CN104755084A - 抑制缺氧诱导型转录因子复合体的活性的组合物和方法及其治疗肿瘤的用途 - Google Patents
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Abstract
公开了桥二硫二酮哌嗪化合物,基于其的药物组合物,以及处理、减少或抑制缺氧诱导基因的转录和翻译的方法。本发明的实施方式涉及干扰缺氧诱导型转录途径的方法。一般而言,本实施方式所述的方法包括将细胞与式I、式II或式III的至少一种化合物或者其盐、溶剂合物或水合物接触。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年8月29日提交的美国临时申请第61/694,717号公开的发明的权益,将其全部内容以引用的方式并入本文中。
关于联邦赞助的研发的声明
本发明是根据美国国家科学基金会(National Science Foundation)所授予的合同第CHE-1161644号在政府的资助下得以完成的。政府在本发明中享有一定权利。
技术领域
本发明涉及桥二硫二酮哌嗪(epidithiodiketopiperazine)化合物,基于其的药物组合物,以及处理、减少或抑制缺氧(hypoxia)诱导型基因的转录和翻译的方法。
发明背景
癌症发病率和死亡率的高比例仍是西方社会人群主要关心的问题。除了对癌症患者以及其直系亲属成员有影响外,癌症还给社会造成了很大的负担。癌症治疗和病患护理的成本通常较高,并促成了健康保险成本增加,进而导致未保险的人比例更高,并因此使在未保险的人患病或受伤时的经济负担增加。癌症也因癌症患者旷日持久的缺席工作而对商业造成了显著的负面影响。
虽然多年来癌症治疗方法已大大改进,但仍有许多挑战,最显著的是癌症患者中的复发,以及治疗癌症晚期患者以及患转移性疾病或全身性癌症(例如白血病或淋巴瘤)的患者的困难。例如,改进的诊断方法结合更好的手术技术使肿瘤科医生更有信心移除肿瘤,同时将正常组织的移除减到最少。由此,可缩短患者的恢复时间,并且减少心理影响。然而,外科手术仅是治疗具有局部非转移性肿瘤或最低程度扩散的肿瘤的患者的少数有效手段之一。
化学疗法是针对某些癌症类型的另一治疗选择。然而,相比于正常细胞,化疗方法一般对肿瘤细胞没有特异性。因此,化学疗法通常伴随有严重的副作用,可以对患者的免疫系统和迅速分裂的组织(例如肝脏、肾脏、肠和上皮中的组织)特别有害。
癌的进展取决于血管发生或穿透每个实体瘤的新血管的芽生。定义癌的快速组织增殖造成大量的适应性细胞响应,其中主要是独特但相关的血管发生和增加的糖酵解过程。血管发生主要由一些促有丝分裂因子驱动,例如血管内皮生长因子(VEGF),并且其受体起着关键作用。虽然新血管形成在胚胎发育中是必不可少的,但其在癌症中是极不受欢迎的,因为这些初生的血管会灌入肿瘤组织,并且为其提供增加的氧合作用和养分以便更快速的生长。血管发生是特别有害的,因为其造成双重威胁:其不仅加速肿瘤生长,而且经由新形成的脉管系统而提供代谢入口。由于对总体患者生存影响最大的是转移性生长,因此血管发生是关键的化疗靶标。而且,血管靶标不应对治疗产生抵抗,因为其不受发生在恶性细胞中的多重突变的影响。将血液供应(脉管系统)作为靶标的一个主要优点是:不同于癌组织中的细胞,构成血管的细胞是遗传稳定的,并因此应当对治疗具有减弱的抗性。
当肿瘤细胞继续增殖时,其被迫使远离携带代谢过程所需的氧和营养物的血液供应,并因此不能获得足够的氧灌注。接踵而至的缺氧1造成厌氧代谢,其选择出糖酵解上调的细胞2。增强的糖酵解功能随后导致乳酸生成增加,这降低了细胞内pH并且可促进细胞外基质和基底膜的降解,从而促成血管发生3。糖酵解在克服肿瘤发生期间的生长抑制方面带来了显著的优势4,5,多数原发性转移瘤展示了诸如己糖激酶1和2以及葡萄糖载体GLUT1和GLUT3等糖酵解酶的显著上调6。
缺氧是实体瘤最重要的标志之一,其在细胞增殖、信号传导和生长中起着重要作用7。典型的赘生物(neoplasm)通常在其早期缺乏血管。快速增殖的细胞有助于缺氧的发展8。尽管细胞增殖在肿瘤的远离血管的那些部分中有所减少9,但它们趋于选择更有侵略性的细胞表型。此外,已报告了远离血管的缺氧组织产生了对p53介导的细胞凋亡丧失敏感性的细胞7。
除了缺氧细胞缺乏足够的血液供应严重损害药物向这些细胞的递送这一事实之外,缺氧还导致抗药性中涉及的基因(例如P糖蛋白10,11)的上调12,13。最重要地,从转录的角度而言,缺氧造成血管发生14和肿瘤侵袭15中涉及的基因的上调,从而造成更具侵略性的癌表型16。
在细胞和组织中,对缺氧的响应主要由缺氧诱导型转录因子家族介导,其中缺氧诱导因子1(HIF1)起着主要作用。其是异二聚体转录因子,其介导在缺氧状态中被上调的许多关键基因的调控(图1a)17。在常氧条件中,HIF1的α亚基受到脯氨酸残基402和564的羟基化的调控18;这些修饰充当von Hippel-Lindau(pVHL)蛋白19结合HIF1的对接位点,并使其带有泛素标签,以便进行随后的蛋白酶体降解20。然而,在缺氧条件下,HIF1α积聚,进入细胞核,并与其β亚基芳烃受体核转运蛋白(ARNT或HIF1β)形成二聚体21。其结合至具有缺氧响应元件(HRE)的缺氧诱导型基因(包括VEGF、c-Met、EPO和GLUT-123,24)的启动子区22。由于低氧水平还妨碍Asn803处的另一调节位点的羟基化25~30,辅活化因子CREB结合蛋白(CBP)/p30031~33通过结合HIF1α的C末端结构域而被募集,并且促进缺氧诱导型基因的表达水平升高(图1b)34~ 36。在发现具有RAS、SRC和HER2/NEU/ERBB2的致癌突变的许多肿瘤细胞中,即便在充分充氧的条件下,也检测到了高水平的HIF1α37。
已显示了HIF1α的反义构建体在体内根除了较小的移植胸腺淋巴癌,甚至提高了对于更大肿瘤的免疫疗法的功效38。微管的小分子抑制剂,例如2-甲氧基雌二醇、长春新碱和紫杉醇,据显示能够在体外降低HIF1α水平,还减少肿瘤生长和血管化39。然而,不清楚该肿瘤生长减少效果是由于微管抑制还是由于HIF1α水平的降低。
HIF1主要通过一系列关键的半胱氨酸残基与CBP/300的CH1结构域相互作用,并且这种相互作用由疏水力驱动。据显示,天然产物毛壳菌素(chetomin)(图2,参见下文)(毛壳菌属物种(Chaetomium sp.)的真菌代谢物)展现出了对HIF/p300复合体的强效和特异性的抑制。由于p300/CBP对于HIF1介导的反式激活而言是绝对必需的,阻断HIF1和p300/CBP的关联有效地下调了转录。
发明内容
本发明的一个实施方式涉及式I的化合物,包括其盐、溶剂合物和水合物:
其中n=1、2、3、4;
R1和R2独立地选自由氢、烷基、具有取代基的烷基和芳基组成的组;
R3选自由H和酰基组成的组;
Y选自由(CH2)k、(-CH2-CH2-O-)l、(-CH2-CH2-NH-)m、(-CH2-CH2-S-)n、(-CH=CH-)o、杂环、组成的组,其中X选自由(CH2)k、(-CH2-CH2-O-)l、(-CH2-CH2-NH-)m、(-CH2-CH2-S-)n、(-CH=CH-)o和杂环组成的组;且其中k、l和m、n、o各自独立地等于1、2或3;并且
R4选自由H、烷基和卤素组成的组。
在以上实施方式中,对于R1和R2,烷基优选为甲基或乙基,具有取代基的烷基优选为-CH2OH,而芳基优选为苯基或苄基;对于R3,酰基优选为COCH3。
本发明的另一个实施方式涉及式II的化合物,包括其盐、溶剂合物和水合物:
其中n=1、2、3、4;
R1和R2独立地选自由氢、烷基、具有取代基的烷基和芳基组成的组;
R3选自由H和酰基组成的组;
X独立地选自由(CH2)k、(-CH2-CH2-O-)l、(-CH2-CH2-NH-)m、(-CH2-CH2-S-)n、(-CH=CH-)o和杂环组成的组;其中k、l和m、n、o各自独立地等于1、2或3;并且
R4选自由H、烷基和卤素组成的组。
在以上实施方式中,对于R1和R2,烷基优选为甲基或乙基,具有取代基的烷基优选为-CH2OH,而芳基优选为苯基或苄基;对于R3,酰基优选为COCH3。
本发明的另一个实施方式涉及式III的化合物,包括其盐、溶剂合物和水合物:
其中n=1、2、3、4;
R1和R2独立地选自由氢、烷基、具有取代基的烷基、芳基组成的组;
R3=H或酰基;
X选自由(CH2)k、(-CH2-CH2-O-)l、(-CH2-CH2-NH-)m、(-CH2-CH2-S-)n、(-CH=CH-)o和杂环组成的组;其中k、l和m、n、o各自独立地等于1、2或3;并且
R4=H、烷基或卤素。
在以上实施方式中,对于R1和R2,烷基优选为甲基或乙基,具有取代基的烷基优选为-CH2OH,而芳基优选为苯基或苄基;对于R3,酰基优选为COCH3。
本发明的另一个实施方式涉及一种药物组合物,所述药物组合物包含溶解或分散在载剂中的式I、式II或式III的至少一种化合物或其盐、溶剂合物或水合物。
本发明的另一个实施方式涉及以下化合物:
本发明的另一个实施方式涉及干扰缺氧所诱导的转录途径的方法。一般而言,本实施方式的方法包括将细胞与式I、式II或式III的至少一种化合物或者其盐、溶剂合物或水合物接触。
本发明的另一个实施方式涉及治疗乳腺癌的方法,其包括向有需要的受试对象施用有效量的式I、式II或式III的至少一种化合物或者其盐、溶剂合物或水合物。
本发明的另一个实施方式涉及治疗癌的方法,其包括向有需要的受试对象施用有效量的式I、式II或式III的至少一种化合物或者其盐、溶剂合物或水合物。
本发明的其他方面和优势将通过以下具体描述、附图和所附的权利要求而变得显而易见。
附图说明
图1(a)是HIF1αC-TAD/p300CH1复合体的结构、缺氧诱导因子1α(HIF1α)的结构域图以及人类HIF1αC-TAD的序列。(b)是HIF1α转录途径的示意图。
图2是从球毛壳菌(Chaetomium globosum)中分离的毛壳素(chaetocin)CTC和来自螺卷毛壳菌(Chaetomium cocliodes)的毛壳菌素CTM。
图3是合成的桥二硫二酮哌嗪LS69、LS72和对照二酮哌嗪NP481的结构。
图4是显示二环硫缩醛和单环ETP在以下条件下的合成:a:p-茴香醛,BF3,ET2O,DCM,RT,16hr,92%;b:mCPBA,Me2S,HClO4;c:BOMCl,nBuLi,THF,-78℃,d:BCL3,CH2Cl2;e:AcCl,吡啶,CH2Cl2;f:nBuLi,THF,-78℃,BnCl。
图5是显示桥接的ETP在以下条件下的合成:a:7,nBuLi,THF,-78℃;b:BCl3,CH2Cl2;c:mCPBA;Me2S,HClO4;d:nBuLi,THF,-78℃。
图6是LS69与固定化的融合蛋白GST-CH1-p300直接结合的SPR数据。获得了1.09μM的结合常数。
图7是显示LS72与固定化的GST-CH1-p300结合的SPR传感图。获得了3.62μM的结合常数。
图8是在用hRE-hCMV-Luc质粒稳定转染的MDA-MB-231细胞系中通过荧光素酶测定对缺氧诱导型启动子活性进行的分析。化合物LS69、LS72和NP481的浓度分别为200nM和600nM。
图9是通过实时定量RT-PCR测量的MCF7细胞中VEGF基因的相对mRNA水平。化合物LS69、LS72和NP481的浓度分别为200nM和600nM。
图10是MCF7细胞中LS72的MTT细胞毒性测定。将细胞维持在增补有10%FBS的RPMI-1640培养基中。将细胞用不同浓度的LS72处理24小时,并用分光光度法确定紫色甲的形成量。
图11是A549细胞系中毛壳菌素的MTT细胞毒性测定数据。在无血清F-12K培养基中将细胞用不同浓度的化合物处理48小时。在处理48小时后,A549细胞系中的针对毛壳菌素获得的EC50值为0.9μM。作为比较,用毛壳菌素处理MCF7细胞系24小时得到了0.2μM的EC50,表明该细胞系中该化合物的细胞毒性显著更高。
图12是A549细胞系中LS72的MTT细胞毒性测定数据。在无血清F-12K培养基中将细胞用不同浓度的化合物处理48小时。
图13是在用LS72处理后A549细胞中三种HIF1α诱导基因——VEGF、c-Met和Glut1的mRNA水平。来自qRT-PCR实验的数据显示了在用LS72(400nM)处理具有0.2%血清的培养基中的细胞之后A549中的三种HIF1α诱导基因——VEGF、c-Met和Glut1的mRNA水平。用DFO诱导(300μM)缺氧。误差条为一式四份进行的实验的±测量标准误差(s.e.m)。误差条为一式三份进行的实验的±s.e.m。***P<0.001,**P<0.01,t检验。
