为抗微生物蛋白质)的复合物,这种应用在直接接种进入上皮癌症(例如,子宫颈癌和头颈癌)时可具有肿瘤抑制性。(Khammanivong等,2013.PLoSOne8:e69395.Doi:10.1371/journal.pone.0069395)。生长抑制的缺失是癌症的特点之一(Hanahan和Weinberg,2011.Cell144:646-674),这造成恶性转移和肿瘤发生。导致异常的细胞周期调控和生长的分子机制在不同类型的癌症中是不同的,并且在头颈鳞状细胞癌(HNSCC)中仍难以定义。HNSCC和其它鳞状细胞癌(SCC)的生长调控和肿瘤发生中可能涉及钙卫蛋白。S100A8/A9在口腔和口咽的健康鳞状上皮细胞的胞浆中组成性表达(Ross等,2001.InfectImmun69:3248-3254;Hitomi等,1998.ArchHistolCytol61:163-178)。由定位至染色体基因座1q21上的人上皮分化复合体的编码区域编码,S100A8和S100A9是S100蛋白质家族的成员,其包含两个典型的EF-手型钙结合基序(参与细胞周期进程和生长、细胞分化的钙依赖性控制)(Itou等,2002.JMolBiol316:265-276),并且潜在涉及癌症发展和其它炎性疾病。在癌症中,胞外S100A8/A9,通常从浸润性多形核白细胞和巨噬细胞的胞浆释放(Hessian等,2001.EurJBiochem268:353-363;Hsu等,2009.AntiinflammAntiallergyAgentsMedChem8:290-305),其与炎症和所述疾病的进程相关联(Gebhardt等,2002.Oncogene21:4266-4276)。释放时,S100A8/A9能够通过晚期糖基化端产物(RAGE)的受体和/或toll样受体4(TLR4)传递信号,以促进肿瘤相关的炎症以及晚期腺癌和结肠炎相关癌症的进程(Hermani等,2006.ExpCellRes312:184-197;Gebhardt等,2006.BiochemPharmacol72:1622-1631;Ehrchen等,2009.JLeukocBiol86:557-566;Turovskaya等,2008.Carcinogenesis29:2035-2043)。然而,关于S100A8/A9的胞内作用,以及所述蛋白质复合物如何调控癌细胞中的功能等方面知之尚少。
胞内S100A8/A9表达似乎具有细胞特异性和组织特异性,并且在不同恶性情况中存在差异调控。在源自非正常表达该蛋白质的组织的人原发性肿瘤中,S100A8/A9水平可能异常升高,所述组织例如皮肤(Gebhardt等,2002.Oncogene21:4266-4276)、乳腺(Arai等,2008.CurrCancerDrugTargets8:243-252;Moon等,2008.MolCancerRes6:1544-1553)、甲状腺(Ito等,2009.AnticancerRes29:4157-4161)、肝(Nemeth等,2009.Hepatology50:1251-1262)、胃粘膜(Yong等,2007.ArchPharmRes30:75-81)、前列腺(Hermani等,2006.ExpCellRes312:184-197)、卵巢(Odegaard等,2008.AmJObstetGynecol198:418e411-417)、膀胱(Yao等,2007.AnticancerRes27:3051-3058)和肺(Arai等,2001.OncolRep8:591-596)。在这些组织中,尚不明确S100A8/A9水平升高是对肿瘤发生的响应,还是实际上驱动肿瘤发展和进程。相反,S100A8/A9表达可能在鳞状上皮细胞来源的人肿瘤中减少,这些细胞正常时组成性地表达所述蛋白质复合物,例如头颈部SCC(包括口腔、鼻咽和口咽)(Melle等,2004.CancerRes64:4099-4104;Gonzalez等,2003.ArchOtolaryngolHeadNeckSurg129:754-759;Fung等,2000.LifeSci67:923-936)、食道SCC(Kong等,2004.WorldJGastroenterol10:1093-1097;Wang等,2004.CellRes14:46-53)和宫颈SCC(Tugizov等,2005.JVirol79:1099-1112;Coleman等,1994.HumPathol25:73-79)。在这些鳞状上皮癌中,减少的S100A8/A9与缺少分化和增加的生长与侵袭性相关联。相反地,表达S100A8/A9的SCC看来较低侵袭性。因此,我们需要确定SCC中的S100A8/A9是否起生长调控因子的作用。
为了通过在S100A8/A9阴性癌细胞中进行拯救来测试S100A8/A9的调控作用,我们稳定转染KB细胞以表达S100A8/A9蛋白复合物。S100A8/A9在KB细胞中的稳定表达导致S100A8/A9依赖性G2/M细胞周期阻滞,以及软琼脂中锚着非依赖性生长和集落形成的减少。为测定降低S100A8/A9水平将会造成的效果,利用短发夹RNA(shRNA)来沉默TR146细胞中的S100A8和S100A9。在TR146细胞中,使S100A8和S100A9的表达沉默逆转了对生长和集落形成的抑制作用,并且似乎与G2/M检验点控制的损失相关联。G1/S和G2/M细胞周期检验点在癌中皆不受控制,导致失控的细胞生长和增殖。KB细胞中,发现S100A8/A9的生长调控不是通过G1、G1/S检验点或S期。相反,S100A8/A9的表达显然通过蛋白质-蛋白质相互作用来增加蛋白质磷酸酶2A(PP2A)活性,这似乎涉及G2/M检验点信号转导的调节和恢复以及癌生长的减少。
PP2A是一种丝氨酸和苏氨酸(Ser/Thr)蛋白磷酸酶,已知其通过如下方式来调控细胞周期检验点:靶向G2/M特异性Cdc25C以通过在Thr48处去磷酸化来失活,抑制有丝分裂退出,和细胞分裂(Forester等,2007.ProcNatlAcadSciUSA104:19867-19872;Margolis等,2006.Cell127:759-773)。PP2A靶向广谱的磷酸蛋白质,并且还显示通过抑制细胞存活和增殖通路中的AKT和C-MYC,以及通过诱导细胞周期阻滞,来发挥抗肿瘤活性(Guenin等,2008.IntJOncol32:49-57)。当与S100A8/A9[B30]相互作用时,PP2A可以被活化以在G2/M检验点处的细胞周期进程中发挥调控作用。因此,S100A8/A9和PP2A可作为相互作用伴侣来发挥作用,以调控有丝分裂并控制细胞生长。癌中(例如HNSSC中)的S100A8/A9减少可导致PP2A磷酸酶活性的降低和生长与肿瘤发生的增加。
通过qRT-PCR检测正常和SCC样品中的S100A8和S100A9基因表达
S100A8/A9蛋白表达在HNSCC中减少(Driemel等,2007.ProteomicsClinAppl1:486-493;Roesch等,2005.EurJCellBiol84:431-444)。我们采用实时定量逆转录聚合酶链式反应(qR-PCR)比较了匹配的HNSCC和正常邻接(NAT)组织中的S100A8和S100A9亚基基因的表达。表达分析对GAPDH管家基因(作为内部和总RNA上样对照)进行标准化。从具有第II期、第III期和第IVA期肿瘤的三位不同患者分开汇集来自HNSCC和NAT组织的总RNA,并分析差异化的mRNA表达。利用qRT-PCR,我们发现HNSCC中的S100A8和S100A9表达比作为正常组织对照的NAT中低约10倍(图7A)。
我们还采用微阵列基因表达分析研究了超过35例临床病例和十一例健康口腔粘膜样品中的S100A8和S100A9的表达水平,发现这些蛋白质的表达相对于正常对照组织也有降低(未公开数据)。TR146和KB-S100A8/A9细胞中的S100A8和S100A9的表达比S100A8/A9阴性KB和KB-EGFP细胞中多1到2个对数倍(log-fold)(图7B;点线显示为检测阈值)。KB-S100A8/A9细胞是S100A8/A9阴性KB细胞,其被转染以过表达S100A8/A9,而KB-EGFP细胞是伪转染的对照。在KB野生型和伪转染的KB-EGFP细胞中,S100A8和S100A9mRNA与蛋白质表达几乎无法检测,而转染的KBS100A8/A9和TR146细胞清楚显示S100A8和S100A9蛋白表达(图7C,7D)。TR146细胞的S100A8特异性和S100A9特异性的稳定shRNA转染将内源性S100A8和S100A9蛋白减少至几乎无法检测的水平(图7D)。根据免疫印迹显示,S100A8和S100A9蛋白水平似乎存在差异(图7C,7D)。这些差异可能是真实的,或反映对所用一抗的敏感性的差异。因此,可能无法直接将S100A8和S100A9的水平彼此做比较。
癌细胞的锚着依赖性和非依赖性生长被S100A8/A9抑制
在标准无热原聚苯乙烯组织培养瓶上(锚着依赖性生长条件(贴壁))和软琼脂中(锚着非依赖性生长条件)测试转染的KB-S100A8/A9细胞中S100A8/A9调控细胞生长的能力。高度恶性的细胞能够存活,形成集落,且不依赖于锚着条件增殖,于是在软琼脂中进行常规测试。当与KB野生型或KB-EGFP细胞做比较时,KBS100A8/A9细胞显示锚着依赖性体外生长低约两倍(图8A)。在标准贴壁条件下生长时,S100A8/A9的异位表达看来不诱导KB-S100A8/A9细胞中的凋亡,因为通过免疫印迹检测不到切割的胱冬酶1或切割的胱冬酶3,而KB野生型、KB-EGFP和KB-S100A8/A9细胞显示相似的总胱冬酶1和胱冬酶3水平(数据未显示)。在软琼脂中的锚着非依赖性生长过程中,KB-S100A8/A9细胞生长较差,相较于KB和KB-EGFP细胞形成较小且较少的集落(图8B)。为了证实S100A8/A9对细胞生长的作用,相较于敲减阴性的对照细胞(TR146-shRNA-对照),在TR146-shRNA-S100A8/A9KD细胞中敲减内源性S100A8/A9表达显示增加的锚着依赖性(图8C)和锚着非依赖性(图8D)生长。
S100A8/A9诱导G2/M细胞周期检验点阻滞
为了确定S100A8/A9是否通过调控细胞周期来抑制癌细胞生长,我们在表达和不表达S100A8/A9的KB细胞中进行了细胞周期分析。快速分裂细胞(例如癌)以高于正常细胞的速率发展通过细胞周期。DNA含量的细胞变化可通过随时间的碘化丙啶(PI)染色来检测。为确定细胞周期进程的差异,通过血清饥饿过夜,之后用阿非迪霉素在正常生长培养基中处理12小时来将癌细胞同步在G1/S期。从阿非迪霉素诱导的G1/S阻滞释放之后,根据DNA的PI染色测定,KB野生型、KB-EGFP和KB-S100A8/A9细胞以大致相同的速率进展通过G1/S期并进入G2/M期(图9A,9C)。截至同步后11小时,KB和KB-EGFP细胞出G2/M期,而截至同步后13小时,G2/M细胞群回到背景水平。然而,KB-S100A8/A9细胞看来在G2/M期阻滞至少三小时。与这些观察结果一致,相较于KB-EGFP细胞,KB-S100A8/A9细胞在同步后9小时显示较少的有丝分裂细胞,并且在中期保持较久(图9B,9D)。
