JP2016220559A

JP2016220559A - ヒトｉｌ−１５分泌免疫不全マウス

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Publication number: JP2016220559A
Application number: JP2015107932A
Authority: JP
Inventors: 伊藤　守; Mamoru Ito; 守伊藤; いくみ片野; Ikumi Katano
Original assignee: Central Institute for Experimental Animals; Central Inst for Experimental Animals
Current assignee: Central Institute for Experimental Animals; Central Inst for Experimental Animals
Priority date: 2015-05-27
Filing date: 2015-05-27
Publication date: 2016-12-28
Anticipated expiration: 2035-05-27
Also published as: KR20180012294A; US10575505B2; US20180213755A1; KR102118003B1; WO2016189799A1; JP6654001B2

Abstract

【課題】ヒトＮＫ細胞の機能を検討することができるマウスの提供【解決手段】ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のシグナルペプチドをコードするｃＤＮＡ配列にインターロイキン１５（ＩＬ−１５）をコードするｃＤＮＡ配列が作動可能に連結されたＤＮＡを含む遺伝子領域である塩基配列からなるＤＮＡを免疫不全マウスのｃＤＮＡに挿入することにより、作製されたＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスによると移植後少なくとも６カ月は、ヒト成熟ＮＫ細胞の研究をインビボで行うために十分な濃度のｈＣＤ５６＋細胞が検出される。【選択図】なし

Description

本発明は、ヒトＩＬ−１５を分泌することができ、かつ、ヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞を移植後に、ｈ（human:ヒト）ＣＤ５６^＋細胞がインビボで長期に検出される、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡがゲノムＤＮＡに挿入されている免疫不全マウスに関する。

ヒト細胞、ヒト組織をインビボで解析できるヒト化免疫不全マウスは、創薬のためのリサーチツールとしての利用のみならず、ヒト細胞を移植することによりインビボでヒト細胞の分化、機能解析等の基礎研究を行うことができる有用なツールとして、医療への貢献が期待できる実験動物であるとされ、長年にわたり、より有用なヒト化免疫不全マウスの作出が試みられてきた。

１９６２年、胸腺がないため、胸腺に由来するＴ細胞を欠損したヌードマウスが免疫不全マウスとして発見されたが、このマウスには他の免疫細胞は存在し、一部のヒトがん細胞は生着したが、通常のヒト細胞は生着しなかった。１９８０年に、ＭｅｌｖｉｎＢｏｓｍａらによってＣ．Ｂ−１７系統マウスで発見された自然発症の突然変異体で、重度のＳＣＩＤ（Severe Combined Immuno Deficiency）変異を呈するＳＣＩＤ免疫不全マウスが発見された（例えば、非特許文献１参照）。上記ｓｃｉｄ変異とは、定染色体劣性の遺伝様式をとり、Ｔ細胞及びＢ細胞がないことから、ＳＣＩＤマウスの腎被膜下にヒト胎児の胸腺を移植することができた等の一定の成果があったが、期待されたほどヒト細胞の生着率は向上しなかった。

同じく１９８０年ごろ、白内障マウスの中に、多尿・尿糖強陽性を呈するメス個体が発見され、その症状がヒトの１型糖尿病(インスリン依存型糖尿病)に類似することから、ＮＯＤ（Non Obese Diabetes）と命名されたＮＯＤマウスが牧野により確立された（例えば、非特許文献２参照）。かかるＮＯＤマウスと上記ＳＣＩＤマウスとを交配させることにより、ＳＣＩＤマウスを上回るヒト細胞の生着が可能となるＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスが作出された。ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスでは、ＮＯＤ系統に由来する補体活性、マクロファージ機能やナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性等の減退がみられ、ヒト造血幹細胞を移植しても拒絶されなかったが、生着効率が高くないことや、マウスの寿命が短いことなどの問題が指摘されていた。

さらに本発明者らは、ＮＯＤマウスにＣ．Ｂ−１７−ｓｃｉｄマウスを戻し交配することにより得られるマウスに、インターロイキン２受容体γ鎖遺伝子をノックアウトしたマウスを戻し交配することにより、機能的なＴ細胞及びＢ細胞を共に欠失し、マクロファージ機能が減退し、ＮＫ細胞又はＮＫ活性を消失し、かつ樹状細胞機能が減退しており、優れた異種細胞生着性を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γc^ｎｕｌｌマウス（単に「ＮＯＧマウス」ともいう。）を作出した（例えば、特許文献１等参照）。ＮＯＧマウスは、従来のマウスと比較して格段にヒトの細胞や組織の生着性が高く、かつ移植したヒト幹細胞が成熟細胞へも分化することが可能であり、さらに多様なヒト化マウスモデルの作製に有用であるとされている（例えば、非特許文献３参照）。

一方、ＮＫ細胞とは、先天免疫の主要因子として働く細胞傷害性リンパ球の一種とされ、抗原感作なしに、腫瘍細胞やウィルス感染細胞を障害することができ、ＣＤ５６を含む表面抗原が発現しているという特性を有する。しかしながら、上記ＮＯＧマウスにおいては、臍帯血由来の造血幹細胞を移植した場合においては、ヒトＮＫ細胞への分化効率は低く、末梢血由来のヒト成熟ＮＫ細胞を移植した場合においても、ヒトＮＫ細胞は短期間維持されるにとどまるとされた。

特許第３７５３３２１号

Nature. 301, 527-530, 1983. Jikken Dobutsu. 29:1-13, 1980 Blood, 100, no.9, 3175-3182, 2002

本発明の課題は、ヒトＮＫ細胞の機能を検討することができるマウスを提供することにある。

本発明者らは、ヒトインターロイキン２（ｈＩＬ−２）のシグナルペプチドとｈＩＬ−２タンパク質とをコードするＤＮＡを含む遺伝子領域をＮＯＤ−ＩＬ２ｒγ^ｎｕｌｌマウスのゲノムＤＮＡに挿入し、ＮＯＧマウスと交配することによりＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−２Ｔｇマウスを作製し、かかるマウスにおいては、ヒト臍帯血由来造血幹細胞を移植することにより、ｈＣＤ５６が陽性を示す成熟型ヒトＮＫ細胞がインビボで分化、増殖したが(Katano et al., J. Immunol. February 23, 2015 1401323）、ヒト末梢血を移植した場合には、ｈＣＤ５６が陽性を示すヒトＮＫ様細胞が増殖することはほとんどなかったことを確認している。

上記ｈＩＬ−２のシグナルペプチドをコードする配列を、ｈＩＬ−１５タンパク質をコードするＤＮＡ配列の上流に設置した配列を含むＤＮＡをＣＯＳ細胞にトランスフェクトして、ｈＩＬ−２シグナルペプチド−ｈＩＬ−１５融合タンパク質を発現させたところ、ｈＩＬ−１５のシグナルペプチドをコードする配列をｈＩＬ−１５をコードするＤＮＡ配列の上流に設置した配列を含むＤＮＡを用いてｈＩＬ−１５タンパク質を産生させた場合と比較して、細胞外に分泌されたｈＩＬ−１５タンパク質量が、１５倍から２０倍に達するという報告（J. Immunol. 1998;160;4418-4426）がある。

本発明者らは、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のシグナルペプチドをコードするｃＤＮＡ配列にインターロイキン１５（ＩＬ−１５）をコードするｃＤＮＡ配列が作動可能に連結されたＤＮＡを含む遺伝子領域である配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡを公知の免疫不全マウスのｃＤＮＡに挿入することにより、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスを作製し、臍帯血由来ヒト造血幹細胞を移植したところ、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−２Ｔｇマウスについての上記結果と同様、ヒトＣＤ５６^＋ＮＫ細胞が分化、増殖していることが確認された。

