TWI480040B - 雷公藤甲素用於製備治療與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病的藥物的用途 - Google Patents

Description

雷公藤甲素用於製備治療與運動神經元存活蛋白質表 現相關之疾病的藥物的用途

本發明係關於一種用於治療與運動神經元存活蛋白質(survival motor neuron protein,SMN)表現相關之疾病的醫藥組合物，且特別關於一種用於治療與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病的醫藥組合物，其以雷公藤甲素(triptolide)為活性成分，其中，由雷公藤甲素具有增加運動神經元存活蛋白質表現的功效。

在人類中，具有一個端粒複製(telomeric copy)之運動神經元1(survival motor neuron 1,SMN1)基因與數個中心粒複製(centromeric copy)之運動神經元2(SMN2)基因。SMN1與SMN2基因分別編碼出90%與10%全長運動神經元存活蛋白質(full-length survival motor neuron,FL-SMN)。一般而言，有效FL-SMN蛋白質可維持運動神經元的存活。FL-SMN蛋白質無所不在地被表現並且位於細胞質與細胞核兩者中。在細胞核中，SMN藉由緊密的蛋白質-蛋白質互相作用與Gemin2-8結合，形成一穩定之多重蛋白質複合物，稱為gems(Liu and Dreyfuss,1996)，其在剪接體小核核糖蛋白(spliceosomal small nuclear ribonucleoproteins,snRNPs)的裝配中扮演一個必要角色(Meister et al.,2002；Eggert et al.,2006；Neuenkirchen et al.,2008；Talbot and Davies,2008)。在SMN複合物之組成中，Gemin2與Gemin3兩者直接且穩定地與SMN互相作用(Todd et al.,2010)。介 於SMN與Gemin2之間的關係大於SMN複合物之任何其他組成(Ogawa et al.,2007)。SMN複合物之互相作用的向下調控可導致SMN蛋白質的量降低與運動神經元退化(Friesen et al.,2001；Gubitz et al.,2004；Yong et al.,2004；Morris,2008；Chari et al.,2009)。

脊髓性肌肉萎縮症(spinal muscular atrophy,SMA)為一種常染色體隱性神經元退化疾病(autosomal recessive neurodegenerative disease)，其以脊髓之前角(anterior horn)中的α-運動神經元退化為特徵，引起肌肉癱瘓(muscular paralysis)與肌肉萎縮(muscular atrophy)。一般而言，根據發病年齡(age of onset)、嚴重程度與臨床運動功能測試，SMA被分成三種類型。從最嚴重至輕微之分類為：第一型(沃尼克-霍夫曼症(Werdnig-Hoffmann disease))、第二型(中等程度)與第三型(庫格勃-韋蘭德症(Kugelberg-Welander disease))。另外，還有兩種額外之類型，第四型(具有非常輕微症狀的成人發病)與第0型(產前發病結合嚴重症狀導致早期新生兒死亡)(Dubowitz,1999；Russman,2007；Lunn and Wang,2008)。SMA起因於同型合子瓦解(homozygous disruption)以及由於缺失或突變所導致之SMN1基因功能喪失。大於98%之SMA病患的SMN1基因功能喪失，但是卻永遠維持至少一個SMN2基因的複製(Monani,2005)。

然而，直至今日，仍然沒有一有效的藥物或治療方式可治療與運動神經元存活蛋白質缺乏相關之疾病，特別是沒有一有效的藥物或治療方式可減緩或反轉於SMA中的 神經元退化。因此，目前亟需一新穎之藥物，其可有效治療與運動神經元存活蛋白質表現相關的疾病。

本發明提供一種用於治療與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病的醫藥組合物，包括：一有效量之雷公藤甲素為活性成分，該雷公藤甲素之分子式如式(I)所示： 以及一藥學上可接受之載體或鹽類。

本發明也提供一種運動神經元存活蛋白質表現的促進劑，包括雷公藤甲素為活性成分，該雷公藤甲素之分子式如式(I)所示：

本發明還提供一種雷公藤甲素在製備用於治療與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病的藥物用途，該雷公藤甲素之分子式如式(I)所示：

為了讓本發明之上述和其他目的、特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下：

在本發明一第一態樣中，本發明提供一種以雷公藤甲素(triptolide)為主要活性成分之用於治療與運動神經元存 活蛋白質表現相關之疾病的醫藥組合物，其具有增加運動神經元存活蛋白質表現的功效，而上述雷公藤甲素之分子式如式(I)所示：

上述本發明之用於治療與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病的醫藥組合物，可包括，但不限於，一有效量之雷公藤甲素與一藥學上可接受之載體或鹽類，其中雷公藤甲素為增加運動神經元存活蛋白質表現的活性成分。

