CN111954818A - 轻度或重度牙周炎的诊断 - Google Patents

轻度或重度牙周炎的诊断 Download PDF

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Abstract

公开了一种用于评估患有牙周炎的人类患者是具有轻度牙周炎还是重度牙周炎的体外方法。方法基于确定对三种生物标志物蛋白质的选择的见解。因此，在患有牙周炎的患者的唾液样本中，以下蛋白质的浓度被测量：丙酮酸激酶(PK)以及以下中的至少两种：血红蛋白‑β(Hb‑β)、血红蛋白‑δ(Hb‑δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)。基于所测量的浓度，反映针对蛋白质的联合浓度的值被确定。该值与阈值进行比较，阈值以相同方式反映与重度牙周炎相关联的联合浓度。比较允许评估测试值是否指示患者的重度牙周炎或轻度牙周炎的存在。由此，通常，反映联合浓度低于由阈值反映的联合浓度的测试值指示患者患有轻度牙周炎，并且反映联合浓度等于或高于由阈值反映的联合浓度的测试值指示患者患有重度牙周炎。

Description

轻度或重度牙周炎的诊断
技术领域
本发明属于口腔护理领域，并且涉及基于唾液的牙周疾病的诊断。具体地，本发明涉及用于区分轻度与重度牙周炎的试剂盒以及方法。
背景技术
牙龈发炎或牙龈炎是非破坏性的牙周疾病，主要由牙菌膜或牙菌斑附着至牙齿表面引起，其在周围的组织中触发炎症反应。牙龈炎是牙龈组织的可逆性感染和发炎，并且可以利用适当的口腔卫生措施和牙科专业干预来解决。如果不进行检测或解决，牙龈炎通常会导致牙齿周围的组织(即，牙周组织)发炎，这种情况被定义为牙周炎，其导致组织破坏和牙槽骨脱落，并最终导致牙齿脱落。在牙龈疾病的发展期间，通常会有与其相关联的临床体征和症状，诸如，牙龈肿胀，颜色由粉红色变为深红色，牙龈出血，口臭以及牙龈触摸起来变得越来越脆弱或疼痛。
牙周炎是由口腔微生物引起的慢性多因素的炎症疾病，并且其特征是逐步破坏硬(骨)以及软(牙周韧带)组织，最终导致牙齿松动和脱落。这需要区别于牙龈炎，牙龈炎是牙龈组织的可逆性感染和发炎。炎症牙周炎是最普遍的慢性人类疾病中的一种并且是成年人牙齿脱落的主要原因。除了牙周炎对口腔健康的实质性负面影响外，这里还有大量证据证明牙周炎具有全身性影响，并且它是多种全身性疾病的风险因素，包括心脏病(例如，动脉粥样硬化、中风)、糖尿病、妊娠并发症、类风湿关节炎以及呼吸道感染。
因此，从口腔以及整体健康来看，牙周疾病的早期和准确诊断都很重要。
在一般牙科实践中，牙周疾病的诊断仍然较差，导致相对较低的治疗干预率以及大量未经治疗的病例。当前的诊断依赖于牙科专业人员对口腔组织情况(颜色、肿胀、探查的出血程度、探查口袋深度；以及来自口腔x射线的骨脱落)进行不精确的主观临床检查。这些传统方法耗时，并且所使用的某些技术(口袋深度、x射线)反映了历史事件，诸如，过去的疾病活动，而不是当前的疾病活动或对进一步疾病的敏感性。因此，期望更客观、更快、准确、更易于使用的诊断，其优选地也可以由非专科医生执行。从而，期望测量当前的疾病活动以及可能的对象对进一步的牙周疾病的敏感性。
唾液或口腔流体长期以来被提倡作为口腔和一般疾病的诊断流体，并且随着微型生物传感器(也称为芯片实验室)的出现，用于快速椅旁测试的即时诊断获得了更大的科学和临床兴趣。特别是针对牙周疾病检测，与组织发炎和分解相关联的炎症生物标志物可能会由于邻近而容易地结束在唾液中，这表明唾液具有用于牙周疾病检测的强大潜力。的确，这个领域因此引起了明显的兴趣并且提出了令人鼓舞的结果。例如，Kido等人(JPeriodont Res 2012；47：488-499)标识出了来自健康部位和牙周炎部位的龈沟液(GCF)样本中的104种蛋白质、64种蛋白质仅包含在来自健康部位的GCF中以及63种蛋白质仅包含在来自牙周炎部位的GCF中。然而，还没有确切的测试出现。
生物标志物表示支持临床表现的生物学指标，因此，它们是诊断牙周疾病的临床结果的客观度量。最终，经过证明的生物标志物可以被用于评估未来疾病的风险，在最早阶段标识疾病，标识对初始治疗的反应并且允许实施预防策略。
先前用于唾液生物标志物的即时测试发展的限制包括缺少适用于椅旁应用的技术以及无法分析各个样本中的多种生物标志物。而且，在这种测试中包括多种生物标志物的哪种的选择没有在文献中得到充分的解决，也没有在实际测试中实施。
而且，牙周炎可以在轻度到重度疾病的整个严重程度中显露出来。为了容易地评估情况的严重性，牙医通常将患有牙周炎的患者分类为两组——患有轻度牙周炎的患者以及患有重度牙周炎的患者。然而，进行这种评估的可用方法涉及劳动密集型过程，牙医不会对每个患者和/或每次就诊都例行执行，并且消费者无法执行(自我诊断)。
期望提供更简单的过程，具体地仅需要从患者获得(并且可能地由患者他或她自己获得)少量唾液样本的过程。期望将这种样本输入体外诊断设备中，它将基于测量允许对唾液样本进行分类，使得它可以返回患者被分类为患有轻度牙周炎或患有重度牙周炎的可能性的指示。
发明内容
为了更好地解决前述需求，在一个方面中，本发明涉及一种用于评估人类患者是具有轻度牙周炎还是重度牙周炎的体外方法，该方法包括：在来自所述人类患者的唾液样本中，检测以下蛋白质的浓度：丙酮酸激酶(PK)、以及以下中的至少两种：血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)；确定反映针对所述蛋白质确定的联合浓度的测试值；以及将测试值与阈值进行比较，以便评估测试值是否指示所述患者患有轻度牙周炎或重度牙周炎，该阈值以相同方式反映与重度牙周炎相关联的联合浓度。
在另一方面中，本发明提出了一种蛋白质在人类患者的唾液样本中作为生物标志物的用途，蛋白质为：丙酮酸激酶(PK)以及以下中的至少两种：血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)，该生物标志物用于评估患者是具有轻度牙周炎还是重度牙周炎。
可选地，患者的年龄也被用作生物标志物。
在又一方面中，本发明在于一种用于评估人类患者是具有轻度牙周炎还是重度牙周炎的系统，该系统包括：
