JP2016147870A - 抗hsv抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
・本発明のマウスモノクローナル抗体の効力は既に証明されている(Eis-Hubinger et al., 1991; Eis-Hubinger et al., 1993を参照のこと)。さらに、本発明者らは、本発明のヒト化抗体がまた、インビトロでのHSV1およびHSV2ウイルス感染を中和でき、「細胞間伝播」機構を阻害することによりウイルス伝播を阻害できることを実施例の項において示す。ヒトでの感染進行との関連で、ヒト免疫系は、HSV 1/2に典型的な細胞間伝播を効率的に予防するための抗体特異性を生み出すことができない。
・アシクロビルおよびホスカネットなどの保守的な化学療法剤の頻繁かつ長期にわたる予防的および治療的適用は、耐性ウイルス株の形成の増加をもたらす。この耐性の問題は、単独でまたはアシクロビルおよび/もしくはホスカネットなどのウイルス抑制剤との組み合わせで投与される、本明細書に記述の(ヒト化)抗HSV抗体によって克服することができる。これは、この抗体が異なる作用機序に依るからである。
・本明細書において記述される抗体はHSV gBタンパク質のエピトープに特異的に結合する。本発明の抗体に対するHSV耐性の出現は、gB-タンパク質中の変異がウイルス感染価の喪失をもたらすので、予想されるものではない。
・従来のウイルス抑制剤の全身投与が禁忌とされる患者は、本明細書において記述される(ヒト化)抗体から特に利益を得る。
SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、およびSEQ ID NO: 6に示される相補性決定領域を含む、抗体。
[本発明1002]
本発明1001の抗体と同じエピトープを認識する抗体。
[本発明1003]
感染細胞から、隣接する第2の非感染細胞へのHSVの伝播(細胞間伝播)を阻害することができる、本発明1001または1002のいずれかの抗体。
[本発明1004]
最大でも40 nM、好ましくは最大でも30 nM、より好ましくは最大でも20 nM、さらにより好ましくは最大でも15 nM、最大でも13 nM、最大でも10 nM、および最も好ましくは最大でも7 nMの解離定数KDを有する、本発明1001〜1003のいずれかの抗体。
[本発明1005]
最大でも20 nM、好ましくは最大でも16 nM、より好ましくは最大でも12 nM、最大でも10 nM、最大でも8 nM、最大でも6 nM、および最も好ましくは最大でも4 nMの濃度で100 TCID50のHSVの規定量を中和することができる、本発明1001〜1004のいずれかの抗体。
[本発明1006]
SEQ ID NO: 9の1〜30位、38〜51位、68〜99位、および112〜122位、ならびにSEQ ID NO: 10の1〜23位、40〜54位、62〜93位、および103〜113位に示されるアミノ酸残基に対して少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1005のいずれかの抗体。
[本発明1007]
SEQ ID NO: 7の1〜30位、38〜51位、68〜99位、および112〜122位、ならびにSEQ ID NO: 8の1〜23位、41〜55位、63〜94位、および104〜114位に示されるアミノ酸残基対して少なくとも80%、好ましくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1006のいずれかの抗体。
[本発明1008]
二価抗体または多価抗体である、本発明1001〜1007のいずれかの抗体。
[本発明1009]
エフェクター部分、治療部分、または検出可能な標識とコンジュゲートしている、本発明1001〜1008のいずれかの抗体。
[本発明1010]
本発明1001〜1009のいずれかの抗体の有効量と、少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
[本発明1011]
本発明1001〜1008のいずれかの抗体をコードする核酸配列を含む、発現ベクター。
[本発明1012]
本発明1001〜1008のいずれかの抗体をコードするヌクレオチド配列を含む、宿主細胞。
[本発明1013]
本発明1001〜1008のいずれかの抗体を産生することができる、ハイブリドーマ細胞。
[本発明1014]
薬物としての使用のための本発明1001〜1009のいずれかの抗体。
[本発明1015]
対象におけるHSV関連疾患の予防的または治療的処置のための方法における使用のための本発明1001〜1009のいずれかの抗体。
[本発明1016]
HSV関連疾患が以下の特徴の1つまたは複数を伴う、本発明1015の使用のための抗体:
(a) 口辺再発の存在、
(b) 生殖器再発の存在、
(c) ヘルペス性湿疹、
(d) 新生児ヘルペス、
(e) 免疫不全、免疫減弱状態の患者、
(f) ウイルス抑制剤に対する耐性、
(g) 脳炎、
(h) 髄膜炎、
(i) 髄膜脳炎、
(J) 眼感染症、および/または
(k) 汎発性HSV感染症。
独立請求項に記載の本発明のさまざまな局面および従属請求項に含まれる好ましい態様は、参照により本明細書に組み入れられる。
1型および2型単純ヘルペスウイルス(HSV1、HSV2)の糖タンパク質B (gB)に対する特異性を有するマウスモノクローナル抗体(mAb) 2cの調製
抗HSV特異的なmAbの作出のため、BALB/cマウスをUV不活化HSV1-株342 hvで免疫した。その後、マウス脾細胞を骨髄腫細胞株X63-Ag8.653との体細胞融合によって不死化し、抗HSV特異的なmAb 2c (IgG2a)を分泌するハイブリドーマ細胞株を、酵素免疫アッセイ法、免疫蛍光アッセイ法およびHSV中和アッセイ法を用いて単細胞クローンの上清をスクリーニングすることによって単離した。結合試験によって、mAb 2cがHSV1およびHSV2の糖タンパク質gBの共用の、不連続なエピトープを認識することが明らかになった。糖タンパク質Bは約904アミノ酸長であり、ウイルス膜中におよびHSV 1/2感染細胞の膜中に三量体として挿入される。mAb 2cが細胞外ウイルス粒子の伝播を中和するだけでなく、HSVに特徴的な、最初に感染した細胞から、隣接した非感染細胞への感染(細胞間伝播)の直接経路を効率的に阻害もすることは特に関係がある。後者の過程は、通常、ヒトにおいて天然のHSV特異的抗体のレパートリーによって阻害されることはない。
mAb 2cのキメラ化およびヒト化
