JP2016025863A - Ｔｏｌｌ受容体２へのヒト化抗体およびその使用 - Google Patents

Ｔｏｌｌ受容体２へのヒト化抗体およびその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）に特異的に結合し、ＴＬＲ２機能に拮抗するが、ヒトにおいて実質的に非免疫原生である、完全なヒト化モノクローナル抗体を提供する。【解決手段】ヒトＴｏｌｌ様受容体２のエピトープと３?１０-8Ｍ以下のＫDで結合し、ＣＤ３２（Ｆｃγ受容体ＩＩ）とは独立にＴｏｌｌ様受容体２の拮抗に介在する抗体またはその抗原結合部位であり、前記エピトープは、参照抗体に認識され、前記参照抗体は、特定のアミノ酸配列を含む重鎖の可変領域および他の特定のアミノ酸配列を含む軽鎖の可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部位。また、提供するのは、このような抗体をコード化する核酸並びに医療における抗体の使用、特にＴｏｌｌ様受容体２の活性およびシグナリングによって介在される炎症および自己免疫疾患の治療を含む。【選択図】図１Ｂ

Description

本発明は、完全なヒト化抗体およびその断片、特にＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２，Ｔ
ＬＲ−２）に特異的な結合がある完全なヒト化抗体に関する。さらに、本発明は、Ｔｏｌ
ｌ様受容体２活性化およびシグナリングによって介在される炎症および自己免疫疾患の治
療並びに予防に関する前記完全なヒト化抗体の使用に関する。
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、固有の免疫反応を調整する重要な役割を有するパター
ンを認識する受容体の一群を形成して、組織修復、組織完全性および腫瘍形成に関与する
。現在まで１１種類のＴｏｌｌ様受容体が、ヒトで同定された。Ｔｏｌｌ様受容体の一群
のメンバーは、１０から１５のＴｏｌｌ様受容体を有する大半の哺乳類で、高い保存性を
有する。個々のＴｏｌｌ様受容体は、特異的な病原体関連分子を認識する。Ｔｏｌｌ様受
容体（ＴＬＲ２，ＣＤ２８２，ＴＬＲ−２）は、ペプチドグリカン、リポタンパク質、リ
ポテイコ酸および内因性リガンドによって活性化することができる。
Ｔｏｌｌ様受容体２に特異的結合を有する数々のモノクローナル抗体が既知である。国
際公開第０１／３６４８８号は、European Collection of Cell Culture（ECACC）アクセ
ス番号９９１０２８３２としてブダペスト条約に基づいて寄託されたハイブリドーマ細胞
株由来のＴＬ２．１として指定される抗体を開示する。前記抗体は、ヒト細胞で発現のあ
るＴｏｌｌ様受容体２の活性と拮抗する。
国際公開第２００５／０２８５０９号は、哺乳類ＴＬＲ２の活性を特異的に阻害するＴ
２．５とされるネズミモロクローナル抗体を開示する。Ｔ２．５モノクローナル抗体は、
ヒトおよびネズミの両形態のＴＬＲ２に交差反応性があることを示す。前記事実は、国際
公開０１／３６４８８号に開示され、この特許出願に示されているように、ネズミＴＬ２
．１抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体が、ヒトおよびネズミの双方の形態のＴＬＲ２に交差
反応性がない実験データをさらに含む。むしろ、ＴＬ２．１抗体は、国際公開２００５／
０２８５０９号にヒトＴｏｌｌ様受容体２に結合するのみで、ネズミＴｏｌｌ様受容体２
に結合しないことを示す。国際公開２００５／０２８５０９のＴ２．５モノクローナル抗
体は、ＴＬＲ２の細胞外領域に対して産生され、したがって、Ｔｏｌｌ様受容体２範囲内
のエピトープに特異的に結合する。
国際公開２００５／０１９４３１号は、１１Ｇ７として指定されるＴＬＲ２に特異的に
結合する抗体を開示する。このネズミ抗体は、American Type Culture Centre(ATCC)に基
づいてＰＴＡ−５０１４指定され、寄託されているハイブリドーマ細胞株１１Ｇ７由来で
ある。１１Ｇ７モノクローナル抗体は、ＴＬＲ２の細胞外領域に選択的に結合し、サイト
カインの産生の誘導を、Ｔｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）およびＴＬＲ２の間で形成する
ヘテロ二量体を活性する拮抗剤で刺激したヒト抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）によって、阻
害することができる。１１Ｇ７抗体は、Ｔｏｌｌ様受容体６（ＴＬＲ６）およびＴＬＲ２
の間で形成するヘテロ二量体を経てシグナリングを誘導する拮抗剤で刺激したＰＢＭＣに
よってサイトカイン産生を阻害しない。
齧歯類モノクローナル抗体、例えばネズミモノクローナル抗体の生体内（ｉｎ−ｖｉｖ
ｏ）治療に適用するための使用は、抗体が投与される対象によって望ましくない免疫反応
を生じることと関連があることを示した。前記免疫反応は、治療抗体の効果を有意に中和
する抗体の産生を結果として生じる。かかる免疫反応は、通常、ヒト抗マウス抗体（ＨＡ
ＭＡ）反応を示す。ＨＡＭＡ反応は、その結合標的に達するための治療抗体の性能を弱め
て、抗体の治療効果を低下させることを含む、様々な方法で投与した抗体の治療効果を低
下させる。
数々の方法が、ここに投与された治療抗体に対して産生された望ましくないＨＡＭＡ反
応の課題に対処するため、開発されてきた。一般的に、これらの方法は、ヒト抗体由来の
ある部位と、マウス抗体のこれに相当する部位の置換を行う技術を伴う。かかる方法は、
例えば、ヒト由来の定常領域に結合した、ネズミの可変領域を含むキメラ抗体の産生を生
じる。或いは、「ＣＤＲ移植」として既知の技術を用いることができ、ネズミ抗体からの
相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ヒト抗体の軽鎖および重鎖の可変領域に提供されるフレー
ムワーク内に移植される。これは、ネズミ抗体の結合特異性を保持する抗体の産生を生じ
るが、非ヒト成分のみが、ネズミＣＤＲ領域に移植される。
しかしながら、これらの方法の双方によって生じる、ヒト化抗体の治療効果は弱い可能
性がある。例えば、マウスのキメラ抗体の可変領域成分は、依然として、そこに備えられ
たＨＡＭＡ反応の基盤を提供する。さらに、ＣＤＲ移植されたヒト化抗体が産生され、単
純なＣＤＲ領域の移植は、減少された抗体の結合親和性のため、抗体の治療効果の低下を
生じ得ることが観測された。
したがって、発明者は、Ｔｏｌｌ様受容体２に特異的に結合し、ＴＬＲ２機能に拮抗す
るが、ヒトにおいて実質的に非免疫原生である、完全なヒト化モノクローナル抗体を生じ
る必要性を認識した。広範囲に亘る実験の結果、発明者は、ヒトのＴｏｌｌ様受容体２に
特異的に結合し、Ｔｏｌｌ様受容体１またはＴｏｌｌ様受容体６とＴｏｌｌ様受容体２が
ヘテロ二量体を形成するか否かに関わりなく、ＴＬＲ２機能を拮抗する完全なヒト化モノ
クローナル抗体を産生した。ＴＬＲ２拮抗抗体は、既に知られたキメラまたはＣＤＲ移植
技術から産生されるものでなく、したがって、あらゆるネズミアミノ酸残基をも含まない
。さらに、抗体は、ＣＤ３２細胞表面抗原に結合する必要なく、ＴＬＲ２の中和を介在す
ることを示し、これは他の既知のＴｏｌｌ様受容体２の拮抗抗体の機能必要条件でもある
。さらに、本発明の完全なヒト化抗体は、従来技術において既知となった初めての完全な
ヒトＴＬＲ２中和抗体である。抗体は、いずれのＴ細胞エピトープをも示さず、したがっ
て、中和抗体は、対象に投与する際、それに対して産生されない。さらに、抗ＴＬＲ２拮
抗抗体は、ヒト、マウス、サル細胞で発現したＴｏｌｌ様受容体２に結合することが、驚
くべきことに観測された完全なヒト化抗体の結合で、多岐に亘る哺乳類細胞で発現するＴ
ｏｌｌ様受容体２への幅広いレベルでの交差反応性を示す。
本発明の第１の態様によると、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２，ＣＤ２８２，ＴＬＲ−
２）に特異的に結合することができる中和抗体、またはその抗原結合部位を提供し、抗体
または抗原結合部位は、軽鎖および重鎖を含むか、それらからなるかまたは実質的にそれ
からなり、軽鎖の可変領域（ＶＬ）は、配列番号：１のアミノ酸配列に同一であるか、実
質的に相同性のあるアミノ酸配列を含み、重鎖の可変領域（ＶＨ）は、配列番号：４のア
ミノ酸配列に同一であるか、実質的に相同性のあるアミノ酸配列を含むか、それからなる
か、または、実質的にそれからなる。
ここに規定するように、中和抗体の用語は、Ｔｏｌｌ様受容体２の生物活性およびシグ
ナリングを中和することができる抗体を記載する。拮抗抗体またはブロッキング抗体とし
ても示される中和抗体は、特に、好ましくは特異的にＴｏｌｌ様受容体２に結合し、１以
上のＴｏｌｌ様受容体２の生物活性を阻害する。例えば、中和抗体は、リガンドまたは基
質、例えばＴｏｌｌ様受容体２リガンドのＴｏｌｌ様受容体２リガンド結合部位への結合
を阻害することができる。或いは、一旦、リガンド拮抗剤に結合してから、例えばリガン
ド拮抗剤結合を弱めることによって、中和抗体は、Ｔｏｌｌ様受容体２の活性を防止する
ことができる。通常、中和抗体は、Ｔｏｌｌ様受容体２に特異的に結合し、したがって、
生理的または治療条件下で、実質的に他のＴｏｌｌ様受容体群のメンバー（例えばＴｏｌ
ｌ様受容体４）に結合しない。
ある実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２の中和抗体は、ＣＤ３２（Ｆｃγ受容体Ｉ
Ｉ（ＦｃγＲＩＩ，ＦｃｇＲＩＩ））、特にＣＤ３２ａおよび／またはＣＤ３２ｂに結合
するための抗Ｔｏｌｌ様受容体２抗体またはその結合断片の必要条件から独立してＴｏｌ
ｌ様受容体２の機能的活性の拮抗に介在する。したがって、Ｔｏｌｌ様受容体２の中和は
、抗体、特に抗体のＦｃ部位または抗体断片のＣＤ３２への結合を必要としない。
典型的に、本発明の抗Ｔｏｌｌ様受容体２抗体は、抗体を対象、特にヒトに投与した場
合、免疫反応が介在することができるあらゆる結合エピトープを含むことを特徴とする。
免疫反応が生じたとき、抗体の治療効果が非常に弱まっているため、かかる特徴は、本発
明の抗体に対する中和抗体の生成を抗体が投与される対象において防止する際に重要とな
る。
通常、中和抗Ｔｏｌｌ様受容体２抗体は、完全なヒト化抗体である。即ち、抗体を含む
アミノ酸残基の全ての組み合わせは、完全にヒト由来であり、したがって、例えば、ヒト
領域および非ヒト領域を含まない。特に、本発明の抗体は、ヒトの可変領域配列のみを含
む。本発明の抗体は、重鎖および軽鎖の可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、ネズミ
抗体由来のアミノ酸残基を含む部位に、例えばマウスおよびヒトの双方に由来する重鎖お
よび軽鎖の可変領域からなるキメラモノクローナル抗体またはＣＤＲ移植した「ヒト化」
抗体とは異なり、一方、抗体の関連したフレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域（Ｃ
Ｒ）は、ヒト抗体由来である。それゆえ、本発明の完全なヒト化抗体は、必ずしも同じ抗
体というわけではないが、全てのヒト由来のまたはヒト由来の配列に同一の重鎖および軽
鎖双方の可変および定常領域を有する。本発明の完全なヒト化抗体は、「ヒト化」抗体ま
たは完全なヒト配列のいずれかに由来する抗体としてさらに示される。
本発明の抗体の軽鎖の可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列は、以下の配列番号：１に示す
：
Figure 2016025863
配列番号：１において、図１に示す下線部位の残基は、相補性決定領域の部位に関する
ものであり、残基２４から３４は、ＣＤＲに関するものであり、残基５０から５６は、Ｃ
ＤＲ２に関するものであり、残基８９から９７は、ＣＤＲ３に関するものである。図１Ｂ
は、軽鎖の可変ヌクレオチド配列および検出したアミノ酸配列を示す。この図において、
軽鎖領域の残基は、従来、カバット（Ｋａｂａｔ）ナンバリングシステムに基づいて計数
する（Kabat EA et al. (1991 ) Sequences of proteins of immunological interest, 5
th edition. Bethesda: US Department of Health and Human Services）。
これらＣＤＲ残基の同定は、カバットナンバリングシステムを用いたＣＤＲ領域に指定
された残基と一致していて、ＶＬＣＤＲ１（即ち、軽鎖の可変領域の相同性決定領域１）
は、残基２４から３４、ＶＬＣＤＲ２（即ち、軽鎖の可変領域の相同性決定領域１）は、
残基５０から５６、ＶＬＣＤＲ３（即ち、軽鎖の可変領域の相同性決定領域１）は、残基
８９から９７を含む。
ここに規定するように、配列番号：１のアミノ酸配列に実質的に相同性のあるアミノ酸
配列は、配列番号：１のアミノ酸配列の少なくとも２０，５０または１００アミノ酸の長
さに亘るか、または、その完全な配列の長さに亘って、配列番号：１のアミノ酸配列に少
なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは少なくとも９８％アミノ酸相同
性を有することを意味する。一般的に、このような相同性を有するアミノ酸配列は、Ｔｏ
ｌｌ様受容体２に特異的結合があり、Ｔｏｌｌ様受容体２に結合する場合は、Ｔｏｌｌ様
受容体２の機能活性に拮抗する。
通常、軽鎖の可変領域（ＶＬ）は、軽鎖を提供するため、ヒトの免疫グロブリンκ定常
領域（ＣＬ）に結合し、前記軽鎖は、ヒト化抗体の軽鎖である。
したがって、ある実施形態において、本発明の抗体または結合メンバーが完全な軽鎖を
含む場合、軽鎖は配列番号：２のアミノ酸配列を有する。
Figure 2016025863
さらに、ある実施形態において、本発明は、配列番号：２のアミノ酸配列と少なくとも
８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ま
しくは９８％相同性があるアミノ酸配列を含むか、それからなるか、または実質的にそれ
からなる軽鎖を含む抗体または結合メンバーにも及ぶ。通常、配列番号：２と少なくとも
８０％以上のアミノ酸相同性がある抗体は、Ｔｏｌｌ様受容体２に特異的に結合し、それ
に結合する場合、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能活性に拮抗するように働く。
ある実施形態において、配列番号：２に規定して、図３に示すような軽鎖のアミノ酸配
列は、図４に示すような配列番号：３のヌクレオチド配列からコード化される。図４に示
す配列番号：３の配列において、下線部位の核酸は、軽鎖の可変領域のアミノ酸をコード
化する。
１つの実施形態において、重鎖の可変領域のアミノ酸配列を、以下の配列番号：４に示
す：
Figure 2016025863
図２に示すような配列番号：４において、下線部位の残基は、３つの相同性決定領域に
関するものであり、残基３１から３５はＣＤＲ１（ＶＨＣＤＲ１（重鎖の可変領域の相同
性決定領域１））、残基５０から６５はＣＤＲ２（ＶＨＣＤＲ２）、残基９５から１０３
はＣＤＲ３（ＶＨＣＤＲ３）に関連している。これらＣＤＲ領域の位置は、カバットナン
バリングシステムを用いてＣＤＲ領域とみなしたものとわずかに異なり、ＣＤＲ１は残基
３１から３５、ＣＤＲ２は残基５０から６６、ＣＤＲ３は残基９５から１０３の位置に存
在する。
ここに規定するように、実質的に配列番号：４のアミノ酸配列に相同性のあるアミノ酸
配列は、配列番号：４のアミノ酸配列のアミノ酸少なくとも２０，５０または１００アミ
ノ酸の長さに亘って、少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは少なく
とも９８％アミノ酸の相同性を有するアミノ酸配列を有することを意味する。尚、ある実
施形態において、本発明は、配列番号：４のアミノ酸配列に少なくとも８０％、より好ま
しくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９８％の配
列相同性を含むか、それからなるか、または、実質的にそれからなる鎖の可変領域（ＶＨ
）を含む抗体または結合メンバーにまで及ぶ。
通常、重鎖の可変領域（ＶＨ）は、さらに少なくとも１の免疫グロブリンの定常領域を
含むアミノ酸配列に結合する。ある実施形態において、免疫グロブリンの定常領域は、本
発明の完全なヒト化抗体の完全な重鎖を形成するため、サブクラスの抗体由来のものであ
る。したがって、前記定常領域は、ＣＨ１およびＣＨ２領域の間に設置されたリンカーに
加えてＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。
ある実施形態において、免疫グロブリンの定常領域は、ＩｇＧアイソタイプ、通常、免
疫グロブリンＧアイソタイプ４（ＩｇＧ４）由来である。ＩｇＧ４抗体は、他の分子から
の重軽鎖の対と重鎖および結合した軽鎖（半分子）を換えることによって、Ｆａｂアーム
を交換するダイナミック分子であり、この交換は、二重特異性抗体の産生を結果として生
じる。したがって、ある実施形態において、Ｆａｂアーム交換が生じることを防ぐため、
少なくとも１つの変異を、ＩｇＧ４免疫グロブリン少なくとも１の定常領域に構築した。
したがって、本発明のある実施形態において、抗体または抗体断片が、ＩｇＧ４由来の定
常領域を含む場合、ヒンジ領域に局在する重鎖のアミノ酸残基２４１の変異は、セリン残
基がプロリン残基に置換されるように（Ｓ２４１Ｐ）実施される（Angal S. et al. Mole
cular Immunology. 1993. Vol. 30. No.1. p105-108に教示する）。
したがって、ある実施形態において、重鎖および軽鎖の定常領域残基を提供するために
使用したアミノ酸残基は、アイソタイプＩｇＧ４の免疫グロブリン由来のものである。さ
らに、ある実施形態において、免疫グロブリンは、サブクラスＩｇＧの免疫グロブリンお
よびアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３の免疫グロブリン由来のものである
。さらに、ある実施形態において、重鎖および軽鎖の定常領域残基を提供するために使用
されるアミノ酸残基は、サブタイプＩｇＡの免疫グロブリン由来のものである。
さらなる様々な実施形態において、１以上の突然変異、置換、欠失、挿入が、抗体の機
能特性を改善するため、抗体の定常領域のアミノ酸配列に作ることができる。例えば、抗
体の、エフェクター機能、有効性また半減期から選択される（ただし、これらに限定され
ない）少なくとも１つの特性を改良するため、少なくとも１つのアミノ酸変異、挿入、欠
失および／または置換を、定常領域のアミノ酸残基に形成することができる。
ある実施形態において、本発明による抗体の重鎖のアミノ酸配列であり、ＶＨ−ＣＨ１
−ＣＨ２−ＣＨ３領域を含み、さらにヒンジ領域を含むものは、以下の配列番号：５とし
て提供する：
Figure 2016025863
さらに、ある実施形態において、本発明は、配列番号：５のアミノ酸配列と少なくとも
８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％および最も
好ましくは９８％相同性アミノ酸配列を有する相同性アミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体
または結合メンバーにまで及ぶ。
ある実施形態において、配列番号：５に規定し、図５に示すように、重鎖のアミノ酸配
列は、図６に示すような配列番号：６のヌクレオチド配列からコード化される。図５に示
すような配列番号：５の配列において、太字の残基はヒンジ領域、斜体の残基はＣＨ１定
常領域の残基、下線部位の残基はＣＨ２定常領域の残基、下線部位の残基の後ろに記載さ
れている残基はＣＨ３定常領域の残基である。ある実施形態において、ＣＨ１，ＣＨ２お
よび／またはＣＨ３定常領域は、あらゆる適切な免疫グロブリンのサブタイプ、例えばＩ
ｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＡまたはＩｇＭ（ただし、これらに制限されない）に由来するＣ
Ｈ１，ＣＨ２またはＣＨ３領域と完全にまたは部分的に置換することができる。ある実施
形態において、ある定常領域における、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加または置
換も提供することができる。通常、前記欠失、付加または置換は、抗体または抗体断片の
Ｆｃ部位の結合特徴、特にＦｃ受容体が結合して、エフェクター機能を介在する抗体のＦ
ｃ領域の性能の調節といった機能的な変化を結果として生じる。
また、ある実施形態において、本発明は、配列番号：１の軽鎖の可変領域またはそれに
少なくとも９０％アミノ酸配列の相同性を有する変異体、および配列番号：４の重鎖可変
領域、またはそれに少なくとも９０％アミノ酸配列の相同性を有する変異体を含む、単離
された抗体にまで及ぶ。
さらに、ある実施形態において、配列番号：２のアミノ酸配列またはそれに少なくとも
９０％の相同性を有する変異体を含む軽鎖、および配列番号：５のアミノ酸配列、または
それに少なくとも９０％の相同性を有する変異体を含む重鎖から形成される抗体が提供さ
れている。
本発明の抗体および抗体断片の産生に使用する軽鎖および重鎖双方の可変および定常領
域が理解されていて、例えば前記可変および定常領域は、ここに記載するこれら領域の配
列と比較して、１以上のアミノ酸の変異体を含むことができる。変異体の定常領域は、こ
こに記載の定常領域より長いか、短いことが好ましい。ある実施形態において、変異体の
可変または定常領域は、野生型抗体の定常領域と、少なくとも９０％の相同性を有するか
、類似性を有していてもよい。
ここに規定する「配列相同性」の用語は、配列相同性または類似配列として示すことも
できる。ここに使用する「相同性」または「配列相同性」の用語は、配列アライメントに
おける特定の部位を意味し、アミノ酸残基は配列アライメント間で同一である。ここに使
用する「類似性」または「類似配列」の用語は、配列アライメントにおける特定の位置を
示し、配列間のアミノ酸残基は、互いに類似のものが存在する。例えば、ロイシンは、イ
ソロイシンまたはバリン残基と置換される。これは、保存的置換として示すこともできる
。好ましくは、本発明のアミノ酸配列は、そこに含まれるアミノ酸残基のあらゆる保存的
置換による変更であり、これらの置換は、修飾されていない抗体と比較して、結合特異性
または結果として生じる抗体の機能活性には影響を及ぼさない。
本発明の（固有の）ポリペプチドおよびその機能的誘導体に関する配列相同性または配
列同一性は、最大の割合の相同性を達成するため、必要に応じて、配列を並べ、ギャップ
を導入した後、同一の配列の一部としてあらゆる保存的置換を考慮することなく、相当す
る固有のポリペプチドの残基と同一の候補配列におけるアミノ酸残基の割合として算出さ
れる。Ｎ−またはＣ−末端の伸長も、挿入も、配列同一性または配列相同性を減少させる
ものとはみなされない。２以上のアミノ酸配列を並列化し、それらの配列同一性および配
列相同性を決定する方法およびコンピュータープログラムは、当業者に周知である。例え
ば、２アミノ酸配列と同一または類似の割合は、アルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ（Alts
chul et al. 1990）、ＦＡＳＴＡ（Pearson & Lipman 1988）またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔ
ｅｒｍａｎアルゴリズム（Smith & Waterman 1981）を用いて容易に算出することができ
る。
さらなる態様において、本発明は、ネズミモノクローナル抗体Ｔ２．５に認識されるＴ
ｏｌｌ様受容体２に存在するエピトープに特異的に結合する完全なヒト化抗体を提供し、
前記ヒト抗体は：
−軽鎖可変領域であり、可変領域は配列番号：１のアミノ酸配列を含むか、それからなる
かまたは実質的にそれからなる、
−重鎖であり、可変領域は、配列番号：４のアミノ酸配列を含むか、それからなるかまた
は実質的にそれからなるもの
を含む。
ある実施形態において、抗体は、少なくとも１のエフェクターまたはレポーター分子と
結合することができる。
あるさらなる態様において、本発明は、ＯＰＮ−３０５として指定する、配列番号：１
のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号：４のアミノ酸配列を有する可変
領域の重鎖を含む、完全なヒト化モノクローナル抗体も包含する。ＯＰＮ−３０５抗体は
、配列番号：２のアミノ酸配列からなるか、実質的にそれからなる軽鎖および配列番号：
５のアミノ酸配列からなるか、実質的にそれからなる重鎖としてもさらに規定することが
できる。
ここに使用する「実質的になる（consists essentially ofまたはconsisting essentia
lly of）」の用語は、ポリぺプチドが、本明細書に記載される範囲を超えて付加的な特徴
または要素を有するものの、該付加的または要素は、Ｔｏｌｌ様受容体２に特異的に結合
する抗体または抗体断片の性能に実質的に影響しないことを意味する。即ち、ポリペプチ
ドを含む抗体または抗体断片は、付加的な機能または要素を有するが、これらは、抗体ま
たは抗体断片が、Ｔｏｌｌ様受容体２と結合して、Ｔｏｌｌ様受容体２の、アミノ酸配列
に修飾を導入して抗体の免疫性を減少させるような機能活性に拮抗するのを妨げない。例
えば、実質的に特定の配列からなるポリペプチドは、いずれかの末端または両方の末端に
、抗体または抗体断片のポリペプチドの役割を作用し、阻害し、ブロックしまたは妨害し
ない１，２，３，４，５残基以上の付加的なアミノ酸を含むことができる。同様に、本発
明のＴｏｌｌ様受容体２拮抗抗体に寄与するポリペプチド分子は、かかる機能基が抗体ま