-检测装置，能够以及适于在人类患者的唾液样本中检测蛋白质：丙酮酸激酶(PK)以及以下中的至少两种：血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)；以及
-处理器，能够以及适于通过所述蛋白质的所确定的浓度，来确定具有轻度牙周炎或重度牙周炎的患者的指示。
该系统可选地包含到界面的数据连接，该界面特别是图形用户界面，该界面能够呈现信息，优选地还能够输入诸如对象的年龄等信息以及可选地诸如性别和/或BMI(身体质量指数)等其他信息，所述界面是该系统的一部分或远程界面。
可选地，前述项目中的一个或多个(特别是处理器)能够“在云中”运行，即，不是在固定机器上，而是通过基于互联网的应用的装置。
在又一方面中，本发明提供了一种用于在人类患者的唾液样本中检测用于牙周炎的至少三种生物标志物的试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种(通常是三种或四种)检测试剂，该一种或多种检测试剂用于检测丙酮酸激酶(PK)以及以下中的至少两种：血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)。通常，使用三种或多种检测试剂，例如，四种检测试剂，每种检测试剂结合不同的生物标志物。在一个实施例中，第一检测试剂用于检测PK，第二检测试剂用于检测血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的一种，并且第三检测试剂用于检测血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的不同的一种。可选的第四检测试剂可以用于检测来自血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)的组的又一不同的蛋白质。
在再一方面中，本发明提供了一种体外方法，该体外方法用于确定在从第一时间点t1到第二时间点t2的时间间隔内患有牙周炎的人类患者的牙周炎状态的变化，该方法包括：在t1时从所述患者获得的至少一个唾液样本中以及在t2时从所述患者获得的至少一个唾液样本中，检测如下蛋白质的浓度：丙酮酸激酶(PK)以及以下中的至少两种：血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)，以及比较浓度，由此在浓度的任何一种、两种或所有三种中的差异反映出状态变化。
在又一方面中，本发明提供了一种诊断人类患者是具有轻度牙周炎还是重度牙周炎的方法，该方法包括：在人类患者的唾液样本中检测如下蛋白质：丙酮酸激酶(PK)以及以下中的至少两种：血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)；以及基于所述样本中的所述蛋白质的浓度，评估患者的轻度牙周炎或重度牙周炎的存在。可选地，该方面的方法包括治疗患者的牙周炎的又一步骤。
在再一方面中，本发明提供了一种在患有轻度或重度牙周炎的人类患者中检测蛋白质的方法，蛋白质是：丙酮酸激酶(PK)以及以下中的至少两种：血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)，该方法包括：
(a)从人类患者获得唾液样本；以及
(b)通过使样本与用于结合所述蛋白质的一种或多种检测试剂接触，并且检测每种蛋白质与一种或多种检测试剂之间的结合，来检测丙酮酸激酶(PK)以及以下中的至少两种：血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)是否存在于样本中。通常，存在用于检测PK的第一检测试剂，用于检测血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的一种的第二检测试剂，以及用于检测血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中不同的一种的第三检测试剂。
附图说明
图1示意性地表示用于如本公开所描述的方法的系统。
具体实施方式
在一般意义上，本发明基于明智的洞察力，即，在患有牙周炎的人类患者的唾液样本中少到三种蛋白质可以充当生物标志物，用于将所述牙周炎分类为两个类别中的任何一个，一个类别为重度牙周炎，另一类别为轻度或中度(即，不是重度，在上文以及下文中，术语“轻度牙周炎”将包括中度牙周炎，除非另有指示)。后一类别在下文中统称为轻度牙周炎。
所标识的蛋白质生物标志物在与血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的至少两种组合时是丙酮酸激酶(PK)。
可选地，可以包括对象的年龄作为附加标志物。
丙酮酸激酶(PK)催化糖酵解的最后一个步骤。丙酮酸激酶有四种组织特异性同工酶，每种具有不同组织所需的特定动力学性质。
血红蛋白(Hb)是几乎所有脊椎动物的红细胞以及某些无脊椎动物的组织中的含铁氧转运金属蛋白。血红蛋白-β(也称为β球蛋白、HBB、β-球蛋白和血红蛋白β亚基)是一种球蛋白，它与α球蛋白(HBA)一起构成成年人的血红蛋白的最常见形式，即，HbA。Hb-β通常长146个氨基酸，并且分子量为15,867Da。正常成年人HbA是由两条α链和两条β链组成的异四聚体。Hb-β通常由人类11号染色体上的HBB基因编码。血红蛋白δ亚基(也称为δ球蛋白、HBD、δ-球蛋白和血红蛋白δ)是一种球蛋白，它与α球蛋白(HBA)一起构成成年人的血红蛋白的较不常见形式，即，HbA-2。Hb-δ通常长147个氨基酸，并且分子量为16,055Da。正常成年人HbA-2是由两条α链和两条δ链组成的异四聚体。Hb-δ由人类11号染色体上的HBD基因编码。
S100钙结合蛋白A8(S100A8)是钙和锌结合蛋白，其在调节炎症过程和免疫反应中起着显著作用。它可以诱导中性粒细胞趋化性和附着。
S100钙结合蛋白A9(S100A9)，也称为钙粒蛋白B，是钙和锌结合蛋白，其在调节炎症过程和免疫反应中起着显著作用。它可以诱导中性粒细胞趋化性、附着性，可以通过经由激活SYK、PI3K/AKT和ERK1/2促进吞噬作用来增强中性粒细胞的杀菌活性，并可以通过MAPK依赖性机制诱导中性粒细胞脱粒。