マウスモノクローナル抗体2cを治療剤として利用するために、親抗体の特異性を完全に保持しながらも、ヒトへの投与中のその免疫原性を低減または排除することを目的として遺伝子操作の方法を用いて抗体を修飾した。したがって、mAb 2cと同じ特異性を有するキメラおよびヒト化モノクローナル抗体を作出した(図3)。
HSV感染Vero細胞を用いて、親mAb 2cおよび2c抗体断片の場合に記述したようにフローサイトメトリーによって同様に、親和性定数(KD)を決定した(実施例1参照)。この結果を図5に示す。
全長gB (31〜904)または720、630、503、487および470の位置でC末端の切断を伴うgB変異体のどちらかをコードする発現プラスミドでトランスフェクトされたCOS-1細胞を用いた結合試験により、マウス親mAb 2cによって認識されるエピトープがgBの最初の487アミノ酸のなかに位置付けられた。連続ペプチドの間に12 aaの重複を有する、固相に結合された15アミノ酸(aa)長の合成ペプチドを用いたさらなる研究によって、mAb 2cが立体構造エピトープに位置することが示された。mAb 2cはaa 175〜195の糖タンパク質B配列(領域A)に相当する3つの連続ペプチドに結合する。さらに、mAb 2cは、アミノ酸298〜312に相当するペプチド(298SPFYGYREGSHTEHT312) (SEQ ID NO: 17)に強力に結合し、アミノ酸301〜315に相当する後続のペプチドに中程度に結合する(図13Aおよび図22)。未変性または変性SDS-PAGE条件の下で分離された組換えgB (gB(730)t、Florent Bender, University of Pensylvania, Philadelphia, USAから親切にも提供していただいた)を用いたウエスタンブロットに関するその反応性によるmAb 2cの特徴付けからは、変性に対して部分的に耐性であるか、またはウエスタンブロット条件の間に再編成され、それゆえ、「偽連続」エピトープと呼ばれる(Bender, F et al. J. Virol. 2007, 81 p3872-3841を参照のこと)不連続なエピトープを、mAb 2cが認識することが確認される(図13B)。
(a) シグナル配列を含む成熟糖タンパク質Bによる付番(図13A)
(1) Kousoulas et al., 1984
(2) Pellett et la., 1985
(3) Kousoulas et al., 1988
(4) Highlander et al., 1989
抗体親和性の判定
Vero細胞の単層に80〜90%の集密でMOI 3のHSV-1またはHSV-2を感染させ、これを翌日、トリプシン処理により、その後、PBS中での洗浄により収集した。2c抗体の細胞表面結合測定は既報(1)のように行った。手短に言えば、精製されたmAb 2cまたはmAb 2c由来抗体断片2c-F(ab')2、2c-Fabおよび2c-scFvを室温で1時間、FACS緩衝液(PBS、2% FBS、0.1%アジ化ナトリウム) 100μl中5×105個のVero細胞とともに、0.03 nM〜500 nMの濃度にて三つ組でインキュベートした。細胞をFACS緩衝液200μlで2回洗浄し、結合したmAb 2c、2c-F(ab')2、および2c-Fabの検出のためFITC標識Fab特異的ヤギ抗マウスIgG, (15μg/ml, Jackson ImmunoResearch, Newmarket, Suffolk, England)とともにインキュベートした。結合したscFvは飽和濃度の抗c-myc mAb 9E10 (10μg/ml; Roche, Indianapolis, IN, USA)と最初にインキュベートし、その後、2回の洗浄およびFcγ特異的FITC標識ヤギ抗マウスIgG (15μg/ml; Jackson ImmunoResearch)とのインキュベーションを行うことによって検出された。細胞を2回洗浄し、FACS緩衝液中に再懸濁した。蛍光をFACScalibur (BD Bioscience, San Jose, CA, USA)にて測定し、CellQuest(商標)ソフトウェア(BD Biosciences)を用いて平均蛍光強度(MFI)を計算した。バックグラウンドの蛍光を差し引き、GraphPad Prism 4.0版(GraphPad Software, La Jolla, CA)で非線形回帰のためのMarquardtおよびLevenbergの方法を用いることにより平衡結合定数を決定した。
Roselyn J. EisenbergおよびGary H. Cohen (University of Pennsylvania, Philadelphia, USA)から親切にも提供していただいた、未変性または変性切断型糖タンパク質B、つまりgB(730)t (4)とのmAb 2cの免疫反応性は、本質的には既報(4)のように行った: 精製gB(730)t (0,75μg)を非還元(0.2% SDSを含有するサンプル用緩衝液)条件または変性(2% SDSおよび155 mM β-メルカプトエタノールを含有するサンプル用緩衝液、95℃で2分)条件のどちらかの下で8% SDS-PAGEにて分離し、ニトロセルロース膜上に転写した。膜ストリップをTNT緩衝液(0.1 M Tris.HCl, pH 7.5, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20)中2%のミルクで1時間ブロッキングし、その後、2%ミルク/TNT緩衝液中5μg/mlの糖タンパク質B特異的抗体mAb 2c、H126 (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA)およびH1817 (Novus)との室温で2時間のインキュベーションを行った。結合した抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートポリクローナルヤギ抗マウス抗体(1:20,000 QED Bioscience Inc. San Diego, CA, USA)および化学発光(Thermo Scientific,)で、LAS 3000 Luminescent Image Analyzer (Fujifilm, Tokyo, Japan)を用いて検出した。