图14是用LS72处理的A549细胞中的(A)LOX和(B)CXCR4基因的qRT-PCR数据。用缺氧袋诱导缺氧。将细胞维持在具有2%血清的F-12K培养基中。在达到65%融合后,使细胞在无血清培养基中生长,并用LS72(400nM)处理。用DFO(300μM)诱导缺氧48小时。误差条为一式三份进行的实验的±s.e.m。**P<0.01,t检验。
图15是A549细胞系中的VEGF的mRNA水平,表明了对三种不同浓度的LS72处理的剂量响应。进行qRT-PCR测定以确定在用浓度为100nM、400nM、1600nM的LS72处理的A549细胞系中VEGF的mRNA水平。用DFO(300μM)诱导缺氧。误差条为一式三份进行的实验的±s.e.m。误差条为一式三份进行的实验的±s.e.m。**P<0.01,*P<0.05,t检验。
图16是A549细胞系中c-Met的mRNA水平,显示了对浓度为100nM、400nM、1600nM的LS72的剂量响应。qRT-PCR用于确定c-Met的mRNA水平。用DFO(300μM)诱导缺氧。误差条为一式三份进行的实验的±s.e.m。误差条为一式三份进行的实验的±s.e.m。***P<0.001,**P<0.01,#P<0.1,t检验。
图17是用三种不同浓度的LS72处理的85%融合的A549细胞中的Glut1 mRNA的qRT-PCR数据。进行qRT-PCR测定以确定在用浓度为100nM、400nM、1600nM的LS72处理的A549细胞系中的Glut1的mRNA水平。用DFO(300μM)诱导缺氧。误差条为一式三份进行的实验的±s.e.m。误差条为一式三份进行的实验的±s.e.m。**P<0.001,*P<0.01,t检验。
图18是A549细胞的qRT-PCR数据,其中在85%融合的细胞中诱导缺氧。在浓度为300μM的DFO下观察到对CXCR4转录的超过650倍的诱导。400nM和1600nM两个不同浓度的LS72以剂量依赖性方式下调了CXCR4mRNA水平。误差条为一式三份进行的实验的±s.e.m。误差条为一式三份进行的实验的±s.e.m。**P<0.01,*P<0.1,t检验。
图19是被LS72下调的VEGF和c-Met蛋白水平。a)用毛壳菌素(200nM)、LS72(400nM)和LS75(400nM)处理MCF7细胞。用300μM DFO诱导HIF1α。一式三份地进行蛋白质印迹,并且蛋白水平的柱状图显示了VEGF蛋白在LS72下的显著下调。b)用毛壳菌素(200nM)、LS72(400nM)和LS75(400nM)处理MDA-MB-231细胞。用150μM CoCl2诱导HIF1α。一式三份地进行蛋白质印迹,并且蛋白水平的柱状图显示出毛壳菌素和LS72都显著下调了c-Met蛋白水平。
图20是微阵列数据的分析结果。绿色维恩图(Venn diagram)显示了在载质中下调的基因(左侧绿色圆),即与载质常氧相比在载质缺氧中下调的基因;而右侧绿色圆显示了与用LS72处理的常氧中的基因相比在用LS72(400nM)处理的缺氧中下调(>2.0倍)的基因的数量。红色图显示了在如对绿色维恩图所解释的相同条件下上调的基因。蓝色图显示了在上述条件下基因增加或减少(>2.0倍)的整体效果。
图21是在用DFO(300μM)的缺氧诱导下用LS72处理的MCF7细胞的微阵列分析。进行聚类分析以看出不同条件中基因的相似趋势。此分析显示出,在缺氧下用LS72(400nM)处理的MCF7细胞示出了如载质中所见的相似趋势,这表示LS72朝着消除缺氧对整体转录水平的影响的方向起作用。
图22是稳定转染有H2B-GFP构建体的荧光N2O2细胞的鼠皮下肿瘤模型的活体镜检图像。在第0天对具有N202 H2B-GFP肿瘤的小鼠静脉注射1mg/kg的LS72化合物,然后在第8天后每日注射2mg/kg,并持续2周记录图像。在所示的处理后日期采集肿瘤的荧光IVM图像。
图23是从来自用或不用LS72处理的小鼠IVM的肿瘤图像获得的荧光强度变化。图表显示了如图22的IVM图像所示的肿瘤体积之间的定量差异。载质小鼠(-■-)以及用LS72处理的小鼠#1(-▲-)和#2(-◆-)。
图24是用毛壳菌素CTM以及ETP LS69和LS72处理的HeLa细胞的细胞密度和群体倍增数据。对照:仅有细胞培养基;载质:细胞培养基含0.1%DMSO。
具体实施方式
定义
除非本文另外指出,否则本文中使用的所有术语均具有对本发明所属技术领域的技术人员而言通常具有的含义。从业者可以特别参考现有的教科书来获得本领域的定义和术语。不过,要理解的是,本发明并不限于所描述的特定方法、方案和试剂,因为这些要素可以改变。
术语“烷基”是指C1~C10直链的或带支链的烷基,例如,甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基和叔戊基等。
“具有取代基的烷基”的取代基为羟基、烷氧基(例如,甲氧基和乙氧基)、巯基、烷基硫基(例如,甲硫基)、环烷基(例如,环丙基、环丁基、环戊基和环己基)、卤素(例如,氟、氯、溴和碘)、羧基、烷氧基羰基(例如,甲氧基羰基和乙氧基羰基)、硝基、氰基、卤代烷基(例如,三氟甲基)、醇、经取代或未经取代的氨基(例如,甲基氨基、二甲基氨基和氨基甲酰基氨基)、胍基、苯基和苄氧基等。这些取代基能够在一个或多个任何可能的位置出现。
术语“芳基”是指单环或稠环芳香烃。芳基的实例为苯基和萘基等。
术语“杂环”是指芳族杂环基团,其在环中含有选自由氮、氧和硫原子组成的组的一个或多个杂原子,并且可在任何可能的位置与碳环或其它杂环稠合。
术语“酰基”是指烷基羰基、环烷基羰基、芳基羰基、杂环基羰基或杂芳基羰基取代基,其中任意基团可进一步取代有例如一个或多个取代基。
单独或组合的术语“卤素”表示氟、氯、溴或碘,优选为氟、氯或溴。
本发明的一个实施方式涉及式I的化合物,包括其盐、溶剂合物和水合物,
其中n=1、2、3、4;
各二酮哌嗪环的中心之间的距离为4埃~32埃;
各二酮哌嗪环的中心之间优选的距离为10埃~22埃;
R1和R2独立地选自由氢、烷基、具有取代基的烷基和芳基组成的组;
R3选自由H和酰基组成的组;
Y选自由(CH2)k、(-CH2-CH2-O-)l、(-CH2-CH2-NH-)m、(-CH2-CH2-S-)n、(-CH=CH-)o、杂环、组成的组,其中X选自由(CH2)k、(-CH2-CH2-O-)l、(-CH2-CH2-NH-)m、(-CH2-CH2-S-)n、(-CH=CH-)o和杂环组成的组;且其中k、l、m、n、o各自独立地等于1、2或3;并且
R4独立地选自由H、烷基和卤素组成的组。
在以上实施方式中,对于R1和R2,烷基优选为甲基或乙基,具有取代基的烷基优选为-CH2OH,而芳基优选为苯基或苄基;对于R3,酰基优选为COCH3。
本发明的另一个实施方式涉及式II的化合物,包括其盐、溶剂合物和水合物:
其中n=1、2、3;
R1和R2独立地选自由氢、烷基、具有取代基的烷基和芳基组成的组;
R3选自由H和酰基组成的组;
X独立地选自由(CH2)k、(-CH2-CH2-O-)l、(-CH2-CH2-NH-)m、(-CH2-CH2-S-)n、(-CH=CH-)o和杂环组成的组;其中k、l、m、n、o各自独立地等于1、2或3;并且
R4独立地选自由H、烷基和卤素组成的组。
在以上实施方式中,对于R1和R2,烷基优选为甲基或乙基,具有取代基的烷基优选为-CH2OH,而芳基优选为苯基或苄基;对于R3,酰基优选为COCH3。
本发明的另一个实施方式涉及式III的化合物,包括其盐、溶剂合物和水合物:
其中n=1、2、3;
R1和R2独立地选自由氢、烷基、具有取代基的烷基、芳基组成的组;
R3=H或酰基;
X=(CH2)k、(-CH2-CH2-O-)l、(-CH2-CH2-NH-)m、(-CH2-CH2-S-)n、(-CH=CH-)o、杂环,其中k、l、m、n、o各自独立地等于1、2或3;并且
R4独立地选自H、烷基和卤素。
在以上实施方式中,对于R1和R2,烷基优选为甲基或乙基,具有取代基的烷基优选为-CH2OH,而芳基优选为苯基或苄基;对于R3,酰基优选为COCH3。
在式I~III中,优选的杂环为吲哚类、具有取代基的苯类(即,氟苯基类等)。同样在式I~III中,R4表示芳环上的可变的附接物,并且表明R4可在芳环上进行单、二、三或四取代,且R4可在每个取代位上独立地选择。
本发明的另一个实施方式涉及一种药物组合物,所述药物组合物包含溶解或分散在载剂中的式I、式II或式III的至少一种化合物或者其盐、溶剂合物或水合物。
本发明的另一个实施方式涉及干扰缺氧所诱导的转录途径的方法。一般而言,本实施方式所述的方法包括将细胞与式I、式II或式III的至少一种化合物或者其盐、溶剂合物或水合物接触。
本发明的另一个实施方式涉及治疗乳腺癌的方法,其包括对有需要的受试对象施用有效量的式I、式II或式III的至少一种化合物或者其盐、溶剂合物或水合物。
本发明的另一个实施方式涉及治疗癌的方法,其包括对有需要的受试对象施用有效量的式I、式II或式III的至少一种化合物或者其盐、溶剂合物或水合物。
作为缺氧诱导型转录的抑制剂的合成桥二硫二酮哌嗪
在HIF1αC端活化结构域(C-TAD)和p300/CBP富半胱氨酸-组氨酸区域1(CH1)(图1a)之间的接触部中存在两个α螺旋区域,这开启了设计合成转录拮抗剂的可能,该拮抗剂能够可预见地调节这种相互作用。然而,一旦从蛋白质环境中切出,由少于15个氨基酸残基组成的肽在生理条件下一般不形成α螺旋结构。值得注意的是,用α螺旋破坏C-TAD/CH1相互作用的唯一尝试是由Kung等人报道的方法40。在此研究中,C-TAD表达为具有Gal4的融合蛋白,其使该结构域稳定。所得的蛋白抑制了缺氧诱导型基因的转录,并且对裸小鼠异种移植模型中的经修饰的人类肿瘤细胞的生长具有抑制效果。然而,全身递送的困难以及由在细胞和组织中使用逆转录病毒引起的并发症妨碍了其广泛适用。
由于HIF1αC-TAD与转录辅活化因子p300/CBP的相互作用是生物响应的重要放大点,用设计好的蛋白配体将其破坏可以作为抑制癌症中的有氧糖酵解和血管发生的有效手段41~43。虽然HIF1αC-TAD与p300/CBP的接触表面广阔但通过直接相互作用来抑制这种蛋白-蛋白相互作用是困难的。反之,诱导结合伴侣之一(p300/CBP)的结构变化可足以破坏复合体44。已展示了相反的策略,其中蛋白质p53的功能被小分子恢复45。
本发明提供了干扰缺氧所诱导的转录途径的方法。一般而言,所述方法包括将细胞与式I~III的任意化合物接触。
下面讨论代表上述结构的小分子以及设计用于治疗应用的ETP的方法的实施例。
实施例
靶向缺氧诱导型转录因子复合体的二聚桥二硫二酮哌嗪的设计和合成
在合成的二聚桥二硫二酮哌嗪的设计中使用的结构基础
虽然用小分子抑制核蛋白-蛋白相互作用在过去被证明是困难的46,近来对高亲和力蛋白配体的筛选已产生了一些显著的成绩44,47~53。已显示出,两种小分子毛壳素(CTC)54和毛壳菌素(CTM)55(图2)能够抑制HIF1αC-TAD与p300/CBP之间的相互作用并减弱缺氧诱导型转录,但其确切的作用机制仍不清楚44。尽管有初期鼓舞人心的报道,但需要进一步设计HIF1途径抑制剂,因为这两种化合物都诱导了试验动物中的凝固性坏死、贫血和白细胞增多。
毛壳素和毛壳菌素是来自毛壳属物种的丝状真菌的两种桥二硫二酮哌嗪56(ETP)代谢物,先前已被表征为具有抗微生物活性57,58。这些天然产物的总体合成是非常有挑战性的,并且迄今尚无针对毛壳菌素的合成报道,大概是由于二酮哌嗪环的对映选择性亚磺酰化方法的缺乏以及二硫键对碱和还原剂的不稳定性。在生理条件下,桥接的二硫化物部分可以以二硫化物或二巯基化物形式存在,并且被认为对于此类天然产物的生物活性是必不可少的。此假说得到了发明人的初步结果以及Bernardo和Waring的近期工作的支持,Bernardo和Waring展示了仅天然(氧化)形式的桥二硫二酮哌嗪随后还原,并以谷胱甘肽依赖性方式活跃地集中在活细胞中59。ETP的细胞内水平可以是所施加的浓度的至多1500倍,并且细胞中的ETP几乎仅以还原形式存在59。
发明人假设,毛壳素和毛壳菌素中两个适当定位的氧化还原活性ETP环在这些化合物与富半胱氨酸-组氨酸Zn2+依赖性蛋白结构域的高亲和力双齿结合中可以起到重要作用。CTC和CTM结构的刚性使得更容易预测其生物活性构象。尽管中心骨架结构存在明显差异,但这两个分子具有低能构象,且具有非常相似的ETP环取向。
