JP2015526516A - 低酸素誘導性転写因子複合体の活性を阻害するための組成物および方法、ならびに腫瘍の治療のためのその使用 - Google Patents

Abstract

エピジチオジケトピペラジン化合物、それをベースとする医薬組成物、ならびに低酸素誘導性遺伝子の転写および翻訳を処置する、減少させる、または阻害する方法が開示されている。本発明の一態様は、低酸素誘導性転写経路に干渉するための方法を対象とする。一般に、この態様による方法は、細胞を、式Ｉ、式ＩＩもしくは式ＩＩＩのいずれかによる少なくとも１種の化合物、またはその塩、溶媒和物もしくは水和物と接触させることを含む。

Description

発明の分野

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年８月２９日に出願された米国仮出願第６１／６９４，７１７号に開示された発明について主張するものであり、その全内容はここで参照によりここに組み込まれる。

連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国国立科学財団によって授与された契約番号ＣＨＥ−１１６１６４４の下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

本発明は、エピジチオジケトピペラジン化合物、それをベースとする医薬組成物、ならびに低酸素誘導性遺伝子の転写および翻訳を処置する、減少させる、または阻害する方法に関する。

発明の背景

癌の罹患率および死亡率の高さは、西洋社会の人々の間で、依然として主要な懸案事項である。癌患者およびその近親者に影響を及ぼすことに加えて、癌は、社会に大きな負担を強いる。癌治療および患者のケアの費用は典型的に高く、健康保険の費用増加の一因となり、ひいては、無保険者の割合の上昇をもたらし、その結果、無保険者が病気または負傷した場合の経済的負担の増加をもたらす。癌はまた、癌患者の長期欠勤に起因して、企業に対する重大な悪影響を引き起こす。

癌治療の方法は長年にわたり大幅に改善されてきたが、多くの課題、中でもとりわけ、癌患者の間の再発、ならびに癌の進行期の患者および転移性疾患または全身性の癌、たとえば、白血病もしくはリンパ腫を有する患者の治療の困難性が、依然として存在する。たとえば、改善された診断法とより良好な手術手技との併用により、腫瘍医は、より確信を持って腫瘍を除去しながら、同時に正常組織の除去を最小化することができる。したがって、患者の回復時間を短縮でき、心理的影響が減少する。しかしながら、手術は、限局性の非転移性腫瘍または広がりの少ない腫瘍を有する患者を治療するためのいくつかの有用なツールのうちの１つにすぎない。

化学療法は、ある特定の種類の癌に対する別の最適な治療である。しかしながら、化学療法の方法は、一般に、正常細胞と比較して、腫瘍細胞に特異的なものではない。結果として、化学療法は、一般に、深刻な副作用を伴い、患者の免疫系および急速に分裂する組織、たとえば、肝臓、腎臓、腸および上皮の組織に対して、特に破壊的なものであり得る。

癌の進行は、血管新生、またはあらゆる固形腫瘍を貫通する新たな血管の発芽に依存する。癌を定義する急速な組織増殖は、多数の適応的細胞応答をもたらし、その中でも主なものが、別個であるが関連した過程である血管新生および解糖の増加である。血管新生は、いくつかの分裂促進因子、たとえば血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）によって主に推進され、その受容体が、鍵となる役割を果たす。新血管形成は、胚発生においては必須であるが、癌においては非常に望ましくなく、その理由は、これらの新生血管は、腫瘍組織に注ぎ込み、より急速な成長のための増加した酸素供給および栄養分をそれらに与えるからである。血管新生は、特に致命的であり、その理由は、二重の脅威：腫瘍成長を加速するだけでなく、新たに形成された血管系を介した転移のための通路を与えるという脅威を及ぼすからである。全患者生存に最大の影響を及ぼすのは転移成長であることから、血管新生は、決定的な化学療法の標的である。さらに、血管標的は、療法に対する耐性を生じないはずであり、その理由は、悪性細胞において起こる多重変異を受けないからである。血液供給（血管系）を標的とする主な利点のうちの１つは、癌性組織における細胞とは異なり、血管を構成する細胞は、遺伝的に安定であり、したがって、療法に対して低減された耐性を有するはずであることである。

腫瘍細胞は、増殖し続けると、代謝過程のために必要な酸素および栄養素を運ぶ血液供給からさらに遠くに押しやられ、したがって、適切な酸素灌流を得ることができない。続いて起こる低酸素¹は、嫌気的代謝への切り替えをもたらし、これは、解糖が上方調節された細胞を選択する。²解糖機能の増大は、次いで、細胞内ｐＨを下げて細胞外マトリックスおよび基底膜の分解を容易にすることができる乳酸の発生の増加をもたらし、それによって血管新生を促進する。³解糖は、腫瘍形成の間の成長抑止の克服において有意な利点を与え^4、5、大部分の主な転移性腫瘍は、解糖酵素、たとえば、ヘキソキナーゼ１および２ならびにグルコーストランスポーターＧＬＵＴ１およびＧＬＵＴ３の有意な上方調節を実証する。⁶
低酸素は、細胞の、増殖、シグナル伝達、および成長において極めて重要な役割を果たす、固形腫瘍の最も重要な特質のうちの１つである。⁷典型的な新生物は、その早期において血管を通常は持っていない。急速に増殖する細胞は、低酸素の発生の一因となる。⁸血管から離れた腫瘍の部分では細胞増殖が低下する⁹にもかかわらず、それらは、より攻撃的な細胞表現型を選択する傾向がある。さらに、血管から離れた低酸素組織は、ｐ５３媒介性アポトーシスに対する感受性を喪失した細胞を生じさせることが報告されている。⁷
低酸素細胞への適切な血液供給の欠如により、これらの細胞への薬物の送達がひどく損なわれる^12、13ことに加えて、低酸素はまた、薬物耐性にかかわる遺伝子、たとえばＰ糖タンパク質の上方調節をもたらす。^10、11最も重要なことには、転写の観点から、低酸素は、血管新生¹⁴および腫瘍浸潤¹⁵にかかわる遺伝子の上方調節をもたらし、より攻撃的な癌表現型がもたらされる。¹⁶
細胞および組織において、低酸素に対する応答は、低酸素誘導性転写因子のファミリーによって主に媒介され、その中でも、低酸素誘導性因子１（ＨＩＦ１）が主要な役割を果たす。これは、低酸素状態において上方調節される多くの鍵遺伝子の調節を媒介するヘテロ二量体転写因子である（図１ａ）。¹⁷正常酸素条件の間、ＨＩＦ１のαサブユニットは、プロリン残基４０２および５６４におけるヒドロキシル化によって調節され、¹⁸これらの修飾は、フォンヒッペルリンドウ（ｐＶＨＬ）タンパク質¹⁹がＨＩＦ１に結合し、その後のプロテアソーム分解のため、それをユビキチンで標識するためのドッキング部位として働く。²⁰しかしながら、低酸素条件下では、ＨＩＦ１αは蓄積し、核に移行し、そのベータサブユニットであるアリール炭化水素受容体核内輸送体（ＡＲＮＴ、またはＨＩＦ１β）と二量体化する²¹。これは、低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）を保有する低酸素誘導性遺伝子のプロモーター領域と結合し、²²このような遺伝子としては、ＶＥＧＦ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＰＯ、およびＧＬＵＴ−１が挙げられる。^23、24低い酸素レベルはまた、Ａｓｎ８０３の別の調節部位のヒドロキシル化を不可能にする^25〜30ことから、コアクチベーターであるＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）／ｐ３００^31〜33がＨＩＦ１αのＣ−末端ドメインへの結合を介して動員され、低酸素誘導性遺伝子の発現レベルの上昇を促進する（図１ｂ）。^34〜36ＲＡＳ、ＳＲＣ、およびＨＥＲ２／ＮＥＵ／ＥＲＢＢ２の発癌性変異が見られる多くの腫瘍細胞では、酸素供給が十分な条件下でも高レベルのＨＩＦ１αが検出されている。³⁷
ＨＩＦ１αのアンチセンス構築物は、小さな移植された胸腺リンパ腫をインビボで根絶し、さらにはより大きな腫瘍に対する免疫療法の有効性を高めることが示されている。³⁸低分子の微小管阻害剤、たとえば、２−メトキシエストラジオール、ビンクリスチン、およびパクリタキセルは、インビトロでＨＩＦ１αレベルを減少させ、また腫瘍成長および血管形成を減少させることが示されている。³⁹しかしながら、腫瘍成長の減少において示される作用が、微小管阻害とＨＩＦ１αレベルの減少のどちらに起因するかは、明確に理解されていない。

ＨＩＦ１は、主にＣＢＰ／３００のＣＨ１ドメインと、一連の鍵となるシステイン残基を介して相互作用し、この相互作用は、疎水性力によって推進される。天然産物のケトミン（chetomin）（図２、下記参照）は、ケトミウム属種（Chaetomium sp.）の菌代謝産物であるが、ＨＩＦ／ｐ３００複合体の強力で特異的な阻害を実証することが示された。ｐ３００／ＣＢＰは、ＨＩＦ１媒介性トランス活性化に不可欠であることから、ＨＩＦ１とｐ３００／ＣＢＰとの会合の遮断は、転写を有効に下方調節する。

本発明の一態様は、その塩、溶媒和物および水和物を含む式Ｉによる化合物：

（式中、ｎ＝１、２、３、４であり、
Ｒ₁およびＲ₂は、水素、アルキル、置換アルキル、およびアリールからなる群から独立して選択され、
Ｒ₃は、Ｈおよびアシルからなる群から選択され、
Ｙは、（ＣＨ₂）_k、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−）_l、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−）_m、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｓ−）_n、（−ＣＨ＝ＣＨ−）_o、ヘテロ環、

からなる群から選択され、
ここで、Ｘは、（ＣＨ₂）_k、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−）_l、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−）_m、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｓ−）_n、（−ＣＨ＝ＣＨ−）_o、およびヘテロ環からなる群から選択され、
ここで、ｋ、ｌ、およびｍ、ｎ、ｏは、それぞれ独立して、１、２、または３に等しく、
Ｒ₄は、Ｈ、アルキル、およびハロゲンからなる群から選択される）を対象とする。

上記の態様では、Ｒ₁およびＲ₂について、アルキルは、好ましくはメチルまたはエチルであり、置換アルキルは、好ましくは−ＣＨ₂ＯＨであり、アリールは、好ましくはフェニルまたはベンジルであり、Ｒ₃について、アシルは、好ましくはＣＯＣＨ₃である。

本発明の別の態様は、その塩、溶媒和物および水和物を含む式ＩＩによる化合物：

（式中、ｎ＝１、２、３、４であり、
Ｒ₁、Ｒ₂は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、およびアリールからなる群から独立して選択され、
Ｒ₃は、Ｈ、アシルからなる群から選択され、
Ｘは、（ＣＨ₂）_k、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−）_l、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−）_m、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｓ−）_n、（−ＣＨ＝ＣＨ−）_o、およびヘテロ環からなる群から独立して選択され、ここで、ｋ、ｌ、およびｍ、ｎ、ｏは、それぞれ独立して、１、２、または３に等しく、
Ｒ₄は、Ｈ、アルキル、およびハロゲンからなる群から選択される）を対象とする。

上記の態様では、Ｒ₁およびＲ₂について、アルキルは、好ましくはメチルまたはエチルであり、置換アルキルは、好ましくは−ＣＨ₂ＯＨであり、アリールは、好ましくはフェニルまたはベンジルであり、Ｒ₃について、アシルは、好ましくはＣＯＣＨ₃である。

本発明の別の態様は、その塩、溶媒和物および水和物を含む式ＩＩＩによる化合物：

（式中、ｎ＝１、２、３、４であり、
Ｒ₁およびＲ₂は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリールからなる群から独立して選択され、
Ｒ₃＝Ｈまたはアシルであり、
Ｘは、（ＣＨ₂）_k、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−）_l、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−）_m、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｓ−）_n、（−ＣＨ＝ＣＨ−）_o、およびヘテロ環からなる群から選択され、ここで、ｋ、ｌ、およびｍ、ｎ、ｏは、それぞれ独立して、１、２、または３に等しく、
Ｒ₄＝Ｈ、アルキル、またはハロゲンである）を対象とする。

上記の態様では、Ｒ₁およびＲ₂について、アルキルは、好ましくはメチルまたはエチルであり、置換アルキルは、好ましくは−ＣＨ₂ＯＨであり、アリールは、好ましくはフェニルまたはベンジルであり、Ｒ₃について、アシルは、好ましくはＣＯＣＨ₃である。

本発明の別の態様は、担体に溶解または分散された、式Ｉ、式ＩＩもしくは式ＩＩＩのいずれかによる少なくとも１種の化合物、またはその塩、溶媒もしくは水和物を含む医薬組成物を対象とする。

本発明の別の態様は、以下の化合物：

を対象とする。

本発明の別の態様は、低酸素誘導性転写経路に干渉するための方法を対象とする。一般に、この態様による方法は、細胞を、式Ｉ、式ＩＩもしくは式ＩＩＩのいずれかによる少なくとも１種の化合物、またはその塩、溶媒もしくは水和物と接触させることを含む。

本発明の別の態様は、乳癌を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、式Ｉ、式ＩＩもしくは式ＩＩＩのいずれかによる少なくとも１種の化合物、またはその塩、溶媒もしくは水和物の有効量を投与することを含む方法を対象とする。

本発明の別の態様は、癌腫を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、式Ｉ、式ＩＩもしくは式ＩＩＩのいずれかによる少なくとも１種の化合物、またはその塩、溶媒もしくは水和物の有効量を投与することを含む方法を対象とする。