セルロースに結合された重複する13 merのペプチドおよびデュオトープは既報(20, 34)のように標準的なSPOT合成プロトコルにしたがって自動的に調製された(JPT Peptide Technologies, Berlin, Germany)。さらに、反応性タグおよびリンカーとカップリングされたペプチドを3つの同一のサブアレイ中の修飾ガラス表面上に化学選択的に固定化し、切断されアセチル化された配列の除去、その後の洗浄段階によって精製した。ペプチドマイクロアレイを、TBS含有ブロッキング用緩衝液(Pierce International)で2時間ブロッキングし、ブロッキング用緩衝液中10μg/mlのmAb 2cとともに2時間インキュベートした。ペプチドマイクロアレイを、0.1% Tweenを含有するTBS緩衝液(T-TBS)で洗浄し、ペプチド膜上のペプチドに結合した抗体をPVDF膜上に転写した。ペルオキシダーゼ標識された抗マウスIgG (Sigma)または蛍光標識された抗マウスIgG (Pierce)をブロッキング用緩衝液中1μg/mlの終濃度で二次抗体として用いた。2時間のインキュベーションおよびT-TBSによる最終の洗浄の後、化学発光基質(Roche Diagnostics)を用いてPVDF膜を分析した。スライドガラスペプチドマイクロアレイをT-TBSおよび3 mM SSC緩衝液(JPT Peptide Technologies)で徹底的に洗浄し、窒素下で乾燥し、高分解能蛍光スキャナ(Axon GenePix 4200 AL)を用いてスキャンした。蛍光シグナル強度(発光量, LU)を、スポット認識ソフトウェア(GenePix 6.0)を用いて分析し、二次抗マウスIgGとの対照のインキュベーションからのバックグラウンドの強度に対して補正した。
抗体の中和活性を既報(16)のように終点希釈アッセイ法によって決定した。手短に言えば、抗体の連続希釈液を細胞培地中37℃で1時間100 TCID50のHSV-1またはHSV-2とともにインキュベートした。抗体ウイルス接種材料を、マイクロタイタープレート中で増殖させたVero細胞単層に適用し、37℃で72時間のインキュベーション後に細胞変性効果(CPE)をスコア化した。ウイルス誘導性CPEを100%低減するのに必要な抗体濃度を完全中和価として決定した。さらに、一価2c-Fab断片のウイルス中和能を架橋抗体の存在下で、過剰の抗マウスFab IgG (2600 nM, Jackson ImmunoResearch, Newmarket, Suffolk, England)をプレインキュベーション段階に加えることによって調べた。対照の目的で、抗体なしのウイルスおよび抗体のみを用いて、それぞれ、最大CPEまたはCPEなしを誘導した。ウイルス中和アッセイ法を少なくとも2回繰り返し、同じ結果となった。
予冷されたVero細胞単層(15分間4℃)に1時間4℃で100 TCID50 HSV-1 Fを感染させてウイルス吸収を可能とした後に、mAb 2cまたはヒト血漿由来の多価IgG調製物(Intratect(登録商標), Biotest AG, Dreieich, Germany)のどちらかの連続希釈液を添加した(付着後中和)。同一の実験条件下でのmAb 2cの付着前 vs 付着後中和効率を比較するため、予冷されたVero細胞単層に添加する前に、100 TCID50 HSV-1 Fを同じ抗体希釈液とともに4℃で1時間インキュベートした。両アッセイ由来の接種済みVero細胞を37℃に移す前に、4℃でさらに1時間インキュベートした。上記の標準的な中和アッセイ法に記述されているように、72時間後に中和価を決定した。
集密までカバーガラス上で増殖されたVero細胞に37℃で4時間500μl中400 TCID50/ウェルでHSV-1 Fを接種した。ウイルス接種材料を吸引し、Vero細胞をPBSで2回洗浄し、2% FBSを含む増殖培地1 ml中、過剰の中和抗体の存在下または非存在下において37℃で48時間さらに培養した。高力価の抗HSV-1免疫グロブリンを有する免疫ドナーに由来するプール済みヒト血清を1:20の希釈で対照として用い、二価抗体mAb 2cおよび2c-F(ab')2の濃度は500 nMとし、一価2c-Fabの濃度は3000 nMとした。48時間後、培地を除去し、Vero細胞単層をHEPES緩衝生理食塩水で2回洗浄し、室温で15分間PBS中4%のパラホルムアルデヒドで固定した。ウイルス伝播を可視化するため、細胞をPBSで2回すすぎ、0.05% Tween 20を含むHEPES緩衝生理食塩水500μl中で15分間インキュベートし、FITCコンジュゲートポリクローナルヤギ抗HSV血清(1:100, BETHYL, Montgomery, TX, USA)で染色した。PBSによって3回洗浄した染色細胞を、0.2 g/ml Mowiol 4-88 (Calbiochem, San Diego, CA, USA)を含有するマウンティング培地中でマウントした。蛍光像をLeica DM IRE2共焦点顕微鏡により40倍の倍率で捕捉した。細胞間伝播の阻害を吸収後ウイルス中和アッセイ法によってさらに試験した。6ウェルプレート中で集密まで増殖されたVero細胞を、2% FBSおよび抗生物質を含有するDMEM 3 ml中、200 TCID50のHSV-1 Fとともに37℃で4時間インキュベートした。細胞単層をPBSで2回洗浄し、過剰の中和抗体またはポリクローナルヒトHSV-1中和血清を含有する温かいプラーク形成用培地(DMEM, 5% (w/v)アガロース, 10% FBS, 抗生物質)で重層した。37℃で48時間のインキュベーション後、光学顕微鏡検査によってプラーク形成を分析した。
リアルタイム(RT) PCRを行ってHSV-1およびHSV-2ゲノムを定量化した。自動核酸抽出システムMagNA Pure LC System (Roche)を製造元の指示にしたがって用い、等量のHSV-1およびHSV-2感染粒子を含有するサンプルからDNAを精製した。ウイルスDNAを次いで、Real Art HSV-1 / HSV-2定量キット(Qiagen)を用いRT-PCR (Lightcycler, Roche)を行って定量した。
麻酔した6〜8週齢の、雌性非肥満糖尿病/重症複合免疫不全(NOD-SCID)マウス(NOD.CB17-Prkdcscid/J, Charles River Laboratories, Research Models and Services, Sulzfeld, Germany)を1×106 TCID50 HSV-1 F/マウスの接種材料20μlで膣内から攻撃した。皮膚接着剤(Epiglu, Meyer-Haake Medical Innovations, Wehrheim, Germany)を外陰部に適当して、ウイルス接種材料の流出(dircharge)を抑止した。送達された接種材料は膣洗浄液の培養によって評価した場合に94%超(>94%)の感染率を誘導した。マウスをウイルス接種後毎日、体重減少、外陰炎/膣炎(発赤、粘液膿性排出物および炎症の兆候)ならびに神経疾患について調べた。これらの症状のいずれかを呈するマウスをすぐに殺処理した。免疫予防の場合にはウイルス接種の24時間前に、または治療的処置の場合にはウイルス感染から24時間、40時間および56時間後に、精製mAb 2cの静脈内(i.v.)注射によってマウスを受動的に免疫した。Vero細胞に対する終点希釈アッセイ法を用いて感染後1、2、4、6および8日目に、ならびに死亡時に得られた膣洗浄液からのウイルス力価の判定により感染についてマウスを評価した。殺処理したマウスの臓器(脾臓、副腎、肺、心臓、肝臓、腎臓、脊髄および脳)中のウイルス量を、他で既報(41)のようにVero細胞単層に対する力価測定によって臓器のホモジナイゼーション後に判定した。各試験および対照群には、検出可能なHSV-1感染を伴う動物9〜10匹を含めた。