将两个ETP环通过半刚性中心骨架连接起来,从而设计出合成的二聚桥二硫二酮哌嗪。这种小分子能够破坏整体折叠,由此破坏HIF1α对p300/CBP的募集。为了确认这点,发明人设计了两种ETP:LS69和LS72(其中ETP环的定位与毛壳菌素相似),并检查了它们对HIF诱导型基因的转录的影响(图3)。还设计了与LS69结构上相似但缺少二硫桥的分子NP481作为对照化合物(图3)。
二聚桥二硫二酮哌嗪的合成
在发明人的合成计划中,发明人在尽可能最迟的阶段在合成中间体中形成二硫桥。发明人在初期引入受保护的二硫化物,希望受保护的二硫化基团的稳定性会改进并由此促进合成60。二硫桥可随后在较晚阶段中再生。
发明人的合成计划包括三个关键转换(图4和5):i)将二硫桥作为二环硫缩醛进行保护;ii)通过负碳离子化学过程使硫缩醛环的C-3和C-6位置官能化;以及iii)使二硫桥再生。将市售的1,4-二甲基-2,5-二酮哌嗪1溴化,然后使2与硫代乙酸钾反应,随后在酸性条件下去除3中的乙酰基,从而以良好的整体收率提供了顺式和反式二巯基化物4的混合物(图4)。通过二巯基化物与对茴香醛和三氟化硼醚合物的反应,以高收率获得硫缩醛5。已知硫缩醛的形成由二巯基化物的顺式和反式异构体开始进行60。用强碱在桥头位置对5进行位置选择性去质子化61,随后与苄氧基甲基氯(BOM氯化物)反应,从而以良好的收率提供单取代的硫缩醛7。同样地,使5与2当量的强碱反应,然后添加两当量的BOM氯化物,从而提供化合物9。9中单个苄基的位置选择性去除可用一当量的三氯化硼来进行,从而形成醇10。两个苄基皆可通过用两当量的三氯化硼处理9来去除,从而形成二醇12,其乙酰化后得到二乙酸酯13。硫缩醛7、10和13中二硫桥的再生使得分别形成单环ETP化合物8、11(LS75)和14。所有产物都通过制备型反相HPLC来提纯,其身份和纯度通过NMR和质谱法确认。
图5中概述了桥接的硫缩醛二聚体的制备。用强碱使硫缩醛7的桥头位置去质子化,然后与过量α,α’-二溴对二甲苯反应,产生中间体15,其与由7生成的负碳离子的第二等价物反应,从而转化为硫缩醛二聚体16和21。通过用三氯化硼处理16或21来完成苄基保护基团的去除。按如下方法将受保护的硫缩醛转化为桥接的ETP:用间氯过氧苯甲酸氧化以形成单亚砜,用THF中的70%高氯酸进行处理而将单亚砜原位转化为ETP。产物19(LS69)和24(LS72)通过以下方式提纯:制备型TLC;或者反相HPLC,其利用5%~95%梯度的乙腈和水,以及0.05%的三氟乙酸(TEA)。为了利于表征,还将醇19和24乙酰化以产生二乙酰衍生物20和26。
为了比较ETP的生物效应和展示二硫桥的重要性,还合成了亚二甲苯基桥接的双(1,4-哌嗪-2,5-二酮)(DKP)NP481。此化合物在结构上与ETP LS69相似,但其缺少二硫桥。合成的ETP的活性可与细胞培养物中的DKP化合物的活性直接比较。
结果
LS69和LS72结合p300的CH1结构域
在对二聚ETP LS69和LS72进行更严格的生物物理学和生物学表征之前,重要的是先表征其与靶标p300CH1结构域的热力学结合性质。发明人在DTT的存在下进行了SPR实验,以模拟存在于细胞内环境中的还原性环境。从SPR传感图清楚可见,LS69和LS72都以高亲和力直接结合至人类p300的带GST标签的CH1结构域(aa残基323-423)。
针对LS69,发明人确定了结合速率(ka)为6.97×103±0.157M-1s-1,并且在结合步骤之后的洗涤步骤中针对LS69获得的解离速率kd为1.33×10-2±1.72×10-4s-1。因此通过针对LS69与p300的CH1结构域结合的SPR分析而测量的结合常数为“解离速率/结合速率”,其给出KD值=1.09μM。
针对LS72,通过SPR分析获得的结合速率ka为4.25×103±85.8,而在后面的洗涤步骤中获得的解离速率kd为1.54±0.14×10-2s-1。因此针对LS72获得的结合常数为KD=3.62μM。基于这些数据,LS69和LS72都可逆地结合至p300-CH1-GST,并且展现了快速的结合速率和缓慢的解离速率,从固定在芯片表面上的蛋白上逐渐解离。对照DKP NP481在最高达5.0×10-5M的任何试验浓度下都未结合(未示出数据)。
设计的ETP下调缺氧诱导型启动子的活性
发明人首先检查了所设计的ETP对于HIF1诱导型启动子的活化的影响。发明人使用了MDA-MB-231乳腺癌细胞系,其含有染色体整合的载体构建体,所述构建体具有5个拷贝的源自人VEGF基因的5’-未翻译区域(UTR)的缺氧响应元件(HRE)62。它们在与肿瘤缺氧相关的低氧紧张环境下显示出了优异的转录活化63。在发明人的萤光素酶报告基因测定中使用了这些细胞系。在实验过程中,将细胞与ETP LS69、LS72、LS75和DKP化合物NP481一起温育。平行地,将仅添加了载质(DMSO)的未处理的细胞用作对照。通过将细胞与300uM甲磺酸去铁胺温育18小时来诱导缺氧条件。将细胞收获,裂解,并通过光度计确定萤光素酶水平。
测量结果在图8中示出,其中柱状图表明诱导的与未诱导的萤光素酶水平的比率。在无化合物时,将细胞置于缺氧条件中使报告基因的表达水平增加了约56倍。用毛壳菌素CTM以及合成的ETP化合物LS69和LS72处理细胞导致了缺氧诱导型启动子活性的显著降低(图8)。所观察到的效果是剂量依赖性的。相比之下,用单环ETP LS75进行处理仅导致启动子活性的小幅降低。同样地,用DKP化合物NP481进行处理导致了最小程度的启动子活性降低,并且未显示出剂量依赖性。
对缺氧诱导型转录的体外抑制
发明人使用实时定量RT-PCR测定来确定用ETP化合物和对照DKP化合物处理过的缺氧细胞中的VEGF mRNA的相对水平。平行地,将用载质处理过的细胞用作对照。在确定相对转录水平时,将β-葡萄糖醛酸糖苷酶基因的mRNA水平用作对照。
在缺氧条件下培养的MCF7细胞中,合成的ETP化合物LS69和LS72下调了VEGF(图9),其水平堪比或在某些情况下超越了用毛壳菌素时观察到的水平。因此,浓度为600nM的LS69将VEGF表达抑制了约65%,从而与未诱导(常氧)的细胞中的VEGF mRNA水平接近。所观察到的效果是剂量依懒性的。对照化合物NP481未显示出对VEGF水平的抑制效果。
发明人还试验了本发明的化合物在不同细胞系中对VEGF基因表达水平的影响。选择HeLa细胞进行此测定。用200nM浓度的毛壳菌素、LS69或LS72进行处理,导致VEGF mRNA水平降低约50%。
c-Met基因是缺氧诱导型转录因子系统的另一个重要的下游基因靶标。其在其起启动子区域中具有五个重复的HRE序列,Comoglio等已示出HRE 4和HRE 5主要负责c-Met基因的缺氧诱导型转录。c-Met基因启动子序列中的HRE 4和HRE 5的突变或缺失显著减少了对其转录的缺氧诱导型诱导。在许多癌细胞系中,c-Met的mRNA及蛋白水平在缺氧下显著上调,而这些癌细胞系中的大部分通常实际上是转移性的。
LS72在MCF7乳腺癌细胞系和A549肺上皮腺癌细胞系中的细胞毒性
在用ETP作为转录抑制剂时出现的一个潜在问题是其细胞毒性。因此,为了排除对转录机制的非特异性的总体效果,仔细评估细胞毒性对于充当转录抑制剂的每个小分子而言都至关重要。
发明人进行了细胞毒性实验,以便获得LS72在MCF7乳腺癌细胞系和A549肺腺癌细胞系中的EC50值。目标是确定可行浓度的区间,并且在这些细胞系中以显著低于EC50值的浓度进行转录抑制实验。
在我们先前的工作中64,我们报告了毛壳菌素在MCF7细胞中的EC50值为180nM。发明人发现新设计的LS72与毛壳菌素相比对MCF7细胞的细胞毒性小得多。在MCF7细胞中的MTT细胞毒性测定中,在用LS72处理24小时之后获得的EC50值为547nM(图10)。基于MCF7细胞中LS72的这个EC50值,发明人选择在MCF7中在400nM的最大浓度下测量其对HIF诱导型转录的影响。这是重要的,目的是使因细胞活力降低而带来的对mRNA水平的非特异性效果最小化。
细胞系A549是非小细胞型的肺上皮腺癌,已知其在缺氧条件下展现出了关键HIF1α诱导型基因的显著上调,例如c-Met、VEGF和Glut1。在该细胞系中进行的活力测定中,与MCF7细胞系相比,ETP显示了更低的细胞毒性。在Kahn改性的F-12培养基中用毛壳菌素和LS72处理24小时之后,观察到了EC50>10μM。因此,将对细胞的处理延长至48小时,以便更好的确定其细胞毒性。
对A549细胞系中的毛壳菌素和LS72,进行48小时MTT细胞毒性测定。在处理48小时后,由此测定获得的LS72的EC50为2.8μM(图11~12)。此值是在处理24小时之后于MCF7细胞系中获得的EC50值的约五倍。这些数据表示,与MCF7细胞相比,A549细胞系在面对处理时稳健得多。另外,LS72对于细胞的毒性明显比毛壳菌素低得多。由于ETP模块在LS72和毛壳菌素中是共有的,发明人只能推测毛壳菌素的毒性更高可能归因于其环色氨酸(cyclotryptophan)模块,该模块在LS72中不存在。
在A549肺腺癌细胞系中用LS72调节HIF1α诱导型转录
找到始终展现出缺氧诱导基因的高转录活性的良好体外模型是具有挑战性的任务。在评价多种细胞系之后,发明人把注意力集中于A549细胞,一种非小细胞肺腺癌细胞系。已报道了A549细胞系在缺氧条件下产生关键HIF诱导型基因的稳健上调。特别地,Comoglio等15报道了在缺氧条件下,A549细胞系中c-Met mRNA水平显著上调。
在用培养基中的各种血清水平和各种缺氧诱导方法进行试验之后,对于诱导HIF1α依赖性基因表现出显著的和持续性的良好效果的条件是:将A549细胞保持在2%血清中,然后在具有0.2%血清的培养基中用化合物或对照处理细胞48小时(图13)。在这些条件下(其中缺氧袋是诱导LOX基因的最佳选择),导致许多其它HIF1α诱导型基因上调的最佳缺氧响应是用300μM DFO进行处理。
图13显示了LS72处理对三种重要基因VEGF、Glut1和c-Met的水平的影响,已知这些基因在缺氧条件下在许多实体瘤中上调。
用LS72进行处理使得VEGF、Glut1和c-Met基因的缺氧响应显著降低。VEGF水平降低了50%,而Glut1mRNA水平降低了超过60%。c-Met也显著下调,基本达到其常氧水平(图13)。
LOX(赖氨酰氧化酶)是另一种在缺氧下上调的基因,并且该蛋白在癌组织的侵入行为和转移期间参与调控细胞外基质65。LOX基因在用缺氧袋诱导48小时后显示出良好诱导,并且在用LS72处理后显示出转录活性的显著下调。CXCR4是一种对于损伤愈合期间的干细胞和祖细胞的趋化性而言必不可少的基因,其也与癌干细胞的迁移有关66。SDF1-CXCR4轴导致祖细胞和干细胞向癌组织或创伤的趋化性,随后这些细胞分化。在发明人的A549细胞模型系统中,在用DFO或缺氧袋化学诱导缺氧之后,CXCR4也上调了超过100倍。在用浓度400nM的LS72处理后,针对CXCR4基因观察到了优异的转录活性抑制(图14)。
总体上,在上述条件下的A549细胞系成为研究HIF1α诱导型基因表达的非常好的模型。所有上述五种基因不仅显示了肿瘤发生中所涉及的许多关键基因的HIF1α诱导型转录的高度上调,同时在给定的条件下在LS72存在时显示出常氧下转录活性的极小变化。
在获得VEGF、c-Met、Glut1、LOX和CXCR4五种基因(它们受到HIF1α转录系统的上调,并在受到400nM的LS72处理后下调)的大幅转录诱导之后,下一个合理步骤是研究药物剂量响应。在100nM、400nM和1600nM三种不同的浓度下研究LS72对HIF1α诱导型转录的调节作用。
在具有300μM DFO的无血清F-12K培养基中,在85%细胞融合时进行缺氧诱导。
对于每个LS72浓度,也存在对照样品,其中用LS72处理细胞但没有诱导缺氧。对照显示出在常氧中的三种不同浓度的LS72下VEGF转录水平没有显著改变,这突显了以下事实:在这些条件中,由于应激或一些其它途径,LS72未显示出转录水平的升高或降低。在缺氧下,LS72显示了VEGF基因的HIF1α诱导型转录的剂量依赖性降低(图15)。
在这些对高度融合的细胞诱导的缺氧条件下,c-Met基因显示出增强的转录上调。c-Met mRNA在缺氧中上调超过5倍。在用LS72处理后,对c-Met观察到转录上调的剂量依赖性降低(图16)。
Glut1在高度融合的细胞中显示出了10倍的诱导。在100nM、400nM和1600nM的LS72下,Glut1还显示出了缺氧转录上调的剂量依赖性降低(图17)。