雷公藤甲素，其為原始來自雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.F.)之一種具有生物活性的二萜內酯。而於本發明藥學組合物中所使用之雷公藤甲素，可為來自一植物或者是為人工合成，並無特別限定。

於此，用語“與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病”意指一疾病，其發病原因與運動神經元存活蛋白質表現量直接相關，抑或是，一疾病，其發病機制牽涉到運動神經元存活蛋白質表現量。與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病的例子，可包括，但不限於，脊髓性肌肉萎縮症、肌萎縮性側索硬化症與運動神經元損傷等。在一實施 例中，上述與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病為脊髓性肌肉萎縮症。又，上述脊髓性肌肉萎縮症可包括第一型、第二型及/或第三型脊髓性肌肉萎縮症，並無特別限制。

本發明組合物中之雷公藤甲素具有增加運動神經元存活蛋白質表現的能力。在一實施例中，雷公藤甲素in vitro 或in vivo 具有增加運動神經元存活蛋白質表現的能力。此外，雷公藤甲素具有增加全長運動神經元存活基因2與外顯子7缺乏運動神經元存活基因2的轉錄能力。又，上述雷公藤甲素具有增加Gemin2蛋白質及/或Gemin3蛋白質表現的能力，且同時於細胞核內增加之Gemin2蛋白質與運動神經元存活蛋白質形成一運動神經元存活蛋白質複合物，又稱之為核點(nuclear gem)。

而於上述本發明用於治療與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病的醫藥組合物中，前述藥學上可接受之載體可包括，但不限於溶劑、分散媒(dispersion medium)、套膜(coating)、抗菌與抗真菌試劑與一等滲透壓與吸收延遲(absorption delaying)試劑等與藥學投予相容者。對於不同的給藥方式，可利用一般方法將藥學組合物配置成劑型(dosage form)。

又，上述藥學上可接受之鹽類可包括，但不限於鹽類包括無機陽離子，例如，鹼金屬鹽類，如鈉、鉀或胺鹽，鹼土金族鹽類，如鎂、鈣鹽，含二價或四價陽離子之鹽類，如鋅、鋁或鋯鹽。此外，也可是為有機鹽類，如二環己胺鹽類、甲基-D-葡糖胺，胺基酸鹽類，如精胺酸、離胺酸、組織胺酸、麩胺酸醯胺。

本發明藥學組合物之給藥可以口服、非口服、經由吸入噴霧(inhalation spray)或藉由植入貯存器(implanted reservoir)的方式。非口服可包括(subcutaneous)、皮內(intracutaneous)靜脈內(intravenous)、肌肉內(intramuscular)、關節內(intraarticular)動脈(intraarterial)、滑囊(腔)內(intrasynovial)、胸骨內(intrasternal)蜘蛛膜下腔(intrathecal)、疾病部位內(intralesional)注射以及灌注技術。

口服成分的形式可包括，但不限定於，藥錠、膠囊、乳劑(emulsions)、水性懸浮液(aqueous suspensions)、分散液(dispersions)與溶液。

另外，在本發明一第二態樣中，本發明提供一種運動神經元存活蛋白質促進劑，其以雷公藤甲素為活性成分，且具有增進運動神經元存活蛋白質表現之功效，而雷公藤甲素之分子式如式(I)所示：

上述運動神經元存活蛋白質促進劑，可包括，但不限於，一有效量之雷公藤甲素，其中雷公藤甲素為增加運動 神經元存活蛋白質表現的活性成分。而於本發明促進劑中所使用之雷公藤甲素，可為來自一植物或者是為人工合成，並無特別限定。

本發明運動神經元存活蛋白質促進劑之雷公藤甲素具有增加運動神經元存活蛋白質表現的能力。在一實施例中，雷公藤甲素in vitro 或in vivo 具有增加運動神經元存活蛋白質表現的能力。此外，雷公藤甲素具有增加全長運動神經元存活基因2與外顯子7缺乏運動神經元存活基因2的轉錄的能力。又，上述雷公藤甲素具有增加Gemin2蛋白質及/或Gemin3蛋白質表現的能力。且同時於細胞核內增加之Gemin2蛋白質與運動神經元存活蛋白質形成一運動神經元存活蛋白質複合物，又稱之為核點。

在一實施例中，可將本發明運動神經元存活蛋白質促進劑應用於與運動神經元存活蛋白質相關之疾病的治療。而上述與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病意指一疾病，其發病原因與運動神經元存活蛋白質表現量直接相關，或者是，一疾病，其發病機制牽涉到運動神經元存活蛋白質表現量。與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病的例子，可包括，但不限於，脊髓性肌肉萎縮症、肌萎縮性側索硬化症與運動神經元損傷等。在一實施例中，上述與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病為脊髓性肌肉萎縮症。上述脊髓性肌肉萎縮症可包括第一型、第二型及/或第三型脊髓性肌肉萎縮症，並無特別限制。