mAb 2cによって認識されるgBエピトープのマッピングおよび分析
最近になって決定された1型HSV (HSV-1)由来gB細胞外ドメイン結晶構造から、5つの異なる構造ドメイン: ドメインI (基部)、ドメインII (中央部)、ドメインIII (コア部)、ドメインIV (冠部)およびドメインV (腕部)を有する多ドメイン三量体が明らかになった(24)。mAb 2cの中和エピトープを特徴付けるために、本発明者らは、還元条件下または非還元条件下のどちらかのウエスタンブロット分析において組換えgB(730t)(4)とのその反応性について試験した。対照として、本発明者らは、線状エピトープを認識するmAb H1817 (4)および不連続なエピトープを認識するmAb H126 (33)を用いた。線状エピトープに典型的な染色パターンがmAb H1817によるウエスタンブロット分析において得られ、非還元条件下でのgBの単量体型および三量体型の検出ならびに還元条件下でのgB単量体の唯一の主たる染色が示された(図13B)。予想通り、mAb H126は未変性条件下でのみgBと反応した。驚いたことに、170 kDa超(>170 kDa)の、唯一の、上方のgBタンパク質のバンドの認識から、mAb H126が三量体特異的であることが示唆される(図13B)。しかしながら、mAb 2cは未変性および変性gBと反応し、変性条件下での反応性はmAb H1817と比べてはるかに弱かった(図13B)。変性条件下でのgB単量体との弱い反応性は、変性に対して耐性であるか、またはSDS-PAGE電気泳動の間に再び折り畳まれるように見え、それゆえ「偽連続」エピトープと呼ばれる、不連続なエピトープに結合する一連の他の中和抗体についてこれまでに報告されている(4)。
ウイルス侵入におけるgBの機能に不可欠なgB上の領域を特定するために幾人の研究者らによってモノクローナル抗体が用いられている(4, 25, 39, 52)。ドメインVのC末端の残基および近接プロモーターのドメインIの残基を含むgB三量体の基部の特異な機能領域にマッピングされている、中和抗体がgBの融合活性を妨害することが示唆されている(4)。本発明者らはそれゆえ、ドメインVのC末端に近いドメインI内のmAb 2cエピトープに結合する一価抗体がgBの活性化による協同的な立体構造変化を十分に遮断するはずであると仮定した。mAb 2cはインビトロにおいて補体なしでHSV-1を中和する(16)ので、本発明者らは、mAb 2cが媒介する仮説的機構を研究するのに有益なツールとして従来のF(ab')2およびFab断片ならびに組換え一本鎖可変断片(scFv)を作出した。作出した抗体調製物の均一性をサイズ排除クロマトグラフィーによってモニタリングした(データ不掲載)。それぞれ、HSV-1もしくはHSV-2で感染された、または感染されなかったVero細胞を用いたフローサイトメトリー分析から、mAb 2cおよびmAb 2c由来抗体断片の特異的な結合が実証された(データ不掲載)。本発明者らはさらに蛍光サイトメトリーを用いて、HSV-1およびHSV-2感染Vero細胞に対する抗体の平衡結合曲線を決定した(図17)。これらの研究の結果から、それぞれ、FabおよびscFvに対するよりも全IgGおよびF(ab')2断片に対するいっそう高い見掛け上の親和性が実証された(表6)。決定された一価抗体親和性に対する二価抗体の機能的親和性(親和力)の増加から、二価抗体が細胞表面上の2つのgBエピトープに同時に結合できたことが示唆される。二価mAb 2cおよび2c-F(ab')2は、その一価対応物と比べて1.7〜2.8倍高い見掛け上の親和性を示した。IgGに比べてF(ab')2断片の見掛け上のKDのわずかな増加は、F(ab')2構築物内の抗原結合部位のいっそう高い可動性によるものでありうる。両方のHSV-1およびHSV-2感染Vero細胞に対するmAb 2c、2c-F(ab')2および2c-Fabの同様の見掛け上の親和性から、認識されるgBエピトープが両方のウイルス間で構造的に違わないことが確認された(表6)。
aHSV感染細胞上のgBとの結合に対するKD値は、フローサイトメトリーによって決定された平衡結合曲線からのデータ(図17)をMarquardt-Levenberg式に適合させることによって決定された。
HSV-1ウイルス粒子がVero細胞と相互作用する前(付着前)または後(付着後)に抗体が加えられるかどうかにかかわりなくmAb 2cの等しい中和効力(図18A)から、mAb 2cが標的細胞とのウイルスの結合を妨害しないことが示唆された。対照的に、ポリクローナルヒトγグロブリンIntratect(登録商標)は、標的細胞へのウイルス粒子の付着の阻害によって明らかに中和をしていた(図18B)。mAb 2c由来断片F(ab')2、FabおよびscFvの中和活性を、Vero細胞に対する標準的な中和アッセイ法においてその親IgG対応物と比較した。親mAb 2cは8 nMの濃度でHSV-1誘導性の細胞変性効果(CPE)を100%低減した。興味深いことに、HSV-2誘導性のCPEを完全に低減するには、4倍高いmAb 2c濃度が必要とされた(図19A)。二価2c-F(ab')2はHSV-1およびHSV-2誘導性のCPEの両方を親mAb 2cよりも2倍効率的に低減した。驚いたことに、本発明者らは、HSV-1およびHSV-2を中和するための一価2c抗体断片の能力の基本的相違を認めた。親mAb 2cと比べて、HSV-1およびHSV-2誘導性のCPEを100%低減するには、それぞれ、およそ375倍および94倍高い濃度の2c-Fabが必要であった(図19A)。組換え2c-scFvは光学顕微鏡の下でプラーク低減効果を示したが、3,000 nMの最も高い試験濃度でさえもHSV誘導性のCPEを100%低減することはできなかった(データ不掲載)。