上面提到的蛋白质是本领域已知的。技术人员知道其结构以及在含水样本(诸如，唾液样本)中检测它们的方法。在下文中，前面提到的蛋白质生物标志物被统称为“本发明的生物标志物组”。
示例中的表1提供了12种根据本发明的特别优选的组合。
在一个实施例中，本发明的生物标志物组包括或由在本发明中标识的五种蛋白质生物标志物组成，即，PK、Hb-β、Hb-δ、S100A8和S100A9。优选地，本发明的生物标志物组由在本发明中标识的不超过四种蛋白质生物标志物组成，例如，PK、以及Hb-β、Hb-δ、S100A8和S100A9中不超过三种的蛋白质生物标志物。除了本发明的生物标志物组外，其他生物标志物和/或数据，诸如人口统计数据(例如，年龄、性别)也可以包括在应用于确定牙周炎类型的一组数据中。
附加蛋白质生物标志物的示例是α-1-酸性糖蛋白(A1AGP)。另一示例性的附加蛋白质生物标志物是抑制蛋白。这些蛋白质包括在下面的表1中的某些优选生物标志物组中。α-1-酸性糖蛋白(A1AGP)是主要由肝脏合成的血浆α-球蛋白糖蛋白。它有时也被称为血清类黏蛋白。它用作血液中的转运蛋白，充当碱性和中性带电荷的亲脂化合物的载体。还认为它调节血细胞和内皮细胞之间的相互作用。抑制蛋白是一种肌动蛋白结合蛋白，参与在大多数细胞中发现的肌动蛋白细胞骨架的动态更新和重组。这对于肌动蛋白微丝的时空控制生长很重要，这是细胞运动和细胞形状变化的关键过程。人类抑制蛋白-1在表达时通常长140个氨基酸，但通常会进一步加工为成熟形式。
优选的扩展生物标志物组是：
A1AGP+PK+S100A8+S100A9
A1AGP+Hb-β+Hb-δ+PK
抑制蛋白+Hb-β+Hb-δ+PK
抑制蛋白+Hb-β+PK+S100A8
当可选地包括其他生物标志物时，生物标志物的总数(即，本发明的生物标志物组加上其他生物标志物)通常为4、5或6。
然而，本发明的期望优点是可以通过优选地测量不超过四种生物标志物，并且更优选地仅测量三种生物标志物来确定患者的牙周炎的分类，其中，(下面的)表1的生物标志物组是优选的。具体地，该确定不需要涉及其他数据的使用，这有利地提供了简单且直接的诊断测试。
如所期望的，该方法仅需要从对象获取少量唾液样本，例如，水滴大小。样本大小的典型范围在0.1μl至2ml，诸如1-2ml，由此，更小量(例如，0.1至100μl)可以被用于体外设备处理，以及由此，获取更大的样本也是可能的，诸如高达20ml，诸如，7.5至17ml。
该样本被输入到体外诊断设备中，该设备测量所涉及的至少三种蛋白质的浓度，并且返回诊断结果，基于具有轻度牙周炎或重度牙周炎的可能性对对象进行分类。
本发明的易用性将使得可以定期(例如，作为定期牙科检查的一部分甚或在家)对大多数具有牙周炎或具有发生牙周炎的高风险的牙科患者进行测试。尤其是，这允许在它发展为重度牙周炎之前，检测轻度牙周炎的存在，因此能够更及时地采取口腔护理措施，以防止牙周炎加重。或者，例如，对已知处于牙周炎高风险并首次进行测试的患者，该方法允许标识牙周炎是轻度还是重度的。而且，该方法可以在对先前被诊断为重度牙周炎的患者进行治疗之后应用，以便检查牙周炎是否已经被改善从而变为轻度。在进一步的场景中，开始治疗方案后先前患有轻度牙周炎的患者并没有改善或实际上已经恶化的指示可能会导致牙医或患者决定更改治疗计划以帮助加快恢复过程。具体地，该方法也适合于自我诊断，由此通过患者他或她本人进行取出样本以及将其输入到设备中的步骤。
当执行本发明以确定牙周炎是轻度还是重度时，患者可能通常被已知具有牙周炎。因此，在某些实施例中，该方法用于评估已知具有牙周炎的人类患者是具有轻度牙周炎还是重度牙周炎。
本发明的方法通常包括通过使用一种或多种检测试剂来检测构成本发明的生物标志物组的前面提到的至少三种蛋白质以及可选地其他生物标志物蛋白质。
根据本发明被测试的“唾液”可以是可以通过吐出或擦拭来获得的未稀释的唾液，或者是可以通过用液体冲洗嘴巴来获得的稀释的唾液。稀释的唾液可以通过以下方法获得：患者用无菌水(例如，5ml或10ml)或其他合适的液体冲洗或漱口几秒钟，并且吐出到容器中。稀释的唾液有时可以称为口腔冲洗液。
“检测”是指测量、定量、评分或测定生物标志物蛋白质的浓度。评估包括生物标志物蛋白质的生物化合物的方法是本领域已知的。可以认识到检测蛋白质生物标志物的方法包括直接测量和间接测量。本领域技术人员将能够选择测定特定的生物标志物蛋白质的适当方法。
关于蛋白质生物标志物的术语“浓度”应赋予其通常的含义，即，一定体积中蛋白质的丰度。蛋白质浓度通常以每体积的质量进行测量，最典型为mg/ml或μg/ml，但有时低至pg/ml。备选的度量是克分子浓度(或摩尔浓度)mol/L或“M”。浓度可以通过检测已知、已确定或预定体积的样本中的蛋白质的量来确定。
确定浓度的备选方案是确定样本中的蛋白质生物标志物的绝对量，或确定样本中的生物标志物的质量分数，例如，相对于样本中的所有其他蛋白质总量的生物标志物的量。
“检测试剂”是特异性地(或选择性地)结合、相互作用或检测感兴趣的蛋白质生物标志物的试剂或化合物。这种检测试剂可以包括但不限于优先结合蛋白质生物标志物的抗体、多克隆抗体或单克隆抗体。
当涉及检测试剂时，短语“特异性地(或选择性地)结合”或“特异性地(或选择性地)与之发生免疫反应”是指结合反应，其确定蛋白质的异质群体和其他生物制剂中的蛋白质生物标志物的存在。因此，在所指定的免疫测定条件下，特异性检测试剂(例如，抗体)与特定蛋白质结合至少是本底的两倍，并且基本上不与样本中存在的其他蛋白质大量结合。在这种条件下特异性结合可能需要选择对于特定蛋白质具有特异性的抗体。多种免疫测定格式可以被用于选择与特定蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。例如，常规地使用固相ELISA免疫测定(酶联免疫吸附测定)来选择与蛋白质发生特异性免疫反应的抗体(例如,参见Harlow&Lane在1988年的实验室手册上发表的Antibodies，以描述可以用于确定特异性免疫反应的免疫测定格式和条件)。通常，特异性或选择性反应至少是本底信号或噪声的两倍，更典型地是本底的10至100倍以上。