本発明の他の側面および利点は、以下の詳細な説明、付属の図面、および添付の特許請求の範囲から明らかとなる。

（ａ）ＨＩＦ１α Ｃ−ＴＡＤ／ｐ３００ ＣＨ１複合体の構造、低酸素誘導性因子１α（ＨＩＦ１α）のドメインマップ、およびヒトＨＩＦ１α Ｃ−ＴＡＤの配列。（ｂ）ＨＩＦ１α転写経路の概略図。 ケトミウム・グロボーサム（Chaetomium globosum）から単離されるケトシン（chaetocin）ＣＴＣおよびケトミウム・コクリオデス（Chaetomium cocliodes）から単離されるケトミンＣＴＭ。 合成エピジチオジケトピペラジンＬＳ６９、ＬＳ７２および対照のジケトピペラジンＮＰ４８１の構造。 図４は、以下の条件下での二環式チオアセタールおよび単環ＥＴＰの合成を示す：ａ：ｐ−アニスアルデヒド、ＢＦ₃、ＥＴ₂Ｏ、ＤＣＭ、室温、１６時間、９２％；ｂ：ｍＣＰＢＡ、Ｍｅ₂Ｓ、ＨＣｌＯ₄；ｃ：ＢＯＭＣｌ、ｎＢｕＬｉ、ＴＨＦ、−７８℃、ｄ：ＢＣＬ₃、ＣＨ₂Ｃｌ₂；ｅ：ＡｃＣｌ、ピリジン、ＣＨ₂Ｃｌ₂；ｆ：ｎＢｕＬｉ、ＴＨＦ、−７８℃、ＢｎＣｌ。 図５は、以下の条件下での架橋ＥＴＰの合成を示す：ａ：７、ｎＢｕＬｉ、ＴＨＦ、−７８℃；ｂ：ＢＣｌ₃、ＣＨ₂Ｃｌ₂；ｃ：ｍＣＰＢＡ；Ｍｅ₂Ｓ、ＨＣｌＯ₄；ｄ：ｎＢｕＬｉ、ＴＨＦ、−７８℃。 ＬＳ６９の固定化融合タンパク質ＧＳＴ−ＣＨ１−ｐ３００に対する直接結合についてのＳＰＲデータ。１．０９μＭの結合定数が得られた。 ＬＳ７２の固定化ＧＳＴ−ＣＨ１−ｐ３００に対する結合を示すＳＰＲセンサーグラム。３．６２μＭの結合定数が得られた。 ｈＲＥ−ｈＣＭＶ−Ｌｕｃプラスミドを安定にトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株における、ルシフェラーゼアッセイを用いた低酸素誘導性プロモーター活性の分析。化合物ＬＳ６９、ＬＳ７２、およびＮＰ４８１の濃度は、それぞれ２００ｎＭと６００ｎＭであった。 リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した、ＭＣＦ７細胞におけるＶＥＧＦ遺伝子の相対ｍＲＮＡレベル。化合物ＬＳ６９、ＬＳ７２、およびＮＰ４８１の濃度は、それぞれ２００ｎＭと６００ｎＭである。 ＭＣＦ７細胞におけるＬＳ７２についてのＭＴＴ細胞毒性アッセイ。１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で細胞を維持した。異なる濃度のＬＳ７２で２４時間細胞を処理し、形成された紫色のホルマザンの量を、分光光度法によって決定した。 Ａ５４９細胞株におけるケトミンについてのＭＴＴ細胞毒性アッセイデータ。無血清Ｆ−１２Ｋ培地中で異なる濃度の化合物で４８時間細胞を処理した。ケトミンについて得られたＥＣ５０値は、４８時間の処理後のＡ５４９細胞株において０．９μＭであった。比較のため、ケトミンによる２４時間のＭＣＦ７細胞株の処理では、０．２μＭのＥＣ５０が得られ、その細胞株における化合物の細胞毒性が有意により高いことが示される。 Ａ５４９細胞株におけるＬＳ７２についてのＭＴＴ細胞毒性アッセイデータ。無血清Ｆ−１２Ｋ培地中で異なる濃度の化合物で４８時間細胞を処理した。 ＬＳ７２による処理後のＡ５４９細胞における３つのＨＩＦ１α誘導性遺伝子：ＶＥＧＦ、ｃ−Ｍｅｔ、およびＧｌｕｔ１のｍＲＮＡレベル。０．２％血清を含む培地中でＬＳ７２（４００ｎＭ）で細胞を処理した後のＡ５４９における３つのＨＩＦ１α誘導性遺伝子、ＶＥＧＦ、ｃ−Ｍｅｔ、およびＧｌｕｔ１のｍＲＮＡレベルを示す、ｑＲＴ−ＰＣＲ実験からのデータ。３００μＭ ＤＦＯによって低酸素を誘導した。エラーバーは４連で実施した実験についての±ｓ．ｅ．ｍである。エラーバーは３連で実施した実験の±ｓ．ｅ．ｍである。^***Ｐ＜０．００１、^**Ｐ＜０．０１、ｔ検定。 （Ａ）ＬＯＸ遺伝子についての、ＬＳ７２で処理されたＡ５４９細胞におけるｑＲＴ−ＰＣＲデータ。低酸素バッグによって低酸素を誘導した。２％血清を含むＦ−１２Ｋ培地中で細胞を維持した。６５％コンフルエントに達した後、細胞を無血清培地中で成長させ、ＬＳ７２（４００ｎＭ）で処理した。ＤＦＯ（３００μＭ）を用いて４８時間低酸素を誘導した。エラーバーは３連で実施した実験の±ｓ．ｅ．ｍである。^**Ｐ＜０．０１、ｔ検定。 （Ｂ）ＣＸＣＲ４遺伝子についての、ＬＳ７２で処理されたＡ５４９細胞におけるｑＲＴ−ＰＣＲデータ。低酸素バッグによって低酸素を誘導した。２％血清を含むＦ−１２Ｋ培地中で細胞を維持した。６５％コンフルエントに達した後、細胞を無血清培地中で成長させ、ＬＳ７２（４００ｎＭ）で処理した。ＤＦＯ（３００μＭ）を用いて４８時間低酸素を誘導した。エラーバーは３連で実施した実験の±ｓ．ｅ．ｍである。**Ｐ＜０．０１、ｔ検定。 ３つの異なる濃度のＬＳ７２処理に対する用量応答を示す、Ａ５４９細胞株におけるＶＥＧＦのｍＲＮＡレベル。濃度：１００ｎＭ、４００ｎＭ、１６００ｎＭのＬＳ７２で処理されたＡ５４９細胞株におけるＶＥＧＦのｍＲＮＡレベルを決定するため、ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを実施した。ＤＦＯ（３００μＭ）によって低酸素を誘導した。エラーバーは３連で実施した実験についての±ｓｅｍである。エラーバーは３連で実施した実験の±ｓ．ｅ．ｍである。^**Ｐ＜０．０１、^*Ｐ＜０．０５、ｔ検定。 １００ｎＭ、４００ｎＭ、１６００ｎＭの濃度のＬＳ７２に対する用量応答を示す、Ａ５４９細胞株におけるｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡレベル。ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、ｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡレベルを決定した。ＤＦＯ（３００μＭ）を用いて低酸素を誘導した。エラーバーは３連で実施した実験についての±ｓｅｍである。エラーバーは３連で実施した実験の±ｓ．ｅ．ｍである。^***Ｐ＜０．００１、^**Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．１、ｔ検定。 ３つの異なる濃度のＬＳ７２で処理された８５％コンフルエントなＡ５４９細胞におけるＧｌｕｔ１ ｍＲＮＡについてのｑＲＴ−ＰＣＲデータ。濃度：１００ｎＭ、４００ｎＭ、１６００ｎＭのＬＳ７２で処理されたＡ５４９細胞株におけるＧｌｕｔ１のｍＲＮＡレベルを決定するため、ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを実施した。ＤＦＯ（３００μＭ）を用いて低酸素を誘導した。エラーバーは３連で実施した実験についての±ｓｅｍである。エラーバーは３連で実施した実験の±ｓ．ｅ．ｍである。^***Ｐ＜０．００１、^**Ｐ＜０．０１、ｔ検定。 ８５％コンフルエントな細胞において低酸素を誘導したＡ５４９細胞についてのｑＲＴ−ＰＣＲデータ。６５０倍を超えるＣＸＣＲ４転写の誘導が、３００μＭの濃度のＤＦＯを用いて観察された。２つの異なる濃度である４００ｎＭおよび１６００ｎＭのＬＳ７２は、ＣＸＣＲ４ ｍＲＮＡレベルを用量依存的に下方調節した。エラーバーは３連で実施した実験についての±ｓｅｍである。エラーバーは３連で実施した実験の±ｓ．ｅ．ｍである。^**Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．１、ｔ検定。 ＬＳ７２によって下方調節されるＶＥＧＦおよびｃ−Ｍｅｔタンパク質レベル。ａ）ＭＣＦ７細胞を、ケトミン（２００ｎＭ）、ＬＳ７２（４００ｎＭ）、およびＬＳ７５（４００ｎＭ）で処理した。３００μＭ ＤＦＯを用いてＨＩＦ１αを誘導した。ウエスタンブロットを３連で行い、タンパク質レベルについての棒グラフは、ＬＳ７２によるＶＥＧＦタンパク質の有意な下方調節を示す。ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ケトミン（２００ｎＭ）、ＬＳ７２（４００ｎＭ）、およびＬＳ７５（４００ｎＭ）で処理した。１５０μＭ ＣｏＣｌ２を用いてＨＩＦ１αを誘導した。ウエスタンブロットを３連で行い、タンパク質レベルについての棒グラフは、ケトミンとＬＳ７２の両方が、ｃ−Ｍｅｔタンパク質レベルを有意に下方調節することを示す。 マイクロアレイデータの分析からの結果。緑色のベン図形は、ビヒクルにおいて下方調節される遺伝子（左の緑色の円）、すなわち、正常酸素ビヒクルと比較して、低酸素ビヒクルにおいて下方調節される遺伝子を示し、右の緑色の円は、ＬＳ７２で処理された正常酸素における遺伝子と比較して、ＬＳ７２（４００ｎＭ）で処理された低酸素において（２．０倍超）下方調節される遺伝子の数を示す。赤色の図形は、緑色のベン図形について説明したのと同じ条件において上方調節される遺伝子を示す。青色の図形は、上記の条件下での遺伝子の増減（２．０倍超）の総合的作用を示す。 ＤＦＯ（３００μＭ）を使用した低酸素誘導時のＬＳ７２で処理されたＭＣＦ７細胞のマイクロアレイ分析。クラスタリング分析を行って、異なる条件間の遺伝子における類似した傾向を確かめた。分析により、低酸素下のおよびＬＳ７２（４００ｎＭ）で処理されたＭＣＦ７細胞は、ビヒクルにおいて見られるのと類似した傾向を示すことが示され、これは、ＬＳ７２が全体的な転写レベルに対する低酸素の作用を無効にする働きをすることを示唆する。 Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ構築物を安定にトランスフェクトした蛍光Ｎ２Ｏ２細胞のマウス皮下腫瘍モデルの生体顕微鏡画像。Ｎ２０２ Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ腫瘍を有するマウスに、０日目に１ｍｇ／ｋｇのＬＳ７２化合物を静脈内注射し、続いて、８日目以降２ｍｇ／ｋｇを毎日注射し、２週間にわたり撮像した。処置後の示された日に撮影された腫瘍の蛍光ＩＶＭ画像。 ＬＳ７２で処置されたまたは処置されていないマウスのＩＶＭの腫瘍画像から得られた蛍光強度の変化。グラフは、図２２のＩＶＭ画像に示される腫瘍体積間の量的な差を示す。ビヒクルマウス（−四角−）、ならびにＬＳ７２で処置されたマウス、＃１（−三角−）および＃２（−菱形−）。 ケトミンＣＴＭならびにＥＴＰ ＬＳ６９およびＬＳ７２で処理されたＨｅＬａ細胞についての細胞密度および集団倍加データ。対照：細胞培養培地のみ、ビヒクル：細胞培養培地中０．１％ＤＭＳＯ。

詳細な説明

定義
ここで別段の指示がない限り、ここで使用されるすべての用語は、本発明の技術分野の当業者にとってそれらの用語が有すると思われる意味を有する。当業者は、当技術分野の定義および用語について、最新の教本を特に参照されたい。しかしながら、本発明は、記載された特定の、方法、プロトコール、および試薬に限定されるものではなく、その理由は、これらは変動してもよいからであることを理解すべきである。

用語「アルキル」は、Ｃ₁〜Ｃ₁₀の直鎖状または分枝鎖状のアルキル、たとえば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｉ−ペンチル、ｎｅｏ−ペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチルなどを指す。

「置換アルキル」の置換基は、ヒドロキシ、アルコキシ（たとえば、メトキシおよびエトキシ）、メルカプト、アルキルチオ（たとえば、メチルチオ）、シクロアルキル（たとえば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシル）、ハロゲン（たとえば、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨード）、カルボキシ、アルコキシカルボニル（たとえば、メトキシカルボニルおよびエトキシカルボニル）、ニトロ、シアノ、ハロアルキル（たとえば、トリフルオロメチル）、アルコール、置換または無置換のアミノ（たとえば、メチルアミノ、ジメチルアミノ、およびカルバモイルアミノ）、グアニジノ、フェニル、ベンジルオキシなどである。これらの置換基は、任意の可能な位置のうちの１つ以上でそれらに結合することが可能である。

用語「アリール」は、単環式または縮合環の芳香族炭化水素を指す。アリールの例は、フェニル、ナフチルなどである。

用語「ヘテロ環」は、窒素、酸素、および硫黄原子からなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を環中に含有し、任意の可能な位置で炭素環式環または他のヘテロ環式環と縮合していてもよい芳香族ヘテロ環式基を指す。

用語「アシル」は、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、またはヘテロアリールカルボニル置換基を指し、これらはいずれも、たとえば１つ以上の置換基によって、さらに置換され得る。

用語「ハロゲン」は、単独または組合せで、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素、好ましくは、フッ素、塩素、または臭素を表す。

本発明の一態様は、その塩、溶媒和物および水和物を含む式Ｉによる化合物、

（式中、ｎ＝１、２、３、４であり、
各ジケトピペラジン環の中心間の距離は、４〜３２オングストロームであり、
各ジケトピペラジン環の中心間の好ましい距離は、１０〜２２オングストロームであり、
Ｒ₁およびＲ₂は、水素、アルキル、置換アルキル、およびアリールからなる群から独立して選択され、
Ｒ₃は、Ｈおよびアシルからなる群から選択され、
Ｙは、（ＣＨ₂）_k、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−）_l、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−）_m、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｓ−）_n、（−ＣＨ＝ＣＨ−）_o、ヘテロ環、

からなる群から選択され、
ここで、Ｘは、（ＣＨ₂）_k、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−）_l、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−）_m、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｓ−）_n、（−ＣＨ＝ＣＨ−）_o、およびヘテロ環からなる群から選択され、ここで、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｏは、それぞれ独立して、１、２、または３に等しく、
Ｒ₄は、Ｈ、アルキル、およびハロゲンからなる群から独立して選択される）を対象とする。

上記の態様では、Ｒ₁およびＲ₂について、アルキルは、好ましくはメチルまたはエチルであり、置換アルキルは、好ましくは−ＣＨ₂ＯＨであり、アリールは、好ましくはフェニルまたはベンジルであり、Ｒ₃について、アシルは、好ましくはＣＯＣＨ₃である。

本発明の別の態様は、その塩、溶媒和物および水和物を含む式ＩＩによる化合物：

（式中、ｎ＝１、２、３であり、
Ｒ₁、Ｒ₂は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、およびアリールからなる群から独立して選択され、
Ｒ₃は、Ｈおよびアシルからなる群から選択され、
Ｘは、（ＣＨ₂）_k、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−）_l、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−）_m、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｓ−）_n、（−ＣＨ＝ＣＨ−）_o、およびヘテロ環からなる群から独立して選択され、ここで、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｏは、それぞれ独立して、１、２、または３に等しく、
Ｒ₄は、Ｈ、アルキル、およびハロゲンからなる群から独立して選択される）を対象とする。

上記の態様では、Ｒ₁およびＲ₂について、アルキルは、好ましくはメチルまたはエチルであり、置換アルキルは、好ましくは−ＣＨ₂ＯＨであり、アリールは、好ましくはフェニルまたはベンジルであり、Ｒ₃について、アシルは、好ましくはＣＯＣＨ₃である。

本発明の別の態様は、その塩、溶媒和物および水和物を含む式ＩＩＩによる化合物：

（式中、ｎ＝１、２、３であり、
Ｒ₁およびＲ₂は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリールからなる群から独立して選択され、
Ｒ₃＝Ｈまたはアシルであり、
Ｘ＝（ＣＨ₂）_k、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−）_l、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−）_m、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｓ−）_n、（−ＣＨ＝ＣＨ−）_o、ヘテロ環であり、ここで、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｏは、それぞれ独立して、１、２、または３に等しく、
Ｒ₄は、Ｈ、アルキル、およびハロゲンから独立して選択される）を対象とする。

上記の態様では、Ｒ₁およびＲ₂について、アルキルは、好ましくはメチルまたはエチルであり、置換アルキルは、好ましくは−ＣＨ₂ＯＨであり、アリールは、好ましくはフェニルまたはベンジルであり、Ｒ₃について、アシルは、好ましくはＣＯＣＨ₃である。

式Ｉ〜ＩＩＩ中、好ましいヘテロ環（heterocyles）は、インドール、置換ベンゼン（すなわち、フルオロフェニル等）である。また式Ｉ〜ＩＩＩ中、Ｒ４は、芳香族環に対する可変結合点（variable attachment）として示され、Ｒ₄は、芳香族環において一、二、三、または四置換されていてもよく、Ｒ₄は、各置換部位で独立して選択されてもよいことを示す。

本発明の別の態様は、担体に溶解または分散された、式Ｉ、式ＩＩもしくは式ＩＩＩのいずれかによる少なくとも１種の化合物、またはその塩、溶媒もしくは水和物を含む医薬組成物を対象とする。

本発明の別の態様は、低酸素誘導性転写経路に干渉するための方法を対象とする。一般に、この態様による方法は、細胞を、式Ｉ、式ＩＩもしくは式ＩＩＩのいずれかによる少なくとも１種の化合物、またはその塩、溶媒もしくは水和物と接触させることを含む。

本発明の別の態様は、乳癌を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、式Ｉ、式ＩＩもしくは式ＩＩＩのいずれかによる少なくとも１種の化合物、またはその塩、溶媒もしくは水和物の有効量を投与することを含む方法を対象とする。

本発明の別の態様は、癌腫を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、式Ｉ、式ＩＩもしくは式ＩＩＩのいずれかによる少なくとも１種の化合物、またはその塩、溶媒もしくは水和物の有効量を投与することを含む方法を対象とする。

低酸素誘導性転写の阻害剤としての合成エピジチオジケトピペラジン
ＨＩＦ１α ｃ−末端活性化ドメイン（Ｃ−ＴＡＤ）とｐ３００／ＣＢＰシステイン−ヒスチジンリッチ領域１（ＣＨ１）との間の接触部における２つのαヘリックス領域の存在（図１ａ）は、この相互作用を予測通りにモジュレートし得る合成転写アンタゴニストの設計のための可能性を広げる。しかしながら、１５個未満のアミノ酸残基から構成されるペプチドは、タンパク質環境から切除されると、生理的条件においてαヘリックス構造を一般に形成しない。とりわけ、αヘリックスによってＣ−ＴＡＤ／ＣＨ１相互作用を破壊する唯一の試みは、Ｋｕｎｇらによって報告された手法であった。⁴⁰この研究では、Ｃ−ＴＡＤを、ドメインを安定化させるＧａｌ４との融合タンパク質として発現させた。得られるタンパク質は、低酸素誘導性遺伝子の転写を抑制し、ヌードマウス異種移植片モデルにおける改変ヒト腫瘍細胞の成長に対する阻害作用を有していた。しかしながら、全身送達の困難性ならびに細胞および組織におけるレトロウイルスの使用から生じる合併症は、その広範な適合の障害となる。

