CN107841508A - 含抑铁素重组减毒沙门杆菌及构建方法、表达或递送载体 - Google Patents

含抑铁素重组减毒沙门杆菌及构建方法、表达或递送载体 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种含抑铁素重组减毒沙门杆菌及构建方法、表达或递送载体，用LB培养基培养沙门杆菌，制备感受态细菌；将质粒电转化SL7207，在含Zeocin抗性的培养基中获取阳性克隆，制备相应的rSL7207；用rSL7207感染RAW264.7细胞，分别检测抑铁素在MΦ中的表达。本发明实验结果显示rSL7207有效杀伤感染巨噬细胞的BCG，为后续治疗性抗结核疫苗提供了坚实的实验基础；重组减毒沙门杆菌rSL7207感染巨噬细胞后成功表达抑铁素；rSL7207可以有效的杀伤感染巨噬细胞的BCG。后续拟建立小鼠BCG感染模型，更加全面的评估rSL7207在治疗结核感染中的作用。

Description

含抑铁素重组减毒沙门杆菌及构建方法、表达或递送载体
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种含抑铁素重组减毒沙门杆菌及构建方法、表达或递送载体。
背景技术
结核病是严重威胁人类健康的疾病，感染者约占全球总人口的三分之一。据WHO最新全球结核病控制报告的数据表明，2016年约有900万新发病例，150万人死亡，死亡人数居单一传染病之首，而我国的结核病患者人数居全球第二位。目前结核病防治工作中存在几大难题：①大量潜伏感染者：结核分枝杆菌(Mtb)为细胞内寄生菌，感染主要寄生于巨噬细胞(MΦ)内，并通过其逃逸机制逃避免疫杀伤，在MΦ内长期存活而造成持留(persist)。为杀灭少量的持留菌需维持化疗5个月以上，易造成结核病治疗后的复发，同时也是耐药菌产生的重要原因之一。②多耐菌株(MDR)的流行：据WHO最新全球结核病控制报告2016年有48万耐药结核的新发病例，只有13.6万检测出携有MDR株。耐多药结核病的病程短，死亡率高，控制和治疗困难。③免疫低下人群的合并感染：各种原因(如HIV感染、衰老、肿瘤)所致的免疫低下人群合并感染结核病的情况增多，特别是HIV的感染是最具危险的因素。卡介苗(BCG)是目前预防结核病最有效的疫苗，其保护效果约为80％-0％，因地区、人群不同而异。目前结核病发病率的上升趋势已使人们质疑BCG的效果，寻求新型结核病防治手段已成当务之急。MΦ是Mtb寄生和潜伏的场所，也是抗Mtb感染的主要效应细胞。首先，MΦ是Mtb感染的第一道防线，通过吞噬作用杀灭Mtb，参与固有免疫。其次，作为抗原提呈细胞将Mtb有效抗原成分提呈给T细胞，启动适应性免疫。最后在免疫效应阶段，受多种细胞因子活化，作为主要效应细胞参与对Mtb的杀灭。因此，MΦ是抗Mtb感染中最重要的细胞。但同时MΦ是Mtb寄生和潜伏的场所，为Mtb繁殖提供所需的生长环境。铁是Mtb必不可少的营养元素，Mtb能分泌转铁体到吞噬体外摄取铁，以维持其生存。目前针对结核病的重组减毒沙门杆菌是将重要的保护性抗原如Ag85B，Ag85A，以及ESAT-6、CFP-10等的编码基因引入减毒沙门杆菌，这些对策都是围绕Mtb暴露前的预防性疫苗，而暴露后的治疗性疫苗研究则是未来的发展趋势。
综上所述，现有技术存在的问题是：目前结核病防治方法存在大量潜伏感染者，多耐菌株(MDR)的流行，免疫低下人群的合并感染；潜伏感染者，在没有发病的时候，结核杆菌是潜伏在人体内的巨噬细胞内的，此时用现在的抗结核药物是没有效果的。耐菌株(MDR)的流行，用目前的抗生素也是效果不好的。潜伏感染需要靶向递送抗结核的药物到巨噬细胞内，而沙门菌可以靶向递送抑铁素到巨噬细胞内，杀灭潜伏的结核杆菌和多耐药的菌株目前的疫苗主要是预防性疫苗对潜伏感染者无效，而本发明是治疗性疫苗，可以有效治疗大量潜伏感染者。同时，目前多耐菌株(MDR)的流行，需要新的药物靶点，而本发明中的抑铁素是一种新的抗结核的蛋白，还没有耐药的发生，可以有效的抗结核。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种含抑铁素重组减毒沙门杆菌及构建方法、表达或递送载体。
本发明是这样实现的，一种含抑铁素的质粒，所述含抑铁素的质粒为pBudCE4.1-Sid。