CXCR4是在缺氧条件下上调的G蛋白偶联受体。发明人选择A549细胞并用DFO诱导缺氧,发现在85%融合的细胞中CXCR4基因水平在转录上过表达了超过650倍。在用浓度400nM和1600nM的LS72处理后,可观察到CXCR4的mRNA水平的剂量依赖性降低(图18)。这些发现不仅显示了CXCR4在缺氧条件下在A549中受到转录诱导,还显示了其可被靶向HIF1α途径的小分子下调。
LS72下调VEGF和c-Met蛋白水平
在获得一些关键的HIF-1诱导型基因(包括VEGF和c-Met)的转录的显著下调之后,发明人研究了VEGF和c-Met的蛋白水平,以查明在mRNA水平上观察到的下调是否也被翻译成相应的蛋白水平的下调。进行蛋白质印迹来测量在各自用LS72处理的MCF7和MDA-MB-231细胞系中的VEGF和c-Met的蛋白水平。在用300μMDFO进行了HIF1α诱导的MCF7细胞中,VEGF蛋白水平在毛壳菌素(200nM)和LS72(400nM)下显示出了显著下调(图19a)。在MDA-MB-231细胞中用毛壳菌素(200nM)和LS72(400nM)处理后,在HIF1α所诱导的蛋白水平方面,c-Met蛋白水平也显示出了的显著下调(图19b)。
基因表达谱和微阵列分析
由于靶蛋白p300和CBP是多向性多结构域辅活化剂,其CH1区含有多种转录因子的结合部位。使用ETP进行基因调控的一个潜在顾虑点是特异性,因为抑制CBP/p300与除HIF1α之外的转录因子之间的相互作用可产生大量的受影响的基因。为了排除ETP的非特异性的全基因组影响,发明人使用含有代表28,869个转录本的寡核苷酸序列的Affymetrix Human Gene ST 1.0阵列用LS72进行了体外基因表达谱实验67,68。
为了查询细胞基因组的整体效果,使用了用400nM的LS72处理过的MCF7细胞。用浓度为400nM的LS72处理细胞,仅178个基因的表达受到的影响>2.0倍水平(图20)。相比之下,单独用DFO处理使329个基因的水平改变了>2.0倍。其中,88个基因下调>2.0倍,而90个基因上调>2.0倍。在DFO诱导的缺氧条件下用LS72处理的细胞中,发明人鉴定出了190个基因受此化合物影响。进行聚类分析来鉴定不同处理之间表达谱的相似性(图19)。
图21显示了在不同的缺氧和LS72(400nM)处理条件下基因的凝聚聚类(agglomerative clustering)。该聚类显示出,在许多基因中,LS72在缺氧下的效果是消除缺氧的效果,从而使得许多基因转录水平表现为与在载质(即,没有LS72处理的常氧)中所见的相似。
在DFO诱导的缺氧下用LS72处理的细胞的表达谱与仅用DFO时的表达谱差别很大。然而,在DFO诱导的缺氧下用LS72处理的细胞和在常氧条件下的细胞的表达谱显示出相似的区域。这表示,正如对于影响缺氧诱导基因的转录抑制剂所期望的,用LS72的处理降低了DFO处理对某些基因群的效果。不完全惊奇的是,鉴于缺氧响应中涉及的细胞信号传导途径的复杂性,受LS72和DFO影响的基因中存在一些重叠。结果也清楚地展示了在整个基因组的环境中LS72在其对缺氧诱导的效果方面的特异性。
表1列出了在MCF7细胞中用400nM LS72处理时在缺氧下下调的重要基因。从该基因列表中提取的数据显示了>2倍的变化。
有趣的是,许多属于溶质载体(SLC)蛋白家族的基因在缺氧下被LS72下调。将它们列在表2中。这显示,溶质载体蛋白在缺氧下上调以促进细胞中分子的更高的摄取和分泌,而LS72将此趋势颠倒。
用活体镜检法在小鼠肿瘤异种移植模型中进行LS72功效的体内研究
制备来自N2O2(乳腺癌)的肿瘤球体,并将其皮下植入裸小鼠中。使肿瘤血管化10~14天,之后在第0天经由尾静脉对小鼠注射1mg/kg的(±)-LS72。从第8天至第13天,每日对小鼠注射2mg/kg的(±)-LS72。在指定日期获得的活体镜检(IVM)图像在图22中示出。
图23显示了从IVM图像获得的肿瘤体积的量化。数据清楚地显示了在注射了(±)-LS72的小鼠#1和#2中,肿瘤脉管系统和肿瘤生长被显著抑制。在这些实验过程中,如通过观察动物的行为和监测其体重确认的,(±)-LS72对小鼠显示了非常低的毒性。发明人设计的双-ETP的这种低毒性使其与天然双-ETP毛壳菌素相比具有巨大的体内优势,据报道毛壳菌素对动物是有毒且甚至致命的,因为用毛壳菌素处理的小鼠在连续注射五天之后未存活。
在发明人的研究中,用(±)-LS72处理的小鼠在14天的处理后仍存活,并且未显示出任何急性毒性征兆。此研究证实了(±)-LS72作为体外癌细胞系中HIF-1诱导型基因表达和体内小鼠异种移植模型中肿瘤生长的抑制剂的功效。在足以维持体内肿瘤生长抑制的治疗浓度的试验范围内,(±)-LS72的毒性远小于毛壳菌素。
进行了额外的试验,其中使小鼠中的肿瘤血管化10~14天,其后在第0、8、10和12天经由尾静脉对小鼠注射1mg/kg的内消旋-LS72。如上所述获得各日期的活体镜检(IVM)图像。数据显示,注射了内消旋-LS72的小鼠的肿瘤脉管系统和肿瘤生长也被显著抑制。在这些实验过程中,如通过观察动物行为和监测其体重所确认的,内消旋-LS72也对小鼠显示了非常低的毒性。这确立了(±)-LS72和内消旋-LS72在抑制小鼠异种移植模型中肿瘤生长的体内功效。
讨论
如本文公开的,本发明的化合物能够在体外和体内破坏缺氧诱导型转录,并且对细胞生长和复制速率的有害影响很小。在缺氧乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB-231中,所设计的二聚LS72显示出VEGF和c-Met基因的HIF1α诱导型转录及其蛋白产物的显著下调。在肺腺癌细胞系A549中,LS72以剂量依赖性的方式使五种关键基因VEGF、c-Met、Glut1、LOX和CXCR4显著下调。发明人的基因表达谱实验对缺氧条件下的LS72的整体基因组效果提供了重要的深入观察。受LS72影响的基因的数量和类型与我们先前的结果一致,表示此化合物是具有清楚界定的药物基因组谱的高度特异的转录抑制剂。
材料和方法
总体方法
所有试剂和溶剂都从商业来源获得并按接收到的原样使用,除非另有说明。涉及水敏感性试剂的所有反应都用无水溶剂和火焰干燥的玻璃器皿在干燥N2气氛下进行。经由注射器将吸湿性液体转移并通过橡胶隔膜导入反应容器内。在30-150mm Hg下用旋转式蒸发器将反应产物溶液浓缩。用试剂级溶剂在硅胶(230~400目)上进行重力层析。在玻璃底的预涂覆板(0.25ram,硅胶60,F-254,EM Science)上进行分析型薄层层析。在指示的溶剂中,于Varian Unity 300MHz或者Bruker 250MHz、500MHz或600MHz仪器上收集核磁共振(NMR)谱。参照四甲基硅烷(0ppm)、或由溶剂CDCl3的不完全氘化所得的信号(7.26ppm)或CD3OD的多重峰的中心线(3.31ppm),按ppm计的化学位移(δ)报告峰位。13C NMR谱参照CDCl3(77.0ppm)或CD3OD(49.2ppm)的信号。耦合常数(J)以赫兹(Hz)为单位报告。使用以下缩写:单峰(s)、双峰(d)、三峰(t)、四峰(q)、双双峰(dd)、双三峰(dt)、宽峰(br)。
桥二硫二酮哌嗪的合成与表征
1,4-二甲基-2,5-哌嗪二酮-3,6-二溴化物(2)的制备
历时1小时向肌氨酸酐(1.42g,1mmol,1当量,Avocado,Inc.)浆料的邻二氯苯(30mL)溶液中逐滴添加溶于邻二氯苯(10mL)中的溴(1.03mL,3.2g,20mmol,2当量)。立即形成黄色沉淀。将反应混合物加热至150℃并连续搅拌直至不再放出气体。随后将混合物冷却至室温并且逐渐添加己烷(200mL)。沉淀出淡黄色晶体,将混合物在4℃放置过夜。滤出晶体并真空干燥。使粗产物从氯仿-乙醚混合物中再结晶以得到1.62g产物。收率54%,熔点128℃。1H-NMR(CDCl3,TMS,ppm)δ:6.00(s,2H),3.07(s,6H)。
1,4-二甲基-2,5-哌嗪二酮-3,6-二硫代乙酸酯(3)的制备
于4℃历时约1小时向溶于氯仿(50mL)和丙酮(50mL)混合物中的Et3N(3.1mL,22mmol)和粗产物2(20mmol)的溶液中分份添加硫代乙酸钾(6.2g,54mmol,2.7当量)。将反应混合物在4℃下再搅拌3小时。用NMR记录的样品未显示起始原料。将混合物在减压下蒸发,将残留物溶于二氯甲烷并用水洗涤有机相数次,在MgSO4下干燥并在旋转蒸发器上减小体积。将具有一些结晶物质的深色浆液混合物溶于EtOAc,并添加己烷直至溶液变得浑浊。过滤所形成的结晶物质,干燥,得到3.3g(54%)的产物3,熔点204℃。1H-NMR(CDCl3,TMS,ppm)δ:2.95(s,6H),2.49(s,6H)。
1,4-二甲基-2,5-哌嗪二酮-3,6-二巯基化物(4)的制备
将硫代乙酸酯(3,1.33g)悬浮在无水MeOH(40mL)中,并添加无水乙醚(40mL)中的1M HCl。将反应混合物搅拌并回流2小时。浆料变成淡黄色,溶液缓慢变澄清。用TLC监视起始原料的消失,并在2小时后确定为完成。将溶液在真空中浓缩,将残留物溶于氯仿并蒸发。再次重复氯仿溶解-蒸发过程以得到4,0.8g(85%)。记录粗制化合物的NMR谱。熔点108℃。1H-NMR(CDCl3,TMS,ppm)δ:5.00(d,2H,J=10.3Hz),3.09(s,6H),3.06(d,2H.J=10.2Hz)。
3-(4-甲氧基苯基)-6,8-二甲基-2,4-二硫杂-6,8-二氮杂双环[3.2.2]壬烷-7,9-二酮(5)的制备
将粗产物4(1.11g)和对茴香醛(4.1mL)溶于二氯甲烷(50mL)。向受搅拌的该溶液中添加三氟化硼醚化物(250μL)。在室温下搅拌16小时之后,将溶液倒入饱和碳酸氢钠溶液中。用二氯甲烷充分萃取水层,并且将有机相在Na2SO4上干燥。在将溶剂蒸发之后,用TLC(二氯甲烷-EtOAc,7:3,Rf 0.45)测试残留物并记录粗产物的NMR。粗产物的NMR显示了靶化合物和过量的对茴香醛。将粗产物混合物溶于二氯甲烷,并且用乙醚沉淀出产物,以得到590mg纯化产物。从母液中结晶出第二部分的产物,得到260mg产物。总量为850mg的5(50%),熔点269℃。1H NMR(CDCl3,TMS,ppm)δ:7.38(d,J=8.9Hz,2H),6.87(d,J=8.9Hz,2H),5.15(s,1H),5.03(s,1H),4.87(s,1H),3.80(s,1H),3.20(s,3H),3.07(s,3H)。
1,4-二甲基-2,5-哌嗪二酮-3,6-二硫化物(6)的制备
将硫缩醛(5)(18mg,0.056mmol,1当量)溶于无水二氯甲烷(15mL),并将溶液冷却至0℃。向受搅拌的该溶液中添加间氯过氧苯甲酸(15mg,0.067mmol,1.2当量,最大77%纯)。在0℃下搅拌10分钟之后,添加二甲基硫醚(20μL)。随后将溶液用25μL的高氯酸(在甲醇中)(1:5)进行处理。将溶液在室温下放置8小时,然后将其倒入饱和碳酸氢钠溶液中。用二氯甲烷萃取水层。用水洗涤二氯甲烷溶液,在MgSO4下干燥并在真空下浓缩,以得到18mg的粗产物。用Et2O洗涤白色沉淀物以获得8mg(71%)的纯化产物(6)。1H-NMR(CDCl3,TMS,ppm)δ:5.22(s,2H),3.11(s,3H)。ESI MS:针对C6H8N2O2S2的计算值:204.0;实测值[M+H]+:204.8。
3-(4-甲氧基苯基)-6,8-二甲基-2-[(苯基甲氧基)甲基]-2,4-二硫杂-6,8-二氮杂双环[3.2.2]壬烷-7,9-二酮(7)的制备
将晶体5(388mg,1.2mmol,1当量)和苄基氯甲基醚(1,11mL,4.8mmol,4当量,749mg,1.25g,仅60%试剂)溶于无水THF(40mL)中。将溶液冷却至-78℃,并历时5分钟向受搅拌的混合物中逐滴添加1.54M在己烷中的正丁基锂(1.16mL)(1.8mmol,1.5当量)。在于-78℃将混合物搅拌10分钟之后,使所得红色浑浊溶液温热至室温并搅拌30分钟。TLC显示了一种主要产物和少量(~20%)起始原料。随后将饱和NaCl溶液添加到反应混合物中,并且用二氯甲烷萃取红色溶液。将二氯甲烷溶液用水洗涤两次,在MgSO4下干燥,并在真空中浓缩。将浆液在柱(己烷-乙酸乙酯,7-3;Rf 0.43)上分离,以得到作为灰白色粉末的364mg的5(68%)。1H-NMR(CDCl3,TMS,ppm)δ:7.36(m,5H),7.31(d,J=8.7Hz,2H),6.84(d,J=8.7Hz,2H),5.11(s,1H),5.04(s,1H),4.74(d,J=11.2Hz,1H),4.54(d,J=11.2Hz,1H),4.22(d,J=10.5Hz,1H),3.82(d,J=10.5Hz,1H),3.79(s,3H,3.23(s,3H),3.10(s,3H)。FAB-MS:针对C22H24N2O4S2的计算值:444.1;实测值[M+H]+:445.1。
