JP2016220559A - ヒトil−15分泌免疫不全マウス - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヒトインターロイキン2(IL−2)のシグナルペプチドをコードするcDNA配列にインターロイキン15(IL−15)をコードするcDNA配列が作動可能に連結されたDNAを含む遺伝子領域である塩基配列からなるDNAを免疫不全マウスのcDNAに挿入することにより、作製されたNOD−scid,IL−2rγnull−hIL−15 Tgマウスによると移植後少なくとも6カ月は、ヒト成熟NK細胞の研究をインビボで行うために十分な濃度のhCD56+細胞が検出される。
【選択図】なし
Description
[1]ヒトIL−15を分泌することができ、かつ、ヒト末梢血由来のヒトNK細胞を移植後に、hCD56+細胞がインビボで長期に検出されることを特徴とする、配列番号1に示される塩基配列からなるDNAがゲノムDNAに挿入されている免疫不全マウス。
[2]hCD56+細胞がさらにhCD16が陽性を示すhCD56+hCD16+細胞であることを特徴とする前記[1]記載の免疫不全マウス。
[3]hCD56+細胞が、脾臓、肝臓及び/又は肺において検出されるが、骨髄において検出されない細胞であることを特徴とする前記[1]又は[2]記載の免疫不全マウス。
[4]hCD56+細胞が、細胞表面分子として、hNKG2A、hNKG2C、hNKG2D、hCD94、hNKp30、hNKp46、hNKp44、hNKp80、hCD57、hCD158a/h(KIR)、hCD158b(KIR)、hCD158d(KIR)、hCD158e(KIR)、又はhCD158f(KIR)について陽性を示す細胞であることを特徴とする前記[1]〜[3]のいずれか記載の免疫不全マウス。
[5]ヒト末梢血由来のヒトNK細胞を移植後に、サイトカイン存在下で、ヒト腫瘍の生育をインビトロで抑制することができることを特徴とする前記[1]〜[4]のいずれか記載の免疫不全マウス。
[6]サイトカインが、hIL−15であることを特徴とする前記[5]記載の免疫不全マウス。
[7]ヒト末梢血由来のヒトNK細胞を移植後に、ヒト腫瘍の生育をインビボで抑制することができることを特徴とする前記[1]〜[6]のいずれか記載の免疫不全マウス。
[8]以下の(1)〜(7)の工程を順次含む上記NOD−scid,IL−2rγnull−hIL−15 Tgマウスの作製方法。
(1)配列番号1に示される塩基配列からなるDNAをマウスゲノムDNAに挿入するために必要な領域を含むベクターに、配列番号1に示される塩基配列を含むDNAを導入することにより、配列番号1に示される塩基配列を含むDNAを有するマウス受精卵注入DNA調製用ベクターを作製する工程;
(1−1)必要に応じて、配列番号1に示される塩基配列からなるDNAと、配列番号1に示される塩基配列を含むDNAがマウスゲノムDNAに挿入されるために必要な領域とを含む受精卵注入用DNA断片を調製する工程;
(2)上記工程(1)において作製されたベクター及び/又は上記(1−1)で調製されたベクター断片をインターロイキン2受容体γ鎖遺伝子(IL−2Rγ)ノックアウトマウスの受精卵に注入することにより注入受精卵を作製する工程;
(3)上記工程(2)において作製された注入受精卵を培養することにより、新生子マウスを作製する工程;
(4)上記工程(3)において作製されたマウスにおいて、配列番号1に示される塩基配列を含むDNAがNOD−IL−2rγnullマウスのゲノムDNAに挿入されたか否かを判定する工程;
(5)上記工程(4)において配列番号1に示される塩基配列を含むDNAがNOD−IL−2rγnullマウスのゲノムDNAに挿入されたと判定されたマウスが、hIL−15を分泌しているか否かを判定し、hIL−15を分泌しているマウスをNOD−IL−2rγnull−hIL−15Tgマウスとして選抜する工程;
(6)上記NOD−IL−2rγnull−hIL−15Tgマウスと、NOGマウスとを交配して、scid変異が導入されたNOD−scid,IL−2rγnull−hIL−15 Tgマウスを作製する工程;
(7)NOD−scid,IL−2rγnull−hIL−15 Tgマウスと、NOGマウスとを交配してNOD−scid,IL−2rγnull−hIL−15 TgマウスとNOGマウスとを1:1で作製する工程;
(1−1)必要に応じて、配列番号1に示される塩基配列からなるDNAと、配列番号1に示される塩基配列を含むDNAがマウスゲノムDNAに挿入されるために必要な領域とを含む受精卵注入用DNA断片を調製する工程;
(2)上記工程(1)において作製されたベクター及び/又は上記(1−1)で調製されたベクター断片をインターロイキン2受容体γ鎖遺伝子(IL−2Rγ)ノックアウトマウスの受精卵に注入することにより注入受精卵を作製する工程;
(3)上記工程(2)において作製された注入受精卵を培養することにより、新生子マウスを作製する工程;