本发明的另一目的在于提供一种所述含抑铁素的质粒的构建方法，所述含抑铁素的质粒的构建方法包括：取鼠粒细胞抽提细胞总RNA，逆转录后用高保真酶、引物进行PCR扩增，获得抑铁素基因目标序列，并克隆入pBudCE4.1质粒中构建pBudCE4.1-Sid。
本发明的另一目的在于提供一种由所述含抑铁素的质粒构建的含抑铁素重组减毒沙门杆菌。
进一步，所述含抑铁素重组减毒沙门杆菌的构建方法包括：
步骤一，用LB培养基培养沙门杆菌，制备感受态细菌；
步骤二，将质粒电转化SL7207，在含Zeocin抗性的培养基中获取阳性克隆，制备相应的rSL7207；
步骤三，用rSL7207感染RAW264.7细胞，分别检测抑铁素在MΦ中的表达。
本发明的另一目的在于提供一种由所述含抑铁素重组减毒沙门杆菌制备的表达载体。
本发明的另一目的在于提供一种由所述含抑铁素重组减毒沙门杆菌制备的递送载体。
本发明构建的重组减毒沙门杆菌rSL7207感染巨噬细胞后成功表达抑铁素，细胞水平实验结果显示rSL7207可以有效的杀伤感染巨噬细胞的BCG，为后续治疗性的抗结核疫苗提供了坚实的实验基础；重组减毒沙门杆菌rSL7207感染巨噬细胞后成功表达抑铁素；rSL7207可以有效的杀伤感染巨噬细胞的BCG。后续拟建立小鼠BCG感染模型，在机体水平评价该rSL7207的治疗作用，更加全面的评估rSL7207在治疗结核感染中的作用。本发明一是用沙门菌作为载体递送抗结核的抑铁素靶向进入结核杆菌的生存环境巨噬细胞内，更有效的，更有目标性的杀灭结核杆菌。二是，目前耐药株的流行，给结核的治疗带来了巨大的挑战，需要一种新的治疗思路。而本发明中的抑铁素是从固有免疫的角度入手，避免了耐药性的发生，可以用一种全新的思路来抗结核。重组减毒沙门杆菌rSL7207感染巨噬细胞后成功表达抑铁素，说明重组沙门菌可以靶向进入巨噬细胞内，同时所携带的抑铁素基因可以在巨噬细胞内表达，从而发挥其抑制铁摄取的作用，最终抑制分支杆菌的生长。从表1可以看出包含抑铁素基因的重组沙门菌可以有效的抑制巨噬细胞内的BCG分支杆菌的生长，与对照组相比具有显著的统计学意义，说明抑铁素通过抑制BCG分支杆菌对铁元素的摄取，发回来较强的杀灭分支杆菌的作用。
本发明为卫计委课题：携带抑铁素基因的抗结核治疗性重组卡介苗实验研究2015MSXM081；科委课题：调节铁代谢抗结核感染实验研究cstc2016jcyjA0277。
附图说明
图1是本发明实施例提供的含抑铁素重组减毒沙门杆菌的构建方法流程图。
图2是本发明实施例提供的含有抑铁素的重组质粒PbudCE4.1-sid，PCR鉴定及测序鉴定示意图；
图中(a)PCR鉴定；(b)测序鉴定。
图3是本发明实施例提供的合成重组减毒沙门杆菌rSL7207的PCR鉴定结果，及测序鉴定结果示意图；
图中(a)PCR鉴定；(b)测序鉴定。
图4是本发明实施例提供的重组减毒沙门杆菌SPbudce4.1和对照减毒沙门杆菌SL7207感染巨噬细胞示意图。
图5是本发明实施例提供的重组减毒沙门杆菌rSL7207和对照SL7207感染巨噬细胞示意图。
图6是本发明实施例提供的指标检测于加样后24h取样进行检测示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明成功构建含抑铁素的质粒pBudCE4.1-Sid,得到其在巨噬细胞内的表达及作用。用重组质粒pBudCE4.1-Sid转染减毒沙门杆菌SL7207，成功制备rSL7207，并在细胞水平观察到其对BCG的杀伤作用。通过实验结果得出，重组减毒沙门杆菌rSL7207感染巨噬细胞后成功表达抑铁素。rSL7207可以有效的杀伤感染巨噬细胞的BCG。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的含抑铁素重组减毒沙门杆菌的构建方法包括以下步骤：
S101：取鼠粒细胞抽提细胞总RNA，逆转录后用高保真酶、引物进行PCR扩增，获得抑铁素基因目标序列，并克隆入pBudCE4.1质粒中构建pBudCE4.1-Sid；
S102：用LB培养基培养沙门杆菌，并制备感受态细菌；
S103：将质粒电转化SL7207，在含Zeocin抗性的培养基中获取阳性克隆，制备相应的rSL7207；
S104：用rSL7207感染RAW264.7细胞，分别用qRT-PCR、Western Blot等方法检测抑铁素在MΦ中的表达。