“抗体”指的是基本上由一种或多种免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽配体，其特异性地结合并识别表位(例如，抗原)。所识别的免疫球蛋白基因包括kappa和lambda轻链恒定区基因、α、γ、δ、ε和μ重链恒定区基因以及无数免疫球蛋白可变区基因。抗体例如作为完整免疫球蛋白存在或者作为利用多种肽酶消化产生的许多特征明确的片段存在。这包括例如Fab'和F(ab)'2片段。如本文所使用的，术语“抗体”还包括通过修饰完整抗体产生的或使用重组DNA方法从头合成的那些抗体片段。它还包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或单链抗体。抗体的“Fc”部分是指免疫球蛋白重链的部分，该部分包括一个或多个重链恒定区域CH1、CH2和CH3，但不包括重链可变区。抗体可以是双特异性抗体，例如，具有与第一抗原特异性地结合的第一可变区以及与第二不同抗原特异性地结合的第二可变区的抗体。使用至少一种双特异性抗体可以减少所需的检测试剂的数量。
诊断方法的灵敏度和特异性不同。诊断测定的“灵敏度”是指测试阳性的患病个体的百分比(“真阳性”的百分比)。该测定未检测到的患病个体是“假阴性”。没有患病并且在测定中测试为阴性的对象被称为“真阴性”。诊断测定的“特异性”为1减去假阳性率，其中，“假阳性”率被定义为没有疾病的检测呈阳性的患者的比例。
可以通过任何方式在样本中检测本发明的(多种)生物标志物蛋白质。用于生物标志物检测的优选方法是基于抗体的测定、蛋白质阵列测定、基于质谱(MS)的测定和基于(近)红外光谱的测定。例如，免疫测定包括但不限于使用诸如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA、“三明治”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、荧光免疫测定等技术的竞争性和非竞争性测定系统。这种测定是常规的并且是本领域众所周知的。在下面简要描述示例性的免疫测定(但不旨在通过限制)。
免疫沉淀方案通常包括在裂解缓冲液(诸如，补充有蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如，EDTA、PMSF、抑肽酶、钒酸钠)的RIPA缓冲液(1％NP-40或Triton X-100、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、0.15M NaCl、0.01M磷酸钠(pH 7.2)、1％抑肽酶))中裂解细胞群，将感兴趣的抗体添加到细胞裂解液中，在4℃下培养一段时间(例如，1至4小时)，将蛋白质A和/或蛋白质G琼脂糖微珠添加到细胞裂解液中，在4℃下培养大约一个小时或更长时间，在裂解缓冲液中洗涤微珠，并且将微珠重新悬浮在SDS/样本缓冲液中。抗体免疫沉淀特定抗原的能力可以通过例如蛋白质印迹分析来评估。本领域技术人员将了解可以被修改以增加抗体与抗原的结合并降低本底的参数(例如，用琼脂糖微珠预先清除细胞裂解液)。
蛋白质印迹分析通常包括制备蛋白质样本，在聚丙烯酰胺凝胶(例如，取决于抗原的分子量，为8％-20％SDS-PAGE)中电泳蛋白质样本，将蛋白质样本从聚丙烯酰胺凝胶传输到诸如硝酸纤维素、PVDF或尼龙等膜，在封闭溶液(例如，含3％BSA的PBS或脱脂牛奶)中封闭膜，在洗涤缓冲液(例如，PBS-吐温20)中洗涤膜，利用稀释在封闭缓冲液中的一次抗体(感兴趣的抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液中洗涤膜，利用与酶底物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或被稀释在封闭缓冲液中的放射性分子(例如，32P或125I)共轭的二次抗体(其识别一次抗体，例如，抗人类抗体)来封闭膜，在洗涤缓冲液中洗涤膜，并且检测抗原的存在。本领域技术人员将了解可以被修改以增加检测到的信号并减少本底噪声的参数。
ELISA通常包括制备抗原(即，感兴趣的生物标志物蛋白质或其片段)，用抗原涂覆96孔微量滴定板的孔，将与可检测化合物(诸如，酶底物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶))共轭的感兴趣的抗体添加到孔中并培养一段时间，并且检测抗原的存在。在ELISA中，感兴趣的抗体不必与可检测化合物共轭；相反，可以将与可检测化合物共轭的第二抗体(其识别感兴趣的抗体)添加到孔中。进一步地，代替用抗原涂覆孔，可以将抗体涂覆至孔。在这种情况下，在将感兴趣的抗原添加到涂覆的孔之后，可以添加与可检测化合物共轭的第二抗体。本领域技术人员将了解可以被修改以增加检测到的信号的参数以及本领域已知的ELISA的其他变型。
由于使用了多种标志物，基于这些生物标志物的联合浓度(以及可选地年龄)来确定阈值。该阈值确定患者是否被分类为具有轻度牙周炎或重度牙周炎。本发明中反映的见解是：可以基于测量上面指示的生物标志物的组合以足够的准确性来将牙周炎检测为轻度或重度。
该见解支持本发明的另一方面，在患有牙周炎的人类患者的唾液样本中作为生物标志物的蛋白质：丙酮酸激酶(PK)以及以下中的至少两种：血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)的用途，该生物标志物用于评估患者是具有轻度牙周炎还是重度牙周炎。
该用途可以以基本上在上文和下文中描述的方法来实施。
本发明的方法包括确定反映针对所述蛋白质测量的联合浓度的测试值。联合浓度值可以是通过输入所确定的浓度并对这些值进行算术运算而获得的任何值。例如，这可以是浓度的简单相加。它还可以涉及将每个浓度乘以反映这些浓度的期望权重的因子，然后将结果相加。它还可以涉及将浓度彼此相乘或者乘法、除法、减法、求幂和加法的任何组合。它可以进一步涉及将浓度提高到一定的幂。
可选地，测试值结合对象的年龄来反映针对所述(多种)蛋白质确定的联合浓度的浓度。
将所得的联合浓度值与阈值进行比较，该阈值以相同的方式反映与存在重度牙周炎相关联的联合浓度。该比较允许评估测试值是否指示其唾液被接受测试的患者存在重度牙周炎或轻度牙周炎。