ＨＩＦ１α Ｃ−ＴＡＤと転写コアクチベーターｐ３００／ＣＢＰとの相互作用は、生物学的応答の顕著な増幅の要であることから、設計されたタンパク質リガンドによるその破壊は、癌における好気的解糖および血管新生を抑制する有効な手段であり得る。^41〜43ＨＩＦ１α Ｃ−ＴＡＤとｐ３００／ＣＢＰとの接触面は広い（３３９３Ų）が、直接的相互作用によるこのタンパク質−タンパク質相互作用の阻害は困難である。代わりに、結合パートナー（ｐ３００／ＣＢＰ）の一方に対する構造変化の誘導は、複合体を破壊するのに十分であり得る。⁴⁴逆の戦略は既に実証されており、そこでは、タンパク質ｐ５３の機能を低分子によって回復させている。⁴⁵
低酸素誘導性転写経路に干渉するための方法が、本発明によって提供される。一般に、本方法は、細胞を、式Ｉ〜ＩＩＩの化合物のいずれかと接触させることを伴う。

上記の構造をとる低分子の例および治療用途のためのＥＴＰを設計するための方法を下記に述べる。

［実施例］
低酸素誘導性転写因子複合体を標的とする二量体エピジチオジケトピペラジンの設計および合成
合成二量体エピジチオジケトピペラジンの設計における構造基盤
低分子による核タンパク質−タンパク質相互作用の阻害は困難であることがこれまでに分かっている⁴⁶が、高親和性タンパク質リガンドについての最近のスクリーニングは、いくつかの注目すべき業績をもたらしている。^44、47〜53２種の低分子、ケトシン（ＣＴＣ）⁵⁴およびケトミン（ＣＴＭ）⁵⁵（図２）は、ＨＩＦ１α Ｃ−ＴＡＤとｐ３００／ＣＢＰとの間の相互作用を阻害し、低酸素誘導性転写を減衰させることが示されているが、その作用の正確な機序は依然として不明である。⁴⁴初期の有望な報告にもかかわらず、ＨＩＦ１経路の阻害剤のさらなる設計が必要であり、その理由は、いずれの化合物も、実験動物において凝固壊死、貧血、および白血球増加を誘導したからである。

ケトシンおよびケトミンは、ケトミウム属種の糸状菌由来の２種のエピジチオジケトピペラジン⁵⁶（ＥＴＰ）代謝産物であり、抗微生物活性を有すると以前に特徴付けられている。^57、58これらの天然産物の全合成は非常に難題であり、ケトミンについては現在まで報告されておらず、その原因は恐らく、ジケトピペラジン環のエナンチオ選択的スルフェニル化のための方法の欠如ならびにジスルフィド架橋の塩基および還元剤に対する不安定性である。生理的条件下で、架橋ジスルフィド部分は、ジスルフィドまたはジチオールのいずれかの形態で存在し得、このクラスの天然産物の生物学的活性に必須であると考えられる。この仮説は、本発明者らの予備結果ならびにＢｅｒｎａｒｄｏおよびＷａｒｉｎｇの最近の研究によって裏付けられ、ＢｅｒｎａｒｄｏおよびＷａｒｉｎｇは、天然（酸化）形態のみのエピジチオジケトピペラジンが、次いでグルタチオン依存的に還元され生細胞中に能動的に濃縮されることを示している。⁵⁹ＥＴＰの細胞内レベルは、適用された濃度よりも最大１５００倍大きくなり得、細胞中のＥＴＰは、ほぼもっぱら還元形態で存在する。⁵⁹
本発明者らは、ケトシンおよびケトミンにおける２つの適正に配置されたレドックス活性なＥＴＰ環が、システイン−ヒスチジンリッチなＺｎ²⁺依存性タンパク質ドメインに対するこれらの化合物の高親和性二座結合において重要な役割を果たし得るという仮説を立てた。ＣＴＣおよびＣＴＭの構造の剛性は、それらの生物学的に活性な立体配座を予測することを容易にする。中心骨格の構造が顕著に異なるにもかかわらず、２種の分子は、ＥＴＰ環の配向が非常に類似した低エネルギー立体配座を取る。

合成二量体エピジチオジケトピペラジンは、２つのＥＴＰ環を半剛性の中心骨格を介して連結することによって設計された。このような低分子は、全体の折りたたみを破壊し、結果として、ＨＩＦ１アルファによるｐ３００／ＣＢＰの動員を阻止することが可能であり得る。これを確認するため、本発明者らは、ＥＴＰ環の配置がケトミンと類似しているＥＴＰ ＬＳ６９およびＬＳ７２を設計し、ＨＩＦ誘導性遺伝子の転写に対するそれらの作用を調べた（図３）。ジスルフィド架橋を欠いている、ＬＳ６９と構造的に類似した分子であるＮＰ４８１もまた設計し、対照化合物として使用した（図３）。

二量体エピジチオジケトピペラジンの合成
本発明者らの合成計画では、ジスルフィド架橋をできる限り遅い段階の合成中間体において形成させた。本発明者らは、保護ジスルフィドを早い段階で導入し、保護ジスルフィド基の安定性が改善し、その結果、合成を容易にすることを期待する。⁶⁰ジスルフィド架橋は、次いで、後の段階で再生され得る。

本発明者らの合成計画は、３つの鍵となる転換を伴うものであった（図４および５）：ｉ）二環式チオアセタールとしてのジスルフィド架橋の保護、ｉｉ）カルバニオン化学によるチオアセタール環のＣ−３およびＣ−６位の官能化、ならびにｉｉｉ）ジスルフィド架橋の再生。市販で入手可能な１，４−ジメチル−２，５−ピペラジンジオン１を臭素化し、続いて、２をチオ酢酸カリウムと反応させ、その後、酸性条件下で３のアセチル基を除去することにより、ｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−ジチオールの混合物４が良好な全収率で得られた（図４）。チオアセタール５は、ジチオールをｐ−アニスアルデヒドおよび三フッ化ホウ素エーテラートと反応させることによって高収率で得られた。チオアセタールの形成は、ジチオールのｃｉｓとｔｒａｎｓの両方の異性体から進行することが公知である。⁶⁰強塩基を用いて５を橋頭位で位置選択的に脱プロトン化し⁶¹、その後、ベンジルオキシメチルクロリド（ＢＯＭクロリド）と反応させることにより、一置換チオアセタール７が良好な収率で得られた。同様に、５を２当量の強塩基と反応させ、続いて、２当量のＢＯＭクロリドを添加することにより、化合物９が得られた。１当量の三塩化ホウ素を用いて９の１つのベンジル基の位置選択的除去を行うことができ、アルコール１０が形成された。９を２当量の三塩化ホウ素で処理することによって両方のベンジル基を除去することもでき、ジオール１２が形成され、これをアセチル化して、ジアセタート１３を得た。チオアセタール７、１０、および１３におけるジスルフィド架橋の再生により、それぞれ、単環ＥＴＰ化合物、８、１１（ＬＳ７５）、および１４が形成された。すべての生成物を分取逆相ＨＰＬＣによって精製し、ＮＭＲおよび質量分析によってそれらの同定および純度の確認を行った。

架橋チオアセタール二量体の調製は、図５に概説されている。強塩基を用いてチオアセタール７の橋頭位を脱プロトン化し、続いて、過剰のα，α’−ジブロモ−ｐ−キシレンと反応させることにより、中間体１５が生成され、これを、７から発生させたカルバニオンの第２の当量と反応させることによってチオアセタール二量体１６および２１に変換した。１６または２１を三塩化ホウ素で処理することによって、ベンジル保護基の除去を達成した。保護チオアセタールの架橋ＥＴＰへの変換は、以下の通りに行った：ｍ−クロロ過安息香酸を用いた酸化によりモノスルホキシドが形成され、これを、ＴＨＦ中７０％過塩素酸で処理することによってインサイチューでＥＴＰに変換した。生成物１９（ＬＳ６９）および２４（ＬＳ７２）を、分取ＴＬＣによって、または逆相ＨＰＬＣによって０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含むアセトニトリルおよび水の５〜９５％勾配を使用して、精製した。また、特徴付けを容易にするため、アルコール１９および２４をアセチル化して、ジアセチル誘導体２０および２６を生成した。

ＥＴＰの生物学的作用を比較し、ジスルフィド架橋の重要性を実証するため、キシリレン架橋ビス（１，４−ピペラジン−２，５−ジオン、ＤＫＰ）ＮＰ４８１もまた合成した。この化合物は、ＥＴＰ ＬＳ６９と構造的に類似しているが、ジスルフィド架橋を欠いている。合成ＥＴＰの活性は、細胞培養物におけるＤＫＰ化合物の活性と直接比較することができる。

結果
ＬＳ６９およびＬＳ７２はｐ３００のＣＨ１ドメインに結合する
二量体ＥＴＰ ＬＳ６９およびＬＳ７２のより厳密な生物物理学的および生物学的特徴付けに着手する前に、まず、標的であるｐ３００ ＣＨ１ドメインに対するその熱力学的結合特性を特徴付けることが重要であった。本発明者らは、細胞内状況において見られる還元環境を模倣するため、ＤＴＴの存在下でＳＰＲ実験を実行した。ＳＰＲセンサーグラムから、ＬＳ６９とＬＳ７２の両方が、ヒトｐ３００のＧＳＴタグ付きＣＨ１ドメイン（ａａ残基３２３〜４２３）と高い親和性で直接結合することが明らかである。

ＬＳ６９については、会合速度（ｋ_a）は、６．９７×１０³±０．１５７Ｍ^-1ｓ^-1であることが決定され、会合工程に続く洗浄工程においてＬＳ６９について得られた解離速度ｋ_dは、１．３３×１０^-2±１．７２×１０^-4ｓ^-1であった。したがって、ｐ３００のＣＨ１ドメインに対するＬＳ６９の結合についてのＳＰＲ分析によって測定された結合定数は、「オフ速度」／「オン速度」であり、これは、Ｋ_D＝１．０９μＭの値を与える。

ＬＳ７２については、ＳＰＲ分析によって得られた会合速度ｋ_aは、４．２５×１０³±８５．８であり、続く洗浄工程において、得られた解離速度ｋ_dは、１．５４±０．１４×１０^-2ｓ^-1であった。したがって、ＬＳ７２について得られた結合定数は、Ｋ_D＝３．６２μＭである。これらのデータに基づけば、ＬＳ６９とＬＳ７２の両方が、ｐ３００−ＣＨ１−ＧＳＴと可逆的に結合し、速いオン速度および遅いオフ速度を示し、チップ表面に固定化されたタンパク質から徐々に解離する。対照のＤＫＰ ＮＰ４８１は、５．０×１０^-5Ｍまでの試験したいずれの濃度でも結合しなかった（データ示さず）。

設計されたＥＴＰは、低酸素誘導性プロモーター活性を下方調節する
本発明者らはまず、ＨＩＦ１誘導性プロモーターの活性化に対する設計されたＥＴＰの作用を調べた。ヒトＶＥＧＦ遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に由来する低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）の５つのコピーを有する染色体に組み入れられたベクター構築物を含有するＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株を使用した。⁶²これらは、腫瘍低酸素に関連する低い酸素圧で優れた転写活性化を示した。⁶³これらの細胞株を、本発明者らのルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて使用した。実験の中で、細胞を、ＥＴＰ ＬＳ６９、ＬＳ７２、ＬＳ７５、およびＤＫＰ化合物ＮＰ４８１とともにインキュベーションした。並行して、ビヒクル（ＤＭＳＯ）のみを添加した未処理の細胞を対照として使用した。細胞を３００ｕＭメシル酸デスフェリオキサミンとともに１８時間インキュベーションすることによって、低酸素条件を誘導した。細胞を収穫し、溶解し、ルシフェラーゼのレベルを照度計によって決定した。

本発明者らの測定の結果は図８に示され、棒グラフは、誘導対非誘導のルシフェラーゼレベルの比率を示す。化合物なしの場合、レポーター遺伝子の発現のレベルは、細胞を低酸素条件に置くことによって、約５６倍増加する。ケトミンＣＴＭならびに合成ＥＴＰ化合物ＬＳ６９およびＬＳ７２による細胞の処理は、低酸素誘導性プロモーター活性の有意な減少をもたらした（図８）。観察された作用は用量依存性であった。対照的に、単環ＥＴＰ ＬＳ７５による処理は、プロモーター活性のわずかな減少のみをもたらした。同様に、ＤＫＰ化合物ＮＰ４８１による処理は、プロモーター活性の最小の減少をもたらし、用量依存性を示さなかった。

インビトロでの低酸素誘導性転写の阻害
本発明者らは、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して、ＥＴＰ化合物および対照のＤＫＰ化合物で処理された低酸素細胞におけるＶＥＧＦ ｍＲＮＡの相対レベルを決定した。並行して、ビヒクルで処理された細胞を対照として使用した。β−グルクロニダーゼ遺伝子のｍＲＮＡレベルを、転写の相対レベルの決定における対照として使用した。

低酸素条件下の培養ＭＣＦ７細胞において、合成ＥＴＰ化合物ＬＳ６９およびＬＳ７２は、ケトミンで観察されたレベルと同等かまたはある特定の場合にはそれを上回るレベルで、ＶＥＧＦ遺伝子を下方調節した（図９）。したがって、６００ｎＭの濃度のＬＳ６９は、ＶＥＧＦ発現を約６５％阻害し、これは、非誘導（正常酸素）細胞におけるＶＥＧＦ ｍＲＮＡレベルに近似している。観察された作用は用量依存性であった。対照化合物ＮＰ４８１は、ＶＥＧＦのレベルに対する阻害作用を示さなかった。

本発明者らはまた、異なる細胞株におけるＶＥＧＦ遺伝子の発現のレベルに対する本発明者らの化合物の作用を試験した。このアッセイのためにＨｅＬａ細胞を選択した。２００ｎＭの濃度の、ケトミン、ＬＳ６９、またはＬＳ７２による処理は、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡのレベルの約５０％の減少をもたらした。

ｃ−Ｍｅｔ遺伝子は、低酸素誘導性転写因子系の別の重要な下流の遺伝子標的である。これは、そのプロモーター領域中にＨＲＥ配列の５回の繰り返しを有し、Ｃｏｍｏｇｌｉｏらは、ＨＲＥ４およびＨＲＥ５が、ｃ−Ｍｅｔ遺伝子の低酸素誘導性転写を主として司ることを示している。ｃ−Ｍｅｔ遺伝子のプロモーター配列におけるＨＲＥ４およびＨＲＥ５の変異または欠失は、その転写の低酸素誘導性誘導を有意に低減する。ｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡおよびタンパク質レベルは、多くの癌細胞株において低酸素下で有意に上方調節され、これらの癌細胞株の大部分は、典型的に、転移性の性質である。

ＭＣＦ７乳癌細胞株およびＡ５４９肺上皮腺癌細胞株におけるＬＳ７２の細胞毒性
転写阻害剤としてのＥＴＰの使用により生じる１つの考えられる問題点は、その細胞毒性である。したがって、細胞毒性を慎重に査定することは、転写機構に対する非特異的な全体的作用を排除するため、転写阻害剤として働くあらゆる低分子にとって肝要である。

本発明者らは、ＭＣＦ７乳癌細胞株およびＡ５４９肺腺癌細胞株におけるＬＳ７２のＥＣ₅₀値を得るため、細胞毒性実験を実施した。目標は、生存可能濃度域を決定し、本発明者らの転写阻害実験を、これらの細胞株におけるＥＣ₅₀値を有意に下回る濃度で実施することであった。

本発明者らの以前の研究⁶⁴において、ＭＣＦ７細胞におけるケトミンのＥＣ₅₀値は１８０ｎＭであると報告した。本発明者らは、新たに設計されたＬＳ７２は、ケトミンと比較して、ＭＣＦ７細胞に対する細胞毒性がはるかに低いことを発見した。ＭＣＦ７細胞におけるＭＴＴ細胞毒性アッセイにおいて、ＬＳ７２による２４時間の処理の後、得られたＥＣ₅₀値は５４７ｎＭであった（図１０）。ＭＣＦ７細胞におけるＬＳ７２のこのＥＣ₅₀値に基づき、ＨＩＦ誘導性転写に対するその作用を、ＭＣＦ７細胞において４００ｎＭの最大濃度で測定することを選択した。これは、細胞生存率の減少に起因するｍＲＮＡレベルに対する非特異的作用を最小化するために重要である。

細胞株Ａ５４９は、低酸素条件下で、鍵となるＨＩＦ１α誘導性遺伝子、たとえば、ｃ−Ｍｅｔ、ＶＥＧＦ、およびＧｌｕｔ１の有意な上方調節を示すことが公知である非小細胞型の肺上皮腺癌である。この細胞株における本発明者らの生存率アッセイにおいて、ＥＴＰは、ＭＣＦ７細胞株と比較して低い細胞毒性を示した。Ｋａｈｎ改変Ｆ−１２培地中でのケトミンとＬＳ７２の両方による２４時間の処理の後、１０μＭ超のＥＣ₅₀が観察された。したがって、その細胞毒性をより十分に決定するため、細胞の処理を４８時間に延長した。