2c-Fab断片は遊離ウイルス粒子を効率的に中和しなかったが、それでも、小さなサイズの抗体断片はより好ましい拡散特性を有することが報告されており(66)、本発明者らは、HSV-1が細胞間結合を、感染細胞から非感染細胞へと横断することを抑止するその活性について調べた。両方の二価抗体mAb 2cおよび2c-F(ab')2は、Vero細胞単層中で伝播されたHSV-1を完全に抑制し、間接的な免疫蛍光によってただ1つの感染細胞を可視化できただけであった(図9)。遊離ウイルス粒子を中和するポリクローナルヒト血清の能力にもかかわらず、それはウイルスの細胞間伝播を阻害することが全くできなかった。これは、多数のHSVエピトープに対して作製された中和抗体の不均一集団の結果である可能性が最も高い。ポリクローナルヒト免疫血清と比べて、一価2c-Fab断片は細胞間伝播をある程度制御することができた。しかしながら、一価2c-Fab断片は、その二価対応物とは対照的に、6倍高い濃度で試験してさえもウイルス伝播を完全に排除することができなかった(図9)。ゆえに、抗体価は隣接細胞の間でのHSV-1の伝播の阻害においても鍵となる役割を果たした。
本発明者らは、CD4+およびCD8+ T細胞の両方が枯渇したマウスが、膣内HSV-1感染の後にmAb 2cの受動移入によって致死性脳炎から完全に保護されることを以前に示した(17)。ヒトにおいてHSV-2感染の部位に蓄積するナチュラルキラー(NK)細胞(28)はインターフェロン-γの初期供給源であり(45)、インターフェロン-γはHSV感染の制御に不可欠な役割を果たす(2, 45, 62)。つい最近、初めて、ヒトNK細胞が先天性免疫応答としてヒト化マウスで初感染性器HSV感染に対する保護を媒介することが実証された(37)。mAb 2cが抗体媒介性の免疫反応とは独立して抗ウイルス活性を付与するかどうか調べるために、本発明者らは、SCID T細胞欠乏およびB細胞欠乏に加えて、NK細胞およびマクロファージの機能ならびに補体経路を刺激する能力を欠くNOD/SCIDマウスモデルを利用した。NOD/SCIDマウスの膣内HSV-1感染(1×106 TCID50)は、急速進行性の全身疾患を引き起こし、9日の生存期間中央値であった。臓器におけるHSV力価を終点希釈アッセイ法によって判定し、脊髄(2.3×106 TCID50)、脳(3.8×105 TCID50)および膣粘膜(1.4×106 TCID50)において高ウイルス力価、腎臓(1.7×104 TCID50)および副腎(1.1×104 TCID50)において中力価ならびに肺(1.1×103 TCID50)および心臓(1.9×102 TCID50)において低力価を示した(データ不掲載)。mAb 2cの治療効率を評価するため、NOD/SCIDマウスを膣内HSV-1攻撃の24時間前に2.5 mg/kg、5 mg/kgまたは15 mg/kgの抗体で静脈内処置した(図20)。低抗体用量を投与されたマウスは、HSV-1による致命的感染から十分には保護されなかった。しかしながら、5 mg/kgのmAb 2cで処置されたマウスの生存期間中央値は、PBSを投与された対照マウスと比べた場合に2.6倍引き延ばされた。致死性脳炎から保護されなかったマウスより調べた臓器におけるHSV-1の力価は未処置対照群に匹敵していた。対照的に、動物の完全保護は15 mg/kgのmAb 2cの用量で達成された。抗体によって保護されたマウスの臓器におけるウイルス力価は、1×102 TCID50の検出限界未満であった。
ウイルスが標的細胞に侵入するために取る段階に続いて、ウイルス中和mAbはいくつかの機構によって侵入を阻害することができる。ウイルス表面タンパク質と細胞のタンパク質、脂質または糖質との特異的な相互作用は、感染の初期段階に相当し、これを中和抗体によって遮断することができる。ウイルス付着を阻害する抗体は、HIV-1 gp120のCD4結合部位と反応するmAb F105およびインフルエンザ血球凝集素(HA)の受容体結合部位を網羅するFab HC19など、ウイルス粒子の受容体結合部位に直接結合するか(6, 19, 54)、またはHA受容体結合部位の近く17Åで結合するFab HC45など、受容体連結を立体的に妨害するか(18)のどちらかである。HSV gDとその細胞受容体の1つとの不可欠な結合に加えて、gBは標的細胞へのウイルス粒子の付着に関与している。最近、HSV gBに対する2つのへパラン硫酸プロテオグリカン非依存的な真の細胞表面受容体および/または付着因子の存在が報告された(5, 23, 60)。対になった免疫グロブリン様2型受容体(PILRα)は少なくともある種の細胞型において、gBの潜在的タンパク質受容体の1つと特徴付けられている(60)。mAb 2cに対し、比較による付着前 vs 付着後中和アッセイ法から、この抗体は細胞表面へのウイルスの結合を阻害できないが、ウイルス侵入を遮断することが示された。gBと、その融合ドメインの鍵となる疎水性および親水性残基を介した脂質膜との相互作用(22, 23)は、融合ループのすぐ近くのエピトープを認識するmAbによって遮断されうることがこれまでに示されている(4, 22)。mAb 2cの立体構造エピトープは融合ループ1と部分的に重複するので、本発明者らは、mAb 2cの結合が融合シグナルの伝達を妨害する可能性が最も高いと推論し、本発明者らはさらに、考えられる作用機序として結合後/融合前の段階で中和を評価した。
ウイルス中和アッセイ法
ウイルスの中和感受性を決定するための過剰量の抗体によるプラーク低減アッセイ法としてまたは抗体溶液の中和価を決定するための終点希釈法として、中和アッセイ法をVero細胞に対してマイクロタイタープレート中で行った。プラーク低減アッセイ法は、20μgのMAb 2cとの250プラーク形成単位のインキュベーションによって行った。2時間後、50μL/ウェルのVero細胞懸濁液(細胞1.5×105個/mL)を添加した。3日後、細胞をクリスタルバイオレットで染色した。終点力価測定のため、希釈した抗体溶液(0.025 mL)を0.025 mL中100 TCID50のHSV-1、および1:10に希釈したモルモット補体0.025 mLとともにインキュベートした。培養物の50%においてウイルス誘導性の細胞変性効果を抑止する最大血清希釈の逆数として力価を表した。