本発明者らはさらに検討を続け、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスにヒト末梢血由来のｈＣＤ５６^＋ＮＫ細胞を移植したところ、驚くべきことに、ｈＣＤ５６が陽性を示す細胞数は徐々に増加し、移植後５週間経過時には、マウス血液中において８０００細胞／μＬという非常に高濃度のピークの値を示した。その後はｈＣＤ５６が陽性を示す細胞数は漸減したものの、移植後少なくとも６カ月は、ヒト成熟ＮＫ細胞の研究をインビボで行うために十分な濃度のｈＣＤ５６^＋細胞が、本発明のマウスの血液中に検出されることが確認された。さらに、ヒト末梢血由来のｈＣＤ５６^＋ＮＫ細胞を移植後の、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスにおいては、ヒト腫瘍の生育がインビトロのみならず、インビボでも抑制されることを確認し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ヒトＩＬ−１５を分泌することができ、かつ、ヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞を移植後に、ｈＣＤ５６^＋細胞がインビボで長期に検出されることを特徴とする、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡがゲノムＤＮＡに挿入されている免疫不全マウス。
［２］ｈＣＤ５６^＋細胞がさらにｈＣＤ１６が陽性を示すｈＣＤ５６^＋ｈＣＤ１６^＋細胞であることを特徴とする前記［１］記載の免疫不全マウス。
［３］ｈＣＤ５６^＋細胞が、脾臓、肝臓及び／又は肺において検出されるが、骨髄において検出されない細胞であることを特徴とする前記［１］又は［２］記載の免疫不全マウス。
［４］ｈＣＤ５６^＋細胞が、細胞表面分子として、ｈＮＫＧ２Ａ、ｈＮＫＧ２Ｃ、ｈＮＫＧ２Ｄ、ｈＣＤ９４、ｈＮＫｐ３０、ｈＮＫｐ４６、ｈＮＫｐ４４、ｈＮＫｐ８０、ｈＣＤ５７、ｈＣＤ１５８ａ／ｈ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｂ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｄ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｅ（ＫＩＲ）、又はｈＣＤ１５８ｆ（ＫＩＲ）について陽性を示す細胞であることを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれか記載の免疫不全マウス。
［５］ヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞を移植後に、サイトカイン存在下で、ヒト腫瘍の生育をインビトロで抑制することができることを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれか記載の免疫不全マウス。
［６］サイトカインが、ｈＩＬ−１５であることを特徴とする前記［５］記載の免疫不全マウス。
［７］ヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞を移植後に、ヒト腫瘍の生育をインビボで抑制することができることを特徴とする前記［１］〜［６］のいずれか記載の免疫不全マウス。
［８］以下の（１）〜（７）の工程を順次含む上記ＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスの作製方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡをマウスゲノムＤＮＡに挿入するために必要な領域を含むベクターに、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡを導入することにより、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡを有するマウス受精卵注入ＤＮＡ調製用ベクターを作製する工程；
（１−１）必要に応じて、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡがマウスゲノムＤＮＡに挿入されるために必要な領域とを含む受精卵注入用ＤＮＡ断片を調製する工程；
（２）上記工程（１）において作製されたベクター及び／又は上記（１−１）で調製されたベクター断片をインターロイキン２受容体γ鎖遺伝子（ＩＬ−２Ｒγ）ノックアウトマウスの受精卵に注入することにより注入受精卵を作製する工程；
（３）上記工程（２）において作製された注入受精卵を培養することにより、新生子マウスを作製する工程；
（４）上記工程（３）において作製されたマウスにおいて、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡがＮＯＤ−ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌマウスのゲノムＤＮＡに挿入されたか否かを判定する工程；
（５）上記工程（４）において配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡがＮＯＤ−ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌマウスのゲノムＤＮＡに挿入されたと判定されたマウスが、ｈＩＬ−１５を分泌しているか否かを判定し、ｈＩＬ−１５を分泌しているマウスをＮＯＤ−ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスとして選抜する工程；
（６）上記ＮＯＤ−ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスと、ＮＯＧマウスとを交配して、ｓｃｉｄ変異が導入されたＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスを作製する工程；
（７）ＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスと、ＮＯＧマウスとを交配してＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５ＴｇマウスとＮＯＧマウスとを１：１で作製する工程；

本発明によると、本発明のマウスに移植されたヒト末梢血由来ＮＫ細胞は、マウスにおいて非常に長期に維持されることができ、ヒトＮＫ細胞の機能について長期間にわたりインビボで解析することができる。

（ａ）は、ｐＣＭＶβベクターの構成を示し、（ｂ）は、受精卵注入ＤＮＡ調製用ベクターの構成を示す。受精卵注入用ＤＮＡ断片の構成を示す。ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスの血漿中のｈＩＬ−１５濃度を示す。幹細胞移植マウスについて、（ａ）は単核細胞（ＭＮＣ）中のｈＣＤ４５^＋細胞、ｈＣＤ１９^＋細胞、ｈＣＤ５６^＋細胞の細胞量（／μＬ）をそれぞれ示し、（ｂ）は単核細胞中に占めるｈＣＤ４５^＋細胞、ｈＣＤ１９^＋細胞、ｈＣＤ５６^＋細胞の細胞数（％）を示す。幹細胞移植マウスの骨髄、脾臓、末梢血それぞれから得られた免疫細胞についてのフローサイトメトリー解析結果を示す。幹細胞移植マウスにおけるヒトＮＫ細胞のフローサイトメトリー解析により、ヒトＮＫ細胞特異的な受容体の発現を解析した結果である。ヒト造血幹細胞由来ＮＫ細胞の細胞傷害顆粒分泌能についてのフローサイトメトリー解析結果を示し、（ａ）は、ＧｒａｎｚｙｍｅＡとＰｅｒｆｏｒｉｎの発現についての結果を示し、（ｂ）はｈＩＦＮγ発現についての結果を示す。末梢血移植ｈＩＬ−１５マウスの末梢血のフローサイトメトリー解析結果を示す。末梢血移植マウスについて、（ａ）は、単核細胞（ＭＮＣ）中に占めるｈＣＤ５６^＋細胞数（％）を示し、（ｂ）は、単核細胞（ＭＮＣ）中に占めるＣＤ３^＋Ｔ細胞数（％）を示す。（ｃ）は、末梢血移植ｈＩＬ−１５マウス血液中のｈＣＤ５６^＋細胞数（／μＬ）を示し、（ｄ）は、末梢血移植ｎｏｎ−Ｔｇマウス血液中のｈＣＤ５６^＋細胞数（／μＬ）を示す。末梢血移植ｈＩＬ−１５マウスの末梢血中の２種類のヒト成熟ＮＫ細胞亜種の推移を示すグラフである。凍結末梢血ｈＩＬ−１５マウスの末梢血についてのフローサイトメトリー解析結果を示す。凍結末梢血ｈＩＬ−１５マウスの末梢血中の２種類のヒト成熟ＮＫ細胞亜種の推移を示すグラフである。末梢血移植ｈＩＬ−１５マウス各組織中のヒトＮＫ細胞の分布についてのフローサイトメトリー解析結果を示す。末梢血移植ｈＩＬ−１５マウスの脾臓から単離されたヒトＮＫ細胞の細胞表面分子についてのフローサイトメトリー解析結果を示す。ヒト末梢血由来ＮＫ細胞の細胞傷害顆粒分泌能についてのフローサイトメトリー解析結果を示し、（ａ）は、ＧｒａｎｚｙｍｅＡとＰｅｒｆｏｒｉｎの発現についての結果を示し、（ｂ）はｈＩＦＮγ発現についての結果を示す。末梢血移植ｈＩＬ−１５マウスから単離されたｈＣＤ５６^＋細胞の、腫瘍生育インビトロ抑制能を示すグラフである。末梢血移植ｈＩＬ−１５マウスの、皮下移植ヒト腫瘍に対するインビボ細胞傷害活性を示すグラフである。

本発明の免疫不全マウスは、ヒトＩＬ−１５を分泌することができ、かつ、移植されたヒトＮＫ細胞をインビボで長期に維持できることを特徴とする、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡがゲノムＤＮＡに挿入されている免疫不全マウスであれば特に制限されず、ヒトＩＬ−１５とは、ヒト末梢血単核細胞が産生するヒトサイトカインタンパク質の一種であり、上記配列番号１に示される塩基配列とは、ヒトインターロイキン２（ｈＩＬ−２）シグナルペプチドをコードするｃＤＮＡ（以下「ｈＩＬ−２ＳＰｃＤＮＡ」ともいう。）にインターロイキン１５タンパク質（ｈＩＬ−１５）をコードするｃＤＮＡ（以下「ｈＩＬ−１５ｃＤＮＡ」ともいう。）が作動可能なように連結されているｈＩＬ−２ＳＰｃＤＮＡ／ｈＩＬ−１５ｃＤＮＡ連結体の塩基配列である。

上記配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡが、マウスのゲノムＤＮＡに挿入されているか否かを判定する方法としては、マウスの組織から抽出されたゲノムＤＮＡについて、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡを検出するために適切なプライマーセットを用いてＰＣＲ法により確認する方法や、サザンブロット分析により確認する方法を例示することができる。

本発明の免疫不全マウスが、ヒトＩＬ−１５を分泌しているか否かを判定する方法としては、ｈＩＬ−１５を特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法により、本発明のマウスのリンパ液、血清・血漿等の血液の体液や臓器抽出物などにおいて、ヒトＩＬ−１５を検出されるか否かを決定する方法を例示することができる。上記免疫学的測定法としては、免疫組織化学染色法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロット分析により確認する方法等を挙げることができる。具体的には、採取したマウス末梢血に抗凝固剤を添加し、抗ｈＩＬ−１５抗体を備える市販のＥＬＩＳＡキットを用いてヒトＩＬ−１５が血漿分画に検出されるか否かを決定する方法を例示することができる。

本発明におけるヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞としては、ヒト末梢血に含まれているヒトＮＫ細胞や、ヒト末梢血から単離されたヒトＮＫ細胞や、ヒト末梢血を用いて人工的に培養されたヒトＮＫ細胞や、冷凍保存後解凍されたヒト末梢血に含まれているヒトＮＫ細胞や、ヒト末梢血から単離されたヒトＮＫ細胞を冷凍保存後解凍したヒトＮＫ細胞や、ヒト末梢血を用いて人工的に培養されたＮＫ細胞を冷凍保存後解凍したヒトＮＫ細胞等を挙げることができる。