ＭＴＴ細胞毒性アッセイを、Ａ５４９細胞株において４８時間、ケトミンおよびＬＳ７２について行った。４８時間の処理後にこのアッセイから得られたＬＳ７２のＥＣ₅₀は、２．８μＭであった（図１１〜１２）。この値は、２４時間の処理後のＭＣＦ７細胞株において得られたＥＣ₅₀値よりも約５倍高い。これらのデータは、Ａ５４９細胞株が、ＭＣＦ７細胞株と比較して、処理に対してはるかに頑強であることを示唆する。加えて、ＬＳ７２は、ケトミンと比較して、細胞に対する毒性が明らかにはるかに低い。ＥＴＰモチーフはＬＳ７２とケトミンの両方において共通であることから、ケトミンのより高い毒性は、ＬＳ７２には存在しないそのシクロトリプトファンモチーフに起因し得るとのみ推測された。

Ａ５４９肺腺癌株におけるＬＳ７２によるＨＩＦ１α誘導性転写のモジュレーション
低酸素誘導性遺伝子の高い転写活性化を一貫して示す良好なインビトロモデルの発見は、難題であることが判明した。いくつかの細胞株を評価した後、本発明者らは、Ａ５４９細胞、すなわち非小細胞肺腺癌細胞株に着目した。Ａ５４９細胞株は、低酸素条件下で、鍵となるＨＩＦ誘導性遺伝子の強い上方調節を生じさせることが報告されている。具体的には、Ｃｏｍｏｇｌｉｏら¹⁵は、低酸素下で、Ａ５４９細胞株においてｃ−Ｍｅｔ ｍＲＮＡレベルが有意に上方調節されることを報告した。

様々な培地中血清レベルおよび低酸素誘導方法での試験の後、ＨＩＦ１α依存性遺伝子の誘導に著しくかつ一貫して効果のあった条件は、Ａ５４９細胞を２％血清中で保持し、続いて、０．２％血清を含む培地中で４８時間化合物または対照で細胞を処理することであった（図１３）。これらの条件下で、ＬＯＸ遺伝子の誘導については低酸素バッグが最も良好な選択肢であったが、他の多くのＨＩＦ１α誘導性遺伝子の上方調節をもたらす最も良好な低酸素応答は、３００μＭ ＤＦＯを用いた処理であった。

図１３は、３つの重要な遺伝子、ＶＥＧＦ、Ｇｌｕｔ１、およびｃ−Ｍｅｔのレベルに対するＬＳ７２処理の作用を示し、これらの遺伝子は、低酸素条件下で多くの固形腫瘍において上方調節されることが公知である。

ＬＳ７２による処理は、ＶＥＧＦ、Ｇｌｕｔ１、およびｃ−Ｍｅｔ遺伝子の低酸素応答の有意な減少をもたらした。ＶＥＧＦレベルは５０％減少した一方、Ｇｌｕｔ１ ｍＲＮＡレベルは６０％を超えて減少した。ｃ−Ｍｅｔもまた、有意に下方調節され、その正常酸素のレベルに実質的に達した（図１３）。

ＬＯＸ（リシルオキシダーゼ）は、低酸素下で上方調節される別の遺伝子であり、そのタンパク質は、癌組織の浸潤挙動および転移の間の細胞外マトリックスの調節にかかわる⁶⁵。ＬＯＸ遺伝子は、４８時間後、低酸素バッグによってより良好な誘導を示し、ＬＳ７２による処理の後、転写活性の有意な下方調節を示した。ＣＸＣＲ４は、損傷の治癒の間の幹細胞および前駆細胞の走化性に必須の遺伝子であり、癌幹細胞の遊走にも関与する⁶⁶。ＳＤＦ１−ＣＸＣＲ４軸は、前駆および幹細胞の癌組織または創傷への走化性をもたらし、続いて、それらの分化が生じる。本発明者らのＡ５４９細胞のモデル系において、ＣＸＣＲ４もまた、ＤＦＯを用いた低酸素の化学的誘導または低酸素バッグの後、１００倍を超えて上方調節される。４００ｎＭの濃度のＬＳ７２で処理した際、転写活性の優れた阻害が、ＣＸＣＲ４遺伝子について観察された（図１４）。

全体として、上記の条件下のＡ５４９細胞株は、ＨＩＦ１α誘導性遺伝子発現を研究するための非常に良好なモデルとなった。上記の５つの遺伝子はすべて、腫瘍形成にかかわる多くの鍵遺伝子のＨＩＦ１α誘導性転写の高い上方調節を示しただけでなく、所与の条件下で、ＬＳ７２が存在する正常酸素下では転写活性の変化をほとんど示さなかった。

ＨＩＦ１α転写系によって上方調節され、４００ｎＭのＬＳ７２で処理した際下方調節される５つの遺伝子、ＶＥＧＦ、ｃ−Ｍｅｔ、Ｇｌｕｔ１、ＬＯＸ、およびＣＸＣＲ４について大幅な転写誘導を得た後、次の論理的工程は、薬物用量応答を研究することであった。ＬＳ７２によるＨＩＦ１α誘導性転写のモジュレーションを、３つの異なる濃度である、１００ｎＭ、４００ｎＭ、および１６００ｎＭで研究した。

低酸素誘導は、無血清Ｆ−１２Ｋ培地中の８５％コンフルエントな細胞において、３００μＭ ＤＦＯを用いて行った。

各濃度のＬＳ７２について、対照試料もまた存在し、対照試料では、細胞をＬＳ７２で、ただし低酸素の誘導なしで処理した。対照は、正常酸素におけるＬＳ７２の３つの異なる濃度で、ＶＥＧＦ転写レベルが有意に変化しなかったことを示し、これらの条件において、ＬＳ７２がストレスまたは他の何らかの経路に起因して転写レベルの増減を示さなかったことを明示している。低酸素下では、ＬＳ７２は、ＶＥＧＦ遺伝子のＨＩＦ１α誘導性転写の用量依存性の低下を示した（図１５）。

高度にコンフルエントな細胞に対して低酸素誘導したこれらの条件下のｃ−Ｍｅｔ遺伝子は、その転写の上方調節の増大を示した。ｃ−Ｍｅｔ ｍＲＮＡは、低酸素において、５倍を超えて上方調節された。転写上方調節の用量依存性の低下が、ＬＳ７２で処理した際、ｃ−Ｍｅｔについて観察された（図１６）。

高度にコンフルエントな細胞において１０倍の誘導を示したＧｌｕｔ１。Ｇｌｕｔ１もまた、１００ｎＭ、４００ｎＭ、および１６００ｎＭのＬＳ７２で、低酸素性転写上方調節の用量依存性の低下を示す（図１７）。

ＣＸＣＲ４は、低酸素条件下で上方調節されるＧタンパク質共役受容体である。本発明者らは、Ａ５４９細胞を選択し、ＤＦＯを用いて低酸素を誘導して、８５％コンフルエントな細胞において、ＣＸＣＲ４遺伝子のレベルが６５０倍を超えて転写的に過剰発現されることを発見した。４００ｎＭおよび１６００ｎＭの濃度のＬＳ７２で処理した際、ＣＸＣＲ４のｍＲＮＡレベルの用量依存性の低下が観察された（図１８）。これらの発見は、ＣＸＣＲ４が、低酸素条件下のＡ５４９細胞において転写的に誘導されることを示すだけでなく、それが、ＨＩＦ１α経路を標的とする低分子によって下方調節され得ることをも示す。

ＬＳ７２によるＶＥＧＦおよびｃ−Ｍｅｔタンパク質レベルの下方調節
ＶＥＧＦおよびｃ−Ｍｅｔを含むいくつかの鍵となるＨＩＦ−１誘導性遺伝子について転写の有意な下方調節を得た後、本発明者らは、ｍＲＮＡレベルにおいて観察された下方調節が、対応するタンパク質レベルの下方調節にも翻訳されるかどうかを確かめるため、ＶＥＧＦおよびｃ−Ｍｅｔのタンパク質レベルを研究した。ウエスタンブロットを行って、それぞれＬＳ７２で処理されたＭＣＦ７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株におけるＶＥＧＦおよびｃ−Ｍｅｔのタンパク質レベルを測定した。ＶＥＧＦタンパク質レベルは、３００μＭ ＤＦＯを用いたＨＩＦ１α誘導下のＭＣＦ７細胞において、ケトミン（２００ｎＭ）およびＬＳ７２（４００ｎＭ）による有意な下方調節を示した（図１９ａ）。ｃ−Ｍｅｔタンパク質レベルもまた、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞においてケトミン（２００ｎＭ）およびＬＳ７２（４００ｎＭ）で処理した際、ＨＩＦ１α誘導性タンパク質レベルの有意な下方調節を示した（図１９ｂ）。

遺伝子発現プロファイリングおよびマイクロアレイ分析
標的タンパク質ｐ３００およびＣＢＰは多面的なマルチドメインコアクチベーターであることから、それらのＣＨ１領域は、複数の転写因子に対する結合部位を含有する。遺伝子調節のためのＥＴＰの使用の１つの考えられる懸案事項は、特異性であり、その理由は、ＣＢＰ／ｐ３００とＨＩＦ１α以外の転写因子との間の相互作用の阻害は、多数の影響を受ける遺伝子をもたらし得るからである。ＥＴＰの非特異的でゲノムワイドな作用を排除するため、本発明者らは、２８，８６９個の転写を示すオリゴヌクレオチド配列を含有するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ ＳＴ １．０ Ａｒｒａｙを使用して、ＬＳ７２によるインビトロでの遺伝子発現プロファイリング実験を実行した。^67、68
細胞ゲノムを全体的作用について探索するため、４００ｎＭのＬＳ７２で処理されたＭＣＦ７細胞を使用した。４００ｎＭの濃度のＬＳ７２による細胞の処理は、わずか１７８個の遺伝子の発現に２．０倍以上のレベルで影響を与えた（図２０）。対照的に、ＤＦＯ単独での処理は、３２９個の遺伝子のレベルを２．０倍以上変化させた。１７８個のうち、それぞれ、８８個の遺伝子が２．０倍以上下方調節され、９０個が２．０倍以上上方調節された。ＤＦＯで誘導した低酸素条件下でＬＳ７２で処理された細胞において、１９０個の遺伝子がこの化合物によって影響を受けたことを本発明者らは特定した。クラスタリング分析を実施して、異なる処理間の発現プロファイルの類似性を特定した（図１９）。

図２１は、低酸素およびＬＳ７２（４００ｎＭ）処理の異なる条件下での遺伝子の凝集クラスタリングを示す。クラスタリングは、多くの遺伝子において、低酸素下でのＬＳ７２の作用が、低酸素の作用を無効にして、多くの遺伝子の転写レベルがビヒクル、すなわち、ＬＳ７２処理なしの正常酸素において見られるレベルと類似した挙動を示すようにすることであることを示す。

ＤＦＯで誘導した低酸素下でＬＳ７２で処理された細胞の発現プロファイルは、ＤＦＯ単独下のプロファイルとは大きく異なる。しかしながら、ＤＦＯで誘導した低酸素下でＬＳ７２で処理された細胞および正常酸素条件下の細胞のプロファイルは、類似領域を示している。これは、ＬＳ７２による処理が、低酸素誘導性遺伝子に影響を与える転写阻害剤について予想される通り、ある特定の遺伝子群に対するＤＦＯ処理の作用を減少させることを示唆する。低酸素応答にかかわる細胞のシグナル伝達経路の複雑性を考えると、ＬＳ７２とＤＦＯの両方によって影響を受ける遺伝子にいくらかの重複が存在することは、必ずしも驚くべきことではない。結果はまた、全ゲノムに照らして、低酸素誘導に対するその作用におけるＬＳ７２の特異性を明らかに実証する。

表１は、ＭＣＦ７細胞において低酸素下で４００ｎＭのＬＳ７２処理によって下方調節される重要な遺伝子を掲載している。データは、２倍超の変化を示す遺伝子のリストから抽出した。

興味深いことに、タンパク質の溶質キャリア（ＳＬＣ）ファミリーに属する多くの遺伝子は、低酸素下でＬＳ７２によって下方調節された。これらは表２に掲載されている。これは、低酸素下では、溶質キャリアタンパク質が上方調節されて、細胞における分子の取り込みおよび分泌の上昇が容易になり、ＬＳ７２がこの傾向を逆転させたことを示す。

生体顕微鏡法を使用したマウス腫瘍異種移植片モデルにおけるＬＳ７２の有効性のインビボ研究
Ｎ２Ｏ２（乳癌種）由来の腫瘍スフェロイドを調製し、ヌードマウスの皮下に埋め込んだ。腫瘍を１０〜１４日間血管形成させ、その後マウスに、０日目に１ｍｇ／ｋｇの（±）−ＬＳ７２を尾静脈から注射した。８日目から１３日目まで、マウスに２ｍｇ／ｋｇの（±）−ＬＳ７２を毎日注射した。指定の日に得られた生体顕微鏡（ＩＶＭ）画像を図２２に示す。

図２３は、ＩＶＭ画像から得られた腫瘍体積の定量化を示す。データは、（±）−ＬＳ７２を注射されたマウス＃１および＃２において、腫瘍血管系および腫瘍成長が有意に抑制されることを明らかに示す。これらの実験の中で、（±）−ＬＳ７２は、マウスに対する非常に低い毒性を示し、これは、動物の行動の観察およびその体重のモニタリングによって確認された。本発明者らの設計したビス−ＥＴＰのこの低い毒性は、天然のビス−ＥＴＰであるケトミンに対するインビボでの有意な利点を与えるものであり、ケトミンは、動物にとって毒性、さらには致死性であると報告され、その理由は、ケトミンで処置されたマウスは、５日間の連続注射の後生存しないからである。

本発明者らの研究において、（±）−ＬＳ７２で処置されたマウスは、１４日間の処置の後も生存し、急性毒性のいかなる徴候をも示さなかった。この研究は、インビトロでの癌細胞株におけるＨＩＦ−１誘導性遺伝子発現およびインビボでのマウス異種移植片モデルにおける腫瘍成長の阻害剤としての、（±）−ＬＳ７２の有効性を証明する。（±）−ＬＳ７２は、インビボでの腫瘍成長の阻害を維持するのに十分な治療濃度の試験した範囲内において、ケトミンよりも毒性が有意に低い。

さらなる実験を行い、ここでは、マウスの腫瘍を１０〜１４日間血管形成させ、その後マウスに、０、８、１０および１２日目に１ｍｇ／ｋｇのｍｅｓｏ−ＬＳ７２を尾静脈から注射した。各日の生体顕微鏡（ＩＶＭ）画像を、上記の通りに得た。データは、ｍｅｓｏ−ＬＳ７２を注射されたマウスにおいても、腫瘍血管系および腫瘍成長が有意に抑制されることを示す。これらの実験の中で、ｍｅｓｏ−ＬＳ７２もまた、マウスに対する非常に低い毒性を示し、これは、動物の行動の観察およびその体重のモニタリングによって確認された。これは、マウス異種移植片モデルでの腫瘍成長の抑制における、（±）−ＬＳ７２とｍｅｓｏ−ＬＳ７２の両方のインビボでの有効性を立証する。

考察
ここで開示されている通り、本発明の化合物は、インビトロおよびインビボで低酸素誘導性転写の破壊において有能であり、細胞成長および複製速度に対する有害作用をほとんど有さない。低酸素の乳癌腫細胞株ＭＣＦ７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１において、設計された二量体ＬＳ７２は、ＶＥＧＦおよびｃ−Ｍｅｔ遺伝子のＨＩＦ１α誘導性転写ならびにそれらのタンパク質産物の有意な下方調節を示す。肺腺癌細胞株Ａ５４９において、５つの鍵遺伝子、ＶＥＧＦ、ｃ−Ｍｅｔ、Ｇｌｕｔ１、ＬＯＸ、およびＣＸＣＲ４は、ＬＳ７２によって用量依存的に有意に下方調節された。本発明者らの遺伝子発現プロファイリング実験は、低酸素条件下でのＬＳ７２の全体的ゲノム作用に関する重要な知見を提供した。ＬＳ７２によって影響を受ける遺伝子の数および種類は、本発明者らの以前の結果と一致し、この化合物が、明確な薬理ゲノム学的プロファイルを有する高度に特異的な転写阻害剤であることが示唆される。