S100A8/A9调节G2/M信号转导通路
为了确认S100A8/A9是否调控G2/M检验点,我们通过免疫印迹测试了G1/S和G2/M细胞周期检验点调控子的蛋白质表达和活化状态。KB、KB-EGFP和KB-S100A8/A9细胞表达相似水平的细胞周期调控子细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白E、p21、Rb、Chk2和Cdc25B(图10A),表明G1/S检验点不受S100A8/A9表达影响。细胞周期蛋白B1是在进入有丝分裂过程中细胞周期蛋白依赖性激酶1(Cdc2)活性所需的G2/M检验点调控子(Soni等,2008.CellCycle7:1285-1300),它在KB-S100A8/A9细胞中显示比KB和KB-EGFP细胞低的mRNA(数据未显示)和蛋白质(图10B)水平。更显著地,S100A8/A9的表达增加KB-S100A8/A9中的G2/M相关的检验点激酶p-Chk1(Ser345)、磷酸酶p-Cdc25C(Ser216)和p-Cdc2(Thr14/Tyr15)的磷酸化,但不改变这些蛋白质的表达水平(图10B)。S100A8/A9也使p-Cdc25C(Thr48)的有丝分裂活性形式减少(图10B)。在KB-S100A8/A9细胞中,我们发现Cdc25C和14-3-3β有较多免疫共沉淀(图10C),表明Cdc25C和14-3-3β之间的相互作用增加。总14-3-3β蛋白质表达不受S100A8/A9表达的影响。TR146-shRNA-S100A8/A9KD细胞中S100A8/A9的敲减减少了p-Cdc2(Thr14/Tyr15)磷酸化(图10D)。总体而言,我们的结果表明,S100A8/A9调节典型的G2/M信号转导通路,这与G2/M检验点延迟的保持相一致。
S100A8/A9与PP2A磷酸酶相互作用并增加活性
为了鉴定可能与S100A8/A9直接相互作用的候选细胞周期调控子,检索了已知和预期的蛋白质-蛋白质相互作用伴侣的经审校数据库(加利福尼亚州旧金山的基因数据公司(GenedataInc.)的IngenuityPathwayAnalysis)。我们发现S100A8/A9可能是蛋白质磷酸酶2A(PP2A)(一种已知的细胞周期调控子)的结合伴侣和活性调节剂。PP2A是异质三聚体全酶,其具有三个亚基:结构蛋白质亚基A、调控亚基B和催化亚基C。PP2A-C催化活性受Tyr307磷酸化的负调节,并且C末端Leu309甲基化是总体磷酸酶活性所必需的。已报道PP2A-B56δ同种型控制Cdc25C和G2/M细胞周期检验点活性(Guenin等,2008.IntJOncol32:49-57;Perrotti等,2008.CancerMetastasisRev27:159-168)。采用针对S100A8/A9复合物或PP2A的抗体,通过免疫共沉淀试验确认S100A8/A9结合至PP2A。PP2A与被27E10抗体(对S100A8/A9复合物具有特异性)捕获的S100A8/A9免疫共沉淀(图11A)。通过检测被PP2A-Aα/β抗体捕获的S100A9(用作S100A8/A9复合物的标志物)也证实了相互作用。免疫印迹分析显示,KB-S100A8/A9细胞中的S100A8/A9表达不影响PP2A亚基的蛋白质水平(亚基Aα/β、B56δ和Cα/β);然而,亚基Cα/β的磷酸化(Tyr307)似乎减少了(图11B)。通过抗甲基化PP2A-C(Leu309)抗体鉴定显示,C-末端甲基化似乎不受S100A8/A9表达的影响。
为确定PP2A磷酸酶活性,采用针对PP2A-C催化亚基的抗体来与具有或不具有S100A8/A9表达的细胞裂解物的全酶免疫共沉淀。然后,通过检测从磷肽底物释放的无机磷酸盐(Pi)的水平来测定免疫共沉淀的PP2A的磷酸酶活性。同步后至多七小时,在S100A8/A9存在下的PP2A磷酸酶活性比不存在S100A8/A9(KB-EGFP细胞)的情况高约五倍,在同步后12小时降低七倍。使磷酸酶活性对可检测的与S100A8/A9免疫共沉淀的PP2A-Aα/β水平(27E10抗体)进行标准化(图11C)。因此,KB细胞中PP2A活性的S100A8/A9依赖性调节似乎取决于所处细胞周期的时期。当来自KB-EGFP的细胞裂解物与1μg纯化的S100A8/A9预孵育时,也观察到PP2A活性的相似变化(数据未显示)。用PP2A抑制剂冈田酸(OA)处理的KB-S100A8/A9细胞显示与KB和KB-EGFP细胞相似水平的p-Cdc25C(Ser216),表明S100A8/A9介导的p-Cdc25C(Ser216)磷酸化的增加被抑制(图11D)。
因此,作为S100蛋白质家族的成员,认为复合物(S100A8/A9,或钙卫蛋白)形式的S100A8和S100A9在细胞周期进程中具有调控作用。在该研究中,我们发现,在KB和TR146人癌细胞中,S100A8/A9通过诱导G2/M细胞周期阻滞而起到细胞分裂和生长的负调控子的作用。以KB细胞作为体外模型用于功能获得(gain-of-function)研究,因为该癌细胞系在mRNA和蛋白质水平均缺乏S100A8和S100A9的表达。TR146是更高程度分化的HNSCC细胞系,其相较于其它可用细胞系而言具有可检测的S100A8/A9表达。在TR146和KB-S100A8/A9细胞中无法比较S100A8与S100A9的比例,而在G2/M检验点控制中的所属作用似乎相同。因此,如果个体亚基在其一细胞系中过量存在,该差异没有解释S100A8/A9的假设胞内功能。根据我们目前的结果,S100A8/A9水平的降低以及所致的功能损失能够由此解除对SCC生长的调控,并导致癌发生。相对于正常粘膜,在炎性或过度增殖口腔损伤和HNSCC组织中,S100A8/A9复合物在mRNA和蛋白质水平均显著下调(鳞状癌细胞中通常检测不到S100A8/A9)。此外,我们发现HNSCC显示的S100A8和S100A9基因表达比NAT低约10倍。NAT中的S100A8/A9水平可反映局部癌化。尽管无癌个体的粘膜组织中的S100A8/A9基因表达可能甚至更高,S100A8/A9表达水平的降低很明显地与癌有关联。
为了测定HNSCC中S100A8/A9的调节异常是否是癌表型的病因还是结果,我们需要确定细胞周期调控中的作用。发现胞浆中的S100A8/A9蛋白似乎定位在核中(可在www.proteinatlas.org使用的人蛋白质图谱数据库(TheHumanProteinAtlasdatabase))或核周区域(Champaiboon等,2009.JBiolChem284:7078-7090),这取决于细胞生长状态。在细胞分裂过程中,以及控制G2/M检验点时,S100A8/A9定位在有丝分裂纺锤体端点处的微管组织中心。G2/M检验点受检验点激酶Chk1/2的控制(Agarwal等,2003.Oncogene22:8271-8282;Taylor等,2001.Oncogene20:1803-1815)。Chk1/2使蛋白质磷酸酶Cdc25失活,Cdc25是细胞周期蛋白B/细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1,也称作Cdc2)复合物活化和进入有丝分裂所必需的(Agarwal等,2003.Oncogene22:8271-8282;Taylor等,2001.Oncogene20:1803-1815)。在S100A8/A9存在下,我们发现p-Chk1的活化磷酸化(Ser345)的水平升高。相似地,p-Cdc25C(Ser216)和p-Cdc2(Thr14/Tyr15)的抑制性磷酸化升高。G2/M特异性激酶p-Chk1的Ser345高度磷酸化表明,p-Chk1(Ser345)可能被S100A8/A9通过某一未知机制激活(Shiromizu等,2006.GenesCells11:477-485)。通过免疫共沉淀测定S100A8/A9和Chk1之间的蛋白质-蛋白质相互作用的尝试不成功(数据未显示)。在典型G2/M检验点信号转导通路中,激活的p-Chk1(Ser345)使G2/M特异性磷酸酶Cdc25C在Ser216处磷酸化,并促进其结合至分子伴侣14-3-3β(Peng等,1997.Science277:1501-1505;Peng等,1998.CellGrowthDiffer9:197-208)(参见图12)。与14-3-3β的结合钝化p-Cdc25C(Ser216)并促进其胞质累积(Graves等,2001.Oncogene20:1839-1851)。或者,活性p-Cdc25C(Thr48)使p-Cdc2的抑制性残基Thr14和Tyr15去磷酸化,并激活Cdc2/细胞周期蛋白B1复合物,导致进入有丝分裂(Ozen等,2005.ClinCancerRes11:4701-4706)。KB-S100A8/A9细胞中的S100A8/A9表达诱导了抑制性p-Cdc25C(Ser216)、Cdc25C/14-3-3β复合物和p-Cdc2(Thr14/Tyr15)水平的显著升高。在S100A8/A9的存在下,有丝分裂活性p-Cdc25C(Thr48)和细胞周期蛋白B1的水平大幅下降。这些结果指示G2/MDNA损伤检验点的S100A8/A9依赖性活化,导致Cdc25C的失活和有丝分裂阻滞。
提出S100A8/A9诱导的Cdc25C和细胞周期蛋白B1/Cdc2复合物的失活对G2/M细胞周期进程的负调控减少癌生长并可能抑制肿瘤形成。实际上,相较于S100A8/A9-阴性或S100A8/A9-敲减细胞,表达S100A8/A9的KB-S100A8/A9和TR146细胞均显示生长和集落生成方面的显著减少。尽管KB-S100A8/A9细胞表达的S100A8和S100A9比由NAT代表的正常组织少(相对于作为胞内对照的GAPDH管家基因),异位表达导致显著的生长抑制。由于TR146细胞中的S100A8/A9敲减导致软琼脂上生长和集落形成的显著增加,因此,我们的数据强烈表明S100A8/A9对癌细胞生长和集落生成的浓度依赖性作用。预期组织中S100A8/A9表达的进一步损失会加速HNSCC中的肿瘤生长和恶性转化。
尽管G1/S和G2/M检验点的损失是癌中生长与增殖的增加所需要的,G2/M检验点的S100A8/A9依赖性诱导显著导致了对KB细胞的有丝分裂活性和生长的抑制。S100A8/A9的表达导致KB-S100A8/A9细胞在G2/M阻滞并累积,抑制进展进入有丝分裂,而不影响G1/S-G2/M转变的速率。总体而言,S100A8/A9的这一生长抑制作用与表皮角化细胞中的报道相一致,表皮角化细胞中S100A8/A9的异位瞬时表达抑制细胞分裂和增殖(Voss等,2011.FEBSLett585:440-446)。在我们的实验中,对癌生长的作用不能归因于胞外S100A8/A9蛋白,因为S100A8和S100A9基因的序列分析显示没有典型分泌所需的上游信号肽。此外,就我们所掌握的而言,采用特异性ELISA测定,来自TR146或转染的KB的胞外S100A8/A9低于可检测水平(数据未显示)。因此,在研的S100A8/A9是胞质蛋白质复合物,并且,在正常生长条件下不太可能被上皮细胞分泌进入胞外空间。S100A8/A9表达对G1/S相关联的下游调控蛋白质的水平也没有明显作用,并且,从同步释放之后,G1/S和S期中的S100A8/A9阳性细胞和阴性细胞的比例相似。尽管没有严格地排除G1/S中的缺陷,仍强烈提示S100A8/A9介导的细胞周期的调控影响G2/M。
