JP2015518857A - Ｉｌ−６結合分子 - Google Patents

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Abstract

本発明は、IL-6 (例えば、ヒト、マウス、および非ヒト霊長類のIL-6)に特異的に結合しかつIL-6の生物学的活性を阻害する、結合分子(例えば、抗体またはその抗原結合断片)を提供する。好ましい態様において、本発明の抗体または抗原結合断片は、IL-6に結合し、かつIL-6受容体へのIL-6の結合を阻害する。そのような抗体または抗原結合断片は、IL-6関連疾患またはIL-6関連障害(例えば、炎症性疾患およびがん)を処置するのに特に有用である。

Description

関連出願
本出願は、2012年5月23日付で出願された米国仮特許出願第61/650,883号、2012年10月30日付で出願された米国仮特許出願第61/720,102号、および2012年11月14日付で出願されたPCT/IB2012/056424の優先権を主張するものであり、これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
背景
インターロイキン-6 (IL-6)は、主要な炎症誘発性サイトカインである。それは免疫担当細胞および造血細胞の増殖および分化に関与している。ヒトIL-6は、2つのN結合型グリコシル化部位を有する212アミノ酸からなる単一の糖タンパク質であり、約26 kDaの分子量を有する。IL-6の構造は、その三次構造に必要な4つのシステイン残基のモチーフを有する4つのα-ヘリックスドメインを含む。IL-6シグナル伝達は、可溶性または表面結合IL-6受容体α鎖(IL-6Rα)のどちらかへのIL-6の結合により媒介され、細胞内シグナル伝達を媒介する細胞表面膜貫通gp130サブユニットとの複合体の相互作用を可能にする。
IL-6は、関節リウマチ(RA)、脊椎関節症(spondylosing arthropathy)、全身性エリテマトーデス(SLE)、炎症性腸疾患(IBD)およびキャッスルマン病のような炎症性自己免疫疾患を含む、炎症性疾患の病因に関与している。IL-6はまた、前立腺がん、びまん性大細胞型リンパ腫、多発性骨髄腫、および腎細胞がんを含む、がんの病因に関与している。がんに関連した拒食症、口腔粘膜炎および悪液質を促進するうえでのIL-6の役割も報告されている。
非ヒト動物の免疫から得られるIL-6結合分子が当技術分野において公知であるものの、これらの分子は、通例、その免疫原性を低下させるために大規模な抗体操作(例えば、CDRグラフトおよびヒト化)を要している。さらに、得られるヒト化変種は、通例、IL-6標的に対する最適以下の結合親和性に見舞われるため、IL-6結合親和性を回復させようとして、大規模な抗体操作および親和性成熟を要する。この最終結果は、大部分のIL-6抗体がIL-6標的に対する最適以下の結合親和性を示すというものである。
したがって、疾患病因におけるIL-6の重要性および公知のIL-6抗体の欠点を考慮すると、明らかに、IL-6の生物学的活性を阻害でき、従って、IL-6活性に関連した疾患を処置できる改良された(例えば、最小限に操作された)IL-6剤が当技術分野において必要とされている。
本発明は、高い結合親和性(例えば、ピコモルの結合親和性)でIL-6 (例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類IL-6)に特異的に結合し、その生物学的活性(例えば、IL-6受容体への結合)を強力に阻害する、改良された結合プロファイルを有する結合分子(例えば、抗体またはその抗原結合断片)を提供することによって技術水準を改善する。ある種の例示的な態様において、本発明のIL-6結合分子は、IL-6抗原による能動免疫に供されたラクダ科動物の種(例えば、ラマ)の通常型の抗体レパートリーに由来する。例えば、本発明のラクダ科動物由来IL-6結合分子は、VHまたはVLドメインの1つまたは複数の超可変ループ(例えば、H1、H2、H3、L1、L2、および/またはL3)がラクダ科動物の種に由来する、対合VH/VLドメインまたは他の代替的なフレームワークを含みうる。さらに、ある種の態様において、少なくとも1つの超可変ループは、ヒト抗体のものと同一または実質的に同一であるカノニカル折り畳み(またはカノニカル折り畳みの組み合わせ)をとる。そのような結合分子は、高いヒト相同性(配列および構造)を示し、それゆえ、その低い免疫原性によってIL-6関連疾患またはIL-6関連障害(例えば、炎症性疾患またはがん)を処置するのに特に有用である。驚いたことに、本発明のIL-6抗体は、公知のIL-6抗体に、通例、求められる大規模でかつ時間のかかる抗体操作および親和性成熟の必要なしに高い結合親和性、製造性および熱安定性を示す。
したがって、1つの局面において、本発明は、IL-6に特異的に結合し、少なくとも1つの抗体CDRを含む結合分子であって、該CDRが少なくとも1つのアミノ酸残基を含み、該結合分子がIL-6に結合すると該アミノ酸残基がIL-6上のF229空隙またはF279空隙に埋め込まれる、結合分子を提供する。ある種の態様において、結合分子はKabatによる位置番号98のアミノ酸を有するVHドメインを含み、抗体または断片がIL-6に結合すると該アミノ酸がIL-6上のF229空隙に埋め込まれる。1つの特定の態様において、位置番号98のアミノ酸はトリプトファンである。ある種の態様において、結合分子はKabatによる位置番号30のアミノ酸を有するVLドメインを含み、抗体または断片がIL-6に結合すると該アミノ酸がIL-6上のF229空隙に埋め込まれる。1つの特定の態様において、位置番号30のアミノ酸はチロシンである。ある種の態様において、結合分子はKabatによる位置番号99のアミノ酸を有するVHドメインを含み、抗体または断片がIL-6に結合すると該アミノ酸がIL-6上のF279空隙に埋め込まれる。1つの特定の態様において、位置番号99のアミノ酸はバリンである。
ある種の態様において、結合分子はVHドメインおよびVLドメインを含み、該VHドメインが超可変ループH1、H2、およびH3を含み、VHドメインポリペプチドが、超可変ループL1、L2、およびL3を含むVLドメインと対合し、超可変ループH1〜H3およびL1〜L3の少なくとも1つが、IL-6抗原によるラマ(Lama)種の能動免疫によってラマ種の通常型抗体から得られる。1つの特定の態様において、超可変ループH1、H2、L1、L2、およびL3の少なくとも1つは、ヒト抗体において存在するH1、H2、L1、L2、またはL3超可変ループの対応するカノニカル折り畳み構造と同一または実質的に同一である予測されたまたは実際のカノニカル折り畳み構造を示す。
1つの特定の態様において、超可変ループH1およびH2の少なくとも1つはそれぞれ、対応するヒトカノニカル折り畳み構造と同一または実質的に同一である予測されたまたは実際のカノニカル折り畳み構造を示す。1つの特定の態様において、超可変ループL1、L2、およびL3の少なくとも1つはそれぞれ、対応するヒトカノニカル折り畳み構造と同一または実質的に同一である予測されたまたは実際のカノニカル折り畳み構造を示す。1つの特定の態様において、超可変ループH1およびH2の少なくとも1つは、ヒト生殖細胞系列VHドメインに存在することが公知であるカノニカル折り畳み構造の対応する組み合わせと同一または実質的に同一である予測されたまたは実際のカノニカル折り畳み構造の組み合わせを形成する。1つの特定の態様において、超可変ループH1およびH2の少なくとも1つは、1-1、1-2、1-3、1-4、1-6、2-1、3-1、および3-5からなる群より選択されるヒトカノニカル折り畳み構造の組み合わせに対応するカノニカル折り畳み構造の組み合わせを形成する。
1つの特定の態様において、超可変ループL1およびL2の少なくとも1つは、ヒト生殖細胞系列VLドメインに存在することが公知であるカノニカル折り畳み構造の対応する組み合わせと同一または実質的に同一である予測されたまたは実際のカノニカル折り畳み構造の組み合わせを形成する。1つの特定の態様において、超可変ループL1およびL2の少なくとも1つは、11-7、13-7(A、B 、C)、14-7 (A、B)、12-11、14-11、12-12、2-1、3-1、4-1、および6-1からなる群より選択されるヒトカノニカル折り畳み構造の組み合わせに対応するカノニカル折り畳み構造の組み合わせを形成する。
ある種の態様において、結合分子は、結合分子のVHドメインおよび/またはVLドメインがフレームワーク領域FR1、FR2、FR3、およびFR4にわたって1つまたは複数の対応するヒトVHドメインまたはVLドメインとの90%またはそれ以上の配列同一性を示す、VHドメインおよびVLドメインを含む。ある種の態様において、結合分子は、VHドメインおよびVLドメインを含み、親結合分子の生殖細胞系列の変種であり、結合分子のVHドメインおよびVLドメインの一方または両方が、非ヒト親抗体の対応するVHドメインおよびVLドメインと比べてフレームワーク領域にわたり合計1〜10個のアミノ酸置換を含む。1つの特定の態様において、親結合分子は通常型のラクダ科動物抗体である。ある種の態様において、結合分子は抗体またはその抗原結合断片である。
ある種の態様において、結合分子は、
Figure 2015518857
に記載されているHCDR3アミノ酸配列、またはその配列変種を含むVHドメインを含み、
X1は任意のアミノ酸、好ましくはDまたはYであり;
X2は任意のアミノ酸、好ましくはYまたはNであり; かつ
配列変種は、記載されている配列中に1つ、2つ、または3つのアミノ酸置換を含む。1つの特定の態様において、HCDR3アミノ酸のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:497〜499からなる群より選択される。
ある種の態様において、VHドメインは、
Figure 2015518857
に記載されているHCDR2アミノ酸配列、またはその配列変種をさらに含み、
X1は任意のアミノ酸、好ましくはD、Y、またはNであり;
X2は任意のアミノ酸、好ましくはDまたはEであり;
X3は任意のアミノ酸、好ましくはAまたはGであり;
X4は任意のアミノ酸、好ましくはEまたはKであり; かつ
配列変種は、記載されている配列中に1つ、2つ、または3つのアミノ酸置換を含む。1つの特定の態様において、HCDR2アミノ酸のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:501〜506からなる群より選択される。
ある種の態様において、VHドメインは、
Figure 2015518857
に記載されているHCDR1アミノ酸配列、またはその配列変種をさらに含み、
X1は任意のアミノ酸、好ましくはT、S、またはPであり;
X2は任意のアミノ酸、好ましくはRまたはSであり;
X3は任意のアミノ酸、好ましくはAまたはVであり;
X4は任意のアミノ酸、好ましくはSまたはTであり; かつ
配列変種は、記載されている配列中に1つ、2つ、または3つのアミノ酸置換を含む。1つの特定の態様において、HCDR1アミノ酸配列は、SEQ ID NO:508〜511からなる群より選択される。
ある種の態様において、結合分子は、それぞれSEQ ID NO:497、501および508に記載されているHCDR3、HCDR2、およびHCDR1アミノ酸のアミノ酸配列を含むVHドメインを含む。
ある種の態様において、結合分子は、
Figure 2015518857
に記載されているLCDR3アミノ酸配列、またはその配列変種を含むVLドメインをさらに含み、
X1は任意のアミノ酸、好ましくはRまたはKであり;
X2は任意のアミノ酸、好ましくはN、H、R、S、D、T、またはYであり;
X3は任意のアミノ酸、好ましくはF、Y、T、S、またはRであり;
X4は任意のアミノ酸、好ましくはNまたはIであり;
X5は任意のアミノ酸、好ましくはNまたはDであり;
X6は任意のアミノ酸、好ましくはV、N、G、またはAであり;
X7は任意のアミノ酸、好ましくはVまたはIであり; かつ
配列変種は、記載されている配列中に1つ、2つ、または3つのアミノ酸置換を含む。1つの特定の態様において、LCDR3アミノ酸のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:513〜523からなる群より選択される。
ある種の態様において、VLドメインは、
Figure 2015518857
に記載されているLCDR2アミノ酸配列、またはその配列変種をさらに含み、
X1は任意のアミノ酸、好ましくはR、K、D、A、またはEであり;
X2は任意のアミノ酸、好ましくはS、N、またはTであり;
