JP2016010394A - フィルター内の隆起部の比率を最適化したフィルター - Google Patents

Abstract

【課題】細胞の回収効率が向上した細胞分離フィルター及び細胞分離フィルターを用いて、目的の細胞を効率よく回収することができる細胞分離方法を提供すること。
【解決手段】細胞分離材が充填された容器を有し、該容器の上部又は下部のいずれかに液体導入口、その反対側に液体導出口を備えたフィルターにおいて、充填された前記細胞分離材の表面に、液体導入口側又は液体導出口側の少なくとも１方向へ向けて隆起している隆起部を形成し、且つ前記細胞分離材の厚みの最大値（ｍｍ）と最小値（ｍｍ）との比率（細胞分離材の厚みの最大値／細胞分離材の厚みの最小値）を１．０８〜１．５１となるように調整する。
【選択図】図２

Description

本発明は、細胞分離フィルター又はこれを利用した細胞分離方法に関する。

近年、血液学や科学テクノロジーの急速な進歩に伴い、全血・骨髄・臍帯血・組織抽出物をはじめとする体液から必要な血液分画のみを分離して患者に投与することで治療効果を高め、さらに、治療に必要のない分画は投与しないことで副作用を抑制する、という治療スタイルが広く普及している。

例えば、血液輸血もその１つである。赤血球製剤は、出血及び赤血球が不足する場合、又は赤血球の機能低下により酸素が欠乏している場合に使用される血液製剤である。赤血球製剤には、異常な免疫反応や移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）等の副作用を誘導する白血球は不要であり、フィルターで白血球を除去する必要がある。場合によっては白血球に加えて血小板も除去することもある。

一方、血小板製剤は、血液凝固因子の欠乏による出血ないし出血傾向にある患者に使用される血液製剤である。血小板製剤の製造のためには、遠心分離により、血小板以外の不要な細胞や成分は除去され、必要とされる血小板成分のみが採取されている。

加えて近年、白血病や固形癌治療に向けた造血幹細胞移植が盛んに行われるようになり、治療に必要な、造血幹細胞を含む白血球群を分離し投与する方法がとられている。この造血幹細胞のソースとして、ドナーの負担が少ない、増殖能力が優れている、等の利点から、骨髄や末梢血に加えて臍帯血も注目を浴びている。また近年、月経血中にも幹細胞が豊富に存在することが示唆され、これまで廃棄されていた月経血も貴重な幹細胞ソースとして利用される可能性がある。

骨髄や末梢血に関して、不要な細胞を除き白血球を分離・純化して投与することが望まれている一方で、臍帯血についても血縁者のためのバンキングが盛んになり、使用時まで凍結保存する必要性から、凍結保存による赤血球溶血を防ぐことを目的に白血球は分離・純化されている。

細胞分離方法として、最近では、赤血球と血小板は捕捉されず白血球のみを捕捉するフィルター材料を用いて白血球を回収する方法（特許文献１、特許文献２、特許文献３）も報告されている。
しかしながら、実際に細胞の分離を行う際には、原因は不明ながら、フィルター材料に充填する細胞分離材内を血液がうまく通過しなかったり、細胞分離材に細胞が捕捉されたまま回収できないケースがあり、これらの問題は、特に臍帯血のように液量の少ない血液から造血幹細胞等の細胞を回収する際には看過できない問題となっていた。

特表２００１−５１８７９２号公報 国際公開第９８／３２８４０号 特開平１０−３１３８５５号公報

上記のような事情に鑑み、本発明の目的は、細胞の回収効率が向上した細胞分離フィルターを提供することにある。
また、本発明の他の目的は、前記細胞分離フィルターを用いて、目的の細胞を効率よく回収することができる細胞分離方法を提供することにある。

本発明者らは、かかる課題を解決すべく、鋭意検討を進めた。その結果、細胞分離フィルターに充填される細胞分離材における液体導入口側又は液体導出口側の表面に、所定の大きさの隆起部を形成させることで、細胞の回収率が有意に向上し、しかも細胞分離材に捕捉されたまま回収されない血液成分も顕著に低減できることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明の要旨は以下の通りである。

〔１〕細胞分離材が充填された容器を有し、該容器の上部又は下部のいずれかに液体導入口、その反対側に液体導出口を備えたフィルターであって、
充填された前記細胞分離材の表面に、液体導入口側又は液体導出口側の少なくとも１方向へ向けて隆起している隆起部を有し、且つ前記細胞分離材の厚みの最大値（ｍｍ）と最小値（ｍｍ）との比率（細胞分離材の厚みの最大値／細胞分離材の厚みの最小値）が、１．０８〜１．５１であるフィルター。

〔２〕前記細胞分離材の表面に、隆起部を少なくとも２つ及び隆起部の間に凹部を少なくとも１つ有する前記〔１〕に記載のフィルター。

〔３〕隆起部の数をｎ、隆起部間凹部の数をｍとした場合において、以下の（ａ）又は（ｂ）：
（ａ）ｎ＝ｍ＋１；
（ｂ）ｎ＝ｍ＋２；
の関係を満たす前記〔２〕に記載のフィルター。

〔４〕前記細胞分離材の断面積において、隆起部の断面積の和（ｍｍ^２）と、隆起部以外の断面積（ｍｍ^２）との比率（隆起部の断面積の和／隆起部以外の断面積）が、０．２０〜０．３６である前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のフィルター。

〔５〕液体導入口側の隆起部間凹部から液体導出口側の隆起部間凹部までの細胞分離材の厚み（ｍｍ）と細胞分離材の厚みの最小値（ｍｍ）との比率（液体導入口側の隆起部間凹部から液体導出口側の隆起部間凹部までの細胞分離材の厚み／細胞分離材の厚みの最小値）が、１．０３〜１．３９である前記〔２〕〜〔４〕のいずれかに記載のフィルター。

〔６〕液体導入口側の隆起部間凹部から液体導出口側の隆起部間凹部までの細胞分離材の厚み（ｍｍ）と細胞分離材の厚みの最大値（ｍｍ）との比率（液体導入口側の隆起部間凹部から液体導出口側の隆起部間凹部までの細胞分離材の厚み／細胞分離材の厚みの最大値）が、０．８９〜０．９５である前記〔２〕〜〔５〕のいずれかに記載のフィルター。