我们在此报告能解释S100A8/A9如何使Cdc25C失活并诱导G2/M细胞周期阻滞的首个机理性认识。有丝分裂p-Cdc25C(Thr48)磷酸化蛋白的减少可能通过由Ser/Thr蛋白质磷酸酶2A(PP2A)去磷酸化来信号转导。根据已有的报道,PP2A诱导细胞周期阻滞是通过靶向p-Cdc25C(Thr48)并使之去磷酸化(Forester等,2007.ProcNatlAcadSciUSA104:19867-19872;Margolis等,2006.Cell127:759-773;Guenin等,2008.IntJOncol32:49-57),允许Cdc25C在Ser216被p-Chk1(Ser345)磷酸化以如上所述地失活并核导出。
PP2A-Cα/β亚基是PP2A的酶活位点,并且其磷酸酶活性受控于Tyr307处的磷酸化和Leu309处的甲基化,其也是全酶组装所必需的。在KB-S100A8/A9细胞中,S100A8/A9的表达不影响PP2A-Aα/β、PP2A-B56δ(已知该调控亚基信号传导Cdc25C的靶向)或PP2A-Cα/β亚基的蛋白质水平。PP2A-C(甲基-PP2A-C)亚基的Leu309甲基化水平也与KB-S100A8/A9、KB-EGFP和野生型对照细胞中的相似。这些数据表明,S100A8/A9对KB细胞中的PP2A表达或全酶组装没有调控作用。然而,PP2A-C的Tyr307抑制性残基的磷酸化水平在KB-S100A8/A9细胞中减少,表明该酶的磷酸酶活性增加。
S100A8/A9表达加强KB-S100A8/A9-转染的细胞中的有丝分裂前的PP2A磷酸酶活性。当纯化的S100A8/A9蛋白与KB-EGFP细胞裂解物(缺少S100A8/A9)预孵育时,PP2A活性被相似地调节。因此,S100A8/A9似乎直接信号转导出PP2A的去磷酸化和活化。S100A8/A9表达显著抑制有丝分裂后PP2A磷酸酶活性,表明S100A8/A9的两相(biphasic)细胞周期依赖性调控。PP2A磷酸酶活性在同步后时间=0小时显著升高。t=0的水平可反映G1/S过程中的活性。PP2A还在G1/S细胞周期阻滞中起一定作用(Pitre等,2012.MolBiolCell23:1243-1253;Hofstetter等,2012.PLoSOne7:e30059),这不依赖于G2/M检验点信号转导通路。在t=0观察到的PP2A磷酸酶活性提高可能归因于阿非迪霉素所致的瞬时G1/S阻滞,阿非迪霉素用于将细胞同步在G1/S。尽管S100A8/A9不改变G1到S的细胞周期进程,G1/S的S100A8/A9非依赖性抑制(在该情况中由阿非迪霉素药理学所致)可能已经信号转导出PP2A活化。最重要的一点在于,G1/S的PP2A磷酸酶活性依赖于KB-S100A8/A9细胞中的S100A8/A9表达或受其表达增强,我们将就这一点在后续研究中进一步探讨。有趣的是,根据免疫共沉淀实验,PP2A和S100A8/A9看来直接相互作用,提示一种可能的机制:PP2A被S100A8/A9蛋白复合物激活。
为了提供进一步的证据证明S100A8/A9诱导的Cdc25C失活依赖于PP2A活性,显示在存在所表达S100A8/A9的情况下,特异性抑制PP2A活性的冈田酸处理降低了p-Cdc25C(Ser216)的磷酸化。该结果与文献报道一致,因为通过Ser216磷酸化(被Chk1)的Cdc25C的失活需要Cdc25C在Thr48处的去磷酸化,该位点是PP2A的一种已知底物(Zhou等,2000.MolCell6:873-883)。因此,冈田酸处理抑制S100A8/A9诱导的抑制性p-Cdc25C(Ser216)的PP2A依赖性磷酸化。因此,在正常生长条件下,S100A8/A9介导G2/M检验点的PP2A再活化和细胞周期延迟。
本研究中显示的S100A8/A9依赖性的细胞周期蛋白B1的表达减少和p-Cdc2(Thr14/Tyr15)的高度磷酸化也与癌症中常规报道的Cdc2失活和G2/M检验点阻滞相一致(Yang等,2010.FreeRadicRes44:792-802;Maalouf等,2009.IntJRadiatOncolBiolPhys74:200-209;Wang等,2008.JCellBiochem104:1181-1191)。如同在TR146HNSCC细胞中由shRNA所致的S100A8/A9的敲减所观察到的,S100A8/A9的减少提高软琼脂中的生长和集落形成并关联有p-Cdc2(Thr14/Tyr15)磷酸化不足。强烈提示G2/M检验点的S100A8/A9依赖性调控的缺失,G2至M转变的信号转导的增加,以及G1/S检验点的组成型失调造成TR146细胞生长速率的提高。
总而言之,我们提出一种模型,该模型目前包括S100A8/A9作为关键信号转导介导物,该介导物通过PP2A依赖性通路在G2/M细胞周期检验点的诱导和有丝分裂阻滞中发挥作用(图12)。S100A8/A9表达提高了PP2A磷酸酶活性,这可能是通过直接蛋白质-蛋白质相互作用和对催化亚基PP2A-C的抑制性残基Tyr307的去磷酸化作用所致,增加了PP2A的活化。假定活化的PP2A靶向p-Cdc25C(Thr48)并使其去磷酸化,允许Cdc25C被Chk1在抑制性残基Ser216处磷酸化(Perry等,2007.Celldivision2:12)。在癌细胞中,G2/M细胞周期检验点失调,导致p-Cdc25C的Thr48磷酸化增加和细胞生长加速。S100A8/A9通过降低p-Cdc25C(Thr48)的水平并提高p-Chk1(Ser345)和p-Cdc25C(Ser216)的水平,来经由PP2A激活G2/M检验点以诱导有丝分裂阻滞(以及生长的减少)。仍不明确Chk1激酶的活化(通过Ser345磷酸化)和G2/M检验点的活化是否由S100A8/A9表达或由Cdc25C在Thr48处的PP2A去磷酸化直接信号转导,但Cdc25C的Thr48和Ser216残基无法被同时磷酸化。磷酸化的p-Cdc25C(Ser216)被14-3-3β靶向并与其结合,导致失活和Cdc25C的胞质累积。结果是,细胞周期蛋白B1/p-Cdc2(Thr14/Tyr15)复合物被失活,将细胞周期阻滞在G2/M检验点。其它有丝分裂检验点抑制剂不受影响。因此,S100A8/A9(或钙卫蛋白)可作为鳞状上皮细胞中的肿瘤抑制剂发挥作用,并且其表达的减少可作为疾病进展的指标。因此,可证明人工增加S100A8/A9在HNSCC和其它SCC中的胞内表达是有效的治疗策略。
例如,胞内S100A8/A9减少小鼠的口底肿瘤(原位)形成。采用已建立的方案(HensonB.等,2007.JOralPatholMed.36:363-370),将悬浮在MATRIGEL(加利福尼亚圣何塞的BD生物科学公司(BDBiosciences))中的肿瘤细胞接种进入nu/nu小鼠的口底。截至第17天,表达S100A8/A9的KB细胞生成的原位肿瘤比对照伪转染KB细胞(表达EGFP)的小65%(p<0.02)(图13A)。S100A8/A9表达与如下现象相关联:更加离散和较小侵入性的肿瘤(图13B)、减小的坏死面积,和较小的侵袭性组织学表型(图13C)。相反地,TR146颊癌细胞形成的口底(原位)肿瘤比在TR146细胞中伪敲减之后形成的肿瘤大20%(图14)。这些数据指示,S100A8/A9在肿瘤细胞中的表达使口底处的肿瘤形成的体积和表观侵袭性减小。
因此,我们显示,口底肿瘤(原位)中癌细胞的S100A8/A9表达与形成的肿瘤尺寸呈负相关。因此,S100A8/A9可作为肿瘤抑制剂发挥作用。使S100A8/A9表达增加的方法可用作涉及上皮细胞的瘤形成的一些癌症的治疗性方法,这些癌症例如,头颈癌,包括但不限于口底的肿瘤。所述方法可包括:将一种或多种mRNA多核苷酸引入细胞,所述mRNA多核苷酸编码S100A8/A9组件,从而所述细胞增加S100A8/A9生成。在替代性实施方式中,所述方法可包括给予对象导致S100A8/A9表达增加的一种或多种活性试剂。示例性的活性试剂包括,例如,调节性细胞因子例如IL-1α、伴随角化细胞生长因子的IL-1α、IL-6、伴随或不伴随CXCL8的IL-8、IL-22、TNFα、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CCL20。示例性的活性试剂还包括使S100A8/A9上调的化合物,例如,豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯。
因此,在一个方面,本公开内容描述一种用于降低粘膜上皮细胞被病原性微生物感染的可能性和/或严重度的方法。所述方法一般涉及将参与先天免疫的多肽的编码mRNA引入细胞,和允许该细胞足量表达该多肽以有效降低该细胞被病原体感染的可能性。在另一个方面,本公开内容描述一种降低上皮细胞增殖的可能性或程度的方法。所述方法一般涉及:将抑制细胞增殖中涉及的多肽的编码mRNA引入上皮细胞,和允许该细胞足量表达该多肽以有效降低该细胞在锚着非依赖性环境中增殖的可能性。本文中所用的术语“多肽”指的是氨基酸残基的序列,无关于所述序列的长度。因此,术语“多肽”指具有至少两个氨基酸的任何氨基酸序列,并且包括全长蛋白质。
在不同的实施方式中,所述方法可体外或体内进行。可通过任何合适的方法将所述mRNA引入所述细胞。当以体内方式引入所述mRNA时,通常可在体内递送载剂的协助下将该mRNA引入所述细胞。示例性的体内递送载剂可包括如下成分:例如,TransIT-mRNA和TransIT-mRNA加强试剂(威斯康星州麦迪逊的Mirus生物公司)。
在一些实施方式中,所述细胞可以是上皮细胞或源自上皮细胞,例如,粘膜上皮的细胞。因此,对于所述方法的体内实施方式,示例性细胞包括癌细胞。示例性细胞还包括口腔粘膜、阴道粘膜、生殖器粘膜、扁桃体上皮、口咽、鼻咽、肺、胃肠粘膜,或眼睛周围的粘膜上皮的细胞。因此,所述方法可被用作某些病症的治疗方法,所述病症包括,例如,癌症、龈炎、牙周炎、口腔念珠菌病、链球菌咽痛、粘膜炎、细菌性支气管炎、细菌性肺炎、阴道炎、其它阴道和宫颈阴道感染、阴道酵母感染、胃肠感染(例如,李斯特菌和沙门氏菌GI感染)、眼睛感染、粘膜和/或围粘膜(perimucosal)感染。所述方法同样适用于将mRNA引入粘膜和相关的上皮细胞以瞬时表达可能具有预防性或治疗性价值的几乎任何蛋白质,例如肿瘤抑制剂或改善创伤愈合的蛋白质。例如,可利用mRNA转染来表达如下蛋白质:可改善顽固性皮肤创伤的愈合、抗皮肤癌(例如,基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑素瘤)、防止划痕和瘢痕形成,或逆转表皮痣中的血管发生进程的蛋白质。
对于所述方法的体外实施方式,所述细胞可以是或可以源自上述体内细胞类型中的任何一种。或者,所述细胞可以是或源自任何合适的上皮细胞系,例如,人KB细胞(ATCCCCL-17)。