(4)上記工程(3)において作製されたマウスにおいて、配列番号1に示される塩基配列を含むDNAがNOD−IL−2rγnullマウスのゲノムDNAに挿入されたか否かを判定する工程;
(5)上記工程(4)において配列番号1に示される塩基配列を含むDNAがNOD−IL−2rγnullマウスのゲノムDNAに挿入されたと判定されたマウスが、hIL−15を分泌しているか否かを判定し、hIL−15を分泌しているマウスをNOD−IL−2rγnull−hIL−15Tgマウスとして選抜する工程;
(6)上記NOD−IL−2rγnull−hIL−15Tgマウスと、NOG(NOD−scid,IL−2rγnull)マウスとを交配して、scid変異が導入されたNOD−scid,IL−2rγnull−hIL−15 Tgマウスを作製する工程;
(7)NOD−scid,IL−2rγnull−hIL−15 Tgマウスと、NOGマウスとを交配してNOD−scid,IL−2rγnull−hIL−15 TgマウスとNOGマウスとを1:1で作製する工程;
[IL-15を産生するNOD−scid,IL−2rγnull−hIL−15 Tgマウスの作製]
(概要)
公益財団法人実験動物中央研究所(以下、「実中研」ともいう。)の動物実験委員会の承認を得たガイダンスに従い、NOD−IL−2rγnullマウスと、NOD−scid,IL−2rγnullマウス(以下、「NOGマウス」ともいう。)とを用いて、ヒトIL−15を分泌するトランスジェニックマウスである、NOD−scid,IL−2rγnull−hIL−15 Tgマウスを作製した。これらのマウスは、実中研のSPF飼育室において特別に管理されており、一定条件下で分譲可能である。
哺乳類用レポーターベクターであるpCMVβ(インビトロジェン社製)(図1(a)参照)を用いて、サイトメガロウイルスプロモーター(pCMV−IE)DNAの下流に、SV40SD/SV DNA、hIL−2SPcDNA/hIL−15cDNA連結体である配列番号1に示される塩基配列からなるDNA、及びポリA配列DNAが順次組み込まれた、受精卵注入DNA調製用ベクターを構築した。具体的には、上記pCMV−LacZを制限酵素NotIで切り出し、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を、Genbank(アクセッション番号:hIL−2(NM_000586)と、hIL−15(NM_000585又はBC100962)とを参照することにより決定されたhIL−2SPcDNA/hIL−15cDNA連結体の塩基配列を含むDNAと置き換えた。
NOD−IL−2rγnullマウスの前核期受精卵123個に、上記受精卵注入用DNAを1.5ng/mL濃度に調製し、マイクロマニピュレータ付き倒立顕微鏡(ライカ社製)を用いてマイクロインジェクションした。
上記産子マウスが3−4週齢に達した時点で、各産子マウスの尾の先端1−2mmから採取した組織片から自動DNA抽出装置(TOYOBO社製)によって抽出されたゲノムDNAについて、以下に示されるプライマーセットを用いて、配列番号1に示される塩基配列が各産子のゲノムDNAに挿入されたか否かを以下の条件によりPCR法により確認した。
IL2SPS1:5’−ATAGCGGCCGCTCACAGTAACCTCAACTCCTGCCA−3’(フォワードプライマー)(配列番号7)
IL15mpAS3:5’−CAACTAGTTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCAGAA−3’(リバースプライマー)(配列番号8)
A液:
2.5μL Ex−taq用×10 buffer
2μL dNTPmix
1.25μL IL2SPS1 (5μM)
1.25μL IL15mpAS3 (5μM)
0.125μL Ex−taq
6.875μL DW
B液:
8.5μL DW
1.5μL ゲノムDNA
A液とB液とを混合して、PCR反応液を調製した。
24μLの上記PCR反応液を用い、94℃にて3分の加熱処理;94℃にて30秒、60℃にて30秒、72℃にて1分を1サイクルとして35サイクル;その後72℃にて2分加熱処理;の条件で増幅処理が行われた。上記PCRにより得られたPCR産物を2%アガロースゲル中で電気泳動に供し、480bp付近の増幅産物バンドの有無を確認することにより、上記各産子マウスにおいて、配列番号1に示される塩基配列を含むDNAがゲノムDNAに挿入されたか否かを判定した。
上記NOD−IL−2rγnull−hIL−15 Tgマウス(雌)と、NOD−scid,IL−2rγnullマウス(以下「NOGマウス」ともいう。)(雄)とを交配することにより、NOD−IL−2rγnull−hIL−15 Tgマウスに、免疫系の主要な担当細胞であるT細胞及びB細胞が欠損しているscid変異をさらに導入して、NOD−scid,IL−2rγnull−hIL−15 Tgマウス(以下「NOG−hIL−15 Tgマウス」ともいう。)を作製した。
