JP2015519065A - 組み換え代謝微生物およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)メバロン酸(MVA)経路中の1つ以上の外来性酵素を発現しかつ/またはメバロン酸(MVA)経路中の1つ以上の内在性酵素を過剰発現し;かつ
(b)DXS経路中の1つ以上の外来性酵素を発現しかつ/またはDXS経路中の1つ以上の内在性酵素を過剰発現するよう
適合される。
a)チオラーゼ(EC 2.3.1.9)
b)HMG−CoAシンターゼ(EC 2.3.3.10)
c)HMG−CoAレダクターゼ(EC 1.1.1.88)
d)メバロン酸キナーゼ(EC 2.7.1.36)
e)ホスホメバロン酸キナーゼ(EC 2.7.4.2)
f)メバロン酸ジホスホデカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.33)、および
g)機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
a)1−デオキシ−D−キシルロース−5−リン酸シンターゼ DXS(EC:2.2.1.7)、
b)1−デオキシ−D−キシルロース 5−リン酸レダクトイソメラーゼ DXR(EC:1.1.1.267)、
c)2−C−メチル−D−エリスリトール 4−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ IspD (EC:2.7.7.60)、
d)4−ジホスホシチジル−2−C−メチル−D−エリスリトール キナーゼ IspE(EC:2.7.1.148)、
e)2−C−メチル−D−エリスリトール 2,4−シクロ二リン酸シンターゼ IspF(EC:4.6.1.12)、
f)4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エン−1−イル 二リン酸シンターゼ IspG(EC:1.17.7.1)、
g)4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エニル 二リン酸レダクターゼ(EC:1.17.1.2)、および
h)機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
a)ゲラニルトランストランスフェラーゼ(EC: 2.5.1.10)、
b)ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.10)、
c)オクタプレニル−二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.90)、
d)イソプレンシンターゼ(EC 4.2.3.27)、
e)イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ(EC 5.3.3.2)、
f)ファルネセンシンターゼ(EC 4.2.3.46/EC 4.2.3.47)、および
g)機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
a)チオラーゼ(EC 2.3.1.9)、
b)HMG−CoAシンターゼ(EC 2.3.3.10)、
c)HMG−CoAレダクターゼ(EC 1.1.1.88)、
d)メバロン酸キナーゼ(EC 2.7.1.36)、
e)ホスホメバロン酸キナーゼ(EC 2.7.4.2)、
f)ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.33)、
g)1−デオキシ−D−キシルロース−5−リン酸シンターゼ DXS(EC:2.2.1.7)、
h)1−デオキシ−D−キシルロース 5−リン酸レダクトイソメラーゼ DXR(EC:1.1.1.267)、
i)2−C−メチル−D−エリスリトール 4−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ IspD(EC:2.7.7.60)、
j)4−ジホスホシチジル−2−C−メチル−D−エリスリトール キナーゼ IspE(EC:2.7.1.148)、
k)2−C−メチル−D−エリスリトール 2,4−シクロ二リン酸シンターゼ IspF(EC:4.6.1.12)、
l)4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エン−1−イル 二リン酸シンターゼ IspG(EC:1.17.7.1)、
m)4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エニル 二リン酸レダクターゼ(EC:1.17.1.2)、および
n)機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される酵素をコードする1つ以上の遺伝子を欠いている。
a) チオラーゼ(EC 2.3.1.9)、
b) HMG−CoAシンターゼ(EC 2.3.3.10)、
c) HMG−CoAレダクターゼ(EC 1.1.1.88)、
d) メバロン酸キナーゼ(EC 2.7.1.36)、
e) ホスホメバロン酸キナーゼ(EC 2.7.4.2)、
f) ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.33)、および
g) 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
a) 1−デオキシ−D−キシルロース−5−リン酸シンターゼ DXS(EC:2.2.1.7)、
b) 1−デオキシ−D−キシルロース 5−リン酸レダクトイソメラーゼ DXR(EC:1.1.1.267)、
c) 2−C−メチル−D−エリスリトール 4−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ IspD(EC:2.7.7.60)、
d) 4−ジホスホシチジル−2−C−メチル−D−エリスリトール キナーゼ IspE(EC:2.7.1.148)、
e) 2−C−メチル−D−エリスリトール 2,4−シクロ二リン酸シンターゼ IspF(EC:4.6.1.12)、
f) 4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エン−1−イル 二リン酸シンターゼ IspG(EC:1.17.7.1)、
g) 4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エニル 二リン酸レダクターゼ(EC:1.17.1.2)、および
h) 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
a) ゲラニルトランストランスフェラーゼ Fps(EC:2.5.1.10)、
b) ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.10)、
c) オクタプレニル−二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.90)、
d) イソプレンシンターゼ(EC 4.2.3.27)、
e) イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ(EC 5.3.3.2)、
f) ファルネセンシンターゼ(EC 4.2.3.46 / EC 4.2.3.47)、および
g) 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される酵素をコードする。
a) イソプレンシンターゼ;
b) イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ(idi);
c) 1−デオキシ−D−キシルロース−5−リン酸シンターゼ DXS;
または機能的に等価なそれらの変異体
をコードする。
a) チオラーゼ;
b) HMG−CoAシンターゼ;
c) HMG−CoAレダクターゼ;
d) メバロン酸キナーゼ;
e) ホスホメバロン酸キナーゼ;
f) ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ;
g) イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ(idi);および
h) イソプレンシンターゼ;
または機能的に等価なそれらの変異体
をコードする。
a) ゲラニルトランストランスフェラーゼ Fps;および
b) ファルネセンシンターゼ
または機能的に等価なそれらの変異体
をコードする。
(a)本発明の第1の態様の1つ以上の微生物の培養物を含む生物反応器にCOを含む基質を提供するステップ;および
(b)生物反応器中の培養物を嫌気的に発酵して少なくとも1つのテルペンおよび/またはその前駆体を産生するステップ
を含む。
(a)工業的工程の結果として生成したCO含有気体を補足するステップ;
(b)本発明の第1の態様の1つ以上の微生物を含む培養によりこのCO含有気体を嫌気的に発酵して少なくとも1つのテルペンおよび/またはその前駆体を産生するステップ
を含む。
a) チオラーゼ(EC 2.3.1.9);
b) HMG−CoAシンターゼ(EC 2.3.3.10);
c) HMG−CoAレダクターゼ(EC 1.1.1.88);
d) メバロン酸キナーゼ(EC 2.7.1.36);
e) ホスホメバロン酸キナーゼ(EC 2.7.4.2);
f) ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.33);1−デオキシ−D−キシルロース−5−リン酸シンターゼ DXS(EC:2.2.1.7);
g) 1−デオキシ−D−キシルロース 5−リン酸レダクトイソメラーゼ DXR(EC:1.1.1.267);
h) 2−C−メチル−D−エリスリトール 4−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ IspD(EC:2.7.7.60);
i) 4−ジホスホシチジル−2−C−メチル−D−エリスリトール キナーゼ IspE(EC:2.7.1.148);
j) 2−C−メチル−D−エリスリトール 2;4−シクロ二リン酸シンターゼ IspF(EC:4.6.1.12);
k) 4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エン−1−イル 二リン酸シンターゼ IspG(EC:1.17.7.1);
l) 4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エニル 二リン酸レダクターゼ(EC:1.17.1.2);ゲラニルトランストランスフェラーゼ Fps(EC:2.5.1.10);
m) ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.10);
n) オクタプレニル−二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.90);
o) イソプレンシンターゼ(EC 4.2.3.27);
p) イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ(EC 5.3.3.2);および
q) ファルネセンシンターゼ(EC 4.2.3.46 / EC 4.2.3.
47)
からなる群から選択される。
a) チオラーゼ(EC 2.3.1.9);
b) HMG−CoAシンターゼ(EC 2.3.3.10);
c) HMG−CoAレダクターゼ(EC 1.1.1.88);
d) メバロン酸キナーゼ(EC 2.7.1.36);
e) ホスホメバロン酸キナーゼ(EC 2.7.4.2);
f) ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.33);1−デオキシ−D−キシルロース−5−リン酸シンターゼ DXS(EC:2.2.1.7);
g) 1−デオキシ−D−キシルロース 5−リン酸レダクトイソメラーゼ DXR(EC:1.1.1.267);
h) 2−C−メチル−D−エリスリトール 4−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ IspD(EC:2.7.7.60);
i) 4−ジホスホシチジル−2−C−メチル−D−エリスリトール キナーゼ IspE(EC:2.7.1.148);
j) 2−C−メチル−D−エリスリトール 2;4−シクロ二リン酸シンターゼ IspF(EC:4.6.1.12);
k) 4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エン−1−イル 二リン酸シンターゼ IspG(EC:1.17.7.1);
l) 4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エニル 二リン酸レダクターゼ(EC:1.17.1.2);ゲラニルトランストランスフェラーゼ Fps(EC:2.5.1.10);
m) ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.10);
n) オクタプレニル−二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.90);
o) イソプレンシンターゼ(EC 4.2.3.27);
p) イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ(EC 5.3.3.2);および
q) ファルネセンシンターゼ(EC 4.2.3.46 / EC 4.2.3.47)
からなる群から選択される。
培養媒体中の酸化炭素栄養性の酢酸産生細菌の培養物を含む生物反応器に気体のCO含有基質および/またはCO2含有基質を通すことと、生物反応器からイソプレンを回収することとを含む。酸化炭素栄養性の酢酸産生細菌はイソプレンシンターゼを発現するよう遺伝的に改変される。