たは抗体断片のＴｏｌｌ様受容体２に結合したり、その機能を拮抗したりといった、抗体
または抗体断片の性能と作用することのない条件で、１以上の機能基と化学的に修飾する
ことができる。
他の態様において、本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列を含むか、それからなるか
、または実質的にそれからなる軽鎖の可変領域および／または配列番号：４のアミノ酸配
列を有する重鎖可変領域を含む、単離された、完全なヒト化モノクローナル抗体も包含す
る。
ここに規定する「完全なヒト化」抗体は、フレームワーク領域（ＦＲ）、定常領域（Ｃ
Ｒ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来であ
る可変領域を有する抗体を示す。さらに、抗体が定常領域を含む場合、これら定常領域も
ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来である。本発明の完全なヒト化抗体は、ヒト免
疫グロブリン配列にコード化されないアミノ酸残基、例えばランダムまたは部位特異的な
ｉｎ−ｖｉｔｒｏ突然変異生成による突然変異体を含むことができる。しかしながら、完
全なヒト化抗体は、他の哺乳類、例えばマウスの生殖細胞系列が、ヒトのフレームワーク
配列に移植されたものに由来するＣＤＲ配列の抗体を含むことを意図するものではない。
完全なヒト化モノクローナル抗体は、単一の特異的結合を示し、フレームワークおよびＣ
ＤＲ領域がヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列由来である可変領域を有する抗体であ
る。これは、例えば他の哺乳類、例えばマウスの生殖細胞系列が、ヒトのフレームワーク
配列に移植されたものに由来するＣＤＲ配列である場合のヒト化モノクローナル抗体とは
異なる。
重鎖の可変（ＶＨ）または軽鎖の可変（ＶＬ）配列のアミノ酸配列のみが提供されてい
る場合の実施形態において、本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体２、特に哺乳類Ｔｏｌｌ様受容
体２、特に、ヒトＴｏｌｌ様受容体２の細胞外領域に結合する抗体を産生する方法にまで
も及び、前記可変領域配列を、Portolano et al. (Portolano et al. The Journal of Im
munology (1993). 150:880-887)およびClarkson et al. (Clarkson et al. Nature (1991
) 352:624-628)の教示による相補可変領域配列のライブラリに対してスクリーニングす
ることによって、前記抗体は、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能を拮抗するように機能する。
他の実施形態において、本発明は、特異的にヒトＴｏｌｌ様受容体２に結合する単離さ
れた抗体であって、配列番号：４を含むか、それからなるか、または、実質的にそれから
なる重鎖の可変領域および配列番号：１を含むか、それからなるか、または、実質的にそ
れからなる軽鎖の可変領域を含む前記抗体を提供する。ある実施形態において、単離され
た抗体は、異なる抗原特異性を有する実質的に他の抗体を含まない、実質的に純粋な、単
離された抗体である。あるさらなる実施形態において、抗体は組換え抗体であり、即ち、
抗体は組換え法によって産生される。
他の態様においては、Ｔｏｌｌ様受容体２に特異的に結合する抗体を提供し、抗体は配
列番号：２のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号：５のアミノ酸配列を有する重鎖
からなるか、実質的にそれからなり、抗体は、ヒト、ネズミおよびサル細胞で発現するＴ
ｏｌｌ様受容体２と交差反応を生じる（即ち、それは特異的結合を有する）。一般的に、
抗体は、リガンド拮抗結合のＴｏｌｌ様受容体のリガンド結合部位への結合によってＴｏ
ｌｌ様受容体２の活性を妨げるため、リガンド結合部位でＴｏｌｌ様受容体２と結合する
。
他の様々な態様において、本発明は、本発明の前記態様に規定するような２，３，４以
上の抗体を含む多価単一性特異的抗原結合タンパク質またはその断片にまでも及び、前記
抗体は、結合構造によってそれぞれ他のものにも結合する。
他の多様な態様において、本発明は、前記態様の完全なヒト化抗体由来の結合メンバー
、または抗原結合断片にまでも及ぶ。かかる抗原結合断片は、抗原、概してＴｏｌｌ様受
容体２に特異的に結合することができる性能を保持する抗体の１以上の断片を示す。抗体
の抗原結合機能は、抗体全体の断片によって機能することができることを示す。ある実施
形態において、結合メンバーまたは抗原結合断片は、単離された結合メンバーであっても
よい。本発明の結合メンバーまたは抗原結合断片は、本発明の抗体断片、例えば重鎖また
は軽鎖のみといった完全なヒト化抗体分子の断片、または、例えば重鎖および／または軽
鎖の可変領域を含んでいてもよい。ある実施形態において、結合メンバーは、通常、抗体
ＶＨおよび／またはＶＬ領域を含むか、それからなるか、または、実質的にそれからなる
。結合メンバーのＶＨ領域も、本発明の一部として提供する。個々のＶＨおよび／ＶＬ領
域内には、４の関連したフレームワーク領域（「ＦＲ」）と３の相補性決定領域（「ＣＤ
Ｒ」）がある。ＶＨ領域は、通常、３ＨＣＤＲ（重鎖相補決定領域）を含み、ＶＬ領域は
、通常、３ＬＣＤＲ（軽鎖相補決定領域）を含む。したがって、結合メンバーは、複数の
関連したフレームワーク領域に加えて、順にＶＨ ＣＤＲ１（またはＨＣＤＲ１），ＣＤ
Ｒ２（ＨＣＤＲ２）およびＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）領域を含むＶＨ領域を含むことができ
る。結合メンバーは、付加的にまたは選択的に関連したフレームワーク領域と、ＶＬ Ｃ
ＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含むＶＬ領域を含む。通常、ＶＨまたはＶＬ領域
は、３の相補決定領域に散在する ４フレームワーク領域ＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３および
ＦＲ４を以下の配列：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
で含む。
軽鎖の可変領域（ＶＬ）は、抗体または結合断片の結合特異性を与える３相補性決定領
域（ＣＤＲ）を含む。相補性決定領域は、超可変領域としても既知である。３の相補性決
定領域は、以下の配列番号：７、配列番号：８および配列番号：９としても示し、これら
は、ＶＬＣＤＲ１，ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３に関連する。
Figure 2016025863
図１Ａは、配列番号：１に示すような本発明の抗体ＶＬ領域のアミノ酸配列を示す。図
１Ｂは、軽鎖の可変ヌクレオチド配列、および推測されるアミノ酸配列を示す。ＶＬＣＤ
Ｒ１，ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３領域の部位は、図１Ａに個々の相補性決定領域（
ＣＤＲ）を含む適切なアミノ酸残基に下線で示される。
図１Ｂにおいて、軽鎖の可変領域の残基は、Kabat et al.(Kabat,E.A., Wu1TT., Perry
,H., Gottesman,K. and Foeller,C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological I
nterest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242)のナンバリングシステムによっ
て容易に計数可能である。カバットナンバリングシステムは、通常、可変領域の残基を示
す場合に使用される（軽鎖の約残基１−１０７および重鎖の残基１−１１３）。このナン
バリングシステムは、他のシステムが明示されない限り、本明細書おいて使用される。カ
バット残基表示は、必ずしも、直接、本発明の重鎖および軽鎖の可変領域アミノ酸残基に
相当するものでもない。重鎖または軽鎖の基本的な可変領域構造のフレームワーク領域ま
たは相補性決定領域（ＣＤＲ）であるかに関わらず、実際の直鎖アミノ酸配列は、構造成
分の減縮またはその中への挿入に相当する厳しいカバットナンバリングより少ないか、付
加的なアミノ酸を含むことができる。正しいカバットナンバリング残基は、カバットナン
バリングが適用される正常な配列で抗体の配列の残基のアライメントによって、あらゆる
所定の抗体に関して決定することができる。
ＶＬＣＤＲ１（ＶＬ−ＣＤＲ１、軽鎖の可変領域の相補性決定領域１またはＣＤＲ−Ｌ
１としても既知）は、図１Ａに示すような、軽鎖可変領域配列の残基２４から３８に存在
する１５アミノ酸からなる。これらの残基は、図１Ｂに残基２４から３４として示し、十
分な説明としては、残基２７，２７ａ，２７ｂ，２７ｃおよび２７ｄを挙げる。それゆえ
に、ＶＬＣＤＲ１の場合、１５残基は、カバットによる規定のＣＤＲＬ１領域と等しいよ
うに選択される。
図１Ａに示すように、ＶＬＣＤＲ２（ＶＬ−ＣＲＤ２、軽鎖の可変領域の相補性決定領
域２またはＣＤＲ−Ｌ２としても既知である）は、７アミノ酸残基からなり、図１Ｂに示
すように、可変領域配列の残基５０から５６に位置する。これらの残基は、カバットによ
る規定のＣＤＲＬ２領域に等しいと理解される。
図１Ａに示すように、ＶＬＣＤＲ３（ＶＬ−ＣＲＤ３、軽鎖の可変領域の相補性決定領
域３またはＣＤＲ−Ｌ３）は、９アミノ酸残基からなり、図１Ｂに示すように、軽鎖の可
変領域配列の場合、残基８９から９７に位置する。これら残基は、カバットによる規定の
ＣＤＲＬ３領域に等しいと理解されるように、完全に残基８９から９７に相当する。
重鎖（ＶＨ）の可変領域は、抗体または抗体断片の特異的結合を与える役割を果たす３
相補性決定領域（ＣＤＲ）も含む。３相補性決定領域は、以下の配列番号：１０、配列番
号：１１および配列番号：１２として示し、これらはＶＨＣＤＲ１，ＶＨＣＤＲ２および
ＶＨＣＤＲ３に関連する。
Figure 2016025863
図２Ａは、配列番号：２に示すようなＶＨ領域のアミノ酸配列を示す。図２Ｂは、重鎖
の可変ヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列を示す。
図２Ｂにおいて、重鎖可変領域の残基は、カバット（前記参照）の考案した系に従って
、従来通りに計数する。ＶＨＣＤＲ１，ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３領域の位置は、
図２Ａにおいて、下線を付した位置が適切なアミノ酸残基である。
ＶＨＣＤＲ１（ＶＨ−ＣＤＲ１、重鎖の可変領域の相補性決定領域１またはＣＤＲ−Ｈ
１としても既知である）は、可変領域配列の残基３１から３５に存在する５アミノ酸残基
からなる。これら残基は、カバットによる規定のＣＤＲＨ１領域に等しいと理解され、完
全に残基３１から３５に相当する。
ＶＨＣＤＲ２（ＶＨ−ＣＲＤ２、重鎖の可変領域の相補性決定領域２またはＣＤＲＨ２
）は、１７のアミノ酸残基からなり、可変領域配列の残基５０から６５に位置する。これ
らの残基は、カバットによる規定のＣＤＲＨ ２領域に等しいと理解され、完全に残基５
０から６５に相当する。
ＶＨＣＤＲ３（ＶＨ−ＣＲＤ２、重鎖の可変領域の相補性決定領域３またはＣＤＲＨ３
）は、９のアミノ酸残基からなり、軽鎖の可変領域配列の場合、可変領域配列の残基９５
から１０３に位置する。図２Ｂに図示すように、カバット由来のＣＤＲＨ３領域のＣＤＲ
Ｈ３領域の残基１００にそろえるように考慮された位置１００および１００ａにおける２
残基の存在のため、これら９残基は、カバットによる規定のＣＤＲＨ２領域の８残基に完
全に相当する。
双方のセットのＣＤＲが存在する場合、軽鎖のＣＤＲは、抗体または抗体結合断片の結
合特異性を与える重鎖のＣＤＲと連結する。軽鎖の可変領域の結合エネルギーへの関与は
、連結する重鎖の可変領域と比較して小さいことは知られている。したがって、３つの相
補性決定領域（ＶＨＣＤＲ１，ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３）を順に含む単離された
重鎖領域は、抗原結合性能を有していることが知られていて、単一領域抗体として一般的
に示される。かかる抗体断片は、本発明によって、重鎖の可変領域の条件に基づいて、例
えば配列番号：１に規定されるように提供する。
他の様々な態様において、本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２，ＴＬＲ−２，Ｃ
Ｄ２８２）に特異的な結合を有していて、配列番号：７から配列番号１２を含む群から選
択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むか、それからなるかまたは実質的にそれか
らなる完全なヒト化抗体、または関連する結合メンバーにまでも及ぶ。ある実施形態にお
いて、結合メンバーは、配列番号：１０，１１および１２のアミノ酸配列を含む。他の実
施形態において、順番に、配列番号：１０、配列番号：１１および配列番号１２を含むか
、それからなるか、実質的にそれからなる結合メンバーを提供する。ある実施形態におい
て、それぞれ配列番号：１０、配列番号：１１および配列番号：１２は、順にその間にフ
レームワーク領域を散在して提供することができる。
ある実施形態において、ＶＨまたはＶＬ領域のアミノ酸配列は、少なくとも１の復帰突
然変異を有していてもよく、前記復帰突然変異は、配列の特定の位置でのアミノ酸残基の
置換であり、ヒト化抗体またはその断片のＴＬＲ２への結合特異性を高める、および／ま
たはＴＬＲ２拮抗剤としてのヒト化抗体の治療効果を上昇する。通常、かかる修飾は、軽
鎖および重鎖の可変領域内のフレームワークに作ることができ、抗体の免疫性を減少させ
る。ある実施形態において、さらなる工学技術は、本発明の抗体を修飾するために使用す
ることができ、例えば血清の半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存
的な細胞障害活性Ｆｃ領域の修飾を含む。さらに、ある実施形態において、抗体または抗
体断片は、グリコシル化パターンを換えて産生することができる。ある実施形態において
、本発明の抗体は、抗体がグリコシル化される範囲を増減するために変更される。ポリペ
プチドのグリコシル化は、通常、Ｎ−結合またはＯ−結合のいずれかである。Ｎ−結合は
、アスパラギン残基の側鎖に炭水化物成分が結合したものとして示す。トリペプチド配列
アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（Ｘは、プロリン以外の
いずれのアミノ酸であってもよい）は、、炭水化物成分のアスパラギン側鎖への酵素結合
のための認識配列である。したがって、ポリペプチド内のこれらトリペプチド配列のいず
れかの存在は、潜在的グリコシル部位を生じる。Ｏ−結合グリコシル化は、１糖鎖のＮ−
アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースの最も一般的なセリンまたはト
レオニンであるヒドロキシアミノ酸への結合を示すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５
−ヒドロキシリジンも使用することができる。
あるさらなる実施形態において、抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体で
抗体を反応させることによりペグ化されていてもよい。ある実施形態において、抗体は、
脱フコシル化されており、したがって、フコース残基を欠失している。
ある実施形態において、抗体の生物学的特徴における修飾は、（ａ）置換領域における
ポリペプチド骨格構造、例えばシートまたはヘリカル構造、（ｂ）標的部位での分子の電
荷若しくは疎水性、または（ｃ）嵩高側鎖に影響を及ぼす置換基を選択することによって
達成することができる。アミノ酸は、それら側鎖の類似する特徴に基づいて分類すること
ができる（A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publish
ers, New York (1975) ）：（１）非極性：Ａｌａ（Ａ），Ｖａｌ（Ｖ），Ｌｅｕ（Ｌ）
，Ｉｌｅ（Ｉ），Ｐｒｏ（Ｐ），Ｐｈｅ（Ｆ），Ｔｒｐ（Ｗ），Ｍｅｔ（Ｍ）；（２）非
荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ），Ｓｅｒ（Ｓ），Ｔｈｒ（Ｔ），Ｃｙｓ（Ｃ），Ｔｙｒ（Ｙ），
Ａｓｎ（Ｎ），Ｇｌｎ（Ｑ）；（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ），Ｇｌｕ（Ｅ）；（４）塩基：
Ｌｙｓ（Ｋ），Ａｒｇ（Ｒ），Ｈｉｓ（Ｈ）。或いは、自然に発生する残基は、一般的な
側鎖の特徴に基づいてグループに分けることができる：（１）疎水性：ノルロイシン，Ｍ
ｅｔ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｈｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ａ
ｓｎ，Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ，Ｇｌｕ；（４）塩基：Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ；（
５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ，Ｐｒｏ；（６）芳香族：Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｐｈ
ｅ。非保存的置換は、これらの１クラスを他のクラスのメンバーに交換することを伴う。
かかる置換残基は、保存的置換部位または残りの部位（例えば非同類）に導入することが
できる。
あるさらなる態様において、本発明は、ヒト化抗体またはその断片の形成における配列
番号：１のＶＬ領域および／または配列番号：４のＶＨ領域の使用を含み、前記抗体また
は断片は、Ｔｏｌｌ様受容体２に特異的な結合を有していて、前記抗体または断片は、Ｔ
ｏｌｌ様受容体２の機能的活性に拮抗するように機能する。
あるさらなる実施形態において、本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体２への特異的結合を有し
ていて、ＴＬＲ２拮抗剤として機能する結合メンバー、配列番号：１もしくは配列番号：
４のアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、よ
り好ましくは少なくとも９５％、および最も好ましくは少なくとも９８％の相同性のアミ
ノ酸配列を有する配列を含むか、それからなるか、または、実質的にそれからなる前記結
合メンバーにまでも及ぶ。
あるさらなる態様において、本発明は、以下の例を特徴とするＯＰＮ−３０５として指
定される完全なヒト化モノクローナル抗体にまでも及ぶ。ＯＰＮ−３０５の軽鎖の可変領
域（ＶＬ）のアミノ酸配列は、配列番号：１に示す。一方、ＯＰＮ−３０５の重鎖の可変
領域（ＶＨ）のアミノ酸配列は、配列番号：４に示す。さらに、ＯＰＮ−３０５の重鎖ア
ミノ酸配列は、配列番号：５、さらにＯＰＮ−３０５の軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号
：２に示す。
抗体は、組換えを用いた手段、例えば細胞培養によって産生してもよく、或いは、抗体
は、単離された抗体であってもよい。ある実施形態において、さらなる修飾が、重鎖のＦ
ｃ部位、特に抗体のＣＨ２およびＣＨ３の定常領域になされる。かかる実施形態において
、抗体は、配列番号：２のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号：４のアミノ酸配列
を含む重鎖の可変領域を含む。ある実施形態において、結合断片は、ＯＰＮ−３０５の完
全なヒト化抗体、例えばＦａｂ断片、Ｆ’ａｂ断片またはｓｃ−Ｆｖに由来してもよい。
さらなる様々な態様において、本発明は、本開示の抗体を含む免疫複合体、またはパー
トナー分子に結合する、その抗原結合部位も包含する。ある実施形態において、かかる抗
体パートナー分子結合は、化学リンカー例えばペプチジルリンカー、ヒドラジンリンカー
またはジスルフィドリンカーによって結合される。ある実施形態において、カップリング
パートナーは、エフェクター分子、標識、薬剤またはキャリア分子である。
本発明の抗体をペプチジルおよび非ペプチジルの双方のカップリングパートナーにカップ
リングする適切な技術が、当業者に既知である。適切な標識の例としては、放射性標識等
の検出可能な標識、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素標識またはビオチン等の化学部
分を含む。或いは、標識は機能標識、例えばリシンまたはプロドラッグを活性ドラッグに
抗体結合部位で変換することができるプロドラッグであってもよい。
さらなる様々な態様において、本発明は、前記抗体またはその抗原結合部位より異なる
結合特異性を有する第２機能部分に結合した抗体、またはその抗原結合部位も包含する。
あるさらなる態様において、本発明は、モノクローナル抗体ＯＰＮ−３０５のように、
Ｔｏｌｌ様受容体２の細胞外領域に存在する同じエピトープに特異的に結合する抗体、ペ
プチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド模倣薬または有機化合物由来のモノクローナル抗
体、結合断片も包含する。ここで、モノクローナル抗体はＴ２．５として市販される抗体
ではない。通常、化合物によって特異的に結合するエピトープは、配列番号：１３および
／または配列番号：１４のアミノ酸配列を含む。前記化合物は、ここに開示した抗体と、
Ｔｏｌｌ様受容体２への結合に関して、同じエピトープで交差競合する性能を有する。こ
のような化合物は、本発明の抗体、例えばＯＰＮ−３０５に対して実施することができる
交差競合結合研究方法によって同定することができる。
さらなる様々な態様において、本発明は、完全なヒト化抗体の使用を包含し、Ｔｏｌｌ
様受容体２の活性および／または細胞内シグナリングが全体的または部分的に介在するこ
とによる、疾患または状態の予防および／または治療における、本発明に由来する完全な
ヒト化モノクローナル抗体または結合メンバーも包含する。
ある実施形態において、ＴＬＲ２介在による疾患または状態は炎症状態である。
ある実施形態において、結合メンバーは、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ（短鎖
可変断片）、ペプチド模倣薬、ジアボディまたは関連する多価誘導体を含む群から選択さ
れるが、制限しない。
Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片は、技術分野における当業者に周知であり
、国際公開第92/22324号, Sawai et al., "Direct Production of the Fab Fragment Der
ived From the Sperm Immobilizing Antibody Using Polymerase Chain Reaction and CD
Na Expression Vectors", 1995, AJRI 34:26-34,およびMullinax et al., "Expression o
f a Heterodimeric Fab Antibody Protein in One Cloning Step", 1992, BioTechniques
12(6):864-869およびBetter et al., "Escherichia coli Secretion of an Active Chim
eric Antibody Fragment" 1988, Science 240:1041 -1043に開示したものを含め、その内
容を本明細書に参考として組み込む。
ｓｃＦｖ（短鎖Ｆｖ断片）を産生することができる技術例は、Huston et al., "Protei
n Engineering of Single-Chain Fv Analogs and Fusion Proteins", Methods in Enzymo
logy, vol. 203:46-88 (1991)に開示した内容を参照して組み込む。
ある実施形態において、抗体断片は、Morimoto(Morimoto et al., "Single-step purif
ication of F(ab').sub.2 fragments of mouse monoclonal antibodies (immunoglobulin
s G1 ) by hydrophobic interaction high performance liquid chromatography using T
SKgel Phenyl-5PW" Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (199
2))の方法によるタンパク質分解による全長抗体に由来することができる。抗体断片は、
すぐに宿主細胞から直接産生することができる (Carter et al., "High level Escherich
ia coli expression and production of a bivalent humanized antibody fragment" Bio
/Technology 10:163-167 (1992)参考)。
様々な態様において、本発明は、全体的にまたは部分的にＴｏｌｌ様受容体２に介在さ
れる炎症状態の治療および／または予防の方法を提供し、前記方法は、