材料および方法
一般的方法
別段の記述がない限り、すべての試薬および溶媒は、市販供給源から入手し、そのまま使用した。水分感受性試薬を要するすべての反応は、乾燥Ｎ₂雰囲気下で、無水溶媒および火炎乾燥したガラス器具を用いて実行した。吸湿性液体は、シリンジによって移し、ラバーセプタムを介して反応容器に導入した。反応生成物溶液は、３０〜１５０ｍｍＨｇでロータリーエバポレーターを使用して濃縮した。重力クロマトグラフィーは、シリカゲル（２３０〜４００メッシュ）にて、試薬グレードの溶媒を使用して実施した。分析薄層クロマトグラフィーは、ガラス基板のプレコートプレート（０．２５ｒａｍ、シリカゲル６０、Ｆ−２５４、ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ）にて実施した。核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、Ｖａｒｉａｎ Ｕｎｉｔｙ ３００ＭＨｚまたはＢｒｕｋｅｒ ２５０ＭＨｚ、５００ＭＨｚもしくは６００ＭＨｚ装置にて、示された溶媒中で収集した。ピーク位置は、化学シフト（δ）によって、テトラメチルシラン（０ｐｐｍ）または溶媒の不完全な重水素化から生じるシグナル：ＣＤＣｌ₃（７．２６ｐｐｍ）もしくはＣＤ₃ＯＤの多重線の中心線（３．３１ｐｐｍ）を基準としてｐｐｍで報告する。１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、ＣＤＣｌ₃（７７．０ｐｐｍ）またはＣＤ₃ＯＤ（４９．２ｐｐｍ）のシグナルを基準とした。カップリング定数（Ｊ）は、ヘルツ（Ｈｚ）で報告する。以下の略語を使用する：一重線（ｓ）、二重線（ｄ）、三重線（ｔ）、四重線（ｑ）、二重線の二重線（ｄｄ）、三重線の二重線（ｄｔ）、広幅（ｂｒ）。

エピジチオジケトピペラジンの合成および特徴付け
１，４−ジメチル−２，５−ピペラジンジオン（piperazidnedione）−３，６−ジブロミド（２）の調製

ｏ−ジクロロベンゼン（dichorobenzene）（１０ｍＬ）に溶解した臭素（１．０３ｍＬ、３．２ｇ、２０ｍｍｏｌ、２当量）を、サルコシン無水物（１．４２ｇ、１ｍｍｏｌ、１当量、Ａｖｏｃａｄｏ，Ｉｎｃ．）スラリーのｏ−ジクロロベンゼン（３０ｍＬ）溶液に、１時間かけて滴下添加した。黄色の沈殿物が直ちに形成した。反応混合物を１５０℃まで加熱し、ガスの発生が止むまで撹拌を続けた。次いで、混合物を室温に冷却し、ヘキサン（２００ｍＬ）を徐々に添加した。淡黄色の結晶が堆積し、混合物を４℃で終夜静置した。結晶を濾別し、真空下で乾燥させた。粗生成物をクロロホルム−エーテル混合物から再結晶させて、１．６２ｇの生成物を得た。収率５４％、融点１２８℃。¹H-NMR (CDCl₃, TMS, ppm) δ: 6.00 (s, 2H), 3.07 (s, 6H).
１，４−ジメチル−２，５−ピペラジンジオン−３，６−ジチオアセタート（３）の調製

チオ酢酸カリウム（６．２ｇ、５４ｍｍｏｌ、２．７当量）を、Ｅｔ₃Ｎ（３．１ｍＬ、２２ｍｍｏｌ）および粗生成物２（２０ｍｍｏｌ）をクロロホルム（５０ｍＬ）およびアセトン（５０ｍＬ）の混合物に溶解した４℃の溶液に、約１時間かけて少量ずつ添加した。反応混合物を、４℃でさらに３時間撹拌した。ＮＭＲによって記録された試料は、出発材料の不在を示した。混合物を減圧下で蒸発させ、残留物をジクロロメタンに溶解し、有機相を水で４回洗浄し、ＭｇＳＯ₄下で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで体積を減少させた。暗色のシロップといくらかの結晶性材料との混合物をＥｔＯＡｃに溶解し、溶液が濁るまでヘキサンを添加した。結晶性材料が形成し、これを濾過し、乾燥させて、３．３ｇ（５４％）の生成物３を得た、融点２０４℃。¹H-NMR (CDCl₃, TMS, ppm) δ: 2.95 (s, 6H), 2.49 (s, 6H).
１，４−ジメチル−２，５−ピペラジンジオン−３，６−ジチオール（４）の調製

チオアセタート（３、１．３３ｇ）を無水ＭｅＯＨ（４０ｍＬ）に懸濁させ、無水エーテル中１Ｍ ＨＣｌ（４０ｍＬ）を添加した。反応混合物を、２時間撹拌し還流させた。スラリーが黄色味を帯び、溶液がゆっくりと清澄化した。出発材料の消失をＴＬＣによってモニタリングし、２時間後に完了したと決定された。溶液を真空中で濃縮し、残留物をクロロホルムに溶解し、蒸発させた。クロロホルム溶解−蒸発の手順を再度繰り返して、４を得た、０．８ｇ（８５％）。粗化合物に対してＮＭＲスペクトルを記録した。融点１０８℃。¹H-NMR (CDCl₃, TMS, ppm) δ: 5.00 (d, 2H, J = 10.3 Hz), 3.09 (s, 6H), 3.06 (d, 2H. J = 10.2 Hz).
３−（４−メトキシ−フェニル）−６，８−ジメチル−２，４−ジチア−６，８−ジアザ−ビシクロ［３．２．２］ノナン−７，９−ジオン（５）の調製

粗生成物４（１．１１ｇ）およびｐ−アニスアルデヒド（４．１ｍＬ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解した。この撹拌した溶液に、三フッ化ホウ素エーテラート（２５０μＬ）を添加した。室温で１６時間撹拌した後、溶液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液に注いだ。水層をジクロロメタンで完全に抽出し、有機相をＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた。溶媒を蒸発させた後、残留物をＴＬＣ（ジクロロメタン−ＥｔＯＡｃ、７：３、Ｒ_f０．４５）によって試験し、クルードＮＭＲを記録した。クルードＮＭＲは、目標化合物および過剰のｐ−アニスアルデヒドを示す。粗混合物をジクロロメタンに溶解し、生成物をエチルエーテルで析出させて、５９０ｍｇの精製された生成物を得た。母液から、第２の部分の生成物が晶出し、２６０ｍｇの生成物を得た。総量は８５０ｍｇの５である（５０％）、融点２６９℃。¹H NMR (CDCl₃, TMS, ppm) δ: 7.38 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 6.87 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 5.15 (s, 1H), 5.03 (s, 1H), 4.87 (s, 1H), 3.80 (s, 1H), 3.20 (s, 3H), 3.07 (s, 3H)
１，４−ジメチル−２，５−ピペラジドンジオン−３，６−ジスルフィド（６）の調製

チオアセタール（５）（１８ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ、１当量）を無水ジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶解し、溶液を０℃に冷却した。撹拌した溶液に、ｍ−クロロ過安息香酸（１５ｍｇ、０．０６７ｍｍｏｌ、１．２当量、最大７７％純度）を添加した。０℃で１０分間撹拌した後、ジメチルスルフィド（２０μＬ）を添加した。次いで、溶液を過塩素酸のメタノール溶液（１：５）２５μＬで処理した。溶液を室温で８時間静置し、次いで、飽和炭酸水素ナトリウム溶液に注いだ。水層をジクロロメタンで抽出した。ジクロロメタン溶液を水で洗浄し、ＭｇＳＯ₄下で乾燥させ、真空下で濃縮して、１８ｍｇの粗生成物を得た。白色の沈殿物をＥｔ₂Ｏで洗浄して、８ｍｇ（７１％）の精製された生成物（６）を得た。¹H-NMR (CDCl₃, TMS, ppm) δ: 5.22 (s, 2H), 3.11 (s, 3H). ESI MS: C₆H₈N₂O₂S₂の計算値: 204.0, 実測値[M+H]⁺: 204.8.
３−（４−メトキシフェニル）−６，８−ジメチル−２−［（フェニルメトキシ）メチル］−２，４−ジチア−６，８−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナン−７，９−ジオン、（７）の調製

結晶性の５（３８８ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ、１当量）およびベンジルクロロメチルエーテル（１．１１ｍＬ、４．８ｍｍｏｌ、４当量、７４９ｍｇ、１．２５ｇ、６０％試薬用）を無水ＴＨＦ（４０ｍＬ）に溶解した。溶液を−７８℃に冷却し、撹拌した混合物に、ヘキサン中１．５４Ｍ ｎ−ブチルリチウム（１．１６ｍＬ、１．８ｍｍｏｌ、１．５当量）を、５分間かけて滴下添加した。混合物を−７８℃で１０分間撹拌した後、得られる赤色の濁った溶液を室温に昇温させ、３０分間撹拌した。ＴＬＣは、１つの主要生成物および少量（約２０％）の出発材料を示す。次いで、飽和ＮａＣｌ溶液を反応混合物に添加し、赤色の溶液をジクロロメタンで抽出した。ジクロロメタン溶液を水で２回洗浄し、ＭｇＳＯ₄下で乾燥させ、真空中で濃縮した。シロップをカラムにて分離（ヘキサン−酢酸エチル、７−３；Ｒｆ０．４３）して、３６４ｍｇの５を灰白色の粉末として得た（６８％）。¹H-NMR (CDCl₃, TMS, ppm) δ: 7.36 (m, 5H), 7.31 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.84 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 5.11 (s, 1H), 5.04 (s, 1H), 4.74 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 4.54 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 4.22 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 3.82 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 3.79 (s, 3H, 3.23 (s, 3H), 3.10 (s, 3H). FAB-MS: C₂₂H₂₄N₂O₄S₂の計算値: 444.1, 実測値[M+H]⁺: 445.1.
１，４−ジメチル−２−［（フェニルメトキシ）メチル］−２，５−ピペラジンジオン−３，６−ジスルフィド（８）の調製

精製された７（９．２ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ、１当量）を無水ジクロロメタン（４ｍＬ）に溶解し、溶液を０℃に冷却した。撹拌した溶液に、ｍ−クロロ過安息香酸（５．５ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ、１．２当量、７７％純度）を添加した。０℃で１０分間撹拌した後、ジメチルスルフィド（４．６μＬ）を添加した。次いで、溶液を過塩素酸のメタノール溶液（１：５）９．２μＬで処理した。溶液を室温で２時間、次いで、０℃で１８時間静置した。反応混合物をＨＰＬＣによって追跡した。１８時間後、それ以上の変化は見られなかった。混合物を真空下で蒸発させ、分取ＨＰＬＣによって分離して、３．５ｍｇ（４９％）の純粋化合物８を得た。¹H-NMR (CDCl₃, TMS, ppm) δ: 7.38 (m, 5H), 5.26 (s, 1H), 4.72 (d, J = 1.8 Hz, 2H), 4.22 (d, J = 1.8 Hz, 2H), 3.12 (s, 3H).
３−（４−メトキシフェニル）−６，８−ジメチル−２，４−ジ［（フェニルメトキシ）メチル］−２，４−ジチア−６，８−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナン−７，９−ジオン（９）の調製

チオアセタール５（２２７ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ、１当量）および１ｍＬのベンジルクロロメチルエーテル（５４６ｍｇ、３．５ｍｍｏｌ、５当量、６０％の市販供給源の試薬）を無水ＴＨＦ（３５ｍＬ）に溶解し、溶液を−７８℃に冷却した。撹拌した溶液に、ヘキサン中１．５４Ｍ ｎ−ブチルリチウム（１ｍＬ、１．５４ｍｍｏｌ、２．２当量）を、１０分間かけて滴下添加した。混合物を−７８℃で１０分間撹拌した後、反応物を室温まで昇温させた。これは約３０分を要した。ＴＬＣは、１つの主要生成物の存在、および出発材料の不在を示す。飽和ＮａＣｌ溶液を反応混合物に添加し、赤色の溶液をジクロロメタンで抽出した。ジクロロメタン溶液を水で２回洗浄し、ＭｇＳＯ₄下で乾燥させ、減圧下で濃縮した。油状残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって分離して、１８５ｍｇの二置換生成物９を得た（４７％）。¹H NMR (CDCl₃, TMS, ppm) δ: 7.38 (m, 10H), 7.31 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.86 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.00 (s, 1H), 4.76 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 4.74 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.71 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.61 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.57 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 4.49 (d, J = 10.6 Hz, 1H), 4.30 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 3.83 (d, J = 11.1 Hz, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.29 (s, 3H), 3.20 (s, 3H). FAB-MS: C₃₀H₃₂N₂O₅S₂の計算値: 564.1, 実測値[M+H]⁺: 565.1.
３−（４−メトキシフェニル）−６，８−ジメチル−２−［（フェニルメトキシ）メチル］−４メチルヒドロキシ−２，４−ジチア−６，８−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナン−７，９−ジオン（１０）の調製

２８０ｍｇの９（０．５ｍｍｏｌ、１当量）のジクロロメタン（３０ｍＬ）溶液を、０℃に冷却した。これに、ジクロロメタン中１Ｍ三塩化ホウ素（６２５μＬ、０．６２５ｍｍｏｌ、１．２５当量）を、３０秒間かけて滴下添加した。溶液を０℃で１０分間撹拌させ、次いで、氷水に注いだ。水相をジクロロメタンで抽出した。ジクロロメタン溶液を水で洗浄し、ＭｇＳＯ₄下で乾燥させ、真空下で濃縮して、３５０ｍｇの粗生成物を得た。ガラス状固体を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、ジクロロメタン−ＥｔＯＡｃ混合物（８５−１５）、Ｒｆ０．４４中で精製して、１７５ｍｇの１０を得た（７４％）。¹H NMR (CDCl₃, TMS, ppm) δ: 7.30 (m, 5H), 7.28 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.83 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 5.00 (s, 1H), 4.69 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 4.56, (d, J = 12.3 Hz, 1H), 4.46 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.30 (dd, J = 12.6および5,4 Hz, 1H), 3.99 (dd, J = 12.6および9.9 Hz, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.73 (d, J = 10.6 Hz, 1H), 3.31 (s, 3H), 3.15 (s, 3H), 3.15 (m, 1H). FAB-MS: C₂₃H₂₆N₂O₅S₂の計算値: 474.1, 実測値[M+H]⁺: 475.1.
１，４−ジメチル−２−メチルヒドロキシ−５−［（フェニルメトキシ）メチル］−２，５−ピペラジンジオン−３，６−ジスルフィド（１１）の調製

精製された１０（２０ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ、１当量）を無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解し、溶液を０℃に冷却した。撹拌した溶液に、ｍ−クロロ過安息香酸（１０ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ、１．２当量、最大７７％純度）を添加した。０℃で１０分間撹拌した後、ジメチルスルフィド（１３μＬ）を添加した。次いで、溶液を過塩素酸のメタノール溶液（１：５）１６μＬで処理した。溶液を室温で８時間静置し、次いで、飽和炭酸水素ナトリウム溶液に注いだ。水層をジクロロメタンで抽出した。ジクロロメタン溶液を水で洗浄し、ＭｇＳＯ₄下で乾燥させ、真空下で濃縮して、１８ｍｇの粗生成物を得た。白色の沈殿物をＥｔ₂Ｏで洗浄して、８ｍｇ（７１％）の最終純粋生成物１１を得た。¹H NMR (CDCl₃, TMS, ppm) δ: 7.38 (m, 5H), 4.76 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.71 (d, J = 12.1 Hz, 1H), 4.36 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.28 (d, J = 11.1 Hz, 1H), 4.24 (d, J = 12.6 Hz, 1H), 4.23 (d, J = 11.1 Hz, H), 3.18 (s, 3H), 3.16 (s, 3H).
３−（４−メトキシフェニル）−６，８−ジメチル−１，５−ビス（ヒドロキシメチル（hydoxymethyl））−２，４−ジチア−６，８−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナン−７，９−ジオン（１２）の調製

４０ｍｇの９（０．０７１ｍｍｏｌ、１当量）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液を、０℃に冷却した。撹拌した溶液に、ジクロロメタン中１Ｍ三塩化ホウ素（１８０μＬ、０．１８ｍｍｏｌ、２．５当量）を、３０秒間かけて滴下添加した。溶液を０℃で１０分間撹拌させ、次いで、氷水に注いだ。水相をジクロロメタンで抽出した。ジクロロメタン溶液を水で洗浄し、ＭｇＳＯ₄下で乾燥させ、真空下で濃縮して、３５ｍｇの粗生成物を得た。結晶性固体をＴＬＣで試験し、カラムにてジクロロメタン−アセトン混合物（８：２）、Ｒｆ０．２８中で精製して、２５ｍｇの１２を得た（９３％）。¹H NMR (CDCl₃, TMS, ppm) δ: 7.31 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.85 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 5.01 (s, 1H), 4.64 (dd, J = 9.3および4.8 Hz, 1H), 4.32, (dd, J = 12.3および4.5 Hz, 1H), 4.01 (d, J = 12.3および10.2 Hz, 1H), 3.82 (dd, J = 9.3および4.2 Hz, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.33 (s, 3H), 3.21 (s, 3H), 2.86 (dd, J = 9.9および4.8 Hz, 1H), 2.56 (dd, J = 9.9および5.1 Hz, 1H). FAB-MS: C₁₆H₂₀N₂O₅S₂の計算値: 384.0, 実測値[M+H]⁺: 385.1.
３−（４−メトキシフェニル）−６，８−ジメチル−２，４−ジ［（アセチルオキシ）］メチル−２，４−ジチア−６，８−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナン−７，９−ジオン（１３）の調製