上記ヒトＮＫ細胞を本発明の免疫不全マウスに移植する方法としては、移植された異種細胞の生着能を向上させるためにＸ線等の骨髄内環境を破壊する放射線を照射し、放射線照射後にヒト末梢血由来のｈＣＤ５６^＋ＮＫ細胞を移植する方法を挙げることができ、放射される放射線の強度としては、好ましくは１．５〜３．５Ｇｙを挙げることができる。移植の時期としては、放射線照射後２４時間以内が好ましい。また、移植されるＮＫ細胞移植数としては、好ましくは０．２〜１０×１０^６個、好ましくは０．５〜３×１０^６個、より好ましくは１〜２×１０^６個を挙げることができる

本発明の免疫不全マウスが、ｈＣＤ５６^＋細胞がインビボで検出されるか否かを確認する方法としては、公知の方法を用いることができるが、例えば、本発明の免疫不全マウスの血液中の細胞や、本発明の免疫不全マウスの血液中から単離された細胞について、ｈＣＤ５６が陽性を示すｈＣＤ５６^＋細胞であるか否かをフローサイトメトリーによる解析により確認する方法を挙げることができる。

具体的には、上記フローサイトメトリーによる解析において、ｈＣＤ５６^＋細胞が、単核細胞中に１％以上、好ましくは３％以上、より好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上存在する場合や、ｈＣＤ５６^＋細胞が、血液中に少なくとも４０細胞／μＬ存在する場合を挙げることができる。

本発明におけるｈＣＤ５６^＋細胞の、ヒト生体内で成熟したＮＫ細胞との表現型における同一性を増強するための条件としては、ヒトＣＤ５６^＋ＣＤ１６^＋細胞やヒトＣＤ５６^＋ＣＤ１６⁻細胞がそれぞれ血液、脾臓、肝臓及び／又は肺において検出されるが、ヒトＣＤ５６^＋ＣＤ１６^＋細胞やヒトＣＤ５６^＋ＣＤ１６⁻細胞がそれぞれ骨髄において検出されない場合を挙げることができ、本発明において、脾臓、肝臓、肺、血液等のマウスの臓器・組織においてｈＣＤ５６^＋細胞が検出されることを、ｈＣＤ５６^＋細胞が生着したと表現することがある。

本発明におけるｈＣＤ５６^＋細胞の、ヒト生体内で成熟したＮＫ細胞との表現型における同一性を補完するための追加的な条件としては、ヒト組織における成熟ＮＫ細胞の特異的な細胞表面分子として知られている、ｈＮＫＧ２Ａ、ｈＮＫＧ２Ｃ、ｈＮＫＧ２Ｄ、ｈＣＤ９４、ｈＮＫｐ３０、ｈＮＫｐ４６、ｈＮＫｐ４４、ｈＮＫｐ８０、ｈＣＤ５７、ｈＣＤ１５８ａ／ｈ（Killer Immunoglobulin-like Receptor:ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｂ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｄ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｅ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｆ（ＫＩＲ）等の各抗原のいくつかが陽性を示す（発現している）細胞であることを挙げることができ、ｈＮＫＧ２Ａ、ｈＮＫＧ２Ｃ、ｈＮＫＧ２Ｄ、ｈＣＤ９４、ｈＮＫｐ３０、ｈＮＫｐ４６、ｈＮＫｐ４４、ｈＮＫｐ８０、ｈＣＤ５７、ｈＣＤ１５８ａ／ｈ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｂ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｄ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｅ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｆ（ＫＩＲ）のすべてが移植前のＮＫ細胞（ドナー）と同様の発現を示す細胞であることを好ましく挙げることができる。

本発明におけるｈＣＤ５６^＋細胞の、ヒト生体内で成熟したＮＫ細胞との表現型における同一性を増強するためのさらに追加的な条件としては、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を誘導するnatural cytotoxicity receptor（ＮＣＲ）ファミリーの一員として知られているｈＮＫｐ４６が陽性を示す細胞であることや、ＧｒａｎｚｙｍｅＡが陽性を示す細胞であることを挙げることができる。

本発明の免疫不全マウスが、ヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞を移植後にヒト腫瘍の生育をインビトロで抑制することができるか否かを確認する方法としては、脾臓から単離したｈＣＤ５６^＋ＮＫ細胞をサイトカイン存在下で培養後に標的ヒト腫瘍細胞と共培養し、その培養上清について、死細胞由来細胞質性酵素ＬＤＨと反応基質との共益酵素反応による呈色度によって評価することにより、細胞傷害活性（cytotoxicity(%)）を測定する方法を例示することができる。上記サイトカインとしては、ヒトＩＬ−２、ヒトＩＬ−１５、ヒトＩＬ−２とヒトＩＬ−１５との混合組成物等を挙げることができるが、ヒトＩＬ−１５が好ましい。

本発明の免疫不全マウスが、ヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞を移植後にヒト腫瘍の生育をインビボで抑制することができるか否かを確認する方法としては、ヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞を移植後に、さらにＮＫ感受性ヒト腫瘍細胞株を移植して経時的に腫瘍径を測定した場合に、腫瘍のサイズが縮小するか否かにより判定することができる。

上記ｈＣＤ５６^＋細胞がインビボで検出される長期の期間としては、８週間以上を挙げることができ、１２週間以上が好ましく、１６週間以上がより好ましく、２０週間以上がさらに好ましく、２４週間以上が特に好ましい。

本発明の免疫不全マウスとしては、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスを好適に例示することができ、本発明免疫不全マウスの作製方法は特に制限されるものではないが、例えば、以下の（１）〜（７）の工程を順次含む上記ＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスの作製方法を例示することができる。

（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡをマウスゲノムＤＮＡに挿入するために必要な領域を含むベクターに、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡを導入することにより、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡを有するマウス受精卵注入ＤＮＡ調製用ベクターを作製する工程；
（１−１）必要に応じて、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡがマウスゲノムＤＮＡに挿入されるために必要な領域とを含む受精卵注入用ＤＮＡ断片を調製する工程；
（２）上記工程（１）において作製されたベクター及び／又は上記（１−１）で調製されたベクター断片をインターロイキン２受容体γ鎖遺伝子（ＩＬ−２Ｒγ）ノックアウトマウスの受精卵に注入することにより注入受精卵を作製する工程；
（３）上記工程（２）において作製された注入受精卵を培養することにより、新生子マウスを作製する工程；
（４）上記工程（３）において作製されたマウスにおいて、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡがＮＯＤ−ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌマウスのゲノムＤＮＡに挿入されたか否かを判定する工程；
（５）上記工程（４）において配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡがＮＯＤ−ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌマウスのゲノムＤＮＡに挿入されたと判定されたマウスが、ｈＩＬ−１５を分泌しているか否かを判定し、ｈＩＬ−１５を分泌しているマウスをＮＯＤ−ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスとして選抜する工程；
（６）上記ＮＯＤ−ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスと、ＮＯＧ（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ）マウスとを交配して、ｓｃｉｄ変異が導入されたＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスを作製する工程；
（７）ＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスと、ＮＯＧマウスとを交配してＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５ＴｇマウスとＮＯＧマウスとを１：１で作製する工程；

工程（１）において、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡをマウスゲノムＤＮＡに挿入するために必要な挿入領域としては、サイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ−ＩＥ）等のマウス細胞において作動可能なプロモーター、ＳＶ４０ＳＳ／ＳＡ、及びＳＶ４０ＰｏｌｙＡを含む領域を例示することができ、かかる挿入領域を含む発現ベクターとしては、ｐＣＭＶβを例示することができる。

上記配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡを含むマウス受精卵注入ＤＮＡ調製用ベクターを作製する方法としては、公知の遺伝子組換え技術を用いる方法を挙げることができ、具体的には、ｐＣＭＶ−ＬａｃＺを制限酵素ＮｏｔＩで切り出し、β−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡを、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに置換する方法を例示することができる。

工程（１−１）における、受精卵注入用ＤＮＡ断片を作製する方法としては、公知の遺伝子組換え技術を用いる方法を挙げることができ、具体的には、上記配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡを有するマウス受精卵注入ＤＮＡ調製用ベクターを制限酵素ＰｖｕIIで切り出し、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡと挿入領域とを含むＤＮＡとを有するベクター断片を精製する方法を挙げることができる。

工程（２）における、注入受精卵を作製する方法としては、上記マウス受精卵注入ＤＮＡ調製用ベクターや受精卵注入用ＤＮＡ断片を、マウスの受精卵に注入することができる方法であれば特に制限されず、マイクロインジェクションによる方法、電気穿孔法、ウィルスベクター法等を挙げることができる。インターロイキン２受容体γ鎖遺伝子（ＩＬ−２Ｒγ）ノックアウトマウスとしては、ＮＯＤ−ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌマウスを好適に挙げることができる。

工程（３）における、注入受精卵を培養する方法としては、新生子マウスを取得することができる方法であれば特に制限されず、注入受精卵を体外で１８〜２４時間３７℃にて培養した後、仮親の子宮へ移植・着床させ、出産直前に帝王切開を行い、新生子マウスを取得する方法を例示することができる。かかる新生子マウスは、さらに里子操作を行うことにより産子マウスとすることが好ましい。

工程（４）における、上記新生子マウスや産子マウスにおいて、配列番号１に示される塩基配列がゲノムＤＮＡに挿入されているか否かを判定する方法としては、各マウスが３−４週齢以上に達した時点で、マウスの組織から抽出されたゲノムＤＮＡについて、配列番号１に示される塩基配列が挿入されたか否かをＰＣＲ法により確認する方法を挙げることができる。