[NOG−hIL−15 Tgマウスについての検討]
(血漿中のhIL−15濃度)
NOG−hIL−15 Tgマウスの血漿中のhIL−15濃度を測定した。4〜6週齢のマウス個体からヘパリン(Novo-heparin、持田製薬株式会社製)を用いて麻酔下にて末梢血を収集した。血漿中のhIL−15濃度は、前記ELISAキットを用いて測定した。結果を図3に示す。
図3から明らかなとおり、NOG−hIL−15 Tgマウス(図中では「hIL−15Tg」)(N=126)における血漿中のhIL−15濃度は、47.7±27.5pg/mLであり、non−Tgマウスにおける血漿中のhIL−15濃度は、1.3±1.5pg/mLであった。したがって、ゲノムDNAに挿入されたNOG−hIL−15 Tgマウスにおいては、NOGマウスに比べて顕著に多く、ゲノムDNAに挿入された配列番号1に示される塩基配列を有する遺伝子により全身的に産生されたhIL−15が血液中に分泌されていることが確認された。
[ヒト臍帯血由来CD34+造血幹細胞移植NOG−hIL−15 Tgマウスのヒト細胞分化能の検討]
(フローサイトメトリー測定手順)
実施例3以降のフローサイトメトリーを用いる検討は、以下の手順で行われた。hCD56+細胞がヒトNK細胞であると判断し、それぞれの検討項目に適した抗体により解析を行った。具体的には、4℃にて暗所で30分間染色後、FACS緩衝液(1%FBSと0.1%NaN3を含むPBS)で洗浄し、細胞はヨウ化プロピジウム含有FACS緩衝液で再懸濁され、その後フローサイトメトリー測定に供された。フローサイトメトリー測定は、BD FACSCantoTM フローサイトメーター(BD社製)を用いて行われ、データは、FACSDiva ソフトウェア(ver.6.1.3)(BD社製)によって解析された。細胞数の絶対値は、Flow−Count(Beckman Coulter社製)を用いて取扱説明書にしたがって算出された。
使用された抗体は、具体的には以下のとおりである。
抗hCD3抗体:anti-human CD3-FITC(BioLegend社製)anti-human CD3-PE (BioLegend社製)、
抗hCD16抗体:anti-human CD16-FITC(BioLegend社製)、
抗hCD19抗体:anti-CD19 (BioLegend社製)、
抗hCD33抗体:anti-human CD33-FITC (BD Biosciences社製)、
抗hCD45抗体:anti-human CD45-allophycocyanin-Cy7 (BioLegend社製)、
抗hCD56抗体:anti-human CD56-PE(BioLegend社製)、
抗hCD57抗体:anti-CD57(BioLegend社製)、
抗NKG2A抗体:anti-human CD159a (NKG2A)-PE (Beckman Coulter社製)、
抗NKG2C抗体: Alexa Fluor 488-conjugated anti-human NK group 2 membrane C(R&D Systems社製)、
抗NKG2D抗体:anti-NKG2D(BioLegend社製)、
抗hCD94抗体:anti-CD94(BioLegend社製)、
抗hNKp30抗体:anti-NKp30(BioLegend社製)、
抗hNKp46抗体:anti-NKp46(BioLegend社製)、
抗hNKp44抗体:anti-NKp44(BioLegend社製)、
抗hNKp80抗体:anti-human NKp80-PE(Beckman Coulter社製)、
抗hCD158a/h抗体(Killer Immunoglobulin-like Receptor:KIR)(KIR2DL1/S1/S3/S5):FITC-conjugated anti-CD158a/h (BioLegend社製)、
抗hCD158b抗体(KIR2DL2/L3,NKAT2):anti-CD158b (BioLegend社製)、
抗hCD158d抗体(KIR2DL4):anti-CD158d (BioLegend社製)、
抗hCD158e抗体(KIR3DL1,NKB1):anti-CD158e (BioLegend社製)、
抗hCD158f抗体(KIR2DL5);anti-CD158f (BioLegend社製)、
抗mCD45抗体: anti-mouse CD45-allophycocyanin(BioLegend社製)、
(ヒト臍帯血由来hCD34+造血幹細胞移植NOG−hIL−15 Tgマウスの作製)