ジオール１２（３ｍｇ）をジクロロメタン（５００μＬ）に溶解し、ピリジン（１００μＬ）およびＡｃ₂Ｏ（１００μＬ）を添加した。１６時間後、出発材料は存在せず、新たな生成物のみがＴＬＣによって検出された。溶液をジクロロメタン（２０ｍＬ）で希釈し、氷を添加し、反応物を２時間撹拌した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ₃溶液で洗浄した。減圧下で蒸発させた後、残留物をＨＰＬＣによって精製して、３ｍｇの生成物１３を得た（８２％）。¹H NMR (CDCl₃, TMS, ppm) δ: 7.30 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.86 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.03 (s, 1H), 4.64 (dd, J = 9.3および4.8 Hz, 1H), 4.32, (dd, J = 12.3および4.5 Hz, 1H), 4.01 (d, J = 12.3および10.2 Hz, 1H), 3.82 (dd, J = 9.3および4.2 Hz, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.33 (s, 3H), 3.21 (s, 3H), 2.86 (dd, J = 9.9および4.8 Hz, 1H), 2.56 (dd, J = 9.9および5.1 Hz, 1H).
１，４−ジメチル−３，６−ジ（アセチルオキシ）メチル−２，５−ピペラジンジオン（piperazidenedione）−３，６−ジスルフィド（１４）の調製

精製された１３（３０ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ、１当量）を無水ジクロロメタン（８ｍＬ）に溶解し、溶液を０℃に冷却した。撹拌した溶液に、ｍ−クロロ過安息香酸（１７ｍｇ、０．０７７ｍｍｏｌ、１．４当量、最大７７％純度）を添加した。０℃で１０分間撹拌した後、ジメチルスルフィド（１０μＬ）を添加した。次いで、溶液を過塩素酸のメタノール溶液（１：５）２０μＬで処理した。溶液を室温で１８時間静置し、次いで、飽和炭酸水素ナトリウム溶液に注いだ。水層をジクロロメタンで抽出した。ジクロロメタン溶液を水で洗浄し、ＭｇＳＯ₄下で乾燥させ、真空中で濃縮した。固体残留物をＨＰＬＣによって精製して、１４を得た、収量７ｍｇ（３１％）。¹H NMR (CDCl₃, TMS, ppm) δ: 4.97 (d, J = 12.6 Hz, 2H), 4.76 (d, J = 12.6 Hz, 2H), 3.13 (s, 6H), 2.16 (s, 6H). HRFAB-MS: C₁₂H₁₆N₂O₆S₂の計算値: 348.045, 実測値[M+H]⁺: 349.053.
３−（４−メトキシ−フェニル）−６，８−ジメチル−１−［（フェニルメトキシ）メチル］−５［（４−ブロモメチルフェニル）メチル］−２，４−ジチア−６，８−ジアザ−ビシクロ［３．２．２］ノナン−７，９−ジオン（１５）の調製

保護チオアセタール（４４４ｍｇ、１ｍｍｏｌ、１当量）およびジブロモ−ｐ−キシレン（１．５８ｇ、６ｍｍｏｌ、６当量）を無水ＴＨＦ（８０ｍＬ）に溶解し、−７８℃に冷却した。次に、ＬＨＭＤＳの１Ｍ ＴＨＦ溶液（１．３ｍＬ、１．３ｍｍｏｌ、１．３当量）を、撹拌しながら３分間かけて滴下添加した。添加に続いて、−７８℃でさらに５分間撹拌を続けた。次いで、冷却浴を取り外し、混合物を昇温させ、室温で３時間静置した。飽和ＮａＣｌ溶液を反応混合物に添加し、赤色の溶液をＣＨ₂Ｃｌ₂（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を無水ＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。固体残留物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、ＣＨ₂Ｃｌ₂を使用して分離して、生成物３８８ｍｇを得た（収率７７％）。¹H NMR (CDCl₃, TMS, ppm) δ: 7.33 (m, 9H), 7.13 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.85 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.08 (s, 1H), 4.78 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.56 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.46 (s, 2H), 4.37 (d, J = 16.8 Hz, 1H), 4.32 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 3.85 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.35 (s, 3H), 3.15 (d, J = 16.8 Hz, 1H), 2.97 (s, 3H). ¹³C NMR (CDCl₃, ppm) δ:165.72, 165.46, 160.55, 137.39, 136.30, 135.50, 130.46, 129.38, 128.75, 128.45, 127.93, 127.78, 126.52, 114.39, 74.02, 73.39, 71.07, 68.68, 55.37, 51.24, 40.21, 33.07, 29.80, 28.08. FABMS: C₃₀H₃₁BrN₂O₄S₂の計算値: 626.1, 実測値[M+H]⁺: 627.0.
３−（４−メトキシ−フェニル）−６，８−ジメチル−１−［（フェニルメトキシ）メチル］−５［（４−｛３−（４−メトキシフェニル）−６，８−ジメチル−１−［（フェニルメトキシ）メチル］−２，４−ジチア−６，８−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナン−７，９−ジオン−５−イル｝メチルフェニル）メチル］−２，４−ジチア−６，８−ジアザ−ビシクロ［３．２．２］ノナン−７，９−ジオン（１６）およびビス｛３−（４−メトキシ−フェニル）−６，８−ジメチル−１−［（フェニルメトキシ）メチル］−２，４−ジチア−６，８−ジアザ−ビシクロ［３．２．２］ノナン−７，９−ジオン−５［（４−メチルフェニル）メチル］｝（２１）の調製

１９６ｍｇの７（０．４４ｍｍｏｌ、１当量）および４１３ｍｇの１５（０．６６ｍｍｏｌ、１．５当量）の無水ＴＨＦ（６０ｍＬ）溶液を、−７８℃に冷却した。撹拌した溶液に、ヘキサン中２．５Ｍ ｎ−ブチルリチウム（２６４μＬ、０．６６ｍｍｏｌ、１．５当量）を、３０秒間かけて滴下添加した。混合物を−７８℃で５分間撹拌した後、反応物をＴＬＣによって検査したところ、新たなスポットが存在するが多量の出発材料が存在するようであった。さらに１５０μＬのｎ−ブチルリチウムを徐々に添加したが、各分割量（約３０μＬ）の後に、反応混合物をＴＬＣによって試験した。最終的に、ＴＬＣは、出発材料である７の不在を示した。混合物を、撹拌しながら室温に昇温させた。これは約３０分を要した。ＴＬＣは、１つの主要生成物および少量（約５％未満、ジブロミド）の出発材料を示す。有機溶液を１５０ｍＬのジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＣｌ溶液で数回洗浄した。有機溶液を、ＭｇＳＯ₄下で乾燥させ、真空下で濃縮した。固体残留物を、カラムにてヘキサン−ＥｔＯＡｃ、６：４の混合物中で分離した。２種の新たな二量体が存在した：２１（５４ｍｇ、１６％、Ｒｆ０．４２、ＨＲＦＡＢ−ＭＳ：Ｃ₆₀Ｈ₆₂Ｎ₄Ｏ₈Ｓ₄の計算値１０９４．３４５、実測値［Ｍ＋Ｈ］⁺１０９５．３５６）および１６（１０７ｍｇ、３６％、Ｒｆ０．３５、ＦＡＢ−ＭＳ：Ｃ₅₂Ｈ₅₄Ｎ₄Ｏ₈Ｓ₄の計算値：９９０．２８２、実測値［Ｍ＋Ｈ］⁺：９９１．２９１）。次の工程は、この粗材料から出発して行った。

５，５’−（１，４−フェニレンビス（メチレン））ビス（１−（ベンジルオキシメチル）−３−（４−メトキシフェニル）−６，８−ジメチル−２，４−ジチア−６，８−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナン−７，９−ジオン）（１６）

７（０．３３ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（１５ｍＬ）溶液を、−７８℃に冷却した。次に、ＬＨＭＤＳの１Ｍ ＴＨＦ溶液（１．０ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）を、撹拌しながら２分間かけて滴下添加した。次いで、２ｍＬのＴＨＦに溶解したα，α’−ジヨード−ｐ−キシレン（８８ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を反応混合物に滴下添加し、溶液を３時間室温まで昇温させた。水を反応物に添加し、混合物をジクロロメタン（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を無水ＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。ジアステレオアイソマーｍｅｓｏ−１６および（±）−１６の混合物（０．２０ｇ、８０％）を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、溶離液としてＣＨ₂Ｃｌ₂：ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝５：４：１を使用して分離した。（±）−１６について、¹H NMR (CDCl₃, ppm) δ: 7.33 (m, 14H), 7.07 (s, 4H), 6.84 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 5.06 (s, 2H), 4.78 (d, J = 12.20 Hz, 2H), 4.56 (d, J = 12.20 Hz, 2H), 4.36 (d, J = 16.39 Hz, 2H), 4.28 (d, J = 10.67 Hz, 2H), 3.82 (d, J = 10.67 Hz, 2H), 3.80 (s, 6H), 3.34 (s, 6H), 3.08 (d, J = 16.39 Hz, 2H), 2.94 (s, 6H). ¹³C NMR (CDCl₃, ppm) δ: 165.76, 165.50, 160.45, 137.27, 133.72, 130.43, 128.78, 128.44, 127.92, 127.84, 126.52, 114.31, 73.97, 73.39, 71.00, 68.51, 55.35, 51.03, 40.23, 29.80, 28.08. HRMS (FAB) m/z: C₅₂H₅₅N₄O₈S₄ ⁺ [M+H⁺]の計算値: 991.290, 実測値: 991.291.
（±）−５，５’−（１，４−フェニレンビス（メチレン））ビス（１−（ヒドロキシメチル）−３−（４−メトキシフェニル）−６，８−ジメチル−２，４−ジチア−６，８−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナン−７，９−ジオン）、（±）−１７

０℃に冷却した（±）−１６（０．１３ｇ、０．１３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液に、三塩化ホウ素（ＣＨ₂Ｃｌ₂中１Ｍ溶液、３２０μＬ、０．３２ｍｍｏｌ）を、撹拌しながら滴下添加した。溶液を、０℃でさらに１０分間撹拌し、次いで、氷冷水（１０ｍＬ）に注ぎ、ジクロロメタン（２５ｍＬ）で抽出した。有機層を水で２回洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗生成物を白色の固体として得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＥｔＯＡｃ＝７：３）によって精製して、（±）−１７を得た（９３ｍｇ、９１％）。¹H NMR (CDCl₃, ppm) δ: 7.32 (d, J=8.8 Hz, 4H), 7.03 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 5.08 (s, 2H), 4.37 (d, J = 16.24 Hz, 1H), 4.33 (dd, J = 12.60 Hzおよび5.54 Hz, 2H), 4.05 (dd, J = 12.6 Hzおよび9.93 Hz, 2H), 3.81 (s, 6H), 3.42 (s, 6H), 3.06 (d, J = 16.24 Hz, 2H), 2.95 (dd, J = 9.93 Hzおよび5.54 Hz, 2H), 2.91 (s, 6H). ¹³C NMR (CDCl₃, ppm) δ:166.67, 165.83, 160.45, 133.70, 130.42, 128.80, 126.45, 114.39, 73.20, 71.12, 62.98, 55.39, 50.98, 40.42, 29.79, 27.98. HRMS (ESI) m/z: C₃₈H₄₃N₄O₈S₄ ⁺ [M+H⁺]の計算値: 811.196, 実測値: 811.195.
（±）−４，４’−（１，４−フェニレンビス（メチレン））ビス（１−（ヒドロキシメチル）−５，７−ジメチル−２，３−ジチア−５，７−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン−６，８−ジオン）、（±）−１８、ＬＳ６９

ｍ−クロロ過安息香酸（２２ｍｇ、７７％最大含有率、０．１０ｍｍｏｌ）を、氷冷した（±）−１７（３３ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液に、撹拌しながら添加した。０℃で１０分間撹拌した後、ジメチルスルフィド（１０μＬ）を添加し、続いて、７０％過塩素酸のメタノール溶液（１：５）２０μＬで処理した。溶液を室温で９時間静置した。反応混合物を飽和炭酸水素ナトリウムに注いだ。溶液をジクロロメタン（３×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を合わせ、無水ＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。ガラス状残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＥｔＯＡｃ＝６：４）によって精製して、（±）−１８（ＬＳ６９）を得た（１１ｍｇ、３３％）。¹H NMR (DMSO-D6, ppm) δ: 7.24 (s, 4H), 5.90 (t, J = 5.50 Hz, 2H), 4.33 (dd, J = 12.83 Hzおよび5.50 Hz, 2H), 4.23 (dd, J = 12.83 Hzおよび5.50 Hz, 2H), 3.89 (d, J = 16.04 Hz, 2H), 3.73 (d, J = 16.04 Hz, 2H), 3.13 (s, 6H), 2.82 (s, 6H). ¹³C NMR (CDCl₃, ppm) δ:165.35, 164.92, 133.45, 128.89, 76.33, 75.91, 59.12, 35.50, 28.31, 27.89. HRMS (FAB) m/z: C₂₂H₂₆N₄O₆S₄Na⁺ [M+Na⁺]の計算値: 593.063. 実測値: 593.063.
５，５’−（（エタン−１，２−ジイルビス（４，１−フェニレン））ビス（メチレン））ビス（１−（（ベンジルオキシ）メチル）−３−（４−メトキシフェニル）−６，８−ジメチル−２，４−ジチア−６，８−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナン−７，９−ジオン）（２１）。

１５（２．１４ｇ、３．４０ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液を−７８℃に冷却し、ヘキサン中１．６Ｍ ｎ−ブチルリチウム（２．７７ｍＬ、４．４３ｍｍｏｌ、１．３当量）を、２分間かけて撹拌しつつ滴下添加した。添加に続いて、−７８℃でさらに５分間撹拌を続けた。次いで、冷却浴を取り外し、混合物を、３時間かけて室温まで徐々に昇温させた。次いで、反応混合物を氷冷水に注ぎ、ジクロロメタン（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を無水ＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、生成物をｍｅｓｏ−２１および（±）−２１の混合物として得た。生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、溶離液としてＣＨ₂Ｃｌ₂：ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝５：４：１を使用して反応物質から精製し、混合物として次の工程で使用した。総収量：６３８ｍｇ（３４％）。得られた生成物の試料を、同じ溶離液系を使用して２回目のシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、ここで、ラセミ（±）−２１のある分割量を（±）−２１およびｍｅｓｏ−２１の混合物から分離し、分析に使用した。（±）−２１についての分析データ：¹H NMR (CDCl₃, ppm) δ: 7.34 (m, 14H), 7.08 (q, 8H), 6.85 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 5.07 (s, 2H), 4.78 (d, J = 12.2 Hz, 2H), 4.56 (d, J = 12.2 Hz, 2H), 4.36 (d, J = 16.8 Hz, 2H), 4.31 (d, J = 10.7 Hz, 2H), 3.84 (d, J = 10. 7 Hz, 2H), 3.80 (s, 6H), 3.34 (s, 6H), 3.10 (d, J = 16.8 Hz, 2H), 2.97 (d, 6H), 2.86 (s, 4H). ¹³C NMR (CDCl₃, ppm) δ:165.76, 165.63, 160.51, 140.26, 137.44, 132.66, 130.46, 128.69, 128.42, 127.89, 127.76, 126.67, 114.36, 74.00, 73.56, 71.08, 68.71, 55.36, 51.23, 40.24, 37.27, 29.78, 28.07. HRFABMS: C₆₀H₆₂N₄O₈S₄の計算値1094.345, 実測値[M+H]⁺ 1095.356.
５，５’−（（エタン−１，２−ジイルビス（４，１−フェニレン））ビス（メチレン））ビス（１−（ヒドロキシメチル）−３−（４−メトキシフェニル）−６，８−ジメチル−２，４−ジチア−６，８−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナン−７，９−ジオン）（２２）