X3は任意のアミノ酸、好ましくはT、K、またはYであり;
X4は任意のアミノ酸、好ましくはA、T、またはVであり; かつ
配列変種は、記載されている配列中に1つ、2つ、または3つのアミノ酸置換を含む。1つの特定の態様において、LCDR2アミノ酸のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:525〜534からなる群より選択される。
ある種の態様において、VLドメインは、
Figure 2015518857
に記載されているLCDR1アミノ酸配列、またはその配列変種をさらに含み、
X1は任意のアミノ酸、好ましくはAまたはTであり;
X2は任意のアミノ酸、好ましくはSまたはNであり;
X3は任意のアミノ酸、好ましくはS、E、またはNであり;
X4は任意のアミノ酸、好ましくはVまたはIであり;
X5は任意のアミノ酸、好ましくはG、Y、T、またはFであり;
X6は任意のアミノ酸、好ましくはGまたはYであり;
X7は任意のアミノ酸、好ましくはN、D、またはAであり; かつ
配列変種は、記載されている配列中に1つ、2つ、または3つのアミノ酸置換を含む。
1つの特定の態様において、LCDR1アミノ酸のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:538〜541からなる群より選択される。ある種の態様において、結合分子は、それぞれSEQ ID NO:513、525、および536に記載されているLCDR3、LCDR2、およびLCDR1アミノ酸のアミノ酸配列を含むVLドメインを含む。ある種の態様において、結合分子は、それぞれSEQ ID NO:497、501、および508に記載されているHCDR3、HCDR2、およびHCDR1アミノ酸のアミノ酸配列を有するVHドメイン; かつそれぞれSEQ ID NO:513、525、および536に記載されているLCDR3、LCDR2、およびLCDR1アミノ酸のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む。
ある種の態様において、結合分子は、SEQ ID NO:152に記載されているアミノ酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有するVHドメインを含む。ある種の態様において、結合分子は、SEQ ID NO:127〜232および569〜571からなる群より選択されるVHドメインアミノ酸配列を含む。ある種の態様において、結合分子は、SEQ ID NO:152であるVHドメインアミノ酸配列を含む。ある種の態様において、結合分子は、SEQ ID NO:416に記載されているアミノ酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有するVLドメインを含む。ある種の態様において、結合分子は、SEQ ID NO:391〜496からなる群より選択されるVLドメインアミノ酸配列を含む。ある種の態様において、結合分子は、SEQ ID NO:416であるVLドメインアミノ酸配列を含む。ある種の態様において、結合分子は、SEQ ID NO:152に記載されているアミノ酸配列を有するVHドメイン; およびSEQ ID NO:416に記載されているアミノ酸配列を有するVLドメインを含む。
ある種の態様において、結合分子は、ヒト1ACY抗体構造に見出されるヒトカノニカル折り畳み構造の3-1の組み合わせに対応するカノニカル折り畳み構造の組み合わせを形成するH1およびH2ループを含む。
ある種の態様において、結合分子は、ヒト3MUG抗体構造に見出されるヒトカノニカル折り畳み構造の6λ-1の組み合わせに対応するカノニカル折り畳み構造の組み合わせを形成するL1およびL2ループを含む。ある種の態様において、結合分子は、ヒト3MUG抗体構造に見出されるヒトカノニカル折り畳み構造の6λ-1-5の組み合わせに対応するカノニカル折り畳み構造の組み合わせを形成するL1、L2、およびL3ループを含む。
ある種の態様において、結合分子は、
Figure 2015518857
に記載されているHCDR3アミノ酸配列、またはその配列変種を含むVHドメインを含み、
X1は任意のアミノ酸、好ましくはWであり;
X2は任意のアミノ酸、好ましくはM、A、L、S、またはNであり; かつ
配列変種は、記載されている配列中に1つ、2つ、または3つのアミノ酸置換を含む。1つの特定の態様において、HCDR3アミノ酸のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:543、SEQ ID NO:566、SEQ ID NO:567、およびSEQ ID NO:568からなる群より選択される。
ある種の態様において、VHドメインは、
Figure 2015518857
に記載されているHCDR2アミノ酸配列、またはその配列変種をさらに含み、
X1は任意のアミノ酸、好ましくはA、P、またはRであり;
X2は任意のアミノ酸、好ましくはAまたはSであり;
X3は任意のアミノ酸、好ましくはSまたはGであり;
X4は任意のアミノ酸、好ましくはGまたはVであり;
X5は任意のアミノ酸、好ましくはAまたはTであり;
X6は任意のアミノ酸、好ましくはY、N、またはSであり;
X7は任意のアミノ酸、好ましくはG、A、またはTであり; かつ
配列変種は、記載されている配列中に1つ、2つ、または3つのアミノ酸置換を含む。1つの特定の態様において、HCDR2アミノ酸のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:545〜553からなる群より選択される。
ある種の態様において、VHドメインは、SEQ ID NO:562 [X1X2X3X4X5]に記載されているHCDR1アミノ酸配列、またはその配列変種をさらに含み、
X1は任意のアミノ酸、好ましくはSまたはTであり;
X2は任意のアミノ酸、好ましくはHまたはYであり;
X3は任意のアミノ酸、好ましくはAまたはRであり;
X4は任意のアミノ酸、好ましくはMまたはLであり;
X5は任意のアミノ酸、好ましくはSまたはYであり; かつ
配列変種は、記載されている配列中に1つ、2つ、または3つのアミノ酸置換を含む。1つの特定の態様において、HCDR1アミノ酸のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:555〜561からなる群より選択される。
ある種の態様において、VHドメインは、SEQ ID NO:543、566、567、および568からなる群より選択されるアミノ酸のアミノ酸配列を有するHCDR3、ならびにそれぞれ、SEQ ID NO:545および555に記載されているHCDR2およびHCDR1アミノ酸のアミノ酸配列を含む。ある種の態様において、結合分子はVLドメインをさらに含み、VLドメインは、SEQ ID NO:563に記載されているLCDR3アミノ酸配列、またはその配列変種を含み、配列変種は、記載されている配列中に1つ、2つ、または3つのアミノ酸置換を含む。ある種の態様において、VLドメインは、SEQ ID NO:564に記載されているLCDR2アミノ酸配列、またはその配列変種をさらに含み、配列変種は、記載されている配列中に1つ、2つ、または3つのアミノ酸置換を含む。ある種の態様において、VLドメインは、SEQ ID NO:565に記載されているLCDR1アミノ酸配列、またはその配列変種をさらに含み、配列変種は、記載されている配列中に1つ、2つ、または3つのアミノ酸置換を含む。ある種の態様において、VLドメインは、それぞれSEQ ID NO:563、564、および565に記載されているLCDR3、LCDR2、およびLCDR1アミノ酸のアミノ酸配列を含む。ある種の態様において、結合分子は、それぞれSEQ ID NO:544、545、および555に記載されているHCDR3、HCDR2、およびHCDR1アミノ酸のアミノ酸配列を有するVHドメイン; ならびにそれぞれSEQ ID NO:563、564、および565に記載されているLCDR3、LCDR2、およびLCDR1アミノ酸のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む。ある種の態様において、結合分子は、SEQ ID NO:86に記載されているアミノ酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有するVHドメインを含む。ある種の態様において、結合分子は、SEQ ID NO:39〜126および569〜571からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するVHドメインを含む。ある種の態様において、結合分子は、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:569、SEQ ID NO:570、およびSEQ ID NO:571より選択されるアミノ酸配列を有するVHドメインを含む。ある種の態様において、結合分子は、SEQ ID NO:350に記載されているアミノ酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有するVLドメインを含む。ある種の態様において、結合分子は、SEQ ID NO:303〜390からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するVLドメインを含む。ある種の態様において、結合分子は、SEQ ID NO:350であるアミノ酸配列を有するVLドメインを含む。ある種の態様において、結合分子は、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:569、SEQ ID NO:570、またはSEQ ID NO:571に記載されているアミノ酸配列を有するVHドメイン; およびSEQ ID NO:350に記載されているアミノ酸配列を有するVLドメインを含む。
ある種の態様において、結合分子は、ヒト1DFB抗体構造に見出されるヒトカノニカル折り畳み構造の1-3の組み合わせに対応するカノニカル折り畳み構造の組み合わせを形成するH1およびH2ループを含む。ある種の態様において、結合分子は、ヒト1MFA抗体構造に見出されるヒトカノニカル折り畳み構造の7λ-1の組み合わせに対応するカノニカル折り畳み構造の組み合わせを形成するL1およびL2ループを含む。ある種の態様において、結合分子は、ヒト3MUG抗体構造に見出されるヒトカノニカル折り畳み構造の7λ-1-4の組み合わせに対応するカノニカル折り畳み構造の組み合わせを形成するL1、L2、およびL3ループを含む。
ある種の態様において、結合分子は、2×10-5s-1未満のオフ速度(表面プラズモン共鳴によって測定されたkオフ)でヒトIL-6に結合するFab断片である。ある種の態様において、結合分子は、ピコモル未満の結合親和性でヒトIL-6抗原に結合する。ある種の態様において、結合分子は、1桁のフェムトモルの結合親和性でヒトIL-6抗原に結合する。ある種の態様において、結合分子は、その後の親和性成熟なしのラマの通常型抗体に由来する超可変ループを含む。ある種の態様において、結合分子は、0.1 pM未満のIC50でB9ハイブリドーマ細胞のIL-6誘導性集団を阻害する。
ある種の態様において、結合分子は、65℃超の融解温度(Tm)を示す。ある種の態様において、結合分子は、ラクダ科動物親抗体よりも高い融解温度を有する、ラクダ科動物親抗体の生殖細胞系列化された変種である。ある種の態様において、結合分子は、HEK293細胞における一過性発現の後に少なくとも20 mg/mlのレベルで発現される。ある種の態様において、結合分子は、約10.0未満、例えば、約6.0未満のEpiBase(登録商標)スコアを特徴とする。ある種の態様において、結合分子は、IL-6受容体へのIL-6の結合を阻害する。ある種の態様において、結合分子は、IL-6受容体へのgp130の結合を阻害する。ある種の態様において、結合分子は、ヒトおよびカニクイザル(cynomologus monkey) IL-6に特異的に結合する。ある種の態様において、結合分子は、IL-6に特異的に結合するラクダ科動物抗体由来の少なくとも1つのCDRを含む。
別の局面において、本発明は、前記請求項のいずれかに記載の結合分子および1つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。
別の局面において、本発明は、IL-6関連疾患またはIL-6関連障害を処置する方法であって、その処置を必要とする対象に、本発明の薬学的組成物の有効量を投与する段階を含む、方法を提供する。
別の局面において、本発明は、本明細書において開示される結合分子をコードする単離された核酸を提供する。