工程（５）における、工程（４）において配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡがＮＯＤ−ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌマウスのゲノムＤＮＡに挿入されたと判定されたマウスが、ｈＩＬ−１５を分泌しているか否かを判定する方法としては、ｈＩＬ−１５を特異的に認識する抗体を用いた前記免疫学的測定法を挙げることができる。

工程（６）における、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスを作製する方法としては、上記ＮＯＤ−ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌマウス−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスとして選抜されたマウスにｓｃｉｄ変異を導入することができる方法であれば特に制限されず、具体的には、ＮＯＤ−ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５ＴｇマウスとＮＯＧ（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ）マウスとを交配する方法を挙げることができる。

工程（７）においては、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスと、ＮＯＧマウスとを交配することによりＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５ＴｇマウスとＮＯＧマウスとを１：１で取得することができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

［実施例１］
［ＩＬ-１５を産生するＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスの作製］
（概要）
公益財団法人実験動物中央研究所(以下、「実中研」ともいう。）の動物実験委員会の承認を得たガイダンスに従い、ＮＯＤ−ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌマウスと、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌマウス（以下、「ＮＯＧマウス」ともいう。)とを用いて、ヒトＩＬ−１５を分泌するトランスジェニックマウスである、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスを作製した。これらのマウスは、実中研のＳＰＦ飼育室において特別に管理されており、一定条件下で分譲可能である。

（受精卵注入用ＤＮＡの調製）
哺乳類用レポーターベクターであるｐＣＭＶβ（インビトロジェン社製）（図１（ａ）参照）を用いて、サイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ−ＩＥ）ＤＮＡの下流に、ＳＶ４０ＳＤ／ＳＶＤＮＡ、ｈＩＬ−２ＳＰｃＤＮＡ／ｈＩＬ−１５ｃＤＮＡ連結体である配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、及びポリＡ配列ＤＮＡが順次組み込まれた、受精卵注入ＤＮＡ調製用ベクターを構築した。具体的には、上記ｐＣＭＶ−ＬａｃＺを制限酵素ＮｏｔＩで切り出し、β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を、Ｇｅｎｂａｎｋ（アクセッション番号：ｈＩＬ−２（ＮＭ＿０００５８６）と、ｈＩＬ−１５（ＮＭ＿０００５８５又はＢＣ１００９６２）とを参照することにより決定されたｈＩＬ−２ＳＰｃＤＮＡ／ｈＩＬ−１５ｃＤＮＡ連結体の塩基配列を含むＤＮＡと置き換えた。

具体的には、ｐＣＭＶβを制限酵素ＮｏｔＩで処理し、β−ガラクトシダーゼ遺伝子配列部分を除去し、その中にＮｏｔＩで切り出したｈＩＬ−２ＳＰｃＤＮＡ／ｈＩＬ−１５ｃＤＮＡ連結体を挿入した。ｈＩＬ−２ＳＰｃＤＮＡ／ｈＩＬ−１５ｃＤＮＡ連結体は、別途調製された。すなわち、健常人末梢血単核球より作製したｃＤＮＡより、ＰｒｉｍｅｒＡ：ＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＡＧＴＡＡＣＣＴＣＡＡＣＴＣＣＴＧＣＡＡ（配列番号２）及びＰｒｉｍｅｒＢ：ＡＴＣＡＣＴＡＧＴＴＧＣＡＣＴＧＴＴＴＧＴＧＡＣＡＡＧＴＧＣ（配列番号３）を用いてヒトｈＩＬ−２ＳＰ部分を増幅し、ＰｒｉｍｅｒＣ：ＧＧＧＡＣＴＡＧＴＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＴＡＡＴＡＡＧＴＧ（配列番号４）及びＰｒｉｍｅｒＤ：ＣＡＡＣＴＡＧＴＴＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＡＧＡＡＧＴＧＴＴＧＡＴＧＡＡ（配列番号５）でヒトｈＩＬ−１５ＭＰ部分を増幅し、それぞれの増幅断片をＰＣＲ２．１ベクター（登録商標）（インビトロジェン社製）にそれぞれ挿入した。その後、ヒトｈＩＬ−２ＳＰ部分をＮｏｔ１で切り出し、β−ガラクトシダーゼ遺伝子配列部分を除去したｐＣＭＶβに挿入した。その後、さらにそのベクターにヒトＩＬ−１５ｃＤＮＡ部分を含む領域をＳｐｅＩで切り出し、挿入した。構築された受精卵注入ＤＮＡ調製用ベクターの構成を図１（ｂ）に示す。

上記受精卵注入ＤＮＡ調製用ベクターを制限酵素ＰｖｕIIで切り出し、受精卵に注入するために必要な領域を含むベクター断片を精製して、１８４０ｂｐからなる受精卵注入用ＤＮＡ断片（図２参照）を調製した。受精卵注入用ＤＮＡ断片の配列を配列番号６に示す。

（ＮＯＤ−ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスの作製）
ＮＯＤ−ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌマウスの前核期受精卵１２３個に、上記受精卵注入用ＤＮＡを１．５ｎｇ／ｍＬ濃度に調製し、マイクロマニピュレータ付き倒立顕微鏡（ライカ社製）を用いてマイクロインジェクションした。

上記受精卵注入用ＤＮＡがマイクロインジェクションされた前核期受精卵のうち、培養後正常に２細胞期になった受精卵と判断された２細胞期胚６３個を仮親マウスの卵管へ移植し、出産直前に帝王切開を行い、新生子マウスを得、さらに里子操作を行うことにより２４匹の産子マウスを得た。

（遺伝子解析）
上記産子マウスが３−４週齢に達した時点で、各産子マウスの尾の先端１−２ｍｍから採取した組織片から自動ＤＮＡ抽出装置（ＴＯＹＯＢＯ社製）によって抽出されたゲノムＤＮＡについて、以下に示されるプライマーセットを用いて、配列番号１に示される塩基配列が各産子のゲノムＤＮＡに挿入されたか否かを以下の条件によりＰＣＲ法により確認した。

(プライマー)
ＩＬ２ＳＰＳ１：５’−ＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＡＧＴＡＡＣＣＴＣＡＡＣＴＣＣＴＧＣＣＡ−３’(フォワードプライマー)（配列番号７）
ＩＬ１５ｍｐＡＳ３：５’−ＣＡＡＣＴＡＧＴＴＣＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＡＧＡＡ−３’（リバースプライマー）（配列番号８）

(ＰＣＲ反応液)
Ａ液：
２．５μＬＥｘ−ｔａｑ用×１０ｂｕｆｆｅｒ
２μＬｄＮＴＰｍｉｘ
１．２５μＬＩＬ２ＳＰＳ１（５μＭ）
１．２５μＬＩＬ１５ｍｐＡＳ３（５μＭ）
０．１２５μＬＥｘ−ｔａｑ
６．８７５μＬＤＷ
Ｂ液：
８．５μＬＤＷ
１．５μＬゲノムＤＮＡ
Ａ液とＢ液とを混合して、ＰＣＲ反応液を調製した。

（ＰＣＲ増幅条件）
２４μＬの上記ＰＣＲ反応液を用い、９４℃にて３分の加熱処理；９４℃にて３０秒、６０℃にて３０秒、７２℃にて１分を１サイクルとして３５サイクル；その後７２℃にて２分加熱処理；の条件で増幅処理が行われた。上記ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲル中で電気泳動に供し、４８０ｂｐ付近の増幅産物バンドの有無を確認することにより、上記各産子マウスにおいて、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡがゲノムＤＮＡに挿入されたか否かを判定した。

上記遺伝子解析にて、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡがゲノムＤＮＡに挿入されたと判定された産子マウスから採血を行い、血清／血漿分画へのｈＩＬ−１５の分泌の有無を、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄＨｕｍａｎＩＬ−１５キット（cat no.435108）を用いてＥＬＩＳＡ法で確認した。ｈＩＬ−１５が分泌されていることが確認されたマウスを、ＮＯＤ−ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスと呼ぶことにした。

（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスの作製）
上記ＮＯＤ−ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウス（雌）と、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌマウス（以下「ＮＯＧマウス」ともいう。）（雄）とを交配することにより、ＮＯＤ−ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスに、免疫系の主要な担当細胞であるＴ細胞及びＢ細胞が欠損しているｓｃｉｄ変異をさらに導入して、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウス（以下「ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウス」ともいう。）を作製した。

上記ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５ＴｇマウスとＮＯＧマウスとを交配することによりＮＯＧ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスと、ＮＯＧマウスとを１：１の割合で取得した。実施例２以降においては、ＮＯＧマウス（以下「ｎｏｎ-Ｔｇマウス」と表記される場合もある。)を、配列番号１に示される塩基配列を有する遺伝子がゲノムＤＮＡに挿入されていないネガティブコントロールとして、ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスについて検討を行った。

［実施例２］
［ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスについての検討］
（血漿中のｈＩＬ−１５濃度）
ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスの血漿中のｈＩＬ−１５濃度を測定した。４〜６週齢のマウス個体からヘパリン(Novo-heparin、持田製薬株式会社製)を用いて麻酔下にて末梢血を収集した。血漿中のｈＩＬ−１５濃度は、前記ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。結果を図３に示す。