2つのテルペン産生経路、解糖系における2つの重要な中間体基質であるピルビン酸およびD−グリセルアルデヒド−3−リン酸(G3P)から開始するデオキシキシルロース 5−リン酸(DXP/DXPS/DOXPまたはDXS)/メチルエリスリトール リン酸(MEP)経路(Hunter et al., 2007, J. Biol. chem. 282: 21573−77)、ならびにアセチルCoAから開始するメバロン酸(MVA)経路(Miziorko, 2011, Arch Biochem Biophys, 505: 131−143)が知られている。多くの異なる分類の微生物が、これら経路のいずれかの存在について研究されている(Lange et al., 2000, PNAS, 97: 13172−77; Trutko et al., 2005, Microbiology, 74: 153−158; Julsing et al., 2007, Appl Microbiol Biotechnol, 75: 1377−84)が、酸化炭素栄養性酢酸産生では研究されていなかった。たとえばDXS経路は、E.coli、 Bacillus、またはMycobacterium中に存在すると見出されており、一方メバロン酸経路は、酵母Saccharomyces、Cloroflexus、またはMyxococcus中に存在する。
より高いATPが利用可能であるにも関わらず、この中間体の毒性の問題は、糖からのテルペン産生における障害となり得る。
メバロン酸(MVA)経路由来の1つ以上の外来性酵素を発現し、かつ/またはメバロン酸(MVA)経路由来の1つ以上の内在性酵素を過剰発現し;かつ
a)DXS経路由来の1つ以上の外来性酵素を発現し、かつ/またはDXS経路由来の1つ以上の内在性酵素を過剰発現するように
適合される。
a) チオラーゼ(EC 2.3.1.9)、
b) HMG−CoAシンターゼ(EC 2.3.3.10)、
c) HMG−CoAレダクターゼ(EC 1.1.1.88)、
d) メバロン酸キナーゼ(EC 2.7.1.36)、
e) ホスホメバロン酸キナーゼ(EC 2.7.4.2)、
f) ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.33)、および
g) 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
a) 1−デオキシ−D−キシルロース−5−リン酸シンターゼ DXS(EC:2.2.1.7)、
b) 1−デオキシ−D−キシルロース 5−リン酸レダクトイソメラーゼ DXR(EC:1.1.1.267)、
c) 2−C−メチル−D−エリスリトール 4−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ IspD(EC:2.7.7.60)、
d) 4−ジホスホシチジル−2−C−メチル−D−エリスリトール キナーゼ IspE(EC:2.7.1.148)、
e) 2−C−メチル−D−エリスリトール 2,4−シクロ二リン酸シンターゼ IspF(EC:4.6.1.12)、
f) 4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エン−1−イル 二リン酸シンターゼ IspG(EC:1.17.7.1)、
g) 4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エニル 二リン酸レダクターゼ(EC:1.17.1.2)、および
h) 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
a) ゲラニルトランストランスフェラーゼ Fps(EC:2.5.1.10)、
b) ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.10)、
c) オクタプレニル−二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.90)、
d) イソプレンシンターゼ(EC 4.2.3.27)、
e) イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ(EC EC 5.3.3.2)、
f) ファルネセン シンターゼ(EC 4.2.3.46 / EC 4.2.3.47)、および
g) 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体.
からなる群から選択される。
本発明はまた、本発明の組換え微生物を作成するのに使用される1つ以上の核酸または核酸構築物を提供する。
a) チオラーゼ(EC 2.3.1.9)、
b) HMG−CoAシンターゼ(EC 2.3.3.10)、
c) HMG−CoAレダクターゼ(EC 1.1.1.88)、
d) メバロン酸キナーゼ(EC 2.7.1.36)、
e) ホスホメバロン酸キナーゼ(EC 2.7.4.2)、
f) ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.33)、および
g) 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
a) 1−デオキシ−D−キシルロース−5−リン酸シンターゼ DXS(EC:2.2.1.7)、
b) 1−デオキシ−D−キシルロース 5−リン酸レダクトイソメラーゼ DXR (EC:1.1.1.267)、
c) 2−C−メチル−D−エリスリトール 4−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ IspD(EC:2.7.7.60)、
d) 4−ジホスホシチジル−2−C−メチル−D−エリスリトール キナーゼ IspE(EC:2.7.1.148)、
e) 2−C−メチル−D−エリスリトール 2,4−シクロ二リン酸シンターゼ IspF(EC:4.6.1.12)、
f) 4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エン−1−イル 二リン酸シンターゼ IspG(EC:1.17.7.1)、
g) 4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エニル 二リン酸レダクターゼ(EC:1.17.1.2)、および
h) 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
a) ゲラニルトランストランスフェラーゼ Fps(EC:2.5.1.10)、
b) ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.10)、
c) オクタプレニル−二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.90)、
d) イソプレンシンターゼ(EC 4.2.3.27)、
e) イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ(EC EC 5.3.3.2)
f)ファルネセンシンターゼシンターゼ(EC 4.2.3.46/EC 4.2.3.47)、および
g)機能的に等価なそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