上記8〜12週齢の成体NOG−hIL−15 Tgマウスにヒト臍帯血由来hCD34+造血幹細胞を移植した。2.5GyのX線を照射し、照射後24時間以内にヒト臍帯血由来のhCD34+造血幹細胞2×104個を尾静脈より移植し、ヒト臍帯血由来hCD34+造血幹細胞を移植したNOG−hIL−15 Tgマウス(以下「幹細胞移植hIL−15マウス」ともいう。)を作製した。同様に、ヒト臍帯血由来hCD34+造血幹細胞を移植したNOGマウス(以下「幹細胞移植non−Tgマウス」ともいう。)を作製し、ネガティブコントロールとした。また、ヒトNK細胞が選択的に分化・増殖することが既に確認されている、インターロイキン2(hIL−2)のシグナルペプチドとcDNAがゲノムDNAに挿入されているNOG−hIL−2 Tgマウスに、ヒト臍帯血由来hCD34+造血幹細胞移植したマウス(以下「幹細胞移植hIL−2マウス」ともいう。)をポジティブコントロールとした。
(臍帯血由来hIL−15マウスの末梢血中のヒト細胞分化能の検討)
上記3種類のhCD34+造血幹細胞移植マウスについて、移植後4週経過時に末梢血から採血を行い、NK細胞の指標となるhCD56抗原、白血球の指標となるhCD45抗原、B細胞の指標となるhCD19抗原、T細胞の指標となるhCD3抗原に対する各特異抗体で染色した後フローサイトメトリーで測定することにより、マウス血液中のヒト白血球キメラ率を解析した。図4(a)に単核細胞(MNC)中のヒト免疫細胞量(/μL)を示し、及び図4(b)に単核細胞中に占める細胞数(%)を示す。
図4(a)から明らかなとおり、移植後4週目の幹細胞移植hIL−15マウス及び幹細胞移植hIL−2マウスの末梢血においては、hCD56+細胞の発現が多く、ヒトNK細胞が選択的に分化、増殖していることが確認された。一方、幹細胞移植non−Tgマウスの末梢血においては、hCD56陽性細胞の発現はほとんどなかった。また、hCD19+細胞の発現は、幹細胞移植hIL−2マウスの末梢血において約3細胞/μLであり、また、幹細胞移植hIL−15マウス、及び幹細胞移植non−Tgマウスの末梢血においては1〜2細胞/μL程度であって、いずれのマウスにおいてもヒトB細胞への分化、増殖はほとんど観察されなかった。
図4(b)から明らかなとおり、移植後4週目の幹細胞移植hIL−15マウス及び幹細胞移植hIL−2マウスの末梢血においてはhCD56+細胞の発現が非常に多く、ヒトCD56+NK細胞が分化、増殖していることが確認された。
(幹細胞移植hIL−15マウスの各組織におけるヒト細胞分化能の検討)
hCD34+造血幹細胞移植した上記3種類の被検マウスについて、移植後6週経過時に骨髄、脾臓、末梢血を採取し、ヒトCD56+NK細胞を単離し、各特異抗体で染色した後フローサイトメトリーで測定することにより、マウス各組織中のヒト細胞分化能を解析した。結果を図5に示す。
図5から明らかなとおり、幹細胞移植hIL−15マウス及び幹細胞移植hIL−2マウスの骨髄(BM)、脾臓(SPL)、末梢血(PB)のいずれにおいても、ヒトNK細胞の局在が、hCD56+、hCD45+の分画で示される赤枠内に確認されたが、幹細胞移植non-Tgマウスにおいては、ヒトNK細胞の局在はほとんど確認されなかった。
(ヒト造血細胞由来NK細胞に特異的な受容体の発現解析)
前記幹細胞移植hIL−15マウス及び幹細胞移植hIL−2マウスの脾臓から単離されたヒトNK細胞について、ヒト生体内で分化した成熟NK細胞の亜分画で特異的な細胞表面分子であるとされるhCD16抗原、ヒト末梢血でNK活性を持つ細胞サブセットに発現されるとされるhCD57抗原、NK細胞表面に発現する抑制型受容体とされるhNKG2A抗原、NK細胞表面に発現する活性型受容体とされるhNKG2C抗原、NK細胞表面に発現する活性型受容体とされるhNKG2D抗原に対する各特異抗体で染色した後フローサイトメトリーで測定することにより、ヒトNK細胞特異的な受容体の発現を解析した。ヒト末梢血成熟NK細胞であるJapanese PB−NK細胞(インフォームドコンセントを受けた、日本人ドナーの末梢血より単離したヒトNK細胞)をポジティブコントロールとした。結果を図6に示す。
図6からも明らかなとおり、幹細胞移植hIL−15 Tgマウス、幹細胞移植hIL−2 Tgマウスいずれの末梢血におけるNK細胞においても、hCD16抗原、hCD57抗原、hNKG2A抗原、hNKG2C抗原、hNKG2D抗原の発現が確認された。しかしながら、その発現パターンは、hCD56抗原の発現強度が高い点と、hCD56+CD16−分画の割合が多い点で、ヒト末梢血成熟NK細胞とは発現様式が異なっており、臨床において、IL−2投与療法を受けた患者の血液中で増加するhCD56+CD16−活性化NK細胞と類似したNK細胞特異抗原の発現パターンを示してしていたことから、幹細胞移植hIL−15マウス・幹細胞移植hIL−2マウスの中で分化したヒト造血幹細胞由来NK細胞は、マウス内のhIL−15又はhIL−2によって活性化したNK細胞が多く存在している事が推定された。
(ヒト造血細胞由来NK細胞の細胞傷害顆粒分泌能の検証)