1,4-二甲基-2-[(苯基甲氧基)甲基]-2,5-哌嗪二酮-3,6-二硫化物(8)的制备
将提纯的7(9.2mg,0.021mmol,1当量)溶于无水二氯甲烷(4mL),并将溶液冷却至0℃。向受搅拌的该溶液中添加间氯过氧苯甲酸(5.5mg,0.025mmol,1.2当量,77%纯)。在0℃搅拌10分钟之后,添加二甲基硫醚(4.6μL)。随后将溶液用9.2μL高氯酸(在甲醇中)(1:5)进行处理。将溶液在室温下放置2小时,然后在0℃下放置18小时。反应混合物随后进行HPLC。在18小时后,不再变化。将混合物在真空下蒸发并通过制备型HPLC分离,以得到3.5mg(49%)的纯化合物8。1H-NMR(CDCl3,TMS,ppm)δ:7.38(m,5H),5.26(s,1H),4.72(d,J=1.8Hz,2H),4.22(d,J=1.8Hz,2H),3.12(s,3H)。
3-(4-甲氧基苯基)-6,8-二甲基-2,4-二[(苯基甲氧基)甲基]-2,4-二硫杂-6,8-二氮杂双环[3.2.2]壬烷-7,9-二酮(9)的制备
将硫缩醛5(227mg,0.7mmol,1当量)和1mL苄基氯甲基醚(546mg,3.5mmol,5当量,60%商业来源的试剂)溶于无水THF(35mL)中,并将溶液冷却至-78℃。历时10分钟向受搅拌的溶液中逐滴添加1.54M在己烷中的正丁基锂(1mL,1.54mmol,2.2当量)。在于-78℃将混合物搅拌10分钟之后,使反应温热至室温。这需要约30分钟。TLC显示了一种主要产物且无起始原料。将饱和NaCl溶液添加到反应混合物中,并且用二氯甲烷萃取红色溶液。将二氯甲烷溶液用水洗涤两次,在MgSO4下干燥,并在减压下浓缩。将油状残留物经由硅胶上的柱层析法分离,以得到185mg的双取代产物9(47%)。1H NMR(CDCl3,TMS,ppm)δ:7.38(m,10H),7.31(d,J=8.7Hz,2H),6.86(d,J=8.5Hz,2H),5.00(s,1H),4.76(d,J=12.3Hz,1H),4.74(d,J=12.0Hz,1H),4.71(d,J=11.0Hz,1H),4.61(d,J=12.0Hz,1H),4.57(d,J=12.3Hz,1H),4.49(d,J=10.6Hz,1H),4.30(d,J=10.7Hz,1H),3.83(d,J=11.1Hz,1H),3.80(s,3H),3.29(s,3H),3.20(s,3H)。FAB-MS:对于C30H32N2O5S2的计算值:564.1;实测值[M+H]+:565.1。
3-(4-甲氧基苯基)-6,8-二甲基-2-[(苯基甲氧基)甲基]-4-甲基羟基-2,4-二硫杂-6,8-二氮杂双环[3.2.2]壬烷-7,9-二酮(10)的制备
将280mg的9(0.5mmol,1当量)在二氯甲烷(30mL)中的溶液冷却至0℃。历时30秒向其中逐滴添加在二氯甲烷中的1M三氯化硼(625μL,0.625mmol,1.25当量)。将所述溶液在0℃下搅拌10分钟,然后将其倒入冰水中。用二氯甲烷萃取水相。将二氯甲烷溶液用水洗涤,在MgSO4下干燥,并在真空下浓缩,从而获得350mg的粗产物。将玻璃质固体在二氯甲烷-EtOAc混合物(85-15)(Rf 0.44)中经由硅胶上的柱层析法提纯,从而得到175mg的10(74%)。1H NMR(CDCl3,TMS,ppm)δ:7.30(m,5H),7.28(d,J=8.7Hz,2H),6.83(d,J=8.7Hz,2H),5.00(s,1H),4.69(d,J=12.3Hz,1H),4.56,(d,J=12.3Hz,1H),4.46(d,J=10.7Hz,1H),4.30(dd,J=12.6和5,4Hz,1H),3.99(dd,J=12.6和9.9Hz,1H),3.77(s,3H),3.73(d,J=10.6Hz,1H),3.31(s,3H),3.15(s,3H),3.15(m,1H)。FAB-MS:针对C23H26N2O5S2的计算值:474.1;实测值[M+H]+:475.1。
1,4-二甲基-2-甲基羟基-5-[(苯基甲氧基)甲基]-2,5-哌嗪二酮-3,6-二硫化物(11)的制备
将提纯的10(20mg,0.035mmol,1当量)溶于无水二氯甲烷(10mL),并将溶液冷却至0℃。向受搅拌的溶液中添加间氯过氧苯甲酸(10mg,0.043mmol,1.2当量,最大77%纯)。在0℃下搅拌10分钟之后,添加二甲基硫醚(13μL)。随后将溶液用16μL高氯酸(在甲醇中)(1:5)进行处理。将溶液在室温下放置8小时,然后将其倒入饱和碳酸氢钠溶液中。用二氯甲烷萃取水层。将二氯甲烷溶液用水洗涤,在MgSO4下干燥并在真空下浓缩,以得到18mg的粗产物。用Et2O洗涤白色沉淀物以获得8mg(71%)的最终纯产物11。1H NMR(CDCl3,TMS,ppm)δ:7.38(m,5H),4.76(d,J=11.9Hz,1H),4.71(d,J=12.1Hz,1H),4.36(d,J=12.0Hz,1H),4.28(d,J=11.1Hz,1H),4.24(d,J=12.6Hz,1H),4.23(d,J=11.1Hz,H),3.18(s,3H),3.16(s,3H)。
3-(4-甲氧基苯基)-6,8-二甲基-1,5-二(羟甲基)-2,4-二硫杂-6,8-二氮杂双环[3.2.2]壬烷-7,9-二酮(12)的制备
将40mg的9(0.071mmol,1当量)在二氯甲烷(10mL)中的溶液冷却至0℃。历时30秒向受搅拌的溶液中逐滴添加在二氯甲烷中的1M三氯化硼(180μL,0.18mmol,2.5当量)。将所述溶液在0℃搅拌10分钟,然后将其倒入冰水中。用二氯甲烷萃取水相。将二氯甲烷溶液用水洗涤,在MgSO4下干燥并且在真空下浓缩,从而获得35mg的粗产物。将结晶固体在TLC上测试并在二氯甲烷-丙酮混合物(8:2)(Rf 0.28)中在柱上提纯,从而得到25mg的12(93%)。1H NMR(CDCl3,TMS,ppm)δ:7.31(d,J=8.7Hz,2H),6.85(d,J=8.7Hz,2H),5.01(s,1H),4.64(dd,J=9.3和4.8Hz,1H),4.32,(dd,J=12.3和4.5Hz,1H),4.01(d,J=12.3和10.2Hz,1H),3.82(dd,J=9.3和4.2Hz,1H),3.79(s,3H),3.33(s,3H),3.21(s,3H),2.86(dd,J=9.9和4.8Hz,1H),2.56(dd,J=9.9和5.1Hz,1H)。FAB-MS:对于C16H20N2O5S2的计算值:384.0;实测值[M+H]+:385.1。
3-(4-甲氧基苯基)-6,8-二甲基-2,4-二[(乙酰氧基)]甲基-2,4-二硫杂-6,8-二氮杂双环[3.2.2]壬烷-7,9-二酮(13)的制备
将二醇12(3mg)溶于二氯甲烷(500μL)和吡啶(100μL)中,并且添加Ac2O(100μL)。在16小时后,用TLC未检测到起始原料,仅检测到新产物。用二氯甲烷(20mL)稀释溶液,添加冰并且将反应搅拌2小时。用饱和NaHCO3溶液洗涤有机层。在减压下蒸发之后,通过HPLC提纯残留物,从而得到3mg的产物13(82%)。1H NMR(CDCl3,TMS,ppm)δ:7.30(d,J=9.0Hz,2H),6.86(d,J=8.8Hz,2H),5.03(s,1H),4.64(dd,J=9.3和4.8Hz,1H),4.32,(dd,J=12.3和4.5Hz,1H),4.01(d,J=12.3和10.2Hz,1H),3.82(dd,J=9.3和4.2Hz,1H),3.79(s,3H),3.33(s,3H),3.21(s,3H),2.86(dd,J=9.9和4.8Hz,1H),2.56(dd,J=9.9和5.1Hz,1H)。
1,4-二甲基-3,6-二(乙酰氧基)甲基-2,5-哌嗪二酮-3,6-二硫化物(14)的制备
将提纯的13(30mg,0.055mmol,1当量)溶于无水二氯甲烷(8mL),并将溶液冷却至0℃。向受搅拌的溶液中添加间氯过氧苯甲酸(17mg,0.077mmol,1.4当量,最大77%纯度)。在0℃搅拌10分钟之后,添加二甲基硫醚(10μL)。随后将溶液用20μL高氯酸(在甲醇中)(1:5)进行处理。将溶液在室温下放置18小时,然后将其倒入饱和碳酸氢钠溶液中。用二氯甲烷萃取水层。将二氯甲烷溶液用水洗涤,在MgSO4下干燥并在真空中浓缩。通过HPLC提纯固体残留物以得到14,收率7mg(31%)。1HNMR(CDCl3,TMS,ppm)δ:4.97(d,J=12.6Hz,2H),4.76(d,J=12.6Hz,2H),3.13(s,6H),2.16(s,6H)。HRFAB-MS:对于C12H16N2O6S2的计算值:348.045;实测值[M+H]+:349.053。
3-(4-甲氧基苯基)-6,8-二甲基-1-[(苯基甲氧基)甲基]-5[(4-溴甲基苯基)甲基]-2,4-二硫杂-6,8-二氮杂-双环[3.2.2]壬烷-7,9-二酮(15)的制备
将受保护的硫缩醛(444mg,1mmol,1当量)和二溴对二甲苯(1.58g,6mmol,6当量)溶于无水THF(80mL)中,并冷却至-78℃。然后,在搅拌下历时3分钟逐滴添加1M LHMDS的THF溶液(1.3mL,1.3mmol,1.3当量)。在添加后,于-78℃再继续搅拌5分钟。随后移除冷却浴,并且使混合物温热并在室温下放置3小时。将饱和NaCl溶液添加到反应混合物中,并用CH2Cl2(3×50mL)萃取红色溶液。将合并的有机提取物在无水MgSO4上干燥,过滤并在减压下浓缩。在使用CH2Cl2的硅胶上通过柱层析法分离固体残留物,以得到产物388mg(77%收率)。1H NMR(CDCl3,TMS,ppm)δ:7.33(m,9H),7.13(d,J=8.4Hz,2H),6.85(d,J=8.8Hz,2H),5.08(s,1H),4.78(d,J=12.0Hz,1H),4.56(d,J=12.0Hz,1H),4.46(s,2H),4.37(d,J=16.8Hz,1H),4.32(d,J=10.5Hz,1H),3.85(d,J=10.5Hz,1H),3.80(s,3H),3.35(s,3H),3.15(d,J=16.8Hz,1H),2.97(s,3H)。13C NMR(CDCl3,ppm)δ:165.72,165.46,160.55,137.39,136.30,135.50,130.46,129.38,128.75,128.45,127.93,127.78,126.52,114.39,74.02,73.39,71.07,68.68,55.37,51.24,40.21,33.07,29.80,28.08。FABMS:对于C30H31BrN2O4S2的计算值:626.1;实测值[M+H]+:627.0。
3-(4-甲氧基苯基)-6,8-二甲基-1-[(苯基甲氧基)甲基]-5[(4-{3-(4-甲氧基苯基)-6,8-二甲基-1-[(苯基甲氧基)甲基]-2,4-二硫杂-6,8-二氮杂双环[3.2.2]壬烷-7,9-二酮-5-基}甲基苯基)甲基]-2,4-二硫杂-6,8-二氮杂双环[3.2.2]壬烷-7,9-二酮((16)和二{3-(4-甲氧基苯基)-6,8-二甲基-1-[(苯基甲氧基)甲基]-2,4-二硫杂-6,8-二氮杂双环[3.2.2]壬烷-7,9-二酮-5[(4-甲基苯基)甲基]}(21)的制备