阈值例如可以是联合浓度值，其是以相同的方式基于针对参考样本中的相同蛋白质确定的浓度而获得的，该参考样本与存在重度牙周炎相关联(即，在诊断为重度牙周炎的患者中)。通常，由此，反映出相同的或更高的联合浓度的值指示受测患者存在重度牙周炎。类似地，在受测牙周炎患者的唾液中反映出较低联合浓度的值指示牙周炎为轻度或中度(即，非重度)。然而，要理解的是，还可以计算阈值(例如，通过使用负乘数)，使得指示重度牙周炎的测试值将低于阈值，并且指示轻度牙周炎的测试值将高于阈值。
还可以基于测量样本集合中的现在的生物标志物蛋白质的浓度来确定阈值，该样本集合包括已知诊断为重度牙周炎以及不是重度(轻度和/或中度)牙周炎的患者。由此，可以对所测量的浓度值进行统计分析，可能包括机器学习方法，以允许以期望的灵敏度和特异性来区分被分类为轻度或中度牙周炎的患者以及被分类为患有重度牙周炎的患者。由此，可以获得期望的阈值。基于该阈值，可以对待测样本进行相同的浓度测量，然后以与获得阈值相同的方式处理浓度值，从而确定联合浓度值，可以将其与阈值进行比较，因此允许将测试样本分类为具有轻度或重度牙周炎。
在令人关注的实施例中，以如下分数的形式获得联合浓度值。数值(蛋白质浓度值，例如以ng/ml为单位)被分配给每个测量，并且这些值以线性或非线性组合使用以计算0和1之间的分数。在上面提到的基于对象集合确定阈值的情况下，通常利用以联合浓度作为输入的S型函数来计算0和1之间的分数(如进一步所示的)。
当分数超过某个阈值时，该方法指示患者具有重度牙周炎。该阈值可以基于期望的灵敏度和特异性来选择。
要理解的是，根据本发明，在对对象执行“轻度或重度牙周炎分类”时，这是针对可以假设患有牙周炎的对象。这可以例如从先前执行的牙周炎诊断已知，尽管可能无法区分其程度，或者例如是通过对象的口腔健康状况记录假设的。
本领域公认的临床定义基于以下内容：
牙龈指数(GI)
将基于等级为0至4的洛宾改良牙龈指数(MGI)记录全口牙龈指数，其中：
-0＝没有发炎，
-1＝轻度发炎；任何部分的颜色略有变化，纹理少量变化，而不是整个边缘或乳突状牙龈单位变化，
-2＝轻度发炎；但涉及整个边缘或乳突状单位，
-3＝中度发炎；边缘或乳突状单位的上光、发红、水肿和/或肥大，
-4＝严重发炎；边缘或乳突状牙龈单位明显发红、水肿和/或肥大、自发性出血、充血或溃疡]。
探查深度(PD)
使用手动UNC-15牙周探针将探查深度记录到最接近的毫米。探查深度是从探针尖端(假设位于口袋底部)到游离牙龈边缘的距离。
牙龈萎缩(REC)
使用手动UNC-15牙周探针将牙龈萎缩记录到最接近的毫米。牙龈萎缩是从游离牙龈边缘到釉牙骨质界的距离。牙龈萎缩将以正数指示，并且牙龈过度生长将以负数指示。
临床附着丧失(CAL)
临床附着丧失将作为每个部位的探查深度+萎缩量之和来计算。
探查出血(BOP)
探查后，将评估每个部位的探查出血，如果在探查的30s内发生出血，则为该部位分配分数1，否则将分配分数0。
所得的对象组(患者组)定义如下，由此，轻度-中度牙周炎组和重度牙周炎组与本发明有关：
-健康组(H)：所有部位的PD≤3mm(但在最后一个保留臼齿的远端最多允许四个4mm的口袋)，无邻间附着丧失的部位，≤10％部位的GI≥2.0，％BOP分数≤10％；
-牙龈炎组(G)：>30％部位的GI≥3.0，无邻间附着丧失的部位，没有PD>4mm的部位，％BOP分数>10％；
-轻度-中度牙周炎组(MP)：邻间PD为5至7mm，(相当于大约2至4mm CAL)≥8颗牙齿，％BOP分数>30％；
-重度牙周炎组(AP)：邻间PD≥7mm，(相当于大约≥5mm CAL)≥12颗牙齿，％BOP分数>30％。
在实施例中，本发明的方法利用图1示意性地表示的系统。该系统可以是具有集成在其中的各种设备组件(单元)的单个装置。该系统还可以将其各种组件或这些组件中的一些作为单独的装置。图1所示的组件是测量设备(A)、图形用户界面(B)和计算机处理单元(C)。
如上面所提到的，本发明的系统包括到界面的数据连接，由此界面本身可以是系统的一部分或可以是远程界面。后者是指可以使用不同的装置来提供实际界面，优选是手持装置，诸如智能手机或平板计算机。在这种情况下，数据连接将优选地涉及无线数据传输，诸如通过Wi-Fi或蓝牙或者通过其他技术或标准。
测量设备(A)被配置为接纳唾液样本，例如通过将唾液滴放置在药筒(A1)上，该药筒可以插入到设备(A)中。该设备可以是现有设备，其能够通过相同的唾液样本确定至少以下蛋白质的浓度：丙酮酸激酶(PK)以及以下中的至少两种：血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)。
测量设备(A)应该能够接纳唾液样本，例如通过将唾液滴放置在药筒(A1)上，该药筒可以插入到设备(A)中。该设备可以是现有设备，其能够通过相同的唾液样本确定至少以下蛋白质的浓度：丙酮酸激酶(PK)以及以下中的至少两种：血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)。
处理单元(C)从部分(A)接收用于蛋白质浓度的数值。单元(C)设置有软件(通常为嵌入式软件)，该软件允许它计算0和1之间的分数(S)。该软件进一步包括阈值(T)的数值。如果计算值(S)超过(T)，则单元(C)将向GUI(B)输出‘重度牙周炎’的指示(I)，否则将输出‘轻度牙周炎’。又一实施例可以使用(S)的特定值来指示利用其做出指示(I)的确定性。这可以是概率分数，由此0.5是可能的阈值，并且例如分数S＝0.8将指示重度牙周炎的可能性。令人关注的选项是：
基于分数S，人员可以直接指示确定性，即，S＝0.8意味着80％的重度牙周炎的确定性；
-基于分数S，人员可以进行二进制或三级指示：
-S<T->轻度牙周炎，S≥T->重度牙周炎；
-S<R1->轻度牙周炎，R1≤S<R2->不确定，
-S≥R2->重度牙周炎；
另外，可以对这种二进制或三级指示附加确定性。该确定性将通过分数S与(多个)所选阈值(T、R1、R2)的距离而被确定。
分数的特定计算可以例如借助于应用以下公式的S型函数来实施：
Figure BDA0002717716760000161