前記幹細胞移植hIL−15 Tgマウス及び幹細胞移植hIL−2 Tgマウスの脾臓から単離されたヒトNK細胞が、細胞傷害顆粒の分泌能/サイトカイン産生能を有する否かを検証した。移植後6週経過時に各マウスの脾臓を摘出し細胞調製を行い、ヒトCD56+NK細胞を単離し、ブレフェルディンA(BioLegend社製)存在下で20時間培養した後に蛍光標識抗体(FITC−抗hGranzymeA抗体、FITC−抗Perforin抗体(BioLegend社製)で細胞内染色をして、フローサイトメトリーで測定した。結果を図7(a)に示す。また、ヒト上記単離したヒトCD56+NK細胞をPMA/ionomycin存在下で培養した後、蛍光標識抗体PE−抗hIFNg抗体(BioLegend社製)で細胞内染色を行い、フローサイトメトリーで測定した。結果を図7(b)に示す。
図7(a)から明らかなとおり、上記いずれのマウス由来のヒトCD56+NK細胞においても、ヒト生体内で分化した成熟NK細胞の結果(データ示さず)と同等の細胞傷害顆粒であるGranzymeAの発現が確認された。Perforinについても発現が確認されたが、ヒト生体内で分化した成熟NK細胞の結果(データ示さず)と比較して発現がやや少ない結果となった。また、図7(b)から明らかなとおり、上記いずれのマウス由来のヒトNK細胞においても、PMA/ionomycin刺激により、インターフェロンガンマ(IFNγ)の産生が認められた。
(ヒト末梢血由来hCD56+NK細胞移植NOG−hIL−15 Tgマウスの作製)
上記8〜12週齢の成体NOG−hIL−15 Tgマウスにヒト末梢血由来CD56+NK細胞を移植した。2.5GyのX線を照射し、照射後24時間以内にヒト末梢血由来のhCD56+NK細胞1〜2×106個を尾静脈より移植し、ヒト末梢血由来CD56+NK細胞移植NOG−hIL−15 Tgマウス(以下「末梢血移植hIL−15マウス」ともいう。)を作製した。同様に、ヒト末梢血由来hCD56+NK細胞移植NOG−hIL−2 Tgマウス(以下「末梢血移植hIL−2マウス」ともいう。)を作製した。ヒト末梢血由来hCD56+NK細胞を移植したNOGマウス(以下「末梢血移植non−Tgマウス」ともいう。)を作製し、ネガティブコントロールとした。
(末梢血移植hIL−15マウスの末梢血中細胞の検討)
移植後3週間経過時に採血し、mCD45抗原、hCD3抗原、hCD16抗原、hCD45抗原、hCD56抗原に対する各特異抗体で染色した後フローサイトメトリーで測定することにより、各マウス血液中のヒト白血球キメラ率を解析した。ヒト白血球の指標となるhCD45抗原陽性分画(マウス白血球の指標となるmCD45は陰性の分画)にゲートし、さらにヒトNK細胞の指標となるhCD56抗原とT細胞の指標となるhCD3抗原に対するパターンで展開した。hCD45+CD56+NK細胞にゲートし、さらにhCD56抗原とhCD16抗原に対するパターンで展開し、hCD56+hCD16+NK細胞の割合を解析した。ヒトT細胞の混入を確認するため、hCD45+hCD3+T細胞の割合も確認した。結果を図8に示す。
図8において、「PBMC」は、健常人由来のヒト末梢血中の単核球を表す。「CD56+sorted (pre−transfer)」は、移植前のPBMCより単離したhCD56+NK細胞を表す。「After transfer(3w)」は、移植後3週経過時の末梢血移植hIL−15マウスの末梢血を表す。移植後3週経過時の末梢血移植hIL−15マウスにおいては、hCD45+ヒト白血球内ではCD56+CD16+NK細胞分画が大部分(99.7%)を占めていた。「PBMC」、「CD56+sorted (pre−transfer)」においても、ヒト末梢血中の成熟NK細胞は、hCD45+ヒト白血球中のhCD56+hCD16+分画において90%以上を占めていることから、移植されたhCD56+NK細胞は、移植後3週間経過時においても、健常人由来のヒト末梢血中の単核球と同様のhCD56+hCD16+NK細胞という性質を維持したまま生着し、増殖していると判断することができた。
移植後経時的に採血し、単核細胞中のNK細胞とT細胞の占める割合を計測した。上記3種類の末梢血移植マウスについて、移植後経過時に末梢血から採血を行い、NK細胞の指標となるhCD56抗原、白血球の指標となるhCD45抗原、T細胞の指標となるhCD3抗原に対する各特異抗体で染色した後フローサイトメトリーで測定することにより、マウス血液中のヒト白血球キメラ率を解析した。図9(a)に単核細胞(MNC)中に占めるNK細胞数(%)を、図9(b)にMNC中に占めるT細胞数(%)を示す。また、図9(c)に末梢血移植hIL−15マウス血液中のNK細胞数(/μL)を示し、図9(d)に末梢血移植non−Tgマウス血液中のNK細胞数(/μL)を示す。