在本發明一第三態樣中，本發明提供一種雷公藤甲素在製備用於治療與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病 的藥物的用途，而雷公藤甲素之分子式如式(I)所示：

於此，將上述與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病意定義為一疾病，其發病原因與運動神經元存活蛋白質表現量直接相關，或者是，一疾病，其發病機制牽涉到運動神經元存活蛋白質表現量。與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病的例子，可包括，但不限於，脊髓性肌肉萎縮症、肌萎縮性側索硬化症與運動神經元損傷等。在一實施例中，上述與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病為脊髓性肌肉萎縮症。上述脊髓性肌肉萎縮症可包括第一型、第二型及/或第三型脊髓性肌肉萎縮症，並無特別限制。

於本發明中確認雷公藤甲素具有增加運動神經元存活蛋白質表現的能力。在一實施例中，雷公藤甲素in vitro 或in vivo 具有增加運動神經元存活蛋白質表現的能力。此外，雷公藤甲素具有增加全長運動神經元存活基因2與外顯子7缺乏運動神經元存活基因2的轉錄的能力。又，上述雷公藤甲素具有增加Gemin2蛋白質及/或Gemin3蛋白質表現的能力，且同時於細胞核內增加之Gemin2蛋白質 與運動神經元存活蛋白質形成一運動神經元存活蛋白質複合物，又稱之為核點。

【實施例】

A.方法

1.細胞培養

如先前文獻所述來培養NSC34、小鼠神經母細胞瘤(neuroblastoma)，N18TG2與小鼠胚胎脊髓運動神經元(embryonic spinal cord motor neuron)細胞株(Rizzardini et al.,2006)。簡單而言，使細胞生長於添加10%熱去活化胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)與抗生素(100U．mL^-1 penicillin and 100mg．mL^-1 鏈黴素(streptomycin))之達氏修正依氏培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)中。將細胞培養於37℃，含5% CO₂ 之潮濕空氣下直到細胞聚滿(confluence)。每3天更換一次培養基，且每3-5天將聚滿之細胞以胰蛋白酶(trypsin)溶液來繼代。下述實驗為在80%細胞聚滿之狀態下執行。

人類SMA纖維母細胞(fibroblast)細胞株係從具有知情同意書(informed consent)之SMA病患切片來建立，且如先前文獻所述來製備(Yuo et al.,2008)。知情同意書係經由高雄醫學大學附設中和紀念醫院(Kaohsiung Medical University Chung-Ho Memorial Hospital)之人體試驗委員會(institutional review board)(KMUH-IRB-990122)所公認。將纖維母細胞維持於添加10% FBS、100U．mL^-1 青黴素(penicillin)與100μg．mL^-1 鏈黴素之DMEM/F12培養基中。 將細胞維持於37℃，含5% CO₂ 之潮濕空氣下。

2.細胞存活率分析

細胞存活率係以藉由使用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)之定量比色分析(quantitative colorimetric assay)來測量，顯示存活細胞之粒腺體(mitochondrial)活性。將細胞置於96孔盤中且以不同濃度之雷公藤甲素來培養。在24小時後，將細胞以0.1mg．mL^-1 終濃度的MTT於37℃培養3小時。藉由添加100μL之二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide,DMSO)來終止反應。藉由使用一微量盤式分析儀(microplate reader)測來於560nm之吸收來測定MTT甲臢(formazan)產物的量。

3.藉由膜聯蛋白(annexin)V的細胞凋亡(apoptosis)分析

以Annexin V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide,PI)(Rizzardini et al.)雙重染色(double staining)來偵測遭遇細胞凋亡的細胞。簡單而言，將貼附至塑膠培養盤之細胞藉由0.25%之胰蛋白酶來收集並以冷的PBS來清洗兩次。將細胞塊以1×10⁶ 顆細胞．mL^-1 之濃度懸浮於1倍的結合緩衝溶液(10mM HEPES/NaOH,pH 7.4,140mM NaCl,2.5mM CaCl₂ )中。之後，於黑暗中，以Annexin V-FITC與PI培養細胞15分鐘(22-25℃)。藉由Coulter CyFlow® Cytometer (Partec,Germany)立即分析經染色之細胞。Annexin V-陽性細胞被視為凋亡細胞。