其中，N是所使用的蛋白质/生物标志物的数量，c0、c1等是系数(数值)，并且B1、B2等是相应的蛋白质浓度。
系数ci的确定可以通过训练程序来完成：
-选择N1个具有重度牙周炎的对象(例如，如牙医使用当前标准所标识的)以及N2名具有轻度牙周炎的对象。
没有轻度牙周炎的对象被认为具有分数S＝0，具有重度牙周炎的对象被认为具有分数S＝1。
-从每个对象中获取唾液样本，并且如上面所解释的确定生物标志物组合的蛋白质浓度。
-在蛋白质浓度和分数之间执行逻辑回归。
其他回归或机器学习方法(线性回归、神经网络、支持向量机)可以被用于训练分类器，该分类器基于蛋白质浓度预测对象是否具有牙周炎或具有健康的口腔情况。
具体地，利用具有轻度牙周炎或重度牙周炎的对象使用临床研究(牙科专家经由当前标准(例如，美国牙周病学会标准)通过临床评估标识的)来应用这种程序(在示例中)。借助于一法(Leave-1-out)交叉验证评价各种生物标志物组合的性能，得到本发明的优选生物标志物组合。
参照前面提到的系统，在又一方面中，本发明还提供了一种用于评估人类患者是具有轻度牙周炎还是重度牙周炎的系统，该系统包括：
-检测装置，能够以及适于在人类患者的唾液样本中检测以下蛋白质：丙酮酸激酶(PK)以及以下中的至少两种：血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)；如上面所解释的，这种装置是已知的，并且对于技术人员来说是容易获得的；通常，提供一种用于在其中接纳对象的口腔样本的容器，该容器由检测装置提供；
-处理器，能够以及适于通过所述蛋白质的所确定的浓度，来确定具有轻度牙周炎或重度牙周炎的患者的指示。
可选地，该系统包括能够呈现信息的用户界面(或到远程界面的数据连接)，特别是图形用户界面(GUI)；GUI是一种用户界面，它允许用户通过图形图标和视觉指示符(诸如，二级符号)与电子设备进行交互，而不是基于文本的用户界面、键入的命令标签或文本导航(在本发明中不排除任何这样的界面类型)；GUI通常是众所周知的，并且通常用于手持移动设备，诸如，MP3播放器、便携式媒体播放器、游戏设备、智能手机以及较小的家庭、办公室和工业控件；如所述的，可选地，还可以选择界面以便能够输入信息，诸如，例如，对象的年龄、性别、BMI(身体质量指数)。
单独地或者作为前面提到的系统的一部分，本发明还提供了一种用于在人类患者的唾液样本中检测用于牙周炎的至少三种生物标志物的试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种检测试剂，该一种或多种检测试剂用于检测丙酮酸激酶(PK)以及以下中的至少两种：血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)。因此，该试剂盒包括三种检测试剂，每种针对不同的生物标志物，其中，第一检测试剂用于检测PK，第二检测试剂用于检测血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的一种，并且第三检测试剂用于检测血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中不同的一种。如上面参照本发明的方法所讨论的，试剂盒可以包括更多检测试剂，诸如特别用于抑制蛋白或A1AGP和/或其他蛋白质的。在优选实施例中，在试剂盒中可用的检测试剂由用于选择构成本发明的3生物标志物或4生物标志物组的三种蛋白质的检测试剂组成，如所提到的。在其他实施例中，为存在于在下面示例中的表1中例证的组合中的每种生物标志物蛋白质提供单独的检测试剂。
优选地，所述试剂盒包括固体支持物，诸如，芯片、微量滴定板或者包括所述检测试剂的微珠或树脂。在一些实施例中，试剂盒包括质谱探针，诸如，ProteinChipTM。
试剂盒还可以提供特定于未结合的检测试剂或所述生物标志物(三明治型测定)的洗涤溶液和/或检测试剂。
在令人关注的方面中，本发明的生物标志物组的识别被应用于随时间监测人类患者的牙周炎状态。因此，本发明还提供了一种体外方法，该体外方法用于确定在从第一时间点t1到第二时间点t2的时间间隔内患有牙周炎的人类患者的牙周炎状态的变化，该方法包括：在t1时从所述患者获得的至少一个唾液样本中以及在t2时从所述患者获得的至少一个唾液样本中，检测蛋白质的浓度：丙酮酸激酶(PK)以及以下中的至少两种：血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)，以及比较浓度，由此优选地至少两种(更优选地至少三种)浓度的差异反映出状态变化。可以将这种差异视为浓度差异，从而允许无需首先生成0和1之间的数字或任何其他分类即可进行直接比较。要理解的是，在两个时间点接收的测量也可以以与上文确定轻度或重度牙周炎时完全相同的方式进行处理。
本发明还提供了一种诊断人类患者是具有轻度牙周炎还是重度牙周炎的方法，该方法包括在患者的唾液中检测以下蛋白质的存在：丙酮酸激酶(PK)以及以下中的至少两种：血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)。基于所述样本中的所述蛋白质的浓度来评估患者的轻度牙周炎或重度牙周炎的存在。可选地，该方面的方法包括治疗患者的牙周炎的又一步骤。该可选的治疗步骤可以包括施用已知的治疗剂或牙科程序或者治疗剂与牙科程序的组合。已知的治疗剂包括施用含抗菌剂的试剂，诸如，漱口剂、片、凝胶或微球体。用于治疗牙周炎的典型抗菌剂是洗必泰。其他治疗剂包括抗生素(通常是口服抗生素)以及酶抑制剂(诸如，强力霉素)。已知的非手术治疗程序包括刮治和根面平整(SRP)。已知的手术程序包括手术囊袋减少、皮瓣手术、牙龈移植或骨移植。
本发明进一步提供了一种在患有轻度或重度牙周炎的患者中检测以下蛋白质的方法：丙酮酸激酶(PK)以及以下中的至少两种：血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)，该方法包括：
(a)从人类患者获得唾液样本；以及
(b)通过使唾液样本与用于检测蛋白质的第一、第二和第三检测试剂接触，并且检测每种蛋白质与检测试剂之间的结合，来检测所述蛋白质是否存在于唾液样本中。
参照以下非限制性实施例，将进一步说明本发明。
示例