−本発明による治療への有効量のヒト化抗体またはその結合断片を提供する工程および
−そのような治療の必要な対象にそれを投与する工程
を備える。
ある実施形態において、方法は、本発明による２，３，４以上の抗体を含む多価単一特
異的抗原結合タンパク質の投与を伴う。
本発明のさらに他の態様は、少なくとも１の薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤また
は賦形剤と共に本発明によるヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、その抗原結合部位
、免疫複合体または二重特異性分子を提供する。
ある実施形態において、剤形は液体剤形、凍結乾燥された剤形、液体として再構成され
た凍結乾燥された剤形またはエアゾール剤形である。ある実施形態において、抗体製剤は
、濃度：約０．５ｍｇ／ｍＬから約２５０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬから約４５ｍ
ｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬから約２０
０ｍｇ／ｍＬまたは約５０ｍｇ／ｍＬから約２５０ｍｇ／ｍＬである。
ある実施形態において、さらに処方はバッファーを含む。通常、製剤ｐＨは約ｐＨ５．
５から約ｐＨ６．５である。
ある実施形態では、バッファーは、約４ｍＭから約６０ｍＭのヒスチジンバッファー、
約５ｍＭから約２５ｍＭのコハク酸バッファー、または約５ｍＭから２５ｍＭの酢酸バッ
ファーを包含することができる。ある実施形態において、バッファーは、塩化ナトリウム
を濃度約１０ｍＭから３００ｍＭ、特に約１２５ｍＭ、クエン酸ナトリウムを濃度約５ｍ
Ｍから５０ｍＭ、特に２５ｍＭ含む。ある実施形態において、処方は、界面活性剤を約０
％から約０．２％さらに含む。ある実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベート−
２０、ポリソルベート−４０、ポリソルベート−６０、ポリソルベート−６５、ポリソル
ベート−８０、ポリソルベート−８５およびそれらの組み合わせからなる群から選択され
るが、これらに制限されるものではない。好ましい実施形態において、界面活性剤は、ポ
リソルベート−２０である。ある実施形態において、処方は、約０．００１％から約０．
０５％のＴｗｅｅｎをさらに含み、塩化ナトリウムを濃度約１２５ｍＭ、クエン酸ナトリ
ウムを濃度約２５ｍＭでさらに含む。
ある実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１の免疫調節性化合物、例えば免疫
抑制化合物、二次抗体もしくはその断片または組換えタンパク質をさらに含むか、対象に
投与される。
本発明の抗体が、Ｔｏｌｌ様受容体２を発現する細胞を標的として、結合するように使
用される場合、本発明の抗体および結合メンバーも診断、例えばｉｎ ｖｉｖｏ診断およ
びＴｏｌｌ様受容体２を伴う疾患状態のイメージングに使用することもできる。さらに、
ある実施形態において、二次分子または化合物は、Ｔｏｌｌ様受容体２を発現する細胞に
二次分子または細胞を標的とするために使用する際、本発明の抗体に結合することができ
る。
尚、ある態様において、本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体２を介在した炎症の状態、もしく
は疾患を治療または予防するためのキットを提供する。ある実施形態において、キットは
、Ｔｏｌｌ様受容体２に結合することができ、その機能活性に拮抗することができる本発
明による抗体またはその抗原結合断片およびそれを患者に投与するための説明書を含む。
さらに他の態様によると、ヒト化中和抗体またはその抗原結合部位が提供され、抗体は
、ＫＤ１×１０−８未満で哺乳類Ｔｏｌｌ様受容体２に特異的に結合するが、ＣＤ３２（
Ｆｃγ受容体ＩＩ）に結合せず、前記抗体は、Ｔ２．５として市販される抗体によって結
合するような、Ｔｏｌｌ様受容体２の細胞外領域に存在する同じエピトープに特異的に結
合する。
さらに他の態様によると、ＫＤ１×１０−８未満で哺乳類Ｔｏｌｌ様受容体２のエピト
ープに結合し、ＣＤ３２（Ｆｃγ受容体ＩＩ）に結合しない、単離されたモノクローナル
抗体またはその抗原結合部位が提供され、エピトープは参照抗体に認識され、参照抗体は
、配列番号：４のアミノ酸配列を含む重鎖の可変領域、および配列番号：１のアミノ酸配
列を含む軽鎖の可変領域を含む。
さらに他の態様によると、哺乳類Ｔｏｌｌ様受容体２に特異的に結合し、以下の特徴を
示す単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部位が提供される：
−ＫＤ１×１０−８未満で哺乳類Ｔｏｌｌ様受容体２に結合する、
−ＣＤ３２（Ｆｃγ受容体ＩＩ）に結合しない、
−ヒトＴｏｌｌ様受容体２、ネズミＴｏｌｌ様受容体２およびサルＴｏｌｌ様受容体２に
交差反応性である。
＜Ｆａｂ結合メンバー＞
本発明の前記態様のある実施形態において、本発明は、抗体断片または抗体の抗原結合
部位を提供する。結合断片の例は、ヘテロ四量体抗体ＶＬ，ＶＨ，ＣＬおよびＣＨ１領域
からなるか、実質的にそれからなる一価断片のＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断
片を含む。ある実施形態において、ＶＬ領域は配列番号：１のアミノ酸配列を有していて
、ＶＨ領域は配列番号：４のアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、ＣＬおよび
ＣＨ１領域は、免疫グロブリンのサブクラスＩｇＧ、およびアイソタイプＩｇＧ４のＣＬ
、並びにＣＨ１領域のアミノ酸配列に基づくものであるか、図５の配列番号：５に示すよ
うなＣＬおよびＣＨ１領域である。ある実施形態において、本発明のこの実施形態のＦａ
ｂ断片は、ブドウ膜炎およびＡＭＤ（加齢性黄斑変性症）を挙げる乾癬、皮膚炎および眼
疾患（ただし、これらに制限されない）の治療または予防に使用することができる。
＜単一領域結合メンバー＞
ＴＬＲ２に特異的な結合を有し、ＴＬＲ２機能に拮抗するヒト化モノクローナル抗体を
提供するのに加えて、本発明は、さらに配列番号：１に規定するようなＶＬ（軽鎖可変）
領域のアミノ酸配列および配列番号：４に規定するようなＶＨ（重鎖可変）領域のアミノ
酸配列に基づく結合領域の一組を含む抗体以外の結合メンバーも包含する。特に、本発明
は、本発明の抗体のヒト化抗体のＶＬまたはＶＨ領域のいずれかに基づく単一結合領域に
までも及ぶ。
したがって、本発明のさらなる実施形態において、本発明のヒト化抗体由来の単一結合
領域を含むか、それからなるか、実質的にそれからなる結合メンバーが提供される。ある
実施形態において、単一結合領域は、配列番号：４に規定するようなＶＨ（重鎖の可変領
域）のアミノ酸配列由来である。免疫グロブリンＶＨ領域が特定の方法において標的抗原
に結合することができることが既知であるように、かかる結合領域は、ＴＬＲ２への標的
剤として使用することができる。
＜ＣＤＲ残基の修飾＞
従来技術における当業者であれば、相補領域の配列（配列番号：７，８，９，１０，１
１および１２）を理解し、並びに、超可変および可変領域の配列は、ＴＬＲ２特異的に結
合する性能を欠失することなく修飾することができるであろう。例えば、本発明のヒト化
抗体由来の結合メンバーのＣＤＲ領域は、ここに規定した配列番号：７，８，９，１０，
１１および１２のアミノ酸配列と相同性があるか、非常に高い相同性を有する（例えば９
５％以上の同一な配列）。ここに規定する「非常に相同性がある」の用語は、１から５ア
ミノ酸の置換が、ＣＤＲの配列にされることを意味する。ある実施形態において、個々の
ＣＤＲ，超可変領域または可変領域およびそれらの非修飾対応物に存在する相同性は、少
なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％、および最も好ま
しくは９８％を超える。かかる修飾配列は、本発明の範囲内に分類され、例えば修飾した
か、相同する欠乏メンバーは、ＴＬＲ２に特異的に結合する能力を保持し、その機能活性
に拮抗する。
＜ポリヌクレオチド＞
また、様々な態様において、本発明は、本発明のヒト化抗体、抗体断片および結合メン
バーをコード化するポリヌクレオチド、特に単離されたポリヌクレオチドも包含する。
したがって、本発明のさらなる態様において、配列番号：１および／または配列番号：
４のアミノ酸配列をコード化するポリヌクレオチドが提供される。ある実施形態において
、ポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。
ここに規定する「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖領
域と二本鎖領域が混在したＲＮＡを含むが、制限しない非修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡ、
または修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡである、いずれのポリリボヌクレオチドまたはポリ
デオキシリボヌクレオチドも包含する。
本発明のポリヌクレオチド、例えば配列番号：１または配列番号：４のアミノ酸配列を
含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、適度または高度に厳しい条件下、
かかるヌクレオチド配列とハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドを含むその対立遺伝
子多型および／またはそれらの補足体を含む。
さらになる様々な態様において、本発明は、配列番号：１および／または配列番号：４
を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターにまでも及ぶ。
さらに、本発明は、かかるベクターで形成転換した宿主細胞にまでも及ぶ。
＜ハイブリドーマ細胞株＞
本発明のさらに他の態様は、配列番号：１のアミノ酸配列の重鎖可変領域および配列番
号：４の軽鎖の可変アミノ酸配列を有する抗体を発現するハイブリッド細胞株（ハイブリ
ドーマ）を提供する。
本発明による抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列である、配列番号：１を示す図である。 軽鎖の可変ヌクレオチド配列（配列番号：１７）を示し、カバットにしたがって計数した、推定されるアミノ酸配列（配列番号：１８）を示す図である。 本発明による抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列である、配列番号：４を示す図である。 重鎖の可変ヌクレオチド配列（配列番号：１９）を示し、カバットにしたがって計数した、推定されるアミノ酸配列（配列番号：２０）を示す図である。 本発明による抗体の軽鎖のアミノ酸配列を表す配列番号：２を示す図である。 配列番号：２のアミノ酸配列をコード化するために翻訳することができる核酸配列を示す配列番号：３を示す図である。 本発明による抗体の重鎖のアミノ酸配列である配列番号：５を示す図である。 配列番号：５のアミノ酸配列をコード化するために翻訳することができる核酸配列である配列番号：６を示す図である。 ヒトＴｏｌｌ様受容体２のアミノ酸配列を提供する配列番号：１５を示す図である。 ネズミＴｏｌｌ様受容体２のアミノ酸配列を提供する配列番号：１６を示す図である。 ＯＰＮ−３０５により媒介されるＴｏｌｌ様受容体２拮抗剤は、コントロールヤギ抗体の添加を示す群１、ヤギ抗ｈＣＤ２１ブロッキング抗体の添加を示す群２およびヤギ抗ｈＣＤ３２ｂブロッキング抗体の添加を示す群３とのＣＤ３２抗体結合に依存しないことを示す図である。 ＯＰＮ３０１モノクローナル抗体によって介在されるＴｏｌｌ様受容体２拮抗剤が、ＣＤ３２への抗体結合に依存することを示す図である。 ＯＰＮ−３０５によって介在されるＴｏｌｌ様受容体２拮抗剤は、ＣＤ３２への抗体結合に依存しないことを示す図である。 ＯＰＮ−３０５がヒトＴｏｌｌ様受容体２に特異的に結合することを示すＦＡＣＳ分析の結果を示す図である（図１１Ａ）。一方、ＩｇＧ４アイソタイプコントロール抗体は、Ｔｏｌｌ様受容体２に結合するため、ＯＰＮ−３０１と競合しない（図１１Ｂ）。 ＯＰＮ−３０５（ＯＰＮ−３０５−２１）は、ネズミＯＰＮ−３０１抗体と同じ方法で、ネズミＴＬＲ２反応を抑制することを示す図である。 顆粒球（図１３Ａ）および単球（図１３Ｂ）で発現するＯＰＮ−３０５が、サルＴＬＲ２に結合するが、リンパ球では発現しない（図１３Ｃ）ことを示す３つのＦＡＣＳの微量分析を示す図である。 顆粒球（図１３Ａ）および単球（図１３Ｂ）で発現するＯＰＮ−３０５が、サルＴＬＲ２に結合するが、リンパ球では結合しない（図１３Ｃ）ことを示す３つのＦＡＣＳの微量分析を示す図である。 顆粒球（図１３Ａ）および単球（図１３Ｂ）で発現するＯＰＮ−３０５が、サルＴＬＲ２に結合するが、リンパ球では結合しない（図１３Ｃ）ことを示す３つのＦＡＣＳの微量分析を示す図である。 抗ＴＬＲ２ネズミモノクローナル抗体ＯＰＮ−３０１とＯＰＮ−３０５が、サルＴＬＲ２の結合のために競合することを示す２つのＦＡＣＳの微量分析を示す図であり、図１４（Ａ）は顆粒球および図１４（Ｂ）は単球に関する結果を示す図である。 抗ＴＬＲ２ネズミモノクローナル抗体ＯＰＮ−３０１とＯＰＮ−３０５が、サルＴＬＲ２の結合のために競合することを示す２つのＦＡＣＳの微量分析を示す図であり、図１４（Ａ）は顆粒球および図１４（Ｂ）は単球に関する結果を示す図である。 サイズ排除クロマトグラフィを１６／６０Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００カラムで精製された微量の抗体サンプルを示す図である。図１５（Ａ）は、抗ＴＬＲ２キメラ抗体を示し、図１５（Ｂ）は、ＯＰＮ３０５抗体（ＶＫ５／ＶＫ４）を示す。それぞれの場合、Ｂ８からＢ４にわたる一部分のモノマーピークが採取された。 サイズ排除クロマトグラフィを１６／６０Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００カラムで精製された微量の抗体サンプルを示す図である。図１５（Ａ）は、抗ＴＬＲ２キメラ抗体を示し、図１５（Ｂ）は、ＯＰＮ３０５抗体（ＶＫ５／ＶＫ４）を示す。それぞれの場合、Ｂ８からＢ４にわたる一部分のモノマーピークが得られた。 細胞毒性に関するテストサンプルのプレスクリーンおよび４つのドナーサンプルにおけるＴ細胞調節の活性を示す図である。サンプル１（それぞれの群の第１カラム（黒バー））はキメラ抗ＴＬＲ２抗体、サンプル２（それぞれの群の第２カラム（白バー））はＶＫ５／ＶＨ４（ＯＰＮ３０５）であり、サンプル３（第３バー（濃いグレー））はＫＬＨと共にＶＫ５／ＶＨ５として指定された比較抗体である、一方、サンプル４（それぞれの群の右側の第４バー（薄いグレー））はＫＬＨのみのコントロールである。結果は、７日目の生存細胞の数を示す。ＫＬＨの存在下でインキュベートされたサンプルのＳ．Ｉ．は、ＫＬＨのみのものと比較された。Ｓ．Ｉ．は４日間に亘るサンプリング期間で平均された。ＳＩ≧２を有する肯定的な反応を決定するためのカットオフ。 ＥｐｉＳｃｒｅｅｎテストの結果を示す３つのバーチャートを示す図である。キメラ抗ＴＬＲ２，ＶＫ５／ＶＨ４およびＶＫ５／ＶＨ５抗体は、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）の時間経過において、２１のドナーからのＰＢＭＣを用いたＴ細胞分析をテストされた。テスト抗体とインキュベートされたＰＢＭＣのバルク培養は、５，６，７および８日目にサンプルされ、３Ｈ−チミジンを適用された。細胞は、収集され、放射能を組み込まれ、シンチレーション計数で測定された。それぞれ３倍のサンプルに関する結果は、平均され、刺激指数（ＳＩ）で転換して正常化された。それぞれのドナーでのそれぞれの時点のＳＩは、（ａ）キメラ抗体に関して前記に示す。ＳＩ≧２を有する肯定的な反応を決定するためのカットオフは、濃い黒い横線でハイライトして、著しい反応（ｔ−検定ｐ＜０．０５）は、（＊）で示す。 ＥｐｉＳｃｒｅｅｎテストの結果を示す３つのバーチャートを示す図である。キメラ抗ＴＬＲ２，ＶＫ５／ＶＨ４およびＶＫ５／ＶＨ５抗体は、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）の時間経過において、２１のドナーからのＰＢＭＣを用いたＴ細胞分析をテストされた。テスト抗体とインキュベートされたＰＢＭＣのバルク培養は、５，６，７および８日目にサンプルされ、３Ｈ−チミジンを適用された。細胞は、収集され、放射能を組み込まれ、シンチレーション計数で測定された。それぞれ３倍のサンプルに関する結果は、平均され、刺激指数（ＳＩ）で転換して正常化された。それぞれのドナーでのそれぞれの時点のＳＩは、（ｂ）ＯＰＮ−３０５抗ＴＬＲ２抗体（ＶＫ５Ａ／Ｈ４と指定する）に関して前記に示す。ＳＩ≧２を有する肯定的な反応を決定するためのカットオフは、濃い黒い横線でハイライトして、著しい反応（ｔ−検定ｐ＜０．０５）は、（＊）で示す。 ＥｐｉＳｃｒｅｅｎテストの結果を示す３つのバーチャートを示す図である。キメラ抗ＴＬＲ２，ＶＫ５／ＶＨ４およびＶＫ５／ＶＨ５抗体は、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）の時間経過において、２１のドナーからのＰＢＭＣを用いたＴ細胞分析をテストされた。テスト抗体とインキュベートされたＰＢＭＣのバルク培養は、５，６，７および８日目にサンプルされ、３Ｈ−チミジンを適用された。細胞は、収集され、放射能を組み込まれ、シンチレーション計数で測定された。それぞれ３倍のサンプルに関する結果は、平均され、刺激指数（ＳＩ）で転換して正常化された。それぞれのドナーでのそれぞれの時点のＳＩは、（ｃ）ＶＫ５Ａ／Ｈ５と指定する比較抗ＴＬＲ２抗体に関して前記に示す。ＳＩ≧２を有する肯定的な反応を決定するためのカットオフは、濃い黒い横線でハイライトして、著しい反応（ｔ−検定ｐ＜０．０５）は、（＊）で示す。 ＥＰＩＳＣＲＥＥＮ（商標）技術を用いて予測した免疫性および臨床状態で観測される免疫性の比較を示す図である。１６の治療的タンパク質は、それら免疫性の相対危険度をＥＰＩＳＣＲＥＥＮ（商標）技術を用いてテストされた。結果は、臨床において使用される際のそれぞれのタンパク質に関して観測された免疫性の頻度（抗治療的抗体の反応）に対してプロットされた（ＰｕｂＭｅｄに基づくデータ）。回帰線および相関係数を示す。 ＯＰＮ−３０５の抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体（配列番号：２２）およびＴ２．５ネズミ抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体（配列番号：２１）の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列のアライメントを示す図であり、測定された配列の同一性は８９．２％として示される。 ＯＰＮ−３０５の抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体（配列番号：２４）およびＴ２．５ネズミ抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体（配列番号：２５）の重鎖の可変領域のアミノ酸配列のアライメントを示す図であり、測定された配列の同一背は８８．１％として示される。 ＴＬＲ２依存シグナリングの完全阻害は、ＯＰＮ−３０５の最大より少ない受容体結合で達成することができることを示す。ＮＦ−κＢ活性の阻害は、Ｐａｍ３Ｃｓｋ４での処理後に用量依存的な方法で観測される（図２１ＡおよびＢ）。 ＴＬＲ２依存シグナリングの完全阻害は、ＯＰＮ−３０５の最大より少ない受容体結合で達成することができることを示す。ＮＦ−κＢ活性の阻害は、Ｐａｍ３Ｃｓｋ４での処理後に用量依存的な方法で観測される（図２１ＡおよびＢ）。 ＯＰＮ３０５は、濃度２μｇ／ｍＬでＮＦ−κＢをほぼ完全に阻害する（図２１Ｃ）。 図２２Ａは、ＮＦ−κＢ依存性の［Ｐａｍ３ＣＳＫ４］に対するＳＥＡＰ活性を示す、一方、図２２Ｂは、１／Ｓに対する１／Ｖのラインウィーバー・バークプロットを示す。 Ｔｏｌｌ様受容体を介在したフラジェリン（ＴＬＲ５，図２３Ｃ）およびＬＰＳ（ＴＬＲ４，図２３Ｂ）への反応を示す３つのチャートＡ，ＢおよびＣは、ＯＰＮ−３０５にさらされていないコントロール細胞と比較して、変わらなかった。予想通り、Ｔｏｌｌ様受容体２を介在したＰａｍ３ＣＳＫおよびＦＳＬ−１への反応は、ＯＰＮ−３０５によってブロックされた（図２３Ａ）。これは、ＯＰＮ−３０５が予期しないＴＬＲ４またはＴＬＲ５のリガンドへの反応性に増減をもたらさないことを示唆する。 ＯＰＮ−３０５モノクローナル抗体は、Ｐａｍ３Ｃｓｋ４によって誘発された敗血症を阻害することを示す図である。雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの群（ｎ＝４）は、１００μｇのＰａｍ３Ｃｓｋ４で処理する３０分前、ＯＰＮ−３０５で示される服用量で処理された。 ＯＰＮ３０５は、Ｐａｍ３Ｃｓｋ４によって誘発された敗血症を阻害することを示す図である。この実験において、ＯＰＮ３０５は、１００μｇのＰａｍ３Ｃｓｋ４の腹腔内投与３０分前に静脈内投与された。４時間後、マウスは、致死麻酔によって屠殺され、血液が採取された。血清は誘導され、サイトカイン濃度はＥＬＩＳＡで測定された。血清はＫＣおよびＩＬに関して１／１０、ＩＬ−６ＥＬＩＳＡに関して１／５希釈された。 ＴＬＲ２はラットの肺胞マクロファージ（ＮＲ８３８３）で発現され、ＯＰＮ３０５を用いて検出された。（Ａ）非染色細胞、（Ｂ）陽性対象；ポリクローナルラビット抗ラットＴＬＲ２一次抗体、二次抗体は抗ラビットＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ４８８であった、（Ｃ）ポリクローナルヒトＩｇＧ４で処理された細胞、二次抗体はヒト抗ＩｇＧ４ ＰＥであった、（Ｄ）ＯＰＮ３０５染色した細胞、二次抗体抗ヒトＩｇＧ４ＰＥ。 ＴＬＲ２は、ブタＰＢＭＣで発現され、ＯＰＮ３０５で染色された。ＰＢＭＣはＦｉｃｏｌｌを用いて単離して精製された。Ａ−ＣはＰｇ ６６６からのＰＢＭＣを示し、Ｄ−ＦはＰｉｇ ４８８である。Ａ，Ｄは非染色；Ｂ，ＥはポリクローナルヒトＩｇＧ４で標識され、その後、ＰＥ標識された抗ヒトＩｇＧ４で二次染色された；Ｃ，ＦはＯＰＮ３０５で標識され、その後、抗ヒトＩｇＧ４でＰＥ標識された。
本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体２に特異的な結合を有していて、Ｔｏｌｌ様受容体２に結
合したとき、Ｔｏｌｌ様受容体の機能活性を拮抗する完全なヒトモノクローナル抗体を提
供する。また、本発明は、完全なヒト抗体由来の結合断片、さらには配列番号：１の軽鎖
の可変領域のアミノ酸配列および／または配列番号：４の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
を含むか、それからなるか、実質的にそれからなる結合メンバーをも提供する。
「Ｔｏｌｌ様受容体２機能に拮抗する」の用語または「Ｔｏｌｌ様受容体２の拮抗剤」
または「Ｔｏｌｌ様受容体２の作動剤」等の同様の用語は、抗体、断片または結合メンバ
ーがＴｏｌｌ様受容体２に特異的に結合することを意味し、これにより、リガンドの結合
もしくはＴｏｌｌ様受容体２への結合化合物を阻害またはブロックするか、または、Ｔｏ
ｌｌ様受容体、例えばＴｏｌｌ様受容体２リガンドの活性化を生じる。Ｔｏｌｌ様受容体
２リガンドの結合に次いで、Ｔｏｌｌ様受容体２によって介在される細胞内シグナリング
の阻害または抑制に機能することによって、抗体、断片または結合メンバーは、さらにＴ
ｏｌｌ様受容体２の活性化および機能を阻害することができる。「Ｔｏｌｌ様受容体２の
活性化および下流の介在したシグナリング」とは、ＴＬＲ２の活性化によって誘発される
あらゆる細胞内シグナリング経路を意味する。シグナリング経路は、ＴＬＲ２特異的な経
路であるか、「共有した」シグナリング経路があり得て、例えばシグナリング経路は、他
の要因、例えばＴＬＲ２以外の受容体の活性であって、免疫反応メディエーター、例えば
転写因子ＮＦ−κＢの活性に寄与することによって活性化することができる。
ＴＬＲ２は、２機能のヘテロ二量体に二量体化することが知られている。特に、ＴＬＲ
２は、Ｔｏｌｌ様受容体１またはＴｏｌｌ様受容体６のいずれかとヘテロ二量体を形成す
ることが既知である。また、ヘテロ二量体は、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４，ＴＬＲ−
４）およびＴｏｌｌ様受容体１０（（ＴＬＲ１０，ＴＬＲ−１０）と形成することが可能
である。前記二量体化は、異なる微生物由来のリガンドによるＴＬＲ２結合に結果である
差異と関連している。発明者は、Ｔｏｌｌ様受容体２がＴｏｌｌ様受容体１またはＴｏｌ
ｌ様受容体６とヘテロ二量体を形成するかに関わらず、本発明のヒト化抗体は、ＴＬＲ２
機能に拮抗するように機能することが確認された。
＜抗体結合エピトープ＞
本発明のヒト化抗体もしくはその断片またはその結合メンバーは、Ｔｏｌｌ様受容体２
に選択的に結合し、その機能に拮抗する。受容体のリガンド結合部位付近のそのリガンド
による結合によって、モノクローナル抗体は、受容体の活性をブロックすることができ、
これは、リガンド結合部位にリガンドを接近させることを排除する立体障害を結果として
生じる。
理論に抑制されることなく、発明者は、本発明によるヒト化抗体に結合した結合部位を
同定した。抗体は、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）の成熟細胞外領域のＮ末端およびＣ
末端領域の双方に由来する残基を含むエピトープに結合する。ある実施形態において、エ