（結果）
図３から明らかなとおり、ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウス（図中では「ｈＩＬ−１５Ｔｇ」）（Ｎ＝１２６）における血漿中のｈＩＬ−１５濃度は、４７．７±２７．５ｐｇ／ｍＬであり、ｎｏｎ−Ｔｇマウスにおける血漿中のｈＩＬ−１５濃度は、１．３±１．５ｐｇ／ｍＬであった。したがって、ゲノムＤＮＡに挿入されたＮＯＧ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスにおいては、ＮＯＧマウスに比べて顕著に多く、ゲノムＤＮＡに挿入された配列番号１に示される塩基配列を有する遺伝子により全身的に産生されたｈＩＬ−１５が血液中に分泌されていることが確認された。

［実施例３］
［ヒト臍帯血由来ＣＤ３４^＋造血幹細胞移植ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスのヒト細胞分化能の検討］
（フローサイトメトリー測定手順）
実施例３以降のフローサイトメトリーを用いる検討は、以下の手順で行われた。ｈＣＤ５６^＋細胞がヒトＮＫ細胞であると判断し、それぞれの検討項目に適した抗体により解析を行った。具体的には、４℃にて暗所で３０分間染色後、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＦＢＳと０．１％ＮａＮ_３を含むＰＢＳ）で洗浄し、細胞はヨウ化プロピジウム含有ＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁され、その後フローサイトメトリー測定に供された。フローサイトメトリー測定は、ＢＤＦＡＣＳＣａｎｔｏ^ＴＭフローサイトメーター（ＢＤ社製）を用いて行われ、データは、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ver.6.1.3）（ＢＤ社製）によって解析された。細胞数の絶対値は、Ｆｌｏｗ−Ｃｏｕｎｔ(Beckman Coulter社製）を用いて取扱説明書にしたがって算出された。

（抗体）
使用された抗体は、具体的には以下のとおりである。
抗ｈＣＤ３抗体：anti-human CD3-FITC(BioLegend社製）anti-human CD3-PE (BioLegend社製）、
抗ｈＣＤ１６抗体：anti-human CD16-FITC（BioLegend社製）、
抗ｈＣＤ１９抗体：anti-CD19 （BioLegend社製）、
抗ｈＣＤ３３抗体：anti-human CD33-FITC （BD Biosciences社製）、
抗ｈＣＤ４５抗体：anti-human CD45-allophycocyanin-Cy7 （BioLegend社製）、
抗ｈＣＤ５６抗体：anti-human CD56-PE(BioLegend社製）、
抗ｈＣＤ５７抗体：anti-CD57（BioLegend社製）、
抗ＮＫＧ２Ａ抗体：anti-human CD159a (NKG2A)-PE (Beckman Coulter社製）、
抗ＮＫＧ２Ｃ抗体： Alexa Fluor 488-conjugated anti-human NK group 2 membrane C(R&D Systems社製）、
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体：anti-NKG2D（BioLegend社製）、
抗ｈＣＤ９４抗体：anti-CD94（BioLegend社製）、
抗ｈＮＫｐ３０抗体：anti-NKp30（BioLegend社製）、
抗ｈＮＫｐ４６抗体：anti-NKp46（BioLegend社製）、
抗ｈＮＫｐ４４抗体：anti-NKp44（BioLegend社製）、
抗ｈＮＫｐ８０抗体：anti-human NKp80-PE(Beckman Coulter社製）、
抗ｈＣＤ１５８ａ／ｈ抗体（Killer Immunoglobulin-like Receptor:ＫＩＲ）（ＫＩＲ２ＤＬ１／Ｓ１／Ｓ３／Ｓ５）：FITC-conjugated anti-CD158a/h （BioLegend社製）、
抗ｈＣＤ１５８ｂ抗体（ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３，ＮＫＡＴ２）：anti-CD158b （BioLegend社製）、
抗ｈＣＤ１５８ｄ抗体（ＫＩＲ２ＤＬ４）：anti-CD158d （BioLegend社製）、
抗ｈＣＤ１５８ｅ抗体（ＫＩＲ３ＤＬ１，ＮＫＢ１）：anti-CD158e （BioLegend社製）、
抗ｈＣＤ１５８ｆ抗体（ＫＩＲ２ＤＬ５）；anti-CD158f （BioLegend社製）、
抗ｍＣＤ４５抗体: anti-mouse CD45-allophycocyanin（BioLegend社製）、

［実施例４］
（ヒト臍帯血由来ｈＣＤ３４^＋造血幹細胞移植ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスの作製）
上記８〜１２週齢の成体ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスにヒト臍帯血由来ｈＣＤ３４^＋造血幹細胞を移植した。２．５ＧｙのＸ線を照射し、照射後２４時間以内にヒト臍帯血由来のｈＣＤ３４^＋造血幹細胞２×１０^４個を尾静脈より移植し、ヒト臍帯血由来ｈＣＤ３４^＋造血幹細胞を移植したＮＯＧ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウス（以下「幹細胞移植ｈＩＬ−１５マウス」ともいう。）を作製した。同様に、ヒト臍帯血由来ｈＣＤ３４^＋造血幹細胞を移植したＮＯＧマウス（以下「幹細胞移植ｎｏｎ−Ｔｇマウス」ともいう。）を作製し、ネガティブコントロールとした。また、ヒトＮＫ細胞が選択的に分化・増殖することが既に確認されている、インターロイキン２（ｈＩＬ−２）のシグナルペプチドとｃＤＮＡがゲノムＤＮＡに挿入されているＮＯＧ−ｈＩＬ−２Ｔｇマウスに、ヒト臍帯血由来ｈＣＤ３４^＋造血幹細胞移植したマウス（以下「幹細胞移植ｈＩＬ−２マウス」ともいう。）をポジティブコントロールとした。

［実施例５］
(臍帯血由来ｈＩＬ−１５マウスの末梢血中のヒト細胞分化能の検討)
上記３種類のｈＣＤ３４^＋造血幹細胞移植マウスについて、移植後４週経過時に末梢血から採血を行い、ＮＫ細胞の指標となるｈＣＤ５６抗原、白血球の指標となるｈＣＤ４５抗原、Ｂ細胞の指標となるｈＣＤ１９抗原、Ｔ細胞の指標となるｈＣＤ３抗原に対する各特異抗体で染色した後フローサイトメトリーで測定することにより、マウス血液中のヒト白血球キメラ率を解析した。図４（ａ）に単核細胞（ＭＮＣ）中のヒト免疫細胞量（／μＬ）を示し、及び図４（ｂ）に単核細胞中に占める細胞数（％）を示す。

（結果１）
図４（ａ）から明らかなとおり、移植後４週目の幹細胞移植ｈＩＬ−１５マウス及び幹細胞移植ｈＩＬ−２マウスの末梢血においては、ｈＣＤ５６^＋細胞の発現が多く、ヒトＮＫ細胞が選択的に分化、増殖していることが確認された。一方、幹細胞移植ｎｏｎ−Ｔｇマウスの末梢血においては、ｈＣＤ５６陽性細胞の発現はほとんどなかった。また、ｈＣＤ１９^＋細胞の発現は、幹細胞移植ｈＩＬ−２マウスの末梢血において約３細胞／μＬであり、また、幹細胞移植ｈＩＬ−１５マウス、及び幹細胞移植ｎｏｎ−Ｔｇマウスの末梢血においては１〜２細胞／μＬ程度であって、いずれのマウスにおいてもヒトＢ細胞への分化、増殖はほとんど観察されなかった。

(結果２)
図４（ｂ）から明らかなとおり、移植後４週目の幹細胞移植ｈＩＬ−１５マウス及び幹細胞移植ｈＩＬ−２マウスの末梢血においてはｈＣＤ５６^＋細胞の発現が非常に多く、ヒトＣＤ５６^＋ＮＫ細胞が分化、増殖していることが確認された。

［実施例６］
(幹細胞移植ｈＩＬ−１５マウスの各組織におけるヒト細胞分化能の検討)
ｈＣＤ３４^＋造血幹細胞移植した上記３種類の被検マウスについて、移植後６週経過時に骨髄、脾臓、末梢血を採取し、ヒトＣＤ５６^＋ＮＫ細胞を単離し、各特異抗体で染色した後フローサイトメトリーで測定することにより、マウス各組織中のヒト細胞分化能を解析した。結果を図５に示す。

（結果）
図５から明らかなとおり、幹細胞移植ｈＩＬ−１５マウス及び幹細胞移植ｈＩＬ−２マウスの骨髄（ＢＭ）、脾臓（ＳＰＬ）、末梢血（ＰＢ）のいずれにおいても、ヒトＮＫ細胞の局在が、ｈＣＤ５６^＋、ｈＣＤ４５^＋の分画で示される赤枠内に確認されたが、幹細胞移植ｎｏｎ-Ｔｇマウスにおいては、ヒトＮＫ細胞の局在はほとんど確認されなかった。