4.動物與雷公藤甲素處理

如先前文獻所述來產生類SMA(SMA-like)(Smn^-/- SMN2)小鼠(Hsieh-Li et al.,2000)。於本發明中所使用之所有動物以及關於使用動物之所有步驟，為經由於高雄醫學大學之動物管理及使用委員會(the Animal Care and Use Committee)所認證(認證識別：98096)。簡單而言，將雜合之小鼠Smn剔除-人類SMN2轉殖小鼠(Smn^+/- SMN2^+/- )與C57BL/6小鼠(購自國家實驗動物繁殖及研究中心，台灣)回交(backcross)。在大於六代的遺傳背景純化後，獲得Smn^+/- SMN2^+/- 小鼠，其可產生類SMA小鼠(Tsai et al.,2008)。藉由尾部DNA的PCR分析來對小鼠進行基因型分析。動物被允許自由食用食物、水，且居住於常溫與經控制之照明(於07時30分與19時30分之間開啟照明)的環境下。

將年齡匹配(age-matched)之動物分成五個實驗組別：野生型(WT,Smn^+/+ SMN2^-/- )組；SMA第三型小鼠組；載劑處理SMA第三型小鼠組(接受5% DMSO於生理時鹽水中)；以0.01或0.1mg．kg^-1 ．day^-1 之雷公藤甲素(溶於5% DMSO/生理食鹽水中)腹腔注射的SMA第三型小鼠組。在實驗期間每日監測存活與體重。

在將動物犧牲之後，獲得小鼠之大腦、脊髓與腓腸肌(gastrocnemius muscle)。之後，立即將所有組織於放射免疫 沈澱分析(radio immuno precipitation assay,RIPA)緩衝溶液中均質化，並在離心後收集上清液。在西方墨點分析之前測定蛋白質量。

5.存活率分析與體重發展

使用30口徑(gauge)1英吋長的注射針，經由腹腔注射，使五天大的小鼠接受0.1mg．kg^-1 ．day^-1 的雷公藤甲素。將出生之日標示為出生後天數(postnatal day)(P)1。控制組僅接受等體積的載劑。於P1開始測量每日的體重。

6.西方墨點分析

將細胞或組織於細胞分解緩衝溶液(cell lysis buffer)(Thermo)中均質化。藉由Bio-Rad DC Protein Assay(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)來測定蛋白質濃度。將各泳道(lane)載入20μg蛋白質，之後藉由SDS-PAGE來分離，並藉由免疫疫轉漬法(immunoblotting)轉移至聚二氟乙烯(polyvinyl difluoride)膜。於室溫以含5% BSA之三羥甲基氨基甲烷緩衝鹽水(Tris Buffered saline Tween,TBST)(50mM Tris-HCl,pH 7.6,150mM NaCl,0.1% Tween 20)來進行非專一結合阻擋(block)1小時，且之後以下列專一的一級抗體之一於4℃進行隔夜培養：小鼠單株抗-SMN(1：5000)、兔子多株抗-Gemin2 H-100(1：500)、兔子多株抗-Gemin3 H-145(1：500)、兔子多株抗-SUV39H1(1：1000)、兔子多株抗-EZH2(1：1000)、小鼠單株抗-β-肌動蛋白(1：10000)。將膜以二級抗體於室溫培養1小時，且之後藉 由曝光至BioMaxMR底片(Kodak)來測定增強的化學發光(chemiluminescence)。核蛋白質之表現偵測而言，根據使用手冊使用核萃取套組(Nuclear Extraction Kit)(Rochester,NY,USA)來分離核萃取物。

7.訊息RNA(messenger RNA,mRNA)之定量分析

對於定量即時PCR(qPCR)實驗而言，將mRNA從纖維母細胞分離且純化、在必要的處理之後，以TRIzol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)均質化，且之後藉由異硫酸氰胍-酚-氯仿(acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform)萃取法來萃取。根據製造商建議步驟，使用Reverse Transcription System kit(Promega,Madison,WI,USA)來執行反轉錄。將1μg的總RNA(total RNA)反轉錄成cDNAs。使用qPCR來定量測定全長SMN2(FL-SMN2)與SMN2△7轉錄程度(transcript levels)。使用Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)於ABI PRISM 7500 Sequence Detector System(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)上執行qPCR。選擇引子來結合於SMN外顯子(exon)7(5’-GAAGGTGCTCACATTCCTTAAAT-3’)(序列辨識號：1)與SMN外顯子8(5’-ATCAAGAAGAGTTACCCATTCCA-3’)(序列辨識號：2)中以用於FL-SMN2轉錄體(transcript)的擴增，並選擇引子來結合於SMN外顯子5(5’-CCACCACCCCACTTACTATCA-3’)(序列辨識號：3)中與SMN外顯子6/外顯子8 border (5’-GCTCTATGCCAGCATTTCCATA-3’)(序列辨識號：4)以擴增經截斷之SMN2△7轉錄體(Riessland et al.,2006)。根據製造商操作指南，藉由比較SMN與GAPDH轉錄體，以使用臨界循環(threshold cycle,Ct)方法來計算轉錄體的相對量。將結果標準化做為介於在經處理與未經處理樣本中之轉錄體的相對量之間的比值。執行各樣本的qPCR反應於三重複，且實驗重複至少三次。