ピトープは、Ｔｏｌｌ様受容体２の５８６アミノ酸配列から決定するＴｏｌｌ様受容体２
のＮ末端のアミノ酸残基１９から３９を含み、前記アミノ酸は、KEESSNQASLSCDRNGICKGS
（配列番号：１３）である。結合エピトープは、配列番号：１のアミノ酸配列のＣ末端領
域に存在するようなＴｏｌｌ様受容体２のアミノ酸残基５３８から５４９をさらに含み、
前記配列はアミノ酸ＣＳＣＥＦＬＳＦＴＱＥＱＱ（配列番号：１４）を含む。
＜交差反応＞
通常、本発明の抗体、抗体断片または結合メンバーによって拮抗されるＴＬＲ２は、哺
乳類ＴＬＲ２（またはその機能的変異体）、例えばヒトＴＬＲ２またはネズミＴＬＲ２で
ある。ある実施形態にいて、拮抗したＴＬＲ２は、図７の配列番号：１５に規定するよう
なアミノ酸配列を有するヒトの形状のＴＬＲ２であり、これは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス
番号ＡＡＣ ３４１３３ （ＵＲＬ ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に規
定するような７８４アミノ酸の全長ヒトＴｏｌｌ様受容体配列を含む。
あるさらなる実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２は、ネズミＴＬＲ２であり、これ
は、図８の配列番号：１６に規定するようなＧｅｎｂａｎｋアクセス番号ＮＰ＿０３６０
３５（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）由来のアミノ酸配列を含む。
あるさらなる実施形態において、本発明の抗体、抗体断片または結合メンバーは、サル
細胞で発現するＴｏｌｌ様受容体２の機能活性、またはシグナリングに拮抗するような役
割を果たす。
あるさらなる実施形態において、抗体は、（ｉ）１０−７Ｍから１０−１１Ｍの解離定
数、（ｉｉ）１０−８Ｍから１０−９Ｍの解離定数、（ｉｉｉ）１０−９Ｍから１０−１
０Ｍの解離定数、（ｉｖ）１０−１１Ｍから１０−１２Ｍの解離定数からなる群から選択
される解離定数（Ｋｄ）を有する。ある実施形態において、本発明の抗体またはその断片
は、Ｋｄ３×１０−８以下もしくは４×１０−８以下でヒトまたはネズミＴｏｌｌ様受容
体２と結合することができる。
本発明の抗体のＴｏｌｌ様受容体２への結合は、したがって、ＴＬＲ２およびそのリガ
ンドのリガンド／受容体の相互作用と関連のある細胞内シグナリングのブロッキングを生
じる。
＜抗体構造＞
本発明の抗体および抗体断片は、完全なヒトのものである。即ち、抗体を含むアミノ酸
残基は、例えばマウスと対象的なヒト由来のものである。したがって、本発明の抗体は、
ネズミ抗体またはキメラ抗体、例えばマウス／ヒト抗体より低い免疫性がある。
ネズミまたはキメラ抗体の投与から結果として生じた免疫性は、モノクローナル抗体の
治療への使用に最も著しいバリアであることが分かった。したがって、完全なヒト抗体の
供給は、１度を超える投与を対象にした場合、免疫性反応、例えば抗体に対するＨＡＭＡ
反応を生じる、ネズミまたはヒト／マウスの供給と関連のある課題を解決する。前記反応
は、対象の血清からネズミまたはキメラ抗体を除去することによって、それらの標的に達
する抗体を防ぎ、それらの意図する治療効果を生じさせる。したがって、本発明の完全な
ヒト抗体は、このようなネズミおよびキメラ抗体に対して、顕著な効果を奏する。
抗体に対する免疫性の１の内因性原因は、抗体に存在するＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープで
ある。したがって、本発明の抗体および結合断片は、抗体または抗体断片に存在するあら
ゆるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを同定して、調節するために分析された。この過程は、本
発明の抗体および抗体断片の免疫性をさらに減少する。
さらに、本発明の抗体または抗体断片は、対象に投与したとき、さらに免疫反応が抗体
に備わっていないことを確実にする、１以上の技術分野の対象とすることができる。この
ような技術分野の例は、当業者に既知であり、脱免疫化、遺伝子シャッフリングおよびペ
グ化を含むが、これらに制限されるものではない。
さらに、本発明の抗体または抗体断片の生物学的機能または治療活性を上昇するため、
さらなる技術の最適化が用いられる。このような技術は、抗体の以下の寄与を調節するこ
とを含む、ただし、これらに制限されるものではない：効力、親和性、結合特異性、Ｋオ
ン（会合速度定数）、Ｋオフ（解離速度定数）、熱力学的安定性、可溶性、血清の半減期
、発現、折りたたみ速度、プロテアーゼの感受性、Ｆｃ領域エフェクター機能および薬物
リサイクル。調節することができる生物学的機能または治療活性は：有効性の強化、改良
した薬物動態額的プロフィール、患者への良い都合、減少した商品コスト、改良された安
全性プロフィール、減少した免疫性およびより長い貯蔵時間を含むが、これらの制限され
るものではない。
＜ＴＬＲ２を介在した疾患の治療＞
本発明のヒト化抗体、断片および結合メンバーは、免疫抑制（免疫反応、最も特に、炎
症性免疫反応）、特にＴｏｌｌ様受容体２を介在した活性およびシグナリングを抑制する
ことによって誘発することができる。Ｔｏｌｌ様受容体２のこの抑制は、疾患状態の治療
または予防に有用性を有するとして、Ｔｏｌｌ様受容体２の活性化およびシグナリングが
、疾患の発症または進行の原因となることが、発明者に同定された。
本発明の抗体は、例えば実験室内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、（生体外）ｅｘ ｖｉｖｏお
よび生体内の（ｉｎ ｖｉｖｏ）治療法に使用することができる。
あるさらなる態様において、本発明は、本発明の抗体、抗体断片または結合メンバーの
Ｔｏｌｌ様受容体２の活性およびシグナリングに介在する疾患状態の治療への使用にまで
も及ぶ。
＜虚血の治療＞
したがって、さらなる態様において、本発明は、虚血再かん流傷害、それによって生じ
る状態またはそれに関連のある治療および／または予防の方法を提供し、
−ここに規定するようなヒト化抗体またはその結合断片の治療への有効量を提供する工程
および
−前記化合物をその治療の必要のある対象に投与する工程
を備える方法である。
本発明のさらに他の態様は、本発明による完全なヒト化抗体またはそれに由来する結合
メンバーを、Ｔｏｌｌ様受容体２リガンドによる完全なまたは部分的なＴｏｌｌ様受容体
２活性に介在する虚血再かん流傷害、または心臓の炎症状態の治療への使用を提供する。
さらに他の態様は、Ｔｏｌｌ様受容体２リガンドによる完全な、または部分的なＴｏｌ
ｌ様受容体２活性に介在する虚血再かん流傷害、または心臓の炎症の状態の治療または予
防のための薬剤の調製において、本発明によるヒト化抗体、その断片またはそれに由来す
る結合メンバーの使用を提供する。
ある実施形態において、心臓の炎症状態は、虚血再かん流傷害の発生から生じて、心筋
虚血、虚血性心疾患、高血圧心筋虚血、うっ血心不全、組織虚血、器官虚血、急性冠症候
群、肥大、脳梗塞、心筋梗塞、不整脈、虚血再かん流傷害（Ｉ／Ｒ傷害）を含む群から選
択することができるが、これらに制限されるものではない。
虚血は、臓器または体の一部が十分な血液供給を得られないときに生じる。十分な血液
供給が与えられない臓器は、低酸素であると考えられている。再かん流は、血流が一時的
に奪われた後、臓器まで再開したときに生じる。再かん流傷害は、虚血段階の後、血液供
給が組織に戻ることによって組織または臓器に生じる傷害に関する。虚血段階における酸
素および栄養の欠如により、循環が戻る時の炎症及び酸化損傷の段階が生じる。虚血再か
ん流傷害の例としては、低酸素、脳梗塞、心臓発作、慢性腎不全または臓器移植が挙げら
れる。
ある実施形態において、本発明のこの態様の方法は、対象における臓器移植から生じ得
る虚血再かん流傷害の治療または予防にも使用することができる。ある実施形態において
、本発明の抗体は、固形臓器移植から生じ得る虚血の治療および／または予防に使用する
ことができる。
本発明のさらに他の態様は、対象において固形臓器移植と関連する虚血再かん流傷害に
関係するＴＬＲ２発現細胞または組織において、１以上のＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２
）の生物活性を減少する方法を提供し、
−細胞または組織において１以上のＴＬＲ２の生物活性を減少するのに十分な量の本発明
によるＴｏｌｌ様受容体２拮抗抗体と細胞または組織を接触する工程
を備える。
ある実施形態において、ＴＬＲ２発現細胞または組織は、心筋細胞または組織である。
ある実施形態において、ＴＬＲ２発現細胞または組織は、心筋虚血、虚血性心疾患、高血
圧心筋虚血、うっ血心不全、組織虚血、器官虚血、急性冠症候群、肥大、脳梗塞、心筋梗
塞、不整脈、虚血再かん流傷害（Ｉ／Ｒ傷害）を含む群から選択される、再かん流によっ
て誘発される心臓の炎症状態であるが、これらに制限されるものではない。
ある実施形態において、方法は、虚血再かん流傷害を有するか、その危険にあるヒトの
対象に実施される。
本発明のさらに他の態様は、本発明による抗体またはその結合断片の固体臓器移植と関
連のある虚血および再かん流への治療または予防のための使用にまでも及ぶ。
＜自己免疫疾患の治療＞
さらに他の態様において、本発明は、自己免疫疾患もしくはそれに関連のある状態の治
療および／または予防方法を提供し、
−治療への有効量のヒト化抗体またはここに規定するようなその結合断片を提供する工程
および
−前記化合物をその治療を必要とする対象に投与する工程
を備える方法である。
本発明のさらに他の態様は、Ｔｏｌｌ様受容体２リガンドによるＴｏｌ様受容体２活性
によって、完全にまたは部分的に介在される自己免疫疾患を治療する使用のための本発明
によるヒト化抗体またはそれに由来する結合メンバーを提供する。
さらに他の態様は、Ｔｏｌｌ様受容体２リガンドによるＴｏｌｌ様受容体２の活性によ
って完全にまたは部分的に介在される、免疫疾患の治療または予防のための薬剤の調製に
おける、本発明によるヒト化抗体またはそれに由来する結合メンバーの使用を提供する。
ある実施形態において、免疫疾患は、自己免疫性関節炎、特に慢性関節リウマチである
。ある実施形態において、免疫疾患は、乾癬、皮膚炎を含む群から選択される。さらに、
ある実施形態において、自己免疫疾患は、糖尿病である。通常、糖尿病は、真性糖尿病で
ある。ある実施形態において、糖尿病は、１型真性糖尿病である。さらに、ある実施形態
において、糖尿病は２型真性糖尿病である。
ある実施形態において、糖尿病を有する対象から結果として生じる状態は、糖尿病合併
症と呼ばれている。このような糖尿病合併症は、急性合併症、慢性合併症またはそれら双
方の組み合わせがあり得る。
糖尿病合併症が急性合併症である場合、合併症は、網膜症、神経障害, 末梢循環障害、
皮膚潰瘍形成、多尿症、多渇症、多食症、糖尿病性ケトアシドーシス（ＤＫＡ）および高
浸透圧性非ケトン性状態を含むが、選択されない群から選択される。あるさらなる実施形
態において、状態は、以下いずれか１の急性または慢性状態から結果として生じ、失明、
タンパク尿、痛み、無感覚、寒冷感、間欠性跛行および壊疽を含むが、これらに制限され
るものではない。
あるさらなる実施形態において、糖尿病合併症は、例えば血糖値の慢性的な上昇から生
じる血管疾患であり、血管の傷害（血管障害）を引き起こすような慢性合併症である。こ
のような実施形態において、血管疾患が、微小血管に生じる場合、これは、１以上の糖尿
病性網膜症、糖尿病性神経障害および糖尿病性ネフロパシーを引き起こし得る微小血管障
害を生じさせることがある。
本発明のさらに他の態様によると、Ｔｏｌｌ様受容体２リガンドによるＴｏｌｌ様受容
体２の活性によって完全にまたは部分的に介在される対象において、肥満に関連のある疾
患を治療または予防するための方法を提供し、前記方法は、対象に治療への有効量の本発
明の前記態様のいずれかによる抗体またはそれに由来する結合を投与する工程または工程
を備える。
本発明のさらに他の態様は、Ｔｏｌｌ様受容体２リガンドによるＴｏｌｌ様受容体２の
活性によって、完全にまたは部分的に介在される肥満を治療および／または予防するため
に使用する、本発明によるヒト化抗体、またはそれに由来する結合メンバーを提供する。
さらに他の態様は、肥満と関連のある疾患状態の治療または予防のための薬剤の調製に
おいて、状態は、Ｔｏｌｌ様受容体２リガンドによるＴｏｌｌ様受容体２活性によって完
全にまたは部分的に生じる、本発明によるヒト化抗体またはそれに由来する結合メンバー
の使用を提供する。
ある実施形態において、肥満と関連のある疾患は、糖尿病、特に２型真性糖尿病、イン
スリン耐性、高インスリン血、減少したグルコースクリアランス、脂質異常症、非アルコ
ール性脂肪肝、高血圧、炎症、肝腫脹、肝臓脂肪症、心筋梗塞症、喘息または脳卒中を含
む群（だだし、これらに制限されない）から選択される少なくとも１の状態である。
本発明のさらに他の態様は、対象におけるインスリン耐性の治療方法を提供し、前記方
法は、対象に治療への有効量の本発明の抗体、または本発明に提供される結合メンバーを
投与する工程を備える。
本発明のさらに他の態様は、Ｔｏｌｌ様受容体２リガンドによるＴｏｌｌ様受容体２活
性によって、全体的または部分的に介在される対象におけるインスリン耐性の治療に使用
するためのヒト化抗体、その断片、またはそれに由来する結合メンバーを提供する。
さらに他の態様は、Ｔｏｌｌ様受容体２リガンドによるＴｏｌｌ様受容体２の活性によ
って、完全にまたは部分的に介在される対象における、インスリン耐性の治療または予防
のための薬剤の調製において、本発明によるヒト化抗体またはそれに由来する結合メンバ
ーの使用を提供する。
＜眼疾患の治療＞
さらにある態様において、本発明は、眼疾患の治療および／または予防方法を包含し、
前記方法は、
−本発明に提供される治療への有効量のヒト化抗体、結合断片または結合メンバーを提供
する工程および
−前記化合物をその治療の必要のある対象に投与する工程
を備える。
本発明のさらに他の態様は、本発明による抗体またはそれに由来する結合メンバーの眼
疾患を治療または予防するための使用を提供する。
ある実施形態において、眼疾患は、ブドウ膜炎または加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）であ
る。
＜腎炎の治療＞
本発明のさらに他の態様は、腎炎およびその疾患またはそれによって生じるか、それに
関連する状態の治療および／または予防方法を提供し、
前記方法は、
−本発明に提供されるヒト化抗体、結合断片または結合メンバーの治療への有効量を提供
する工程および
−前記化合物をその治療の必要のある対処に投与する工程
を備える。
本発明のさらに他の態様は、Ｔｏｌｌ様受容体２リガンドの活性によるＴｏｌｌ様受容
体２に、完全にまたは部分的に介在される腎炎、または腎疾患の治療に使用するための、
本発明によるヒト化抗体、またはそれに由来する結合メンバーを提供する。
さらに他の態様は、Ｔｏｌｌ様受容体２リガンドの活性によるＴｏｌｌ様受容体２に、
完全にまたは部分的に介在される腎炎または腎疾患の治療、または予防の薬剤の調製にお
いて、本発明によるヒト化抗体またはそれに由来する結合メンバーの使用を提供する。
ここに規定する「腎炎」および「腎疾患」の用語は、実質的に腎臓内または腎臓細胞内
の炎症が生じることを特徴とするか、腎臓炎の発症が腎臓以外の他の体の部位に主に影響
する疾患または炎症によって結果として生じる状態を包含する。特に、炎症は、糸球体、
ボーマン嚢またはボーマン嚢腔を含むが、限定しない部位で生じ得る。一般的に、炎症は
、少なくとも部分的な腎機能傷害および／または腎不全を生じる。
ある実施形態において、腎炎および腎疾患は、「腎臓疾患」を含み、腎臓疾患の用語は
、一般的に、少なくとも１のヒトにおける腎臓疾患を示し、疾患は、腎臓機能を障害する
か弱め、これは生理的に、例えば尿へのタンパク質の漏れまたは窒素性老廃物の排出を特
徴とする。腎臓疾患は、腎臓の主な病状、例えば糸球体または小管または他の臓器、例え
ば膵臓への損傷であって、腎臓性能の生物学的機能、例えばタンパク質の保持に悪影響を
及ぼすことも結果として生じる。したがって、ヒトにおける腎臓疾患は、他の臓器にも影
響を及ぼすことができる疾患状態の直接的または間接的な影響があり得る。腎臓に影響を
及ぼすが、特異的に腎臓を標的としない疾患の例は、糖尿病および全身性ループスである
。人疾患および腎臓疾患の用語は、ここで「腎臓疾患」の語句と置き換えて同じ様に使用
される。腎臓疾患は、例えば腎臓皮質または腎臓髄質のいずれかにおける糸球体、小管ま
たは間質組織へのあらゆる変化、損傷または外傷から結果として生じるか、その結果であ
る。
ある実施形態において、腎臓疾患は、新構成腎臓疾患もあり得る。ここに使用するよう
な「新構成腎臓疾患」の用語は、長期に亘って（例えば日、週、月、年）腎臓機能を消失
するように導くあらゆる腎臓疾患を示す。ここに規定するように、「腎臓機能」の用語は
、一般的に腎臓の生理的特徴、例えばタンパク質を保持することができる性能によって、
タンパク尿を予防すること（例えばタンパク尿症）を指す。腎臓機能は、例えば糸球体濾
過率（例えばクレアチンクリアランス）、尿中のタンパク質の排出、例えばタンパク尿症
、血中尿素窒素、血清もしくは血漿クレアチンまたはそれらいずれかの組み合わせによっ
て評価することができる。
「腎炎および腎疾患」の用語の意味に分類される特定の状態の例は：慢性腎不全、急性
腎不全、異種腎毒性腎炎、糸球体腎炎、糸球体硬化症、全身性エリテマトーデス腎炎（Ｓ
ＬＥ）、糖尿病性ネフロパシー腎症、糖尿病性ネフロパシー腎症を含む腎疾患（ただし、
これらに限定されない）、前記糖尿病性ネフロパシー腎症は、腎臓硬化症および糸球体腎
炎を伴い、前記糸球体腎炎は、腎臓硬化症を伴う。
あるさらなる実施形態において、腎炎および腎疾患は、腎臓細胞および／または腎臓機
能に影響する免疫介在疾患に関する。
かかる状態は、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）（例えばウェゲナー肉芽腫症）、ループ
ス腎炎クリオグロブリン血関連の糸球体腎炎、細菌性心内膜炎、ヘノッホ・シェーンライ
ン紫斑病、感染後糸球体腎炎、Ｃ型肝炎、糖尿病性ネフロパシー、ミロイド症、高血圧性
腎硬化、多発性骨髄腫からの軽鎖疾患、二次巣状糸球体硬化症および高血圧性腎硬化と関
連する疾患を含み、免疫グロブリンＡ腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、メサンギウム増殖性
糸球体腎炎、 非増殖性糸球体炎、膜性糸球体腎炎、微小変化型疾患、巣状分節性糸球体
硬化症（ＦＳＧＳ）、線維性糸球体硬化、イムノタクトイド腎症、増殖性糸球体腎炎、進
行性糸球体腎炎、抗ＧＢＭ疾患、腎阻血、腎血管炎を含むが、これらに制限されるもので
はない。
「腎炎および腎疾患」の用語は、急性腎不全も包含する。急性腎不全（「ＡＲＦ」）は
、乏尿（＜５００ｍＬ／日）の症状がすぐに現れ、着実に増加していく抗窒素血漿と関連
のある臨床症状を示す。ＡＲＦの原因は、３診断分類に分類することができる：腎前性（
不十分な腎かん流）；腎後性（閉塞症）；および腎臓性。ＡＲＦの病態生理学は、複雑で
、多因子性である。従来の概念は、ＡＲＦが直接的な尿細管障害、腎虚血または管障害か
ら結果として生じることを示唆する。臨床的に、ＡＲＦは、減少した糸球体濾過および減
少した代謝老廃物、水および電解質を結果として生じる。体液過剰、電解質平衡異常およ
び尿毒症性症候群は、臓器機能不全を結果として生じる。臓器機能不全は、最終的な結果
として死をもたらす。
さらに様々な態様において、本発明は、ＴＬＲ２反応細胞および／または組織（例えば
虚血を経た、虚血を経る可能性のある、または再かん流を経る可能性のある組織、膵臓の
ランゲルハウス島のβ細胞、またはＴＬＲ２を発現し、ＴＬＲ２を介在した疾患状態に関
係するあらゆる他の細胞種またはその発達）において、機能（例えば１以上のＴＬＲ２の
生物活性を変える）を調節する方法を包含する。方法は、ＴＬＲ２反応細胞若しくは組織
の機能、または細胞若しくは組織におけるＴＬＲ２の生物活性に拮抗するのに十分な量で
、本発明に提供するヒト化抗体またはその結合断片と、ＴＬＲ２反応細胞および／または
ＴＬＲ２反応組織を接触する工程を備える。１実施形態において、接触工程は、実験室内
で（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、例えば細胞溶解物または再構成系で生じることができる。或い
は、対象方法は、培養細胞、例えば実験室内（ｉｎ−ｖｉｔｒｏ）または生体外（ｅｘ−
ｖｉｖｏ）で実施することができる。例えば、精製または組換え細胞等の細胞は、実験室
内（ｉｎ−ｖｉｔｒｏ）で培養することができ、接触工程は、ＴＬＲ２モジュレーターを
培養培地に添加することによって生じることができる。一般的に、ＴＬＲ２反応細胞は、
哺乳類細胞、例えばヒト細胞である。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ２反応組織は
、虚血を経て、再かん流を経る可能性があるか、それと関連のある細胞集団の組織である
。他の実施形態において、方法は、対象に存在する細胞、例えば生体内（ｉｎ−ｖｉｖｏ
）プロトコルの一部としてまたは動物対象（例えばヒトの対象または生体（ｉｎ−ｖｉｖ
ｏ）動物モデル）に実施することができる。生体内（ｉｎ−ｖｉｖｏ）プロトコルは、治
療的または予防的とすることができ、炎症モデルは、例えば遺伝子学的に調節されたモデ
ル、例えば過剰発現したＴＬＲ２を有する動物モデルまたはＴＬＲ受容体の突然変異もし
くは欠如があり得る。生体内の（ｉｎ−ｖｉｖｏ）方法のため、ヒト化抗体またはその断
片は、例えば二次治療、例えば抗炎症薬または薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤もし
くは希釈剤といった他の薬剤単独で、または組み合わせて提供することができる。通常、
抗体は、ＴＬＲ２介在状態、例えば慢性関節リウマチ、虚血再かん流傷害、糖尿病または
腎炎を患ったか、そのおそれのある対象に、１以上のＴＬＲ２の介在による活性または機
能に十分に拮抗する量で、対象に投与される。ある実施形態において、本発明のヒト化抗
ＴＬＲ２抗体の量または投薬量は、投与前に実験室内（ｉｎ−ｖｉｔｒｏ）または生体外
（ｅｘ−ｖｉｖｏ）試験によって、１以上のＴＬＲ２の機能活性を減少または阻害等の変
化に必要とされる抗体の量であって、前記機能活性は、通常、１以上のここに記載のＴＬ
Ｒ２生物活性である。
前記いずれかの治療方法は、本発明の抗ＴＬＲ２抗体または抗体結合断片の代わりに、
または、それに加えて免疫複合体を用いて実施することができる。
あるさらなる態様において、本発明は、本発明に係る抗体の、診断に応用するための使
用をも包含する。このように、本発明のさらなる態様は、Ｔｏｌｌ様受容体２の発現上昇
と関連のある疾患を診断するための方法を提供する。ある実施形態において、方法は、本
発明の抗ＴＬＲ２抗体とテスト細胞を接触する工程；抗ＴＬＲ２抗体のＴＬＲ２への結合
を検出することによってテスト細胞によるＴＬＲ２の発現レベルを測定する工程（定量的
または質的のいずれかで）；およびコントロール細胞によるＴＬＲ２発現レベルと（例え
ば正常細胞に相当するレベルでＴＬＲ２を発現するテスト細胞または細胞と同じ組織由来
の正常細胞）、テスト細胞によるＴＬＲ２の発現レベルを比較する工程を備え、コントロ
ール細胞と比較して、テスト細胞によるＴＬＲ２のより高いレベルの発現は、ＴＬＲ２の
高い発現と関連した疾患の存在を示す。ある実施形態において、テスト細胞は、高いＴＬ
Ｒ２の発現と関連のある疾患を有すると疑われている各々のものから得られる。ある実施
形態において、疾患は、ここに記載するような、炎症性疾患または免疫介在疾患である。
＜治療効果＞
発明者は、ここに提供するヒト化抗ＴＬＲ２抗体が、技術分野に既知の抗ＴＬＲ２ネズ
ミモノクローナル抗体より、治療的に好ましいことを確認した。
本発明のヒト化抗体および従来技術のネズミ抗ＴＬＲ２抗体の、軽鎖および重鎖の可変
領域に存在する構造的差異に加えて、発明者は、驚くべきことに、本発明のヒト化抗体に
よって与えられる数々の機能的利点であり、かかる抗体をより好ましくは臨床状態で使用
する点も同定した。
限定することなく、発明者は、１１Ｇ７抗ＴＬＲ２ネズミモノクローナル抗体と比較し
たとき、ＴＬＲ２がＴＬＲ１またはＴＬＲ６のいずれとヘテロ二量体を形成するかに関わ
らず、抗体がＴＬＲ２機能に拮抗するため、本発明による完全なヒト化抗体は、優れた機
能および臨床への使用を示すことを確認した。
ネズミＴＬ２．１抗体に関して、発明者は、ネズミＴＬ２．１抗体がヒトＴＬＲ２への
特異的結合のみを示すのに対し、本発明のヒト化抗体が異なる哺乳類細胞の形状のＴＬＲ
２、例えばヒト、ネズミ、ラット、ブタおよびサルと交差反応することを確認した。さら
に、本発明のヒト化抗体は、ネズミアミノ酸残基を含まず、したがって、対象に投与した
ときのそれらに対して生成された抗体を中和する可能性は、ネズミ由来のＴＬ２．１抗体
と比較したとき、最小限である。
Ｔ２．５抗体に関して、発明者は、驚くべきことにＴ２．５抗体（ハイブリドーマクロ
ーンＴ２．５由来のマウスＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）抗体、HyCult Biotechnology
b.v., Cell Sciences, Canton,米国:カタログ番号1054）が、ＣＤ３２依存的な方法で生
じるＴＬＲ２活性化およびシグナリングの拮抗を介在することを同定した。発明者は、Ｔ
ＬＲ２シグナリングの抑制、即ち、ＣＤ３２への結合を介在するため、例えば抗体のＦａ
ｂ部位に結合したとき、ＴＬＲ２受容体の拮抗を介在するため、抗体のＦｃ領域は存在す
る必要がなく、本発明の完全なヒト化抗体がＣＤ３２を必要としないことを同定した。し