［実施例７］
（ヒト造血細胞由来ＮＫ細胞に特異的な受容体の発現解析）
前記幹細胞移植ｈＩＬ−１５マウス及び幹細胞移植ｈＩＬ−２マウスの脾臓から単離されたヒトＮＫ細胞について、ヒト生体内で分化した成熟ＮＫ細胞の亜分画で特異的な細胞表面分子であるとされるｈＣＤ１６抗原、ヒト末梢血でＮＫ活性を持つ細胞サブセットに発現されるとされるｈＣＤ５７抗原、ＮＫ細胞表面に発現する抑制型受容体とされるｈＮＫＧ２Ａ抗原、ＮＫ細胞表面に発現する活性型受容体とされるｈＮＫＧ２Ｃ抗原、ＮＫ細胞表面に発現する活性型受容体とされるｈＮＫＧ２Ｄ抗原に対する各特異抗体で染色した後フローサイトメトリーで測定することにより、ヒトＮＫ細胞特異的な受容体の発現を解析した。ヒト末梢血成熟ＮＫ細胞であるＪａｐａｎｅｓｅＰＢ−ＮＫ細胞（インフォームドコンセントを受けた、日本人ドナーの末梢血より単離したヒトＮＫ細胞）をポジティブコントロールとした。結果を図６に示す。

(結果)
図６からも明らかなとおり、幹細胞移植ｈＩＬ−１５Ｔｇマウス、幹細胞移植ｈＩＬ−２Ｔｇマウスいずれの末梢血におけるＮＫ細胞においても、ｈＣＤ１６抗原、ｈＣＤ５７抗原、ｈＮＫＧ２Ａ抗原、ｈＮＫＧ２Ｃ抗原、ｈＮＫＧ２Ｄ抗原の発現が確認された。しかしながら、その発現パターンは、ｈＣＤ５６抗原の発現強度が高い点と、ｈＣＤ５６^＋ＣＤ１６⁻分画の割合が多い点で、ヒト末梢血成熟ＮＫ細胞とは発現様式が異なっており、臨床において、ＩＬ−２投与療法を受けた患者の血液中で増加するｈＣＤ５６^＋ＣＤ１６⁻活性化ＮＫ細胞と類似したＮＫ細胞特異抗原の発現パターンを示してしていたことから、幹細胞移植ｈＩＬ−１５マウス・幹細胞移植ｈＩＬ−２マウスの中で分化したヒト造血幹細胞由来ＮＫ細胞は、マウス内のｈＩＬ−１５又はｈＩＬ−２によって活性化したＮＫ細胞が多く存在している事が推定された。

［実施例８］
（ヒト造血細胞由来ＮＫ細胞の細胞傷害顆粒分泌能の検証）
前記幹細胞移植ｈＩＬ−１５Ｔｇマウス及び幹細胞移植ｈＩＬ−２Ｔｇマウスの脾臓から単離されたヒトＮＫ細胞が、細胞傷害顆粒の分泌能／サイトカイン産生能を有する否かを検証した。移植後６週経過時に各マウスの脾臓を摘出し細胞調製を行い、ヒトＣＤ５６^＋ＮＫ細胞を単離し、ブレフェルディンＡ（BioLegend社製）存在下で２０時間培養した後に蛍光標識抗体（ＦＩＴＣ−抗ｈＧｒａｎｚｙｍｅＡ抗体、ＦＩＴＣ−抗Ｐｅｒｆｏｒｉｎ抗体（BioLegend社製）で細胞内染色をして、フローサイトメトリーで測定した。結果を図７（ａ）に示す。また、ヒト上記単離したヒトＣＤ５６^＋ＮＫ細胞をＰＭＡ／ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ存在下で培養した後、蛍光標識抗体ＰＥ−抗ｈＩＦＮｇ抗体（BioLegend社製）で細胞内染色を行い、フローサイトメトリーで測定した。結果を図７（ｂ）に示す。

(結果)
図７（ａ）から明らかなとおり、上記いずれのマウス由来のヒトＣＤ５６^＋ＮＫ細胞においても、ヒト生体内で分化した成熟ＮＫ細胞の結果（データ示さず）と同等の細胞傷害顆粒であるＧｒａｎｚｙｍｅＡの発現が確認された。Ｐｅｒｆｏｒｉｎについても発現が確認されたが、ヒト生体内で分化した成熟ＮＫ細胞の結果（データ示さず）と比較して発現がやや少ない結果となった。また、図７（ｂ）から明らかなとおり、上記いずれのマウス由来のヒトＮＫ細胞においても、ＰＭＡ／ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ刺激により、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の産生が認められた。

［実施例９］
（ヒト末梢血由来ｈＣＤ５６^＋ＮＫ細胞移植ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスの作製）
上記８〜１２週齢の成体ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスにヒト末梢血由来ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞を移植した。２．５ＧｙのＸ線を照射し、照射後２４時間以内にヒト末梢血由来のｈＣＤ５６^＋ＮＫ細胞１〜２×１０^６個を尾静脈より移植し、ヒト末梢血由来ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞移植ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウス（以下「末梢血移植ｈＩＬ−１５マウス」ともいう。）を作製した。同様に、ヒト末梢血由来ｈＣＤ５６^＋ＮＫ細胞移植ＮＯＧ−ｈＩＬ−２Ｔｇマウス（以下「末梢血移植ｈＩＬ−２マウス」ともいう。）を作製した。ヒト末梢血由来ｈＣＤ５６^＋ＮＫ細胞を移植したＮＯＧマウス（以下「末梢血移植ｎｏｎ−Ｔｇマウス」ともいう。）を作製し、ネガティブコントロールとした。

［実施例１０］
(末梢血移植ｈＩＬ−１５マウスの末梢血中細胞の検討)
移植後３週間経過時に採血し、ｍＣＤ４５抗原、ｈＣＤ３抗原、ｈＣＤ１６抗原、ｈＣＤ４５抗原、ｈＣＤ５６抗原に対する各特異抗体で染色した後フローサイトメトリーで測定することにより、各マウス血液中のヒト白血球キメラ率を解析した。ヒト白血球の指標となるｈＣＤ４５抗原陽性分画（マウス白血球の指標となるｍＣＤ４５は陰性の分画）にゲートし、さらにヒトＮＫ細胞の指標となるｈＣＤ５６抗原とＴ細胞の指標となるｈＣＤ３抗原に対するパターンで展開した。ｈＣＤ４５^＋ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞にゲートし、さらにｈＣＤ５６抗原とｈＣＤ１６抗原に対するパターンで展開し、ｈＣＤ５６^＋ｈＣＤ１６^＋ＮＫ細胞の割合を解析した。ヒトＴ細胞の混入を確認するため、ｈＣＤ４５^＋ｈＣＤ３^＋Ｔ細胞の割合も確認した。結果を図８に示す。

(結果)
図８において、「ＰＢＭＣ」は、健常人由来のヒト末梢血中の単核球を表す。「ＣＤ５６^＋ｓｏｒｔｅｄ（ｐｒｅ−ｔｒａｎｓｆｅｒ）」は、移植前のＰＢＭＣより単離したｈＣＤ５６^＋ＮＫ細胞を表す。「Ａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｒ（３ｗ）」は、移植後３週経過時の末梢血移植ｈＩＬ−１５マウスの末梢血を表す。移植後３週経過時の末梢血移植ｈＩＬ−１５マウスにおいては、ｈＣＤ４５^＋ヒト白血球内ではＣＤ５６^＋ＣＤ１６^＋ＮＫ細胞分画が大部分（９９．７％）を占めていた。「ＰＢＭＣ」、「ＣＤ５６^＋ｓｏｒｔｅｄ（ｐｒｅ−ｔｒａｎｓｆｅｒ）」においても、ヒト末梢血中の成熟ＮＫ細胞は、ｈＣＤ４５^＋ヒト白血球中のｈＣＤ５６^＋ｈＣＤ１６^＋分画において９０％以上を占めていることから、移植されたｈＣＤ５６^＋ＮＫ細胞は、移植後３週間経過時においても、健常人由来のヒト末梢血中の単核球と同様のｈＣＤ５６^＋ｈＣＤ１６^＋ＮＫ細胞という性質を維持したまま生着し、増殖していると判断することができた。

［実施例１１］
移植後経時的に採血し、単核細胞中のＮＫ細胞とＴ細胞の占める割合を計測した。上記３種類の末梢血移植マウスについて、移植後経過時に末梢血から採血を行い、ＮＫ細胞の指標となるｈＣＤ５６抗原、白血球の指標となるｈＣＤ４５抗原、Ｔ細胞の指標となるｈＣＤ３抗原に対する各特異抗体で染色した後フローサイトメトリーで測定することにより、マウス血液中のヒト白血球キメラ率を解析した。図９（ａ）に単核細胞（ＭＮＣ）中に占めるＮＫ細胞数（％）を、図９（ｂ）にＭＮＣ中に占めるＴ細胞数（％）を示す。また、図９（ｃ）に末梢血移植ｈＩＬ−１５マウス血液中のＮＫ細胞数（／μＬ）を示し、図９（ｄ）に末梢血移植ｎｏｎ−Ｔｇマウス血液中のＮＫ細胞数（／μＬ）を示す。