在具有79个对象的临床研究中，其中41位被诊断具有轻度牙周炎(包括中度牙周炎)，以及38位具有重度牙周炎，获得了ROC(接收者-操作者-特征)曲线下的区域(AUC)值。
在统计中，接收者操作特征曲线或ROC曲线是一个图表，它说明了二进制分类器系统随着鉴别阈值变化时的性能。曲线通过绘制各种阈值设置下的真阳性率(TPR)与假阳性率(FPR)而被创建。真阳性率在机器学习中也称为灵敏度、重现或检测概率。假阳性率也称为混乱(fall-out)或错误警报概率，并且可以被计算为(1-特异性)。因此，ROC曲线是根据混乱的灵敏度。通常，如果已知用于检测和错误警报的概率分布，则可以通过相对于x轴上的错误警报概率的累积分布函数的值，针对阈值的每个值在y轴上绘制检测概率的累积分布函数(从-∞到鉴别阈值的概率分布下的区域)的值，来生成ROC曲线。测试的准确性取决于该测试将测试对象分为具有或没有所讨论的疾病的人群的程度。准确性通过ROC曲线下的区域来被测量。1的区域表示完美的测试；0.5的区域表示毫无价值的测试。对诊断测试的准确性进行分类的指南是传统的学术评分系统：
-0.90-1＝优秀 (A)
-0.80-0.90＝良好 (B)
-0.70-0.80＝一般 (C)
-0.60-0.70＝较差 (D)
-0.50-0.60＝不及格 (F)
基于前述内容，在前面提到的临床研究的结果中，ROC AUC值高于0.75被认为表示用于提供根据本发明的诊断测试的期望准确性。
在所确定的所有生物标志物以及生物标志物组中，下面的表1总结了具有至多四种蛋白质生物标志物的组的表示0.75以上的ROC AUC值的数据。这些数据指示，3种蛋白质生物标志物(以指定的组合)可以提供>0.75的AUC LOOCV，以对轻度牙周炎与重度牙周炎进行分类：
表1
Figure BDA0002717716760000211
该表中的12个生物标志物组合中的每个被突出显示为本发明的优选组合。
在该表中，在标志物年龄旁边，考虑了8种蛋白质标志物(先前未与口腔健康链接)：
·A1AGP
·Hb-β
·Hb-δ
·角蛋白4
·抑制蛋白
·丙酮酸激酶
·S100A8
·S100A9
为了正确地看待AUC>0.75的12个已标识组：
·使用8种蛋白质标志物，可选地加上年龄作为标志物，有324个可能的组，其最多具有4种蛋白质标志物(不考虑仅具有年龄的组)。
·不限制组中的蛋白质标志物的数量，从这8种标志物中产生510个可能的组(不考虑仅具有年龄的组)。
虽然已经在附图和前述描述中详细说明和描述了本发明，但是这种说明和描述被认为是说明性的或示例性的，而不是限制性的；本发明不限于所公开的实施例。
例如，可以以不同单位提出用于不同生物标志物的检测试剂。或者，方便地，本发明的试剂盒可以包括在所有实施例中使用的用于蛋白质生物标志物的固定的检测试剂集合，即，PK以及包括用于其他生物标志物中的任何一种的检测试剂(即，血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9))的灵活模块。
通过研究附图、公开内容和所附权利要求，本领域技术人员在实践要求保护的本发明时可以理解和实现所公开的实施例的其他变型。在权利要求中，词语“包括”不排除其他元件或步骤，并且不定冠词“一”或“一个”不排除多个。本发明的某些特征被记载在相互不同的从属权利要求中这一事实并不指示这些特征的组合无法被有利地使用。权利要求中的任何附图标记不应该被解释为限制范围。
总之，我们在此公开了一种用于评估患有牙周炎的人类患者是具有轻度牙周炎还是重度牙周炎的体外方法。该方法基于确定对三种生物标志物蛋白质的选择的见解。因此，在患有牙周炎的患者的唾液样本中，以下蛋白质的浓度被测量：丙酮酸激酶(PK)以及以下中的至少两种：血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)。基于所测量的浓度，反映针对所述蛋白质的联合浓度的值被确定。该值与阈值进行比较，该阈值以相同方式反映与重度牙周炎相关联的联合浓度。该比较允许评估测试值是否指示所述患者的重度牙周炎或轻度牙周炎的存在。由此，通常，反映联合浓度低于由阈值反映的联合浓度的测试值指示所述患者患有轻度牙周炎，并且反映联合浓度等于或高于由阈值反映的联合浓度的测试值指示所述患者患有重度牙周炎。

Claims (22)

1.一种用于评估人类患者是具有轻度牙周炎还是重度牙周炎的体外方法，其中所述方法包括：
-在来自所述人类患者的唾液样本中检测以下项的浓度：丙酮酸激酶(PK)以及以下中的至少两种：血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)；
-确定反映针对蛋白质确定的联合浓度的测试值；
-将所述测试值与阈值进行比较，以便评估所述测试值是否指示所述患者患有轻度牙周炎或重度牙周炎，所述阈值以相同方式反映与重度牙周炎相关联的联合浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述人类患者被已知具有牙周炎。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中对象的年龄被确定，并且所述测试值结合所述对象的所述年龄，反映针对所述蛋白质确定的所述联合浓度。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阈值基于针对一个或多个参考样本中的所述蛋白质确定的所述浓度，每个样本与重度牙周炎的存在相关联。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述阈值基于样本集合中的所述蛋白质的浓度，所述样本集合包括来自具有轻度或中度牙周炎的对象的样本以及来自具有重度牙周炎的对象的样本。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述蛋白质包括：PK、S100A8和S100A9；PK、Hb-β和Hb-δ；PK、S100A8和Hb-β；PK、S100A8、Hb-β和Hb-δ；PK、S100A9、Hb-β和Hb-δ；PK、S100A8、S100A9和Hb-β；A1AGP、PK、S100A8和S100A9；A1AGP、Hb-β、Hb-δ和PK；A1AGP、PK、S100A8和S100A9；抑制蛋白、Hb-β、Hb-δ和PK；或者抑制蛋白、Hb-β、PK和S100A8。