〔７〕細胞分離材の厚みの最小値が１．２０×１０〜１．２６×１０ｍｍ、細胞分離材の厚みの最大値が１．２６×１０〜２．１０×１０ｍｍである前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のフィルター。

〔８〕隆起部の断面積の和が２．０８×１０〜１．０９×１０^２ｍｍ^２、隆起部以外の断面積が５．４０×１０^２〜５．６１×１０^２ｍｍ^２である前記〔４〕〜〔７〕のいずれかに記載のフィルター。

〔９〕前記容器の内側に突き出しており、前記容器に内蔵している前記細胞分離材の上部側又は下部側の表面を押圧可能な突起部を前記容器内部の上部側又は下部側に備え、前記突起部の先端面の面積が前記細胞分離材の表面積の３０％以下である前記〔１〕〜〔８〕いずれかに記載のフィルター。

〔１０〕前記突起部の先端面の形状が線形、棒形、多角形、楕円形、円形又はこれらの形状のうち２種以上を組み合わせた形状である前記〔９〕に記載のフィルター。

〔１１〕前記突起部を少なくとも２つ以上有する前記〔９〕又は〔１０〕に記載のフィルター。

〔１２〕前記〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載のフィルターの液体導入口から細胞含有液を導入し、フィルター内に充填されている細胞分離材と接触させて、白血球及び／又は単核球を細胞分離材に捕捉させる第一の工程、及び、
前記フィルター内に回収液を導入し、白血球及び／又は単核球を細胞分離材から回収する第二の工程
を含む、細胞分離方法。

〔１３〕前記第二の工程が、フィルターの液体導出口から回収液を導入し、液体導入口から白血球及び／又は単核球を回収する工程である、前記〔１２〕に記載の細胞分離方法。

〔１４〕さらに、前記第一の工程の前に、フィルターの液体導入口から生理食塩水又は緩衝液を導入し、細胞分離材と生理食塩水又は緩衝液とを接触させる工程を含む、前記〔１２〕又は〔１３〕に記載の細胞分離方法。

〔１５〕さらに、前記第一の工程の後であって第二の工程の前に、フィルターの液体導入口から生理食塩水又は緩衝液を導入して、フィルターの液体導出口から導出することにより、フィルター内の夾雑成分を除去する工程を含む、前記〔１２〕〜〔１４〕のいずれかに記載の細胞分離方法。

本発明のフィルターを用いることにより、血液中の細胞を効率よく回収することができる。

本発明のフィルターの１例を示す概略図である。 図１に示すフィルターのＡ−Ａ部における縦断面図である。 図２に示すフィルターの要部拡大縦断面図である。 フィルターのノズル付押え部材の１例を示す概略図である。 図２に示すフィルターに充填された細胞分離材の縦断面図である。 実施例１で用いたフィルターの概略の分解図である。 実施例１で用いた細胞分離用デバイスの回路の概略図である。 実施例１及び比較例１において細胞回収後のフィルターから取り出した細胞分離材を置き、そこに残存する血液成分をそれぞれ比較した際の図である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明のフィルターは、細胞分離材が充填された容器を有し、該容器の上部又は下部のいずれかに液体導入口、その反対側に液体導出口を備えたフィルターであって、
充填された前記細胞分離材の表面に、液体導入口側又は液体導出口側の少なくとも１方向へ向けて隆起している隆起部を有し、且つ前記細胞分離材の厚みの最大値（ｍｍ）と最小値（ｍｍ）との比率（細胞分離材の厚みの最大値／細胞分離材の厚みの最小値）が、１．０８〜１．５１であることを特徴とする。

（細胞分離材）
本発明で使用される細胞分離材の形態は、特に限定されず、連通孔構造の多孔質体、繊維の集合体、織物等が挙げられる。好ましくは繊維で構成されるものであり、より好ましくは不織布である。

前記細胞分離材の材質としては、例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、高密度ポリエチレン、低密度ポリエチレン等のポリオレフィン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリビニルアルコール、塩化ビニリデン、レーヨン、ビニロン、ポリスチレン、アクリル（ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクロニトリル、ポリアクリル酸、ポリアクリレート等）、ナイロン、ポリウレタン、ポリイミド、アラミド、ポリアミド、キュプラ、ケブラー、カーボン、フェノール、テトロン、パルプ、麻、セルロース、ケナフ、キチン、キトサン、ガラス、綿等を挙げることができる。中でも、ポリエステル、ポリプロピレン、アクリル、レーヨン、ナイロン、ポリブチレンテレフタラート、ポリエチレンテレフタラート等の高分子を好適に用いることができる。前記細胞分離材は、これらの材質のうち、単一の材質からなってもよいし、複数の材質を組み合わせた複合材からなってもよい。

本発明で用いられる細胞分離材の平均繊維径としては、目的の細胞の種類に合わせて適宜選択すればよく特に限定はない。

前記細胞分離材の性能をより向上させるために、細胞分離材に親水化処理を行ってもよい。親水化処理することにより、目的とする必要細胞以外の細胞における非特異的な捕捉の抑制、細胞含有液を偏り無く細胞分離材中に通過させ、性能の向上、必要細胞の回収効率向上等を付与することができる。親水化処理方法としては、水溶性多価アルコール、又は水酸基やカチオン基、アニオン基を有するポリマー、あるいはその共重合体（例えば、ヒドロキシエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、あるいはその共重合体等）を吸着させる方法、水溶性高分子（ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等）を吸着させる方法、疎水性膜に親水性高分子を固定する方法（例えば、表面に親水性モノマーを化学的に結合させる方法等）、電子線照射する方法、含水状態で細胞分離フィルターに放射線を照射することで親水性高分子を架橋不溶化する方法、乾燥状態で熱処理することにより親水性高分子を不溶化すし固定する方法、疎水性膜の表面をスルホン化する方法、親水性高分子と疎水性ポリマードープとの混合物から膜をつくる方法、アルカリ水溶液（ＮａＯＨ、ＫＯＨ等）処理により膜表面に親水基を付与する方法、疎水性多孔質膜をアルコールに浸漬した後、水溶性ポリマー水溶液で処理乾燥後、熱処理や放射線等で不溶化処理する方法、又は界面活性作用を有する物質を吸着させる方法等が挙げられる。