将196mg的7(0.44mmol,1当量)和413mg的15(0.66mmol,1.5当量)在无水THF(60mL)中的溶液冷却至-78℃。历时30秒向受搅拌的溶液中逐滴添加在己烷中的2.5M正丁基锂(264μL,0.66mmol,1.5当量)。在将混合物于-78℃搅拌5分钟之后,通过TLC检查所述反应,并且其看起来像是存在新的色点,但有大量起始原料。逐渐添加额外的150μL的正丁基锂,但在每个部分(约30μL)之后,通过TLC测试反应混合物。最终,TLC显示没有起始原料7。在搅拌的同时使混合物温热至室温。这需要约30分钟。TLC显示一种主要产物和少量(约小于5%,二溴化物)起始原料。将有机溶液用150mL二氯甲烷稀释,并以饱和NaCl溶液洗涤数次。将有机溶液在MgSO4下干燥并在真空下浓缩。在己烷-EtOAc(6:4)的混合物中将固体残留物在柱上分离。存在两种新的二聚体:21(54mg,16%,Rf 0.42,HRFAB-MS:对于C60H62N4O8S4的计算值1094.345,实测值[M+H]+1095.356)和16(107mg,36%,Rf 0.35,FAB-MS:对于C52H54N4O8S4的计算值:990.282;实测值[M+H]+:991.291)。由此粗物料开始进行下一步骤。
5,5'-(1,4-亚苯基二(亚甲基))二(1-(苄氧基甲基)-3-(4-甲氧基苯基)-6,8-二甲基-2,4-二硫杂-6,8-二氮杂双环[3.2.2]壬烷-7,9-二酮)(16)
将7(0.33g,0.75mmol)在无水THF(15mL)中的溶液冷却至-78℃。然后,在搅拌下历时2分钟逐滴添加1M LHMDS的THF溶液(1.0mL,1.0mmol)。随后将溶于2mLTHF中的α,α'-二碘对二甲苯(88mg,0.25mmol)逐滴添加至反应混合物中,并使溶液温热至室温保持3小时。将水加入反应中,并用二氯甲烷(3×50mL)萃取混合物。将合并的有机提取物在无水MgSO4上干燥,过滤并在减压下浓缩。在使用CH2Cl2:己烷:EtOAc=5:4:1作为洗脱液的硅胶上通过柱层析法分离非对映异构体内消旋-16和(±)-16(0.20g,80%)的混合物。对于(±)-16,1H NMR(CDCl3,ppm)δ:7.33(m,14H),7.07(s,4H),6.84(d,J=8.8Hz,4H),5.06(s,2H),4.78(d,J=12.20Hz,2H),4.56(d,J=12.20Hz,2H),4.36(d,J=16.39Hz,2H),4.28(d,J=10.67Hz,2H),3.82(d,J=10.67Hz,2H),3.80(s,6H),3.34(s,6H),3.08(d,J=16.39Hz,2H),2.94(s,6H)。13C NMR(CDCl3,ppm)δ:165.76,165.50,160.45,137.27,133.72,130.43,128.78,128.44,127.92,127.84,126.52,114.31,73.97,73.39,71.00,68.51,55.35,51.03,40.23,29.80,28.08。HRMS(FAB)m/z:对于C52H55N4O8S4 +[M+H+]的计算值:991.290;实测值:991.291。
(±)-5,5'-(1,4-亚苯基二(亚甲基))二(1-(羟甲基)-3-(4-甲氧基苯基)-6,8-二甲基-2,4-二硫杂-6,8-二氮杂双环[3.2.2]壬烷-7,9-二酮),(±)-17
在搅拌下向冷却至0℃的(±)-16(0.13g,0.13mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中逐滴添加三氯化硼(在CH2Cl2中的1M溶液,320μL,0.32mmol)。将溶液在0℃下再搅拌10分钟,然后将其倒入冰冷的水(10mL)中,并用二氯甲烷(25mL)萃取。将有机层用水洗涤两次,用无水MgSO4干燥,并在减压下浓缩,从而获得作为白色固体的粗产物。通过柱层析法(硅胶,CH2Cl2/EtOAc=7:3)提纯粗产物以获得(±)-17(93mg,91%)。1H NMR(CDCl3,ppm)δ:7.32(d,J=8.8Hz,4H),7.03(d,J=8.8Hz,4H),5.08(s,2H),4.37(d,J=16.24Hz,1H),4.33(dd,J=12.60Hz和5.54Hz,2H),4.05(dd,J=12.6Hz和9.93Hz,2H),3.81(s,6H),3.42(s,6H),3.06(d,J=16.24Hz,2H),2.95(dd,J=9.93Hz和5.54Hz,2H),2.91(s,6H).13C NMR(CDCl3,ppm)δ:166.67,165.83,160.45,133.70,130.42,128.80,126.45,114.39,73.20,71.12,62.98,55.39,50.98,40.42,29.79,27.98。HRMS(ESI)m/z:对于C38H43N4O8S4 +[M+H+]的计算值:811.196;实测值:811.195。
(±)-4,4'-(1,4-亚苯基二(亚甲基))二(1-(羟甲基)-5,7-二甲基-2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮),(±)-18,LS69
在搅拌下向(±)-17(33mg,0.040mmol)在无水二氯甲烷(10mL)中的冰冷溶液中添加间氯过氧苯甲酸(22mg,77%最大含量,0.10mmol)。在0℃下搅拌10分钟之后,添加二甲基硫醚(10μL),然后用20μL 70%的高氯酸溶液(在甲醇中)(1:5)进行处理。将溶液在室温下放置9小时。将反应混合物倒入饱和碳酸氢钠中。用二氯甲烷(3×30mL)萃取溶液。将合并的有机提取物合并,在无水MgSO4上干燥,过滤并在减压下浓缩。通过柱层析法(硅胶,CH2Cl2/EtOAc=6:4)提纯玻璃质残留物以获得(±)-18(LS69)(11mg,33%)。1H NMR(DMSO-D6,ppm)δ:7.24(s,4H),5.90(t,J=5.50Hz,2H),4.33(dd,J=12.83Hz和5.50Hz,2H),4.23(dd,J=12.83Hz和5.50Hz,2H),3.89(d,J=16.04Hz,2H),3.73(d,J=16.04Hz,2H),3.13(s,6H),2.82(s,6H)。13C NMR(CDCl3,ppm)δ:165.35,164.92,133.45,128.89,76.33,75.91,59.12,35.50,28.31,27.89。HRMS(FAB)m/z:对于C22H26N4O6S4Na+[M+Na+]的计算值:593.063;实测值:593.063。
5,5'-((乙烷-1,2-二基二(4,1-亚苯基))二(亚甲基))二(1-((苄氧基)甲基)-3-(4-甲氧基苯基)-6,8-二甲基-2,4-二硫杂-6,8-二氮杂双环[3.2.2]壬烷-7,9-二酮)(21)
将15的溶液(2.14g,3.40mmol,1.0当量)冷却至-78℃,并且历时2分钟在搅拌下逐滴添加在己烷中的1.6M正丁基锂(2.77mL,4.43mmol,1.3当量)。在添加后,在-78℃再连续搅拌5分钟。随后移除冷却浴,并历时3小时使混合物逐渐温热至室温。将反应混合物倒入冰冷的水中并用二氯甲烷(3×50mL)萃取。将合并的有机提取物在无水MgSO4上干燥,过滤并在减压下浓缩,从而产生作为内消旋-21和(±)-21的混合物的产物。在使用CH2Cl2:己烷:EtOAc=5:4:1作为洗脱液的硅胶上通过柱层析法将产物从反应物中提纯,并将其用作下一步骤中的混合物。总收率:638mg(34%)。将所得产物的样品在使用相同洗脱液体系的硅胶上进行第二柱层析法,其中一部分外消旋(±)-21从(±)-21和内消旋-21的混合物中分离出,用于分析。对于(±)-21的分析数据:1HNMR(CDCl3,ppm)δ:7.34(m,14H),7.08(q,8H),6.85(d,J=8.8Hz,4H),5.07(s,2H),4.78(d,J=12.2Hz,2H),4.56(d,J=12.2Hz,2H),4.36(d,J=16.8Hz,2H),4.31(d,J=10.7Hz,2H),3.84(d,J=10.7Hz,2H),3.80(s,6H),3.34(s,6H),3.10(d,J=16.8Hz,2H),2.97(d,6H),2.86(s,4H)。13C NMR(CDCl3,ppm)δ:165.76,165.63,160.51,140.26,137.44,132.66,130.46,128.69,128.42,127.89,127.76,126.67,114.36,74.00,73.56,71.08,68.71,55.36,51.23,40.24,37.27,29.78,28.07。HRFABMS:对于C60H62N4O8S4的计算值:1094.345;实测值[M+H]+:1095.356。
5,5'-((乙烷-1,2-二基二(4,1-亚苯基))二(亚甲基))二(1-(羟甲基)-3-(4-甲氧基苯基)-6,8-二甲基-2,4-二硫杂-6,8-二氮杂双环[3.2.2]壬烷-7,9-二酮)(22)
在搅拌下向21(125mg,0.126mmol,1当量)在二氯甲烷中的冰冷溶液中逐滴添加在二氯甲烷中的1M三氯化硼溶液(320μL,0.32mmol,2.5当量)。将混合物在0℃放置15分钟,然后将其倒入冰冷的水中。用二氯甲烷(3×50mL)萃取水层。将合并的有机提取物在无水硫酸镁上干燥,过滤并在减压下蒸发。通过闪蒸柱层析法将粗反应混合物提纯,从而得到78mg作为白色固体的内消旋-22和(±)-22的产物混合物(75%组合收率)。在使用梯度为10%~50%的EtOAC(在二氯甲烷中)的硅胶柱上将内消旋-22和(±)-22的混合物进一步提纯以分离内消旋-22和(±)-22。(±)-22的分析数据:1HNMR(CDCl3,ppm)δ:7.32(d,4H),6.93(d,4H)6.89(d,4H),6.86(d,4H),5.08(s,2H),4.47(dd,J=6Hz,13Hz,2H),4.37(d,2H),4.26(m,2H),3.98(dd,J=10Hz,13Hz,2H),3.80(s,6H),3.41(s,6H),2.98(d,2H),2.84(s,6H),2.69(d,2H)。13C NMR(DMSO-d6,ppm)δ:165.42,165.19,160.06,140.00,132.93,130.52,128.53,128.42,126.82,114.38,73.47,71.51,60.79,55.29,49.91,40.14,36.36,29.60,27.96。FABMS:对于C46H50N4O8S4的计算值:914.3;实测值[M+Na]+:936.9。内消旋-7的分析数据:1H NMR(CDCl3,ppm)δ:7.33(d,4H),7.02(d,4H)6.99(d,4H),6.86(d,4H),5.09(s,2H),4.35(dd,J=10Hz,13Hz,2H),4.37(d,2H),3.11(m,2H),4.04(dd,J=10Hz,13Hz,2H),3.81(s,6H),3.41(s,6H),2.91(s,6H),2.85(s,4H)。13C NMR(DMSO-d6,ppm)δ:165.47,165.24,160.10,140.04,132.96,130.56,128.55,128.48,126.85,114.42,73.50,71.55,60.83,55.34,49.96,40.14,36.42,29.63,28.00。FABMS:对于C46H50N4O8S4的计算值:914.3;实测值[M+Na]+:936.9。
(±)-4,4'-((乙烷-1,2-二基二(4,1-亚苯基))二(亚甲基))二(1-(羟甲基)-5,7-二甲基-2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮)((±)-LS72,(±)-23)
将溶于35mL CH2Cl2中的二硫缩醛(±)-22(20mg,0.022mmol)装入50mL圆底烧瓶。将烧瓶冷却至0℃并添加过量的间氯过氧苯甲酸(15mg,77%含量,0.07mmol)。在0℃下搅拌30分钟之后,移除冰浴并添加二甲基硫醚(6.4μL,0.09mmol),然后添加三氟乙酸(126μL)。在室温下搅拌反应混合物3小时。向反应混合物中添加饱和碳酸氢钠水溶液(15mL)并分离有机层。用二氯甲烷(20mL)进一步萃取水层。将合并的有机层在无水Mg2SO4上干燥,过滤并在减压下浓缩。将玻璃质残留物溶于在乙腈中的50%DMSO中,并通过反相HPLC提纯,从而以61%的收率获得(±)-LS72((±)-23)。或者,为了提纯更大量的(±)-LS72,进行反应混合物的后处理结晶。简单而言,向残留物(25mg)中添加乙腈(2ml),并将混合物在室温下短暂超声处理以便将残留物溶解。将混合物冷却至4℃并维持在该温度2小时,其后将其在-20℃储存过夜。过滤移除上清液,并用冷却至-20℃的乙腈洗涤白色晶体。采用以上程序再次使上清液再结晶。利用水相中的乙腈(含有0.05%v/v的三氟乙酸)梯度(历时20分钟从40%至95%)通过分析型HPLC检验最终产物的纯度。1H NMR(CDCl3,ppm)δ:7.19(d,4H),7.07(d,4H),4.39(d,2H),4.30(d,2H),4.04(d,2H),3.59(d,2H),3.21(s,6H),2.96(s,6H),2.86(m,4H)。13C NMR(CDCl3,ppm)δ:166.85,165.57,140.65,131.58,129.07,128.81,75.80,75.18,61.21,37.22,36.51,28.59,27.53。HR-ESIMS:对于C30H34N4O6S4+H+的计算值:675.14;实测值[M+H]+:675.1401。