たがって、本発明のＯＰＮ−３０５の完全なヒト化モノクローナル抗体によって介在され
るＴｏｌｌ様受容体２機能の拮抗は、ＣＤ３２に独立した方法で介在される。これは、Ｃ
Ｄ３２ａおよびＣＤ３２ｂの双方への結合を含む。本発明の完全なヒト化抗体は、患者の
アクセスが実質的により高いため、発明者に達成されたこの驚くべき観測は、臨床的に重
要である。
さらに、本発明の完全なヒト化抗体は、ＴＬＲ２アミノ酸配列のＮおよびＣ末端の双方
に存在する残基に規定されるエピトープに結合することが予測される。これは、Ｔ２．５
モノクローナル抗体によって結合するエピトープが、ＴＬＲ２配列のＮ末端（のみ）に局
在することが記載された国際公開第２００５／０２８５０９号と対照的である。
さらに、ここに提供する比較例で例示するように、本発明者は、本発明の完全なヒト化
抗体が減少した免疫性プロフィールを示したこと、即ち、Ｔ細胞エピトープの欠失によっ
て抗体が減少した免疫性を有することを確認した。したがって、本発明による抗体は、ヒ
トの対象に投与したとき、それらに対して産生した中性抗体反応を有する可能性が非常に
低い。この機能的特徴は、本発明の完全なヒト化抗体が、ネズミ抗体ＴＬ２．１，Ｔ２．
５および従来技術に既知の１１Ｇ７よりまたは従来のＣＤＲ移植技術に基づいて開発する
ことができるキメラ抗体もしくはヒト化抗体より臨床状態における使用により好ましいこ
とを意味する。
＜抗体＞
「抗体」は、天然または部分的もしくは完全に合成して産生した免疫グロブリンである
。この用語は、結合領域を有するあらゆるポリペプチド、タンパク質またはペプチドの範
囲を包含し、即ち本発明のヒト化抗体の結合領域に相合性がある。
通常、免疫グロブリンは、２の相同性のある重鎖および２の相同性のある軽鎖がジスル
フィド結合によって共に結合しているものを含む、ヘテロ四量体構造を有する。それぞれ
重鎖および軽鎖は、抗原の特異的結合に対応する可変領域を有し、これらの領域は、ＶＨ
及びＶＬ領域として知られる。それぞれの鎖は、少なくとも1つの定常領域を有し、ＣＬ
領域として指定される少なくとも1つの定常領域を有する軽鎖を有し、一方で、重鎖領域
は３の定常領域であるＣＨ１，ＣＨ２およびＣＨ３を含む。さらに、いくつかの抗体アイ
ソタイプは、さらにＣＨ４領域として示す定常領域を含む。ヒトにおいて、５つの異なる
抗体のクラスが存在し、これらは；ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥおよびＩｇＭである
。
抗体のＦｃ領域は、通常、少なくとも２つの重鎖定常領域をそれぞれの鎖に含む。これ
らは、ＡＤＣＣおよび補体結合等の抗体のエフェクター機能を介在するための役割を果た
すＦｃ領域を形成するため、二量体化する。抗体のＦｃ領域は、抗体の循環半減期におい
ても役割を果たす。変異は、抗原機能を調節するためのＦｃ領域にもされる。
抗体は、数々の方法で調節できるため、「抗体」の用語は、本発明のヒト化抗体として
同じ結合特異性を有するあらゆる特定の結合メンバーにまで及ぶように構成する必要があ
る。したがって、「抗体」の用語は、抗体断片および相同物並びにＴｏｌｌ様受容体２に
特異的に結合し、ＴＬＲ２機能に拮抗するように働く免疫グロブリン結合ドメインを含む
あらゆるポリペプチドにまで及ぶ。
さらに、全抗体の断片が結合抗原の機能を実施することができることが既知である。か
かる結合断片の例は、（ｉ）ヘテロ四量体抗体のＶＬ，ＶＨ，ＣＬおよびＣＨ１領域を含
むＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合した２のＦａｂ断片
を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆａｂ’断片、ヒンジ領域部位を
有するＦａｂ断片、（ｉｖ）ヘテロ四量体抗体のＶＨおよびＣＨ１領域からなるＦｄ断片
、（ｖ）ヘテロ四量体抗体のＶＨおよびＶＬ領域からなるＦｖ断片、（ｖｉ）ｓｃＦｖ（
短鎖Ｆｖ分子）であり、ＶＨ領域およびＶＬ領域は、ペプチドリンカーによって結合され
ている、（ｖｉｉ）ＶＨＣＤＲ３等の単離されたＣＤＲおよび（ｖｉｉｉ）ポリペプチド
の多量体であり、遺伝子融合技術によって産生される多価または多特異的断片がありえる
ジアボディを含むが、これらに制限されるものではない。
あるさらなる態様において、本発明は、二重特異性抗体にまでも及ぶ。これらは、化学
結合方法によって調製することができる、従来の二重特異性抗体またはハイブリッドハイ
ブリドーマ細胞株を含むことができる。或いは、二重特異性抗体は、二重特異性抗体断片
、例えばｓｃＦｖ二量体、またはジアボディに由来することができる。ある実施形態にお
いて、全抗体よりｓｃＦｖ二量体が使用できる。前記ジアボディは、可変領域のみを用い
て構成することができ、したがって、Ｆｃ領域、例えばＨＡＭＡまたは抗イディオタイプ
免疫反応を生じる可能性を減少する構造を提供する。
抗体領域内のアミノ酸残基は、カバットらによる既知の系にしたがって計数した(URL -
www.kabatdatabase.com)。前記数は、他に示されていない限り、本明細書に使用されて
いる。
＜ペプチド模倣薬＞
本発明は、さらに本発明の抗体またはその結合断片に基づくペプチド模倣薬をも包含す
る。ここに使用する「ペプチド模倣薬」または「ペプチド模倣剤」の用語は、ポリペプチ
ドでないが、それらの構造的態様を模倣し、本発明の拮抗するＴｏｌｌ様受容体２の機能
活性を生じる方法で、Ｔｏｌｌ様受容体に特異的に結合する分子を示す。それゆえに、本
発明は、Ｔｏｌｌ様受容体２拮抗剤として働く本発明の抗体に基づくペプチド模倣薬をも
包含する。
ペプチド模倣拮抗剤は、従来の化学的方法によって調製することができる（例えばDame
wood J. R. "Peptide Mimetic Design with the Aid of Computational Chemistry" in R
eviews in Computational Biology, 2007, Vol. 9, pp.1 -80, John Wiley and Sons, In
c., New York, 1996; Kazmierski W.K., "Methods of Molecular Medicine: Peptidomime
tic Protocols," Humana Press, New Jersey, 1999を参考）。ペプチド模倣薬拮抗剤は、
Ｔｏｌｌ様受容体２の拮抗剤から調製することができ、前記ペプチド模倣薬は、本発明の
抗体に基づくものであり、特に重鎖および軽鎖可変領域に基づくものである。例えば、多
糖類は、ペプチドと同じ機能基を有するように調製することができる。ペプチド模倣薬は
、Ｔｏｌｌ様受容体２の拮抗剤として調製することができ、前記ペプチド模倣薬は、本発
明の抗体に基づくものであり、特に重鎖および軽鎖の可変領域に基づくものである。例え
ば、多糖類は、ペプチドと同じ機能基を有するように調製することができる。ペプチド模
倣薬は、結合の存在下または標的分子への結合の条件で、例えばペプチド剤の三次元構造
を確立することによって設計することができる。ペプチド模倣薬は、結合部分および骨格
または支持構造の少なくとも２成分を含む。
結合部分は、標的分子、例えばリガンド結合部位またはその付近のアミノ酸、例えば配
列番号：３または配列番号：４のアミノ酸配列を含むＴｏｌｌ様受容体２エピトープと反
応し、複合体を（例えば疎水性またはイオン相互作用を経て）形成する化学原子または化
学基である。例えば、ペプチド模倣薬の結合部分は、ペプチドまたはタンパク質拮抗剤の
ものと同じである。結合部分は、本発明の抗体と同じまたは同様の方法でＴｏｌｌ様受容
体２と反応する、Ｔｏｌｌ様受容体２原子または化学基であってもよい。ペプチド内の塩
基アミノ酸のペプチド模倣薬の設計に使用するために適切な結合部分の例としては、窒素
含有基、例えばアミン、アンモニウム、グアニジンおよびアミドまたはホスホニウムが挙
げられる。酸性のペプチド模倣薬を設計するため使用する際、適切な結合部分の例として
は、例えばカルボキシル、低級アルキルカルボン酸エステル、スルホン酸、低級アルキル
スルホン酸エステルもしくは亜リン酸またはそのエステルが挙げられる。
支持構造は、結合部分に結合したとき、ペプチド模倣薬の三次元構造を与える化学的構
成要素である。支持構造は有機または無機である。有機支持構造の例としては、有機合成
ポリマーの多糖類、ポリマーまたはオリゴマー（例えばポリビニルアルコールまたはポリ
ラクチド）が挙げられる。支持構造は、ペプチド骨格または支持構造と実質的に同じ大き
さおよび寸法を有することが好ましい。これは、ペプチドおよびペプチド模倣薬の原子並
びに結合の大きさを算出し、測定することによって決定することができる。一実施形態に
おいて、ペプチド結合の窒素は、酸素または硫黄と置換することができ、例えばポリエス
テル骨格を形成する。他の実施形態において、カルボニルは、スルホニル基またはスルフ
ィニル基に置換することができ、それによってポリアミド（例えばポリスルホンアミド）
を形成する。ペプチドの逆アミドを生成することができる（例えば１以上の−ＣＯＨＮ基
を−ＮＨＣＯ基に置換する）。さらに他の実施形態において、ペプチド骨格はポリシラン
骨格と置換することができる。
これらの化合物は、既知の方法で生成することができる。例えば、ポリエステルペプチ
ド模倣薬は、ヒドロキシ基を相応するアミノ酸のα−アミノ基に置換し、ヒドロキシ酸を
調製し、次に、副反応を制限するため、ヒドロキシ酸をエステル化し、任意に塩基および
酸の側鎖をブロッキングすることによって調製することができる。適切な化学合成経路を
決定することは、一般的に、化学的構造を決定することによって、容易に同定することが
できる。
ペプチド模倣薬は、少数から多くの別々の分子種を含むライブラリを合成し、構成する
ことができる。このようなライブラリは、周知のコンビナトリアルケミストリーの方法を
使用して調製することができ、ライブラリが望ましい活性を有する１以上のペプチド模倣
薬を含む場合、測定のためにスクリーンすることができる。該ペプチド模倣拮抗剤は、そ
の後、適切な方法で単離することができる。
したがって、本発明のあるさらなる態様は、本発明のＴｏｌｌ様受容体２に結合する抗
体のパラトープに基づいて設計されたペプチド模倣薬にまで及ぶ。特に、このようなペプ
チド模倣薬は、ここに開示した抗体のＣＤＲ領域の構造に基づく。前記ペプチド模倣薬の
産生技術は、当業者に周知であり、Dougall et al.の方法("Design of pharmacologic ag
ents based on antibody structure", Trends in Biotechnology. 1994. 12. p372-379)
を含む。さらに、Saragovi et al. (Saragovi, et al., "Design and Synthesis of a Mi
metic from an Antibody Complementarity-Determining Region", Science 253:792-795
(1991) and Saragovi et al., "Loops and Secondary Structure Mimetics: Development
and Applications in Basic Science and Rational Drug Design", Biotechnology 10:
773-778 (1992))の技術が既知である。該ペプチド模倣薬は、特に重鎖のＣＤＲ３に基づ
くものである。Williams, et al. (Williams et al., "Design of Bioactive Peptides B
ased on Antibody Hypervahable Region Structures", J.Biol. Chem. 266: 5182-5160 (
1991))には、抗体の軽鎖の相補性決定領域由来の立体配座的に制限されたペプチドについ
て記載されている。その構造に影響する、中位から長いループを有することができるよう
に生じ、様々なパターンの相互作用を有する複雑な遺伝子機構の結果として、このＣＤＲ
は、抗体の結合特異性に特に重要である。ペプチドループまたは逆のターンの構造的特徴
は、ポリペプチドの生物活性における重要な媒介物として考えられる。ターンは、生物活
性に重要な結合基の適切な配向性を折りたたみ構造を小分子内で安定化することによって
提供し、結合および認識部位の双方に伴うことができる。
さらに、本発明は、本発明のＴｏｌｌ様受容体２抗体に基づく抗体模倣薬、例えばアフ
ィボディ、ドメイン抗体、ナノボディ、ユニボディ、ダルピン、アンチカリン、アビマー
、バーサボディ、デュオカリンをも包含する。多岐に亘る抗体模倣薬の技術分野が、当業
者に既知である。例えば、いわゆるドメイン抗体（Domantis, UK）は、ヒト抗体の軽鎖ま
たは重鎖のいずれかの可変領域に相当する抗体の小さい機能結合単位である。かかるドメ
イン抗体の産生法は、米国特許第６，２９１，１５８号、第６，５８２，９１５号および
第６，５９３，０８１号明細書に見られる。ナノボディは、ラクダ科の動物に見られる自
然に生じる重鎖抗体の独特の構造、および機能特徴を含む抗体由来の治療タンパク質であ
る。ユニボディは、ＩｇＧ４抗体のヒンジ領域を取り除くことに基づくさらなる抗体断片
化技術である。ヒンジ領域の欠失は、従来のＩｇＧ４抗体の約半分の大きさであり、単価
結合領域の分子を生じる。ユニボディは、不活性なＩｇＧ４抗体の特徴を保持し、したが
って免疫反応は含まない。それゆえに、ＩｇＧ４抗体等に基づく治療、例えば本明細書に
記載の本発明の抗体の実施形態において、ユニボディは細胞の特定機能に拮抗するために
使用することができるが、細胞死は、通常、ＩｇＧ４抗体等のユニボディに生じず、それ
が結合する標的に対する免疫反応を介在しない。ユニボディは、ＩｇＧ４と同じ割合で体
内から取り除かれ、それら標的拮抗剤と同様の結合親和性を有する。
さらに結合分子は：アフィボディ分子（米国特許第５，８３１，０１２号）、ダルピン
（設計されたアンキリン反復タンパク質）（国際出願０２／２０５６５号）およびアンチ
カリン（米国特許第７，２５０，２９７号および国際出願９９／１６８７３号）を含む。
バーサボディは、さらなる抗体模倣薬技術である。バーサボディ（Amunix、米国特許出願
第２００７／０１９１２７２号明細書）は、３−５ｋＤａの１５％システイン残基を有す
るマイクロタンパク質として示される小タンパク質であり、タンパク質が、通常、示す疎
水性コアを置換する高いジスルフィド結合密度スカフォールドを形成する。
アビマーは、他の種類の抗体模倣剤である。アビマーは、ヒト血清タンパク質族の組換
えのいずれかに由来するものである。それらは、モジュール結合ドメイン単一のタンパク
鎖であり、それぞれ特定の標的部位に結合するように設計されている。アビマーは、単一
のタンパク質標的および／または複数のタンパク質標的部位に同時に結合することができ
る。多点結合または結合活性として知られているこの結合機構は、細胞および分子が体内
で作用する方法を模倣し、拮抗物および拮抗剤の生成を支持し、複数の機能および強い活
性を有する薬物を結果として生じる。アビマーライブラリは、本明細書に参考として、こ
こに参考として組み込む国際公開第２００４／０４４０１１号、９９頁の実施例６、およ
び例えば米国特許出願第２００５／００５３９７３号、第２００５／００８９９３２号、
第２００５／０１６４３０１号明細書に記載の方法によって産生することができる。アビ
マーライブラリは、Avidia Inc, Mountain View, California, USAからも入手可能である
。
＜抗体産生＞
本発明の抗体および結合メンバーは、完全にまたは部分的に化学合成によって生成する
ことができる。例えば、本発明の抗体および結合メンバーは、当業者に周知の技術、例え
ば標準の液体ペプチド合成または固相ペプチド合成法によって調製することができる。或
いは、抗体および結合メンバーは、溶液中に液相ペプチド合成技術または具体的には固相
、液相および溶液化学の組み合わせを用いて調製することができる。
本発明は、望ましいペプチドまたはポリペプチドがコード化されるような適切な発現系
に、本発明の抗体を含む少なくとも１アミノ酸をコード化する核酸の発現による本発明の
抗体または結合メンバーの産生にまで及ぶ。
例えば、アミノ酸の軽鎖をコード化する核酸およびアミノ酸の重鎖をコード化する第２
の核酸は、本発明の抗体を提供するために発現することができる。
したがって、本発明のさらなるある実施形態において、本発明の抗体または結合メンバ
ーを形成するアミノ酸配列をコード化する核酸を提供する。
通常、本発明の抗体または結合メンバーを形成するアミノ酸配列をコード化する核酸は
、単離されるか、精製された状態で提供されるか、１以上の制御配列を除いては、物質を
含まなくて、実質的に自然にそれと関連しているものを含まないものを提供する。本発明
の抗体または結合メンバーを発現する核酸は、完全にまたは部分的に合成することができ
、ＤＮＡ，ｃＤＮＡおよびＲＮＡを含むが、これらに制限されるものではない。
本発明の抗体または結合メンバーをコード化する核酸配列は、例えばSambrook et al.
"Molecular Cloning", A laboratory manual, cold Spring Harbor Laboratory Press, V
olumes 1 -3, 2001 (ISBN-0879695773)およびAusubel et al. Short Protocols in Molec
ular Biology. John Wiley and Sons, 4th Edition, 1999 (ISBN - 0471250929)に記載さ
れた技術を用いて当業者は容易に調製することができる。前記技術は、（ｉ）ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の核酸サンプルを増幅するための使用、（ｉｉ）化学合成、または
（ｉｉｉ）ｃＤＮＡ配列の調製を含む。本発明のＤＮＡをコード化する抗体または結合メ
ンバーは、コード化ＤＮＡを得て、発現部位のいずれかの側面を適切な制限酵素組換え部
位を同定し、ＤＮＡから前記部位を切断する工程を備える、当業者に既知のあらゆる適切
な方法で生成され、使用される。切断部位は、その後、適切なプロモーターに作動可能と
なるように連結され、適切な発現系、例えば市販の発現系にて発現することができる。或
いは、ＤＮＡの関連部位は、適切なＰＣＲプライマーを用いて増幅することができる。Ｄ
ＮＡ配列への修飾は、部位特異的突然変異誘発法を用いて産生することができる。
本発明の抗体または結合メンバーをコード化する核酸配列は、少なくとも１の前記核酸
を含むプラズミド、ベクター、転写または発現カセットの形状のコンストラクトを提供す
ることができる。コンストラクトは、１以上の前記コンストラクトを含む組換え宿主細胞
内に含むことができる。発現は、適切な核酸配列を含む組換え宿主細胞を適切な条件で培
養することによって、好適に達成することができる。発現後、抗体または抗体断片は、あ
らゆる適切な技術を用いて、単離および／または精製することができ、その後、適切に使
用される。
様々な異なる宿主細胞内でのポリペプチドのクローニング、および発現の系が知られる
。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳類細胞、酵母、昆虫およびバキュロウイルス系を
挙げる。異種ポリペプチドの発現に関する従来技術に利用できる哺乳類細胞株としては、
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞
およびＮＳＯマウス骨髄腫細胞が挙げられる。一般的な、好ましい細菌宿主は、Ｅ． ｃ
ｏｌｉである。抗体および抗体断片の、原核細胞、例えばＥ． ｃｏｌｉにおける発現は
、従来技術として確立されている。真核細胞の培養物における発現は、結合メンバーの産
生の選択肢として当業者が利用することもある。
抗体の生成に関する一般的な技術は、例えばKohler and Milstein (1975) Nature 256:
495-497; US Patent No. 4,376,110; Harlow and Lane, Antibodies: a Laboratory Man
ual, (1988) Cold Spring Harborに記載された方法として、その分野の当業者に周知であ
る。組換え抗体分子の調製に関する技術は、前記参考文献および例えば欧州特許第０，３
６８，６８４号明細書にも記載されている。
本発明のある実施形態において、抗体または結合メンバーの重鎖の可変領域および／ま
たは軽鎖の可変領域をコード化する挿入断片を含む組換え核酸が用いられる。定義による
と、前記核酸は、前記コード化核酸およびその相補性核酸またはこれら相補性（一本鎖）
核酸、またはそれらの相補性核酸（一本鎖）からなるコード化一本鎖核酸、二本鎖核酸を
含む。
さらに、抗体の重鎖の可変領域および／または軽鎖の可変領域をコード化する核酸は、
自然に生じる重鎖の可変領域および／もしくは軽鎖の可変領域またはその突然変異体をコ
ード化する確立された配列を有する核酸を酵素または化学合成することができる。
本発明の抗体は、組換え法によって、直接的ではないが、異種ポリペプチドを有する融
合ポリペプチドであって、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端の特定の切断部位
を有するシグナル配列または他のポリペプチドとして好ましく産生することができる。好
ましく選択される異種シグナル配列は、宿主細胞に認識され、処理される（即ち、シグナ
ルペプチダーゼによって切断した）。自然抗体シグナル配列を認識も処理もしない原核宿
主細胞に関して、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉ
ｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーから選択される原核シグナル配列に置
換される。
＜単離抗体＞
本発明の完全なヒト化抗体、それに由来する結合メンバーまたはそれをコード化するポ
リペプチドに関するものである場合、「単離された」の用語は、前記抗体、結合メンバー
または核酸（ポリヌクレオチド）が単離されたおよび／または精製された形状にあること
を示し、即ち、それらが自然環境で別々にされ、単離されまたは精製され、実質的に精製
されたか、異種形状であるかまたは核酸の場合、必要とされる機能を有するポリペプチド
をコード化する配列以外の原点となる核酸もしくは遺伝子を含まないか、実質的にそれを
含まない。したがって、このように単離した抗体、結合メンバーおよび単離した核酸は、
前記調製が実験室内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で実施したＤ
ＮＡ技術によって調製された場合、それらが自然に関連する物質、例えばそれらの自然環
境またはそれらが調製される環境で（例えば細胞培養）みられる他のポリペプチドまたは
核酸を含まないか、実質的にそれを含まない。
抗体、結合メンバーおよび核酸は、希釈剤またはアジュバントと処方することができ、
依然として、実際に単離された形状で提供されていると考えられる。例えば、免疫分析に
使用するため、マイクロタイタープレートをコーティングするたまに使用する場合、抗体
および結合メンバーは、ゼラチンまたは他のキャリアと混合してもよく、また、診断また
は治療に使用する場合、薬物学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤と混合してもよい。
抗体または結合メンバーは、自然にまたは異種真核性細胞（例えばＣＨＯまたはＮＳＯ細
胞）のいずれかによってグリコシル化できるか、または、それらは（例えば原核細胞の発
現によって産生される）非グリコシル化があり得る。
抗ＴＬＲ２ヒト化抗体分子を含む異種調製は、本発明の一部としても形成される。例え
ば、前記調製は、全長の重鎖およびＣ末端リジンを欠如した重鎖と、異なる程度でのグリ
コシル化とおよび／または誘導体化されたアミノ酸、例えばピログルタミン酸残基を形成
するＮ末端のグルタミンサンの環化と抗体の混合があり得る。
＜投与＞
本発明のモノクローナル抗体または結合メンバーは、単独で投与することができるが、
好ましくは、意図する経路による投与に依存して選択される、適切な薬学的に許容可能な
賦形剤、希釈剤またはキャリアを一般的に含む医薬組成物として投与される。適切な薬学
的なキャリアの例としては：水、グリセロール、エタノール等を含む。
本発明のモノクローナル抗体または結合メンバーは、その治療の必要のある患者にあら
ゆる経路で投与することができる。通常、組成物は、注射または注入によって非経口投与
することができる。非経口投与の好ましい経路の例は、静脈、心臓内、動脈内、腹膜内、
筋肉内、腔内、皮下、経粘膜、吸入または経皮性を含むが、これらに制限されるものでは
ない。投与経路は、局所または腸内、例えば粘膜（肺を含む）、経口、経鼻、直腸をさら
に含むことができる。
組成物が注入可能な組成物、例えば静脈、皮内または皮下への適用として導入される実
施形態において、活性成分は、発熱物質を含まない適切なｐＨ、等張性および安定性を有
する、非経口製剤として許容可能な水溶液の形状とすることができる。従来技術としては
、例えば塩化ナトリウム注入液、リンゲル注入液または乳酸加リンガー注入液等の等張性
賦形剤を使用した適切な溶液を調製するのに適している。防腐剤、安定剤、バッファー、
抗酸化物質および／または他の添加剤を、必要であれば含有させてもよい。
組成物は、微小球体、リポソーム、他の微小粒子の送達系または血液を含むある組織に
配置された徐放製剤によって投与することもできる。
前記技術およびプロトコル並びに本発明よって使用することができる他の技術およびプ
ロトコルの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Gennaro, A.R.