全長HSV-1 gB (gB(1〜904) = pMT2gB)、gB(1〜720)、gB(1〜630)、gB(1〜505)、gB(1〜503)、gB(1〜487)およびgB(1〜470)をコードするプラスミドの構築は他で記述されている[30, 31]。プラスミドはLeonore Pereira, University of California, San Franciscoから親切にも提供していただいた。gB(1〜130)、gB(1〜223)、gB(183〜488)およびgB(436〜642)をコードするプラスミドは、制限酵素部位Bam HIおよびXho Iが隣接するPCR単位複製配列を、真核生物発現ベクターpSVL (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany)の中にクローニングすることによって構築した。gBヌクレオチド52588〜60362を含んだHSV-1株17+ [33; GenBank X14112]のサブゲノムプラスミドクローンをPCRにおける鋳型として用いた。N末端切断型のgB構築物の発現のため、gBシグナル配列をコードするDNAを、5'末端の位置にXhoI部位を含むプライマーを用いたPCRによって増幅し、小断片プラスミドgB(183〜488)およびgB(436〜642)のgBをコードするDNAの5'側に挿入した。挿入断片の正しい組み込みおよびその配列をヌクレオチド配列決定によって確認した。COS-1細胞を、24ウェルプレートの中に配置されたカバーガラス(直径10 mm)上で増殖させ、DEAE-デキストラン法によりプラスミドでトランスフェクトした[34]。gBおよびその切断型誘導体の発現を、よく特徴付けられた抗HSV-1 gBマウスモノクローナル抗体H1396およびH1781の混合物を用いた間接的免疫蛍光顕微鏡検査法により検証した。トランスフェクトされ固定されたCOS-1細胞をMAb 2cと反応させ、免疫蛍光顕微鏡検査法により分析した。
単一のアミノ酸変異を、Altered Sites(商標) in vitro Mutagenesis System (Promega, Mannheim, Germany)を用いてオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によりHSV-1 gBに導入した。手短に言えば、pMT2gB [31]内のgBコード配列を大腸菌(E. coli)ファージミド突然変異誘発ベクターpAlter-1の中に移入した。pALTER-lgBで形質転換された大腸菌JM109細胞にファージR408を感染させることによって、一本鎖pALTER-lgB DNA分子を調製した。以下のようにミスマッチプライマー(変異させた位置に下線を引いた)を用い製造元のプロトコルにしたがって部位特異的突然変異誘発を行った。
細胞とのHSV gB特異的マウスモノクローナル抗体の結合を、DTAFコンジュゲートヤギ抗マウスIgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Dianova, Hamburg, Germany)を用いて検出した。ウサギ抗HSV-1 IgGの結合の検出のため、TexasRedまたはCy3コンジュゲートヤギ抗ウサギIgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Dianova)を用いた。ヒト抗体の検出のため、DTAFコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Dianova)を用いた。
全てのペプチドは既報[37, 38]のようにWhatman 50セルロース膜上での半自動SPOT(商標)合成により作出した。合成後、ブロッキング用試薬(1X, Cambridge Research Biochemicals, Northwich, UK)をTris緩衝生理食塩水(50 mM Tris, 125 mM NaCl, 4 mM KCl, pH 8.0)、0.05% (v/v) Tween 20および5% (w/v)スクロース(TBST)の中に含有するブロッキング用緩衝液中で終夜、この膜をブロッキングした。TBST中で1回洗浄した後に、このシートを室温で3時間ブロッキング用緩衝液中で同時にMAb 2c (0.5〜1.0μg/mL)およびPODコンジュゲート抗マウスIgG Fab断片(5倍過剰; Roche Applied Science, Mannheim, Germany)とともにインキュベートした。TBST中で2回洗浄した後に、Chemiluminescence Western Blotting Kit (Roche Applied Science, Mannheim, Germany)を製造元のプロトコルにしたがって用いることにより、抗体結合を検出した。
雌性C57BL/6J (H-2b)マウスを、Charles River Wiga (Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germany)から入手し、33〜37日齢の時点で使用した。実験を既報[1, 2]のように行った。手短に言えば、マウスに、10%ウシ胎仔血清を含むEMEM 0.1 mL中2×106 TCID50のHSV-1を膣内から接種した。ウイルス接種の24時間前に、腹腔内注射によってMAb 2c、ポリクローナル免疫血清または沈殿させた培地のいずれか0.5 mLをマウスに投与した。使用したヒト標準的免疫血清調製物(Beriglobin S(商標), CSL Behring, Germany)は、0.025 mL中でHSV-1に対して1:1280の補体非依存性の中和価を有し、適用のためIscoveの培地中で4倍希釈した。MAb 2cのストック調製液は1:640の補体非依存性の中和価を有し、ポリクローナル免疫血清と同じ中和活性を含むように2倍希釈した。適用した抗体希釈液のELISA力価は、マウスおよびヒトIgGに対するペルオキシダーゼコンジュゲートウサギを用いKahlon & Whitleyの方法[43]にしたがって決定した場合に104.5〜105.5であった。対照の場合、等量のIscoveの培地を同じように処理した。培地を投与した対照マウスは、非HSV特異的なMAbを投与した対照と同等であった[1]。膣拭き取り検体をウイルス接種後1日おきに採取し、Vero細胞単層上のウイルスについてアッセイした。感染性ウイルスの力価をReed & Muenchの方法[44]にしたがって0.05 mLあたりのTCID50によりマイクロタイタープレート中で決定した。
gBの最初の487アミノ酸はMAb 2cの結合に必要である
MAb 2cエピトープの適切な折り畳みに必要な糖タンパク質B領域に関する最初の見識を得るために、全長HSV-1 gB構築物および一連のカルボキシ末端切断型gB構築物を方法の項に示したようにCOS-1細胞において発現させた。gBの発現を、マウスHSV gB特異的MAb H1396およびH1781の混合物を用いた間接的免疫蛍光顕微鏡検査法により検証した。間接的免疫蛍光アッセイ法によりMAb 2cの結合も可視化した。表7に示されるように、全長タンパク質および切断型誘導体gB(1〜720)、gB(1〜630)、gB(1〜505)、gB(1〜503)およびgB(1〜487)はMAb 2cによって認識された。対照的に、MAb 2cはgB(1〜470)、gB(1〜223)およびgB(1〜130)を結合することができなかった。さらに、N末端およびC末端の両方の切断のある2つの構築物(gB(183〜488)、gB(436〜642))で反応は認められなかった。これらの結果から、MAb 2cのエピトープが最初の487アミノ末端残基のなかに位置することが示唆された。