8.免疫螢光染色(immunofluorescence staining)與nuclear gems計數

免疫螢光染色為根據一般程序。簡單而言，使人類SMA纖維母細胞生長於一玻璃培養槽玻片(glass chamber slides)上。在處理後，將細胞以4%三聚甲醛(paraformaldehyde)固定，並以於PBS中之0.2% Triton X-100透性化(permeabilized)。在以於PBS中之2% BSA阻擋後，將細胞以小鼠單株抗-SMN抗體與兔子多株抗-Gemin2 H-100抗體於4℃隔夜培養。之後加入Alexa Fluor 555山羊抗-小鼠IgG與Alexa Fluor 488山羊抗-兔子IgG二及抗培養1小時。4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)核酸染色確認gems的位置。在以共軛焦雷射掃描式顯微鏡(FluoView1000；Olympus,Center Valley,PA,USA)觀察前，將玻片固定並且密封。將每100個細胞之總計經染色gems進行分析。

9.資料分析

藉由採取用於多重比較之Bonferroni事後比較檢定(post hoc test)的Kaplan-Meier曲線與對數等級檢定(log-rank test)來分析存活率。藉由採取用於多重比較ANOVA之事後比較檢定Tukey’s來評估體重曲線。藉由採取ANOVA之所有配對比較以Dunnett’s來檢定執行蛋白質程度與即時PCR資料的統計分析。資料被顯示為平均值±標準差。機率值(probability values,P )小於0.05被視為在所有實驗中為顯著的。以社會科學統計套裝軟體(Statistical Package for Social Sciences)(SPSS,Version 14.0,Chicago,IL,USA)來分析所有資料。

10.材料

雷公藤甲素與MTT為獲自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。DMEM、Ham’s F-12 Medium、FBS、青黴素、兩性黴素(amphotericin)B與鏈黴素為獲自Invitrogen。用於SDS-PAGE的所有材料為獲自Bio-Rad。抗Gemin2,Gemin3與SUV39H1之兔子抗體與所有二級抗體為獲自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA,USA)。抗EZH2之兔子抗體為獲自Cell Signaling Technology(Beverly,MA,USA)。抗SMN小鼠之抗體為獲自BD Bioscience(San Jose,CA,USA)。抗β-肌動蛋白之小鼠抗體為獲自Sigma-Aldrich。所有其他化學物為購自Sigma Chemical Co.。

B.結果

1.在類運動神經元(motor neuron-like)細胞株NSC34中於pM濃度之雷公藤甲素增加SMN、Gemin2與Gemin3的蛋白質程度

首先藉由使用NSC34細胞來實驗雷公藤甲素(0.01-1pM)對於SMN蛋白質之調控的影響。將細胞以載劑(0.001% DMSO於二次水中)與雷公藤甲素(0.01、0.1與1pM)分別處理24小時。之後將蛋白質萃取物進行SDS-PAGE，並藉由西方墨點法來分析將SMN、Gemin2、Gemin3與β-肌動蛋白的表現。將在以β-肌動蛋白標準化之SMN、Gemin2、與Gemin3程度中的改變進行定量，且表示成載劑組的百分比。對於SMN以及Gemin2、Gemin3的結果分別顯示於第1A圖與第1B圖中。柱狀物表示從三個獨立實驗之平均值±標準差。相對於載劑組*P <0.05、**P <0.01與***P <0.001(採用ANOVA後再用Dunnett’s檢定)。

結果指出，與載劑(0.001% DMSO於二次水中)處理細胞相較，雷公藤甲素顯著地向上調控SMN蛋白質程度(第1A圖)。之後研究雷公藤甲素對於SMN複合物(SMN complex)之組成，Gemin2與Gemin3之表現的影響。如於第1B圖中所示，雷公藤甲素顯著地增加Gemin2與Gemin3的表現。