親水性高分子としては、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、多糖類（セルロース、キチン、キトサン等）、水溶性多価アルコール等が挙げられる。

疎水性ポリマーとしては、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリオレフィン（ポリエチレン、ポリプロピレン等）、アクリル、ウレタン、ビニロン、ナイロン、ポリエステル等が挙げられる。

さらに回収目的とする細胞の細胞分離材への付着性を向上させるために、細胞付着性のタンパク質や、目的とする幹細胞上の発現されている特異的抗原に対する抗体を、細胞分離材上に固定化してもよい。細胞付着性のタンパク質としては、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン等が挙げられる。抗体としては、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ１４０a、ＣＤ２７１等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、固定化方法としては、例えば、一般的なタンパク質の固定化方法である、臭化シアン活性化法、酸アジド誘導体法、縮合試薬法、ジアゾ法、アルキル化法、架橋法等の方法を任意に用いることができる。

（容器）
前記細胞分離材を充填する容器は、上部又は下部のいずれかに液体導入口、その反対側に液体導出口を備える。
液体導入口とは前記容器外部から前記容器内部に目的の細胞を含有する液体（細胞含有液ともいう）を導入する口をいう。
液体導出口とは、前記液体導入口の上下方向に対して反対側に設けられる口であり、主に細胞分離操作の際に細胞分離材を通過した液体を容器外部へ排出するための口をいう。
前記液体導入口及び液体導出口はそれぞれ１つ以上あればよく、数については特に限定はない。
また、前記液体導入口又は液体導出口が設けられる上部又は下部の位置としては、特に限定はない。
なお、細胞分離材に捕捉された細胞は、本発明のフィルターを組み合わせた細胞分離デバイスの構成によっては、前記液体導入口から容器外部に排出される場合もある。

前記容器の形状としては、前記細胞分離材を内蔵できる形状であればよく、球、コンテナ、カセット、バッグ、チューブ等、任意の形態であってよい。好ましい具体例としては、例えば、容量約０．１〜４００ｍＬ程度、直径０．１〜１５ｃｍ程度の筒状容器や、一片の長さ０．１〜２０ｃｍ程度の正方形又は長方形で、厚みが０．１〜５ｃｍ程度の四角柱状容器等が挙げられる。

例えば、図１、２（ａ）、２（ｂ）に示すように円筒形状のフィルター１では、円筒状の本体３と、その上部及び下部にある開口部に蓋をすることができるノズル付押え部材４、５と、前記本体３とノズル付押え部材４、５とを固定するためのキャップ６、７とで構成される。
前記ノズル付押え部材４、５には、容器２内部に液体を導入するための液体導入口９、容器２から液体を排出するための液体導出口１０がそれぞれ設けられている。なお、前記液体導入口９及び液体導出口１０は液体を送液するためのチューブを接続しやすくするために、ノズルで構成されている。前記ノズルの形状や大きさについては特に限定はない。
前記ノズル付押え部材４、５は栓型になっており、円筒状の前記本体３の内腔に押し込むことで、本体３の内面と接して固定される。
前記ノズル付押え部材４、５と本体３との接触面にはシール８が設けられている。このシール８により、ノズル付押え部材４、５と本体３との気密性を確実にして外部からの微生物等の侵入を防ぐことができる。前記シール８としては、例えば、図２（ｂ）に示すように、ノズル付押え部材４、５の表面に設けた溝の周囲に樹脂製のパッキンを設けることが挙げられるが、シール８の配置や構成については特に限定はない。

前記ノズル付き押え部材４、５は、前記本体３に直接固定できるようにしてもよい（図示せず）。ノズル付き押え部材と本体とが接触する面に、例えば、ネジを設けることでノズル付き押え部材と本体とを固定することができる。この場合、図２（ｂ）に示す前記キャップ６、７は不要となる。

前記容器２内では、前記細胞分離材１１が積層されて充填される。例えば、繊維径の異なる細胞分離材１１を２層以上積層したフィルターとすることにより、細胞を捕捉する箇所が分散され、目詰まりの発生が抑制されるとともに、フィルターからの細胞の分離・回収も効率的に行うことができる。なお、繊維径が同じ細胞分離材が連続して積層された部分は、積層された細胞分離材の枚数によらず１層として扱う。

また、前記容器２には、液体導入口９側に独立して細胞分離材１１内に留まっている非付着細胞を洗浄するための洗浄液導入口を設けたり（図示せず）、液体導出口１０側に独立して細胞分離材に捕捉された細胞を回収するための細胞回収液導入口（細胞含有液及び洗浄液の流れとは逆方向から細胞回収液を流すため）を備えていてもよい（図示せず）。

前記容器２は、任意の構造材料を使用して作製することができる。構造材料としては、具体的には非反応性ポリマー、生体親和性金属、合金、ガラス等が挙げられる。非反応性ポリマーとしては、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー当のアクリルニトリルポリマー；ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、テトラフルオロエチレンとヘキサフルオロプロピレンのコポリマー、ポリ塩化ビニル等のハロゲン化ポリマー；ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホン、ポリカードネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、ポリカーボネートアクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリスチレン、ポリメチルペンテン等が上げられる。容器の材料として有用な金属材料（生体親和性金属、合金）としては、ステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、及びそれらの合金、並びに金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コバルトクロミウム合金、窒化チタン被覆ステンレス鋼等が挙げられる。特に好ましくは、耐滅菌製を有する素材であるが、具体的には、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリイミド、ポリカードネート、ポリスルホン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。