, Lippincott Williams & Wilkins; 20th edition ISBN 0-912734-04-3 and Pharmaceuti
cal Dosage Forms and Drug Delivery Systems; Ansel, H.C. et al. 7th Edition ISBN
0-683305-72-7に見られ、ここに参照として組み込んだものを完全に開示する。
通常、本発明の組成物は、「治療への有効量」で対象に投与され、これは組成物が投与
される対象に利点を十分に示す量である。実際に投与された服用量並びに投与速度および
経時変化は、治療条件の性質および厳しさ、並びに、治療される対象の年齢、性別および
体重等の要因並びに投与経路に依存し、正当な参照文献と決定することができる。さらな
る正当な検討は、組成物の特徴、例えばその結合活性および生体内（ｉｎ−ｖｉｖｏ）プ
ラズマ寿命、処方の抗体または結合メンバーの濃度並びに送達の経路、部位および速度に
ついてなされるべきである。
投与単位は、組成物の単一投与または組成物の複数の投与服用を含むことができる。さ
らに、組成物は、治療のため投与される本発明の抗体または結合メンバーを、投与する状
態への治療に使用される他の治療および薬物で、順にまたは別途投与することができる。
対象に投与することができる投薬単位の例は、１μｇ／ｋｇ／日から２０ｍｇ／ｋｇ／
日、１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日、１０μｇ／ｋｇ／日から１ｍｇ／ｋｇ／
日から選択し得るが、これらの制限されるものではない。ある実施形態において、投薬量
は、抗体の血漿濃度１μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬが得られる条件である。しかしな
がら、実際投与した投与組成物並びに投与の速度および経過変化は、治療条件の性質およ
び苛酷性に依存する。
＜定義＞
他に定められない限り、ここに使用される用語の全ての技術および科学用語は、本発明
の分野の当業者に一般的に理解できる意味を有する。
文脈が他に必要としない限り、本明細書によると、「含む(“comprise”または“inclu
de”)」の用語またはその活用、例えば「含む、備える、包含する(“comprises”または
“comprising”、“includes”または“including”)」は、定められた整数または整数の
群を包含し、あらゆる他の整数または整数の群を除くと解釈される。
本明細書に使用するように、「冠詞(“a”,“an”および“the”)」等の用語は、文脈
に他に明らかに指示しない限り、単数および複数の指示対象を含む。したがって、例えば
「活性剤（ａｎ ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）」または「薬学的活性剤（ａ ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）」の示すものとしては、単一の
活性剤並びに２以上の異なる活性剤の組み合わせを含む、一方、「キャリア（ａ ｃａｒ
ｅｅｒ）」の参照するものとしては、２以上のキャリアの混合物並びに単一のキャリア等
を含む。
「特異的な結合」、「選択的な結合」または「結合特異性」の用語は、本発明の完全な
ヒト化抗体または結合化合物の非標的エピトープの結合によって生じた、より高い親和性
でＴｏｌｌ様受容体に存在する標的エピトープに結合する性能を示す。ある実施形態にお
いて、特異的な結合は、非標的エピトープより少なくとも１０，５０，１００，２５０，
５００または１０００倍より高い親和性で標的に結合することを示す。ある実施形態にお
いて、前記親和性は、親和性ＥＬＩＳＡ分析によって測定される。ある実施形態において
、親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ分析によって測定することができる。ある実施形態において
、親和性は、速度論的方法によって測定することができる。ある実施形態において、親和
性は、平衡／溶液法によって測定することができる。
ここに使用する「有効量」または「治療への有効量」の用語は、腎臓におけるＴＬＲ２
の介在による炎症の抑制に必要とされるか、ＴＬＲ２介在による腎臓病もしくは少なくと
も１のその症状またはそれに関連のある状態の重症度を軽減するおよび／またはそれを改
善する本発明の薬剤、結合化合物、小分子、融合タンパク質またはペプチド模倣薬の量を
意味する。
ここに使用する「予防への有効量」の用語は、本発明の化合物を対象に投与した後、Ｔ
ＬＲ２介在による疾患の初期発生、進行もしくは再発、炎症状態または少なくともその１
の症状を予防するために必要とされる組成物の量に関する。
ここに使用する「治療（treatment）」および関連のある用語、例えば「治療する(“tr
eat”および“treating”)」の用語は、ＴＬＲ２介在による状態または少なくとも１のそ
の症状の進行、重症度および／もしくは期間を軽減することを意味し、前記軽減または改
善は、本発明のＴＬＲ２結合エピトープに特異性を有する結合化合物を投与することを結
果として生じる。したがって、「治療」の用語は、対象に対して効果を奏する、あらゆる
計画を示す。治療は、現状に関するものであるか、予防（予防的治療）に関するものがあ
り得る。治療としては、治癒するか、軽減するか、予防効果を挙げることができる。ここ
に参照する「治療的」および「予防的」な治療は、それらのより広い範囲の文脈として考
えられる。「治療」の用語は、必ずしも、対象が完全に回復するまでの治療を意味するも
のでない。同様に、「予防」は、必ずしも、対象が疾患状態を最終的に減少することを意
味しない。
本明細書に使用するように、「対象」という用語は、動物、好ましくは哺乳類、特にヒ
トを示す。特定の実施形態において、対象は哺乳類、特にヒトである。用語「対象」は、
本明細書で使用される「患者」という用語と置き換えて同じ様に使用される。
本発明は、説明の目的で提供するものであり、本発明に制限することとして解釈するこ
とを目的としない以下の例を参考として記載する。
〔実施例１−完全なヒト化モノクローナル抗体の産生〕
本発明のＴＬＲ２拮抗抗体は、通常、完全なヒト化抗体である。即ち、抗体は、完全に
ヒト起源のものであるため、非ヒト類、例えばマウス由来の領域またはアミノ酸の組み合
わせを含まない。
本発明の完全なヒト化抗体を産生する１の方法は、国際公開第２００６／０８２４０６
号に記載されたヒト抗体技術（Antitope、英国）を使用して実施される。該抗体は、ヒト
抗体由来のアミノ酸配列の２以上の断片を含む複合タンパク質である。断片は、最終的な
抗体におけるＴ細胞エピトープの存在が回避できるように選択することができ、例えば残
基をスクリーニングし、特に軽鎖および重鎖の可変領域がＭＣＨクラスＩＩ結合モチーフ
を含まないこと、または、それらがＭＨＣクラスＩＩへのペプチド結合をしっかりと固定
する残基を含まないことを確実にする。さらに、本発明の完全なヒト化抗体の可変領域を
分析するｉｎ−ｓｉｌｉｃｏ法が、Ｔ細胞エピトープの不存在を確実化させるために使用
される。
合成ヒト抗体技術を用いた完全なヒト化抗体の産生の際、最終抗体は、数々の配列断片
の組成物であって、全てヒト起源であって、全て異なるヒト由来抗体を含むように産生す
る。簡潔に、技術としては、開始するモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変領域、
例えば相補性決定領域（ＣＤＲ）を同定するため、Ｔｏｌｌ様受容体２に特異的な結合を
有するネズミまたはキメラ抗体の分析工程を備える。その後、抗体の可変領域のタンパク
質モデルは、Ｓｗｉｓｓ ＰＤＢを用いた鋳型として既存の抗体構造を用いて生成する。
抗体の結合特性に重要である可能性のある本来の抗体の可変領域部位内の重要な「抑制」
アミノ酸を同定するため、その後、これらの構造モデルを分析する。フレームワーク残基
の数と共にＣＤＲ領域内に含まれる残基（カバットおよびコチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）の定
義の双方を用いて規定した）は、通常、重要である。タンパク質モデルからの構造情報は
、抗体の確認および既存の抗体構造および配列のデータベースと構造的に同一の結合に重
要な残基を同定し、比較するために使用される。その後、これらアミノ酸は、１以上の最
終的なヒト化配列の変異体を包含する候補とすることができる。本発明の抗体の調製にお
いて、本発明の完全なヒト化抗体に基づくネズミ抗ＴＬＲ２抗体（ハイブリドーマクロー
ンＴ２．５由来のマウスＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）抗体HyCult Biotechnology b.v
., Cell Sciences, Canton,米国:カタログ番号1054）のＶＨおよびＶＫ配列の双方は、典
型的なフレームワーク残基、特に抗体が非常に一般的な配列構成を重要な位置、例えばカ
バット残基４５−４９（ＬＥＷＩＧ）および９２−９４（ＣＡＲ）で有するＶＨにおいて
含むことを観測した。
最終的なヒト化配列を含む可能性のある、潜在的な重鎖および軽鎖のヒト配列を同定す
るため、モノクローナル重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列の起源となる配列を、
その後、相応するヒト化変領域の配列の断片と比較した。最後に、ヒト化重鎖および軽鎖
を、その後、完全にヒトの可変領域配列の断片から設計する。
全長の合成Ｖ領域を得るため、アニールされ、ライゲーションされ、ＰＣＲ増幅された
重なり合うオリゴヌクレオチドの一群を用いて、最初に、ＶＨおよびＶＫ領域の遺伝子を
合成して、完全なヒト化抗体を設計し、産生した。その後、ポリヌクレオチド配列を、適
切な発現ベクター、例えばＩｇＧ等の抗体をコード化する発現ベクター系等の、当業者に
周知のもので直接クローン化した。本発明のＯＰＮ−３０５抗体の産生に使用した発現ベ
クターの場合、発現ベクター系は、修飾されたヒンジ領域（Ｓ２４１Ｐ置換）並びに重鎖
およびκ軽鎖を含むＩｇＧ４由来配列に関する。重鎖および軽鎖は、その後、エレクトロ
ポーレーションおよび選択した２００ｎＭメトトレキサート（Sigma,カタログ番号M8407
）を用いて、ＮＳＯ細胞内に安定的に形質転換された。メトトレキサート耐性群を、Ｉｇ
Ｇ発現レベルに関して試験した。
本実施例ではＮＳ０細胞を使用したが、当業者に既知のあらゆる適切な細胞株を使用す
ることができる。特に、哺乳類細胞培養物中の哺乳類細胞の使用は、本発明の抗体および
結合断片の産生のための基盤として好ましい。特に、哺乳類細胞の使用が、タンパク質に
適用されるＮ−グリコシル化特性またはグリコシル化特性は、ヒトタンパク質に見られる
ものと同様のため、好適である。哺乳類細胞培養に一般的に用いられる細胞株としては、
ＣＨＯ，ＮＳ0ハイブリドーマ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞およびＰＥＲ
．Ｃ６（商標）ヒト細胞が挙げられる。生産規模の体積で、哺乳類細胞培養に使用するた
め、最も一般的に用いられる哺乳類細胞株は、ＣＨＯおよびＮＳ０細胞株である。これら
細胞種は、遺伝子組換えが比較的容易であり、幅広い特徴を有していて、大規模に成長す
ることが比較的容易であり、溶液中に組換えタンパク質の高い滴定量を分泌することがで
きる。ＣＨＯおよびＮＳ０細胞株の双方は、高いタンパク質の発現レベルで産生すること
ができる。
哺乳類細胞に基づくタンパク質発現基板に加えて、植物に基づく発現系または遺伝子導
入動物系の使用は、本発明のタンパク質の生成の使用の際にも用いることができる。
その後、プロテインＡセファロースカラム（GE Healthcareカタログ番号110034-93）を
通して、ＯＤ２８０ｎｍで定量化して、Ｅｃ（０．１％）＝１．４３の場合に算出された
減滅係数を用いることによって、複合抗体を、細胞培養上清から精製した。その後、競合
ＥＬＩＳＡ分析において、Ｔｏｌｌ様受容体２の結合を確認するため、精製された抗体を
試験した。前記結合は、参照抗体、例えばＴｏｌｌ様受容体２の結合抗体のビオチン化形
状の完全なヒト抗体に基づく設計の結合と比較することができる。特に、ＥＬＩＳＡ競合
分析からの吸収率は、サンプル濃度に対して、完全なヒトおよび最初のビオチン化抗体に
関係のあるそれぞれのデータセットを通るように合わせた直線をプロットすることができ
る。線の公式は、ビオチン化参照抗体のＴＬＲ２への結合を５０％阻害するために必要と
される濃度を算出するために使用した。ＩＣ５０値は、結合効率の倍率差を算出するため
に使用することができる。測定された結合効率は、産生された完全なヒト化抗体の特異性
の重要な測定である。さらなる比較、例えば完全なヒト化抗体を同じ抗原に特異的な結合
を有する。キメラまたはネズミ抗体と比較することも実施することができる。
〔実施例２−ＯＰＮ−３０５モノクローナル抗体の結合特徴の決定〕
驚くべきことに、本発明者は、完全にＴｏｌｌ様受容体２機能を拮抗するため、Ｔ２．
５ ＴＬＲ２拮抗ネズミモノクローナル抗体がＣＤ３２への結合に必要であることを同定
した。したがって、Ｔ２．５抗体の使用と関連のあるこの機能制限が、そのＴｏｌｌ様受
容体２の生物活性の中和効果を拮抗するためのＯＰＮ−３０５モノクローナル抗体の使用
とも関連することを確認するため、実験を実施した。
＜材料および方法＞
ＴＨＰ−１細胞は、ヒト末消血単球細胞である。Ｔｏｌｌ様受容体リガンドに応じて、
転写制御因子ＮＦ−κＢおよび他の転写制御因子は、ＴＨＰ１細胞内で活性化されている
。ＴＨＰ−１青色細胞株を、いくつかの転写制御因子、例えばＮＦ−κＢおよびＡＰ−１
による誘導性プロモーターの調節下、分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺
伝子をコード化することが報告されているプラズミドを安定的に形質転換した。ＴＨＰ−
１ ＣＤ１４青色細胞株の変異体は、高い感度で細胞表面タンパク質を過剰発現する。結
果として生じるＴＨＰ−１ ＣＤ１４青色細胞は、選択的なマーカーであるゼオシンおよ
びブラストサイジンに抵抗性である。ＴＬＲ刺激に応じて、ＴＨＰ−１青色細胞は、転写
制御因子、その後、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅレポーター系を用いて検出されるＳＥＡＰ分
泌を活性化する。ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅは、分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥ
ＡＰ）活性を、細胞培養物の上清中で測定するために開発された比色分析の酵素分析であ
る。ＳＥＡＰの存在下におけるＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ培地は、紫青色への変化を肉眼で
簡便に定性的に検出するか、６２５−６５５ｎｍでの吸光度（ＯＤ）を計測することによ
って定量化することができる。
ＴＨＰ ＣＤ１４青色細胞を、５μｇ／ｍＬ−０．１８μｇ／ｍＬの範囲の抗ＣＤ３２
ａ抗体（RnD #AF1875）もしくは抗ＣＤ３２ｂ抗体（RnD #AF1330）またはヤギＩｇＧと既
に混合されたＯＰＮ−３０５抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体（１μｇ／ｍＬ）と、２０ｎ
ｇ／ｍＬのＴＬＲ１／ＴＬＲ２拮抗剤Ｐａｍ３ＣＳＫ４で刺激する前、５分間、３７℃で
インキュベートした。ＯＰＮ−３０５モノクローナル抗体は、配列番号：２としてここに
規定される軽鎖および配列番号：５としてここに規定される重鎖を有する完全なヒト化抗
体である。
その後、細胞を、一晩、３７℃でインキュベートした。その後、上清を取り除き、ＱＵ
ＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（Invivogen,サンディエゴ、米国）の添加前に熱不活性化した。ＮＦ
−κＢの活性を示す吸光度を、吸光光度計を用いて６５０ｎｍで測定した。
図９に示すように、これらの結果は、Ｔｏｌｌ様受容体２の拮抗剤としてのＯＰＮ−３
０５の機能的活性は、抗ＣＤ３２ａ／ｂ抗体によってブロックされないことを示す。した
がって、これは、ＯＰＮ−３０５によって介在されるＴｏｌｌ様受容体２の中和活性が、
ＣＤ３２ａまたはＣＤ３２ｂへの結合に依存しないことを示す。
〔実施例３−Ｔｏｌｌ様受容体２の拮抗作用におけるＣＤ３２の役割〕
実施例２の結果は、本発明のＯＰＮ−３０５の完全なヒト化抗体によるＴｏｌｌ様受容
体２の拮抗剤が、ＣＤ３２（ＣＤ３２ａまたはＣＤ３２ｂのいずれか）への抗体結合に依
存しないことを示唆する。
これを確認し、この分野において既知の他のＴＬＲ２拮抗抗体、例えばＴ２．５ネズミ
ＴＬＲモノクローナル抗体（ＯＰＮ−３０１）との比較を提供するため、さらなる実験を
実施した。
＜材料および方法＞
ＴＨＰ−１ ＣＤ１４青色細胞（Invivogen,サンディエゴ、米国）を、ＣＤ３２ａまた
はＣＤ３２ｂをブロックする抗体の量で、前もってインキュベートした。
前もってインキュベートしたＴＨＰ−１ ＣＤ１４青色細胞は、多量の（ｉ）抗ヒトＦ
ｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）抗体（前記実施例に使用したようなR&D Systems,カタログ番
号AF1875）、（ｉｉ）抗ヒトＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）抗体（R&D Systems,カタログ番号
AF1330）または（ｉｉｉ）アイソタイプコントロール抗体（ヤギＩｇＧ（R&D systems,カ
タログ番号AB-108-C））とインキュベートした。その後、細胞は、２００ｎｇ／ｍＬのネ
ズミ抗ＴＬＲ２抗体Ｔ２．５（ＯＰＮ−３０１）または完全なヒト化ＯＰＮ−３０５抗体
のいずれかを添加された。細胞を、その後、一晩、ＴＬＲ２作用薬Ｐａｍ３ＣＳＫ４（In
vivogen）１００ｎｇ／ｍＬで刺激した。
＜結果＞
ＮＦ−κＢに依存するＳＥＡＰ生成は、細胞上清で測定された。図１０Ａは、ＯＰＮ−
３０１（Ｔ２．５ネズミ抗ＴＬＲ２抗体）にさらされた細胞の結果を示す。図１０Ｂは、
ＯＰＮ−３０５の完全なヒト化ＴＬＲ２拮抗抗体にさらされた細胞に関する結果を示す。
図１０Ａにおいて、カラムＡは、Ｐａｍ３ＣＳＫ４のみで刺激された細胞に関する。カラ
ムＢは、ＯＰＮ−３０１抗体にさらされた細胞に関する。カラムＣは、０．４μｇ／ｍＬ
の抗ＣＤ３２ａ／ｂまたはコントロールヤギＩｇＧ抗体を加えられたＯＰＮ３０１抗体に
関する。カラムＤは、２μｇ／ｍＬ抗ＣＤ３２ａ／ｂ抗体またはコントロールヤギＩｇＧ
抗体を加えられたＯＰＮ３０１抗体に関する。カラムＥは、ＯＰＮ３０１抗体と１０μｇ
／ｍＬ抗ＣＤ３２ａ／ｂ抗体またはコントロールヤギＩｇＧ抗体に関する。
図１０Ｂにおいて、カラムＡは、Ｐａｍ３ＣＳＫ４のみで刺激された細胞に関する。カ
ラムＢは、ＯＰＮ−３０５抗体にさらされた細胞に関する。カラムＣは、０．４μｇ／ｍ
Ｌ抗ＣＤ３２ａ／ｂまたはコントロールヤギＩｇＧ抗体を加えられたＯＰＮ３０５抗体に
関する。カラムＤは、２μｇ／ｍＬ抗ＣＤ３２ａ／ｂ抗体またはコントロールヤギＩｇＧ
抗体を加えられたＯＰＮ３０５抗体に関する。カラムＥは、ＯＰＮ３０５抗体と１０μｇ
／ｍＬ抗ＣＤ３２ａ／ｂ抗体またはコントロールヤギＩｇＧ抗体に関する。
２つの図に示されるデータの比較は、ＣＤ３２ａまたはＣＤ３２特異的な抗体でのＣＤ
３２のブロッキングが、ＯＰＮ３０５のＴＬＲ２中和性能に効果を奏しないため、ＯＰＮ
−３０５によって介在されているＴＬＲ２拮抗作用は、ＣＤ３２と相互作用する抗体に依
存しないことを明らかに示す。対照的に、ネズミＴ２．５抗体（ＯＰＮ−３０１）は、Ｔ
ｏｌｌ様受容体２機能活性を完全に中和するため、ＣＤ３２結合に依存性を示す。理論に
抑制されることなく、発明者は、したがって、ＴＬＲ２拮抗作用の介在において、ＯＰＮ
−３０１抗体が、ＴＬＲ２、さらにはＣＤ３２にも結合し、このＣＤ３２との相互作用が
、Ｔｏｌｌ様受容体２の拮抗作用を介在するのに必要であることを予測した。したがって
、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能活性に拮抗する関係にあるＯＰＮ−３０５抗体およびＯＰＮ
−３０１抗体に用いられる作用機序に機能的な差が存在する。それゆえに、ＯＰＮ−３０
１のＴＬＲ２に拮抗的な活性は、ＣＤ３２への結合をブロックすることによって阻害する
ことができる。しかしながら、ＯＰＮ−３０５のＣＤ３２、ＣＤ３２ａまたはＣＤ３２ｂ
へ結合する性能をブロックすることは、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能的活性を拮抗するその
性能に影響を及ぼさない。
〔実施例４−ＯＰＮ−３０５のＴｏｌｌ様受容体２への結合特異性の確認〕
本発明のＯＰＮ−３０５モノクローナル抗体が、Ｔｏｌｌ様受容体２、特にヒトＴｏｌ
ｌ様受容体２に特異的な結合を示すことを確認するため、実験を設計した。
＜材料および方法＞
ＴＬＲ１／ＴＬＲ２へテロ二量体の形成を可能とするため、Ｔｏｌｌ様受容体１および
Ｔｏｌｌ様受容体２と安定的に形質転換したＨＥＫ ２９３（ヒト胎児由来腎臓２９３）
細胞は、ビオチン化形状のネズミ抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１（Ｔ２．５）１．０μｇ
／ｍＬ単独で、または、完全なヒト化抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０５またはＯＰＮ−３０
５ ＩｇＧ４アイソタイプコントロール抗体１．０μｇまたは１０μｇ／ｍＬの存在下の
いずれかで３０分間、氷の上でインキュベートした。
ＯＰＮ−３０１モノクローナル抗体は、ネズミＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体（マウスＴｏｌ
ｌ様受容体２（ＴＬＲ２）抗体、クローンＴ２．５、HyCuIt Biotechnology b.v., Cell
Sciences, Canton,米国:カタログ番号1054）である。
ＯＰＮ−３０５モノクローナル抗体は、本明細書に配列番号：２として規定される軽鎖
および本明細書に配列番号：５として規定される重鎖を有する完全なヒト化抗体である。
その後、細胞を、洗浄し、ＰＥＣｙ７に結合されたストレプトアビジンとさらに３０分
間インキュベートした。ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Becton Dickinson）を用いて結合を測
定した。結果は図１１に示す。
図１１Ａは、ＯＰＮ−３０５結合に関する（変異体２１として標識する）。左から右に
移動して、最初のピークの最も濃い線は、赤線に関するものである。最初のピークのより
薄い線は、緑線に関するものである。右に移動して、第３、第４および第５のピークは、
それぞれ紫、青および黒ピークである。ＯＰＮ−３０５がＨＥＫ細胞におけるヒトＴＬＲ
２への結合に関してＯＰＮ−３０１と競合するＯＰＮ−３０１のみ（黒棒グラフ）と比較
して、ＯＰＮ−３０５の結合を、青または紫の棒グラフ（ＯＰＮ−３０１およびＯＰＮ−
３０５を示す）の左への移動によって示す。結論として、図１１Ａは、ピークの用量依存
を示し、これは、ヒトＴｏｌｌ様受容体２へのＯＰＮ−３０１およびＯＰＮ−３０５の間
の競合を示す。
図１１Ｂは、ＩｇＧ４アイソタイプコントロールとの結合の結果を示す。ＩｇＧ４アイ
ソタイプコントロール抗体が、ＴＬＲ２への結合特異性を有さないため、それは結合に競
合的でない。したがって、図１１Ｂの右側に示すように、集められて、第２ピークとして
示す黒、紫または青のピークが存在する。左側のピークは、赤ピーク（より濃い線）およ
び緑ピーク（より薄い線）に関するものである。したがって、これらの結果は、ＯＰＮ−
３０５がヒトＴｏｌｌ様受容体２に特異的に結合することを確実にする。
〔実施例５−ＯＰＮ−３０５のネズミＴｏｌｌ様受容体２への交差反応〕
実施例４において、ＯＰＮ−３０５がヒトＴｏｌｌ様受容体２に特異的結合を示すこと
を測定した後、この実験は、ＯＰＮ−３０５モノクローナル抗体が、Ｔｏｌｌ様受容体２
種内交差反応であり、ＯＰＮ−３０５が哺乳類Ｔｏｌｌ様受容体２の他の形状、例えばネ
ズミＴｏｌｌ様受容体２に結合することを可能とすることを示すかを評価した。
＜材料および方法＞
Ｊ７７４マウスマクロファージを、１×１０６／ｍＬで、５μｇ／ｍＬのＯＰＮ−３０
５（OPN-305-21として示す）、ＯＰＮ−３０１（Ｔ２．５）または関連のあるアイソタイ
プコントロール抗体（ＯＰＮ−３０１へのネズミＩｇＧ１およびＯＰＮ−３０５へのヒト
ＩｇＧ４）の存在下、６時間、３７℃で培養した。細胞を、ＴＬＲ２拮抗剤ＨＫＬＭ（In
vivogen,サンディエゴ、米国,カタログ番号ｔｌｒ−ｋｉｔ２）にさらした。ＨＫＬＭは
、凍結乾燥され、熱殺菌されたグラム陽性通性細胞内細菌であるリステリア菌である。そ
の後、上清を取り除き、ネズミＴＮＦ−αレベルを、RnD systems (R&D Systems)からの
特定のＥＬＩＳＡデュオセットによって測定した。
＜結果＞
結果は図１２のグラフに示す。これは、ＯＰＮ−３０１の阻害と類似する方法において
、ＯＰＮ−３０５がネズミＴＬＲ２反応を抑制することを示す。したがって、それが表面
またはネズミ細胞で発現するＴｏｌｌ様受容体２に結合するため、ＯＰＮ−３０５は、交
差反応性がある。
結論として、ＯＰＮ−３０５は、ＴＬＲ２拮抗剤で刺激された、ネズミＪ７７４マクロ
ファージからのＴＮＦ−α分泌を抑制することを示した。
〔実施例６−ＯＰＮ−３０５のサルＴｏｌｌ様受容体２への交差反応性〕
さらなる実験は、ＯＰＮ−３０５のサル細胞で発現されているＴｏｌｌ様受容体の特異
的結合を測定するため、実施された。これは、ＯＰＮ−３０５抗体が、ヒトおよびネズミ
の形状のみより、種々の哺乳類形状のＴｏｌｌ様受容体２に交差反応性であるかを同定し
た。
ＯＰＮ−３０５のサルＴｏｌｌ様受容体２への結合を、直接的な抗体および競合結合分
析の双方によって測定した。