所述mRNA编码参与先天免疫的多肽。参与先天免疫的示例性多肽包括,例如,普抑素抗微生物蛋白(CAMP)、钙卫蛋白、S100A8、S100A9、任何α-防御素、β-防御素、S100A7、S100A12、分泌性白细胞抑制剂、脂质运载蛋白2和溶菌酶。所述mRNA还可编码两种或更多种参与先天免疫的多肽的任何组合。本文中所用的“参与先天免疫的多肽”指的是全长多肽、其有效片段,或全长多肽或有效片段的前体。例如,CAMPmRNA可编码CAP-18,该前体由蛋白酶3(一种丝氨酸蛋白酶)激活成LL-37。除先天免疫以外,mRNA货物可编码几乎任何宿主多肽以引入、替代或加强任何功能。
所述方法可用于降低被病原体感染的可能性和/或程度。所述病原体可以是将所述细胞作为感染目标的任何病原体。示例性的病原体包括,例如,真菌,例如白色念珠菌(Candidaalbicans)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、曲霉属真菌(Aspergillusspp.)(例如,构巢曲菌(A.nidulans)和烟曲霉(A.fumigatus)),和细菌,例如生痰二氧化碳噬纤维菌(Capnocytophagasputigena)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、葡萄球菌(Staphylococcusspp.)(例如,金黄色葡萄球菌(S.aureus)和表皮葡萄球菌(S.epidermis))、链球菌(Streptococcusspp.)(例如,肺炎链球菌(S.pneumonia)、A组链球菌(StreptococcusgroupA)、B组链球菌(StreptococcusgroupB),和C组链球菌(StreptococcusgroupC))、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、布氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)、福赛斯坦纳菌(Tannerellaforsythia)、齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、衣原体(Chlamydiaspp.)、奈瑟氏菌(Neisseriaspp.)、加德纳菌(Gardnerellaspp.)和毛滴虫(Trichomonasspp)。
在一些实施方式中,所述mRNA可包括使该mRNA在引入所述细胞之后的半衰期延长的稳定化部分。所述稳定化部分可包括5'帽,例如,抗反向帽类似物(ARCA)或7-甲基鸟苷酸(m7G)帽。在一些实施方式中,所述稳定化部分可包括3'聚(A)延伸。示例性的聚(A)延伸可包括任何数量的腺嘌呤残基。在某些实施方式中,聚(A)延伸可包括64个腺嘌呤残基或150个腺嘌呤残基,其在mRNA的半衰期方面几乎无明显差异。合成所述mRNA构建体时,稳定化还可涉及采用经修饰的碱基。
在一些实施方式中,所述方法还可包括使所述病原体接触其中已引入mRNA的细胞。
就体内方法而言,其中引入所述mRNA的细胞可以是患有或有风险患上由所述病原体感染所致病症的对象的细胞。如本文中所用,患有由所述病原体感染所致病症的对象指的是,显示该病症的一种或多种症状或临床体征的对象。“症状”指的是疾病或患者的病症的任何主观证据。“体征”或“临床体征”指的是,能够由该患者以外的人发现的与具体病症相关的客观身体发现。本文中所用的术语“有风险”指的是,可能或可能不实际具有所述风险的对象。因此,例如,就感染性病症"有风险"的对象是,处于某一区域(该区域中有其他个体已被鉴定为患有该感染性病症)的对象,和/或,有可能接触感染物,即便尚未显示任何可检测的微生物感染迹象的对象,与该动物是否携带亚临床量的微生物无关。
因此,可在所述对象初次显示该病症症状或临床体征之前、过程中或之后进行所述mRNA的引入,或者,在感染性病症的情况中,在所述对象初次接触所述感染物之前、过程中或之后进行所述mRNA的引入。在所述对象初次显示与所述病症相关联的症状或临床体征之后起始的治疗—即,治疗性治疗—可导致:相较于未给予所述组合物的动物而言,该病症的症状和/或临床体征的严重性降低、完全治愈该病症,和/或降低该病症发展出临床迹象的可能性。类似地,治疗在所述对象初次显示与所述病症相关联的症状或临床体征之前起始的治疗—即,预防性治疗—可导致:相较于未给予所述组合物的动物而言,该病症的症状和/或临床体征的严重性降低,完全治愈该病症,和/或降低该病症发展出临床迹象的可能性。
所述方法包括:将有效量的所述组合物给予患有或有风险患上具体病症的患者。在本发明的该方面中,“有效量”是能有效减弱、限制进展、改善或治愈与所述病症相关联的症状或临床体征至任何程度的量。
包含所述mRNA的制剂可以任何合适的形式提供,包括但不限于,溶液、悬液、乳液、喷雾、气溶胶,或任何形式的混合物。所述组合物可在含有任何药学上可接受的赋形剂、运载体或载剂的制剂中递送。所述制剂还可包含一种或多种添加剂,包括例如佐剂或惰性运载体(例如,纳米颗粒)。
给予对象的mRNA的量可视多种因素而变化,所述因素包括但不限于:对象的体重、身体状况和/或年龄、给药途径、特定mRNA货物和/或所得蛋白质表达的稳定性。因此,给定单元剂型中包含的mRNA的绝对量可广泛变化,并且取决于多种因素,例如mRNA货物、治疗指标、对象的物种、年龄、体重和/或身体状况,以及给予的方法。因此,总体设定对所有可能的应用有效的mRNA的量是不切实际的。然而,本领域普通技术人员在考虑此类因素之后能容易地确定合适的量。
在一些实施方式中,mRNA可以,例如,以单剂量至多剂量的方式给予。因为mRNA不整合进入对象的基因组,将mRNA引入对象细胞的治疗性和/或预防性作用将随时间推移自然消失。因此,涉及将mRNA引入对象细胞的治疗性或预防性方案可包括多次处理。
在另一个方面,本公开内容描述一种组合物,所述组合物包含如本文所述参与先天免疫的多肽的编码mRNA,和体内递送载剂。所述组合物可具有抗肿瘤、抗微生物和/或抗真菌活性,并且因此可以是抗肿瘤、抗微生物和/或抗真菌试剂。
本文所述的mRNA可以随“运载体”配制在组合物中。本文中所用的“运载体”包括任何溶剂、分散介质、载剂、包衣、稀释物、抗细菌和/或抗真菌剂、等张剂、延迟吸收剂、缓冲剂、载体溶液、悬液、胶体等。用于药学活性物质的这类介质和/或试剂的应用是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂都与活性成分不相容,否则可考虑在治疗组合物中使用这些介质或试剂。也可在组合物中纳入补充活性成分。
"药学上可接受的"指,生物学或其它方面没有不良影响的任何材料,即可将该材料与mRNA一起给予个体,而不引起任何不良的生物学作用或不与包含它的药物组合物的任何其它成分发生有害的相互作用。
可将所述mRNA配制成药物组合物。所述药物组合物可以配制成适于优选给药途径的多种形式。因此,组合物可通过已知途径给予,所述途径包括,例如,经口,胃肠外(例如,皮内、经皮、皮下等),或局部(例如,鼻内、肺内、乳房内、阴道内、子宫内、皮内、经皮、经直肠等)。预计可将组合物给予粘膜表面,例如,通过给予例如阴道、鼻部或呼吸道粘膜(例如,通过喷雾或气溶胶)。组合物还可通过缓释或迟释方式给予。
制剂可以作为单位剂型方便地提供,且可通过药学领域熟知的方法制备。制备包含药学上可接受的运载体的组合物的方法可包括如下步骤:使包含mRNA的载体与构成一种或多种附加组分的运载体相联合。一般而言,制剂可如下制备:使活性化合物与液体运载体、细分固体运载体或其两者均一和/或密切地相联合,然后,如果需要,使该产物成型成所需制剂。
在先前描述中,为了清楚,可能孤立地描述了具体的实施方式。除非另有明确说明具体实施方式的特点与另一个实施方式的特点不相容,某些实施方式可包括与一个或多个实施方式相关联描述的相容特点的组合。
对于本文公开的包括不连续步骤的任何方法,所述步骤可以任何可行的顺序进行。并且,如果合适,可同时进行两个或更多个步骤的任何组合。
术语“和/或”指的是,所列要素的一个或全部,或者任何两个或更多个所列要素的组合;术语“包含(包括)”及其变化形式出现在本说明书和权利要求中不具有限制意义;除非另有说明,“一个”、“一种”、“所述”和“至少一个(一种)”可互换使用并表示一个(一种)或多于一个(一种);并且,由端点表示的数字范围包括该范围中所含的全部数字(例如,1~5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
下文将通过实施例说明本发明。应理解,具体实施例、材料、量和程序能够根据本文所述的本发明的范围和精神而得到宽泛的解读。
实施例
实施例1
细胞培养
人KB细胞(美国典型培养物保藏中心,ATCCCCL-17)在补充有10%胎牛血清(FBS)的改良型伊格尔培养基(MEM,弗吉尼亚州赫恩登的Mediatech公司)中,在37℃于5%CO2孵育箱中培养。
细菌
单核细胞增多性李斯特菌ATCC10403S和肠道沙门菌(S.enterica)血清型鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)ATCC14028生长于脑心浸液培养基(DIFCO,BD诊断系统公司,马里兰州斯巴克斯)中并在胰蛋白酶大豆琼脂(DIFCO,马里兰州斯巴克斯的BD诊断系统公司)上于37℃培养。李斯特菌和沙门氏菌细胞分别收获自对数期和稳定期(以620nm处0.4-0.6的吸光度),并且用于感染KB细胞。
质粒构建
pGEM4Z.ss1bbz.2bgUTR.150A(由宾夕法尼亚大学的CarlH.June教授和YangbingZhao博士提供)采用NotI和HindIII消化以去除插入物(Zhao等,2010.CancerRes.70:9053-9061)。将EGFP的开放阅读框(ORF)(引物对P1和P2)、人CAMP(引物对P3和P4)、包含Kozak序列的S100A9(引物对P7和P8)和S100A8(引物对P5和P6)克隆进入pGEM4Z.2bgUTR.150A(表1)。另一方面,通过NheI和XhoI(引物对P11和P12),将包含Kozak序列的S100A8ORF克隆入pIRES载体(加利福尼亚州山景城的ClontechLaboratories公司)的第一多克隆位点(MCS)。通过XbaI和NotI(引物对P13和P14),将包含Kozak序列的S100A9ORF克隆进入第二MCS(表1)。然后,扩增A8-IRES-A9片段(引物对P9和P10)并克隆进入pGEM4Z.2bgUTR.150A以产生质粒pGEM4Z.A8-IRES-A9.2bgUTR.150A(表1)。
表1.寡核苷酸探针
a不源自基因/片段的寡核苷酸区域为粗体+斜体。
粗斜体