別の局面において、本発明は、本発明の核酸分子を含む組換え発現ベクターを提供する。
別の局面において、本発明は、本発明の組換え発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明の抗体のインビトロでのIL-6中和活性を測定する細胞増殖アッセイ法の結果を図示している。 本発明の抗体のインビボでの効果を測定する卵巣上皮がんマウス腫瘍異種移植片実験の結果を図示している。 図3Aおよび3Bは、本発明の61H7抗体のラクダ科動物由来の超可変ループ(L1〜L3、H1、およびH2)は、ヒト抗体の予測されたカノニカル折り畳みおよびカノニカル折り畳みの組み合わせを採用していることを示す。 図4Aおよび4Bは、本発明の68F2抗体および生殖細胞系列化されたその変種(129D3)のラクダ科動物由来の超可変ループ(L1〜L3、H1、およびH2)は、ヒト抗体の予測されたカノニカル折り畳みおよびカノニカル折り畳みの組み合わせを採用していることを示す。 Kabat番号付けによる、(A) IL-6受容体のF229; (B) IL-6受容体のF229および61H7 VHのW98、(C) IL-6受容体のF229および68F2 VLのY30; ならびに(D) IL-6受容体のF229、61H7 VHのW98および68F2 VHのV99と重なり合わされたIL-6の空間充填モデルを図示している。 Kabat番号付けによる、IL-6受容体の残基F229およびF279、ならびに68F2 VLの残基Y30および68F2 VHのV99と重なり合わされた、IL-6受容体結合に重要なIL-6上の2つの表面結合空隙の空間充填モデルを図示している(構造中のY32およびV104)。 図7Aおよび7Bは、(A) 本発明の他の生殖細胞系列化された変種IL-6抗体および(B) 他の参照基準抗体に対して固定化されたグリコシル化ヒトIL-6でBiacoreにおいて測定された場合の68F2および生殖細胞系列化されたその変種129D3の熱安定性を図示している。各図の上部は融解曲線を図示し、その一方で下部は各抗体のTm値を記載している。 抗体クローン68F2、129D3 (68F2の生殖細胞系列化された変種)、および103A1 (61H7の変種)の血清中安定性を図示している。参照基準抗体GL18も含めた。 完全ヒト抗体アダリムマブ(ヒュミラ)を含む、参照基準抗体(太字で示した)と比べて本発明のIL-6抗体の低い免疫原性(Epibase)スコアを図示している。 図10Aおよび10Bは、(A) 68F2および(B) 61H7のVHおよびVLの、その各生殖細胞系列化された変種129D3および111A7のフレームワーク領域との高レベルの配列相同性を示した、アライメントを図示している。各分子に導入された最小数のフレームワーク改変(合計13個)も示されている。 図11Aおよび11Bは、(A) CNTO328および(B) VH_ウサギ(ALD518)のVHおよびVKの、その各生殖細胞系列化された変種CNTO136およびVH_ヒト(ALD518)のフレームワーク領域との高レベルの配列相同性を示した、アライメントを図示している。各分子に導入された最小数のフレームワーク改変(合計36個および46個)も示されている。 カニクイザルにおける129D3 IgG1抗体およびその変種の薬物動態プロファイルを図示している。 本発明の抗体のインビボでの効果を測定する血清アミロイドA (SAA)マウスモデル実験の結果を図示している。 本発明の抗体のインビボでの効果を測定するマウス乾癬異種移植片実験の結果を図示している。 腎細胞がんマウス腫瘍異種移植片モデルにおいて本発明の抗体のインビボでの効果を測定する実験で認められた腫瘍成長データを図示している。 腎細胞がんマウス腫瘍異種移植片モデルにおいて本発明の抗体のインビボでの効果を測定する実験で認められた生存データのKaplan-Meierプロットを図示している。 腎細胞がんマウス腫瘍異種移植片モデルにおいて本発明の抗体のインビボでの効果を測定する実験で、全ての作用物質を3 mg/kgで投薬し、認められた腫瘍成長データを図示している。 腎細胞がんマウス腫瘍異種移植片モデルにおいて本発明の抗体のインビボでの効果を測定する実験で、全ての作用物質を3 mg/kgで投薬し、認められた生存データのKaplan-Meierプロットを図示している。
発明の説明
I. 定義
本発明がより容易に理解されうるように、ある種の用語を最初に定義する。
本明細書において用いられる場合、「IL-6」という用語はインターロイキン-6をいう。IL-6ヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、当技術分野において周知である。例示的なヒトIL-6アミノ配列はGenBank寄託GI: 10834984に記載されており、例示的なマウスIL-6アミノ配列はGenBank寄託GI: 13624311に記載されている。
本明細書において用いられる場合、「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に連結された4本のポリペプチド鎖、つまり2本の重(H)鎖および2本の軽(L)鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにその多量体(例えば、IgM)をいう。各重鎖は重鎖可変領域(VHと略される)および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は3つのドメインCH1、CH2、およびCH3を含む。各軽鎖は軽鎖可変領域(VLと略される)および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は1つのドメイン(CL1)を含む。VHおよびVL領域は、相補性決定領域(CDR)と称される超可変性の領域にさらに細分することができ、これらはフレームワーク領域(FR)と称されるより保存された領域に組み入れられている。
本明細書において用いられる場合、抗体の「抗原結合断片」という用語は、任意の天然に存在するか、酵素により得られるか、合成によるか、または遺伝子操作されている、ポリペプチドまたは糖タンパク質を含み、該ポリペプチドまたは該糖タンパク質は抗原に特異的に結合して複合体を形成する。抗体の抗原結合断片は、例えば、全長抗体分子から、いずれかの適切な標準的技法、例えばタンパク質分解消化または抗体の可変ドメインおよび任意で定常ドメインをコードするDNAの操作および発現を伴う組換え遺伝子操作技法を用いて得られれうる。抗原結合部分の非限定的な例としては、(i) Fab断片; (ii) F(ab')2断片; (iii) Fd断片; (iv) Fv断片; (v) 単鎖Fv (scFv)分子; (vi) dAb断片; および(vii) 抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位(例えば、単離された相補性決定領域(CDR))が挙げられる。ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびミニボディなどのその他の操作された分子も「抗原結合部分」という表現のなかに包含される。
本明細書において用いられる場合、「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、可変ドメインVHおよびVLのある種の部分が、抗体の間で配列が広範囲に異なっており、その標的抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性において用いられるという事実をいう。しかしながら、変異性は抗体の可変ドメイン全体にわたって均等に分布しているわけではない。変異性は、抗原結合部位の一部を形成するVLドメインおよびVHドメインの各々における「超可変ループ」と呼ばれる3つのセグメントに集中している。Vラムダ軽鎖ドメインの第1、第2、および第3の超可変ループは、本明細書においてL1(λ)、L2(λ)、およびL3(λ)といわれ、VLドメイン中の残基番号24〜33 (L1(λ), 9、10、または11個のアミノ酸残基からなる)、49〜53 (L2(λ), 3個の残基からなる)、および90〜96 (L3(λ), 5個の残基からなる)を含むと定義されうる(Morea et al., Methods 20:267-279 (2000))。Vカッパ軽鎖ドメインの第1、第2、および第3の超可変ループは、本明細書においてL1(κ)、L2(κ)、およびL3(κ)といわれ、VLドメイン中の残基番号25〜33 (L1(κ), 6、7、8、11、12、または13個の残基からなる)、49〜53 (L2(κ), 3個の残基からなる)、および90〜97 (L3(κ), 6個の残基からなる)を含むと定義されうる(Morea et al., Methods 20:267-279 (2000))。VHドメインの第1、第2、および第3の超可変ループは、本明細書においてH1、H2、およびH3といわれ、VHドメイン中の残基番号25〜33 (H1, 7、8または9個の残基からなる)、52〜56 (H2, 3または4個の残基からなる)、および91〜105 (H3, 長さに大きな変異性がある)を含むと定義されうる(Morea et al., Methods 20:267-279 (2000))。
別段の指示がない限り、L1、L2、およびL3という用語はそれぞれ、VLドメインの第1、第2、および第3の超可変ループをいい、VカッパおよびVラムダの両アイソタイプから得られる超可変ループを包含する。H1、H2、およびH3という用語はそれぞれ、VHドメインの第1、第2、および第3の超可変ループをいい、γ、ε、δ、α、またはμを含む、公知の重鎖アイソタイプのいずれかより得られる超可変ループを包含する。
超可変ループL1、L2、L3、H1、H2、およびH3はそれぞれ、以下に定義されるように、「相補性決定領域」または「CDR」の一部を含みうる。超可変ループ(HV)は構造に基づいて定義されるが、相補性決定領域(CDR)は配列可変性に基づいて定義され(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1983)、HVおよびCDRの境界はいくつかのVHおよびVLドメインにおいて異なりうるので、「超可変ループ」および「相補性決定領域」という用語は、厳密には同義語ではない。
VLおよびVHドメインのCDRは、典型的には、以下のアミノ酸を含むと定義することができる: 軽鎖可変ドメイン中の残基番号24〜34 (CDRL1)、50〜56 (CDRL2)、および89〜97 (CDRL3)、ならびに重鎖可変ドメイン中の残基番号31〜35または31〜35b (CDRH1)、50〜65 (CDRH2)、および95〜102 (CDRH3); (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。したがって、HVは、対応するCDRのなかに含まれうるが、VHおよびVLドメインの「超可変ループ」への本明細書における言及は、別段の指示がない限り、対応するCDRを同様に包含し、その逆の場合も同じであるものと解釈されるべきである。
より高度に保存された可変ドメイン部分は、以下に定義されるように、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、3つの超可変ループによって結び付けられた、β-シート配置を主にとる、4つのFR (それぞれFR1、FR2、FR3、およびFR4)を含む。各鎖の超可変ループはFRに近接してまとまっており、もう一方の鎖の超可変ループとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。抗体の構造分析から、相補性決定領域によって形成される結合部位の形状と配列との間の関係が明らかにされた(Chothia et al., J. Mol. Biol. 227: 799-817 (1992)); Tramontano et al,, J. Mol. Biol, 215: 175-182 (1990))。それらの高度な配列可変性にもかかわらず、これら6つのループの5つは、「カノニカル構造」と呼ばれる、主鎖高次構造の小さいレパートリーのみを採用している。これらの高次構造は、第一にループの長さにより決定され、かつ第二に、それらのパッキング、水素結合または通常でない主鎖高次構造を推定する能力を通じ、高次構造を決定するループ内およびフレームワーク領域内の特定位置での重要残基の存在により決定される。