（結果）
図９(ａ)から明らかなとおり、ＮＫ細胞については、末梢血移植ｈＩＬ−１５マウスにおいて、移植後２週経過時には単核細胞中の約３０〜約４６％を占め、４週経過時に約１０〜約２０％を占め、６週経過時に約８〜約１５％を占めた。図９（ｂ）から明らかなとおり、末梢血移植ｈＩＬ−２マウスにおいては、一番増加した移植後４週経過時で１０％未満にとどまった。Ｔ細胞については、末梢血移植ｈＩＬ−１５マウスではほとんど検出されなかった一方、末梢血移植ｈＩＬ−２マウスでは移植後３〜４週経過時に約１８〜約２３％を占めた。末梢血移植ｎｏｎ−Ｔｇマウスにおいては、ＮＫ細胞もＴ細胞もほとんど確認されなかった。以上の結果より、末梢血移植ｈＩＬ−２マウスでは、ＮＫ細胞が血液中で増殖せず、移植細胞に極めて少数混入していたＴ細胞が増殖してしまうことが確認されたため、これ以降の実験は、末梢血移植ｈＩＬ−１５マウスについてのみ検討を行うこととした。また、ヒト末梢血ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスにおいては、血液中のヒトＮＫ細胞数が徐々に増加し、移植後４−５週経過時には８０００個／μＬまで増加した。その後は徐々に減少したが、移植後２４週経過しても、約４０細胞／μＬが確認された（図９（ｃ）参照）。ヒト末梢血ｎｏｎ−Ｔｇマウスでは、移植後２週経過の時には約４０細胞／ｕＬ確認されたのが最大値であって、増殖はほとんど観察されなかった（図９（ｄ）参照）。

［実施例１２］
（ヒト成熟ＮＫ細胞亜種の推移についての検討）
ヒトＮＫ細胞は、ｈＣＤ５６^＋ｈＣＤ１６^＋分画を占める細胞傷害能に特化された亜集団と、ｈＣＤ５６^＋ｈＣＤ１６⁻分画を占めるサイトカイン産生能に特化された亜集団とが存在することが知られている。末梢血移植ｈＩＬ−１５マウスに移植されたヒト成熟ＮＫ細胞が、どちらの分画において増殖するのかを確認するために、細胞亜集団（sub-population）の経時的変動を解析した。結果を図１０に示す。

（結果)
図１０から明らかなとおり、ｈＣＤ５６^＋ｈＣＤ１６^＋分画は、移植後１週目〜８週目にわたりほぼ９０％以上を維持した。一方、ｈＣＤ５６^＋ｈＣＤ１６⁻分画は、移植後１週経過時に約１１％を占めたがその後漸減した。したがって、末梢血移植ｈＩＬ−１５マウスの末梢血においては、ｈＣＤ５６^＋ｈＣＤ１６^＋分画を示す細胞傷害能に特化された亜集団が増殖していることが確認された。

［実施例１３］
［凍結末梢血ｈＩＬ−１５マウスの調製］
上記８〜１２週齢の成体ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスにヒト末梢血由来ｈＣＤ５６^＋凍結ＮＫ細胞を解凍して移植した。２．５ＧｙのＸ線を照射し、照射後２４時間経過時に解凍されたヒト末梢血由来ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞１〜２×１０^６個を尾静脈より移植し、ヒト末梢血由来ＣＤ５６^＋凍結ＮＫ細胞移植ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウス（以下「凍結末梢血ｈＩＬ−１５マウス」ともいう。）を作製した。

［実施例１４］
(凍結末梢血ｈＩＬ−１５マウスの末梢血中のヒト細胞分化能の検討)
凍結末梢血ｈＩＬ−１５マウスについて、移植後経時的に採血し、各特異抗体で染色した後フローサイトメトリーで測定することにより、マウス血液中のヒト白血球キメラ率を解析した。ヒト白血球の指標となるｈＣＤ４５抗原陽性分画（マウス白血球の指標となるｍＣＤ４５は陰性の分画）にゲートし、さらにヒトＮＫ細胞の指標となるｈＣＤ５６抗原とＴ細胞の指標となるｈＣＤ３抗原に対するパターン、及びヒトｈＣＤ５６抗原とｈＣＤ１６抗原に対するパターンで展開し、ヒトＣＤ５６^＋ＮＫ細胞、及びヒトＣＤ５６^＋ＣＤ１６^＋ＮＫ細胞の割合を解析した。ヒトＴ細胞の混入を確認するため、ｈＣＤ４５^＋ｈＣＤ３^＋Ｔ細胞の割合も確認した。結果を図１１及び図１２に示す。

（結果１）
図１１において、移植していない凍結ヒトＣＤ５６^＋ＮＫ細胞を表す「ＦｒｏｚｅｎＰＢ−ＮＫ（Ｐｒｅ−ｔｒａｎｓｆｅｒ）」から明らかなとおり、解凍後のヒト末梢血中の成熟ＮＫ細胞は、ｈＣＤ１６^＋ｈＣＤ５６^＋分画において８５．２％を占めている。凍結ヒトＣＤ５６^＋ＮＫ細胞を移植後４週目の凍結末梢血ｈＩＬ−１５マウスにおいても、ｈＣＤ１６^＋ｈＣＤ５６^＋分画において８１．３％を占めているので、新鮮血由来ヒトＮＫ細胞移植実験と同様に、移植された解凍後のヒトＮＫ細胞は、ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスに移植後４週経過時においても生着し、増殖していることを確認することができた。

（結果２）
図１２から明らかなとおり、ＣＤ５６^＋ＣＤ１６^＋分画を占める亜集団が選択的に増幅し、移植後１週目〜２週目にわたり急激に増加し、３週目以降漸減した。一方、ＣＤ５６^＋ＣＤ１６⁻分画を占めるサイトカイン産生能に特化された亜集団はほとんど増加することはなかった。したがって、ＣＤ５６^＋凍結ＮＫ細胞移植ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスにおいては、細胞傷害能に特化されたＣＤ５６^＋ＣＤ１６^＋ＮＫ細胞が顕著に増殖することが確認された。

［実施例１５］
（末梢血移植ｈＩＬ−１５マウスの各組織におけるヒト細胞の検討）
末梢血移植ｈＩＬ−１５マウスについて、移植後６週経過時に麻酔下にて全採血することで安楽死処置を施した後、骨髄、脾臓、肝臓、肺を採取して細胞調製を行った。各特異抗体で染色した後フローサイトメトリーで測定することにより、マウス各組織中のヒト化細胞を解析した。結果を図１３に示す。

（結果）
図１３から明らかなとおり、末梢血移植ｈＩＬ−１５マウスの脾臓（ＳＰＬ）、末梢血（ＰＢ）、肝臓（Ｌｉｖｅｒ）、肺（Ｌｕｎｇ）のいずれにおいても、ヒトＣＤ５６^＋ＣＤ１６^＋ＮＫ細胞の局在が認められたが、骨髄（ＢＭ）では局在が認められなかった。この結果は、ヒト組織における成熟ＮＫ細胞は、主に血液・脾臓・リンパ節・扁桃腺・肝臓・肺等に局在するが、骨髄では成熟ＮＫ細胞はほとんど存在しないという結果と一致した。しかし、前記幹細胞移植ｈＩＬ−１５マウス及び幹細胞移植ｈＩＬ−２マウスにおいては、骨髄において、ヒトＮＫ細胞の局在が認められたという結果とは相違した。また、ＮＫ細胞マーカーの１種である、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を誘導するnatural cytotoxicity receptor（ＮＣＲ）ファミリーの一員として知られているｈＮＫｐ４６^＋の分画で強く発現していることも確認された。

［実施例１６］
（ヒトＮＫ細胞の特異的な細胞表面分子の発現解析）
末梢血移植ｈＩＬ−１５マウスについて、移植後８週経過時に脾臓から単離されたヒトＮＫ細胞は、ヒト組織における成熟ＮＫ細胞と同じ特異的な細胞表面分子が発現しているか否かを解析した。ヒト組織における成熟ＮＫ細胞の特異的な細胞表面分子として知られている、ｈＮＫＧ２Ａ、ｈＮＫＧ２Ｃ、ｈＮＫＧ２Ｄ、ｈＣＤ９４、ｈＮＫｐ３０、ｈＮＫｐ４６、ｈＮＫｐ４４、ｈＮＫｐ８０、ｈＣＤ５７、ｈＣＤ１５８ａ／ｈ（Killer Immunoglobulin-like Receptor:ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｂ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｄ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｅ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｆ（ＫＩＲ）の各抗原に対する各特異的な抗体で染色した後フローサイトメトリーで測定することにより、ヒトＮＫ細胞特異的な細胞表面分子発現解析を行った。マウス結果を図１４に示す。各細胞表面分子の陰性対象として、Isotype Abで染色したパターンも示す。

（結果）
図１４から明らかなとおり、ヒト組織における成熟ＮＫ細胞の特異的な細胞表面分子として知られている、ｈＮＫＧ２Ａ、ｈＮＫＧ２Ｃ、ｈＮＫＧ２Ｄ、ｈＣＤ９４、ｈＮＫｐ３０、ｈＮＫｐ４６、ｈＮＫｐ４４、ｈＮＫｐ８０、ｈＣＤ５７、ｈＣＤ１５８ａ／ｈ（Killer Immunoglobulin-like Receptor:ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｂ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｄ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｅ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｆ（ＫＩＲ）の各抗原の発現が確認された。また、末梢血移植ｈＩＬ−１５マウスにおいて増殖したヒトＮＫ細胞は、ヒト生体内で分化した成熟ＮＫ細胞の結果（データ示さず）とほぼ同一のＮＫ細胞の表面分子発現パターンを有することが確認された。