pIRES载体中的IRES是部分失效的序列(Rees等.1996.Biotechniques20:102-110;Bochkov等,2006.Biotechniques41:283-284,286,288各处)。为了在两个MCS之间构建天然IRES(nIRES),采用pGEM4Z.A8-IRES-A9.2bgUTR.150A载体作为模板,并采用引物对5'-AAACGTCTAGGCCCCCCGAACC-3'/5'-TTTAACCTCGACTAAACACATGTAAAGCATGTGC-3'扩增。产物经纯化和自连接以生成质粒pGEM4Z.A8-IRES/mut1-A9.2bgUTR.150A。使用pGEM4Z.S100A8-IRES/mut1-S100A9.2bgUTR作为模板,采用引物对5'-ACCATGACTTGCAAAATGTCGCAGCTG-3'/
5'-ATTATCATCGTGTTTTTCAAAGGAAAACCAC-3'扩增,然后将片段纯化并自连接以产生质粒pGEM4Z.A8-nIRES-A9.2bgUTR.150A。
体外转录
模板扩增自相应的质粒构建体,并从凝胶提取。纯化的片段用0.5%SDS和100μg/ml蛋白酶K在50℃处理30分钟,并用苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)提取,然后用氯仿提取。经乙醇沉淀后,将模板溶解于10mMTris-HCl并储存在-80℃。采用mMESSAGEmMACHINET7Ultra试剂盒(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司)或ScriptCapTMm7G加帽系统/ScriptCapTM2'-O-甲基转移酶试剂盒(威斯康星州麦迪逊的CellScript公司)合成mRNA,然后,合成的mRNA采用MEGAclear试剂盒(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司)纯化后用乙醇沉淀。
mRNA转染
处于约60%-90%融合度的细胞用mRNA转染,采用TransIT-mRNA试剂盒试剂(威斯康星州麦迪逊的Mirus生物有限责任公司)根据生产商的说明进行转染。
Western印迹分析
细胞用哺乳动物细胞-PELBTM缓冲液(密苏里州圣路易斯的G-Bio科学公司)提取。提取的蛋白质通过SDS-PAGE分离,转移到硝化纤维素膜上,然后与如下一种物质孵育:兔抗β-肌动蛋白(DB070,加利福尼亚基洛瑞的三角洲生物实验室有限责任公司(DeltaBiolabs,LLC))、小鼠抗LL37(sc-166770,加利福尼亚州圣克鲁兹的圣克鲁兹生物技术公司(SantaCruzBiotechnolology,Inc.))、小鼠抗S100A8(sc-48352,加利福尼亚州圣克鲁兹的圣克鲁兹生物技术公司)、兔抗S100A9(sc-20173,加利福尼亚州圣克鲁兹的圣克鲁兹生物技术公司)、兔抗PARP(#9542S,细胞信号转导公司(Cellsignaling))。然后,将兔一抗与偶联辣根过氧化物酶(HP)的山羊抗兔抗体孵育,而小鼠一抗与偶联HP的山羊抗小鼠抗体孵育(这些二抗来自加利福尼亚州圣克鲁兹的圣克鲁兹生物技术公司)。采用SuperSignalWestPico化学发光底物(马萨诸塞州威尔明顿的赛默飞科学公司(ThermoFisherScientific,Inc.))并暴光至AmershamHyperfilmECL膜(新泽西州皮斯卡塔韦的GE健康护理生物科学公司(GEHealthcareBiosciences)),来观察免疫反应。蛋白质条带通过QuantityOne分析(加利福尼亚州赫科勒斯的伯乐实验室公司)来定量。
细菌侵入试验
通过抗生性保护试验来测定细菌侵入(Champaiboon等,2009.J.Biol.Chem.284:7078-90;Nisapakultorn等,2001.Infect.Immun.69:3692-3696)。简言之,将KB细胞(1.0-1.2×105细胞)在24孔板中接种过夜。然后,使细胞与单核细胞增多性李斯特菌ATCC10403S或鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028分别以100:1和1:1的感染复数(MOI)孵育。孵育两小时后,细胞单层用DPBS(密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))清洗,在补充有10%FBS包含100μg/mL庆大霉素(密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司)的MEM中孵育1.5小时,然后通过与无菌蒸馏水孵育15分钟来裂解细胞。将释放的细菌稀释,用旋转铺板仪(马里兰州贝赛斯达的旋转生物技术公司(SpiralBiotech))铺板,在37℃孵育过夜,然后在集落计数器(C-110,康涅狄格州恩菲尔的新布伦瑞克科学公司(NewBrunswickScientific))上对胞内细菌的集落形成单位(CFU)的数量进行计数。
体外毒理学试验
采用溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)试验(体外毒理学试验试剂盒,密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司),通过定量测定细胞活力来分析mRNA体外递送的毒性作用。简言之,以等同于培养基体积10%的量向各孔添加MTT溶液(5mg/ml)。然后,使细胞在37℃孵育两小时,以570nm的波长检测吸光度,然后,活细胞百分比计算为经转染细胞与未转染细胞的吸光度之比。
凋亡分析
为了评价细胞凋亡状态,如上所述在Western印迹中采用兔抗PARP评价经转染细胞的PARP切割,并且采用膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒(马萨诸塞州沃特顿的MBL国际公司(MBLInternationalCorp)),按照生产商建议,通过流式细胞术进行分析。在转染后至多72小时之内的若干时间点,细胞经胰蛋白酶处理,用内含2.5%FBS的PBS清洗,并在结合缓冲剂中与膜联蛋白V-FITC加碘化丙啶在室温下避光孵育5分钟。采用BectonDickinsonFACSCalibur流式细胞仪(加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学公司)利用CellQuest软件来分析染色的细胞,FITC信号定于FL1和碘化丙啶信号定于FL2。认为呈膜联蛋白-V-FITC染色阳性的细胞是凋亡细胞(Pelicano等,2003.J.Biol.Chem.278:37832-37839)。
统计分析
对各条件,进行并分析至少3~6个独立实验。为了分析平均值中的差异,采用Excel软件(华盛顿州雷蒙德的微软公司(Microsoft))进行斯氏t检验。
定量实时聚合酶链式反应分析
采用Trizol试剂(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司)和RNeasy加迷你试剂盒(加利福尼亚州巴伦西亚的凯杰公司(Qiagen)),分离出总RNA并用SuperscriptIII(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司)反转录。进行定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR),采用PrimeTime预设计的qRT-PCR试验(Hs.PT.42.1073747用于人CAMP,Hs.PT.42.3682141用于人S100A8,Hs.PT.42.3080635用于人S100A9,Hs.PT.45.227970.g用于人ACTB;加利福尼亚州圣何塞的IDT公司(IntegratedDeviceTechnology))。CAMP、S100A8、S100A9A8-IRES-A9和A8-nIRES-A9mRNA的表达水平针对ACTBmRNA标准化。
免疫荧光分析
CAMP、S100A8/S100A9mRNA转染16小时后,细胞用4%多聚甲醛固定10分钟,用PBS(pH7.4)清洗,然后用0.25%曲通X-100透化处理10分钟。在用内含1%BSA的PBS/0.1%吐温20封闭1小时并用PBS漂洗3次之后,细胞与小鼠抗钙卫蛋白(mAb27E10,sc-33714,加利福尼亚州圣克鲁兹的圣克鲁兹生物技术公司)或小鼠抗LL37(sc-166770,加利福尼亚州圣克鲁兹的圣克鲁兹生物技术公司)孵育一小时,然后用偶联AlexaFluor568的山羊抗小鼠IgG或偶联AlexaFluor488的山羊抗兔IgG(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司)孵育一小时。对于EGFPmRNA转染,不需要抗体孵育。用DAPI对核进行染色。荧光图像采用落射荧光显微系统捕获。还进行历时40小时的A8-IRES-A9和A8-nIRES-A9mRNA转染。
实施例2
细胞系与培养条件
人癌细胞系KB(ATCCCCL-17),呈S100A8/A9表达阴性,在极限必需培养基(MEM)中培养。内源表达S100A8/A9的人HNSCC细胞系TR146在达氏修正依氏培养基/汉氏F-12(DMEM/F-12)中培养。TR146细胞初始源自成熟分化的颊癌的颈部淋巴结转移(Rupniak等,1985.JNatlCancerInst75:621-635),并且受赠自德克萨斯州休斯顿的德克萨斯大学,M.D.Anderson癌症中心的ReubenLotan博士(Eicher等,1996.ClinCancerRes2:1659-1664)。MEM和DMEM/F-12培养基均补充有10%热失活胎牛血清(完全培养基),并且将细胞维持在37℃下的5%CO2中。各细胞系在使用之前通过qPCR测试为支原体阴性。
S100A8/A9在人癌细胞系中的稳定表达
如先前报道从KB细胞产生稳定转染癌细胞以表达S100A8/A9(KB-S100A8/A9,曾称为KB-MRP8/14),或转染伪对照载体(KB-EGFP)(Nisapakultorn等,2001.InfectImmun69:4242-4247)。简言之,KB细胞用哺乳动物表达载体:包含S100A8(MRP8)或S100A9(MRP14)亚基基因的pIRES-EGFP(加利福尼亚州帕罗阿尔托的克隆泰克公司(Clontech)),和可选择标志物pSV2-neo(G418硫酸酯抗性标志物基因)共转染。所得的细胞系,KBS100A8/A9,表达S100A8/A9蛋白复合物。KB-EGFP伪转染对照通过共转染无插入的pIRES-EGFP和pSV2-neo生成。使KBS100A8/A9和KB-EGFP保持在700μg/mlG418硫酸酯(遗传霉素,弗吉尼亚州马纳萨斯的密迪亚泰克公司(MediatechInc.))中。通过夹心型酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光,采用抗S100A8/A9异质二聚体特异性单克隆抗体27E10(宾夕法尼亚州普鲁士王的巴亨公司(Bachem))检验了经转染细胞中的胞质S100A8/A9表达。还进行了免疫共沉淀以确认蛋白质复合物的形成。
通过实时定量RT-PCR进行基因表达分析