2.在人類SMA纖維母細胞中於pM濃度之雷公藤甲素增加SMN蛋白質程度

藉由將來自三種不同類型之SMA病患的纖維母細胞 以雷公藤甲素處理，來進一步探討在人類SMA纖維母細胞中雷公藤甲素對於SMN蛋白質表現之調控的影響。分別將纖維母細胞以雷公藤甲素(0.01、0.1與1pM)處理24小時。將蛋白質進行萃取並進行SDS-PAGE。之後，藉由西方墨點法來測量SMN與β-肌動蛋白的蛋白質表現。將在以β-肌動蛋白標準化之SMN蛋白質程度中的改變進行定量，且表示成載劑組的百分比。對於來自第一類型、第二類型與第三類型之SMA病患的纖維母細胞的西方墨點分析結果，分別顯示於第2A圖、第2B圖與第2C圖中。對於來自第一類型、第二類型與第三類型之SMA病患的纖維母細胞的SMN蛋白質程度的定量結果顯示於第2D圖中。柱狀物表示從三個獨立實驗之平均值±標準差。相對於載劑組*P <0.05、**P <0.01與***P <0.001(採用ANOVA後再用Dunnett’s檢定)。

結果指出，於所有三種類型之SMA纖維母細胞中，與載劑(0.001% DMSO於二次水中)處理細胞相較，雷公藤甲素皆顯著地向上調控SMN蛋白質程度(第2A-D圖)。

3.於SMA纖維母細胞中雷公藤甲素增加Gemin2與Gemin3的表現以及含SMN之nuclear gems的數目

接著，研究在三種不同類型之SMA纖維母細胞中雷公藤甲素對於SMN複合物組成的表現的影響。

分別將纖維母細胞以雷公藤甲素(0.01、0.1與1pM)處理24小時。藉由西方墨點法來分析Gemin2、Gemin3與β-肌動蛋白的蛋白質表現。將在以β-肌動蛋白標準化之 Gemin2與Gemin3蛋白質程度中的改變進行定量。對於來自第一類型、第二類型與第三類型之SMA病患的纖維母細胞的結果，分別顯示於第3A圖、第3B圖與第3C圖中。柱狀物表示從三個獨立實驗之平均值±標準差。相對於載劑組*P <0.05、**P <0.01與***P <0.001(採用ANOVA後再用Dunnett’s檢定)。如於第3A-C圖中所示，於所有三種類型之SMA纖維母細胞中，雷公藤甲素顯著地增加Gemin2與Gemin3的表現。

另外，核點(nuclear gem)的數目與SMN蛋白質程度相關，且其在具有SMA之病患中顯著地被減少。為更進一步確定增加之SMN量的確為功能性蛋白，使用共軛焦顯微鏡來分析，於經雷公藤甲素處理之細胞中之SMN的細胞內位置。將人類SMA第三型纖維母細胞以雷公藤甲素(1pM)處理24小時。以抗-SMN-與抗-Gemin2-專一抗體，藉由共軛焦顯微鏡來觀察含SMN之nuclear gems的總數/100個細胞。使用Alexa Fluor 555山羊抗-小鼠IgG(紅色)與Alexa Fluor 488山羊抗-兔子IgG(綠色)為二級抗體。DAPI(藍色)被用於核染色(nuclei staining)。第4A圖顯示染色結果，第4B圖顯示含SMN與Gemin2結合在細胞核內之核點的總數。柱狀圖表示從三個獨立實驗之平均值±標準差。相對於載劑組，*P <0.05(採用ANOVA後再用Dunnett’s檢定)。如於第4A-B圖中所示，與經載劑處理之SMA纖維母細胞相較，以雷公藤甲素(1pM)處理，顯著地增加核點的數目。

4.雷公藤甲素於人類SMA纖維母細胞中增加全長SMN2(FL-SMN2)轉錄體

為了測定是否雷公藤甲素誘導之SMN蛋白質的增加導致了含外顯子7之SMN蛋白質之量的增加，使用區別兩變體(FL-SMN2與SMN2△7)之引子組的qPCR來實驗雷公藤甲素來實驗雷公藤甲素對於SMN2轉錄的影響。

將細胞以雷公藤甲素(0.01,0.1與1pM)處理24小時。將以GAPDH標準化之FL-SMN2/SMN2△7比進行定量。所有資料顯示成從三個獨立實驗之相對於GAPDH於任意單位(arbitrary unit)形式的平均值±標準差。對於來自第三類型之SMA病患的纖維母細胞的結果，顯示於第5A圖與第5B圖中，而對於來自第一類型之SMA病患的纖維母細胞的結果，顯示於第5C圖與第5D圖中。相對於載劑組*P <0.05與**P <0.01(採用ANOVA後再用Dunnett’s檢定)。

FL-SMN2轉錄體相較於SMN2△7轉錄體增加至一較大的程度。FL-SMN2比SMN2△7的比值顯著地增加至1.6倍於以雷公藤甲素處理SMA第三型纖維母細胞之後(第5A圖與第5B圖)，而不是以雷公藤甲素處理SMA第一型纖維母細胞之後(第5C圖與第5D圖)。這些結果指出雷公藤甲素增加SMN蛋白質程度，部分是因為SMN2轉錄體的活化。它們也指出至少在SMA第三型纖維母細胞中，雷公藤甲素可促進外顯子7的插入(inclusion)。