* 全てのgB構築物の発現をHSV gB特異的モノクローナル抗体H1396およびH1781を用いた間接的免疫蛍光によって確認した[30〜32]。
** MAb 2cの結合を間接的免疫蛍光によって検出した。
+ はMAb 2c結合を示し、- はMAb 2c結合の失敗を示す。
*** pSVL, 陰性対照として用いた発現ベクター。
MAb 2cによって認識されるエピトープの精密マッピングはCOS-1細胞において発現されたgB欠失構築物によって可能ではなかったので、gBに由来する重複ペプチドのスキャン(ペプチドスキャン)をSPOT(商標)合成により連続的なセルロース膜支持体上で合成した。アミノ酸31〜505のgB領域に及ぶペプチドを、12アミノ酸の重複を有する(すなわち、3アミノ酸ずつgB配列に沿ってシフトする) 15merとして合成し、計155種のペプチドを得た。MAb 2cの結合は一次(MAb 2c)および二次(PODコンジュゲート抗マウスIgG Fab)抗体との同時インキュベーション、ならびに化学発光による検出で示された。
ペプチド90 (図22; 298SPFYGYREGSHTEHT312 (SEQ ID NO: 48)は最も強いシグナル強度を示したので、本発明者らは、結合部位BがMAb 2c結合のための主要な決定因子であると仮定した。かくして、本発明者らは、さらに高分解能のセルロース結合ペプチドスキャンを用いてMAb 2c結合に必要な部位Bの最小の長さを特定した。12アミノ酸の重複を有する(すなわち、アミノ酸ただ1つずつgB配列に沿ってシフトする) gB由来の残基296〜315に及ぶ13merのペプチドを二つ組で合成した。5つの連続ペプチドとのMAb 2cの反応性を上記のようにインキュベーションおよび検出手順の後に認めた。5つの反応性ペプチドの配列アライメントを図23に示す。全5種のペプチドに対する共通配列は300FYGYREGSH308 (SEQ ID NO: 49)であった。
全体的なおよび自然に折り畳まれたタンパク質という状況でMAb 2cに対する結合部位Bを確認するために、本発明者らは、結合部位B内の単一アミノ酸の交換によって、pMT2gBにクローニングされた、全長gBのアミノ酸配列を改変した。部位特異的突然変異誘発用のファージミドに基づく系を用いることにより、単一アミノ酸の交換を有するいくつかのgB構築物を作出した。COS-1細胞における変異型gBの発現の後、免疫蛍光アッセイ法によってMAb 2cの結合を分析した。表8に示されるように、MAb 2cの結合に重要であることが証明された一連のgB残基が特定された。詳細には、SによるgB 299位の残基Pの置換、それぞれYおよびIによるF300の置換、NによるY301の置換、それぞれRおよびVによるG302の置換、NによるY303の置換、それぞれGおよびLによるR304の置換、ならびにKによるE305の置換は、MAb 2c結合の完全な喪失をもたらし、したがって、299〜305位の残基はそれぞれ、その側鎖を介して抗体と相互作用する主要な残基となることにより、または抗体によって認識されるエピトープの立体構造の形成に必要なgBタンパク質の適切な全体的または局部的折り畳みに影響を与えることにより、エピトープの形成に決定的に関与していることを示唆していた。COS-1細胞における変異型gBの発現は、マウスMAb 2cおよびポリクローナルウサギ抗HSV IgG免疫血清との細胞の同時インキュベーションにより、その後、DTAFコンジュゲート抗マウスIgG (MAb 2cが結合したなら緑色の蛍光)およびTexasRedまたはCy3コンジュゲート抗ウサギ抗体(同じ細胞の赤色の蛍光)との同時インキュベーションを介した特定により検証した。反対に、単一のgB残基Y296の、それぞれ、NおよびFへの交換、M297の、それぞれ、L、TおよびVへの交換、ならびにS298のAへの交換のほか、G306の、それぞれ、AおよびVへの交換、ならびにS307のAへの交換はMAb 2cの結合に影響を与えなかった。
* 野生型アミノ酸はgBの位置番号の前に示されており、導入された残基は位置番号の後に示されている。
全てのgBバリアントの発現をポリクローナルウサギ抗HSV-1 IgG血清との細胞の同時インキュベーションによって得た免疫蛍光で確認した。
** MAb 2cの結合を間接的免疫蛍光によって試験した。
+ はMAb 2c結合を示し、- はMAb 2c結合の失敗を示す。
*** この特定の結果の評価については、考察の項を参照されたい。
インビボに最も近い状況に近づけるため、それぞれがgBの中にアミノ酸変異を含む、よく特徴付けられた5つのHSV-1バリアント(R126、R1375、B4.1、R1435、R233) [27〜29]を用いることにより、および方法の項に示されるように、本研究において作出された変異体ウイルス(vY301N [301位のYをNによって置換した]、vG302R、vG302V)により、部位Bの個々のアミノ酸の影響をさらに分析した。カバースライド上のVero細胞に200〜300プラーク形成単位のこれらの変異体または親の野生型ウイルスHSV-1 FおよびKOS 321のどちらかを感染させた。間接的免疫蛍光アッセイ法から、MAb 2cはウイルスvY301N、vG302R、vG302V、R126 (Nによって置換されたY303)、R1375 (R304Q)およびB4.1 (E305K)に感染した細胞に結合できないが、MAb 2cは変異体R1435 (H308Y)、R233 (R328H)を感染させた細胞、および野生型ウイルスを感染させた細胞に対して反応性を示すことが実証された(表9)。
* gBの発現をポリクローナルウサギ抗HSV-1 IgG血清で得た免疫蛍光により全てのウイルスについて確認した。+ は間接的免疫蛍光によって検出された感染Vero細胞とのMAb 2cの結合を示す。- はMAb 2c結合の失敗を示す。