本明細書において用いられる場合、「相補性決定領域」または「CDR」という用語は、重鎖および軽鎖の両ポリペプチドの可変領域内に見出される近接していない抗原結合部位をいう。これらの特定の領域はKabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977)およびKabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991)により、ならびにChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)によりおよびMacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)により記述されており、そこでこれらの定義は、互いに比較した場合のアミノ酸残基の重複またはサブセットを含んでいる。先に引用した各参考文献により定義されたCDRを包含しているアミノ酸残基を、比較のために示す。好ましくは、「CDR」という用語は、配列比較を基づいてKabatにより定義されるCDRである。
（表１）CDR定義
Figure 2015518857
1残基番号付けは、前記のKabatらの命名法に従う。
2残基番号付けは、前記のChothiaらの命名法に従う。
3残基番号付けは、前記のMacCallumらの命名法に従う。
本明細書において用いられる場合、「フレームワーク領域」または「FR領域」という用語は、可変領域の一部であるが、CDRの一部ではない、アミノ酸残基を含む(例えば、CDRのKabat定義を用いる)。それゆえ、可変領域フレームワークは、長さが約100〜120個のアミノ酸であるが、CDRの外側のそれらのアミノ酸のみを含む。重鎖可変領域の具体例およびKabatらにより定義されたCDRについて、フレームワーク領域1は、アミノ酸番号1〜30を包含する可変領域のドメインに相当し; フレームワーク領域2は、アミノ酸番号36〜49を包含する可変領域のドメインに相当し; フレームワーク領域3は、アミノ酸番号66〜94を包含する可変領域のドメインに相当し、かつフレームワーク領域4は、アミノ酸番号103からその可変領域の末端までの可変領域のドメインに相当している。軽鎖のフレームワーク領域は同様に、軽鎖可変領域CDRの各々により隔てられている。同様に、ChothiaらまたはMcCallumらによるCDRの定義を用い、フレームワーク領域の境界は、上述のように、それぞれのCDR末端により隔てられる。好ましい態様において、CDRは、Kabatにより定義されている通りである。
天然に存在する抗体においては、各単量体抗体上に存在する6つのCDRは、抗体が、水性環境においてその三次元配置を担うため、抗原結合部位を形成するように特異的に位置するアミノ酸の短い非隣接配列である。重鎖および軽鎖可変ドメインの残部は、アミノ酸配列の、より低い分子間可変性を示し、フレームワーク領域と称される。フレームワーク領域は大部分、β-シート高次構造を採用し、かつCDRは、β-シート構造を結び付け、場合によっては、β-シート構造の一部を形成しているループを形成する。したがって、これらのフレームワーク領域は、鎖間非共有相互作用によって正確な方向に6つのCDRを位置付けることを可能にする骨格を形成するように作用する。位置付けられたCDRによって形成される抗原結合部位は、免疫反応性抗原上のエピトープに補完的な表面を画定する。この補完的表面は、免疫反応性抗原エピトープへの抗体の非共有結合を促進する。CDRの位置は、当業者によって容易に特定されることができる。
本明細書において用いられる場合、「F229空隙」という用語は、Boulanger et al., 2003, Science 27, 2101-2104に記載されているIL-6/IL-6受容体複合体におけるヒトIL-6受容体のフェニルアラニン229残基によって占有されるヒトIL-6の表面空隙をいい、その文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
本明細書において用いられる場合、「F279空隙」という用語は、Boulanger et al., 2003, Science 27, 2101-2104に記載されているIL-6/IL-6受容体複合体におけるヒトIL-6受容体のフェニルアラニン279残基によって占有されるヒトIL-6の表面空隙をいい、その文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
本明細書において用いられる場合、「ラクダ科動物由来」という用語は、ラクダ科動物(例えば、ラマ)の抗体分子において天然に存在する抗体可変領域のアミノ酸配列(例えば、フレームワークまたはCDR配列)をいう。ラクダ科動物由来抗体は、非限定的に、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、ビクーナ、グアナコ、またはラクダを含む、任意のラクダ科動物の種から得られうる。ある種の態様において、ラクダ科動物(例えば、ラマ)は、IL-6 (例えば、ヒトIL-6)で能動免疫されている。ある種の態様において、「ラクダ科動物由来」という用語は、ラクダ科動物の通常型の抗体レパートリーに由来し、かつラクダ科動物の重鎖のみの抗体(VHH) レパートリーに由来する抗体配列を特に除外する抗体配列に限定される。
本明細書において用いられる場合、「通常型抗体」という用語は、IgA、IgG、IgD、IgE、またはIgMを含む、任意のアイソタイプの抗体をいう。天然のまたは天然に存在する「通常型の」ラクダ科動物抗体は、通常、2本の同一の軽(L)鎖および2本の同一の重(H)鎖から構成される、ヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は1つの共有結合性のジスルフィド結合によって重鎖に連結されるが、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変わる。各重鎖および軽鎖はまた、規則的に間隔をあけて配置された鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は一方の末端(N末端)に、可変ドメイン(VH)、その後にいくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は一方の末端(N末端)に可変ドメイン(VL)およびその他方の末端に定常ドメイン(CL)を有する; 軽鎖の定常ドメインは重鎖の最初の定常ドメインと整列され、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列される。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメイン間の界面を形成していると考えられている。
本明細書において用いられる場合、「〜に特異的に結合する」という用語は、抗体またはその抗原結合断片が少なくとも約1×10-6 (例えば、1×10-6 M、1×10-7 M、1×10-8 M、1×10-9 M、1×10-10 M、1×10-11 M、1×10-12 M、1×10-13 M、1×10-14 M、1×10-15 Mもしくはそれ以上)、好ましくは1×10-12 M〜1×10-15 Mもしくはそれ以上のKDでIL-6に結合する能力、および/または非特異的抗原に対するその親和性よりも少なくとも2倍高い親和性でIL-6に結合する能力をいう。しかしながら、抗体またはその抗原結合断片は、配列が関連している2種もしくはそれ以上の抗原に特異的に結合できることが理解されるものとする。例えば、本明細書において開示される抗体またはその抗原結合断片は、ヒトIL-6および非ヒト(例えば、マウスもしくは非ヒト霊長類) IL-6の両方に特異的に結合することができる。
本明細書において用いられる場合、「抗原」という用語は、抗体可変領域によって認識される結合部位またはエピトープをいう。
本明細書において用いられる場合、「処置する(treat)」、「処置すること(treating)」および「処置(treatment)」という用語は、本明細書において記述される治療的または予防的手段をいう。「処置」の方法では、疾患もしくは障害または再発性疾患もしくは障害の1つもしくは複数の症状を予防するか、該症状を治癒するか、該症状を遅延させるか、該症状の重症度を緩和するため、または、該症状を改善するかするために、あるいはそのような処置がない場合に予想される以上に対象の生存期間を延長させるために、本発明の抗体またはその抗原結合断片の、対象、例えば、IL-6関連疾患もしくはIL-6関連障害(例えば、炎症およびがん)を有する対象またはそのような疾患もしくは障害を有しやすい対象への投与を用いる。
本明細書において用いられる場合、「IL6関連疾患またはIL-6関連障害」という用語は、IL-6活性に関連した疾患状態および/または症状を含む。例示的なIL6関連疾患またはIL-6関連障害としては、炎症性疾患(例えば、関節リウマチおよび全身性エリテマトーデスのような炎症性自己免疫疾患)、がん(例えば、前立腺がん、びまん性大細胞型リンパ腫、多発性骨髄腫、および腎細胞がん)、ならびにがんに関連した障害(例えば、拒食症および悪液質)が挙げられるが、これらに限定されることはない。
本明細書において用いられる場合、「有効量」という用語は、対象に投与される場合に、本明細書において記述される、IL-6関連疾患またはIL-6関連障害の処置、予後診断または診断を達成するのに十分である抗体またはその抗原結合断片のその量をいう。治療的有効量は、処置されている対象および疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与の方法などに依って変わるものと考えられ、当業者はこれを容易に判定することができる。投与の投与量は、例えば、本発明による抗体またはその抗原結合断片およそ1 ng〜およそ10,000 mg、およそ1 ug〜およそ5,000 mg、およそ1 mg〜およそ1,000 mg、およそ10 mg〜およそ100 mgに及ぶことができる。投与計画は、最適な治療反応を提供するように調節されうる。有効量は、結合ポリペプチドの任意の有毒または有害作用(すなわち、副作用)が最小限に抑えられ、かつ/またはそれを有益な効果が上回るものでもある。
本明細書において用いられる場合、「対象」という用語は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。
本明細書において用いられる場合、「表面プラズモン共鳴」という用語は、例えばBIAcore(商標)システム(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare, Piscataway, NJ)を用い、バイオセンサマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によってリアルタイムの相互作用分析を可能にする光学現象をいう。
本明細書において用いられる場合、「KD」という用語は、特定の結合ポリペプチド/抗原の相互作用の平衡解離定数をいう。
本明細書において用いられる場合、「オフ速度」という用語は、特定の結合相互作用に対する解離速度(Kオフ)をいう。
II. IL-6結合分子
1つの局面において、本発明は、IL-6に特異的に結合しかつその活性を阻害する、結合分子(抗体またはその抗原結合断片)を提供する。そのような結合分子は一般に、本明細書において、表13〜18に記載されている少なくとも1つのCDR領域アミノ酸配列を含む。
ヒトIL-6受容体との複合体におけるヒトIL-6の結晶構造の分析から、IL-6受容体の2つの残基F229およびF279がIL-6/IL-6受容体の相互作用に重要であることが示された(例えば、Boulanger et al., 2003, Science 27, 2101-2104を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。IL-6/IL-6受容体複合体において、F229およびF279はIL-6の表面上の別個の空隙に埋め込まれる。ある種の態様において、本発明の結合分子はIL-6上のこれらの空隙を用いて、高い親和性結合を達成する。1つの特定の態様において、本発明の結合分子は抗体CDR領域を含み、該CDR領域がアミノ酸残基を含み、結合分子がIL-6に結合すると該アミノ酸残基がIL-6上のF229空隙またはF279空隙に埋め込まれる。
概して、本発明の結合分子は、(例えば、IL-6受容体へのIL-6の結合に拮抗することによって)IL-6活性を阻害する。ある種の態様において、結合分子はまた、IL-6受容体へのgp130の結合を阻害する。しかしながら、他の態様において、結合分子は、IL-6受容体へのgp130の結合を阻害することなくIL-6に結合することができる。