（隆起部）
本発明のフィルターは、前記容器内に充填された前記細胞分離材の表面に、液体導入口側又は液体導出口側の少なくとも１方向へ向けて隆起している隆起部を有する。
前記隆起部とは、図２（ｂ）、３（ａ）、３（ｂ）に示すように、細胞分離材１１の表面における隆起した部分（１２ａ、１２ａ’、１２ａ’’、１２ｂ、１２ｂ’、１２ｂ’’）をいう。より詳細には、図３（ａ）、３（ｂ）に示すように、フィルターの液体導入口９及び液体導出口１０に対して平行な細胞分離材１１の縦断面において、液体導入口９側又は液体導出口１０側の細胞分離材１１の表面の最も低い部分１３から盛り上がった部分であり、頂点（１４ａ、１４ａ’、１４ａ’’）を有する部分をいう。例えば、図２（ｂ）、３（ａ）、３（ｂ）では、頂点１４ａを有する隆起部１２ａ、頂点１４ａ’を有する１２ａ’、頂点１４ａ’’を有する１２ａ’’という３つの隆起部が、凹部１５ａを境としてつながった形状をしている。

前記隆起部間の凹部とは、隆起部同士の間の凹んだ部分をいう。例えば、図２（ｂ）に示すフィルター１は、液体導入口９側の細胞分離材１１の表面に３つの隆起部１２ａ、１２ａ’、１２ａ”、その間に２つの凹部１５ａ、１５ａ’を有する。また液体導出口１０側の細胞分離材１１の表面に３つの隆起部１２ｂ、１２ｂ’、１２ｂ”、その間に２つの凹部１５ｂ、１５ｂ’を有する、
前記隆起部間の凹部１５ａ、１５ｂは、いずれも略山形の２つの隆起部の間で、曲線状に凹んだ谷形状となっている。なお、本発明では、前記凹部はフィルター内に導入される細胞含有液と直接接触できる状態の凹部をいう。したがって、後述のように、前記ノズル付押え部材４、５に突起部１６を設けることで、前記細胞分離材１１の表面を押圧した場合に生じる凹んだ部分は、突起部と細胞分離材の表面とが接触しており、細胞含有液と直接接触できない状態となっているため、隆起部間凹部には該当しない。

前記のような隆起部や隆起部間凹部を細胞分離材の表面に形成する方法としては、前記細胞分離材の表面に予め隆起部や隆起部間凹部が形成される加工、例えば、エンボス加工等が施された細胞分離材を用いることが挙げられるが、細胞分離材の材質等によらずに簡便に隆起部等を形成できる観点から、ノズル付押え部材４、５の容器２の本体３の内腔に差し込む先端面に、図４に示すように、突起部１６ａ、１６ｂを設けることで、容器２内に充填した前記細胞分離材１１の表面を押圧することができる。

前記突起部１６ａ、１６ｂは、前記容器２の内腔側に突き出ており、前記容器２に充填している前記細胞分離材１１の上部側又は下部側の表面を押圧することで、隆起部を形成することができる。

前記突起部１６ａ、１６ｂの先端面の形状としては、特に限定はないが、線形、棒形、多角形、楕円形、円形又はこれらの形状のうち２種以上を組み合わせた形状が挙げられる。
中でも、前記突起部を少なくとも２つ以上組み合わせると、突起部で細胞分離材の表面を押圧した際に、隆起部間にひずみが生じて隆起部間凹部を形成しやすくなる。
例えば、図２（ａ）に示すように、略円形の突起部１６ａで細胞分離材１１の周囲を丸形に押圧し、さらに略１２０°間隔で周囲から中心部方向にかけて棒形の突起部１６ｂで押圧すると、押圧されていない細胞分離材１１の表面にひずみが生じて、図２（ｂ）、図３（ａ）、３（ｂ）に示すように複数の隆起部及びこれらの隆起部の間に略谷状の複数の凹部が形成される。具体的には、隆起部１２ａ、１２ａ’’は、略円形の突起部１６ａ及び突起部１６ｂ同士で３方向を囲まれた細胞分離材１１の表面に生じる大きい隆起部であり、隆起部１２ａ’は液体導入口９の下方向にある中央付近の小さい隆起部である。したがって、液体導入口９側の細胞分離材１１の表面には隆起部が４つ生じている。また、前記大きい隆起部１２ａと小さい隆起部１２ａ’との間（前記隆起部１２ａ’’と１２ａ’との間も同じ）には凹部１５ａが生じるので、液体導入口９側の細胞分離材１１の表面には凹部が全部で３つ生じている。

前記突起部の先端面の面積としては、隆起部、特に隆起部間凹部の形成をし易くする観点から、前記細胞分離材の表面積の３０％以下であることが好ましい。
なお、突起部の先端面の面積は、断面積における横の長さ（ｘ）、縦の長さ（ｙ）を測定するための原点（０、０）を定め、原点以外の複数点を測定し、エクセルを用いて積分計算することで近似面積を算出すればよい。

なお、前記突起部の先端面は、図４に示すように、全ての突起部の高さを一致するように調整してもよいし、突起部の高さを変えるように調整して先端面が立体的に段差があるように調整してもよい。

本発明のフィルターでは、細胞の回収効率が高くなる観点から、液体導入口側又は液体導出口側の少なくとも１つの表面に、隆起部を少なくとも２つ及び隆起部の間に凹部を少なくとも１つ有することが好ましい。

本発明では、前記細胞分離材の表面の前記隆起部の数をｎ、前記隆起部間凹部の数をｍとした場合において、以下の（ａ）又は（ｂ）：
（ａ）ｎ＝ｍ＋１；
（ｂ）ｎ＝ｍ＋２；
の関係を満たすようにすることで、細胞回収効率を高くすることが可能になる。
なお、ｎ≧２、ｍ≧１である。

なお、前記式（ａ）、（ｂ）でいう隆起部及び隆起部間凹部は、フィルターに充填した細胞分離材の縦断面に見られる隆起部及び隆起部間凹部である。

前記式（ａ）の関係を満たす細胞分離材としては、液体導入口側又は液体導出口側の一方に隆起部がある細胞分離材が挙げられる。例えば、図４に示すノズル付押え部材４をフィルター１の液体導入口側又は液体導出口側に用いた場合、細胞分離材１１の表面において、４つの隆起部及び３つの隆起部間凹部が生じるため、前記式（ａ）の関係を満たすことになる。
他形態の前記式（ａ）の関係を満たす細胞分離材としては、例えば、ノズル付押さえ部材４に存在する突起部の数が図４記載の突起部の数とは異なったノズルを用いた場合等が挙げられる。例えば、前記突起部が２つある場合、突起部同士の間に２つの楕円形隆起部及び中央部に１つの円形隆起部があり、楕円形隆起部と円形隆起部との間に凹部が１つあるため、細胞分離材の表面には隆起部３つ隆起部間凹部２つが生じる
また、前記突起部が４つある場合、突起部同士の間に４つの楕円形隆起部及び中央部に円形隆起部があり、楕円形隆起部と円形隆起部との間に凹部が１つあるため、細胞分離材の表面には隆起部５つ、隆起部間凹部４つが生じる。