** + はMAb 2cによるウイルス中和を示し、- はウイルス中和の失敗を示す。
*** 野生型アミノ酸はgBの位置番号の前に示されており、導入された残基は位置番号の後に示されている。
インビボでのMAb 2cの保護効果がまた、部位Bの特定のアミノ酸に依存するかどうか分析するために、計168匹のC57BL/6マウスにMAb 2cの腹腔内注射から24時間後に変異体ウイルスまたは親野生型株のどちらかを膣内から接種した。比較のため、同じ中和能力に調整されたポリクローナル免疫血清を投与した。この実験は既報[1, 2]のように行った。図25に示されるように、MAb 2cは、変異体R126 (Y303N)、R1375 (R304Q)およびB4.1 (E305K)を接種したマウスでは効果がなかったが、変異体R1435 (H308Y)もしくはR233 (R328H)または野生型ウイルスを接種したマウスでは有効であった。しかし、ウイルス変異体R126、B4.1およびR233を用いた実験は、マウスの粘膜におけるこれらの変異体のウイルス複製が非効率的であるという事実によってわずかに妨げられた。特に、変異体R126は非常に低い複製能を示した。ゆえに、感染の経過は、MAb 2c、ポリクローナル免疫血清または対照液で処置したR126感染マウスの間で違わなかった。総合すれば、マウス保護実験の結果から、MAb 2cがインビボでその保護効果を示すにはgB残基Y303、R304およびE305が不可欠であることが明らかに実証された。
ペプチドスキャン法によるMAb 2cエピトープマッピングの結果(図22)から、共通配列181QFMGIFEDR189を有する結合部位Aは、部位B、およびセグメント化されたペプチドによって検出できない可能性がある潜在的に他の領域とともに形成される不連続なエピトープの構成要素であるが、自然に折り畳まれたタンパク質において機能するエピトープの部分であることが最初に示唆された。しかしながら、部位Aは驚いたことに、三次元gB三量体構造の表面に位置していなかった[21]。さらに、部位AおよびBはgB表面上ですぐ近くになく、抗体の抗原結合部位の平均領域によって同時に網羅することができなかった。
現研究の目的は単純ヘルペスウイルス糖タンパク質B上のMAb 2cに対する結合部位をマッピングすること、および鍵となるエピトープ残基を特定することであった。一連のC末端切断型の組換え発現gBタンパク質を用いて、N末端の487残基がMAb2cの結合に必要であることが分かった。C末端からの17個またはそれ以上のアミノ酸のさらなる欠失は、全ての欠失型gBの一過性トランスフェクト細胞での合成を容易に確認できたという事実にもかかわらず、抗体結合の喪失をもたらした。エピトープの位置を絞り込むために、それぞれがシグナルペプチド配列(アミノ酸1〜30)に融合された2つのさらなる欠失変異体gB(183〜488)およびgB(436〜642)を構築した。MAb2cはこれらの後者の切断型gBタンパク質のいずれにも結合することができず、かくしてMAb 2cのエピトープが残基470〜487の間に局在している可能性があるという本発明者らの初期の前提に矛盾していたので、本発明者らは、合成ペプチドを利用する代替的なエピトープマッピング戦略に切り替えることに決めた。
Claims (16)
- SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、およびSEQ ID NO: 6に示される相補性決定領域を含む、抗体。
- 請求項1記載の抗体と同じエピトープを認識する抗体。
- 感染細胞から、隣接する第2の非感染細胞へのHSVの伝播(細胞間伝播)を阻害することができる、請求項1または2のいずれか一項記載の抗体。
- 最大でも40 nM、好ましくは最大でも30 nM、より好ましくは最大でも20 nM、さらにより好ましくは最大でも15 nM、最大でも13 nM、最大でも10 nM、および最も好ましくは最大でも7 nMの解離定数KDを有する、請求項1〜3のいずれか一項記載の抗体。
- 最大でも20 nM、好ましくは最大でも16 nM、より好ましくは最大でも12 nM、最大でも10 nM、最大でも8 nM、最大でも6 nM、および最も好ましくは最大でも4 nMの濃度で100 TCID50のHSVの規定量を中和することができる、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体。
- SEQ ID NO: 9の1〜30位、38〜51位、68〜99位、および112〜122位、ならびにSEQ ID NO: 10の1〜23位、40〜54位、62〜93位、および103〜113位に示されるアミノ酸残基に対して少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の抗体。
- SEQ ID NO: 7の1〜30位、38〜51位、68〜99位、および112〜122位、ならびにSEQ ID NO: 8の1〜23位、41〜55位、63〜94位、および104〜114位に示されるアミノ酸残基対して少なくとも80%、好ましくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の抗体。
- 二価抗体または多価抗体である、請求項1〜7のいずれか一項記載の抗体。
- エフェクター部分、治療部分、または検出可能な標識とコンジュゲートしている、請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体。
- 請求項1〜9のいずれか一項記載の抗体の有効量と、少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
- 請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体をコードする核酸配列を含む、発現ベクター。
- 請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む、宿主細胞。
- 請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体を産生することができる、ハイブリドーマ細胞。
- 薬物としての使用のための請求項1〜9のいずれか一項記載の抗体。
- 対象におけるHSV関連疾患の予防的または治療的処置のための方法における使用のための請求項1〜9のいずれか一項記載の抗体。
- HSV関連疾患が以下の特徴の1つまたは複数を伴う、請求項15記載の使用のための抗体:
(a) 経口再発の存在、
(b) 生殖器再発の存在、
(c) ヘルペス性湿疹、
(d) 新生児ヘルペス、
(e) 免疫不全、免疫減弱状態の患者、
(f) ウイルス抑制剤に対する耐性、
(g) 脳炎、
(h) 髄膜炎、
(i) 髄膜脳炎、
(J) 眼感染症、および/または
(k) 汎発性HSV感染症。
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