本発明の結合分子は概して、IL-6に対する高い親和性を有し、インビボおよびインビトロでのIL-6活性の阻害において概ね極めて強力である。ある種の態様において、本発明の結合分子は、約1×10-4s-1未満(例えば、約9×10-5、8×10-5、7×10-5、6×10-5、5×10-5、4×10-5、3×10-5、2×10-5、および1×10-5)のオフ速度(表面プラズモン共鳴によって測定されたkオフ)でヒトIL-6に結合する。他の態様において、本発明の結合分子は0.1 pM未満のIC50でB9ハイブリドーマ細胞のIL-6誘導性増殖を阻害する。ある種の他の態様において、本発明の結合分子は、IL-6に結合する所定の抗体と競合し、このような所定の抗体は、表13〜18に記載されているVHおよびVLアミノ酸配列より選択されるVH配列およびVL配列を含む。ある種の他の態様において、本発明の結合分子は、IL-6に結合する所定の抗体の結合の少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%を競合除外する。ある種の他の態様において、本発明の結合分子は、IL-6への20A4、24D10、68F2、61H7、129D3、または111A7の結合と競合し、例えば、IL-6へのこれらの抗体の1つの結合の少なくとも50%、60%、70%、80%、または90%を競合除外する。ある種の他の態様において、本発明の結合分子は、IL-6への17F10、24C9、18C11、29B11、28A6、または126A3の結合と競合し、例えば、IL-6へのこれらの抗体の1つの結合の少なくとも50%、60%、70%、80%、または90%を競合除外する。
概して、本発明の結合分子はまた、高い熱安定性を示す。ある種の態様において、結合分子は、55℃超(例えば、少なくとも56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75C、またはそれ以上)の融解温度(Tm)を示す。ある種の例示的な態様において、本発明のIL-6結合分子は、その親のラクダ科動物由来対応物に匹敵する熱安定性またはそれよりも高い熱安定性を示す生殖細胞系列の変種である。ある種の例示的な態様において、熱安定性は、1時間100 μg/mlの濃度で適切な緩衝液(例えば、PBS)中でのインキュベーションの後に測定される。他の例示的な態様において、IL-6結合分子の熱安定性は、完全長IgGの形式(例えば、IgG1またはIgG4 Fc領域を含む)で示したものである。
本発明の結合分子はまた、低レベルの非機能的な混入物質、例えば高分子量または低分子量の凝集体とともに、高発現レベルの機能的抗体を特徴とする。例えば、本発明のIL-6結合分子は、少なくとも20 mg/L (例えば、少なくとも20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 mg/L、またはそれ以上)の産生レベルを特徴としうる。ある種の例示的な態様において、IL-6結合分子は、その親のラクダ科動物由来対応物に匹敵する発現レベルまたはそれよりも高い発現レベルを示す生殖細胞系列の変種である。他の例示的な態様において、発現レベルは、本発明のIL-6結合分子の完全長IgGの形式を用いて、例えば、HEK293細胞における一過性発現によって判定される。
本発明の結合分子はまた、低い予測された免疫原性を概ね特徴とする。例えば、本発明のIL-6結合分子は、15.0未満、約12.0よりも低い、または約10.0未満のEpiBase(登録商標)スコア(例えば、総DRB1スコア)を示す。ある種の例示的な態様において、結合分子は、約9.0、約8.0、約7.0、または約6.0の免疫原性スコアを示す。他の態様において、免疫原性スコアは、ヒュミラ(登録商標)の免疫原性スコア未満、例えば、約6.0、約5.0、または約4.0である。
本発明の結合分子は、ヒトおよびカニクイザルIL-6を非限定的に含む任意のIL-6に結合することができる。好ましくは、結合分子は、ヒトIL-6およびカニクイザルIL-6の両方に結合することができる。
(i) IL-6抗体またはその抗原結合断片
ある種の態様において、本発明は、IL-6 (例えば、ヒトIL-6)に特異的に結合しかつIL-6受容体へのIL-6の結合に拮抗する、抗体またはその抗原結合断片を提供する。本発明の例示的なFabクローンのVH、VL、およびCDR配列は、表13〜18に記載されている。本発明の抗体は、これらのFabクローンのフレームワークおよび/またはCDRアミノ酸配列のいずれかを含むことができる。
本発明の抗体は、アミノ酸残基(例えば、トリプトファンまたはチロシンのような芳香族アミノ酸)を有するCDR領域配列を含み、IL-6への抗体または断片の結合の際に該アミノ酸残基がIL-6上のF229空隙に埋め込まれることができる。例示的な抗体は、Kabatによる位置番号98のトリプトファンを有するVHドメイン、および/またはKabatによる位置番号30のチロシンを有するVLドメインを含む。そのような抗体はIL-6に対して特に高い親和性を有する。
さらにまたはその代わりに、本発明の抗体は、アミノ酸残基を有するCDR領域配列を含み、IL-6への抗体または断片の結合の際に該アミノ酸残基がIL-6上のF279空隙に埋め込まれることができる。例示的な抗体は、Kabatによる位置番号99のバリンを有するVHドメインを含む。
ある種の態様において、本発明の抗IL-6抗体または断片は、表13〜16に記載されているVH由来の1つ、2つ、または3つのCDRアミノ酸配列を含んだVHを含む。
ある種の態様において、本発明の抗IL-6抗体または断片は、表13〜16に記載されているVL由来の1つ、2つ、または3つのCDRアミノ酸配列を含んだVLを含む。
ある種の態様において、本発明の抗IL-6抗体または断片は、表13〜18に記載されているVH由来の1つ、2つ、または3つのCDRアミノ酸配列を含んだVH; および表13〜18に記載されているVL由来の1つ、2つ、または3つのCDRアミノ酸配列を含んだVLを含む。好ましい態様において、全6つのCDRが同じFabクローン由来である。
ある種の態様において、本発明の抗IL-6抗体または断片は、表13〜16に記載されているVHを含む。
ある種の態様において、本発明の抗IL-6抗体または断片は、表13〜16に記載されているVLを含む。
ある種の態様において、本発明の抗IL-6抗体または断片は、表13〜16に記載されているVHおよびVLを含む。
ある種の態様において、本発明の抗IL-6抗体または断片は、表13〜16に記載されている単一のFabクローン由来のVHおよびVLを含む。
ある種の態様において、本発明は、IL-6に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、表13〜18に記載されているCDR、VH、およびVLアミノ酸配列の配列変種を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
ある種の態様において、配列変種は、表13〜16に記載されているVHまたはVL領域アミノ酸配列と約80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するVHおよび/またはVLアミノ酸配列を含む。
他の態様において、配列変種は、1つまたは複数の保存的アミノ酸置換の導入によって改変された、表13〜18より選択されるVH、VL、またはCDRアミノ酸配列を含む。保存的アミノ酸置換は、同じクラスのアミノ酸による、あるクラスのアミノ酸の置換を含み、この場合にクラスは、例えば、標準的なDayhoff頻度交換マトリックスまたはBLOSUMマトリックスによって判定すると、天然に見出される相同なタンパク質における共通の物理化学的なアミノ酸側鎖特性および高い置換頻度によって規定される。アミノ酸側鎖の6つの一般的なクラスに分類されており、これにはクラスI (Cys); クラスII (Ser、Thr、Pro、Ala、Gly); クラスIII (Asn、Asp、Gln、Glu); クラスIV (His、Arg、Lys); クラスV (Ile、Leu、Val、Met); およびクラスVI (Phe、Tyr、Trp)が含まれる。例えば、Asn、Gln、またはGluのような別のクラスIII残基によるAspの置換は、保存的置換である。したがって、IL-6抗体またはその抗原結合断片において予測された非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じクラス由来の別のアミノ酸残基に置き換えられる。抗原結合を排除しないアミノ酸保存的置換を特定する方法は、当技術分野において周知である(例えば、Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); およびBurks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)を参照のこと)。
他の態様において、配列変種は抗体産生および/または製造を改善するように、例えば、メチオニンをアラニン、セリン、またはロイシンに交換するように改変された、表13〜18より選択されるVH、VLまたはCDRアミノ酸配列を含む。ある種の他の態様において、配列変種は抗体産生を改善するように、例えば、グルタミンをグルタミン酸にまたはアスパラギンをアラニンもしくは関連したアミノ酸に交換するように改変された、表13〜18より選択されるVH、VL、またはCDRアミノ酸配列を含む。例示的な態様において、表16のVHアミノ酸配列のCDR領域外側の1つまたは複数のグルタミンがグルタミン酸に変更されており、例えば、SEQ ID NO. 152の位置番号1、3、5、もしくは16またはその任意の組み合わせの1つまたは複数のグルタミンが、抗体産生または安定性を改善するようにグルタミン酸に変更されている。1つの特定の態様において、SEQ ID NO. 152の位置番号1のグルタミンは、グルタミン酸に変更されている。
(ii) 高いヒト相同性を有するIL-6結合分子
ある種の局面において、本発明のIL-6結合分子は、高いヒト相同性を有する抗体(または抗原結合断片)である。抗体は、VHドメインおよびVLドメインが、一緒になって、最もマッチしているヒト生殖細胞系列VHおよびVL配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を示すなら、「高いヒト相同性」を有するとみなされるであろう。高いヒト相同性を有する抗体は、例えば、ラクダ科動物の通常型抗体のVHおよびVLドメインを含む抗体、ならびにそのような抗体の操作された、特にヒト化された変種、また「完全にヒトの」抗体を含む、ヒト生殖細胞系列配列と十分に高い配列同一性%を示す、未変性の非ヒト抗体のVHおよびVLドメインを含む抗体を含みうる。
1つの態様において、高いヒト相同性を有する抗体のVHドメインは、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3、およびFR4にわたり、1つまたは複数のヒトVHドメインと80%またはそれ以上のアミノ酸配列同一性または配列相同性を示しうる。他の態様において、本発明のポリペプチドのVHドメインと、最もマッチしているヒト生殖細胞系列VHドメイン配列との間のアミノ酸配列同一性または配列相同性は、85%もしくはそれ以上、90%もしくはそれ以上、95%もしくはそれ以上、97%もしくはそれ以上、または最大99%もしくはさらに100%でありうる。
1つの態様において、高いヒト相同性を有する抗体のVHドメインは、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3、およびFR4にわたり、最もマッチしたヒトVH配列と比べて、10個以下(例えば10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1個)のアミノ酸配列置換を含みうる。
別の態様において、高いヒト相同性を有する抗体のVLドメインは、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3、およびFR4にわたり、1つまたは複数のヒトVLドメインと80%またはそれ以上の配列同一性または配列相同性を示しうる。他の態様において、本発明のポリペプチドのVLドメインと、最もマッチしているヒト生殖細胞系列VLドメイン配列との間のアミノ酸配列同一性または配列相同性は、85%もしくはそれ以上、90%もしくはそれ以上、95%もしくはそれ以上、97%もしくはそれ以上、または最大99%もしくはさらに100%でありうる。
1つの態様において、高いヒト相同性を有する抗体のVLドメインは、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3、およびFR4にわたり、最もマッチしたヒトVL配列と比べて、10個以下(例えば10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1個)のアミノ酸配列置換を含みうる。