［実施例１７］
（ヒト末梢血由来ＮＫ細胞の細胞傷害顆粒分泌能の検証）
末梢血移植ｈＩＬ−１５マウスの脾臓から単離されたヒトＮＫ細胞が、ヒト生体内で分化した成熟ＮＫ細胞と同様に細胞傷害顆粒の分泌能／サイトカイン産生能を有する否かを検証した。上記移植８週経過時に末梢血移植ｈＩＬ−１５マウスより脾臓を採取して細胞調製し、ヒトＣＤ５６^＋ＮＫ細胞を単離し、ブレフェルディンＡ存在下及びヒトＩＬ−２もしくはＩＬ−１５サイトカイン存在下で２０時間培養した後に蛍光標識抗体ＦＩＴＣ−抗ｈＧｒａｎｚｙｍｅＡ抗体、ＦＩＴＣ−抗Ｐｅｒｆｏｒｉｎ抗体（Biolegend社製）で細胞内染色をして、フローサイトメトリーで測定した。結果を図１５（ａ）に示す。また、ヒト上記単離したヒトＣＤ５６^＋ＮＫ細胞をＰＭＡ／ｉｏｎｏｍｙｃｉｎｅ存在下で培養した後、蛍光標識抗体ＰＥ−抗ｈＩＦＮｇ抗体（Biolegend社製）を用いて細胞内染色を行い、フローサイトメトリーで測定した。結果を図１５（ｂ）に示す。

（結果）
図１５（ａ）から明らかなとおり、ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウス由来のヒトＣＤ５６^＋ＮＫ細胞においても、ヒト生体内で分化した成熟ＮＫ細胞の結果（データ示さず）と同等の細胞傷害顆粒（ＧｒａｎｚｙｍｅＡ）の発現が確認された。しかし、Ｐｅｒｆｏｒｉｎは各種サイトカインで刺激してもほとんど検出できなかった。また、図１５（ｂ）から明らかなとおり、ＰＭＡ／ｉｏｎｏｍｙｃｉｎｅ刺激により、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の産生が認められた。この結果は、ｈＩＬ−１５マウスで増殖したヒトＮＫ細胞は、刺激因子に対する反応性（サイトカイン産生能）を保持していることを示していた。

（腫瘍生育インビトロ抑制実験）
末梢血移植ｈＩＬ−１５マウスから単離されたヒトＮＫ細胞が、標的細胞にたいして細胞傷害能を示すか検証した。ヒトＮＫ細胞移植後８週経過時に末梢血移植ｈＩＬ−１５マウスより脾臓を採取して細胞調製し、ｈＣＤ５６^＋細胞を単離し、ヒトＩＬ−２、ヒトＩＬ−１５、ヒトＩＬ−２とヒトＩＬ−１５との混合組成物の、各サイトカイン存在下で２日間培養した後に、標的腫瘍細胞（ヒトＮＫ高感受性腫瘍細胞株Ｋ５６２）と４時間共培養し、培養上清を用いて細胞傷害活性（cytotoxicity(%)）を測定した。測定の方法は、得られた培養上清とＣｙｔｏＴｏｘ９６Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙＡｓｓａｙ（Promega社製）を用い、培養上清中に遊離した死細胞由来細胞質性酵素ＬＤＨと反応基質との共益酵素反応による呈色度によって評価した。結果を図１６に示す。

（結果）
図１６から明らかなとおり、ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウス内で分化したヒトＮＫ細胞は、ｈＩＬ−１５存在下で培養した場合に一番強い細胞傷害活性を示した。かかる結果により、末梢血移植ｈＩＬ−１５マウス内で分化したヒトＮＫ細胞が、ヒト生体内で分化した成熟ＮＫ細胞と同様に、ヒト腫瘍の生育をインビトロで抑制できることが確認された。

（腫瘍生育インビボ抑制実験）
末梢血移植ｈＩＬ−１５マウスが、ヒト腫瘍に対する細胞傷害活性を観察することが可能かを検討した。成体ＮＯＧ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスに、２．５ＧｙのＸ線を照射し、骨髄抑制を行った。照射後１日以内にヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来ＮＫ細胞を２×１０^６個ｉｖ移植して（ｈｕ−ＰＢ−ＮＫｈＩＬ−１５Ｔｇを作製した。陰性コントロールとしては、ＮＫ細胞未移植（ｈＩＬ−１５−Ｔｇ）マウスを用いた。ヒトＰＢＭＣ）由来ＮＫ細胞移植後４週経過時に２．５×１０^５個のＮＫ感受性ヒト腫瘍細胞株Ｋ５６２を皮下移植し、継時的に腫瘍径を測定した。結果を図１７に示す。

（結果）
図１７から明らかなとおり、皮下移植後２１日目には、ヒトＮＫ細胞移植マウスにおける腫瘍のサイズは５００〜９５０ｍｍ^３程度であり、ＮＫ細胞未移植（ｈＩＬ−１５−Ｔｇ）マウスにおける腫瘍のサイズは４９５〜１７３０ｍｍ^３程度であり、ヒトＮＫ細胞移植マウスにおける腫瘍のサイズは、ＮＫ細胞未移植（ｈＩＬ−１５−Ｔｇ）マウスにおける腫瘍のサイズの約３分の２であった。ヒトＮＫ細胞移植群で腫瘍抑制効果が認められた（ｄ７−２１；ｐ＜０．０５）。かかる結果により、末梢血移植ｈＩＬ−１５マウスは、ヒト腫瘍の生育をインビボで抑制することが確認された。

本発明のマウスは、ヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞を移植後にヒトＮＫ細胞の機能を長期に検討できるヒト化免疫不全マウスとして、医学分野において非常に有用である。

Claims

ヒトＩＬ−１５を分泌することができ、かつ、ヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞を移植後に、ｈＣＤ５６^＋細胞がインビボで長期に検出されることを特徴とする、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡがゲノムＤＮＡに挿入されている免疫不全マウス。
ｈＣＤ５６^＋細胞がさらにｈＣＤ１６が陽性を示すｈＣＤ５６^＋ｈＣＤ１６^＋細胞であることを特徴とする請求項１記載の免疫不全マウス。
ｈＣＤ５６^＋細胞が、脾臓、肝臓及び／又は肺において検出されるが、骨髄において検出されない細胞であることを特徴とする請求項１又は２記載の免疫不全マウス。
ｈＣＤ５６^＋細胞が、細胞表面分子として、ｈＮＫＧ２Ａ、ｈＮＫＧ２Ｃ、ｈＮＫＧ２Ｄ、ｈＣＤ９４、ｈＮＫｐ３０、ｈＮＫｐ４６、ｈＮＫｐ４４、ｈＮＫｐ８０、ｈＣＤ５７、ｈＣＤ１５８ａ／ｈ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｂ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｄ（ＫＩＲ）、ｈＣＤ１５８ｅ（ＫＩＲ）、又はｈＣＤ１５８ｆ（ＫＩＲ）について陽性を示す細胞であることを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の免疫不全マウス。
ヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞を移植後に、サイトカイン存在下で、ヒト腫瘍の生育をインビトロで抑制することができることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の免疫不全マウス。
サイトカインが、ｈＩＬ−１５であることを特徴とする請求項５記載の免疫不全マウス。
ヒト末梢血由来のヒトＮＫ細胞を移植後に、ヒト腫瘍の生育をインビボで抑制することができることを特徴とする請求項１〜６いずれか記載の免疫不全マウス。
以下の（１）〜（７）の工程を順次含む上記ＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスの作製方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡをマウスゲノムＤＮＡに挿入するために必要な領域を含むベクターに、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡを導入することにより、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡを有するマウス受精卵注入ＤＮＡ調製用ベクターを作製する工程；
（１−１）必要に応じて、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡがマウスゲノムＤＮＡに挿入されるために必要な領域とを含む受精卵注入用ＤＮＡ断片を調製する工程；
（２）上記工程（１）において作製されたベクター及び／又は上記（１−１）で調製されたベクター断片をインターロイキン２受容体γ鎖遺伝子（ＩＬ−２Ｒγ）ノックアウトマウスの受精卵に注入することにより注入受精卵を作製する工程；
（３）上記工程（２）において作製された注入受精卵を培養することにより、新生子マウスを作製する工程；
（４）上記工程（３）において作製されたマウスにおいて、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡがＮＯＤ−ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌマウスのゲノムＤＮＡに挿入されたか否かを判定する工程；
（５）上記工程（４）において配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡがＮＯＤ−ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌマウスのゲノムＤＮＡに挿入されたと判定されたマウスが、ｈＩＬ−１５を分泌しているか否かを判定し、ｈＩＬ−１５を分泌しているマウスをＮＯＤ−ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスとして選抜する工程；
（６）上記ＮＯＤ−ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスと、ＮＯＧマウスとを交配して、ｓｃｉｄ変異が導入されたＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスを作製する工程；
（７）ＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５Ｔｇマウスと、ＮＯＧマウスとを交配してＮＯＤ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ｒγ^ｎｕｌｌ−ｈＩＬ−１５ＴｇマウスとＮＯＧマウスとを１：１で作製する工程；