1つ以上の外来性核酸は、裸核酸として親微生物に送達されてもよく、または形質転換工程を促進するために1つ以上の薬剤と製剤化されてもよい(たとえば、リポソーム結合核酸、核酸が含まれる生物)。1つ以上の核酸は、適切なように、DNA、RNA,またはその組み合わせであってもよい。制限酵素を特定の実施形態で使用してもよい;たとえば、Murray, N.E.らによる(2000) Microbial. Molec. Biol. Rev. 64, 412.参照。
b)(i)本明細書に記載される発現構築物/ベクターおよび(ii)メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むメチル化構築物/ベクターのシャトル微生物への導入;
c)メチルトランスフェラーゼの発現;
d)シャトル微生物由来の1つ以上の構築物/ベクターの単離;
e)1つ以上の構築物/ベクターの目的微生物への導入
を含む方法により産生される。
本発明は、本発明の組換え微生物を使用してCOを含む基質を発酵することを含む微生物発酵により、1つ以上のテルペン類および/またはその前駆体、ならびに任意に1つ以上の他の産物を産生する方法を提供する。好ましくは、1つ以上のテルペンおよび/またはその前駆体は、主要な発酵産物である。本発明の方法は、工業工程由来の大気中炭素の排出の総量を低減するために使用してもよい。
(a)本発明の1つ以上の微生物の培養物を含む生物反応器にCOを含む基質を提供するステップ;および
(b)生物反応器の培養物を嫌気的に発酵して少なくとも1つのテルペンおよび/またはその前駆体を産生するステップと
を含む。
a)工業的工程の結果として産生されたCO含有気体を補足することと、
b)本発明の1つ以上の微生物を含む培養による、少なくとも1つ以上のテルペンおよび/またはその前駆体を産生するためのCO含有気体の嫌気的発酵のステップ
を含む。
本発明を以下の限定する意味を持たない実施例を参照してより詳細に記載する。
本発明者らは、C.autoethanogenumおよびC.ljungdahliiなどの酸化炭素栄養性酢酸産生菌におけるテルペン生合成遺伝子を同定した。組み換え微生物を、イソプレンを産生するように改変した。イソプレンは、ポプラなどのいくつかの植物から、UV放射から葉を保護するため天然に発せられる。ポプラのイソプレンシンターゼ(EC 4.2.3.27)遺伝子を、コドンを最適化して、COからイソプレンを産生するように酸化炭素栄養性酢酸産生菌C.autoethanogenumに導入した。この酵素は、テルペノイド生合成の鍵となる中間体DMAPP(ジメチルアリル二リン酸)を不可逆反応でイソプレンに変換する(図1)。
すべてのサブクローニングステップを、以前に記載された標準的な株および増殖条件を使用してE.coliで実施した(Sambrook et al, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Labrotary Press, Cold Spring Harbour, 1989; Ausubel et al, Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons, Ltd., Hoboken, 1987)。
を使用した。
本発明では、標準的な組み換えDNAおよび分子クローニング技術を使用した(Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, 1989; Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K: Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, Ltd., Hoboken, 1987)。Poplar tremuloidesのイソプレンシンターゼ(AAQ16588.1; GI:33358229)を、コドンを最適化して(配列番号21)合成した。C.autoethanogenumのピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼのプロモーター領域(配列番号22)を使用してこの遺伝子を発現した。
発現プラスミドの構築を、E.coli株DH5α−T1R(体外gen)およびXL1−Blue MRF’ Kan(Stratagene)で実施した。第1のステップで、増幅したPpforプロモーター領域をNotIおよびNdeI制限部位を使用してE.coli−ClostridiumシャトルベクターpMTL85141 (FJ797651.1; Nigel Minton, University of Nottingham; Heap et al., 2009)にクローニングし、プラスミドpMTL85146を産生した。第2のステップとして、ispSを制限部位NdeIおよびEcoRIを使用してpMTL85146にクローニングし、プラスミドpMTL 85146−ispSを得た(図2、配列番号25)。
形質転換の前に、米国特許公開公報第2011/0236941号に記載されるように、C.autoethanogenum、C.ragsdaleiおよびC.ljungdahlii由来のメチルトランスフェラーゼ遺伝子から設計したメチル化プラスミド(配列番号64)上に共発現される、合成したハイブリッドタイプIIメチルトランスフェラーゼ(配列番63)を使用して、DNAをE.coli中で生体内でメチル化した。
すべての形質転換の実験の間、C.autoethanogenum DSM23693は、1g/Lの酵母抽出物および10g/lのフルクトースならびに炭素供給源として30psiの製鋼排ガス(ニュージーランドGlenbrookのNew ZEaland Steelから収集、組成:44% CO、32% N2、22% CO2、2% H2)で補足されたPETC培地(表1)中で増殖させた。
培養した。これらの細胞を使用して、40mMのDL−スレオニンを含む50mlのPETC培地に0.05のOD600mで播種した。培養物のOD600mが0.4に達した際に、細胞を嫌気チャンバーに移し、4,700×gおよび4℃で収集した。この培養物を、氷冷したエレクトロポレーションバッファー(270mM スクロース、1mM MgCl2、7mM リン酸ナトリウム、pH7.4)で2回洗浄し、最終的に600μlの新鮮なエレクトロポレーションバッファー懸濁した。この混合物を、メチル化プラスミド混合物1μgを含む0.4cmの電極ギャップをもつあらかじめ氷冷したエレクトロポレーションキュベットに移し、すぐに以下の設定(2.5kV、600Ω、および25μF)でGene pulser Xcellエレクトロポレーションシステム(Bio−Rad)を使用して電気を通した。時間定数は3.7〜4.0msが達成されたった。この培養物を、5mlの新鮮な培地に移した。細胞の再産生を、チューブホルダーを備えたSpectronic Helios Epsilon Spectrophotometer (Thermo)を使用して600nmの波長でモニタリングした。最初にバイオマスが低下した後、細胞は再び増殖を開始した。この時点からバイオマスが二倍になった後、細胞を回収し、200μlの新鮮な培地に懸濁し、適切な抗生基質である4μg/mlクラリスロマイシンまたは15μg/mlチアンフェニコールを含む選択的PETCプレート(1.2% Bacto(商標)アガロース(BD)を含む)にプレーティングした。播種後37℃の30psiの製鋼ガスで4〜5日で、コロニーが視認できた。