高いヒト相同性を有する抗体はまた、以下で詳細に論じられるように、ヒトまたはヒト様のカノニカルな折り畳みを有する超可変ループまたはCDRを含みうる。1つの態様において、高いヒト相同性を有する抗体のVHドメインまたはVLドメインのいずれかにおける少なくとも1つの超可変ループまたはCDRは、非ヒト抗体、例えばラクダ科動物の種由来の通常型抗体のVHまたはVLドメインから得られうるまたはもたらされうるが、その上ヒト抗体において存在するカノニカル折り畳み構造と実質的に同一である予測されたまたは実際のカノニカル折り畳み構造を示す。
高いヒト相同性を有する抗体は、ヒトまたはヒト様のカノニカル折り畳み構造を必ずしも保有しないことが留意されるべきである。例えば、霊長類抗体は、ヒト抗体と高い配列相同性を有するが、ヒトまたはヒト様のカノニカル折り畳み構造を保有しないことが多い。
ヒト生殖細胞系列によりコードされたVHドメインおよびVLドメインの両方に存在する超可変ループの一次アミノ酸配列は定義により高度に可変性であるが、VHドメインのCDR H3以外の全ての超可変ループは、カノニカルな折り畳みと称されるわずかに数種類の独特な構造の高次構造を採用し(Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Tramontano et al. Proteins 6:382-94 (1989))、これが超可変ループの長さおよびいわゆるカノニカルなアミノ酸残基の存在の両方に依存する(Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))ということは、当技術分野において十分に確立されている。無傷のVHまたはVLドメイン中の超可変ループの実際のカノニカル構造は、構造解析(例えばX線結晶解析)によって決定することができるが、しかし特定の構造に特徴的である重要なアミノ酸残基を基づいて、カノニカル構造を予測することも可能である(以下でさらに論じられる)。本質的に、各々のカノニカル構造を決定する残基の特異的パターンは、「サイン(signature)」を生じ、該サインによって、そのカノニカル構造が未知構造のVHまたはVLドメインの超可変ループにおいて認識されることを可能になり; それゆえカノニカル構造は、一次アミノ酸配列だけに基づいて予測することができる。
高いヒト相同性を有する抗体におけるいずれかの所与のVHまたはVL配列の超可変ループに関して予測されたカノニカル折り畳み構造は、www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html、www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/antibodies.htmlおよびwww.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines/Vbase_hVk.htmlから公に利用可能であるアルゴリズムを用いて解析することができる。これらのツールは、問い合わせVHまたはVL配列を、公知のカノニカル構造のヒトVHまたはVLドメイン配列に対して並置すること、ならびに問い合わせ配列の超可変ループに関して生じたカノニカル構造の予測を可能にする。
VHドメインの場合、H1およびH2ループは、下記の判定基準の少なくとも第一の判定基準および好ましくは両方が満たされる場合、ヒト抗体において存在することが分かっているカノニカル折り畳み構造と「実質的に同一の」カノニカル折り畳み構造を有するものとして、スコア化されうる。
1. 残基の数により決定された、最もマッチングしているヒトカノニカル構造クラスと同一の長さ。
2. 対応するヒトH1およびH2カノニカル構造クラスに関して記述された重要なアミノ酸残基との少なくとも33%の同一性、好ましくは少なくとも50%の同一性。
(前述の解析を目的として、H1およびH2ループは、個別に処理され、かつ各々その最もマッチングしているヒトカノニカル構造クラスに対し比較されることに留意されたい。)
前記の解析は、関心対象の抗体のH1およびH2ループのカノニカル構造の予測に依る。例えばX線結晶解析を基づいて、関心対象の抗体のH1およびH2ループの実際の構造が分かっているなら、関心対象の抗体のH1およびH2ループはまた、そのループの長さが最もマッチングしているヒトカノニカル構造クラスの長さと異なる(典型的には±1または±2個のアミノ酸だけ)が関心対象の抗体のH1およびH2ループの実際の構造がヒトカノニカル折り畳み構造とマッチする場合に、ヒト抗体において存在することが分かっているカノニカル折り畳み構造と「実質的に同一の」カノニカル折り畳み構造を有するものとしてスコア化されうる。
ヒトVHドメインの第一および第二の超可変ループ(H1およびH2)に関してヒトカノニカル構造クラスにおいて見出された重要なアミノ酸残基は、Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799-817 (1992)によって記述されており、この内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。特に、参照により本明細書に具体的に組み入れられるChothia et al.の802頁の表3は、ヒト生殖細胞系列において見出されたH1カノニカル構造に重要な部位での好ましいアミノ酸残基を列記しているのに対し、同じく参照により具体的に組み入れられる803頁の表4は、ヒト生殖細胞系列において見出されたCDR H2カノニカル構造に重要な部位での好ましいアミノ酸残基を列記している。
1つの態様において、高いヒト相同性を有する抗体のVHドメインにおけるH1およびH2の両方は、ヒト抗体において存在するカノニカル折り畳み構造と実質的に同一である予測されたまたは実際のカノニカル折り畳み構造を示す。
高いヒト相同性を有する抗体は、超可変ループH1およびH2が、少なくとも1つのヒト生殖細胞系列VHドメインにおいて存在することが分かっているカノニカル構造の組み合わせと同一であるカノニカル折り畳み構造の組み合わせを形成するVHドメインを含みうる。H1およびH2でのカノニカル折り畳み構造のある種の組み合わせのみが、ヒト生殖細胞系列によりコードされるVHドメインにおいて実際に存在することが認められている。ある態様において、高いヒト相同性を有する抗体のVHドメインにおけるH1およびH2は、非ヒト種、例えばラクダ科動物の種のVHドメインから得られうるが、その上ヒト生殖細胞系列または体細胞変異VHドメインにおいて存在することが分かっているカノニカル折り畳み構造の組み合わせと同一である予測されたまたは実際のカノニカル折り畳み構造の組み合わせを形成する。非限定的な態様において、高いヒト相同性を有する抗体のVHドメインにおけるH1およびH2は、非ヒト種、例えばラクダ科動物の種のVHドメインから得ることができ、かつ以下のカノニカル折り畳みの組み合わせ: 1-1、1-2、1-3、1-6、1-4、2-1、3-1、および3-5の1つを形成する。
高いヒト相同性を有する抗体は、ヒトVHとの高い配列同一性/配列相同性の両方を示し、かつヒトVHと構造相同性を示す超可変ループを含むVHドメインを含みうる。
高いヒト相同性を有する抗体のVHドメインにおけるH1およびH2に存在するカノニカルな折り畳み、ならびにそれらの組み合わせに関して、全体の一次アミノ酸配列の同一性という点で、高いヒト相同性を有する抗体のVHドメインと最も合ったマッチを示すヒトVH生殖細胞系列配列に「補正」されることは有利でありうる。例として、最も合った配列マッチがヒト生殖細胞系列のVH3ドメインとのマッチであるなら、H1およびH2に関して、ヒトVH3ドメインにおいても天然に存在するカノニカルな折り畳みの組み合わせを形成することは有利でありうる。非ヒト種から得られた高いヒト相同性を有する抗体、例えば、ラクダ科動物の通常型抗体から得られたVHおよびVLドメインを含む抗体、特にヒト化されたラクダ科動物のVHおよびVLドメインを含む抗体の場合、このことは特に重要でありうる。
したがって、1つの態様において、高いヒト相同性を有するIL-6抗体のVHドメインは、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3、およびFR4にわたりヒトVHドメインと80%もしくはそれ以上、85%もしくはそれ以上、90%もしくはそれ以上、95%もしくはそれ以上、97%もしくはそれ以上、または最大99%もしくはさらに100%の配列同一性または配列相同性を示すことができ、かつ加えて、同じ抗体のH1およびH2は、非ヒトの(例えば、ラクダ科動物の種からもたらされた)VHドメインから得られるが、同じヒトVHドメインにおいて天然に存在することが分かっているカノニカルな折り畳みの組み合わせと同じである予測されたまたは実際のカノニカル折り畳み構造の組み合わせを形成する。
例えば、1つの例示的な態様において、本発明のIL-6抗体(例えば、61H7)のH1およびH2ループは、例えば、ヒト抗体構造1DFBにおいて見出される通りの、1-2の組み合わせのヒトカノニカル折り畳み構造を含みうる。別の例示的な態様において、本発明のIL-6抗体(例えば、68F2またはその生殖細胞系列の変種129D3)のH1およびH2ループは、例えば、ヒト抗体構造1ACYにおいて見出される通りの、3-1の組み合わせのヒトカノニカル折り畳み構造を含みうる。
他の態様において、高いヒト相同性を有する抗体のVLドメインにおけるL1およびL2は各々、非ヒト種のVLドメイン(例えば、ラクダ科動物由来のVLドメイン)から得られ、かつ各々、ヒト抗体において存在するカノニカル折り畳み構造と実質的に同一である予測されたまたは実際のカノニカル折り畳み構造を示す。
VHドメインと同様に、Vラムダ型およびVカッパ型の両方のVLドメインの超可変ループは、長さによって、および特定のカノニカル位置での重要なアミノ酸残基の存在によっても一部決定される、限られた数の高次構造またはカノニカル構造を採用することができる。
高いヒト相同性を有する関心対象の抗体内において、非ヒト種、例えばラクダ科動物の種のVLドメインから得られたL1、L2、およびL3ループは、少なくとも下記の第一の、および好ましくは両方の、判定基準が満たされる場合、ヒト抗体において存在することが分かっているカノニカル折り畳み構造と「実質的に同一の」カノニカル折り畳み構造を有するものとして、スコア化されうる。
1. アミノ酸残基の数により決定された、最もマッチングしているヒトの構造クラスと同一の長さ。
2. VラムダまたはVカッパレパートリーのいずれかからの対応するヒトL1またはL2カノニカル構造クラスに関して記述された重要なアミノ酸残基との少なくとも33%の同一性、好ましくは少なくとも50%の同一性。
(前述の解析を目的として、L1およびL2ループは、個別に処理され、かつ各々その最もマッチングしているヒトカノニカル構造クラスに対し比較されることに留意されたい。)
前記の解析は、関心対象の抗体のVLドメインにおけるL1、L2、およびL3ループのカノニカル構造の予測に依る。例えばX線結晶解析を基づいて、L1、L2、およびL3ループの実際の構造が分かっているなら、関心対象の抗体から得られたL1、L2、またはL3ループはまた、そのループの長さが最もマッチングしているヒトカノニカル構造クラスの長さと異なる(典型的には±1または±2個のアミノ酸だけ)ものの、これらのラクダ科動物ループの実際の構造がヒトカノニカル折り畳みとマッチする場合に、ヒト抗体において存在することが分かっているカノニカル折り畳み構造と「実質的に同一の」カノニカル折り畳み構造を有するものとしてスコア化されうる。
ヒトVラムダおよびVカッパドメインのCDRに関してヒトカノニカル構造クラスにおいて見出された重要なアミノ酸残基は、Morea et al. Methods, 20: 267-279 (2000)およびMartin et al., J. Mol. Biol., 263:800-815 (1996)によって記述されている。同じくヒトVカッパドメインの構造的レパートリーは、Tomlinson et al. EMBO J. 14:4628-4638 (1995)によって、ならびにVラムダドメインの構造的レパートリーは、Williams et al. J. Mol. Biol., 264:220-232 (1996)によって記述されている。これらの文献の全ての内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