内消旋-4,4'-((乙烷-1,2-二基二(4,1-亚苯基))二(亚甲基))二(1-(羟甲基)-5,7-二甲基-2,3-二硫杂-5,7-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-6,8-二酮)(内消旋-LS72,内消旋-23)
通过与(±)-7类似的以下程序从二硫缩醛内消旋-22制备内消旋-LS72(内消旋-23)。收率60%,1H NMR(CDCl3,ppm)δ:7.21(d,4H),7.09(d,4H),4.39(d,2H),4.31(d,2H),4.04(d,2H),3.59(d,2H),3.21(s,6H),2.97(s,6H),2.87(m,4H)。13C NMR(CDCl3,ppm)δ:166.92,165.58,140.73,131.59,129.16,128.77,75.81,75.15,61.26,37.15,36.53,28.61,27.52。HR-ESIMS:对于C30H34N4O6S4+H+的计算值:675.14;实测值[M+H]+:675.1411。
(±)-22的手性分离:
将(±)-22(20mg,0.22mmol)和5mL二氯甲烷装入圆底烧瓶。在搅拌下向此混合物中相继添加(1S)-(-)-莰烷酰氯(71mg,0.3mmol,1.4当量)、4-二甲基氨基吡啶(0.8mg,0.007mmol,0.03当量)和N,N-二异丙基乙胺(150μL,0.86mmol,3.9当量)。在室温下维持搅拌1小时。将反应混合物用0.1M HCl(5mL)洗涤并在无水MgSO4上干燥。在减压下移除溶剂以获得粗产物24(23mg,83%总收率)。通过柱层析法分离24的两个非对映异构体,所述柱层析法使用己烷中的10%CH2Cl2的初始溶剂体系,并且将CH2Cl2和EtOAc的量逐渐增加至己烷:EtOAc:CH2Cl2=4:3:3的最终溶剂体系。将获得的两部分分别命名为dst1-24(回收13mg)和dst2-24(回收10mg)。dst1-24的分析数据:1H NMR(CDCl3,ppm)δ:7.33(d,2H),7.09(d,2H),7.00(d,2H),6.87(d,2H),5.31(d,1H),5.11(s,1H),4.42(d,1H),4.36(d,1H),3.81(s,3H),3.40(s,3H),3.08(d,1H),2.88(s,3H),2.83(br,2),2.40(m,1H),2.02(m,1H),1.89(m,1H),1.68(m,1H),1.09(s,3H),0.97(s,3H),0.81(s,3H)。13C NMR(CDCl3,ppm)δ:177.78,166.42,165.86,164.81,160.94,140.68,132.58,130.79,129.03,128.42,126.10,114.69,91.01,73.54,70.13,63.05,55.62,55.10,54.62,51.83,40.28,37.53,30.90,29.87,28.92,28.47,16.77,16.67,10.05。dst2-24的分析数据:1H NMR(CDCl3,ppm)δ:7.33(d,2H),7.09(d,2H),7.02(d,2H),6.87(d,2H),5.28(d,1H),5.10(s,1H),4.43(d,1H),4.35(d,1H),3.81(s,3H),3.36(s,3H),3.12(d,1H),2.93(s,3H),2.84(br,2),2.33(m,1H),2.05(m,1H),1.90(m,1H),1.71(m,1H),1.10(s,3H),0.94(s,3H),0.91(s,3H)。13C NMR(CDCl3,ppm)δ:178.12,166.16,165.89,164.74,160.96,140.57,132.73,130.78,128.90,128.42,126.21,114.70,90.87,73.46,70.03,63.16,55.61,54.95,54.47,51.76,40.19,37.44,30.97,29.92,29.19,28.39,16.74,16.64,9.96。
向24的10mg每种非对映异构体中,添加1mL的碳酸氢钠在甲醇中的饱和溶液。将反应在室温下搅拌24小时。将反应通过短硅胶柱初步纯化,然后在反相HPLC上纯化。这两种非对映异构体的反应分别产生两种对映体en1-22或ent2-22(每种对映体回收6mg,74%)。CD谱确认了两种产物的对映体关系。
遵循与(±)-22类似的程序,从二硫缩醛ent1-22和ent2-22分别获得收率61%的ent1-LS72和ent2-LS72。如预期地,ent1-LS72、ent2-LS72和外消旋混合物的NMR数据相同。Ent1-ETP 21H NMR(CDCl3,ppm)δ:7.19(d,4H),7.07(d,4H),4.39(d,2H),4.30(d,2H),4.04(d,2H),3.59(d,2H),3.21(s,6H),2.96(s,6H),2.86(m,4H)。ent1-LS72:对于C30H34N4O6S4+H+的计算值:675.14;实测值[M+H]+:675.1416。ent2-LS72:对于C30H34N4O6S4+H+的计算值:675.14;实测值[M+H]+:675.1316。ent1-LS72和ent2-LS72的CD谱确认了对映体关系。
3-(4-甲氧基苯基)-6,8-二甲基-1-(苯基甲基)2,4-二硫杂-6,8-二氮杂双环[3.2.2]壬烷-7,9-二酮(26)的制备
将硫缩醛5(194mg,0.6mmol,1当量)溶于无水THF(25mL)中,并将溶液冷却至-78℃。历时1分钟向受搅拌的溶液中逐滴添加1.54M在己烷中的正丁基锂(545μL,0.84mmol,1.4当量)。在30秒之后,历时30秒向受搅拌的混合物中添加苄基溴(356μL,513mg,3mmol,5当量)。在将混合物于-78℃搅拌8分钟之后,使所得的红色浑浊溶液温热至室温并搅拌。这需要约30分钟。TLC显示了一种主要产物和少量(约5%)起始原料。将饱和NaCl溶液添加到反应混合物中,并且用二氯甲烷萃取溶液。将有机溶液用水洗涤两次,在MgSO4下干燥并在真空下浓缩。用己烷处理油状残留物。一部分物料成为固体,并移除己烷溶液。将黄色固体用己烷再次洗涤并在真空下干燥。将固体粗物料溶于二氯甲烷(2mL)中,添加甲醇(4mL)和己烷(约20mL)。滤出白色沉淀物,从而得到纯产物:100mg的26(40.8%)。1H NMR(CDCl3,TMS,ppm)δ:7.36(d,J=8.7Hz,2H),7.24(m,5H),6.88(d,J=8.7Hz,2H),5.19(s,1H),5.10(s,1H),4.15(d,J=16.6Hz,1H),3.82(s,3H),3.25(d,J=16.5Hz,1H),3.15(s,3H),3.11(s,1H)。
3-(4-甲氧基苯基)-6,8-二甲基-1-[(苯基甲氧基)甲基]-5-(苯基甲基)-2,4-二硫杂-6,8-二氮杂双环[3.2.2]壬烷-7,9-二酮(27)的制备
将晶体26(144mg,0.35mmol,1当量)和苯基氯甲基醚(500μL,455mg,1.75mmol,5当量,仅60%试剂)溶于无水THF(40mL)中。将溶液冷却至-78℃,并历时5分钟向受搅拌的混合物中逐滴添加1.54M在己烷中的正丁基锂(1.16mL,1.8mmol,1.5当量)。将混合物于-78℃搅拌10分钟之后,使所得的红色浑浊溶液温热至室温并搅拌。将饱和NaCl溶液添加到反应混合物中,并且用二氯甲烷萃取红色溶液。将有机相用水洗涤两次,在MgSO4下干燥并在真空下浓缩。将浆液在柱(己烷-乙酸乙酯,8-2,Rf 0.4)上分离,从而得到114mg作为玻璃状固体的27(62%)。1HNMR(CDCl3,TMS,ppm)δ:7.35(m,5H),7.28(d,J=8.8Hz,2H),6.86(d,J=8.7Hz,2H),5.02(s,1H),4.72(d,J=11.7Hz,1H),4.58(d,J=12.0Hz,1H),4.51(d,J=10.8Hz,1H),4.20(d,J=16.5Hz,1H),3.78(s,3H),3.74(d,J=10.5Hz,1H),3.25(d,J=16.9Hz,1H),3.19(s,3H),3.15(s,3H)。FAB-MS:对于C29H30N2O4S2的计算值:534.1;实测值[M+H]+:535.0。
3-(4-甲氧基苯基)-6,8-二甲基-1-羟甲基-5-(苯基甲基)-2,4-二硫杂-6,8-二氮杂双环[3.2.2]壬烷-7,9-二酮(28)的制备
将28(60mg,0.11mmol,1当量)在无水二氯甲烷(15mL)中的溶液冷却至0℃。历时30秒向受搅拌的反应混合物中逐滴添加在二氯甲烷中的1M三氯化硼(200μL,0.2mmol,1.8当量)。将所述溶液在0℃搅拌10分钟,然后将其倒入冰水中。用二氯甲烷萃取水相。将有机相用水洗涤,在MgSO4下干燥并且在真空下浓缩,从而获得38mg粗产物。将玻璃质固体在利用二氯甲烷-EtOAc(65-35,Rf 0.35)混合物的柱上提纯,从而得到28mg的纯28(57%收率)。1H NMR(CDCl3,TMS,ppm)δ:7.35-7.14(m,7H),6.86(d,J=8.5Hz,2H),5.04(s,1H),4.66(dd,J=5.1和12.5Hz,1H),4.24(d,J=16.5Hz,1H),3.87(dd,J=9.5和12.8Hz,1H),3.80(s,3H),3.25(d,J=16.3Hz,1H),3.24(s,3H),3.14(s,3H)2.73(dd,J=5.7和9.7Hz,1H)。FAB-MS:对于C22H24N2O4S2的计算值:444.1;实测值[M+H]+:444.9。
1,4-二甲基-3-羟甲基-6-苯基甲基-2,5-哌嗪二酮-3,6-二硫化物(29)的制备
将28(25mg,0.056mmol,1当量)在无水二氯甲烷(15mL)中的溶液冷却至0℃。向受搅拌的该溶液中添加间氯过氧苯甲酸(15mg,0.0672mmol,1.2当量,最大77%纯)。在0℃搅拌10分钟之后,添加二甲基硫醚(20μL)。随后将溶液用25μL的高氯酸(在甲醇中)(1:5)进行处理。将溶液在室温下放置9小时,然后将其倒入饱和碳酸氢钠溶液中。用二氯甲烷萃取水层。将有机相用水洗涤,在MgSO4下干燥并在真空下浓缩,从而得到10mg的粗产物。将玻璃质固体在利用二氯甲烷-EtOAc(97.5-2.5,Rf0.3)混合物的柱上提纯,从而得到4mg的29(22%收率)。1H NMR(CDCl3,TMS,ppm)δ:7.30(m,5H),4.34(d,J=8.0Hz,2H),4.08(d,J=12.8Hz,1H),3.65(d,J=13.0Hz,1H),3.50(d,J=7.9Hz,1H),3.22(s,3H),3.00(s,3H)。
合成的ETP的体外活性评价
使用三种生物学测定来评价我们的化合物在细胞培养物中的功效:1)用于测量HIF1诱导型启动子活性的基于萤光素酶的测定;2)通过定量型逆转录酶–聚合酶链反应来测量内源基因的信使RNA水平;和3)通过蛋白质印迹来分析VEGF水平和c-Met蛋白水平。
发明人采用这些测定来评价三种人细胞系中基因表达的相对水平:用主题ETP化合物、DKP对照NP481和毛壳菌素CTM处理HeLa(人子宫颈上皮腺癌)、MCF7(良性人类乳腺癌)和MDA-MB-231(恶性乳腺癌)。平行地,将未经处理的细胞用作对照。一式三份进行萤光素酶和ELISA实验,将RT-PCR实验重复六次。