DNAの転移を検証するために、プラスミドミニプレップを、Zyppy plasmid miniprep kit(Zymo)を使用して10mlの培養容量から実施した。単離したプラスミドの質は、クロストリジウムのエキソヌクレアーゼ活性のため制限消化に十分ではなかったので[Burchhardt および Durre, 1990]、オリゴヌクレオチドの対colE1−F(配列番号:65:CGTCAGACCCCGTAGAAA)+colE1−R(配列番号:66:CTCTCCTGTTCCGACCCT)を用いて単離プラスミドでPCRを実施した。PCRはiNtRON Maximise Premix PCR kit (Intron Bio Technologies)を使用して、以下の条件で行った:最初の変性(94℃、2分間)、続いて35周期の変性(94℃、20秒間)、アニーリング(55℃、20秒間)、および伸長(72℃、60秒間)、その後最終伸長ステップ(72℃、5分間)。
qRT−PCR実験を、導入されたのイソプレンシンターゼの遺伝子がC.autoethanogenumでうまく発現したことを確認するために実行した。
前駆体DMAPP(ジメチルアリル二リン酸)およびIPP(イソペンテニル二リン酸)の利用可能性および均衡は、テルペン類の産生に重要である。DXS経路はIPPおよびDMAPPを等しく合成するのに対し、メバロン酸経路ではIPPのみが産生される。イソプレンの産生では、イソプレンシンターゼとともに存在する前駆体DMAPPのみを必要とし、一方より高度のテルペン類およびテルペノイド類の産生では、ゲラニルトランストランスフェラーゼによりゲラニル−PPを産生するために利用可能な等量のIPPおよびDMAPPを有することが必要である。
イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ(YP_001310174.1)をコードするC. beijerinckii由来のイソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ遺伝子idi(Gene ID:5294264)を、ispSの下流にクローニングした。この遺伝子を、C.autoethanogenumで上述した同一の方法を使用して取得したC. beijerinckii NCIMB8052のゲノムDNA由来のオリゴヌクレオチドIdi−Cbei−SacI−F(配列番号:26:GTGAGCTCGAAAGGGGAAATTAAATG)およびIdi−Cbei−KpnI−R(配列番号:27:ATGGTACCCCAAATCTTTATTTAGACG)を使用して増幅した。このPCR産物を、SacIおよびKpnI制限部位を使用してベクターpMTL 85146−ispSにクローニングし、プラスミドpMTL85146−ispS−idi(配列番号:28)を得た。嫌気性抵抗マーカーを、制限酵素PmeIおよびFseIを使用してcatPからermB(ベクターpMTL82254(FJ797646.1; Nigel Minton, University of Nottingham; Heap et al., 2009から入手)に交換し、プラスミドpMTL85246−ispS−idiを形成した(図3)。
DXS経路を介するフローを改善するために、経路の遺伝子を過剰発現させた。経路の最初のステップである、ピルビン酸およびD−グリセルアルデヒド−3−リン酸(G3P)のデオキシキシルロース5−リン酸(DXP/DXPS/DOXP)への変換は、デオキシキシルロース 5−リン酸シンターゼ(DXS)により触媒される。
C.autoethanogenumのdxs遺伝子を、上述の他の遺伝子に記載されるように、オリゴヌクレオチドDxs−SalI−F(配列番号:29:GCAGTCGACTTTATTAAAGGGATAGATAA)およびDxs−XhoI−R(配列番号:30:TGCTCGAGTTAAAATATATGACTTACCTCTG)を用いてゲノムDNAから増幅させた。増幅された遺伝子を次にSalIおよびXhoIでプラスミドpMTL85246−ispS−idi内にクローン化し、プラスミドpMTL85246−ispS−idi−dxs(配列番号:31および図4)を産生した。表3に開示されるオリゴヌクレオチドを使用したDNAの配列決定により、ispS、idi、およびdxsのクローニングが変異なく成功したことを確認した(図5)。ispSおよびidi遺伝子を、それぞれ実施例1および実施例2に記載する。
C.autoethanogenumnでの形質転換および発現を、プラスミドpMTL 85146−ispSに記載されるように実行した。形質転換の成功後に、増殖実験を、50mlの血清用のビンおよび単一のエネルギーおよび炭素の供給源として30psi製鋼排ガス(ニュージーランドGlenbrookのNew Zealand Steelで収集、組成:44% CO、32% N2、22% CO2、2% H2)を用いPETC培地(表1)中で実行した。遺伝子発現の確認を、OD600nm=0.75で収集した試料から上述したように実行した。オリゴヌクレオチド対 dxs−F(配列番号:73:ACAAAGTATCTAAGACAGGAGGTCA)およびdxs−R(配列番号:74:GATGTCCCACATCCCATATAAGTTT)を使用して、野生型株およびプラスミドpMTL 85146−ispS−idi−dxsをもつ株における遺伝子dxsの発現を測定した。プラスミドをもつ株でのmRNAレベルが、野生型と比較して3倍超増加していることが見出された(図15)。バイオマスはRNA抽出前に規準化した。
メバロン酸経路の第1のステップ(図7)は、2分子のアセチルCoAをアセトアセチルCoA(およびHS−CoA)に変換するチオラーゼにより触媒される。この酵素は、同一の発明者らにより酸化炭素栄養性酢酸産生菌のClostridium autoethanogenumおよびC.ljungdahliiでうまく発現されている(米国特許公開公報第2011/0236941号)。メバロン酸経路の残りの遺伝子の構築物が設計されている。
標準的な組み換えDNAおよび分子クローニング技術を使用した(Sambrook, J., および Russell, D., Molecular cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed., Cold Spring Harbour Lab Press, Cold Spring Harbour, NY, 2001)。メバロン酸経路の前半部によるメバロン酸の合成に必要とされる3つの遺伝子、すなわちチオラーゼ(thlA/vraB)、HMG−CoAシンターゼ(HMGS)およびHMG−CoAレダクターゼ(HMGR)は、オペロン(Pptaack−thlA/vraB−HMGS−Patp−HMGR)としてコドンを最適化された。