高いヒト相同性を有する抗体のVLドメインにおけるL1およびL2は、ヒト生殖細胞系列VLドメインにおいて存在することが分かっているカノニカル折り畳み構造の組み合わせと同一である予測されたまたは実際のカノニカル折り畳み構造の組み合わせを形成しうる。非限定的な態様において、高いヒト相同性を有する抗体(例えば、ラクダ科動物由来のVLドメインを含む抗体またはそれらのヒト化された変種)のVラムダドメインにおけるL1およびL2は、以下のカノニカルな折り畳みの組み合わせ: 11-7、13-7(A、B、C)、14-7(A、B)、12-11、14-11および12-12のの1つを形成しうる(Williams et al. J. Mol. Biol. 264:220-32 (1996)に規定されている通り、かつhttp://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hVL.htmlに示されている通り)。非限定的な態様において、VカッパドメインにおけるL1およびL2は、以下のカノニカルな折り畳みの組み合わせ: 2-1、3-1、4-1、および6-1の1つを形成しうる(Tomlinson et al. EMBO J. 14:4628-38 (1995)に規定されている通り、かつhttp://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hVK.htmlに示されている通り)。例えば、1つの例示的な態様において、本発明のIL-6抗体(例えば、61H7)のL1およびL2ループは、例えば、ヒト抗体構造1MFAにおいて見出される通りの、7λ-1の組み合わせのヒトカノニカル折り畳み構造を含みうる。別の例示的な態様において、本発明のIL-6抗体(例えば、68F2またはその生殖細胞系列の変種129D3)のL1およびL2ループは、例えば、ヒト抗体構造3MUGにおいて見出される通りの、6λ-1の組み合わせのヒトカノニカル折り畳み構造を含みうる。
さらなる態様において、高いヒト相同性を有する抗体のVLドメインにおけるL1、L2、およびL3の3つ全てが実質的にヒトでの構造を示しうる。高いヒト相同性を有する抗体のVLドメインが、ヒトVLとの高い配列同一性/配列相同性の両方を示すこと、かつまた、VLドメインにおける超可変ループがヒトVLと構造相同性を示すことが好ましい。例えば、1つの例示的な態様において、本発明のIL-6抗体(例えば、61H7)のループL1〜L3は、例えば、ヒト抗体構造1MFAにおいて見出される通りの、7λ-1-4の組み合わせのヒトカノニカル折り畳み構造を含みうる。別の例示的な態様において、本発明のIL-6抗体(例えば、68F2またはその生殖細胞系列の変種129D3)のL1〜L3ループは、例えば、ヒト抗体構造3MUGにおいて見出される通りの、6λ-1-5の組み合わせのヒトカノニカル折り畳み構造を含みうる。
1つの態様において、高いヒト相同性を有するIL-6抗体のVLドメインは、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3およびFR4にわたりヒトVLドメインと80%もしくはそれ以上、85%もしくはそれ以上、90%もしくはそれ以上、95%もしくはそれ以上、97%もしくはそれ以上、または最大99%もしくはさらに100%の配列同一性を示すことができ、かつ加えて、超可変ループL1および超可変ループL2は、同じヒトVLドメインにおいて天然に存在することが分かっているカノニカルな折り畳みの組み合わせと同じである予測されたまたは実際のカノニカル折り畳み構造の組み合わせを形成しうる。
当然、ヒトコードVH/VL対合と最大の配列および構造の相同性を有するVH/VL対合(例えばラクダ科動物由来のVH/VL対合)を含む高いヒト相同性を有する抗体を提供するために、ヒトVHとの高い配列同一性/配列相同性をおよびまたヒトVHの超可変ループとの構造相同性をも示すVHドメインを、ヒトVLとの高い配列同一性/配列相同性をおよびまたヒトVLの超可変ループとの構造相同性をも示すVLドメインと組み合わせることが想定されている。
(iii). 非免疫グロブリン結合分子
さらなる局面において、本発明は、IL-6に特異的に結合する非免疫グロブリン結合分子を提供する。本明細書において用いられる場合、「非免疫グロブリン結合分子」という用語は、免疫グロブリン以外のポリペプチドに由来するが、結合分子に対する所望の結合特異性を与えるために操作されうる(例えば、CDR領域配列の付加により)部分(例えば、骨格またはフレームワーク)を、結合部位が含む結合分子である。本発明の非免疫グロブリン結合分子は概して、非免疫グロブリンポリペプチドへグラフトされた表13〜18に記載されているCDR領域の1つまたは複数を含む。
ある種の態様において、非免疫グロブリン結合分子は、免疫グロブリンではない免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー(例えば、T細胞受容体または細胞接着タンパク質(例えば、CTLA-4，N-CAM、テロキン))に由来する結合部位部分を含む。そのような結合分子は、表13〜18に記載されているCDR領域の1つまたは複数を含むように改変された場合、免疫グロブリン折り畳みの配座を保持し、かつIL-6に特異的に結合することが可能な結合部位部分を含む。他の態様において、本発明の非免疫グロブリン結合分子は、表13〜18に記載されているCDR領域の1つまたは複数を含むように改変された場合、免疫グロブリン折り畳みに基づかないタンパク質トポロジー(例えば、アンキリン反復タンパク質、テトラネクチン、およびフィブロネクチン)を有するが、それでも、標的(例えばIL-6)に特異的に結合することが可能な結合部位を含む。
1つの態様において、本発明の結合分子はテトラネクチン分子を含む。テトラネクチンは、三価構造の血漿タンパク質である。テトラネクチン三量体の各単量体は、抗体CDR配列(例えば、表13〜18に記載されているCDR領域)に置き換えられうるまたはそれを含むように操作されうる5つの異なるアミノ酸ループを含む。テトラネクチン結合ポリペプチドを作製するための方法は、例えば、US20110086770に記述されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
1つの態様において、本発明の結合分子はフィブロネクチン分子を含む。フィブロネクチン結合分子(例えば、フィブロネクチンI型、II型、またはIII型ドメインを含む分子)は、抗体CDR配列(例えば、表13〜18に記載されているCDR領域)に置き換えられうるまたはそれを含むように操作されうるCDR様ループを呈する。フィブロネクチン結合ポリペプチドを作製するための方法は、例えば、WO 01/64942に、ならびに米国特許第6,673,901号、同第6,703,199号、同第7,078,490号、および同第7,119,171号に記述されており、これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
別の態様において、本発明の結合分子は、アフィボディ(affibody)由来の結合部位を含む。アフィボディは、ブドウ球菌のプロテインA (SPA)の免疫グロブリン結合ドメインに由来する(例えば、Nord et al., Nat. Biotechnol., 15: 772-777 (1997)を参照のこと)。本発明において用いられるアフィボディ結合部位は、SPAのドメイン(例えば、ドメインB)に由来するSPA関連タンパク質(例えば、プロテインZ)に変異を起こさせ、IL-6に対する結合親和性を有する変異体SPA関連ポリペプチドを選択することによって合成されうる。アフィボディ結合部位を作製するための他の方法は、米国特許第6,740,734号および同第6,602,977号に、ならびにWO 00/63243に記述されており、これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる。
別の態様において、本発明の結合分子は、アンチカリン(anticalin)由来の結合部位を含む。アンチカリン(リポカリンとしても公知)は、多様なβ-バレルタンパク質ファミリーのメンバーであり、その機能は、それらのバレル/ループ領域において標的分子を結合することである。リポカリン結合部位は、バレルの鎖を結び付けるループ配列を無作為化することによって、IL-6を結合するように操作されうる(例えば、Schlehuber et al., Drug Discov. Today, 10: 23-33 (2005); Beste et al., PNAS, 96: 1898-1903 (1999)を参照のこと)。本発明の結合分子において用いられるアンチカリン結合部位は、モンシロチョウ(Pieris brassica)のビリン結合タンパク質(BBP)のアミノ酸位置番号28〜45、58〜69、86〜99、および114〜129を含む直鎖状ポリペプチド配列の配列位置に対応する4つのセグメントにおいて変異されるリポカリンファミリーのポリペプチドから出発して取得可能でありうる。アンチカリン結合部位を作製するための他の方法は、WO99/16873およびWO05/019254に記述されており、これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる。
別の態様において、本発明の結合分子は、システインに富むポリペプチド由来の結合部位を含む。本発明の実践において用いられるシステインに富むドメインは、典型的には、α-ヘリックス、β-シート、またはβ-バレル構造を形成しない。典型的には、ジスルフィド結合は、三次元構造へのドメインの折り畳みを促進する。通常、システインに富むドメインは、少なくとも2つのジスルフィド結合、より典型的には、少なくとも3つのジスルフィド結合を有する。例示的なシステインに富むポリペプチドは、Aドメインタンパク質である。Aドメイン(「相補型反復」と呼ばれることもある)は、約30〜50または30〜65個のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、ドメインは、約35〜45個のアミノ酸、場合によっては、約40個のアミノ酸を含む。30〜50個のアミノ酸のなかに、約6個のシステイン残基がある。6個のシステインのうち、ジスルフィド結合は、典型的には、以下のシステインの間に見出される: C1とC3、C2とC5、C4とC6。Aドメインは、リガンド結合部分を構成する。ドメインのシステイン残基は、ジスルフィド結合されて、小型の安定な機能的に独立した部分を形成する。これらの反復のクラスタは、リガンド結合ドメインを構成し、異なるクラスタリングは、リガンド結合に対して特異性を与えることができる。Aドメインを含む例示的なタンパク質としては、例えば、補体成分(例えば、C6、C7、C8、C9、および因子I)、セリンプロテアーゼ(例えば、エンテロペプチダーゼ、マトリプターゼ、およびコリン)、膜貫通タンパク質(例えば、ST7、LRP3、LRP5、およびLRP6)ならびにエンドサイトーシス受容体(例えば、ソルチリン関連受容体、LDL-受容体、VLDLR、LRP1、LRP2、およびApoER2)が挙げられる。所望の結合特異性のAドメインタンパク質を作製するための方法は、例えば、WO 02/088171およびWO 04/044011に開示されており、これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる。
他の態様において、本発明の結合分子は、反復タンパク質由来の結合部位を含む。反復タンパク質は、互いに積み重なって隣接ドメインを形成する、小さな(例えば、約20〜約40個のアミノ酸残基)構造単位または反復の連続コピーを含むタンパク質である。反復タンパク質は、タンパク質における反復数を調整することによって特定の標的結合部位に適するように修飾することができる。例示的な反復タンパク質としては、デザインされたアンキリン反復タンパク質(すなわち、DARPin) (例えば、Binz et al., Nat. Biotechnol., 22: 575-582 (2004)を参照のこと)またはロイシンに富む反復タンパク質(すなわち、LRRP) (例えば、Pancer et al., Nature, 430: 174-180 (2004)を参照のこと)が挙げられる。これまでに決定された、全てのアンキリン反復単位の三次構造は、β-ヘアピンおよび後続の2つの逆平行α-ヘリックスから構成され、反復単位を次の反復単位と結び付けるループで終了する特徴を共有する。アンキリン反復単位で構築されるドメインは、反復単位を、拡張および湾曲構造に積み重ねることによって形成される。LRRP結合部位は、ウミヤツメ(sea lamprey)および他の無顎類の適応免疫系の一部を形成し、それらは、リンパ球熟成期の間に、一連のロイシンに富む反復遺伝子の組換えによって形成されるという意味で、抗体に類似する。DARpinまたはLRRP結合部位を作製するための方法は、WO 02/20565およびWO 06/083275に記述されており、これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる。