5.在SMN2活化濃度並未偵測到細胞毒性影響

使用MTT分析與Annexin V/PI staining染色來實驗雷 公藤甲素在活化SMN2之濃度的細胞毒性。

分別將SMA纖維母細胞以載劑與雷公藤甲素(0.01、0.1、1、10與100pM)處理24小時。藉由MTT分析測定細胞存活率，結果顯示於第6A圖中。將細胞存活率中之改變顯示成載劑組之百分比。藉由使用Annexin V/PI染色之流式細胞儀來分析細胞凋亡。將各組別之細胞凋亡顯示為一細胞凋亡指數(apoptosis index)，其係藉由計算凋亡細胞(Annexin V-陽性細胞)之百分比來評估，結果顯示於第6B圖中。將環己醯亞胺(cycloheximide,CHX)10mg．mL^-1 使用為誘發細胞凋亡之正控制組。柱狀物表示從三個獨立實驗之平均值±標準差。相對於載劑組***P <0.001(採用ANOVA後再用Dunnett’s檢定)。

如於第6A與6B圖中所示，不論載劑或雷公藤甲素兩者都不具細胞毒性且都不增加細胞死亡。

6.雷公藤甲素在類SMA小鼠之神經元與肌肉組織中增加SMN蛋白質程度

由於上述in vitro 資料顯示雷公藤甲素可顯著地增加SMA蛋白質於人類SMA纖維母細胞中，因此更進一步實驗雷公藤甲素對於類第三型SMA小鼠中的影響。

分別將小鼠(Smn^-/- SMN2)每日注射載劑或雷公藤甲素(0.01或0.1mg．kg^-1 ．day^-1 ，腹腔注射)達一週。從野生型(WT,Smn^+/+ SMN2^-/- )(n=5)與經載劑或雷公藤甲素處理之類第三型SMA組別中(每組n=5)分離出大腦、脊髓與腓腸肌。分別萃取來自多種組織之總蛋白質，並藉由西 方墨點法來測定SMN蛋白質含量，結果顯示第7A圖中。又，將大腦、脊髓與腓腸肌中之SMN蛋白質進行定量，結果顯示於第7B圖中。將β-肌動蛋白(對於大腦與脊髓)或GAPDH(對於腓腸肌)使用為載入控制組。相對於載劑組*P <0.05與**P <0.01。相對於野生型組，###P <0.001(採用ANOVA後再用Dunnett’s檢定)。

在此in vivo 實驗期間，在所有組別中，小鼠之體重與死亡率沒有顯著改變(資料未顯示)。如於第7A與7B圖中所示，來自經雷公藤甲素處理SMA小鼠組別的所有組織接顯示，SMN蛋白質程度之顯著提升，特別是在較高劑量(0.1mg．kg^-1 ．day^-1 )使用時。最重要地，這些in vivo 資料指出，雷公藤甲素增加SMN蛋白質於涉及SMA病狀的兩個主要組織，脊髓與肌肉中。

7.雷公藤甲素處理改善類SMA小鼠的存活率與類降低了SMA小鼠的體重減輕

先前文獻已顯示出生後5天(P5)之SMA小鼠顯示此疾病之清楚表現形式(Le et al.,2005；Avila et al.,2007)，且P5至P13為SMA小鼠最佳的藥物治療時期(minimal window)(Narver et al.,2008)。於此實驗中，從出生後5天至出生後18天，每日以雷公藤甲素(0.1mg．kg^-1 )或載劑腹腔注射類SMA小鼠(Smn^-/- SMN2)與野生型小鼠(WT,Smn^+/+ SMN2^-/- )，並監測其存活率與體重。以Kaplan-Meier存活曲線顯示以雷公藤甲素處理(n=15)或載劑(n=13)處理之小鼠的存活，結果顯示於第8A圖中。P <0.001(對數 等級檢定)。第8B圖顯示以雷公藤甲素處理(n=15)或載劑(n=13)處理之SMA小鼠以及以雷公藤甲素處理(n=20)或載劑(n=20)處理之野生型小鼠的體重。相對於以載劑處理組之SMA小鼠，*P <0.05與**P <0.01(採用ANOVA後再用Tukey’s檢定)。