テルペノイドの重要な中間体IPPおよびDMAPPから直接イソプレンを産生してより長鎖のテルペンを合成する代わりに、ゲラニルトランストランスフェラーゼを介して、直接C10モノテルペノイド類またはC15セスキテルペノイド類などの長鎖テルペン類を合成することも可能である(表6参照)。C15セスキテルペノイド構築ブロックファルネシルPPから、ファルネセンを産生することが可能であり、これはエタノールと同じく、輸送燃料に使用できる。
メバロン酸経路を介したIPPおよびDMAPPからのファルネセン合成に必要とされる2つの遺伝子、すなわち、ゲラニルトランストランスフェラーゼ(ispA)およびαファルネセンシンターゼ(FS)を、コドンを最適化した。ゲラニルトランストランスフェラーゼ(ispA)はEscherichia coli str. K−12 substrから取得しMG1655アルファダルファルネセンシンターゼ(FS)はMalus x domesticaから取得した。使用されたすべてのDNA配列を表6に記載する。コドンを最適化したidiは、メバロン酸経路idi_F(配列番号:86:AGGCACTCGAGATGGCAGAGTATATAATAGCAGTAG)およびidi_R2(配列番号:87: AGGCGCAAGCTTGGCGCACCGGTTTATTTAAATATCTTATTTTCAGC)で合成プラスミドpMTL83245−Pfor−FS−idi(配列番号:85)から増幅した。その後、増幅した遺伝子を、XhoIおよびHindIIIでプラスミドpMTL83245−Pforにクローン化し、プラスミドpMTL83245−Pfor−idi(配列番号:88)を産生した。この結果として得られたプラスミドおよびファルネセンシンターゼの1754bpのコドン最適化フラグメントを、HindIIIおよびNheIで消化した。連結反応を実施して、プラスミドpMTL83245−Pfor−idi−FS(配列番号:89)を得た。ispAの946bpフラグメントおよびpMTL83245−Pfor−idi−FSを、AgeIおよびHindIIIで消化し、結合させ、結果としてプラスミドpMTL83245−Pfor−idi−ispA−FS(配列番号:90)を作成した。上流のメバロン酸経路をもたないファルネセン発現プラスミドは、pMTL83245−Pfor−idi−ispA−FSからのPfor−idi−ispA−FSの2516bpのフラグメントをpMTL 8314−Prnf−MK−PMK−PMDに連結することにより作成して、プラスミドpMTL 8314−Prnf−MK−PMK−PMD−Pfor−idi−ispA−FS(配列番号:91)を得た。最終的なファルネセン発現プラスミドMTL83145−thlA−HMGS−Patp−HMGR−Prnf−MK−PMK−PMD−Pfor−idi−ispA−FS(配列番号:59および図18)は、制限部位NotIおよびXbaIを使用してpMTL8215−Pptaack−thlA−HMGS−Patp−HMGR (配列番号:50)由来のPptaack−thlA−HMGS−Patp−HMGRの4630bpフラグメントをpMTL 8314−Prnf−MK−PMK−PMD−Pfor−idi−ispA−FS(配列番号:91)と連結することにより作成される。
C.autoethanogenumでの形質転換および発現を、実施例1に記載するように実行した。
MTL8314−Prnf−MK−PMK−PMD−Pfor−idi−ispA−FS(配列番号:59)の存在を、garm+ve perpliconの一部およびpMTL831xxxの一連のプラスミド上のcat遺伝子の大部分を選択的に増幅するオリゴヌクレオチドrepHF(配列番号:92:AAGAAGGGCGTATATGAAAACTTGT)およびcatR(配列番号:93:TTCGTTTACAAAACGGCAAATGTGA)を使用して、コロニーPCRにより確認した。1854bpのバンドを得た(図16)。
下流のメバロン酸経路遺伝子であるメバロン酸キナーゼ(MK 配列番号:51)、ホスホメバロン酸キナーゼ(PMK 配列番号:52)、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(PMD 配列番号:53)、イソペンチル−二リン酸Δ−イソメラーゼ(idi;配列番号:54)、ゲラニルトランストランスフェラーゼ(ispA;配列番号:56)およびファルネセンシンターゼ(FS配列番号57)の発現の確認を、実施例1に上述するように行った。使用したオリゴヌクレオチドを表7に列挙する。
プラスミドpMTL8314−Prnf−MK−PMK−PMD−Pfor−idi−ispA−FSの形質転換の成功を確認した後に、唯一の炭素およびエネルギー供給源として30psiのReal Mill Gas(ニュージーランドGlenbrookのNew Zealand Steelで収集、組成:44% CO、32% N2、22% CO2、2% H2)を用いて、250mlの血清ビン中の50mlPETC培地(表1)で増殖実験を行った。すべての培養物を、血清ビンを保持するよう適合されオービタル振盪機上で、37℃でインキュベートした。形質転換物を、1mMのメバロン酸を追加した新鮮な培地に継代培養する前に、OD600が、〜0.4となるまで増殖させた。メバロン酸のない対照を、同一の培養物から同一の時間に設定した。GC−MS(ガスクロマトグラフィー-質量分析)の試料を、各時点で採取した。図17は、2つの対照培養物および1mMのメバロン酸を供給した2つの培養物の代表的な増殖曲線を示す。ファルネセンが、実験の開始から66時間後および90時間後に採取した試料で検出された(図19〜21)。
αファルネセンのGC−MS検出のため、5mlの培養物に対し、2mlのヘキサンを添加し、激しく振って密封したガラスのバルク管(balch tube)中で混合することによりヘキサン抽出を実施した。その後、この管を、5分間超音波処置ウォーターバスでインキュベートして相の分離を促進した。400μlのヘキサン抽出物をGCバイアル(vail)に移しオートローダーに装填した。試料を、0.25μmのフィルム厚のEC−1000カラム( Grace Davidson, OR, USA)、VARIAN MS workstation (Varian Inc, CA, USA. Now Agilent Technologies)およびNIST MS Search 2.0 (Agilent Technologies, CA, USA)を備えたVARIAN GC3800 MS4000 iontrap GC/MS (Varian Inc, CA, USA. Now Agilent Technologies)で分析した。注入容量は1μlであり、ヘリウムキャリアーガスの流量は1ml/分であった。
Claims (31)
- メバロン酸経路またはDXS経路またはテルペン生合成経路の酵素をコードする外来性核酸を含む、単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌であって、これにより細菌が酵素を発現し、前記酵素が、
a) チオラーゼ(EC 2.3.1.9);
b) HMG−CoAシンターゼ(EC 2.3.3.10);