萤光素酶试验。将MDA-MB-231-hRE-Luc细胞维持在增补有10%胎牛血清和0.4g/L遗传霉素(G418硫酸盐,RPI Corporation)的高葡萄糖Dulbecco改良的Eagles氏培养基(DMEM)中。利用1mL的6.5×104细胞/mL的悬液将细胞以6×104细胞/孔的密度平板接种到24孔盘(BD Falcon)中。在发生附着后,用含有浓度为10nM~1μM的合成ETP化合物或毛壳菌素的1mL新鲜培养基处理细胞。在具有5%CO2的潮湿气氛中将细胞在37℃下温育6小时。添加甲磺酸去铁胺(DFO,Sigma)至300μM的最终浓度来诱导缺氧,并且将细胞再温育18小时。用冰冷的PBS将细胞洗涤两次然后添加150μL细胞培养物裂解试剂(CCLR,Promega),从而分离出全细胞裂解物。收集裂解物,在4℃以13,000rpm离心,等分分装,并储存在-80℃。通过使全细胞裂解物和萤光素酶测定试剂(Promega)在使用前达到环境温度1小时来进行萤光素酶试验。用Turner TD-20e光度计依照制造商的操作说明(Promega)进行萤光素酶试验。进行布拉德福德测定来确定萤光素酶试验中所使用的裂解物的蛋白含量,由此将相对光强度测量结果归一化。简单地说,向在1.5mL比色杯中的200μL布拉德福德试剂和750μLMillipore水中,添加50μL的细胞裂解物/萤光素酶测定试剂混合物。用适量的1mg/mL BSA溶液产生1μg/mL~10μg/mL范围内的蛋白标准物。用DU-800分光光度计在595nM测量吸光度。实验以一式三份进行。结果呈现在图6中,其中条带图表示均值,误差条表示均值的标准误差。
细胞培养和mRNA的分离
根据公开的程序69将Hela细胞维持在增补有8%胎牛血清(Irvine Scientific)的高葡萄糖Dulbecco改良的Eagles氏培养基(DMEM,Sigma)中。利用2mL的6×104细胞/mL的悬液将细胞以1.5×105细胞/孔的密度平板接种到6孔盘(BD Falcon)中。在发生附着后,用含有浓度为10nM~1μM的合成ETP化合物或毛壳菌素的1mL新鲜培养基处理细胞。在具有5%CO2的潮湿气氛中在37℃下温育6小时后,添加甲磺酸去铁胺(DFO,Sigma)至300μM的最终浓度且将细胞再温育18小时,从而诱导缺氧。用冰冷的PBS将细胞洗涤两次并立即裂解。依据制造商的操作说明用RNeasy试剂盒(Qiagen)分离出总RNA,并通过UV吸光度来定量。将分离出的RNA用DNase I(Ambion,无DNA试剂盒)进一步处理以去除任何残留的基因组DNA。按照制造商的推荐用Powerscript II逆转录酶(Clontech)进行逆转录。
将MCF7细胞维持在增补有10%胎牛血清(Irvine Scientific)的RPMI-1640培养基(Sigma)中。利用2mL的1.2×105细胞/mL的悬液将细胞以2.4×105细胞/孔的密度平板接种到6孔盘中。在发生附着后,用含有浓度为10nM~1μM的合成ETP化合物或毛壳菌素的1mL新鲜培养基处理细胞。在具有5%CO2的潮湿气氛中在37℃下温育6小时后,添加甲磺酸去铁胺(DFO,Sigma)至300μM的最终浓度且将细胞再温育18小时,从而诱导缺氧。用冰冷的PBS将细胞洗涤两次并立即裂解。依据制造商的操作说明用RNeasy试剂盒(Qiagen)分离出总RNA,并通过UV吸光度来定量。将分离出的RNA用DNase I(Ambion,无DNA试剂盒)进一步处理以去除任何残留的基因组DNA。按照制造商的推荐用Powerscript II逆转录酶(Clontech)进行逆转录。
用affymetrix微阵列分析基因表达。采用实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)来确定在常氧条件和缺氧条件下ETP化合物对HeLa细胞中的VEGF和GLUT1基因的影响。对于VEGF分析,使用正向引物5’-AGG CCA GCA CAT AGG AGA GA-3’和反向引物5’-TTT CCC TTT CCT CGA ACT GA-3’将来自该基因的3’-翻译区的104bp片段扩增。对于GLUT1(SLC2A1)分析,利用以下序列以生产179bp的产物:正向序列5'-TAGAAA CAT GGT TTT GAA ATG C-3',反向序列5'-GGT AAC AGG GAT CAA ACA GATT-3’。通过对管家基因β-葡萄糖醛酸糖苷酶进行定量来将RNA水平标准化。对此基因使用正向引物5’-CTC ATT TGG AAT TTT GCC GAT T-3’和反向引物5’-CCG AGTGAA GAT CCC CTT TTT A-3’。使用Applied Biosystems SYBRGreen RT-PCR总混合液进行实验。用ABI 7300实时PCR仪器进行温度循环和检测SYBR绿色发射。用AppliedBiosystems序列检测系统1.2版分析数据。用来自六个独立实验的数据进行统计学分析。
VEGF和c-Met蛋白水平的蛋白质印迹分析。将MCF7和MDA-MB-231细胞平板接种到60mm直径的细胞培养盘(BD Falcon)中至1.0×106细胞/mL的密度。在附着之后,用含有毛壳菌素(200nM)、LS72和LS75(400nM)的培养基处理这些细胞。所有样品含有最终浓度为0.1%~0.2%v/v的DMSO。在温育6小时后,在MCF7中用300μM的DFO,在MDA-MB-231细胞中用150μM的CoCl2,来诱导缺氧。将样品再温育18小时。根据制造商的操作规程(Cell Signaling)用细胞裂解缓冲液从细胞中提取总细胞蛋白。用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce/Thermo Scientific)测量蛋白浓度。对等量的蛋白样品进行SDS-PAGE并电转染至PVDF膜(Bio-Rad)。首先用抗VEGF小鼠单克隆抗体(sc-57496,Santa Cruz Biotechnology)或抗c-Met兔多克隆抗体(sc-10,Santa Cruz Biotechnology)对其进行探测,用Restore Western Blot剥离缓冲液(Pierce/Thermo Scientific)进行剥离,并且用兔多克隆抗β-肌动蛋白抗体(4867,CellSignaling)再次探测。
在用tris缓冲盐水-吐温20(TBST)溶液洗涤之后,将膜与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(Santa Cruz Biotechnology)一起温育。用SuperSignal化学发光试剂盒(Pierce/Thermo Scientific)检测信号。
动物使用。在获得PRISM实验动物护理与使用委员会(IACUC)的审查和许可后,按照联邦指南进行动物实验。从Harlan购入了8~9周龄的无胸腺裸小鼠。
荧光肿瘤细胞系。在5%CO2的空气中,于37℃将N202(获赠于Joseph Lustgarten,Mayo Clinic,Scottsdale,AZ)维持在增补有L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素(100U/ml)、链霉素(100U/ml)、丙酮酸钠(1mM)(Invitrogen,Carlsbad,CA)和10%热灭活的FBS(Omega Scientific,Tarzana,CA)的高葡萄糖DMEM中。使用来自BOSH2BGFPN1载体70的SalI和钝端NotI位点,将组蛋白H2B-GFP亚克隆至LXRN载体(Clontech,PaloAlto,CA)的SalI/HpaI位点中,用活病毒转导N202以稳定地并入H2B-GFP基因。转导的细胞被FACs分选两次,以确保100%的细胞稳定表达H2B-GFP蛋白。
小鼠异种移植肿瘤模型。在小改动下使用经典IVM肿瘤模型71。将小鼠(通常是无胸腺裸小鼠(体重25~30g))麻醉(每100g体重腹膜内注射7.3mg盐酸氯胺酮和2.3mg甲苯噻嗪)并置于加热垫上。将钛框架置于小鼠的背部皮褶上以夹入延伸的双层皮肤中。随后切离15mm直径的全厚度圆形皮肤层。仔细地移除剩余皮肤顶部的浅筋膜以暴露出下面的肌肉和皮下组织,随后用具有玻璃盖片的另一钛框架将其覆盖,以形成窗口室。在1~2天的复原期后,植入肿瘤球体。肿瘤球体通过如下方式形成:将50,000个N202细胞置于1%琼脂涂覆的96孔非组织培养处理的平底盘上(100μl培养基中20μl细胞),并历时15分钟以2000rpm离心4次,在每次离心后旋转所述盘。在5%CO2的空气中,在37℃下再温育细胞3~7天(取决于细胞类型),以形成紧密球体。仅在窗口室中将肿瘤球体直接移植到背部皮肤上。历时10~14天使肿瘤血管化,然后在第0天注射1mg/kg的LS72化合物,之后在第8~13天每日施用2mg/kg。
肿瘤生长。通过IVM分析肿瘤生长。通过已描述的活体荧光镜检法72将肿瘤成像。利用Image-Pro Plus(Media Cybernetics,Bethesda,MD)从所记录的灰度为0~256的数字图像中线下分析肿瘤生长。通过量化肿瘤随时间的累积荧光信号来确定肿瘤生长。通过超过75的所有像素的信号求和来测量累积的肿瘤荧光信号。针对治疗后第0天的肿瘤将所有生长曲线归一化。
尽管本发明已经描述了特定的示例性实施方式和实施例,但是,应理解的是,本文公开的实施方式仅出于说明目的,本领域技术人员可以做出各种修改和变化,而不脱离所附权利要求所阐述的本发明的实质和范围。
表1
重要的HIF1α诱导型基因的列表,LS72(400nM)处理使DFO(300μM)的缺氧诱导下的这些基因下调。
表2
溶质载体(SLC)加族基因列表,在用LS72(400nM)处理后,在DFO(300μM)的缺氧诱导下这些基因在MCF7细胞中下调。
参考文献
包含前述在内的本文中所有的参考文献都通过引用以其整体并入本文。
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Claims (8)
1.式I的化合物以及其盐、溶剂合物和水合物:
其中n=1、2、3、4;
各二酮哌嗪环的中心之间的距离为4埃~32埃;
各二酮哌嗪环的中心之间优选的距离为10埃~22埃;
R1和R2独立地选自由氢、烷基、具有取代基的烷基、氨基烷基和芳基组成的组;
R3选自由H、烷基、氨基烷基、PEG和酰基组成的组;
Y选自由(CH2)k、(-CH2-CH2-O-)l、(-CH2-CH2-NH-)m、(-CH2-CH2-S-)n、(-CH=CH-)o、杂环和组成的组,其中X选自由(CH2)k、(-CH2-CH2-O-)l、(-CH2-CH2-NH-)m、(-CH2-CH2-S-)n、(-CH=CH-)o和杂环组成的组;且其中k、l、m、n、o各自独立地等于1、2或3;并且
R4选自由H、烷基和卤素组成的组。
2.式II的化合物以及其盐、溶剂合物和水合物:
其中n=1、2、3、4;
R1和R2独立地选自由氢、烷基、具有取代基的烷基、氨基烷基和芳基组成的组;
R3选自由H、烷基、氨基烷基、PEG和酰基组成的组;
X选自由(CH2)k、(-CH2-CH2-O-)l、(-CH2-CH2-NH-)m、(-CH2-CH2-S-)n、(-CH=CH-)o和杂环组成的组;且其中k、l、m、n、o各自独立地等于1、2或3;并且
R4选自由H、烷基和卤素组成的组。
3.式III的化合物,包括其盐、溶剂合物和水合物:
其中n=1、2、3、4;
R1和R2独立地选自由氢、烷基、具有取代基的烷基和芳基组成的组;
R3选自由H、烷基、氨基烷基、PEG和酰基组成的组;
X选自由(CH2)k、(-CH2-CH2-O-)l、(-CH2-CH2-NH-)m、(-CH2-CH2-S-)n、(-CH=CH-)o和杂环组成的组;且其中k、l、m、n、o各自独立地等于1、2或3;并且
R4=H、烷基或卤素。
4.一种药物组合物,所述药物组合物包含溶解或分散在载剂中的权利要求1~3中任一项所述的至少一种化合物。
5.一种干扰细胞中的缺氧诱导型转录途径的方法,所述方法包括:
使所述细胞与权利要求1~3中任一项所述的至少一种化合物接触。
6.一种治疗乳腺癌的方法,所述方法包括:
向有需要的受试对象施用有效量的权利要求1~3中任一项所述的至少一种化合物。
7.一种治疗需要所述治疗的患癌受试对象的方法,所述方法包括:
向所述受试对象施用有效量的权利要求1~3中任一项所述的至少一种化合物。
8.选自以下化合物的化合物:
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