从患有II期(T2N0M0)、III期(T3N0M0)和IVA期(T4N0M0)肿瘤(分别源自舌、喉和唾液腺)的三位患者切除人头颈鳞状细胞癌(HNSCC)和相匹配NAT的临床试样,分析这些试样中的S100A8和S100A9表达。来自三名HNSCC患者的肿瘤组织和NAT(不显示肿瘤细胞迹象)是在知情同意的条件下通过商业组织库(加利福尼亚州卡尔弗城的PG公司(ProteoGenex,Inc.)获得。肿瘤和NAT在切除后30分钟内快速冰冻,之后切片分析肿瘤细胞。采用Trizol,从包含至少70%肿瘤细胞的HNSCC试样区域和NAT提取RNA,并采用安捷伦生物分析仪(AgilentBioanalyzer)2100进行分析以控制质量。将来自各患者的肿瘤和NAT的总RNA分开汇集,反转录,并利用实时定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)用SYBR绿定量。
在另外的实验中,采用凯杰(Qiagen)RNeasy迷你试剂盒从KB和TR146细胞提取总RNA,采用NanoDrop分光光度计定量,并如上所述采用实时qRT-PCR对S100A8和S100A9特异性mRNA定量。
人HNSCC细胞系中S100A8/A9的稳定敲减
为了产生此前所述的S100A8/A9敲减克隆(TR146-shRNA-S100A8/A9KD)(Sorenson等,2012.MucosalImmunol.5:66-75),TR146细胞(具有内源S100A8/A9表达)用包含寡序列的GeneEraser短发夹RNA(shRNA)哺乳动物表达载体(德克萨斯州雪松溪的司查塔基公司(Stratagene))pGE-1转染,以产生针对S100A8和S100A9基因转录本的干扰shRNA。一些细胞用包含乱序(scrambled)shRNA的pGE-1对照载体转染,以产生S100A8和S100A9基因沉默克隆的阴性对照(TR146-shRNA-对照)。选择在250μg/mlG418硫酸酯存在下生长的克隆。S100A8/A9基因和蛋白质表达通过qRT-PCR和免疫印迹定量。
S100A8/A9阳性和阴性细胞的生长
为了测定锚着依赖性生长率,肿瘤细胞在无热原聚苯乙烯组织培养瓶上于完全培养基(见上文)中培养,通过胰蛋白酶消化来收取,并通过台盼蓝排除法计数。采用Vi-Cell细胞活力分析仪(加利福尼亚州富勒敦的贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter))确认计数。在标准软琼脂培养基(内含0.25%琼脂的完全培养基,铺板于0.5%固体琼脂顶上)中于37℃下的5%CO2中生长至多2.5周之后,通过对细胞集落进行逐一计数来确定锚着非依赖性生长。
细胞同步和细胞周期分析
KB、KB-EGFP和KB-S100A8/A9细胞以1×105细胞/mL的密度接种,并培养在先前所述的完全培养基中。为了同步在G1/S,70%融合度的细胞(培养约48小时)经历血清饥饿过夜,然后用内含3μg/ml阿非迪霉素的完全培养基阻滞12小时。为了释放G1/S阻滞并促进重新进入细胞周期,同步的细胞用不含钙和镁的达氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)清洗三次,以去除阿非迪霉素,并在含有10%FBS的新鲜培养基中培养。在从G1/S阻滞释放之后,在不同时间点收取细胞,在70%冰冷乙醇中固定,并在37℃用25μg/ml碘化丙啶(PI)溶液(包含1mg/mlRNA酶和内含0.1%曲通X-100的DPBS)对DNA染色30分钟。PI染色的DNA含量采用流式细胞术分析。还采用磷酸化组蛋白H3(Ser10)特异性多克隆抗体,通过免疫染色来对同步培养物中的有丝分裂细胞计数,该抗体由偶联PE的二抗检测,并按其它文献所述通过流式细胞术分析(Krutzik等,2003.CytometryA55:61-70)。
细胞裂解和蛋白质提取
以单层培养的癌细胞通过胰蛋白酶处理收取,用DPBS清洗两次,并在冰上用以1:100稀释补充有新鲜蛋白酶抑制剂混合物(Cat#P8340,密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇生物技术公司)的免疫沉淀裂解(IP)缓冲剂(50mMTris-HCl,pH7.5,150mMNaCl,1mMEDTA,1mMEGTA,1%曲通X-100,0.5%诺乃洗涤剂P-40,1mMNa3VO4,2mMNaF)裂解两小时。不溶性物质以15,000xg在4℃离心10分钟去除,收集上清液,通过BCATM蛋白质试验(伊利诺斯州洛克福特的皮尔斯生物技术公司(PierceBiotechnologyInc.))测定蛋白质浓度。
免疫印迹分析
蛋白质样品在1X样品缓冲剂(内含1%SDS的31.25mMTris-HCl,pH6.8,含有12.5%甘油、0.005%溴酚蓝和2.5%β巯基乙醇)中煮沸五分钟。如同指示,SDS-聚丙烯酰胺凝胶用50~100μg总蛋白质/孔上样,通过Bio-Rad(加利福尼亚州赫科勒斯的伯乐实验室公司)半干蛋白质转移装置转移至PVDF或硝化纤维素膜,用内含5%脱脂牛奶的TBS-T缓冲液(20mMTris-HClpH7.4,137mMNaCl,0.1%吐温-20)封闭过夜,然后用以1:1000稀释在封闭缓冲剂中的一抗室温孵育1小时。印迹随后清洗三次,每次用TBS-T清洗5分钟,随后用以1:3000稀释在封闭缓冲剂中的偶联有辣根过氧化物酶(HRP)的二抗再孵育1小时。检测细胞周期调控子的所有抗体购自圣克鲁兹生物技术公司(加利福尼亚州圣克鲁兹),例外是磷酸-PP2A-C(Tyr307)兔单克隆抗体(购自加利福尼亚州柏林格姆的宜百康公司(Epitomics,Inc.))。最后用TBS-T清洗三次,然后使印迹在ECLWestern印迹检测底物(新泽西州皮斯卡塔韦的安玛西亚生物科学公司(AmershamBiosciences))中孵育。通过暴光至KodakXAR-5X射线胶片来记录并分析化学发光条带。
免疫共沉淀
来自各细胞系的等量裂解物蛋白质与Ezview红蛋白质A亲和凝胶(蛋白质-A凝胶,西格玛-奥德里奇)一起孵育,以使非特异性结合最小化(预清理)。然后,使经过预清理的裂解物与5μg捕获抗体混合,并用TBS将体积调节至1mL。所述混合物在4℃伴随温和振荡孵育1小时,然后添加25μl的蛋白质-A凝胶,并在4℃伴随温和振荡再孵育1小时。然后,蛋白质-A-抗体-蛋白质复合物用冷的免疫沉淀裂解缓冲剂清洗三次,然后用1X样品缓冲剂(如上所述)从蛋白质-A凝胶洗脱。短暂离心后,上清液在沸水中孵育5分钟,并通过免疫印迹分析。对于14-3-3β:Cdc25C相互作用研究,小鼠抗14-3-3β用作共IP捕获抗体,而兔抗Cdc25C用于免疫印迹检测。小鼠抗S100A8/A9抗体27E10或抗S100A9和山羊抗PP2A-Aα抗体用于S100A8/A9和PP2A的免疫共沉淀。所有抗体购自圣克鲁兹生物技术公司。
通过冈田酸处理的PP2A抑制
KB、KB-EGFP和KB-S100A8/A9细胞以3×105细胞/孔的密度接种,并如上所述在完全培养基中孵育过夜。培养的细胞用包含10nM冈田酸(密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司)或载剂对照(DMSO)的新鲜培养基孵育24小时。细胞通过用冷DPBS清洗两次来收取,并且采用磷酸酶裂解缓冲液(50mMTris-HCl,pH7.5,150mMNaCl,1%脱氧胆酸钠,1%SDS,1%曲通X-100,1mMNa3VO4,2mMNaF和10%蛋白酶抑制剂)在冰上于孔中直接裂解。细胞裂解物在-80oC经历两次冻融循环,在4oC离心并收集上清液用于通过BCA定量蛋白质和进行免疫印迹。
PP2A磷酸酶活性试验
磷酸酶活性采用免疫沉淀磷酸酶试验试剂盒(Cat#17-313,马萨诸塞州比尔里卡的EMD密理博公司(EMDMillipore))进行。同步的细胞经收取,用DPBS洗涤两次,离心沉淀并重悬在补充有新鲜蛋白酶抑制剂混合物的IP裂解缓冲液(如上所述,但不含磷酸酶抑制剂,Na3VO4和NaF)中。新鲜细胞裂解物用于各反应。按照生产商的方案检测PP2A磷酸酶活性。简言之,100μg的总蛋白质(在IP裂解缓冲剂中调节浓度)与2μg的小鼠单克隆捕获抗体(PP2A,C亚基克隆1D6,EMD密理博公司)混合,同种型小鼠IgG2b用作对照,然后用pNPPSer/Thr试验缓冲剂(50mMTris-HCl,pH7.0,100μMCaCl2)将体积调节至500μl,之后恒速振荡在4℃孵育1小时。在孵育后,向各反应混合物添加25μl蛋白质A琼脂糖珠,并在4℃以恒速振荡继续再孵育1小时。然后,所述珠用TBS清洗三次,然后用Ser/Thr试验缓冲液清洗一次,并在Ser/Thr试验缓冲液中稀释的750μM苏氨酸磷酸肽(K-R-pT-I-R-R)溶液中30℃下恒速振荡孵育10分钟。采用孔雀石绿磷酸盐检测溶液(包含在试剂盒内)来检测释放的总无机磷酸盐(Pi)。
实施例3
细胞系
如先前的报道(Nisapakultorn等,2001.Infect.Immun.69:3692-3696),从KB细胞产生稳定转染以表达钙卫蛋白的上皮细胞(KB-S100A8/A9,曾称为KB-MRP8/14)或表达伪对照载体的上皮细胞(KB-EGFP)。简言之,KB细胞用哺乳动物表达载体:包含S100A8(MRP8)和S100A9(MRP14)钙卫蛋白亚基编码区域的pIRES-EGFP(加利福尼亚州帕罗阿尔托的克隆泰克公司),和可选择标志物pSV2-neo(G418硫酸酯抗性标志物)共转染。所得的细胞系KB-S100A8/A9表达钙卫蛋白复合物。KB-EGFP伪转染对照通过共转染无插入的pIRES-EGFP和pSV2-neo生成。KB-S100A8/A9和KB-EGFP均维持在补充有10%胎牛血清(FBS)的内含700μg/mlG418硫酸酯(遗传霉素,弗吉尼亚州马纳萨斯的密迪亚泰克公司)的MEM(CELLGRO,弗吉尼亚州马纳萨斯的密迪亚泰克公司)中,并保持在37℃的5%CO2下。在所有实验之前,使细胞在含有10%FBS但不含G418的MEM(完全培养基)中保持两天。
TR146细胞是获自德克萨斯州休斯顿的MDAnderson癌症中心的ReubenLotan博士的颊癌细胞系。细胞如上所述在无G418的环境下培养。采用标准方法,对一些细胞稳定转染shRNA以抑制S100A8/A9的表达或生成,或稳定转染拟转染对照。
口底肿瘤形成的动物模型
6~8周龄的雌性01N70品系[Cr:NIH(S)-nu/nu裸]小鼠经豢养并自由饲喂食物和水,这些小鼠处于特定无病原体条件下的小隔离笼中(microisolatorcage),施加12小时昼夜周期。采用内含5%异氟烷的O2,以2Lmin-1麻醉动物。使KB(1×105)或TR146(5×104)细胞或经转染衍生细胞悬浮在100μl1:1达氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)/基质胶(MATRIGEL,加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学公司)中,并原位注射入口底。监测动物直至其开始走动,并在实验过程中每日检查。在注射后第17天,小鼠用CO2安乐死。收集包含肿瘤的口腔组织,在DPBS中漂洗,保存在10%福尔马林溶液中,石蜡包埋并用苏木精和曙红(马里兰州日耳曼敦的组织服务公司(HistoservInc))染色用于组织学分析。