前記式（ｂ）の関係を満たす細胞分離材としては、液体導入口側及び液体導出口側の両方に隆起部がある細胞分離材が挙げられる。例えば、図４に示すノズル付押え部材４をフィルター１の液体導入口側及び液体導出口側に用いた場合、上下の両面の表面上に隆起部及び隆起部間凹部が生じるため、隆起部が８個、隆起部間凹部６個を有する細胞分離材となり、前記式（ｂ）の関係を満たすことになる。
他形態の前記式（ｂ）の関係を満たす細胞分離材としては、例えば、上記と同様、図４に記載の突起部の数とは異なったノズルを用いた場合等が挙げられる。例えば、前記突起部が２個あるノズル付押え部材４を用いた場合、上下の細胞分離材の表面には隆起部６つ隆起部間凹部４つが生じる
また、前記突起部が４個あるノズル付押え部材４を用いた場合、細胞分離材の表面には隆起部１０個、隆起部間凹部８個が生じる。

従来の細胞分離用フィルターでは、充填される細胞分離材の表面は、蓋や隔壁等により上下方向に対して略平面状に抑えられているのが一般的である。したがって、前記隆起部、中でも隆起部間凹部は、従来のフィルターに充填される細胞分離材表面には見られない形状である。

（細胞分離材の厚み）
本発明のフィルターでは、前記細胞分離材の厚みの最大値（ｍｍ）と最小値（ｍｍ）との比率（細胞分離材の厚みの最大値／細胞分離材の厚みの最小値）と、１．０８〜１．５１に調整することで、細胞の回収効率を顕著に向上させることができ、しかも細胞分離材に捕捉されたまま回収できない細胞の数を顕著に低減することができる。

本発明のフィルターでは、前記細胞分離材の厚みの最大値について、例えば、図２（ｂ）では、隆起部１２ａ、１２ｂを含む細胞分離材の厚みが他の隆起部を含む細胞分離材の厚みより大きい場合、この厚みＸが細胞分離材１１の厚みの最大値となる。
また、細胞分離材１１の厚みの最小値とは、例えば、図２（ｂ）では、前記突起部１６ａで押えられた部分の細胞分離材１１の表面同士の厚みＹとなる。
細胞分離材１１の表面上の隆起部は、立体的な形状で存在しているため、細胞分離材の中心に対して様々な角度で細胞分離材１１の縦断面を観察して、その中で最大の厚み、最小の厚みを計測すればよい。
なお、フィルターの縦断面はＸ線ＣＴによる撮影を行うことで観察しており、細胞分離材１１の縦断面の各部の長さについては、ＣＴデータビューアー（ｍｙＶＧＬ２．２）を用いて測定すればよい。

前記細胞分離材の厚みの最小値としては、１．２０×１０〜１．２６×１０ｍｍであることが好ましい。また、細胞分離材の厚みの最大値としては、１．５５×１０〜２．０５×１０ｍｍであることが好ましい。

また、本発明のフィルターでは、前記液体導入口９側の隆起部間凹部１５ａから液体導出口１０側の隆起部間凹部１５ｂまでの細胞分離材１１の厚み（ｍｍ）と細胞分離材１１の厚みの最小値（ｍｍ）との比率（液体導入口９側の隆起部間凹部１５ａから液体導出口１０側の隆起部間凹部１５ｂまでの細胞分離材１１の厚み／細胞分離材１１の厚みの最小値）が、１．０３〜１．３９の範囲に調整することが好ましい。

また、本発明のフィルターでは、前記液体導入口９側の隆起部間凹部１５ａから液体導出口１０側の隆起部間凹部１５ｂまでの細胞分離材１１の厚み（ｍｍ）と細胞分離材１１の厚みの最大値（ｍｍ）との比率（液体導入口側の隆起部間凹部から液体導出口側の隆起部間凹部までの細胞分離材の厚み／細胞分離材の厚みの最大値）が、０．８９〜０．９５の範囲に調整することが好ましい。

（細胞分離材の断面積）
本発明のフィルターでは、前記細胞分離材の断面積において、隆起部の断面積の和（ｍｍ^２）と、隆起部以外の断面積（ｍｍ^２）との比率（隆起部の断面積の和／隆起部以外の断面積）が、０．２０〜０．３６の範囲に調整されていることが好ましい。

前記細胞分離材の断面積とは、前記容器の上下方向に対して平行に前記細胞分離材を切断したときの縦断面積をいう。
前記隆起部の断面積とは、上方向又は下方向に対して隆起部の高さが最大となる位置を含む部分で前記細胞分離材を上下方向に切断したときの断面積をいう。また、前記隆起部以外の断面積とは、前記のように細胞分離材を上下方向に切断して測定した総断面積から、隆起部の断面積を引いた面積をいう。
例えば、図２（ｂ）に示すフィルター１の細胞分離材１１の縦断面を図５に示す。
細胞分離材の断面積は、図示される全ての断面積（α＋β＋α’）である。
一方、隆起部の断面積については、液体導入口９側の断面積αと液体導出口１０側の断面積α’とがあり、これらの和（α＋α’）が隆起部の断面積となる。
そして、前記細胞分離材の断面積から隆起部の断面積を引いた残りの断面積（β）が隆起部以外の断面積となる。
前記比率（α＋α’）／βは、０．２０〜０．３６の範囲に調整することがより好ましい。

また、隆起部の断面積の和が２．０８×１０〜１．０９×１０^２ｍｍ^２、隆起部以外の断面積が５．４０×１０^２〜５．６１×１０^２ｍｍ^２とすることでより細胞回収に適した隆起部の外形に調整することができるという利点がある。