図9(a)から明らかなとおり、NK細胞については、末梢血移植hIL−15マウスにおいて、移植後2週経過時には単核細胞中の約30〜約46%を占め、4週経過時に約10〜約20%を占め、6週経過時に約8〜約15%を占めた。図9(b)から明らかなとおり、末梢血移植hIL−2マウスにおいては、一番増加した移植後4週経過時で10%未満にとどまった。T細胞については、末梢血移植hIL−15マウスではほとんど検出されなかった一方、末梢血移植hIL−2マウスでは移植後3〜4週経過時に約18〜約23%を占めた。末梢血移植non−Tgマウスにおいては、NK細胞もT細胞もほとんど確認されなかった。以上の結果より、末梢血移植hIL−2マウスでは、NK細胞が血液中で増殖せず、移植細胞に極めて少数混入していたT細胞が増殖してしまうことが確認されたため、これ以降の実験は、末梢血移植hIL−15マウスについてのみ検討を行うこととした。また、ヒト末梢血hIL−15Tgマウスにおいては、血液中のヒトNK細胞数が徐々に増加し、移植後4−5週経過時には8000個/μLまで増加した。その後は徐々に減少したが、移植後24週経過しても、約40細胞/μLが確認された(図9(c)参照)。ヒト末梢血non−Tgマウスでは、移植後2週経過の時には約40細胞/uL確認されたのが最大値であって、増殖はほとんど観察されなかった(図9(d)参照)。
(ヒト成熟NK細胞亜種の推移についての検討)
ヒトNK細胞は、hCD56+hCD16+分画を占める細胞傷害能に特化された亜集団と、hCD56+hCD16−分画を占めるサイトカイン産生能に特化された亜集団とが存在することが知られている。末梢血移植hIL−15マウスに移植されたヒト成熟NK細胞が、どちらの分画において増殖するのかを確認するために、細胞亜集団(sub-population)の経時的変動を解析した。結果を図10に示す。
図10から明らかなとおり、hCD56+hCD16+分画は、移植後1週目〜8週目にわたりほぼ90%以上を維持した。一方、hCD56+hCD16−分画は、移植後1週経過時に約11%を占めたがその後漸減した。したがって、末梢血移植hIL−15マウスの末梢血においては、hCD56+hCD16+分画を示す細胞傷害能に特化された亜集団が増殖していることが確認された。
[凍結末梢血hIL−15マウスの調製]
上記8〜12週齢の成体NOG−hIL−15 Tgマウスにヒト末梢血由来hCD56+凍結NK細胞を解凍して移植した。2.5GyのX線を照射し、照射後24時間経過時に解凍されたヒト末梢血由来CD56+NK細胞1〜2×106個を尾静脈より移植し、ヒト末梢血由来CD56+凍結NK細胞移植NOG−hIL−15 Tgマウス(以下「凍結末梢血hIL−15マウス」ともいう。)を作製した。
(凍結末梢血hIL−15マウスの末梢血中のヒト細胞分化能の検討)
凍結末梢血hIL−15マウスについて、移植後経時的に採血し、各特異抗体で染色した後フローサイトメトリーで測定することにより、マウス血液中のヒト白血球キメラ率を解析した。ヒト白血球の指標となるhCD45抗原陽性分画(マウス白血球の指標となるmCD45は陰性の分画)にゲートし、さらにヒトNK細胞の指標となるhCD56抗原とT細胞の指標となるhCD3抗原に対するパターン、及びヒトhCD56抗原とhCD16抗原に対するパターンで展開し、ヒトCD56+NK細胞、及びヒトCD56+CD16+NK細胞の割合を解析した。ヒトT細胞の混入を確認するため、hCD45+hCD3+T細胞の割合も確認した。結果を図11及び図12に示す。
図11において、移植していない凍結ヒトCD56+NK細胞を表す「FrozenPB−NK(Pre−transfer)」から明らかなとおり、解凍後のヒト末梢血中の成熟NK細胞は、hCD16+hCD56+分画において85.2%を占めている。凍結ヒトCD56+NK細胞を移植後4週目の凍結末梢血hIL−15マウスにおいても、hCD16+hCD56+分画において81.3%を占めているので、新鮮血由来ヒトNK細胞移植実験と同様に、移植された解凍後のヒトNK細胞は、NOG−hIL−15 Tgマウスに移植後4週経過時においても生着し、増殖していることを確認することができた。
図12から明らかなとおり、CD56+CD16+分画を占める亜集団が選択的に増幅し、移植後1週目〜2週目にわたり急激に増加し、3週目以降漸減した。一方、CD56+CD16−分画を占めるサイトカイン産生能に特化された亜集団はほとんど増加することはなかった。したがって、CD56+凍結NK細胞移植NOG−hIL−15 Tgマウスにおいては、細胞傷害能に特化されたCD56+CD16+NK細胞が顕著に増殖することが確認された。
(末梢血移植hIL−15マウスの各組織におけるヒト細胞の検討)
末梢血移植hIL−15マウスについて、移植後6週経過時に麻酔下にて全採血することで安楽死処置を施した後、骨髄、脾臓、肝臓、肺を採取して細胞調製を行った。各特異抗体で染色した後フローサイトメトリーで測定することにより、マウス各組織中のヒト化細胞を解析した。結果を図13に示す。