结果示于图13。
实施例4
按照实施例1中的描述从pGEM4Z.2bgUTR.150A扩增模板,其中添加25%2-硫尿核苷,添加25%5-甲基胞苷,并且采用mMESSAGEmMACHINET7Ultra试剂盒(Ambion,纽约州格兰德岛的生命技术公司),合成带有ARCA加帽的mRNA。细胞用TransIT-mRNA试剂盒(威斯康星州麦迪逊的Mirus生物有限责任公司)转染。临转染实验之前从三位供者收集唾液,汇集,以12,000×g离心五分钟以去除颗粒物,然后将所得唾液上清液用于所有实验。
唾液经稀释以显示剂量效应关系,并与上皮细胞培养物孵育1分钟、3分钟或5分钟。在一些实验中,清洗经唾液处理的细胞以逆转该处理。唾液处理之后,经清洗或不经清洗的细胞立刻用EGFPmRNA转染。mRNA转染后16小时,细胞用4%多聚甲醛固定10分钟,然后用DAPI对核染色。采用落射荧光显微镜捕捉荧光图像。结果示于图15和图16。
实施例5
牙周炎动物模型和S100A8/A9mRNA处理的功效
评价S100A8/A9-/-的野生型C57BL/6小鼠、上皮组织特异性表达人S100A8/A9的S100A8/A9-/-小鼠或接受局部施加S100A8/A9mRNA转染至牙龈上皮的S100A8/A9-/-小鼠对牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)诱导的牙周炎的易感性。
牙龈卟啉单胞菌的口腔感染
ATCC53977(A7A1-28)(Costalonga,等,2009,JPeriodontalRes44:537-542)诱导的骨破坏程度大于其它牙龈卟啉单胞菌株系(Baker,等,2000,OralMicrobiolImmunol15:27-32)。为了建立口腔感染,小鼠用抗生素预处理,并通过口腔管饲法饲喂内含4×109CFU的2%羧甲基纤维素或对照小鼠乳杆菌(L.murinus),分六个食程,相隔四天,如先前所述(Costalonga等,2009,JPeriodontalRes44:537-542)。小鼠乳杆菌不造成牙周骨损失或炎症。通过在首次管饲和50天之后对小鼠的口腔取样来测试牙龈卟啉单胞菌和小鼠乳杆菌定殖。
采用的动物
C57BL/6J小鼠(缅因州巴尔港的杰克森实验室公司(TheJacksonLaboratory))通过口腔管饲法接种牙龈卟啉单胞菌ATCC53977。所有小鼠豢养在特定的无病原体(SPF)AAALAC-级设施中。基于先前的统计效力计算,接受各处理或对照(伪)的21只小鼠足以用90%的统计效力测定牙龈卟啉单胞菌ATCC53977感染的和伪感染的小鼠之间牙周骨损失程度10-15%的差异(α设定为0.05)。
炎症检测
按照描述(Costalonga等,2009,JPeriodontalRes44:537-542),在0天和50天收取上颌骨和下颌骨,在中线处切开并分离以获得四份试样。来自各实验组或处理组的14块右半下颌骨和半上颌骨中的七块在4%多聚甲醛中固定并在pH8的10%EDTA中脱钙一周。按照描述(Sato,等,1986,AmJPathol125:431-435)将试样包埋在石蜡中,并用苏木精-曙红染色或冷冻在OCT中,然后处理以进行免疫细胞的免疫荧光鉴定。
为了表征临间组织的细胞性质,所有三个臼齿(molar)经中远侧切割7μm尖冠切下试样。通过牙骨质-牙釉质接合处的接合上皮的炎性核和顶端迁移的各自优势来鉴定炎性和附着丧失的存在。
从颌回收细菌
14块右半下颌骨和半上颌骨中的另七块在收取之后立即用于从牙龈上皮回收细菌,所述回收通过从骨脱去组织或通过用分散酶处理颌部以从结缔组织消化上皮层来进行。或者,使颌部在预还原(pre-reduced)的培养基中均质化。将一部分铺板在厌氧室中的血琼脂上,并对CFU计数。还采用一等分样,通过对匀浆进行qPCR,评估牙龈卟啉单胞菌和小鼠乳杆菌的水平。
齿槽骨损失测定
左半下颌骨和半上颌骨用解剖刀轻柔剔除肉。颌部在蒸馏水中煮沸10分钟,在1NNaOH中放置三小时以去除余留的角化牙龈,最后用1%亚甲蓝染色1分钟。剔除肉的半下颌骨和半上颌骨以舌状一侧朝上装在柔韧模具上,并按描述(Costalonga,等,2009,JPeriodontalRes44:537-542)在装有数码相机的立体显微镜下以40倍放大倍数拍照。为了使样品物镜角度相关的图像失真最小化,将半下颌骨和半上颌骨的舌侧视图标准化使得颊中尖端的远缘和舌中尖端的远缘之间的投影面积是10,000±500像素。对拍过照的颌部进行检测,在AdobePhotoshop(加利福尼亚州圣何塞的奥多比系统公司(AdobeSystems,Inc.))中采用标准化栅格,从各三颗臼齿的牙骨质-牙釉质接合处(CEJ)到齿槽骨缘进行测定。按照先前所述(Costalonga,等,2009,JPeriodontalRes44:537-542),根据可见根柱的表面积中的像素数量来间接地测定齿槽骨水平变化。
此外,采用微型计算机断层扫描术(CT)来评估一些颌部。
分析
四个独立组:C57BL/6小鼠和S100A8/A9-/-小鼠中(牙龈卟啉单胞菌感染的、小鼠乳杆菌感染对照)的骨面积测定均值用作方差分析中的应变量。检测方法的灵敏度允许以90%效力检测顶骨水平的10%变化。
类似地,比较S100A8/A9存在和不存在的情况下,一般细菌的生长和特定的牙龈卟啉单胞菌和对照小鼠乳杆菌的生长。
半定量地估计炎症。
为了评价采用人S100A8/A9上皮特异性拯救(rescue)的C57BL/6野生型和S100A8/A9-/-小鼠对牙周炎的易感性,用牙龈卟啉单胞菌或对照小鼠乳杆菌感染野生型C57BL/6(鼠S100A8/A9+/+)小鼠、S100A8/A9-/-小鼠和通过敲入(knock-in)人上皮特异性S100A8和S100A9来拯救的S100A8/A9-/-小鼠。C57BL/6背景的小鼠中的S100A8/A9无效突变采用将多基因引入小鼠的系统,利用转座子可整合的多基因载体(Moriarity等,2013,NucleicAcidsRes41:e92)拯救。采用该系统,能够把包含S100A8和S100A9的编码区域的多基因载体靶向ROSA26基因座(Soriano,P..1999,NatureGenetics21:70-71)与K14启动子一同敲入。因此,所述敲入仅在上皮细胞中表达。人S100A9的表达能够允许小鼠S100A8在S100A8/A9-/-小鼠中翻译,因为小鼠S100A8不与人S100A9复合形成杂合异质二聚体(Propper等,1999,JBiolChem274:183-188)。
如上所述,采用牙龈卟啉单胞菌作为病原体,小鼠乳杆菌作为共生非病原性对照,比较三种小鼠品系的牙周炎表现。野生型C57BL/6(鼠S100A8/A9+/+)和人上皮特异性敲入(S100A8/A9-/-背景)品系中的牙周炎表现类似。S100A8/A9-/-小鼠显示最大量的牙槽骨损失。
该实验显示,S100A8和S100A9的编码区域是抵抗牙周炎的先天免疫因子。比较这三个品系在建立牙周炎之前和之后的软组织组织病理学,确认人和鼠S100A8/A9在齿龈上皮中的定位,和S100A8/A9-/-小鼠感染后的上皮完整性损失。
人上皮特异性S100A8/A9的敲入
采用可整合的多基因载体(Moriarity等,2013,NucleicAcidsRes41:e92)将上皮特异性S100A8/A9敲入S100A8/A9-/-ES细胞,该载体靶向ROSA26基因座。使lox-停-lox盒处于K14启动子和包含人S100A8和S100A9编码区域的多基因载体之间。(人S100A8/A9自发地在上皮细胞中形成复合物(Champaiboon等,2009,JBiolChem284:7078-7090))。使角蛋白14-CRE小鼠纯合体和多基因(S100A8和S100A9)cre条件等位基因小鼠纯合体杂交以产生实验小鼠。成功杂交的小鼠上皮组织中表达S100A8/A9。本文描述为S100A8/A9-/-的小鼠实际是S100A9-/-,表达S100A8mRNA但不表达S100A8蛋白质的小鼠(Hobbs等,2003,MolCellBiol23:2564-2576;Manitz等,2003,MolCellBiol23:1034-1043)。鼠S100A8/A9保持完整,从而S100A8/A9的过表达仅来自其中接入LoxP(floxed-in)的人蛋白质。
牙周炎评估
采用上述方法和方式,在实验起始时和初始接种之后50天评价炎症,并检测牙龈卟啉单胞菌感染的、野生型、S100A8/A9-/-和人S100A8/A9敲入的(S100A8/A9-/-背景)组的上皮牙龈卟啉单胞菌感染和齿槽骨水平。数据与各背景的小鼠乳杆菌感染的(对照)小鼠做比较以确定S100A8/A9在抵抗牙龈卟啉单胞菌感染中的作用。
分析
骨面积检测值的平均数用作六个独立组中的方差分析的应变量,所述六个独立组是:(牙龈卟啉单胞菌感染的,对照小鼠乳杆菌感染的)C57BL/6小鼠、S100A8/A9-/-小鼠和人S100A8/A9拯救的小鼠(S100A8/A9-/-背景)。检测方法的灵敏度允许以90%效力检测顶骨水平中的10%变化。类似地,比较S100A8/A9存在和不存在的情况下,上皮中一般细菌的生长和特定的牙龈卟啉单胞菌和对照小鼠乳杆菌的生长。
半定量地评估炎症。
为了评价具有或不具有局部施加至齿龈的S100A8/A9mRNA的C57BL/6S100A8/A9-/-小鼠的牙周炎易感性,采用牙龈卟啉单胞菌或对照小鼠乳杆菌感染野生型(鼠S100A8/A9+/+)小鼠、S100A8/A9-/-小鼠和通过局部施用包装的人S100A8/A9mRNA拯救的S100A8/A9-/-小鼠。上皮细胞可用S100A8和S100A9特异性的mRNA转染,以表达所述两种蛋白质,并形成抗微生物S100A8/A9复合物(Zou等,2013,InfectImmun81:3975-3983)。该转染系统基本是局部的。向上皮表面直接添加包装的mRNA,该mRNA被摄取进入上皮细胞,新S100A8和S100A9蛋白在相同细胞中共同表达,并提高了对于细菌病原体入侵的抵抗。
对于体内实验,从小鼠口腔上皮清洗掉唾液以减少对摄取包装的mRNA的唾液屏障。该上皮经空气干燥,然后采用高强度喷雾器将包装的mRNA直接施加至齿-齿龈界面,基本按照用于肺部的描述进行(Kormann等,2011,NatureBiotechnology29:154-157;Mays等,2013,JClinInvest123:1216-1228)。该喷雾器配有窄孔径针头以能够将mRNA导向至所需界面。
在各次施用牙龈卟啉单胞菌之前一天,将S100A8/A9mRNA施加至齿龈,以使实验方案干扰最小化。如上所述,比较采用牙龈卟啉单胞菌作为病原体和小鼠乳杆菌作为共生非病原性对照的三种条件的小鼠的牙周炎表现。在野生型(鼠S100A8/A9+/+)和通过局部施予包装的人S100A8/A9mRNA拯救的S100A8/A9-/-小鼠中,牙周炎明显类似。S100A8/A9-/-小鼠显示最大量的齿槽骨损失。