（細胞）
本発明で目的とされる細胞とは、特に限定されないが、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系細胞、脂肪由来間質幹細胞、多能性成体幹細胞、骨髄ストローマ細胞、造血幹細胞等の多分化能を有する生体幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、キラーＴ細胞（細胞障害性Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、制御性Ｔ細胞等のリンパ球系の細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、顆粒球、赤血球、血小板等、神経細胞、筋細胞、線維芽細胞、肝細胞、心筋細胞等の体細胞又は、遺伝子の導入や分化等の処理を行った細胞が例示される。

（細胞分離方法）
本発明のフィルターは、前記のように様々な細胞、特に、白血球、造血幹細胞及び／又は単核球の回収に好適に使用される。
白血球としては、末梢血中の好中球、好酸球、好塩基球等の顆粒球及び単球、リンパ球等の単核球が例示される。

前記フィルターを用いる細胞分離方法としては、前記フィルターの液体導入口から細胞含有液を導入し、フィルター内に充填されている細胞分離材と接触させて、白血球及び／又は単核球を細胞分離材に捕捉させる第一の工程、及び、
前記フィルター内に回収液を導入し、白血球及び／又は単核球を細胞分離材から回収する第二の工程
を含む方法が挙げられる。

前記細胞含有液としては、前記白血球及び／又は単核を含む細胞を含む懸濁液であれば特に限定されず用いることができるが、例えば、臍帯等の生体組織を酵素処理や破砕処理や抽出処理や分解処理や超音波処理等をした後の懸濁液、血液や骨髄液、臍帯血等の体液、血液や骨髄液を密度勾配遠心処理やろ過処理や酵素処理や分解処理や超音波処理等の前処理をして調製された細胞懸濁液等が例示される。

また、前記に例示した白血球等の細胞を生体外で培養液や刺激因子等を用いて培養や増殖等をした後の懸濁液であってもよい。

前記第一の工程において、前記フィルターの液体導入口から前記細胞含有液を導入する際には、前記細胞含有液を加圧することでフィルター内への細胞含有液の導入を行い、細胞含有液をフィルター内に充填されている細胞分離材と接触させて、白血球及び／又は単核球を前記細胞分離材に捕捉させる。前記加圧の程度としては、特に限定はない。

前記細胞分離材は、白血球及び／又は単核球を捕捉できるものを使用すればよい。
なお、白血球以外の血液成分については、不要成分として除いてもよいし、必要に応じて回収してもよく、特に限定はない。

前記第二の工程において、白血球等を捕捉したフィルターには回収液を導入することで、フィルターから白血球等を回収液中に分離させ、この白血球等を含む回収液を液体導入口から回収専用のバッグ等に導入することで白血球等を回収することができる。
前記回収液は、フィルターの液体導出口からフィルター内に導入される。

前記回収液は、細胞と等張である溶液であれば特に限定はないが、生理食塩液やリンゲル液等の注射溶剤として使用実績のあるものや、緩衝液、細胞培養用の培地等が挙げられる。特に、培養工程を経る際はそのまま培養が行える培地が好ましく、培養工程を経ずそのまま治療に用いる際は、生理食塩液等の点滴等に使用実績のある等張液等、安全性が保証されている回収液を使用することが好ましい。

本発明において前記第一工程及び第二工程は、前記室温下で行ってもよいし、冷蔵温度下で行ってもよい。冷蔵温度下で行う場合、冷蔵された細胞含有液を処理することが挙げられる。細胞含有液の保管としては、冷蔵温度に設定した冷蔵庫による保管、ウォーターバスによる保管、及びドライアイスによる保管等が挙げられる。汎用性から冷蔵庫で保存することが好ましい。冷蔵温度としては、１℃以上６℃以下が好ましく、より好ましくは３℃以上５℃以下が好ましい。冷蔵温度が１℃未満では細胞は死滅し、６℃を超えて保存すると細菌が繁殖しコンタミネーションを起こす可能性がある。

また、細胞分離材の状態を整えて、細胞を捕捉しやすくする観点から、前記第一の工程の前に、フィルターの液体導入口から生理食塩水又は緩衝液を導入し、細胞分離材と生理食塩水又は緩衝液とを接触させてもよい。

また、前記第一の工程の後であって第二の工程の前に、フィルターの液体導入口から生理食塩水又は緩衝液を導入して、フィルターの液体導出口から導出することにより、フィルター内の夾雑成分を除去することで、回収される細胞内へ不要成分を低減することができる。

以下、実施例において本発明に関して詳細に述べるが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。

（実施例１）
図６に示すように、高さ（内寸）１２ｍｍ、直径（内径）４５ｍｍの容器本体３に、直径４５ｍｍの丸型にカットしたポリエステル不織布（目付３５ｇ／ｍ^２、細胞分離材１１）を１１２枚充填し、前記容器本体３の上下の開口部に図４で示すノズル付押え部材４、５を差し込み、その上からキャップ６、７でネジ止めし、図１、２（ａ）、２（ｂ）に示すような構造を有する細胞分離フィルター１を作製した。

次に、前記細胞分離フィルター１の液体導入口９と液体導出口１０に、図７で示した回路を接続して細胞分離用デバイス２５を作製した。

図７に示す前記回路において、前記液体導入口９にはチューブ１７ａを接続し、このチューブ１７ａには、細胞懸濁液を収容する手段１８及びプライミング用生理食塩水を収容する手段１９に接続したチューブ１７ｂと、フィルターを通過した回収液を収容する手段（回収バッグ）２０及び回収バッグ等に回収された回収液を回収する手段２１に接続したチューブ１７ｃとを、流路切り替え手段２２ａを介して接続した。
前記チューブ１７ｂには流路切り替え手段２２ｂを介して、細胞懸濁液を収容する手段１８とプライミング用生理食塩水を収容する手段１９とを接続した。
前記チューブ１７ｃには流路切り替え手段２２ｃを介して、前記フィルターを通過した回収液を収容する手段２０と回収バッグ等に回収された回収液を回収する手段２１とを接続した。
また、前記液体導出口１０にはチューブ１７ｄを接続し、流路切り替え手段２２ｄを介して、フィルターを通過した細胞懸濁液を収容する手段（廃液バッグ）２３及び回収液を回収する手段２４と接続した。