図13から明らかなとおり、末梢血移植hIL−15マウスの脾臓(SPL)、末梢血(PB)、肝臓(Liver)、肺(Lung)のいずれにおいても、ヒトCD56+CD16+NK細胞の局在が認められたが、骨髄(BM)では局在が認められなかった。この結果は、ヒト組織における成熟NK細胞は、主に血液・脾臓・リンパ節・扁桃腺・肝臓・肺等に局在するが、骨髄では成熟NK細胞はほとんど存在しないという結果と一致した。しかし、前記幹細胞移植hIL−15マウス及び幹細胞移植hIL−2マウスにおいては、骨髄において、ヒトNK細胞の局在が認められたという結果とは相違した。また、NK細胞マーカーの1種である、NK細胞の細胞傷害活性を誘導するnatural cytotoxicity receptor(NCR)ファミリーの一員として知られているhNKp46+の分画で強く発現していることも確認された。
(ヒトNK細胞の特異的な細胞表面分子の発現解析)
末梢血移植hIL−15マウスについて、移植後8週経過時に脾臓から単離されたヒトNK細胞は、ヒト組織における成熟NK細胞と同じ特異的な細胞表面分子が発現しているか否かを解析した。ヒト組織における成熟NK細胞の特異的な細胞表面分子として知られている、hNKG2A、hNKG2C、hNKG2D、hCD94、hNKp30、hNKp46、hNKp44、hNKp80、hCD57、hCD158a/h(Killer Immunoglobulin-like Receptor:KIR)、hCD158b(KIR)、hCD158d(KIR)、hCD158e(KIR)、hCD158f(KIR)の各抗原に対する各特異的な抗体で染色した後フローサイトメトリーで測定することにより、ヒトNK細胞特異的な細胞表面分子発現解析を行った。マウス結果を図14に示す。各細胞表面分子の陰性対象として、Isotype Abで染色したパターンも示す。
図14から明らかなとおり、ヒト組織における成熟NK細胞の特異的な細胞表面分子として知られている、hNKG2A、hNKG2C、hNKG2D、hCD94、hNKp30、hNKp46、hNKp44、hNKp80、hCD57、hCD158a/h(Killer Immunoglobulin-like Receptor:KIR)、hCD158b(KIR)、hCD158d(KIR)、hCD158e(KIR)、hCD158f(KIR)の各抗原の発現が確認された。また、末梢血移植hIL−15マウスにおいて増殖したヒトNK細胞は、ヒト生体内で分化した成熟NK細胞の結果(データ示さず)とほぼ同一のNK細胞の表面分子発現パターンを有することが確認された。
(ヒト末梢血由来NK細胞の細胞傷害顆粒分泌能の検証)
末梢血移植hIL−15マウスの脾臓から単離されたヒトNK細胞が、ヒト生体内で分化した成熟NK細胞と同様に細胞傷害顆粒の分泌能/サイトカイン産生能を有する否かを検証した。上記移植8週経過時に末梢血移植hIL−15マウスより脾臓を採取して細胞調製し、ヒトCD56+NK細胞を単離し、ブレフェルディンA存在下及びヒトIL−2もしくはIL−15サイトカイン存在下で20時間培養した後に蛍光標識抗体FITC−抗hGranzymeA抗体、FITC−抗Perforin抗体(Biolegend社製)で細胞内染色をして、フローサイトメトリーで測定した。結果を図15(a)に示す。また、ヒト上記単離したヒトCD56+NK細胞をPMA/ionomycine存在下で培養した後、蛍光標識抗体PE−抗hIFNg抗体(Biolegend社製)を用いて細胞内染色を行い、フローサイトメトリーで測定した。結果を図15(b)に示す。
図15(a)から明らかなとおり、NOG−hIL−15 Tgマウス由来のヒトCD56+NK細胞においても、ヒト生体内で分化した成熟NK細胞の結果(データ示さず)と同等の細胞傷害顆粒(GranzymeA)の発現が確認された。しかし、Perforinは各種サイトカインで刺激してもほとんど検出できなかった。また、図15(b)から明らかなとおり、PMA/ionomycine刺激により、インターフェロンガンマ(IFNγ)の産生が認められた。この結果は、hIL−15マウスで増殖したヒトNK細胞は、刺激因子に対する反応性(サイトカイン産生能)を保持していることを示していた。
末梢血移植hIL−15マウスから単離されたヒトNK細胞が、標的細胞にたいして細胞傷害能を示すか検証した。ヒトNK細胞移植後8週経過時に末梢血移植hIL−15マウスより脾臓を採取して細胞調製し、hCD56+細胞を単離し、ヒトIL−2、ヒトIL−15、ヒトIL−2とヒトIL−15との混合組成物の、各サイトカイン存在下で2日間培養した後に、標的腫瘍細胞(ヒトNK高感受性腫瘍細胞株K562)と4時間共培養し、培養上清を用いて細胞傷害活性(cytotoxicity(%))を測定した。測定の方法は、得られた培養上清とCytoTox96 Non−radioactive Cytotoxicity Assay(Promega社製)を用い、培養上清中に遊離した死細胞由来細胞質性酵素LDHと反応基質との共益酵素反応による呈色度によって評価した。結果を図16に示す。
図16から明らかなとおり、NOG−hIL−15 Tgマウス内で分化したヒトNK細胞は、hIL−15存在下で培養した場合に一番強い細胞傷害活性を示した。かかる結果により、末梢血移植hIL−15マウス内で分化したヒトNK細胞が、ヒト生体内で分化した成熟NK細胞と同様に、ヒト腫瘍の生育をインビトロで抑制できることが確認された。