该实验证实,S100A8和S100A9是齿龈上皮抵抗牙周炎的先天免疫因子。比较这三种条件下的小鼠在建立牙周炎之前和之后的软组织组织病理学,确认人和鼠S100A8/A9在齿龈上皮中的定位,和S100A8/A9-/-小鼠感染后上皮完整性的损失。
分析
骨面积检测值的平均数用作六个独立组中的方差分析的应变量,所述六个独立组是:(牙龈卟啉单胞菌感染的、对照小鼠乳杆菌感染的)野生型(鼠S100A8/A9+/+)小鼠、S100A8/A9-/-小鼠和通过局部施用包装的人S100A8/A9mRNA拯救的S100A8/A9-/-小鼠。分析如上所述。
示例性实施方式
实施方式1.一种方法,包括:
将参与抑制细胞增殖的多肽的编码mRNA引入上皮细胞;和
允许所述细胞足量表达所述多肽以有效降低所述细胞在锚着非依赖性环境中增殖的可能性。
实施方式2.如实施方式1所述的方法,其中,所述多肽包括钙卫蛋白、S100A8或S100A9。
实施方式3.一种方法,包括:
将参与先天免疫的多肽的编码mRNA引入细胞;和
允许所述细胞表达足量的所述多肽以有效降低所述细胞被病原体感染的可能性。
实施方式4.如实施方式3所述的方法,其中,所述多肽包括普抑素抗微生物蛋白(CAMP)、钙卫蛋白、S100A8、S100A9、β-防御素、S100A7、分泌性白细胞抑制剂、脂质运载蛋白2或溶菌酶。
实施方式5.如前述实施方式中任一项所述的方法,其中,所述mRNA包含稳定化部分。
实施方式6.如实施方式5所述的方法,其中,所述稳定化部分包含5'帽。
实施方式7.如实施方式5所述的方法,其中,所述稳定化部分包含3'延伸。
实施方式8.如任何前述实施方式所述的方法,其中,所述细胞是粘膜上皮细胞。
实施方式9.如实施方式3-8中任一项所述的方法,其中所述方法还包括允许细胞暴露于所述病原体。
实施方式10.如实施方式3-9中任一项所述的方法,其中,所述病原体包括细菌。
实施方式11.如实施方式10所述的方法,其中,所述细菌包括生痰二氧化碳噬纤维菌(Capnocytophagasputigena)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、葡萄球菌(Staphylococcusspp.)、链球菌(Streptococcusspp.)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)、福赛斯坦纳菌(Tannerellaforsythia)、齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)、铜绿假单孢菌(Pseudomonasaeruginosa)、衣原体(Chlamydiaspp.)、奈瑟氏菌(Neisseriaspp.)、加德纳菌(Gardnerellaspp.)或毛滴虫(Trichomonasspp.)。
实施方式12.如实施方式3-9中任一项所述的方法,其中,所述病原体包括真菌。
实施方式13.如实施方式12所述的方法,其中,所述真菌包括真菌白色念珠菌(Candidaalbicans)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)或曲霉(Aspergillusspp.)。
实施方式14.如实施方式3-13中任一项所述的方法,其中,所述细胞是患有或有风险患上由所述病原体感染所致病症的对象的细胞。
实施方式15.如实施方式14所述的方法,其中,所述病症包括癌症。
实施方式16.如任何前述实施方式所述的方法,其中,所述方法还包括,在向所述细胞引入mRNA之前,清洗所述细胞以从所述细胞去除粘膜液体。
实施方式17.如实施方式16所述的方法,其中,所述粘膜液体包括唾液。
实施方式18.一种组合物,其包含:
mRNA,其编码在上皮细胞中抑制细胞增殖的多肽;和
体内递送载剂。
实施方式19.如实施方式18所述的组合物,其中,所述多肽包括钙卫蛋白、S100A8或S100A9。
实施方式20.如实施方式18或实施方式19所述的组合物,其中,当所述上皮细胞在锚着非依赖性环境中生长时,所述多肽抑制上皮细胞的细胞增殖。
实施方式21.一种组合物,其包含:
mRNA,其编码参与先天免疫的多肽;和
体内递送载剂。
实施方式22.如实施方式21所述的组合物,其中,所述多肽包括普抑素抗微生物蛋白(CAMP)、钙卫蛋白、S100A8、S100A9、β-防御素、S100A7、分泌性白细胞抑制剂、脂质运载蛋白2或溶菌酶。
实施方式23.如实施方式18-22中任一项所述的组合物,其中,所述mRNA包含稳定化部分。
实施方式24.如实施方式23所述的组合物,其中,所述稳定化部分包含5'帽。
实施方式25.如实施方式23所述的组合物,其中,所述稳定化部分包含3'延伸。
本文中引用的所有专利、专利申请和公开文本,以及电子可获得的材料(包括例如,向例如GenBank和RefSeq提交的核苷酸序列,和向例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中提交的氨基酸序列,和从GenBank和RefSeq中的带注释编码区域所翻译的氨基酸序列)均通过引用其全文纳入本文。在本申请公开内容和通过引用纳入本文的任何文件的公开内容之间存在任何矛盾的情况下,以本申请公开内容为准。仅出于理解清楚的目的提供上文中的发明详述和实施例。不应从中理解得到不必要的限制。本发明不限于显示和描述的确切细节,因为本领域技术人员显见的变化将包括在本发明权利要求的限定范围内。
除非另有说明,本说明书和权利要求书所用的表示各成分含量、分子量等等的所有数值应理解为在所有情况下均被术语“约”修饰。因此,除非有相反的说明,否则,在本说明书和权利要求书中所述的数值参数是近似值,可根据本发明试图获得的所需性质而变化。丝毫不是为了限制等同原则对权利要求范围的适用,每个数值参数至少应根据所记录的有效数字的位数并考虑到常用四舍五入规则的运用来进行解释。
虽然限定本发明宽泛范围的数值范围和参数是近似值,但是具体实施例中列出的数值是尽可能准确记录的。然而,所有数值不可避免地包含由其各自的测量过程中存在的标准偏差所必然造成的范围。
除非另有说明,所有标题均出于方便于读者的目的,而不应被用于限制标题之后的内容的表意。
Claims (25)
1.一种方法,包括:
将参与抑制细胞增殖的多肽的编码mRNA引入上皮细胞;和
允许所述细胞足量表达所述多肽以有效降低所述细胞在锚着非依赖性环境中增殖的可能性。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述多肽包括钙卫蛋白、S100A8或S100A9。
3.一种方法,包括:
将参与先天免疫的多肽的编码mRNA引入细胞;和
允许所述细胞足量表达所述多肽以有效降低所述细胞被病原体感染的可能性。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述多肽包括普抑素抗微生物蛋白(CAMP)、钙卫蛋白、S100A8、S100A9、β-防御素、S100A7、分泌性白细胞抑制剂、脂质运载蛋白2或溶菌酶。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于,所述mRNA包含稳定化部分。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述稳定化部分包含5'帽。
7.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述稳定化部分包含3'延伸。
8.如任一前述权利要求所述的方法,其特征在于,所述细胞是粘膜上皮细胞。
9.如权利要求3-8中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法还包括允许所述细胞暴露于所述病原体。
10.如权利要求3-9中任一项所述的方法,其特征在于,所述病原体包括细菌。
11.如权利要求10所述的方法,其中,所述细菌包括生痰二氧化碳噬纤维菌(Capnocytophagasputigena)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、葡萄球菌(Staphylococcusspp.)、链球菌(Streptococcusspp.)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)、福赛斯坦纳菌(Tannerellaforsythia)、齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)、铜绿假单孢菌(Pseudomonasaeruginosa)、衣原体(Chlamydiaspp.)、奈瑟氏菌(Neisseriaspp.)、加德纳菌(Gardnerellaspp.)或毛滴虫(Trichomonasspp.)。
12.如权利要求3-9中任一项所述的方法,其特征在于,所述病原体包括真菌。
13.如权利要求12所述的方法,其中,所述真菌包括真菌白色念珠菌(Candidaalbicans)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)或曲霉(Aspergillusspp.)。
14.如权利要求3-13中任一项所述的方法,其特征在于,所述细胞是患有或有风险患上由所述病原体感染所致病症的对象的细胞。
15.如权利要求14所述的方法,其中,所述病症包括癌症。
16.如任一前述权利要求所述的方法,其特征在于,所述方法还包括,在向所述细胞引入所述mRNA之前,清洗所述细胞以从所述细胞去除粘膜液体。
17.如权利要求16所述的方法,其特征在于,所述粘膜液体包括唾液。
18.一种组合物,其包含:
mRNA,其编码在上皮细胞中抑制细胞增殖的多肽;和
体内递送载剂。
19.如权利要求18所述的组合物,其特征在于,所述多肽包括钙卫蛋白、S100A8或S100A9。
20.如权利要求18或权利要求19所述的组合物,其特征在于,当所述上皮细胞在锚着非依赖性环境中生长时,所述多肽抑制上皮细胞的细胞增殖。
21.一种组合物,其包含:
mRNA,其编码参与先天免疫的多肽;和
体内递送载剂。
22.如权利要求21所述的组合物,其特征在于,所述多肽包括普抑素抗微生物蛋白(CAMP)、钙卫蛋白、S100A8、S100A9、β-防御素、S100A7、分泌性白细胞抑制剂、脂质运载蛋白2或溶菌酶。
23.如权利要求18-22中任一项所述的组合物,其特征在于,所述mRNA包含稳定化部分。
24.如权利要求23所述的组合物,其特征在于,所述稳定化部分包含5'帽。
25.如权利要求23所述的组合物,其特征在于,所述稳定化部分包含3'延伸。
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Legal Events
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160406 |