また、フィルター１に充填された細胞分離材の液体導出口１０側の表面には隆起部が４つ、凹部が３つ、液体導入口９側の表面にも隆起部が４つ、凹部が３つあり、フィルター全体で隆起部８つ、凹部６つであった。なお、以下の実施例でも隆起部及び凹部の位置及び数は同じであった。

また、細胞分離材の厚みの最小値は１２．６ｍｍ
細胞分離材の厚みの最大値は１８．１ｍｍ
隆起部の断面積の和は１．０９×１０^２ｍｍ²
隆起部以外の断面積は５４０ｍｍ²
前記突起部の先端面の面積は、細胞分離材の表面積の１５％
であった。

前記細胞分離用デバイス２５を用いて細胞分離操作を実施した。なお、各流路切り替え手段の操作は、フィルター１に通液する液体の種類、送液する目的の手段に応じて、適宜行った。
まず、プライミング用生理食塩水を収容する手段１９の生理食塩水５０ｍＬ〜１５０ｍＬを用いてフィルター１のプライミング操作を行い、廃液バッグ２３に細胞分離フィルターを通過した生理食塩液を回収した。
次に細胞懸濁液を収容する手段１８からＣＰＤで抗凝固したウシ末梢血Ａ１００ｍＬを、フィルター１に重力を利用して通液し、通過液は廃液バッグ２３に回収した。
最後に、６％(ｗ/ｖ)ヒドロキシエチルスターチを含む生理食塩水（フレゼニウス・カービ・ジャパン）２３ｍＬを１５ｍＬ／秒の流量で、回収液を回収する手段２４としてシリンジを用いて手動で細胞分離フィルター１の液体導出口１０より導入し、液体導入口９に接続した回収バッグ２０に回収した。
回収液、及び、処理前の細胞懸濁液の白血球濃度を血球カウンター（シスメックス製、商品名「Ｋ−４５００」）により測定し、処理前の細胞懸濁液と回収液の体積より白血球数を算出した。結果は表１に示した。
更に、回収液、及び、処理前の細胞懸濁液の単核球の割合をフローサイトメーター（日本ベクトン・ディッキンソン（株）製、商品名「ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ II」）により測定し、回収された単核球数を算出した。これらの細胞数を基に、白血球及び単核球の回収率を算出した。

（比較例１）
細胞分離フィルターの圧縮具として不織布の隆起部が最大（２０．０ｍｍ）となるようなノズル付押え部材を使うこと以外は、実施例１と同様の操作を実施して、白血球及び単核球の回収率を測定した。結果は表１に示した。

（比較例２）
細胞分離フィルターに不織布を充填する前に、積層された不織布を圧縮して表面を平面状にし、隆起部が生じないように加工する工程が加わること以外は実施例１と同様の操作を実施して、白血球及び単核球の回収率を測定した。結果は表１に示した。

（実施例２）
細胞分離フィルターに充填する不織布枚数が８４枚であること及びウシ末梢血Ｂを使ったこと以外は、実施例１と同様の操作を実施して、白血球及び単核球の回収率を測定した。結果は表１に示した。

（実施例３）
細胞分離フィルターに充填する不織布枚数が９９枚であること及びウシ末梢血Ｂを使ったこと以外は、実施例１と同様の操作を実施して、白血球及び単核球の回収率を測定した。結果は表１に示した。

（実施例４）
細胞分離フィルターに充填する不織布枚数が１２４枚であること及びウシ末梢血Ｂを使ったこと以外は、実施例１と同様の操作を実施して、白血球及び単核球の回収率を測定した。結果は表１に示した。

表１の結果より、細胞分離材の厚みの最大値/細胞分離材の厚みの最小値を１．０８〜１．５１の範囲に調整した実施例１〜４では、白血球回収率及び単核球回収率がともに８０％以上と高い回収率を示していたのに対して、比較例１、２では特に白血球回収率が５１％、６７％と有意に低くなっていた。

したがって、図２に示すフィルター１のように、充填された前記細胞分離材の表面に、液体導入口側や液体導出口側へ向けて隆起している隆起部を形成し、且つ前記細胞分離材の厚みの最大値と最小値との比率を１．０８〜１．５１となるように調整したフィルターを用いることで、目的の細胞を効率よく回収することができることがわかる。

（試験例）
白血球回収後の実施例１及び比較例１で使用したフィルターからそれぞれ細胞分離材を取り出して、白色の吸収紙の上に置いた。
その結果、図８に示すように、実施例１及び３で得られた細胞分離材ではほぼ細胞分離材本来の色（白色）となっていたのに対して、比較例１で得られた細胞分離材からは血液由来の成分が多量に残存しており、赤色に染まっていた。
したがって、実施例１で使用したフィルター１のように、充填された前記細胞分離材の表面に、液体導入口側又は液体導出口側の少なくとも１方向へ向けて隆起している隆起部を形成し、且つ前記細胞分離材の厚みの最大値と最小値との比率が特定の半に調整されることで、血液成分の回収ロスを減らすことができ、目的の細胞をより効率よく回収することができることがわかる。

本発明で回収さられた細胞は、細胞を培養し増殖させ提供することも、増殖させずに使用することも可能であり、治療用細胞として用いてもよい。具体的な治療対象としては、虚血性疾患、血管系疾患が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明で得られた必要細胞を、分化誘導剤等により分化誘導することにより軟骨損傷患者に移植する細胞、骨疾患患者に移植する細胞、心筋疾患患者又は血管疾患患者に移植する細胞、神経組織を損傷した患者に移植する細胞として使用することができるが、これらに限定されるものではない。
該分化誘導剤としては、目的とする細胞を分化誘導できるものを使用することが好ましいが、軟骨への分化誘導剤としてはデキサメタゾン、ＴＧＦβ、インシュリン、トランスフェリン、エタノールアミン、プロリン、アスコルビン酸、ピルビン酸塩、セレン等が挙げられ；骨への分化誘導剤としてはデキサメタゾン、β−グリセロリン酸、ビタミンＣ、アスコルビン酸塩等が挙げられ、；心筋への分化誘導剤としてはＥＧＦ、ＰＤＧＦ、５−アザシチジン等が挙げられ；神経への分化誘導剤としてはＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ｂＨＬＨ等が挙げられ；血管への分化誘導剤としてはｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ等が挙げられる。