c) HMG−CoAレダクターゼ(EC 1.1.1.88);
d) メバロン酸キナーゼ(EC 2.7.1.36);
e) ホスホメバロン酸キナーゼ(EC 2.7.4.2);
f) ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.33);1−デオキシ−D−キシルロース−5−リン酸シンターゼ DXS(EC:2.2.1.7);
g) 1−デオキシ−D−キシルロース 5−リン酸レダクトイソメラーゼ DXR(EC:1.1.1.267);
h) 2−C−メチル−D−エリスリトール 4−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ IspD(EC:2.7.7.60);
i) 4−ジホスホシチジル−2−C−メチル−D−エリスリトール キナーゼ IspE(EC:2.7.1.148);
j) 2−C−メチル−D−エリスリトール 2;4−シクロ二リン酸シンターゼIspF(EC:4.6.1.12);
k) 4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エン−1−イル 二リン酸シンターゼ IspG(EC:1.17.7.1);
l) 4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エニル 二リン酸レダクターゼ(EC:1.17.1.2);ゲラニルトランストランスフェラーゼ Fps(EC:2.5.1.10);
m) ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.10);
n) オクタプレニル−二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.90);
o) イソプレンシンターゼ(EC 4.2.3.27);
p) イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ(EC 5.3.3.2);および
q) ファルネセンシンターゼ(EC 4.2.3.46 / EC 4.2.3.47)
からなる群から選択される、
細菌。 - 前記核酸の不在下で、細菌が酵素を発現しない、請求項1に記載の細菌。
- 嫌気的条件下で酵素を発現する、請求項1に記載の細菌。
- メバロン酸経路またはDXS経路またはテルペン生合成経路の酵素をコードする核酸を含む酸化炭素栄養性酢酸産生細菌中で複製できるプラスミドであって、それによりプラスミドが前記細菌にある際に酵素が前記細菌により発現され、前記酵素が、
チオラーゼ(EC 2.3.1.9);
a) HMG−CoAシンターゼ(EC 2.3.3.10);
b) HMG−CoAレダクターゼ(EC 1.1.1.88);
c) メバロン酸キナーゼ(EC 2.7.1.36);
d) ホスホメバロン酸キナーゼ(EC 2.7.4.2);
e) ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.33);1−デオキシ−D−キシルロース−5−リン酸シンターゼ DXS(EC:2.2.1.7);
f) 1−デオキシ−D−キシルロース 5−リン酸レダクトイソメラーゼ DXR(EC:1.1.1.267);
g) 2−C−メチル−D−エリスリトール 4−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ IspD(EC:2.7.7.60);
h) 4−ジホスホシチジル−2−C−メチル−D−エリスリトール キナーゼ IspE(EC:2.7.1.148);
i) 2−C−メチル−D−エリスリトール 2;4−シクロ二リン酸シンターゼ IspF(EC:4.6.1.12);
j) 4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エン−1−イル 二リン酸シンターゼ IspG(EC:1.17.7.1);
k) 4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エニル 二リン酸レダクターゼ(EC:1.17.1.2);ゲラニルトランストランスフェラーゼ Fps(EC:2.5.1.10);
l) ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.10);
m) オクタプレニル−二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.90);
n) イソプレンシンターゼ(EC 4.2.3.27);
o) イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ(EC 5.3.3.2);および
p) ファルネセンシンターゼ(EC 4.2.3.46 / EC 4.2.3.47)
からなる群から選択される、
プラスミド。 - COおよび/またはCO2をイソプレンに変換する工程であって、
気体状のCO含有基質および/またはCO2含有基質を培地中の酸化炭素栄養性酢酸産生細菌の培養物を含む生物反応器に通すことにより、細菌がCOおよび/またはCO2をイソプレンに変換すること、および
前記生物反応器からイソプレンを回収すること
を含み、
酸化炭素栄養性酢酸産生細菌がイソプレンシンターゼを発現するよう遺伝的に改変されている、
工程。 - イソプレンシンターゼをコードする核酸を含む、単離され、遺伝的に改変された、型酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌であって、
それにより細菌がイソプレンシンターゼを発現し、かつ細菌がジメチルアリル二リン酸をイソプレンに変換できる、
細菌。 - イソプレンシンターゼがPopulus tremuloidesの酵素である、請求項6に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
- 核酸が最適化されたコドンである、請求項6に記載の単離され、遺伝的に改変さた、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
- イソプレンシンターゼの発現がClostridium autoethanogenum由来のピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ遺伝子のプロモーターの転写制御下にある、請求項6に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
- COおよび/またはCO2をイソペンテニル二リン酸(IPP)に変換する工程であって、
気体状のCO含有基質および/またはCO2含有基質を培地中の酸化炭素栄養性酢酸産生細菌の培養物を含む生物反応器に通すことにより、細菌がCOおよび/またはCO2をイソペンテニル二リン酸(IPP)に変換すること、および
生物反応器からIPPを回収すること
を含み、
酸化炭素栄養性酢酸産生細菌が、イソペンチル二リン酸デルタ イソメラーゼを発現するよう遺伝的に改変されている、