（ｉ）直接的な結合
カニクイザルからの全血を、１．０μｇ／ｍＬのＯＰＮ−３０５またはＩｇＧ４アイソ
タイプコントロール抗体で、３０分間、室温でインキュベートして、その後、赤血球を溶
解するため、ＰｈａｒｍＬｙｓｅ（BD Biosciences）とインキュベートして、それからＦ
ＩＴＣ標識された抗ヒトＩｇＧ４と検出した。
結果を図１３Ａ，ＢおよびＣに示す。異なる細胞種を、それらの前および側面の散乱特
性にしたがってゲート（gated）した。図１３Ａは、顆粒白血球に関する。図１３Ｂは、
単球に関する。図１３Ｃは、リンパ球に関する。結合は、アイソタイプコントロール抗体
（緑棒グラフ−これは、左から右に移動させた第２ピークであり、このピークは薄い色で
ある）とインキュベートした細胞と比較して、ＯＰＮ−３０５（青棒グラフ−これは、右
側の群のピークのピークである）とインキュベートした細胞の右への棒グラフの移動によ
って示される。図１３Ａおよび１３Ｂの結果は、緑ピークと比較して青ピークがさらに右
に移動したことを示す。これは、ＯＰＮ−３０５が顆粒白血球および単球で発現している
サルＴＬＲ２に結合することを示す。したがって、ＯＰＮ−３０５は、異なる細胞種で発
現しているＴｏｌｌ様受容体２に幅広い交差反応を示す。
（ｉｉ）競合分析
カニクイザルからの全血は、１．０μｇ／ｍＬのビオチン化ＯＰＮ−３０１単独で、ま
たは、ＯＰＮ−３０５もしくはＩｇＧ４アイソタイプコントロール抗体（ＯＰＮ３０５）
１．０μｇもしくは１０μｇ／ｍＬの存在下のいずれかで３０分間、室温でインキュベー
トされた。細胞は、その後、洗浄され、ＰＥＣｙ７に結合されたストレプトアビジンとさ
らに３０分間インキュベートされた。
ＯＰＮ−３０１モノクローナル抗体は、ネズミＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体（マウスＴｏｌ
ｌ様受容体２（ＴＬＲ２）抗体、クローンＴ２．５、HyCuIt Biotechnology b.v., Cell
Sciences, Canton,米国:カタログ番号1054）である。
ＯＰＮ−３０５モノクローナル抗体は、本明細書に配列番号：２として規定される軽鎖
および本明細書に配列番号：５として規定される重鎖を有する完全なヒト抗体である。
結合は、Becton DickinsonからのＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒを用いて測定した。結果を図
１４Ａ，ＢおよびＣに示す。図１４Ａは、顆粒球に関する。図１４Ｂは、単球に関する。
図１４Ｃは、リンパ球に関する。ＯＰＮ−３０５の結合は、ＯＰＮ−３０５がＯＰＮ−３
０１とサルＴＬＲ２への結合に関して競合する結合に関して、ＯＰＮ−３０１単独と比較
して、緑棒グラフの左への移動によって示された。したがって、ＯＰＮ３０５は、サルＴ
ｏｌｌ様受容体２結合に関して競合していることが、再度、観測できる。これは、ＯＰＮ
−３０５がヒト、マウスまたはサル細胞で発現のあるＴｏｌｌ様受容体２に交差反応があ
ることをさらに確認することができる。
〔実施例７−ＯＰＮ−３０５モノクローナル抗体の免疫性〕
ＯＰＮ−３０５抗体の分析は、免疫反応、例えばＨＡＭＡ反応に結果として生じること
があり得る、抗体が投与される対象によって産生された抗体を免疫性エピトープの存在を
見出すため、実施された。前記のように、Ｔ細胞エピトープの存在は、抗体に対する中和
抗体反応の産生が、治療目的のために患者に投与するのにもはや適していない結果を生じ
るため、非常に望ましくない。したがって、Ｔ細胞エピトープが明らかに存在していない
ことを確認するため、ＯＰＮ−３０５抗体をスクリーンした。
＜材料および方法＞
＜ドナーＰＢＭＣの調製および選択＞
末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）をNational Blood Transfusion Service (Addenbrooke'
s Hospital,ケンブリッジ、英国)から健康な群のドナー軟膜（２４時間以内に献血した）
から単離した。ＰＢＭＣは、軟膜からＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ（商標）（Axis-Shield,ダン
ディ、英国）密度遠心によって単離され、ＣＤ８＋ＲＯＳＥＴＴＥＳＥＰ（商標）（Stem
Cell Technologies Inc., ロンドン、英国）を用いて、ＣＤ８＋Ｔ細胞は減少された。ド
ナーは、組織型判定キット（Biotest, Landsteinerstrasse,デンマーク）に基づくＢｉｏ
ｔｅｓｔ ＳＳＰ−ＰＣＲを用いてＨＬＡ−ＤＲハプロタイプを同定し、並びに、コント
ロール抗原であるスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）（Pierce,ロックフォード、米国）へ
のＴ細胞の反応を測定することによって特徴付けられた。ＰＢＭＣは、その後凍結され、
必要とされるまで液体窒素に保管された。
世界人口のＨＬＡ−ＤＲアロタイプを発現する数および頻度を最も示す２１ドナーの一
団を選択した。世界人口において発現されるものに対する一団において発現したアロタイ
プの分析は、＞８０％の範囲を達成し、全ての主要なＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子（頻度＞５
％で世界人口に発現した個々のアロタイプ）をはっきり示していることを明らかにした。
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ経時変化のＴ細胞増殖分析
国際公開第２００７／０９９３４１号に教示するように、Ｔ細胞エピトープの存在を決
定するため、抗体を分析の対象とした。個々のドナーからのＰＢＭＣを解凍し、計数して
生存率を評価した。細胞は、室温ＡＩＭＶ培養培地中（インビトロゲン、ペイズリー、英
国）で回復され、ＡＩＭＶで４．６×１０６ＰＢＭＣ／ｍＬまで再懸濁された。計１ｍＬ
増殖細胞ストックを２４ウェルプレートに添加し、それぞれのドナーに対してバルク培養
を確立した。サンプルあたり最終濃度５０μｇ／ｍＬが得られるように計１ｍＬのそれぞ
れ希釈したテストサンプルをＰＢＭＣに添加した。それぞれのドナーに対して、陽性対象
（１００μｇ／ｍＬのＫＬＨでインキュベートした細胞）および陰性対象（培養培地のみ
でインキュベートした細胞）も含有した。最初の４ドナーに関して、付加的なコントロー
ルは、Ｔ細胞反応の調節をテストサンプルでテストするために含まれ、テストサンプルお
よびＫＬＨの双方ともＰＢＭＣに添加した。ＫＬＨ単独でのこれらサンプルの比較は、増
殖へのテストサンプルの効果を評価するために使用することができる。培養物は、計８日
間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートされた。５，６，７および８日目、それぞれの
ウェル内の細胞を徐々に再懸濁し、丸底９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに３×１
００μＬアリコートで移した。培養物は、１００μＬのＡＩＭＶ培養培地中１μＣｉ［３
Ｈ］−チミジン（Perkin Elmer（商標）, Waltham,マサチューセツ州、米国）を適用し、
さらにTomTec Mach III細胞ハーベスターを用いてフィルターマット（Perkin Elmer（商
標）, Waltham,マサチューセツ州、米国）上に収穫の１８時間前インキュベートした。各
々のウェルにつき１分あたりのカウント（ｃｐｍ）を、ＭＥＬＴＩＬＥＸ（商標）（Perk
in Elmer（商標）, Waltham,マサチューセツ州、米国）シンチレーションカウントによっ
てパララックス(paralux)のマイクロプレートβカウンターの低いバックグラウンドカウ
ントモードで測定した。テストサンプルの潜在的毒性を評価するため、細胞生存率カウン
ト（ＶＩＣＥＬＬ（商標）カウンターおよびトリパンブルー染色による除外を用いた）は
、テスト培養物のサンプル、培地およびＫＬＨコントロールに最初の１０ドナー
に対して７日間インキュベートした後、実施された。
＜ＥｐｉＳｃｒｅｅｎデータ分析＞
増殖分析に関して、２以上の刺激指数（ＳＩ）の実験的閾値（ＳＩ≧２）を、以前確立
し、それによって前記増殖反応を誘発するサンプルは、陽性と考えられる（境界線上のＳ
Ｉ＞１．９５をハイライトしたものを含む）。広範囲に亘る分析開発および以前の研究は
、大きい数の偽陽性反応を検出することなく、これが最高感度を可能とする最小限のシグ
ナルとノイズの閾値であることを示す。増殖データセット（ｎ＝３）について、陽性反応
を統計学および実験による閾値によって規定した：
テストウェルのｃｐｍを培地コントロールウェルに対して２サンプルの対応のないスチ
ューデントt-検定を用いて比較することによる反応の有意性（ｐ＜０．０５）。
２を超える刺激指数（ＳＩ≧２）、ＳＩ＝テストウェルの平均（ｃｐｍ）／平均培地コ
ントロールウェル（ｃｐｍ）
さらに、アッセイ内の変化は、複製培養物からの生データの分散係数および標準偏差（
ＳＤ）を算出することによって評価した。
＜結果＞
抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０５（ＶＫ５／ＶＨ４）を、均一になるまでプロテインＡ親
和性クロマトグラフィで精製し、次いでサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。
変異体の名称ＶＫ５Ａ／Ｈ４は、本明細書に開示したＯＰＮ−３０５完全ヒト化モノク
ローナル抗体である。ＯＰＮ−３０５モノクローナル抗体は、本明細書の配列番号：２に
規定した軽鎖アミノ酸配列、および本明細書の配列番号：５に規定した重鎖アミノ酸配列
を有する、完全なヒト化抗体である。
全ての調製は、モノマー、非凝集抗体（図１５ＡおよびＢ）を示す単一のピークに由来
し、＜５ＥＵ／ｍｇでエンドトキシンを含むことが分かった。
免疫性の相対危険度を測定するため、３つのテストサンプルを、２１の健康なドナーの
一団に対してＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）（Antitope、英国）経時変化Ｔ細胞分析で試験
した。飽和濃度を提供したこの量は、検出可能なタンパク質特異的なＴ細胞反応を十分に
刺激するため、サンプルを最終濃度５０μｇ／ｍＬで試験した。
Ｔ細胞調節および細胞毒性の研究の結果を分析した。７日後の培養物の細胞生存率は、
６５から９５％であり、全てのテストサンプル、培地コントロールおよびＫＬＨコントロ
ール間で同様である。したがって、テストサンプルは、分析に使用した細胞に毒性作用は
ないと考察した。さらに、図１６は、ＫＬＨ単独で、または、テストサンプルの存在下の
いずれかに誘発されるＳＩ間で、有意差が存在しないこと（スチューデントt-検定 ｐ＜
０．０５）を示す。これは、テストサンプルが、ＫＬＨに応じてＣＤ４＋Ｔ細胞活性を直
接調節しないことを示唆する（コントロール抗原）。図１６は、細胞障害およびＴ細胞調
節活性に関するテストサンプルのプレスクリーンの結果を示す。サンプル１は、キメラ抗
ＴＬＲ２（ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域に結合したＴ２．５ネズミ抗体に由来するＦ’ａｂ断
片）、サンプル２は、抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０５（ＶＫ５Ａ／Ｈ４，ＯＰＮ３０５）
、サンプル３は、ＶＫ５Ａ／Ｈ５と指定する変異体抗ＴＬＲ２抗体である。
ＯＰＮ−３０５（ＶＫ５／ＶＨ４、ＯＰＮ−３０５）およびＶＫ５／ＶＨ５の比較抗Ｔ
ｏｌｌ様受容体２抗体、並びに抗ＴＬＲ２キメラ抗体で実施されたＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（
商標）による経時変化の増殖分析からの結果を分析した（図１７Ａ，ＢおよびＣ）。２１
人のドナーのうち、４人のキメラ抗ＴＬＲ２抗体による刺激反応であって（研究一段１８
％）、ＳＩ≧２および有意性は、スチューデントt-検定で達成された（ｐ＜０．０５）。
ドナー２０は、テスト期間を通して高いＳＩで特に活発な反応を示し、ドナー３について
も、６日目に強い反応（ＳＩ＝６．９９）が観測された。対照的に、研究集団におけるド
ナーは、ＯＰＮ−３０５に陽性的に反応しなかった。ＯＰＮ−３０５（ＶＫ５Ａ／Ｈ４）
抗体は、したがって、キメラ抗体に陽性反応を示したドナーにおいて、あらゆる優位なＴ
細胞反応を産生しなかった。
＜結論＞
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）で、経時変化によるキメラ抗体に対するＴ細胞分析を観測
した陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖反応は、１５−４０％の期待範囲にあった。重大なことは、
期待通りに分析が機能したことを示すコントロール抗原ＫＬＨに対して、頻繁、且つ強力
なＴ細胞反応を観測した。結果は、完全なヒト化抗体ＯＰＮ−３０５（ＶＫ５Ａ／Ｈ４）
が、いずれのドナーにおいて、あらゆる陽性反応を示すことができなかったことを示し、
この抗体は、したがって、臨床における免疫性のリスクが低いことが考察された。
図１８は、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）分析を用いて観測した免疫性のレベル、および
実際に臨床で観測した大きな集団に対する治療的なタンパク質の免疫性のレベル（抗タン
パク質治療抗体反応）の間における、明らかな相関関係を示す（Baker and Jones, 2007
）。高いレベルの免疫性が、臨床データおよびＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）分析の双方に
おいて、ＩｎｆｌｉｘｉｍａｂおよびＣａｍｐａｔｈ等のタンパク質について観測され、
比較的低いレベルの免疫性が、Ｘｏｌａｉｒ，ＨｅｒｃｅｐｔｉｎおよびＡｖａｓｔｉｎ
等のタンパク質について観測された。免疫性危険性の低い生物学的治療と関連づけられた
上記の実験結果に基づいて、ＯＰＮ−３０５抗体が、研究集団の＜１０％において反応を
誘発することが重要である。
〔実施例８−ＯＰＮ−３０５モノクローナル抗体の結合親和性の測定および比較〕
抗原および抗体の複合体の結合および親和性を同時に測定する免疫学的バイオセンサー
、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置は、結合反応速度の
解析を可能とする。化合物の分離速度およびその後の最適化は、生物薬剤抗体の開発に特
に重要である。ＢＩＡＣＯＲＥは、表面結合分子「リガンド」および溶液「電解質」中の
、その結合パートナーの間の相互作用を同時に観測するため、表面プラズモン共鳴（ＳＰ
Ｒ）を使用する。ＳＰＲは、総内部反射率の条件下、光が層で反射したとき、金属層の表
面で生じる電子電荷密度波現象である。発生する表面プラズモンは、反射光から金属層の
反対側の媒体の屈折率におけるあらゆる変化に感受性を有する。表面で生じるタンパク質
間相互作用は、媒体の屈折率に影響し、したがって、検出可能である。リガンド修飾した
センサー表面への分子結合は、検出した結合した分解質の量における小さな変化を可能と
する結合した塊に比例する反応を生じる（低いピコグラムレベルまで）。技術は、１０−
５から１０−１２Ｍの範囲に亘る親和定数（ＫＤ）、１０３から１０７Ｍ−１ｓ−１の間
の親和性速度定数（ｋａ）および１０−１から１０−６ｓ−１の間の分離速度定数（ｋｄ
）を測定するために使用することができる（１−３）。
本研究の目的は、２つの関連した受容体、および３つのｍＡｂの間の相互作用の高解像
度の動力学的特性に関するＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００表面プラズモン（Biacore, Inc.）
共鳴装置を使用したことである。研究中の２つの受容体は、組換えｒｈＴＬＲ−２（組換
えヒトＴＬＲ−２）およびｒｍＴＬＲ２／Ｆｃ（組換えネズミＴＬＲ−２）であった。
＜材料および方法＞
＜装置の準備＞
あらゆるサンプルを実施する前、システムチェック（Biacore Preventative Maintenan
ce Kit 2）を実施した。全てのシステム（試薬パンプ、屈折計、注射、ノイズ、混合およ
びバッファーセレクター）の試験に合格したことで、装置が製造者が設定した基準に従っ
て作動することが示された。システムチェック後、脱着／消毒（Biacore Preventative M
aintenance Kit 2）プログラムを、装置を清浄にするために実施した。
＜分析開発＞
＜システム調製＞
ＣＭ５チップの挿入に応じて、システムは、ＢＩＡｎｏｒｍａｌｉｚｉｎｇ ｓｏｌｕ
ｔｉｏｎ（Biacore Preventative Maintenance Kit 2）で満たされ、正常化された。特に
記載のない限り、全サンプルについて、２５℃で試験した（サンプルラックを２５℃でイ
ンキュベートした）。チップは、ＨＢＳ−ＥＰ(ランニングバッファーとして使用)ととも
にシステムに投入した。チップ表面は、事前に３０秒の５０ｍＭ ＮａＯＨで２回処理し
、安定した基準線が全てのフローセル（Ｆｃｓ）内で得られるようにした。
＜サンプル調製＞
Ｔ２．５ネズミ抗Ｔｏｌｌ様受容体２抗体（ハイブリドーマクローンＴ２．５ に由来
するHyCult Biotechnology b.v., Cell Sciences, Canton,米国:カタログ番号1054）およ
び本明細書に記載したＯＰＮ−３０５抗Ｔｏｌｌ様受容体２抗体の２つの抗体について分
析を行った。双方のモノクローナル抗体は、補給品として保存され、全固定を実施するた
め、１μｇ．ｍＬ−１まで希釈された。受容体ｒｈＴＬＲ−２およびｒｍＴＬＲ２／Ｆｃ
を、乾燥粉末からＨＢＳ−ＥＰを用いて最終濃度１０００ｎＭまで再構成し、４℃で保存
した。キャリアタンパク質は、この溶液に添加しなかった。
＜固定条件および活性＞
前記試験の結果に基づいて、最適な条件であることが示された条件に従って、この試験
についての直接的な分析手段を選択した。速度実験に関して、固定したリガンドの量は、
チップ表面での物質移動効果を防ぐために制限する必要がある。
グリコシル化ヒト受容体分解質（ｒｈＴＬＲ−２）については、平均分子量７７．５ｋ
Ｄａ、リガンド（ｍＡｂ）については１５０ｋＤａおよび化学両論（Ｓｍ）を２として使
用し、固定するのに理想的なリガンドの標的量は、１４５ＲＵである。それが９８ｋＤａ
の分子量を有していても、この量での固定がネズミ受容体に適切である。
標準のアミンカップリング剤を用いて、全ての抗体を固定した。固定は、１０ｍＭ酢酸
バッファーｐＨ５．５中タンパク質濃度約１μｇ．ｍＬ−１で、標的反応レベル１５０Ｒ
Ｕまで３のＣＭ５ Ｓｅｒｉｅｓ Ｓセンサーチップにおいて実施された。速度データは
あらゆる潜在的物質移動効果を最小にするため、流出速度４０μＬ・ｍＬ−１で得られた
。表面および２つの受容体の双方の安定性を動態解析について確認するため、ブランク（
受容体なし）および単一の分解質濃度（１００ｎＭ）を動力学的実施の開始で繰り返した
。動態解析の繰り返しが実施され、結果を比較した。
十分なシグナルの減少（３−１０％）を動態周期の分離段階中に観測するため、分離を
２０００秒間測定した。
＜結果＞
結果は図１に示す。会合速度（Ｋｏｎ）および分離速度（Ｋｏｆｆ）は、二価結合モデ
ルを用いて算出された（BIAcore Evaluation Software version 3.2）。平衡解離定数（
Ｋｏ）は、ｋｏｎ／ｋｏｎの比として算出された。
Figure 2016025863
結果は、ＯＰＮ−３０５が、Ｔ２．５モノクローナル抗体より高い結合親和性でヒトＴ
ｏｌｌ様受容体２およびネズミＴｏｌｌ様受容体２の双方に結合することを示す。図１９
は、ＯＰＮ−３０５の完全なヒト化抗ＴＬＲ２抗体およびＴ２．５ネズミ抗ＴＬＲ２抗体
のアミノ酸配列間の配列同一性を示すアライメントを示す。１０％を超える配列同一性の
相違が観測できる。さらに、図２０は、ＯＰＮ−３０５の完全なヒト化抗体の抗ＴＬＲ２
抗体およびＴ．５ネズミ抗ＴＬＲ２抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列のアライメント
を示す。また、１０％を超える配列同一性の相違が存在する。理論に抑制されることなく
、発明者は、ＯＰＮ−３０５抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列の変異は、Ｔ２．５ネ
ズミ抗体に亘って、ＯＰＮ−３０５抗体へのＴｏｌｌ様受容体２の改良された結合特異性
および親和性を与えることを予測する。
〔実施例９−ＴＬＲ２受容体占有調査〕
この実験は、ＴＬＲ２に結合したとき、ＯＰＮ−３０５モノクローナル抗体の生物活性
を阻害するために必要とされる、最小の占有レベルを同定するために設計した。ＴＨＰ−
１受容体細胞株を用いて結合に対する機能を観測した。特に、ＯＰＮ−３０５の生物活性
は、Ｐａｍ３ＣＳＫ４を誘発したＴＨＰ１−ＣＤ１４細胞で評価した。
＜材料および方法＞
ＴＨＰ１−ＣＤ１４細胞を、ウェルあたり１×１０６細胞の濃度で１２ウェルディッシ
ュに播種した。Ｐａｍ３Ｃｓｋ４（２００ｎｇ／ｍＬ）の添加前、ＯＰＮ−３０５は、ウ
ェルに様々な濃度（０．０００４８８μｇ／ｍＬから２μｇ／ｍＬの範囲）で添加した。
細胞は、一晩、３８℃でインキュベートした。ＮＦ−κＢによって促進されるＳＥＡＰ活
性は、１６０μＬ Ｑｕａｎｔｉｂｌｕｅ（Invivogen）試薬と熱不活性条件の培地を９
０分間、３７℃でインキュベートし、６５０ｎｍの吸光度により測定された。
ＯＰＮ３０５のＴＨＰ１−ＣＤ１４細胞における受容体の占有率を測定するため、ＴＨ
Ｐ１−ＣＤ１４青色細胞は、ＦＡＣＳチューブ（１×１０６／チューブ）に配置し、Ｆｃ
Ｒは、抗ＣＤ３２ブロッキング試薬（Mitenyl Biotec）で１５分間ブロックした。細胞は
、様々な濃度（０．０００４８８μｇ／ｍＬから２μｇ／ｍＬ）のＯＰＮ−３０５で１５
分間、室温にて標識された。洗浄後、細胞は、ＲＰＥ結合した抗ヒトＩｇＧ４で１５分間
、室温でインキュベートされた。最後の洗浄工程後、細胞は、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の２
％ホルモル生理食塩水（formol saline）で、採取前に固定した。特異的結合の割合は、
一般式を用いて算出された：
Figure 2016025863
＜結果＞
結果は、図２１Ａ，ＢおよびＣに示す。これらの結果は、Ｐａｍ３Ｃｓｋ４で処理した
後、ＮＦ−κＢ活性の阻害が用量依存的な方法で、観測されたことを示す（図２１Ａおよ
びＢ）。ＯＰＮ−３０５は、ほぼ完全にＮＦ−κＢ活性を濃度２μｇ／ｍＬで阻害する（
図２１Ｃ）。ＴＨＰ１−ＣＤ１４細胞におけるＯＰＮ−３０５の特異的結合の割合は、前
記一般式を用いて算出された。
ＴＨＰ−１細胞での飽和性結合実験は、同じ細胞集団における生物活性の阻害に関連す
る。ＴＬＲ２依存的なシグナリングの完全な阻害は、最大より少ない受容体結合で達成で
きる。これは複合系であり、ＴＬＲ２レベルが、優位にヘテロ二量体パートナーＴＬＲ１
およびＴＬＲ６より高いと考えられる。受容体の占有は、ＴＬＲ２の飽和性結合をモノマ
ーまたはヘテロ二量体として調査した。遊離ＴＬＲ２がパートナーを見出す確率を減少さ
せて、機能的シグナリング複合体が形成されるため、ＴＬＲ２の十分な中和は、受容体の
１００％未満の占有で、明らかな生物活性の欠如の原理となり得ると考えられる。
〔実施例１０−ＯＰＮ−３０５抗体がＴＬＲ２依存シグナリングの競合的または非競合
の阻害剤として働くかを決定する〕
＜材料および方法＞
ＴＨＰ１ ＣＤ１４青色細胞を、ウェルあたり１００，０００細胞で９６ウェルプレー
トに播種した。細胞は、０，１，１０および１００ｎｇ／ｍＬのＯＰＮ−３０５で、一時
的に様々な投与量のＰａｍ３Ｃｓｋ４で一晩、３７℃で刺激する前に前もってインキュベ
ートした。上清４０μＬを取り除き、６５℃で１０分間、熱不活性化した。ＮＦ−κＢに
よって促進されるＳＥＡＰ活性は、１６０μＬＱｕａｎｔｉｂｌｕｅ（Invivogen）試薬
と熱不活性条件の培地を９０分間、３７℃でインキュベートした後、６５０ｎｍの吸光度
より測定された。細胞に基づく分析における受容体は酵素と同様に反応することを仮定し
、Ｖ（ＮＦ−κＢ活性）に対するＳ［Ｐａｍ３ＣＳＫ４］並びに二重逆数のラインウィー
バー・バークプロット（１／ｖ対１／ｓ）をプロットした。
＜結果＞
結果は図２２に示し、図２２Ａは、ＮＦ−κＢに依存するＳＥＡＰ活性に対する［Ｐａ
ｍ３ＣＳＫ４］を示す。一方、図２２Ｂは、１／Ｖに対する１／Ｓのラインウィーバー・
バークプロットを示す。
これらの結果は、リガンド濃度が上昇し、用量反応曲線の典型的な右側への移動が観測
されたことを示す（図２２Ａ）。ラインウィーバー・バークプロット（図２２Ｂ）の分析
は、低いリガンド濃度で競合機構を示す、リガンドがある閾値を越えた場合、動態が変化
することを示唆する。出力が生物活性であり、これは、ＴＬＲ２／リガンドの相互作用の
みでなく、有力な二量体シグナリング複合体を生じるＴＬＲ１またはＴＬＲ６の形成に依
存するため、阻害効果の性質を確定することが、細胞における課題である。一般的に公開
されているデータベースを使用する発現プロフィール分析は、ＴＬＲ２がＴＬＲ１または
ＴＬＲ６と著しく過剰に存在することを示唆し、これはパートナー分子の滴定効果の二相
反応としての可能性を説明することができる。
〔実施例１１−ＯＰＮ−３０５のＴＬＲ２へのライゲーションが他のＴＬＲ２リガンド
への反応を変えるかの測定〕
この実験は、ＯＰＮ−３０５によるＴＬＲ２の阻害が、他のＴＬＲの相当するそれらリ
ガンドに影響するかを考慮した。
＜材料および方法＞
ＴＨＰ１ ＣＤ１４青色細胞を、ウェルあたり２５，０００細胞で３８４ウェルプレー
トに播種した。様々な投与量の異なるＴｏｌｌ様受容体リガンド拮抗剤で刺激する前、細
胞は、１２０分間、０，１，１０および１００ｎｇ／ｍＬのＯＰＮ−３０５またはヒトＩ
ｇＧ４アイソタイプコントロール抗体で前もってインキュベートした。一晩、ＨＥＫ青色
検出用培地を用いて検出した後、ＮＦ−κＢによって促進されるＳＥＡＰ活性は、調整済