氷冷した２１（１２５ｍｇ、０．１２６ｍｍｏｌ、１当量）のジクロロメタン溶液に、三塩化ホウ素の１Ｍジクロロメタン溶液（３２０μＬ、０．３２ｍｍｏｌ、２．５当量）を、撹拌しながら滴下添加した。混合物を０℃で１５分間静置し、次いで、氷冷水に注いだ。水層をジクロロメタン（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。粗反応混合物をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、ｍｅｓｏ−２２および（±）−２２の生成物混合物７８ｍｇを白色の固体として得た（７５％合計収率）。ｍｅｓｏ−２２と（±）−２２とを分離するため、ｍｅｓｏ−２２および（±）−２２の混合物を、シリカゲルカラムにて、ジクロロメタン中ＥｔＯＡＣの１０％から５０％の勾配を使用してさらに精製した。（±）-２２についての分析データ：¹H NMR (CDCl₃, ppm) δ: 7.32 (d, 4H), 6.93 (d, 4H) 6.89 (d, 4H), 6.86 (d, 4H), 5.08 (s, 2H), 4.47 (dd, J = 6 Hz, 13 Hz, 2H), 4.37 (d, 2H), 4.26 (m, 2H), 3.98 (dd, J = 10 Hz, 13 Hz, 2H), 3.80 (s, 6H), 3.41 (s, 6H), 2.98 (d, 2H), 2.84 (s, 6H), 2.69 (d, 2H). ¹³C NMR (DMSO-d₆, ppm) δ:165.42, 165.19, 160.06, 140.00, 132.93, 130.52, 128.53, 128.42, 126.82, 114.38, 73.47, 71.51, 60.79, 55.29, 49.91, 40.14, 36.36, 29.60, 27.96. FABMS: C₄₆H₅₀N₄O₈S₄の計算値: 914.3 実測値[M+Na]⁺: 936.9. meso-7についての解析データ: ¹H NMR (CDCl₃, ppm) δ: 7.33 (d, 4H), 7.02 (d, 4H) 6.99 (d, 4H), 6.86 (d, 4H), 5.09 (s, 2H), 4.35 (dd, J = 10 Hz, 13 Hz, 2H), 4.37 (d, 2H), 3.11 (m, 2H), 4.04 (dd, J = 10 Hz, 13 Hz, 2H), 3.81 (s, 6H), 3.41 (s, 6H), 2.91 (s, 6H), 2.85 (s, 4H). ¹³C NMR (DMSO-d₆, ppm) δ:165.47, 165.24, 160.10, 140.04, 132.96, 130.56, 128.55, 128.48, 126.85, 114.42, 73.50, 71.55, 60.83, 55.34, 49.96, 40.14, 36.42, 29.63, 28.00. FABMS: C₄₆H₅₀N₄O₈S₄の計算値: 914.3 実測値[M+Na]⁺: 936.9.
（±）−４，４’−（（エタン−１，２−ジイルビス（４，１−フェニレン））ビス（メチレン））ビス（１−（ヒドロキシメチル）−５，７−ジメチル−２，３−ジチア−５，７−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン−６，８−ジオン）（（±）−ＬＳ７２、（±）−２３）

５０ｍＬ丸底フラスコに、３５ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解したジチオアセタール（±）−２２（２０ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）を投入した。フラスコを０℃に冷却し、過剰のｍ−クロロ過安息香酸（１５ｍｇ、７７％含有率、０．０７ｍｍｏｌ）を添加した。０℃で３０分間撹拌した後、氷浴を取り外し、ジメチルスルフィド（６．４μＬ、０．０９ｍｍｏｌ）を添加し、続いて、トリフルオロ酢酸（１２６μＬ）を添加した。反応混合物を、室温で３時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１５ｍＬ）を反応混合物に添加し、有機層を分離した。水層をジクロロメタン（２０ｍＬ）でさらに抽出した。合わせた有機層を無水Ｍｇ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。ガラス状残留物をアセトニトリル中５０％ＤＭＳＯに溶解し、逆相ＨＰＬＣによって精製して、（±）−ＬＳ７２（（±）−２３）を収率６１％で得た。あるいは、より多くの量の（±）−ＬＳ７２を精製するため、反応混合物の結晶化後処理を実施した。簡単に言うと、残留物（２５ｍｇ）に、アセトニトリルを添加し（２ｍＬ）、混合物を室温で短時間超音波処理して、残留物を溶解した。混合物を４℃に冷却し、その温度で２時間維持した後、−２０℃で終夜保存した。上清を濾過によって除去し、白色の結晶を−２０℃に冷却したアセトニトリルで洗浄した。上清を、上記の手順を用いることによって再度再結晶させた。最終生成物の純度を、分析ＨＰＬＣによって、０．０５ｖ／ｖ％のトリフルオロ酢酸を含有する水相中のアセトニトリルの勾配（２０分で４０％〜９５％）を使用して検証した。¹H NMR (CDCl₃, ppm) δ: 7.19 (d, 4H), 7.07 (d, 4H), 4.39 (d, 2H), 4.30 (d, 2H), 4.04 (d, 2H), 3.59 (d, 2H), 3.21 (s, 6H), 2.96 (s, 6H), 2.86 (m, 4H). ¹³C NMR (CDCl₃, ppm) δ: 166.85, 165.57, 140.65, 131.58, 129.07, 128.81, 75.80, 75.18, 61.21, 37.22, 36.51, 28.59, 27.53. HR-ESIMS: C₃₀H₃₄N₄O₆S₄+H⁺の計算値: 675.14, 実測値[M+H]⁺: 675.
1401.
ｍｅｓｏ−４，４’−（（エタン−１，２−ジイルビス（４，１−フェニレン））ビス（メチレン））ビス（１−（ヒドロキシメチル）−５，７−ジメチル−２，３−ジチア−５，７−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン−６，８−ジオン）（ｍｅｓｏ−ＬＳ７２、ｍｅｓｏ−２３）

ｍｅｓｏ−ＬＳ７２（ｍｅｓｏ−２３）は、ジチオアセタールｍｅｓｏ−２２から、（±）−７の手順と同様の手順に従って調製した。収率６０％、¹H NMR (CDCl₃, ppm) δ: 7.21 (d, 4H), 7.09 (d, 4H), 4.39 (d, 2H), 4.31 (d, 2H), 4.04 (d, 2H), 3.59 (d, 2H), 3.21 (s, 6H), 2.97 (s, 6H), 2.87 (m, 4H). ¹³C NMR (CDCl₃, ppm) δ: 166.92, 165.58, 140.73, 131.59, 129.16, 128.77, 75.81, 75.15, 61.26, 37.15, 36.53, 28.61, 27.52. HR-ESIMS: C₃₀H₃₄N₄O₆S₄+H⁺の計算値: 675.14, 実測値[M+H]⁺: 675.1411.
（±）−２２のキラル分離：

丸底フラスコに、（±）−２２（２０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）および５ｍＬのジクロロメタンを投入した。この混合物に、（１Ｓ）−（−）−カンファン酸クロリド（７１ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ、１．４当量）、４−ジメチルアミノピリジン（０．８ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ、０．０３当量）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１５０μＬ、０．８６ｍｍｏｌ、３．９当量）を、撹拌しながら順次添加した。室温で１時間撹拌を維持した。反応混合物を０．１Ｍ ＨＣｌ（５ｍＬ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄上で乾燥させた。減圧下で溶媒を除去して、粗生成物２４を得た（２３ｍｇ、８３％総収率）。２４の２種のジアステレオマーを、カラムクロマトグラフィーによって、ヘキサン中１０％ＣＨ₂Ｃｌ₂の初期溶媒系を使用し、ＣＨ₂Ｃｌ₂およびＥｔＯＡｃの量をヘキサン：ＥｔＯＡｃ：ＣＨ₂Ｃｌ₂＝４：３：３の最終溶媒系まで徐々に増加させて分離した。得られた２つの分画を、それぞれｄｓｔ１−２４（１３ｍｇ回収）およびｄｓｔ２−２４（１０ｍｇ回収）と命名した。ｄｓｔ１−２４の分析からのデータ：¹H NMR (CDCl₃, ppm) δ: 7.33 (d, 2H), 7.09 (d, 2H), 7.00 (d, 2H), 6.87 (d, 2H), 5.31 (d, 1H), 5.11 (s, 1H), 4.42 (d, 1H), 4.36 (d, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.40 (s, 3H), 3.08 (d, 1H), 2.88 (s, 3H), 2.83 (br, 2), 2.40 (m, 1H), 2.02 (m, 1H), 1.89 (m, 1H), 1.68 (m, 1H), 1.09 (s, 3H), 0.97 (s, 3H), 0.81 (s, 3H). ¹³C NMR (CDCl₃, ppm) δ: 177.78, 166.42, 165.86, 164.81, 160.94, 140.68, 132.58, 130.79, 129.03, 128.42, 126.10, 114.69, 91.01, 73.54, 70.13, 63.05, 55.62, 55.10, 54.62, 51.83, 40.28, 37.53, 30.90, 29.87, 28.92, 28.47, 16.77, 16.67, 10.05.
ｄｓｔ２−２４の分析からのデータ：¹H NMR (CDCl₃, ppm) δ: 7.33 (d, 2H), 7.09 (d, 2H), 7.02 (d, 2H), 6.87 (d, 2H), 5.28 (d, 1H), 5.10 (s, 1H), 4.43 (d, 1H), 4.35 (d, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.36 (s, 3H), 3.12 (d, 1H), 2.93 (s, 3H), 2.84 (br, 2), 2.33 (m, 1H), 2.05 (m, 1H), 1.90 (m, 1H), 1.71 (m, 1H), 1.10 (s, 3H), 0.94 (s, 3H), 0.91 (s, 3H). ¹³C NMR (CDCl₃, ppm) δ: 178.12, 166.16, 165.89, 164.74, 160.96, 140.57, 132.73, 130.78, 128.90, 128.42, 126.21, 114.70, 90.87, 73.46, 70.03, 63.16, 55.61, 54.95, 54.47, 51.76, 40.19, 37.44, 30.97, 29.92, 29.19, 28.39, 16.74, 16.64, 9.96.

２４の各ジアステレオマー１０ｍｇに、炭酸水素ナトリウムの飽和メタノール溶液１ｍＬを添加した。反応物を、室温で２４時間撹拌した。反応物を初めに短いシリカゲルカラムによって精製し、続いて、逆相ＨＰＬＣにて精製した。２種のジアステレオマーのそれぞれの反応により、２種のエナンチオマーｅｎｔ１−２２またはｅｎｔ２−２２が得られた（６ｍｇの各エナンチオマーを回収、７４％）。ＣＤスペクトルにより、２種の生成物のエナンチオマーの関係が確認された。

ｅｎｔ１−ＬＳ７２およびｅｎｔ２−ＬＳ７２はそれぞれ、ジチオアセタールｅｎｔ１−２２およびｅｎｔ２−２２から、（±）−２２の手順と同様の手順に従って収率６１％で得られた。予想した通り、ｅｎｔ１−ＬＳ７２、ｅｎｔ２−ＬＳ７２、およびラセミ混合物についてのＮＭＲデータは同一であった。Ｅｎｔ１−ＥＴＰ２ ¹H NMR (CDCl₃, ppm) δ: 7.19 (d, 4H), 7.07 (d, 4H), 4.39 (d, 2H), 4.30 (d, 2H), 4.04 (d, 2H), 3.59 (d, 2H), 3.21 (s, 6H), 2.96 (s, 6H), 2.86 (m, 4H). Ent1-LS72: C₃₀H₃₄N₄O₆S₄+H⁺の計算値: 675.14, 実測値[M+H]⁺: 675.1416. ent2-LS72: C₃₀H₃₄N₄O₆S₄+H⁺の計算値: 675.14, 実測値[M+H]⁺: 675.1316.ｅｎｔ１−ＬＳ７２およびｅｎｔ２−ＬＳ７２についてのＣＤスペクトルにより、エナンチオマーの関係が確認された。

３−（４−メトキシフェニル）−６，８−ジメチル−１−（フェニルメチル）２，４−ジチア−６，８−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナン−７，９−ジオン（２６）の調製

チオアセタール５（１９４ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、１当量）を無水ＴＨＦ（２５ｍＬ）に溶解し、溶液を−７８℃に冷却した。撹拌した溶液に、ヘキサン中１．５４Ｍ ｎ−ブチルリチウム（５４５μＬ、０．８４ｍｍｏｌ、１．４当量）を、１分間かけて滴下添加した。３０秒後、臭化ベンジル（３５６μＬ、５１３ｍｇ、３ｍｍｏｌ、５当量）を、撹拌した混合物に３０秒間かけて添加した。混合物を−７８℃で８分間撹拌した後、得られる赤色の濁った溶液を室温に昇温させ、撹拌した。これは約３０分を要した。ＴＬＣは、１つの主要生成物および少量（約５％）の出発材料を示す。飽和ＮａＣｌ溶液を反応混合物に添加し、溶液をジクロロメタンで抽出した。有機溶液を水で２回洗浄し、ＭｇＳＯ₄下で乾燥させ、真空下で濃縮した。油状残留物をヘキサンで処理した。材料の一部が固体化し、ヘキサン溶液を除去した。黄色の固体をヘキサンで再度洗浄し、真空下で乾燥させた。固体粗材料をジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解し、メタノール（４ｍＬ）およびヘキサン（約２０ｍＬ）を添加した。白色の沈殿物を濾別して、純粋生成物である１００ｍｇの２６を得た（４０．８％）。¹H NMR (CDCl₃, TMS, ppm) δ: 7.36 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.24 (m, 5H), 6.88 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 5.19 (s, 1H), 5.10 (s, 1H), 4.15 (d, J = 16.6 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.25 (d, J = 16.5 Hz, 1H), 3.15 (s, 3H), 3.11 (s, 1H).
３−（４−メトキシフェニル）−６，８−ジメチル−１−［（フェニルメトキシ）メチル］−５−（フェニルメチル）−２，４−ジチア−６，８−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナン−７，９−ジオン（２７）の調製

結晶性の２６（１４４ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ、１当量）およびフェニルクロロメチルエーテル（５００μＬ、４５５ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ、５当量、６０％試薬用）を無水ＴＨＦ（４０ｍＬ）に溶解した。溶液を−７８℃に冷却し、撹拌した混合物に、ヘキサン中１．５４Ｍ ｎ−ブチルリチウム（１．１６ｍＬ、１．８ｍｍｏｌ、１．５当量）を、５分間かけて滴下添加した。混合物を−７８℃で１０分間撹拌した後、得られる赤色の濁った溶液を室温に昇温させ、撹拌した。飽和ＮａＣｌ溶液を反応混合物に添加し、赤色の溶液をジクロロメタンで抽出した。有機相を水で２回洗浄し、ＭｇＳＯ₄下で乾燥させ、真空下で濃縮した。シロップをカラムにて分離（ヘキサン−酢酸エチル、８−２、Ｒｆ０．４）して、１１４ｍｇの２７をガラス様固体として得た（６２％）。¹H NMR (CDCl₃, TMS, ppm) δ: 7.35 (m, 5H), 7.28 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.86 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 5.02 (s, 1H), 4.72 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 4.58 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.51 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 4.20 (d, J = 16.5 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.74 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 3.25 (d, J = 16.9 Hz, 1H), 3.19 (s, 3H), 3.15 (s, 3H). FAB-MS: C₂₉H₃₀N₂O₄S₂の計算値: 534.1, 実測値[M+H]⁺: 535.0.
３−（４−メトキシフェニル）−６，８−ジメチル−１−ヒドロキシメチル−５−（フェニルメチル）−２，４−ジチア−６，８−ジアザビシクロ［３．２．２］ノナン−７，９−ジオン（２８）の調製

２８（６０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１当量）の無水ジクロロメタン（１５ｍＬ）溶液を、０℃に冷却した。この撹拌した反応混合物に、ジクロロメタン中１Ｍ三塩化ホウ素（２００μＬ、０．２ｍｍｏｌ、１．８当量）を、３０秒間かけて滴下添加した。溶液を０℃で１０分間撹拌させ、次いで、氷水に注いだ。水相をジクロロメタンで抽出した。有機相を水で洗浄し、ＭｇＳＯ₄下で乾燥させ、真空下で濃縮して、３８ｍｇの粗生成物を得た。ガラス状固体を、カラムにてジクロロメタン−ＥｔＯＡｃ（６５−３５、Ｒｆ０．３５）の混合物を用いて精製して、２８ｍｇの純粋な２８を得た（収率５７％）。¹H NMR (CDCl₃, TMS, ppm) δ: 7.35-7.14 (m, 7H), 6.86 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.04 (s, 1H), 4.66 (dd, J = 5.1および12.5 Hz, 1H), 4.24 (d, J = 16.5 Hz, 1H), 3.87 (dd, J = 9.5および12.8 Hz, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.25 (d, J = 16.3 Hz, 1H), 3.24 (s, 3H), 3.14 (s, 3H) 2.73 (dd, J = 5.7および9.7 Hz, 1H). FAB-MS: C₂₂H₂₄N₂O₄S₂の計算値: 444.1, 実測値[M+H]⁺: 444.9.
１，４−ジメチル−３−ヒドロキシメチル−６−フェニルメチル−２，５−ピペラジンジオン−３，６−ジスルフィド（２９）の調製

２８（２５ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ、１当量）の無水ジクロロメタン（１５ｍＬ）溶液を、０℃に冷却した。この撹拌した溶液に、ｍ−クロロ過安息香酸（１５ｍｇ、０．０６７２ｍｍｏｌ、１．２当量、最大７７％純度）を添加した。０℃で１０分間撹拌した後、ジメチルスルフィド（２０μＬ）を添加した。次いで、溶液を過塩素酸のメタノール溶液（１：５）２５μＬで処理した。溶液を室温で９時間静置し、次いで、飽和炭酸水素ナトリウム溶液に注いだ。水層をジクロロメタンで抽出した。有機相を水で洗浄し、ＭｇＳＯ₄下で乾燥させ、真空下で濃縮して、１０ｍｇの粗生成物を得た。ガラス状固体を、カラムにてジクロロメタン−ＥｔＯＡｃ（９７．５−２．５、Ｒｆ０．３）の混合物を用いて精製して、４ｍｇの２９を得た（収率２２％）。¹H NMR (CDCl₃, TMS, ppm) δ: 7.30 (m, 5H), 4.34 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.08 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 3.65 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 3.50 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 3.22 (s, 3H), 3.00 (s, 3H).
合成ＥＴＰのインビトロ活性の査定
３種類の生物学的アッセイを使用して、細胞培養物における本発明者らの化合物の有効性を評価した：１）ＨＩＦ１誘導性プロモーターの活性を測定するためのルシフェラーゼベースのアッセイ；２）定量的逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応による内在性遺伝子のメッセンジャーＲＮＡレベルの測定；および３）ウエスタンブロット分析によるＶＥＧＦおよびｃ−Ｍｅｔタンパク質レベルのレベル分析。