本発明により回収した細胞や増殖させた細胞を、凍結保存してもよい。細胞へのダメージを少なくできる点から、液体窒素を用いて凍結保存することが好ましい。また、凍結保存した細胞を融解し、ヒトや動物への移植、研究への使用、又は再度培養することができる。

本発明により回収した細胞や増殖させた細胞を用いて、薬品組成物を製造することができる。前記細胞を製薬的に許容される添加剤と混合することで医薬品組成物を製造することができる。製薬的に許容される添加剤としては、凝固剤、ビタミン等の栄養源、抗生物質等が挙げられる。

１ フィルター
２ 容器
３ 本体
４、５ ノズル付押え部材
６、７ キャップ
８ シール
９ 液体導入口
１０ 液体導出口
１１ 細胞分離材
１２ａ、１２ａ’、１２ｂ、１２ｂ’ 隆起部
１３ 細胞分離材１１の表面の最も低い部分
１４ａ、１４ａ’、１４ａ’’ 隆起部の頂点
１５ａ、１５ａ’、１５ｂ、１５ｂ’ 隆起部間凹部
１６ａ、１６ｂ 突起部
１７ａ、１７ｂ、１７ｃ、１７ｄ チューブ
１８ 細胞懸濁液を収容する手段
１９ プライミング用生理食塩水を収容する手段
２０ フィルターを通過した回収液を収容する手段（回収バッグ）
２１ 回収バッグ等に回収された回収液を回収する手段
２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄ 流路切り替え手段
２３ フィルターを通過した細胞懸濁液を収容する手段（廃液バッグ）
２４ 回収液を回収する手段
２５ 細胞分離用デバイス

Claims (15)

1. 細胞分離材が充填された容器を有し、該容器の上部又は下部のいずれかに液体導入口、その反対側に液体導出口を備えたフィルターであって、
   充填された前記細胞分離材の表面に、液体導入口側又は液体導出口側の少なくとも１方向へ向けて隆起している隆起部を有し、且つ前記細胞分離材の厚みの最大値（ｍｍ）と最小値（ｍｍ）との比率（細胞分離材の厚みの最大値／細胞分離材の厚みの最小値）が、１．０８〜１．５１であるフィルター。
2. 前記細胞分離材の表面に、隆起部を少なくとも２つ及び隆起部の間に凹部を少なくとも１つ有する請求項１に記載のフィルター。
3. 隆起部の数をｎ、隆起部間凹部の数をｍとした場合において、以下の（ａ）又は（ｂ）：
   （ａ）ｎ＝ｍ＋１；
   （ｂ）ｎ＝ｍ＋２；
   の関係を満たす請求項２に記載のフィルター。
4. 前記細胞分離材の断面積において、隆起部の断面積の和（ｍｍ^２）と、隆起部以外の断面積（ｍｍ^２）との比率（隆起部の断面積の和／隆起部以外の断面積）が、０．２０〜０．３６である請求項１〜３のいずれかに記載のフィルター。
5. 液体導入口側の隆起部間凹部から液体導出口側の隆起部間凹部までの細胞分離材の厚み（ｍｍ）と細胞分離材の厚みの最小値（ｍｍ）との比率（液体導入口側の隆起部間凹部から液体導出口側の隆起部間凹部までの細胞分離材の厚み／細胞分離材の厚みの最小値）が、１．０３〜１．３９である請求項２〜４のいずれかに記載のフィルター。
6. 液体導入口側の隆起部間凹部から液体導出口側の隆起部間凹部までの細胞分離材の厚み（ｍｍ）と細胞分離材の厚みの最大値（ｍｍ）との比率（液体導入口側の隆起部間凹部から液体導出口側の隆起部間凹部までの細胞分離材の厚み／細胞分離材の厚みの最大値）が、０．８９〜０．９５である請求項２〜５のいずれかに記載のフィルター。
7. 細胞分離材の厚みの最小値が１．２０×１０〜１．２６×１０ｍｍ、細胞分離材の厚みの最大値が１．２６×１０〜２．１０×１０ｍｍである請求項１〜６のいずれかに記載のフィルター。
8. 隆起部の断面積の和が２．０８×１０〜１．０９×１０^２ｍｍ^２、隆起部以外の断面積が５．４０×１０^２〜５．６１×１０^２ｍｍ^２である請求項４〜７のいずれかに記載のフィルター。
9. 前記容器の内側に突き出しており、前記容器に内蔵している前記細胞分離材の上部側又は下部側の表面を押圧可能な突起部を前記容器内部の上部側又は下部側に備え、前記突起部の先端面の面積が前記細胞分離材の表面積の３０％以下である請求項１〜８いずれかに記載のフィルター。
10. 前記突起部の先端面の形状が線形、棒形、多角形、楕円形、円形又はこれらの形状のうち２種以上を組み合わせた形状である請求項９に記載のフィルター。
11. 前記突起部を少なくとも２つ以上有する請求項９又は１０に記載のフィルター。
12. 請求項１〜１１のいずれかに記載のフィルターの液体導入口から細胞含有液を導入し、フィルター内に充填されている細胞分離材と接触させて、白血球及び／又は単核球を細胞分離材に捕捉させる第一の工程、及び、
    前記フィルター内に回収液を導入し、白血球及び／又は単核球を細胞分離材から回収する第二の工程
    を含む、細胞分離方法。
13. 前記第二の工程が、フィルターの液体導出口から回収液を導入し、液体導入口から白血球及び／又は単核球を回収する工程である、請求項１２に記載の細胞分離方法。
14. さらに、前記第一の工程の前に、フィルターの液体導入口から生理食塩水又は緩衝液を導入し、細胞分離材と生理食塩水又は緩衝液とを接触させる工程を含む、請求項１２又は１３に記載の細胞分離方法。
15. さらに、前記第一の工程の後であって第二の工程の前に、フィルターの液体導入口から生理食塩水又は緩衝液を導入して、フィルターの液体導出口から導出することにより、フィルター内の夾雑成分を除去する工程を含む、請求項１２〜１４のいずれかに記載の細胞分離方法。