工程。 - イソペンチル二リン酸デルタ イソメラーゼをコードする核酸を含む、単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌であって、
それにより細菌がイソペンチル二リン酸デルタ イソメラーゼを発現し、かつ細菌がジメチルアリル二リン酸をイソペンチル二リン酸に変換できる、
細菌。 - 核酸がClostridium beijerinckii イソペンチル二リン酸デルタ イソメラーゼをコードする、請求項11に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
- 核酸がClostridium autoethanogenum由来のピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ遺伝子のプロモーターの転写制御下にある、請求項11に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
- 核酸がClostridium autoethanogenum由来のピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ遺伝子の転写制御下にありかつイソプレンシンターゼをコードする第2の核酸の下流にある、請求項11に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
- COおよび/またはCO2をイソペンチル二リン酸(IPP)および/またはイソプレンに変換する工程であって、
気体状のCO含有基質および/またはCO2含有基質を培地中の酸化炭素栄養性酢酸産生細菌の培養物を含む生物反応器に通すことにより、細菌がCOおよび/またはCO2をイソペンチル二リン酸(IPP)および/またはイソプレンに変換すること、および
前記生物反応器からIPPおよび/またはイソプレンを回収すること
を含み、
酸化炭素栄養性酢酸産生細菌がデオキシキシルロース 5−リン酸シンターゼ(DXS)酵素をコードする核酸の増加されたコピー数をもつよう遺伝的に改変され、増加されたコピー数がゲノム当たり1より大きい、
工程。 - デオキシキシルロース 5−リン酸シンターゼ(DXS)の酵素をコードする核酸のゲノムあたり1より大きいコピー数を含む、単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
- イソプレンシンターゼをコードする核酸をさらに含む、請求項16に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
- イソペンチル二リン酸デルタイソメラーゼをコードする核酸をさらに含む、請求項16に記載の一般的に改変されている単離型酸化炭素栄養性酢酸産生細菌。
- イソペンチル二リン酸デルタイソメラーゼをコードする核酸およびイソプレンシンターゼをコードする核酸をさらに含む、請求項16に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
- ホスホメバロン酸キナーゼ(PMK)をコードする核酸を含む、単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌であって、それにより細菌がコードされた酵素を発現し、酵素が細菌にとって天然ではない、細菌。
- 酵素が、Staphylococcus aureusの酵素である、請求項20に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
- 酵素が1つ以上のC.autoethanogenumのプロモーターの制御下で発現される、請求項20に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
- チオラーゼ(thlA/vraB)をコードする核酸、HMG−CoAシンターゼ(HMGS)をコードする核酸、およびHMG−CoAレダクターゼ(HMGR)をコードする核酸をさらに含む、請求項20に記載の遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
- チオラーゼがClostridium acetobutylicumのチオラーゼである、請求項23に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
- ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(PMD)をコードする核酸をさらに含む、請求項20に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
- αファルネセンシンターゼをコードする外来性核酸を含む、単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
- 核酸がC.autoethanogenumでの発現のためにコドンが最適化されている、請求項26に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
- αファルネセンシンターゼがMalus x domesticaのαファルネセンシンターゼである、請求項26に記載の細菌。
- ゲラニルトランストランスフェラーゼをコードする核酸セグメントをさらに含む、請求項26に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
- ゲラニルトランスフェラーゼ(gernayltranstransferase)がE.coliのゲラニルトランストランスフェラーゼである、請求項29に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
- Clostridium autoethanogenum、Clostridium ljungdahlii、Clostridium ragsdalei、Clostridium carboxidivorans、Clostridium drakei、Clostridium scatologenes、Clostridium aceticum、Clostridium formicoaceticum、Clostridium magnum、Butyribacterium methylotrophicum、Acetobacterium woodii、Alkalibaculum bacchii、Blautia producta、Eubacterium limosum、Moorella thermoacetica、Moorella thermautotrophica、Sporomusa ovata、Sporomusa silvacetica、Sporomusa sphaeroides、Oxobacter pfennigii、およびThermoanaerobacter kiuviからなる群から選択される、請求項1、6、11、20、または26に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
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