如於第8A圖中所示，雷公藤甲素處理的小鼠存活率比載劑處理的小鼠存活率增加了3.63天(經雷公藤甲素處理，存活率為11.86±1.25天；經載劑處理，存活率為8.23±1.45天)，其顯示牠們壽命44.16%的增加。SMA之第一臨床症狀之一為體重降低。SMA小鼠於年齡5天(P5)時明顯體重不足(Le et al.,2005)。以5天年齡與野生型小鼠相較，載劑處理SMA小鼠顯示顯著之體重差異(1.90±0.37g相對於2.65±0.70g，第8B圖)。然而，與載劑處理SMA小鼠相較，雷公藤甲素處理SMA小鼠顯示在體重方面輕微的增加。在年齡10至12天生長曲線顯示明顯地不同。

上述各實驗清楚顯示，雷公藤甲素可in vitro 及in vivo 增加SMN蛋白質之表現。又雷公藤甲素可增加為SMN複合物之組成的Gemin2與Gemin3的表現，且增加之SMN蛋白質與Gemin2形成SMN複合物，並可在細胞核中形成核點(nuclear gem)。再者，雷公藤甲素在可使SMN2活化之濃度並無細胞毒性。因此由上述各實驗結果可清楚得知，雷公藤甲素可用於治療運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病，特別是SMA。

雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

第1A與1B圖分別顯示雷公藤甲素在NSC34細胞中對於SMN蛋白質程度與SMN複合物組成的影響。

第2A至2D圖顯示在來自不同類型之SMA病患之人類SMA纖維母細胞中，由於雷公藤甲素的SMN蛋白質程度向上調控。

第3A至3C圖顯示雷公藤甲素在來自不同類型之SMA病患之人類SMA纖維母細胞中對於SMN複合物組成Gemin2與Gemin3蛋白質表現的影響。

第4A與4B圖分別顯示雷公藤甲素在人類SMA第三型纖維母細胞細胞株中對於核中之含SMN和Gemin2的核點與核點之數目的影響。

第5A與5B圖顯示在SMA第三型纖維母細胞中藉由定量即時PCR所測定之FL-SMN2與SMN2△7轉錄體。

第5C與5D圖顯示在SMA第一型纖維母細胞中藉由定量即時PCR所測定之FL-SMN2與SMN2△7轉錄體。

第6A圖顯示雷公藤甲素對於人類SMA第三型纖維母細胞不具細胞毒性影響。

第6B圖顯示藉由使用Annexin V/PI染色之流式細胞儀測定經雷公藤甲素處理之人類SMA第三型纖維母細胞的凋亡的結果。

第7A與7B圖顯示在經雷公藤甲素處理之類SMA小鼠之腦部、脊髓與肌肉中的SMN蛋白質向上調控。

第8A與8B圖分別顯示雷公藤甲素增加類SMA小鼠之存活率與減少SMA小鼠的體重降低。

<110> 雷公藤甲素用於製備治療與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病的藥物的用途

<120> 高雄醫學大學

<130> 0911-A52772TW

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 1

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 2

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 3

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 4

Claims (9)

1. 一種雷公藤甲素在製備用於治療與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病的藥物的用途，該雷公藤甲素之分子式如式(I)所示：
2. 如申請專利範圍第1項所述之雷公藤甲素在製備用於治療與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病的藥物的用途，其中該與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病包括脊髓性肌肉萎縮症、肌萎縮性側索硬化症或運動神經元損傷。
3. 如申請專利範圍第1項所述之雷公藤甲素在製備用於治療與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病的藥物的用途，其中該與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病為脊髓性肌肉萎縮症。
4. 如申請專利範圍第3項所述之雷公藤甲素在製備用於治療與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病的藥物的用途，其中該脊髓性肌肉萎縮症包括第一型、第二型及/或第三型脊髓性肌肉萎縮症。
5. 如申請專利範圍第1項所述之雷公藤甲素在製備用於治療與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病的藥物的用途，其中該式(I)所示的化合物具有增加運動神經元存活蛋白質表現的能力。
6. 如申請專利範圍第1項所述之雷公藤甲素在製備用於治療與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病的藥物的用途，其中該式(I)所示之化合物具有增加全長運動神經元存活基因2與外顯子7缺乏運動神經元存活基因2的轉錄的能力。
7. 如申請專利範圍第1項所述之雷公藤甲素在製備用於治療與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病的藥物的用途，其中該式(I)所示之化合物具有增加Gemin2蛋白質及/或Gemin3蛋白質表現的能力。
8. 如申請專利範圍第7項所述之雷公藤甲素在製備用於治療與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病的藥物的用途，其中於細胞核內該增加之Gemin2蛋白質與運動神經元存活蛋白質形成一運動神經元存活蛋白質複合物。
9. 如申請專利範圍第1項所述之雷公藤甲素在製備用於治療與運動神經元存活蛋白質表現相關之疾病的藥物的用途，其中該雷公藤甲素具有促進核點形成於一細胞核中的能力。