下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述。
1)抑铁素质粒pBudCE4.1-Sid的构建及在MΦ内的表达
①取鼠粒细胞抽提细胞总RNA，逆转录后用高保真酶、引物进行PCR扩增，获得抑铁素基因目标序列，并克隆入pBudCE4.1质粒中构建pBudCE4.1-Sid。
2)rSL7207-pBudCE4.1-Sid的构建
①用LB培养基培养沙门杆菌，并制备感受态细菌。
②将质粒电转化SL7207，在含Zeocin抗性的培养基中获取阳性克隆，制备相应的rSL7207。
③用rSL7207感染RAW264.7细胞，分别用qRT-PCR、Western Blot等方法检测抑铁素在MΦ中的表达。
3)检测rSL7207在细胞水平抗Mtb感染的效果
①感染：取小鼠骨髓来源的巨噬细胞株RAW264.7细胞，用IFN-γ刺激活化后在培养的MΦ中按1:1加入BCG，温育、洗涤，青霉素处理以去除细胞外非特异黏附菌。
②分组:(A):MΦ+BCG
(B):MΦ+BCG+SL7207
(C):MΦ+BCG+rSL7207
③各项指标检测：于加样后24h取样在7H10上涂板，进行BCG计数。
2、结果
图2含有抑铁素的重组质粒PbudCE4.1-sid，PCR鉴定及测序鉴定。
图3合成重组减毒沙门杆菌rSL7207的PCR鉴定结果，及测序鉴定结果。
图4重组减毒沙门杆菌SPbudce4.1和对照减毒沙门杆菌SL7207感染巨噬细胞，24h收样提取RNA后进行qRT-PCR后显示重组减毒沙门杆菌抑铁素表达水平升高。
图5重组减毒沙门杆菌rSL7207和对照SL7207感染巨噬细胞，24h后提蛋白进行WesternBlot的结果。a为SL7207感染巨噬细胞提蛋白，b为rSL7207感染巨噬细胞提蛋白。P<0.05,rSL7207感染巨噬细胞比对照组的抑铁素表达高。
图6取小鼠骨髓来源的巨噬细胞株RAW264.7细胞，用IFN-γ刺激活化后在培养的MΦ中按1:1加入BCG，温育、洗涤，庆大霉素处理以去除细胞外非特异黏附菌。各项指标检测于加样后24h取样进行检测。分组为MΦ+BCG，MΦ+BCG+rSL7207-pBudCE4.1-Sid，MΦ+BCG+SL7207。由图可看出，BCG的数量随着重组减毒沙门杆菌rSL7207的加入减少(见表1)。
表1
BCG BCG+SL7207 BCG+rSL7207
9530 8516 864
9386 8384 673
8593 8188 533
本发明成功构建了含抑铁素的重组减毒沙门杆菌，并且在巨噬细胞内成功表达。由细胞感染实验结果可以推论抑铁素在细胞水平可以抑制分枝杆菌BCG的生长。沙门氏菌可诱导Th1和Th2混合的模式，所以兼性胞内菌沙门杆菌经过分子生物学技术改造后可作为外源基因的表达或递送载体。以减毒沙门杆菌SL7207为抑铁素载体对感染的BCG起到杀伤作用。为暴露后的治疗性疫苗研究打下基础。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种含抑铁素的质粒，其特征在于，所述含抑铁素的质粒为pBudCE4.1-Sid。
2.一种如权利要求1所述含抑铁素的质粒的构建方法，其特征在于，所述含抑铁素的质粒的构建方法包括：取鼠粒细胞抽提细胞总RNA，逆转录后用高保真酶、引物进行PCR扩增，获得抑铁素基因目标序列，并克隆入pBudCE4.1质粒中构建pBudCE4.1-Sid。
3.一种由权利要求1所述含抑铁素的质粒构建的含抑铁素重组减毒沙门杆菌。
4.如权利要求3所述的含抑铁素重组减毒沙门杆菌，其特征在于，所述含抑铁素重组减毒沙门杆菌的构建方法包括：
步骤一，用LB培养基培养沙门杆菌，制备感受态细菌；
步骤二，将质粒电转化SL7207，在含Zeocin抗性的培养基中获取阳性克隆，制备相应的rSL7207；
步骤三，用rSL7207感染RAW264.7细胞，分别检测抑铁素在MΦ中的表达。
5.一种由权利要求3所述含抑铁素重组减毒沙门杆菌制备的表达载体。
6.一种由权利要求3所述含抑铁素重组减毒沙门杆菌制备的递送载体。
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