みの培地中で直接測定した。
フラジェリンは、ＴＬＲ５リガンドとして、ウルトラピュアＬＰＳは、ＴＬＲ４リガン
ドとして、Ｐａｍ３ＣＳＫおよびＦＳＬ−１は、ＴＬＲ２リガンドとして使用した。
＜結果＞
結果は、図２３Ａ，ＢおよびＣに示す。ＯＰＮ−３０５にさらされていないコントロー
ル細胞と比較した場合、フラジェリン（図２３Ｃ）およびＬＰＳ（図２３Ｂ）への反応は
、不変であった。予期したように、Ｐａｍ３ＣＳＫおよびＦＳＬ−１の介在によるＴＬＲ
２活性反応は、ＯＰＮ−３０５によってブロックされた（図２３Ａ）。ＯＰＮ−３０５に
さらされていないコントロール細胞と比較した場合、フラジェリンおよびＬＰＳへの反応
は、不変であった。予期したように、Ｐａｍ３ＣＳＫおよびＦＳＬ−１の反応は、ＯＰＮ
−３０５によってブロックされた。これは、ＯＰＮ−３０５が、あらゆる予期しないＴＬ
Ｒ４またはＴＬＲ５のリガンドへの反応性の増減をもたらさないことを示唆する。
〔実施例１２−敗血症治療におけるＯＰＮ−３０５の使用〕
＜材料および方法＞
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの群（ｎ＝４）は、１００μｇＰａｍ３Ｃｓｋ４処理３０分前、
ＯＰＮ−３０５モノクローナル抗体で１０ｍｇ／ｋｇ，２ｍｇ／ｋｇ、および０．４ｍｇ
／ｋｇ、３０分間処理した。全ての治療は、腹腔内投与によって実施された。４時間後、
マウスを致死麻酔で屠殺し、血液を抽出した。血清を取り出し、サイトカイン濃度を、Ｅ
ＬＩＳＡによって測定した。血清は、ＫＣ，ＩＬ−１２ｐ４０については１／１０、ＩＬ
−６ ＥＬＩＳＡについては１／５希釈して使用した。
＜結果＞
結果を図２４Ａ，ＢおよびＣに示す。ＯＰＮ３０５は、Ｐａｍ３Ｃｓｋ４によって誘発
した敗血症を阻害することを示す。低い投与量（０．４ｍｇ／ｋｇ）の抗ＴＬＲ２ ＯＰ
Ｎ３０５は、Ｐａｍ３Ｃｓｋ４によって誘発されたサイトカインをマウスで著しく阻害す
ることができる。
陽性効果が同じコンパートメントに導入した抗体、および拮抗剤の結果でないことを確
実にするため、ＯＰＮ３０５抗体の静脈内投与のみを用いて、その後、ＴＬＲ２拮抗剤Ｐ
ａｍ３ＣＳＫの腹膜内注射によって、この実験をＯＰＮ−３０５でも繰り返した。
実験の結果を図２５ＡおよびＢに示す。結果は、ＯＰＮ−３０５モノクローナル抗体が
、Ｐａｍ３Ｃｓｋ４によって誘発された敗血症を阻害することを示す。この結果は、前記
実験と同様であり、これは、全身に導入したＯＰＮ−３０５が、Ｐａｍ３ＣＳＫの腹膜内
投与に対する反応に応じて、血清サイトカインの産生を阻害することができることを示す
。
〔実施例１３−ＯＰＮ−３０５モノクローナル抗体のラット細胞で発現したＴＬＲ２へ
の結合〕
＜材料および方法＞
ＮＲ８３３３細胞は、ＡＴＣＣから購入され、ＡＴＣＣの指示に従ってＦＫ１２培地で
培養した。細胞は、ラット特異的抗ＣＤ３２（マウスＩｇＧ１）で１０分間、室温でブロ
ックした。細胞は、ＯＰＮ３０５（またはアイソタイプ）で１５分間処理し、洗浄し、Ｒ
ＰＥ抗ヒトＩｇＧ４で検出し、採取前２％ホルモル生理食塩水で固定した。ＮＲ８３８３
細胞は、ポリクローナルラビット抗ラットＴＬＲ２抗体でも染色し、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕ
ｏｒ ４８８抗ラビットＩｇＧで検出した。
＜結果＞
結果は、ＴＬＲ２がラット肺胞マクロファージ（ＮＲ８３８３）で発現されていて、Ｏ
ＰＮ３０５を用いて検出されたことを図２６に示す。（Ａ）無染色細胞、（Ｂ）陽性対象
；ポリクローナルラビット抗ラットＴＬＲ２一次抗体、二次抗対は抗ラビットＡｌｅｘａ
−Ｆｌｕｏｒ ４８８；（Ｃ）ポリクローナルヒトＩｇＧ４で処理した細胞、二次抗体は
、ヒト抗ＩｇＧ４ ＰＥであった；（Ｄ）ＯＰＮ３０５染色した細胞、二次抗体抗ヒトＩ
ｇＧ４ ＰＥ。
〔実施例１４−ＯＰＮ−３０５モノクローナル抗体のブタ細胞で発現するＴＬＲ２への
結合〕
＜材料および方法＞
フィコールを用いて、ブタＰＢＭＣを血液から精製した。細胞数を計数し、チューブあ
たり１×１０６細胞で配置した。ブタ用の特定のＣＤ３２ブロッキング剤の不存在下にお
いて、細胞は、ＰＢＳ中５０％ ＦＣＳ／ＢＳＡマトリックスのヒト抗ＣＤ３２を用いて
、１０分間、ブロックした。細胞は、ＯＰＮ３０５（またはアイソタイプコントロール）
で１５分間、室温でインキュベートした。１Ｈ１１（マウス抗ブタＴＬＲ２、Javier Dom
inguezからの寄贈）は、陽性対象として使用された。洗浄後、細胞はＲＰＥ結合した抗ヒ
トＩｇＧ４で、１５分間、室温でインキュベートした。最終洗浄工程後、細胞を固定し、
採取し、分析した。
＜結果＞
結果を図２７に示す。ＴＬＲ２は、ブタＰＢＭＣで発現があり、ＯＰＮ３０５で染色さ
れた。ＰＢＭＣは、フィコールを用いた分離によって精製した。Ａ−Ｃは、Ｐｉｇ ６６
６からのＰＢＭＣ、Ｄ−Ｆは、Ｐｉｇ ４８８からのものを示す。Ａ，Ｄは無線色；Ｂ，
Ｅは、コントロールポリクローナルヒトＩｇＧ４抗対で標識し、その後、ＰＥ標識した抗
ヒトＩｇＧ４で二次染色した；Ｃ，Ｆは、ＯＰＮ３０５、その後ＰＥ標識した抗ヒトＩｇ
Ｇ４で染色した。
本明細書に記載の全ての文書は、ここに参照として取り入れる。本発明の記載した実施
形態への様々な修正変更が、発明の要旨を逸脱しない範囲で、当業者に明らかである。本
発明は特定の好ましい実施形態に関連して記載したものであるが、主張するような本発明
は、このような特定の実施形態に過度に制限すべきでないことを理解すべきである。実際
、当業者に明白な記載の本発明の実施形態の様々な変更が当業者に明らかであり、本発明
の対象とすることを意図する。

Claims (68)

  1. 配列番号：１のアミノ酸配列を有する軽鎖の可変領域および／または配列番号：４のア
    ミノ酸配列を含む重鎖の可変領域を含み、
    Ｔｏｌｌ様受容体２に特異的に結合する、Ｔｏｌｌ様受容体２の中和抗体またはその抗
    原結合部位。
  2. 抗体またはその抗原結合部位は、ＣＤ３２（Ｆｃγ受容体ＩＩ）に結合しない、請求項
    １に記載のＴｏｌｌ様受容体２の中和抗体。
  3. 抗体またはその抗原結合部位は、ＣＤ３２ａ（Ｆｃγ受容体ＩＩａ）に結合しない、請
    求項１に記載のＴｏｌｌ様受容体２の中和抗体。
  4. 軽鎖の可変領域は、免疫グロブリンＧのサブクラスのアイソタイプ４（ＩｇＧ４）の抗
    体由来の定常領域に結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載のＴｏｌｌ様受容体
    ２の中和抗体。
  5. 重鎖の可変領域は、免疫グロブリンＧのサブクラスのアイソタイプ４（ＩｇＧ４）の抗
    体由来の少なくとも１つの定常領域に結合する、請求項１から４のいずれか一項に記載の
    Ｔｏｌｌ様受容体２の中和抗体。
  6. 重鎖のヒンジ領域のアミノ酸残基２４１は、セリン残基からプロリン残基（Ｓ２４１Ｐ
    ）に置換される、請求項１から５のいずれか一項に記載のＴｏｌｌ様受容体２の中和抗体
    。
  7. 軽鎖は、配列番号：２のアミノ酸を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のＴｏ
    ｌｌ様受容体２の中和抗体。
  8. 抗体は、配列番号：５のアミノ酸配列を有する重鎖を含む、請求項１から７のいずれか
    一項に記載のＴｏｌｌ様受容体２の中和抗体。
  9. 抗体は、完全なヒト化抗体である、請求項１から８のいずれか一項に記載のＴｏｌｌ様
    受容体２の中和抗体。
  10. 抗体は、単離された抗体である、請求項１から９のいずれか一項に記載のＴｏｌｌ様受
    容体２の中和抗体。
  11. 抗体は、免疫抱合体、脱フコシル化抗体および二重特異性抗体からなる群から選択され
    る、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＴｏｌｌ様受容体２の中和抗体。
  12. 抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＡから選択されるアイソ
    タイプの全長抗体である、請求項１から３のいずれか一項に記載のＴｏｌｌ様受容体２の
    中和抗体。
  13. 哺乳類Ｔｏｌｌ様受容体２と１×１０−８以下のＫＤで結合する、請求項１から１２の
    いずれか一項に記載のＴｏｌｌ様受容体２の中和抗体。
  14. 哺乳類Ｔｏｌｌ様受容体２は、ヒトＴｏｌｌ様受容体２である、請求項１３に記載のＴ
    ｏｌｌ様受容体２の中和抗体。
  15. 抗体は、１×１０−８以下のＫＤでヒトＴｏｌｌ様受容体２と結合する、請求項１４に
    記載のＴｏｌｌ様受容体２の中和抗体。
  16. 抗体は、抗体模倣剤である、請求項１から１５のいずれか一項に記載のＴｏｌｌ様受容
    体２の中和抗体。
  17. 請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体由来であり、
    Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖである、Ｔｏｌｌ様受容体２の中和抗原結合断片。
  18. 請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部位、並びにパート
    ナー分子を含み、
    前記パートナー分子は少なくとも１つの治療薬である、抗体−パートナー分子複合体。
  19. Ｔｏｌｌ様受容体２に特異的に結合してＴｏｌｌ様受容体２の機能に拮抗し、
    前記拮抗は、抗体のＣＤ３２（Ｆｃγ受容体ＩＩ）への結合とは独立して介在され、
    Ｔｏｌｌ様受容体２の細胞外領域に結合し、
    配列番号：１の配列または配列番号：１のアミノ酸配列の少なくとも２０アミノ酸に亘
    って少なくとも９０％アミノ酸配列の同一性を有する配列の軽鎖の可変アミノ酸配列と、
    配列番号：４の配列または配列番号：４のアミノ酸配列の少なくとも２０アミノ酸に亘っ
    て少なくとも９０％アミノ酸配列の同一性を有する配列の重鎖の可変アミノ酸配列と、を
    含む、
    単離された抗体またはそれに由来する抗原結合断片。
  20. 請求項１から１９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部位をコード化する
    、単離された核酸分子。
  21. 請求項２０に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
  22. 請求項２１に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  23. 抗体を請求項２２の宿主細胞で発現する工程および
    宿主細胞から抗体を単離する工程を備える、
    請求項１から１９のいずれか一項に記載のＴｏｌｌ様受容体２抗体を調製する方法。
  24. 少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤またはキャリアと組み合わせた、
    請求項１から１９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部位を含む、医薬組成
    物。
  25. 請求項１から１９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部位を、治療有効な
    量で、その治療の必要のある対象に生体内で（ｉｎ ｖｉｖｏ）または生体外で（ｅｘ−
    ｖｉｖｏ）投与する工程を備える、Ｔｏｌｌ様受容体２の活性によって介在される炎症、
    呼吸もしくは自己免疫の状態または疾患を治療または予防する方法。
  26. 前記炎症、呼吸もしくは自己免疫の状態または疾患は、慢性関節リウマチ、喘息、慢性
    閉塞性肺疾患、アレルギー反応、乾癬、皮膚炎、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化お
    よび虚血再かん流傷害、臓器移植から生じる虚血再かん流、眼疾患、ブドウ膜炎または加
    齢性黄斑変性症、腎臓炎症、糖尿病からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法
    。
  27. Ｔｏｌｌ様受容体２活性によって介在される炎症、呼吸もしくは自己免疫の状態または
    疾患の治療用薬剤の調製への、請求項１から１９に記載の抗体またはその抗原結合部位の
    使用。
  28. 前記炎症、呼吸もしくは自己免疫の状態または疾患は、慢性関節リウマチ、喘息、慢性
    閉塞性肺疾患、アレルギー反応、乾癬、皮膚炎、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化お
    よび虚血再かん流傷害、臓器移植から生じる虚血再かん流、ブドウ膜炎または加齢性黄斑
    変性症等の眼疾患、腎臓炎症、糖尿病からなる群から選択される、請求項２７に記載の使
    用。
  29. Ｔｏｌｌ様受容体２活性によって介在される炎症、呼吸もしくは自己免疫の状態または
    疾患の治療または予防に使用される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の抗体また
    はその抗原結合部位。
  30. 前記炎症、呼吸もしくは自己免疫の状態または疾患は、慢性関節リウマチ、喘息、慢性
    閉塞性肺疾患、アレルギー反応、乾癬、皮膚炎、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化お
    よび虚血再かん流傷害、臓器移植から生じる虚血再かん流、眼疾患、ブドウ膜炎、加齢性
    黄斑変性症、腎臓炎症および糖尿病からなる群から選択される、請求項２９に記載の抗体
    またはその抗原結合部位の使用。
  31. 対象の固形臓器移植と関連のある虚血再かん流障害に関与するＴｏｌｌ様受容体２（Ｔ
    ＬＲ２）発現細胞または組織内のＴＬＲ２の活性を減少させる方法であって、
    前記細胞または組織を、請求項１から１９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原
    結合部位の治療有効量に十分に接触させ、
    前記細胞または組織内のＴＬＲ２の１つ以上の生物活性を減少させる工程を包含する、
    方法。
  32. Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）に介在される炎症、呼吸もしくは自己免疫の状態また
    は疾患に関与するＴＬＲ２発現細胞または組織内のＴＬＲ２の活性を減少させる方法であ
    って、
    前記細胞または組織を、請求項１から１９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原
    結合部位の治療有効量に十分に接触させ、
    前記細胞または組織内のＴＬＲ２の１つ以上の生物活性を減少させる工程を包含する、
    方法。
  33. 請求項１から１９のいずれか一項に記載の抗体、その抗原結合断片、または前記抗体の
    軽鎖もしくは重鎖を産生するハイブリドーマ細胞株。
  34. モノクローナル抗体ＯＰＮ−３０５によって結合する、Ｔｏｌｌ様受容体２の細胞外領
    域に存在する同じエピトープに特異的に結合する、Ｔ２．５として市販される抗体ではな
    い、モノクローナル抗体、抗体由来の結合断片、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ペプチ
    ド模倣剤または有機化合物。
  35. 化合物に特異的に結合するエピトープは、配列番号：１３および／または配列番号１４
    のアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載のモノクローナル抗体、抗体由来の結合断片、
    ペプチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド模倣剤または有機化合物。
  36. 請求項１から１９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部位を、同等品の使
    用指示とともに含む、キット。
  37. 配列番号：１のアミノ酸配列からなるか、実質的にそれからなる軽鎖の可変領域および
    配列番号：２のアミノ酸配列からなるか、実質的にそれからなる重鎖の可変領域を含み、
    哺乳類Ｔｏｌｌ様受容体２に特異的に結合し、少なくとも１のＴｏｌｌ様受容体２の機
    能活性に拮抗し、
    ＣＤ３２に結合しない、完全なヒト化モノクローナル抗体。
  38. 前記抗体は、配列番号：４のアミノ酸配列からなるか、実質的にそれからなる軽鎖およ
    び配列番号：５のアミノ酸配列からなるか、実質的にそれからなる重鎖を含む、請求項３
    ７に記載の抗体。
  39. 抗体は、ヒトＴｏｌｌ様受容体２、マウスＴｏｌｌ様受容体２およびサルＴｏｌｌ様受
    容体２に特異的な結合を有する、請求項３７または３８に記載の完全なヒト化抗体。
  40. 請求項３７から３９のいずれか一項に記載の抗体由来の抗原結合断片。
  41. 前記断片は、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖである、請求項４０に記載の抗原結合断片。
  42. 請求項３７から４０のいずれか一項に記載の完全なヒト化抗体またはその抗原結合部位
    をコード化する、単離された核酸分子。
  43. 請求項４２に記載された核酸分子を含む、発現ベクター。
  44. 請求項４３に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  45. 請求項４４に記載の宿主細胞中の完全なヒト化抗体を発現させる工程、および宿主細胞
    から抗体を単離する工程を備える、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の抗Ｔｏｌ
    ｌ様受容体２の調製方法。
  46. 請求項３７から４０のいずれか一項に記載の完全なヒト化抗体またはその抗原結合部位
    を、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤またはキャリアと組み合わせて含む、医薬組成物
    。
  47. 請求項３７から４０のいずれか一項に記載の完全なヒト化抗体またはその抗原結合部位
    を、治療への有効量、治療の必要のある対象に生体内に（ｉｎ ｖｉｖｏ）または生体外
    に（ｅｘ−ｖｉｖｏ）投与する工程を備える、Ｔｏｌｌ様受容体２の活性によって介在さ
    れる炎症、呼吸もしくは自己免疫状態または疾患を治療または予防する方法。
  48. 前記炎症、呼吸もしくは自己免疫の状態または疾患は、慢性関節リウマチ、喘息、慢性
    閉塞性肺疾患、アレルギー反応、乾癬、皮膚炎、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化お
    よび虚血再かん流傷害、臓器移植から生じる虚血再かん流、ブドウ膜炎または加齢性黄斑
    変性症等の眼疾患、腎臓炎症、糖尿病からなる群から選択される、請求項４７に記載の方
    法。
  49. Ｔｏｌｌ様受容体２の活性によって介在される炎症、呼吸もしくは自己免疫の状態また
    は疾患を治療するための薬剤の調製における、請求項３７から４０のいずれか一項に記載
    の完全なヒト化抗体またはその抗原結合部位の使用。
  50. 前記炎症、呼吸もしくは自己免疫の状態または疾患は、慢性関節リウマチ、喘息、慢性
    閉塞性肺疾患、アレルギー反応、乾癬、皮膚炎、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化お
    よび虚血再かん流傷害、臓器移植から生じる虚血再かん流、眼疾患、ブドウ膜炎加齢性黄
    斑変性症、腎臓炎症または糖尿病からなる群から選択される、請求項４９に記載の使用。
  51. Ｔｏｌｌ様受容体２の活性によって介在される炎症、呼吸もしくは自己免疫の状態また
    は疾患の治療または予防に使用される、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の完全
    なヒト化抗体またはその抗原結合部位。
  52. 前記炎症、呼吸もしくは自己免疫の状態または疾患は、慢性関節リウマチ、喘息、慢性
    閉塞性肺疾患、アレルギー反応、乾癬、皮膚炎、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化お
    よび虚血再かん流傷害、臓器移植から生じる虚血再かん流、眼疾患、ブドウ膜炎、加齢性
    黄斑変性症、腎臓炎症または糖尿病からなる群から選択される、請求項５１に記載の完全
    なヒト化抗体またはその抗原結合部位の使用。
  53. 対象の固形臓器移植と関連のある虚血再かん流障害に関与するＴｏｌｌ様受容体２（Ｔ
    ＬＲ２）発現細胞または組織内のＴＬＲ２の活性を減少させる方法であって、
    前記細胞または組織を、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の完全なヒト化抗体
    またはその抗原結合部位の治療有効量に十分に接触させ、
    前記細胞または組織内のＴＬＲ２の１つ以上の生物活性を減少させる工程を包含する、
    方法。
  54. Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）に介在される炎症、呼吸もしくは自己免疫の状態また
    は疾患に関与するＴＬＲ２発現細胞または組織内のＴＬＲ２の活性を減少させる方法であ
    って、
    前記細胞または組織を、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の完全なヒト化抗体
    またはその抗原結合部位の治療有効量に十分に接触させ、
    前記細胞または組織内のＴＬＲ２の１つ以上の生物活性を減少させる工程を包含する、
    方法。
  55. 請求項３７から４０のいずれか一項に記載の完全なヒト化抗体またはその抗原結合部位
    を産生する、ハイブリドーマ細胞株。
  56. 抗体は、１×１０−８以下のＫＤで哺乳類Ｔｏｌｌ様受容体２と特異的に結合するが、
    ＣＤ３２（Ｆｃγ受容体ＩＩ）に結合せず、
    抗体は、Ｔ２．５として市販される抗体によって、Ｔｏｌｌ様受容体２の細胞外領域に
    存在する同じエピトープに特異的に結合する、
    ヒト化中和抗体またはその抗原結合部位。
  57. 哺乳類Ｔｏｌｌ様受容体２と１×１０−８以下のＫＤで結合し、ＣＤ３２（Ｆｃγ受容
    体ＩＩ）と結合せず、
    エピトープは、参照抗体に認識され、
    前記参照抗体は、配列番号：４のアミノ酸配列を含む重鎖の可変領域および配列番号：
    １のアミノ酸配列を含む軽鎖の可変領域を含む、
    単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部位。
  58. 哺乳類Ｔｏｌｌ様受容体２に特異的に結合し、下記の特徴を示す、単離されたヒトモノ
    クローナル抗体またはその抗原結合部位：
    −１×１０−８以下のＫＤで哺乳類Ｔｏｌｌ様受容体２と結合し、
    −ＣＤ３２（Ｆｃγ受容体ＩＩ）と結合せず、
    −ヒトＴｏｌｌ様受容体２、ネズミＴｏｌｌ様受容体２およびサルＴｏｌｌ様受容体２
    と交差反応する。
  59. 抗体は、免疫抱合体、脱フコシル化抗体および二重特異性抗体からなる群から選択され
    る、請求項５５から５７のいずれか一項に記載の抗体。
  60. 抗体は、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４またはＩｇＡから選択されるアイソ
    タイプの長鎖抗体である、請求項５５から５９のいずれか一項に記載の抗体。
  61. 請求項５５から６０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部位をコード化す
    る単離された核酸分子。
  62. 請求項６１に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
  63. 請求項６２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  64. 請求項６３に記載の宿主細胞に抗体を発現させる工程、および宿主細胞から抗体を単離
    する工程を備える、請求項５５から６０のいずれか一項に記載の抗Ｔｏｌｌ様受容体２抗
    体の調製方法。
  65. 薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤またはキャリアと組み合わされた、請求項５５から
    ６０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部位を包含する医薬組成物。
  66. 請求項５５から６０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部位を、治療への
    有効量、その治療の必要のある対象に生体内で（ｉｎ ｖｉｖｏ）または生体外で（ｅｘ
    −ｖｉｖｏ）投与する工程を備える、Ｔｏｌｌ様受容体２の活性によって介在される炎症
    、呼吸もしくは自己免疫の状態または疾患を治療または予防する方法。
  67. Ｔｏｌｌ様受容体２の活性によって介在される炎症、呼吸もしくは自己免疫の状態また
    は疾患の治療または予防に使用される、請求項５５から６０のいずれか一項に記載の抗体
    またはその抗原結合部位。
  68. 請求項５５から６０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部位を産生する、
    ハイブリドーマ細胞株。
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