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述蛋白质由以下组成：PK、S100A8和S100A9；PK、Hb-β和Hb-δ；PK、S100A8和Hb-β；PK、S100A8、Hb-β和Hb-δ；PK、S100A9、Hb-β和Hb-δ；PK、S100A8、S100A9和Hb-β；A1AGP、PK、S100A8和S100A9；A1AGP、Hb-β、Hb-δ和PK；A1AGP、PK、S100A8和S100A9；抑制蛋白、Hb-β、Hb-δ和PK；或者抑制蛋白、Hb-β、PK和S100A8。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所确定的所述浓度值被算术地处理为0到1之间的数字。
9.一种蛋白质在人类患者的唾液样本中作为生物标志物的用途，所述蛋白质为丙酮酸激酶(PK)以及以下中的至少两种：血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)，所述生物标志物用于评估所述患者是具有轻度牙周炎还是重度牙周炎。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述人类患者的年龄也被用作生物标志物。
11.一种用于评估人类患者是具有轻度牙周炎还是重度牙周炎的系统，所述系统包括：
-检测装置，能够以及适于在所述人类患者的唾液样本中检测以下蛋白质：丙酮酸激酶(PK)以及以下中的至少两种：血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)；
-处理器，能够以及适于通过所述蛋白质的所确定的浓度，来确定所述患者具有轻度牙周炎或重度牙周炎的指示。
12.根据权利要求11所述的系统，还包括用于接纳口腔流体样本的容器，所述容器包括所述检测装置。
13.根据权利要求11或12所述的系统，还包括：
-用于向用户呈现指示的用户界面；以及
-所述处理器与所述用户界面之间的数据连接，所述数据连接用于将所述指示从所述处理器传输给所述用户界面。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的系统，其中所述处理器能够借助于基于互联网的应用来起作用。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的系统，其中所述界面能够输入关于所述对象的年龄的信息，并且所述处理器能够以及适于通过所确定的所述浓度，来确定所述患者具有轻度或重度牙周炎的指示。
16.一种用于在人类患者的唾液样本中检测用于牙周炎的至少三种生物标志物的试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种检测试剂，所述一种或多种检测试剂用于检测丙酮酸激酶(PK)以及以下中的至少两种：血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述一种或多种检测试剂包括至少三种检测试剂，第一检测试剂用于检测丙酮酸激酶(PK)，第二检测试剂用于检测血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的一种，并且第三检测试剂用于检测血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)中的不同的一种。
18.根据权利要求16或17所述的试剂盒，其中所述一种或多种检测试剂被包含在固体支持物上。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的试剂盒，其中所述一种或多种检测试剂由用于以下项的检测试剂组成：PK、S100A8和S100A9；PK、Hb-β和Hb-δ；PK、S100A8和Hb-β；PK、S100A8、Hb-β和Hb-δ；PK、S100A9、Hb-β和Hb-δ；PK、S100A8、S100A9和Hb-β；A1AGP、PK、S100A8和S100A9；A1AGP、Hb-β、Hb-δ和PK；A1AGP、PK、S100A8和S100A9；抑制蛋白、Hb-β、Hb-δ和PK；或者抑制蛋白、Hb-β、PK和S100A8。
20.一种体外方法，所述体外方法用于确定在从第一时间点t1到第二时间点t2的时间间隔内患有牙周炎的人类患者的牙周炎状态的变化，所述方法包括：在t1时从所述患者获得的至少一个唾液样本中以及在t2时从所述患者获得的至少一个唾液样本中，检测以下蛋白质的浓度：丙酮酸激酶(PK)以及以下中的至少两种：血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)，以及比较所述浓度，由此在所述浓度的任何一种、两种或所有三种中的差异反映出状态变化。
21.一种诊断人类患者是具有轻度牙周炎还是重度牙周炎的方法，所述方法包括：在所述人类患者的唾液样本中检测以下蛋白质：丙酮酸激酶(PK)以及以下中的至少两种：血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)；以及基于所述样本中的所述蛋白质的浓度，评估所述患者的轻度牙周炎或重度牙周炎的存在。
22.一种在患有轻度或重度牙周炎的人类患者中检测蛋白质的方法，所述蛋白质是丙酮酸激酶(PK)以及以下中的至少两种：血红蛋白-β(Hb-β)、血红蛋白-δ(Hb-δ)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100钙结合蛋白A9(S100A9)，所述方法包括：
(a)从人类患者获得唾液样本；以及
(b)通过使所述样本与用于结合所述蛋白质的一种或多种检测试剂接触，并且检测每种蛋白质与所述一种或多种检测试剂之间的结合，来检测所述蛋白质是否存在于所述样本中。
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