本発明者らは、これらのアッセイを用いて、以下の３つのヒト細胞株における遺伝子発現の相対レベルを評価した：ＨｅＬａ（ヒト子宮頸部上皮腺癌）、ＭＣＦ７（良性ヒト乳癌腫）、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（悪性乳癌腫）を、表題のＥＴＰ化合物、ＤＫＰ対照ＮＰ４８１、およびケトミンＣＴＭで処理した。並行して、未処理の細胞を対照として使用した。ルシフェラーゼおよびＥＬＩＳＡ実験は３連で行い、ＲＴ−ＰＣＲ実験は６回繰り返した。

ルシフェラーゼアッセイ。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｈＲＥ−Ｌｕｃ細胞を、１０％ウシ胎児血清および０．４ｇ／Ｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８硫酸塩、ＲＰＩ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を補充した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。細胞を、６．５×１０⁴細胞／ｍＬ懸濁液１ｍＬを使用して、２４ウェル皿（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に６×１０⁴細胞／ウェルの密度で播種した。接着が起こった後、細胞を、１０ｎＭから１μＭの範囲にわたる濃度の合成ＥＴＰ化合物またはケトミンを含有する新鮮な培地１ｍＬで処理した。細胞を、５％ＣＯ₂の加湿雰囲気中、３７℃で６時間インキュベーションした。メシル酸デスフェリオキサミン（ＤＦＯ、Ｓｉｇｍａ）を３００μＭの最終濃度まで添加することによって低酸素を誘導し、細胞をさらに１８時間インキュベーションした。細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、１５０μＬのＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＣＣＬＲ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加することによって、全細胞溶解物を単離した。溶解物を収集し、４℃で１３，０００ｒｐｍにて遠心分離し、アリコートに分け、−８０℃で保存した。ルシフェラーゼアッセイは、全細胞溶解物およびＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、使用前に１時間周囲温度に戻すことによって実行した。Ｔｕｒｎｅｒ ＴＤ−２０ｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して製造業者の使用説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って、ルシフェラーゼアッセイを実行した。相対光強度測定値は、ブラッドフォードアッセイを実施して、ルシフェラーゼアッセイにおいて使用された溶解物のタンパク質含量を決定することによって正規化した。簡単に言うと、１．５ｍＬキュベットにおいて、５０μＬの細胞溶解物／ルシフェラーゼアッセイ試薬混合体を、２００μＬのブラッドフォード試薬および７５０μＬのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水に添加した。適当な量の１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ溶液を使用して、タンパク質標準物質を１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬの範囲で作製した。ＤＵ−８００分光光度計を使用して、吸光度を５９５ｎＭで測定した。実験は３連で行った。結果は図６に提示され、棒グラフは平均値を表し、エラーバーは平均値の標準誤差である。

細胞培養およびｍＲＮＡの単離
公開されている手順に従って、ＨｅＬａ細胞を、８％ウシ胎児血清（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）中で維持した。⁶⁹細胞を、６×１０⁴細胞／ｍＬ懸濁液２ｍＬを使用して、６ウェル皿（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に１．５×１０⁵細胞／ウェルの密度で播種した。接着が起こった後、細胞を、１０ｎＭから１μＭの範囲にわたる濃度の合成ＥＴＰ化合物またはケトミンを含有する新鮮な培地１ｍＬで処理した。５％ＣＯ₂の加湿雰囲気中、３７℃で６時間のインキュベーション期間の後、メシル酸デスフェリオキサミン（ＤＦＯ、Ｓｉｇｍａ）を３００μＭの最終濃度まで添加することによって低酸素を誘導し、細胞をさらに１８時間インキュベーションした。細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、直ちに溶解した。全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造業者の使用説明書に従って単離し、ＵＶ吸光度によって定量した。単離したＲＮＡをＤＮａｓｅ Ｉ（Ａｍｂｉｏｎ、ＤＮＡｆｒｅｅキット）でさらに処理して、残存するゲノムＤＮＡを除去した。逆転写は、Ｐｏｗｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて製造業者の推奨通りに実施した。

ＭＣＦ７細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）中で維持した。細胞を、１．２×１０⁵細胞／ｍＬ懸濁液２ｍＬを使用して、６ウェル皿に２．４×１０⁵細胞／ウェルの密度で播種した。接着が起こった後、細胞を、１０ｎＭから１μＭの範囲にわたる濃度の合成ＥＴＰ化合物またはケトミンを含有する新鮮な培地１ｍＬで処理した。５％ＣＯ₂の加湿雰囲気中、３７℃で６時間のインキュベーション期間の後、メシル酸デスフェリオキサミン（ＤＦＯ、Ｓｉｇｍａ）を３００μＭの最終濃度まで添加することによって低酸素を誘導し、細胞をさらに１８時間インキュベーションした。細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、直ちに溶解した。全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造業者の使用説明書に従って単離し、ＵＶ吸光度によって定量した。単離したＲＮＡをＤＮａｓｅ Ｉ（Ａｍｂｉｏｎ、ＤＮＡｆｒｅｅキット）でさらに処理して、残存するゲノムＤＮＡを除去した。逆転写は、Ｐｏｗｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて製造業者の推奨通りに実施した。

アフィメトリクスマイクロアレイを用いた遺伝子発現の分析。リアルタイム定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、正常酸素と低酸素の両方の条件下の、ＨｅＬａ細胞におけるＶＥＧＦおよびＧＬＵＴ１遺伝子に対するＥＴＰ化合物の作用を決定した。ＶＥＧＦの分析については、フォワードプライマー５’−ＡＧＧ ＣＣＡ ＧＣＡ ＣＡＴ ＡＧＧ ＡＧＡ ＧＡ−３’およびリバースプライマー５’−ＴＴＴ ＣＣＣ ＴＴＴ ＣＣＴ ＣＧＡ ＡＣＴ ＧＡ−３’を使用して、遺伝子の３’翻訳領域から１０４ｂｐ断片を増幅した。ＧＬＵＴ１（ＳＬＣ２Ａ１）の分析については、本発明者らは、以下の配列を利用して、１７９ｂｐの産物を得た：フォワード配列５’−ＴＡＧ ＡＡＡ ＣＡＴ ＧＧＴ ＴＴＴ ＧＡＡ ＡＴＧ Ｃ−３’、リバース配列５’−ＧＧＴ ＡＡＣ ＡＧＧ ＧＡＴ ＣＡＡ ＡＣＡ ＧＡＴ Ｔ−３’。ＲＮＡレベルは、ハウスキーピング遺伝子としてのβ−グルクロニダーゼを定量することによって標準化した。フォワードプライマー５’−ＣＴＣ ＡＴＴ ＴＧＧ ＡＡＴ ＴＴＴ ＧＣＣ ＧＡＴ Ｔ−３’およびリバースプライマー５’−ＣＣＧ ＡＧＴ ＧＡＡ ＧＡＴ ＣＣＣ ＣＴＴ ＴＴＴ Ａ−３’を、この遺伝子に対して使用した。実験は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＴ−ＰＣＲマスターミックスを用いて実施した。温度サイクルおよびＳＹＢＲグリーン発光の検出は、ＡＢＩ７３００リアルタイムＰＣＲ装置を用いて実施した。データは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、バージョン１．２を用いて分析した。統計分析は、６回の独立した実験からのデータを用いて実施した。

ＶＥＧＦおよびｃ−Ｍｅｔタンパク質レベルのウエスタンブロット分析。ＭＣＦ７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、直径６０ｍｍの細胞培養皿（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に１．０×１０⁶細胞／ｍＬの密度に播種した。接着の後、それらを、ケトミン（２００ｎＭ）、ＬＳ７２およびＬＳ７５（４００ｎＭ）を含有する培地で処理した。すべての試料は、最終濃度０．１〜０．２ｖ／ｖ％のＤＭＳＯを含有した。６時間のインキュベーション期間の後、ＭＣＦ７では３００μＭ ＤＦＯを用いて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞では１５０μＭ ＣｏＣｌ₂を用いて、低酸素を誘導した。試料をさらに１８時間インキュベーションした。全細胞タンパク質を、細胞溶解バッファーを使用して製造業者のプロトコール（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に従って細胞から抽出した。ＢＣＡプロテインアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、タンパク質濃度を測定した。等量のタンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にエレクトロブロットした。これらを、まず抗ＶＥＧＦマウスモノクローナル（ｓｃ−５７４９６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）または抗ｃ−Ｍｅｔウサギポリクローナル抗体（ｓｃ−１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でプローブし、Ｒｅｓｔｏｒｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でストリッピングし、ウサギポリクローナル抗β−アクチン抗体（４８６７、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で再プローブした。

トリス緩衝生理食塩水−Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）溶液で洗浄した後、膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともにインキュベーションした。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ化学発光キット（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用することによって、シグナルを検出した。

動物の使用。動物実験は、ＰＲＩＳＭ施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）による審査および承認の後、連邦政府のガイドラインに準拠して行った。無胸腺ヌードマウスを、Ｈａｒｌａｎから８〜９週齢で購入した。

蛍光腫瘍細胞株。Ｎ２０２（Ｊｏｓｅｐｈ Ｌｕｓｔｇａｒｔｅｎ、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ、Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺから寄贈）を、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、および１０％熱不活化ＦＢＳ（Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｔａｒｚａｎａ、ＣＡ）を補充したＤＭＥＭ Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ中で、３７℃、大気中５％ＣＯ₂で維持した。ヒストンＨ２Ｂ−ＧＦＰを、ＢＯＳＨ２ＢＧＦＰＮ１ベクター由来のＳａｌＩおよび平滑末端ＮｏｔＩ部位を使用して、ＬＸＲＮベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）のＳａｌＩ／ＨｐａＩ部位にサブクローニングし⁷⁰、Ｎ２０２を生存ウイルスを用いて形質導入して、Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ遺伝子を安定に組み込んだ。形質導入細胞を２回ＦＡＣｓソートして、１００％の細胞がＨ２Ｂ−ＧＦＰタンパク質を安定に発現することを確実にした。

マウス異種移植片腫瘍モデル。古典的なＩＶＭ腫瘍モデル⁷¹を、軽微な改変を加えて使用した。マウス、通常は無胸腺ヌードマウス（体重２５〜３０ｇ）を麻酔し（体重１００ｇあたり７．３ｍｇ塩酸ケタミンおよび２．３ｍｇキシラジン、腹腔内注射）、加熱パッド上に置いた。チタンフレームをマウスの背面の皮膚のひだの上に置いて、伸ばした二重層の皮膚を挟んだ。次いで、直径１５ｍｍの円形の全層皮膚を切除した。残存する皮膚の上の浅筋膜を慎重に除去して、下層にある筋肉および皮下組織を露出させ、これを次いで、カバーガラスを備えた別のチタンフレームで覆って、ウィンドウチャンバーを形成する。１〜２日の回復期間の後、腫瘍スフェロイドを埋め込んだ。腫瘍スフェロイドは、５０，０００個のＮ２０２細胞を、１％寒天で被覆した９６ウェル非組織培養処理平底皿に播種し（１００μｌ培地中２０μｌ細胞）、２０００ｒｐｍにて４回１５分間遠心分離し、各遠心分離後に皿を回転させることによって形成させた。細胞を、さらに３〜７日間（細胞型に応じて）３７℃、大気中５％ＣＯ₂でインキュベーションして、密なスフェロイドを形成した。腫瘍スフェロイドを、ウィンドウチャンバー内のみの背面皮膚に直接埋め込んだ。腫瘍を１０〜１４日間にわたり血管形成させた後、０日目に１ｍｇ／ｋｇのＬＳ７２化合物を注射し、続いて、８〜１３日目に２ｍｇ／ｋｇで毎日投与した。

腫瘍成長。ＩＶＭを用いた腫瘍成長の分析。記載されている通りに、生体蛍光顕微鏡法によって腫瘍を撮像した。⁷²腫瘍成長を、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用して、記録されたデジタルのグレースケール０から２５６の画像からオフラインで分析した。腫瘍の積算蛍光シグナルを経時的に定量することによって、腫瘍成長を決定した。積算腫瘍蛍光シグナルは、７５を超えるすべてのピクセルのシグナル総和によって測定した。すべての成長曲線は、処置後０日目の腫瘍に対して正規化されている。

本発明を具体的な典型的態様および例に関して説明してきたが、ここで開示された態様は例示目的のものにすぎず、以下の特許請求の範囲に規定される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、当業者によって様々な改変および変更がなされ得ることは理解されよう。

ＤＦＯ（３００μＭ）を用いた低酸素誘導下でＬＳ７２（４００ｎＭ）による処理によって下方調節される重要なＨＩＦ１α誘導性遺伝子のリスト。

ＤＦＯ（３００μＭ）を用いた低酸素誘導下のＭＣＦ７細胞においてＬＳ７２（４００ｎＭ）で処理した際に下方調節される溶質キャリア（ＳＬＣ）ファミリー遺伝子のリスト。

参考文献
前述のものを含むここでのすべての参考文献は、参照によりその全体がここに組み込まれる。

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Claims (8)

1. 式Ｉによる化合物、およびその塩、溶媒和物または水和物：
   （式中、ｎ＝１、２、３、４であり、
   各ジケトピペラジン環の中心間の距離は、４〜３２オングストロームであり、
   各ジケトピペラジン環の中心間の好ましい距離は、１０〜２２オングストロームであり、
   Ｒ₁およびＲ₂は、水素、アルキル、置換アルキル、アミノアルキル、およびアリールからなる群から独立して選択され、
   Ｒ₃は、Ｈ、アルキル、アミノアルキル、ＰＥＧ、およびアシルからなる群から選択され、
   Ｙは、（ＣＨ₂）_k、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−）_l、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−）_m、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｓ−）_n、（−ＣＨ＝ＣＨ−）_o、ヘテロ環、および
   からなる群から選択され、
   ここで、Ｘは、（ＣＨ₂）_k、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−）_l、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−）_m、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｓ−）_n、（−ＣＨ＝ＣＨ−）_o、およびヘテロ環からなる群から選択され、ここで、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｏは、それぞれ独立して、１、２、または３に等しく、
   Ｒ₄は、Ｈ、アルキル、およびハロゲンからなる群から選択される）。
2. 式ＩＩによる化合物、およびその塩、溶媒和物または水和物：
   （式中、ｎ＝１、２、３、４であり、
   Ｒ₁、Ｒ₂は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アミノアルキル、およびアリールからなる群から独立して選択され、
   Ｒ₃は、Ｈ、アルキル、アミノアルキル、ＰＥＧ、アシルからなる群から選択され、
   Ｘは、（ＣＨ₂）_k、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−）_l、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−）_m、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｓ−）_n、（−ＣＨ＝ＣＨ−）_o、およびヘテロ環からなる群から選択され、ここで、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｏは、それぞれ独立して、１、２、または３に等しく、
   Ｒ₄は、Ｈ、アルキル、およびハロゲンからなる群から選択される）。
3. その塩、溶媒和物および水和物を含む式ＩＩＩによる化合物：
   （式中、ｎ＝１、２、３、４であり、
   Ｒ₁およびＲ₂は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、およびアリールからなる群から独立して選択され、
   Ｒ₃は、Ｈ、アルキル、アミノアルキル、ＰＥＧ、およびアシルからなる群から選択され、
   Ｘは、（ＣＨ₂）_k、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−）_l、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−）_m、（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｓ−）_n、（−ＣＨ＝ＣＨ−）_o、およびヘテロ環からなる群から選択され、ここで、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｏは、それぞれ独立して、１、２、または３に等しく、
   Ｒ₄＝Ｈ、アルキル、またはハロゲンである）。
4. 担体に溶解または分散された、請求項１〜３のいずれかに記載の少なくとも１種の化合物を含む医薬組成物。
5. 細胞において低酸素誘導性転写経路に干渉するための方法であって、
   前記細胞を、請求項１〜３のいずれかに記載の少なくとも１種の化合物と接触させることを含む方法。
6. 乳癌を治療するための方法であって、
   それを必要とする対象に、請求項１〜３のいずれかに記載の少なくとも１種の化合物の有効量を投与することを含む方法。
7. 治療を必要とする癌腫に罹患した対象を治療するための方法であって、
   前記対象に、請求項１〜３のいずれかに記載の少なくとも１種の化合物の有効量を投与することを含む方法。
8. 以下：
   から選択される化合物。