末梢血移植hIL−15マウスが、ヒト腫瘍に対する細胞傷害活性を観察することが可能かを検討した。成体NOG−hIL−15 Tgマウスに、2.5GyのX線を照射し、骨髄抑制を行った。照射後1日以内にヒト末梢血単核細胞(PBMC)由来NK細胞を2×106個iv移植して(hu−PB−NK hIL−15 Tgを作製した。陰性コントロールとしては、NK細胞未移植(hIL−15−Tg)マウスを用いた。ヒトPBMC)由来NK細胞移植後4週経過時に2.5×105個のNK感受性ヒト腫瘍細胞株K562を皮下移植し、継時的に腫瘍径を測定した。結果を図17に示す。
図17から明らかなとおり、皮下移植後21日目には、ヒトNK細胞移植マウスにおける腫瘍のサイズは500〜950mm3程度であり、NK細胞未移植(hIL−15−Tg)マウスにおける腫瘍のサイズは495〜1730mm3程度であり、ヒトNK細胞移植マウスにおける腫瘍のサイズは、NK細胞未移植(hIL−15−Tg)マウスにおける腫瘍のサイズの約3分の2であった。ヒトNK細胞移植群で腫瘍抑制効果が認められた(d7−21;p<0.05)。かかる結果により、末梢血移植hIL−15マウスは、ヒト腫瘍の生育をインビボで抑制することが確認された。
Claims (8)
- ヒトIL−15を分泌することができ、かつ、ヒト末梢血由来のヒトNK細胞を移植後に、hCD56+細胞がインビボで長期に検出されることを特徴とする、配列番号1に示される塩基配列からなるDNAがゲノムDNAに挿入されている免疫不全マウス。
- hCD56+細胞がさらにhCD16が陽性を示すhCD56+hCD16+細胞であることを特徴とする請求項1記載の免疫不全マウス。
- hCD56+細胞が、脾臓、肝臓及び/又は肺において検出されるが、骨髄において検出されない細胞であることを特徴とする請求項1又は2記載の免疫不全マウス。
- hCD56+細胞が、細胞表面分子として、hNKG2A、hNKG2C、hNKG2D、hCD94、hNKp30、hNKp46、hNKp44、hNKp80、hCD57、hCD158a/h(KIR)、hCD158b(KIR)、hCD158d(KIR)、hCD158e(KIR)、又はhCD158f(KIR)について陽性を示す細胞であることを特徴とする請求項1〜3いずれか記載の免疫不全マウス。
- ヒト末梢血由来のヒトNK細胞を移植後に、サイトカイン存在下で、ヒト腫瘍の生育をインビトロで抑制することができることを特徴とする請求項1〜4いずれか記載の免疫不全マウス。
- サイトカインが、hIL−15であることを特徴とする請求項5記載の免疫不全マウス。
- ヒト末梢血由来のヒトNK細胞を移植後に、ヒト腫瘍の生育をインビボで抑制することができることを特徴とする請求項1〜6いずれか記載の免疫不全マウス。
- 以下の(1)〜(7)の工程を順次含む上記NOD−scid,IL−2rγnull−hIL−15 Tgマウスの作製方法。
(1)配列番号1に示される塩基配列からなるDNAをマウスゲノムDNAに挿入するために必要な領域を含むベクターに、配列番号1に示される塩基配列を含むDNAを導入することにより、配列番号1に示される塩基配列を含むDNAを有するマウス受精卵注入DNA調製用ベクターを作製する工程;
(1−1)必要に応じて、配列番号1に示される塩基配列からなるDNAと、配列番号1に示される塩基配列を含むDNAがマウスゲノムDNAに挿入されるために必要な領域とを含む受精卵注入用DNA断片を調製する工程;
(2)上記工程(1)において作製されたベクター及び/又は上記(1−1)で調製されたベクター断片をインターロイキン2受容体γ鎖遺伝子(IL−2Rγ)ノックアウトマウスの受精卵に注入することにより注入受精卵を作製する工程;
(3)上記工程(2)において作製された注入受精卵を培養することにより、新生子マウスを作製する工程;
(4)上記工程(3)において作製されたマウスにおいて、配列番号1に示される塩基配列を含むDNAがNOD−IL−2rγnullマウスのゲノムDNAに挿入されたか否かを判定する工程;
(5)上記工程(4)において配列番号1に示される塩基配列を含むDNAがNOD−IL−2rγnullマウスのゲノムDNAに挿入されたと判定されたマウスが、hIL−15を分泌しているか否かを判定し、hIL−15を分泌しているマウスをNOD−IL−2rγnull−hIL−15Tgマウスとして選抜する工程;
(6)上記NOD−IL−2rγnull−hIL−15Tgマウスと、NOGマウスとを交配して、scid変異が導入されたNOD−scid,IL−2rγnull−hIL−15 Tgマウスを作製する工程;
(7)NOD−scid,IL−2rγnull−hIL−15 Tgマウスと、NOGマウスとを交配してNOD−scid,IL−2rγnull−hIL−15 TgマウスとNOGマウスとを1:1で作製する工程;
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