本発明の結合分子において用いられうる他の非免疫グロブリン結合部位は、Src相同性ドメイン(例えば、SH2またはSH3ドメイン)、PDZドメイン、β-ラクタマーゼ、高親和性プロテアーゼ阻害物質、またはサソリ毒のような小ジスルフィド結合タンパク質骨格に由来する結合部位を含む。これらの分子に由来する結合部位を作製するための方法は、当技術分野において開示されており、例えば、Panni et al, J. Biol. Chem., 277: 21666-21674 (2002), Schneider et al., Nat. Biotechnol., 17: 170-175 (1999); Legendre et al., Protein Sci., 11: 1506-1518 (2002); Stoop et al., Nat. Biotechnol., 21: 1063-1068 (2003); およびVita et al., PNAS, 92: 6404-6408 (1995)を参照されたい。さらに他の結合部位は、EGF様ドメイン、クリングルドメイン、PANドメイン、Glaドメイン、SRCRドメイン、クニッツ/ウシトリプシン阻害物質ドメイン、カザール型セリンプロテアーゼ阻害物質ドメイン、トレフォイル(P型)ドメイン、フォンウィルブランド因子C型ドメイン、アナフィラトキシン様ドメイン、CUBドメイン、チログロブリンI型反復、LDL-受容体クラスAドメイン、スシドメイン、リンクドメイン、トロンボスポンジンI型ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、C型レクチンドメイン、MAMドメイン、フォンウィルブランド因子A型ドメイン、ソマトメジンBドメイン、WAP型4ジスルフィドコアドメイン、F5/8C型ドメイン、ヘモペキシンドメイン、ラミニン型EGF様ドメイン、C2ドメイン、および当業者に公知の他のそのようなドメイン、ならびにそれらの誘導体および/または変種からなる群より選択される結合ドメインに由来しうる。
非免疫グロブリン結合分子は、人工的に多様化された結合部位を有する結合分子のライブラリーからの標的結合変種の選択または単離によって特定されうる。多様化されたライブラリーは、(例えば、表13〜18に記載されているCDR配列から選択される) CDR配列のライブラリーの組み入れ、および/または完全に無作為の手法(例えば、エラープローンPCR、エクソンシャッフリング、もしくは指向的進化)によって作製され、かつ/あるいは当技術分野において認識されているデザイン戦略によって補助されうる。例えば、結合部位が、その同族標的分子と相互作用する場合に、通常、関与するアミノ酸位置は、結合部位をコードする核酸内における対応する位置での縮重コドン、トリヌクレオチド、無作為ペプチド、またはループ全体の挿入によって無作為化することができる(例えば、米国特許出願公開第20040132028号を参照のこと)。アミノ酸位置の場所は、標的分子を有する複合体における結合部位の結晶構造の研究によって特定することができる。(例えば、表13〜18に記載されているCDR配列から選択される) CDR配列の組み入れおよび/または無作為化の候補位置は、結合部位のループ、平面、らせん、および結合空隙を含む。ある種の態様において、多様化の候補になる可能性が高い結合部位内のアミノ酸は、免疫グロブリンの折り畳みとのその相同性によって特定することができる。例えば、フィブロネクチンのCDR様ループ内の残基は、フィブロネクチン結合分子のライブラリーを作製するために無作為化されうる(例えば、Koide et al., J. Mol. Biol., 284: 1141-1151 (1998)を参照のこと)。(例えば、表2〜6に記載されているCDR配列から選択される) CDR配列の組み入れおよび/または無作為化の後、多様化されたライブラリーは次いで、所望の結合特性、例えば、IL-6への特異的結合を有する結合分子を得るために、選択またはスクリーニング手順に供されうる。選択はファージディスプレー法、酵母ディスプレー法、または核酸ディスプレー法のような、当技術分野において認識されている方法によって達成することができる。
iv. ラクダ科動物由来のVHおよびVLドメインの生殖細胞系列化
ラクダ科動物の通常型抗体は、以下の要因(参照により全体が本明細書に組み入れられるUS 12/497,239に論じられている)のために、ヒト治療物質としての有用性を有する抗体の調製のための都合の良い出発点を提供する:
(1) ラクダ科動物VHおよびVLドメインとそれらのヒト対応物との間の高い配列相同性%;
(2) ラクダ科動物VHおよびVLドメインのCDRと、それらのヒト対応物(すなわち、ヒト様のカノニカル折り畳み構造およびカノニカルな折り畳みのヒト様の組み合わせ)との間の高度の構造相同性。
ラクダ科動物(例えばラマ)のプラットフォームはまた、得ることができるIL-6抗体の機能多様性に関して著しい利点を提供する。
ヒト治療に関するラクダ科動物VHドメインおよび/またはラクダ科動物VLドメインを含むIL-6抗体の有用性は、例えばそれらをヒト宿主においてより低い免疫原性にさせるように、天然のラクダ科動物VHおよびVLドメインの「生殖細胞系列化」によりさらに改善することができる。生殖細胞系列化の全般的目的は、親のVHおよびVLドメインにより形成された抗原結合部位の特異性および親和性は維持しつつも、ヒト対象へ導入された場合に、VHおよびVLドメインが最小の免疫原性を示す分子を作製することである。
ラクダ科動物VH (またはVL)ドメインとヒトVH (またはVL)ドメインとの間の相同性の判定は、(所与のVHまたはVLドメイン中の)変化されるべきラクダ科動物アミノ酸残基の選択および適切な代替アミノ酸残基の選択の両方についての、生殖細胞系列化プロセスの重要な工程である。
ラクダ科動物の通常型抗体を生殖細胞系列化するための手法は、多数の新規ラクダ科動物VH (およびVL)ドメイン配列、典型的には標的抗原に結合することが分かっている体細胞変異されたVH (またはVL)ドメインの、ヒト生殖細胞系列VH (またはVL)配列、ヒトVH (およびVL)コンセンサス配列、ならびにラマ・パコス(llama pacos)から入手可能な生殖細胞系列配列情報とのアライメントを基づいて開発されている。
以下の節は、(i) ラクダ科動物由来のVHもしくはVLドメインまたはそれらのCDRにおける置き換えのための「ラクダ科動物」アミノ酸残基を選択すること、および(ii) いずれか所与のラクダ科動物VH (またはVL)ドメインを生殖細胞系列化する場合に、置換するための置き換え「ヒト」アミノ酸残基を選択することに適用できる原理を概説している。この手法を用いて、本明細書における、表13〜16に記載のVHおよびVL配列の生殖細胞系列化された変種を調製することができる。
工程1. 生殖細胞系列化されるべき成熟ラクダ科動物配列に対する最高の相同性/同一性を示す、ヒト(生殖細胞系列)ファミリーおよびこのファミリーのメンバーを選択する。いずれか所与のラクダ科動物VH (またはVL)ドメインと最もマッチングしているヒト生殖細胞系列を特定するための全般的手順は、以下に概説されている。
工程2. 生殖細胞系列化に用いられる特異的ヒト生殖細胞系列ファミリーメンバーを選択する。これは、最高の相同性を有する生殖細胞系列、または同じファミリー由来の別の生殖細胞系列ファミリーメンバーであることが好ましい。
工程3. 選択されたヒト生殖細胞系列に最も近いラクダ科動物生殖細胞系列に関するアミノ酸使用の表を基づいた生殖細胞系列化について考えられる好ましい位置を特定する。
工程4. 最も近いヒト生殖細胞系列から逸脱しているラクダ科動物生殖細胞系列におけるアミノ酸を変更するよう試み; FR残基の生殖細胞系列化は、CDR残基よりも好ましい。
a. 生殖細胞系列化に用いられる選択されたヒト生殖細胞系列から逸脱している位置が好ましく、これについてラクダ科動物配列に認められたアミノ酸は、選択された生殖細胞系列とマッチせず、かつ同じサブクラスの他の生殖細胞系列においては認められない(VおよびJコードされたFRアミノ酸の両方)。
b. 選択されたヒト生殖細胞系列ファミリーメンバーから逸脱しているが、同じファミリーの他の生殖細胞系列において用いられる位置も、生殖細胞系列化プロセスにおいて扱われうる。
c. 選択されたヒト生殖細胞系列へのさらなるミスマッチ(例えば、さらなる体細胞変異に起因する)も扱われうる。
以下の手法を用いて、所与のラクダ科動物VH (またはVL)ドメインについて、最もマッチングしているヒト生殖細胞系列を判定することができる。
ラクダ科動物とヒトの生殖細胞系列VHおよびVLの間の配列同一性%を分析する前に、そのカノニカルな折り畳みを最初に判定することができ、これはH1およびH2またはL1およびL2 (およびL3)についてカノニカルな折り畳みの同一の組み合わせを有するヒト生殖細胞系列セグメントのファミリーの特定を可能にする。その後、関心対象のラクダ科動物可変領域との最高度の配列相同性を有するヒト生殖細胞系列ファミリーメンバーが、配列相同性のスコア化のために選択されうる。超可変ループL1、L2、L3、H1、およびH2のChothiaカノニカルクラスの判定を、www.bioinf.org.uk/abs/chothia.htmlのウェブページにおいて公に利用可能なバイオインフォマティクスツールにより行うことができる。このプログラムのアウトプットは、データファイルにおける重要な残基の必要要件を示している。これらのデータファイルにおいて、重要な残基の位置が、各位置で許容されるアミノ酸とともに示される。抗体の可変領域の配列は、インプットとして入力し、かつKabat番号付けスキームに割り当てるために、最初にコンセンサス抗体配列と並置する。カノニカルな折り畳みの分析は、MartinおよびThorntonにより開発された自動化法(Martin et al., J. Mol. Biol. 263:800-815 (1996))により得られた重要残基鋳型のセットを用いる。個々のフレームワーク領域の境界は、Chothiaの番号付けスキームの改作であるIMGT番号付けスキーム(Lefranc et al., NAR 27: 209-212 (1999); imgt.cines.fr)を用いて割り当てられうる。
H1およびH2またはL1およびL2 (およびL3)についてのカノニカルな折り畳みの同じ組み合わせを用いる、既知の特定のヒト生殖細胞系列Vセグメントにより、配列相同性に関して最良マッチングファミリーメンバーを判定することができる。ラクダ科動物VHおよびVLドメインフレームワークアミノ酸配列とヒト生殖細胞系列によりコードされた対応する配列との間の配列同一性%は、バイオインフォマティクスツールを用いて判定することができるが、配列の手作業のアライメントも使用することができる。ヒト免疫グロブリン配列は、VBase (vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)またはPluckthun/Honeggerデータベース(http://www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines)のような、いくつかのタンパク質データベースから特定することができる。ヒト配列をラクダ科動物VHまたはVLドメインのV領域と比較するために、www.expasy.ch/tools/#alignのようなウェブサイトを介して利用可能であるような配列アライメントアルゴリズムを用いることができるが、また手作業のアライメントを、限定された配列セットで行うこともできる。カノニカルな折り畳みの同じ組み合わせと、各鎖のフレームワーク領域1、2、および3との最高度の相同性とを有するファミリーのヒト生殖細胞系列軽鎖および重鎖配列を選択し、かつ関心対象のラクダ科動物可変領域と比較することができ; またFR4は、ヒト生殖細胞系列JHおよびJKまたはJL領域に対し照合される。
全体の配列相同性%の算出において、FR1、FR2、およびFR3の残基は、カノニカルな折り畳みの同一の組み合わせを有するヒト生殖細胞系列ファミリーからの最も合ったマッチ配列を用いて評価されることに留意されたい。カノニカルな折り畳みの同じ組み合わせを有する同じファミリーの最も合ったマッチメンバーまたは他のメンバーとは異なる残基のみ、スコア化される(何らかのプライマーでコードされた差異は除外されることに注意のこと)。しかしながら、生殖細胞系列化の目的のためには、カノニカルな折り畳みの同じ組み合わせを持たない、他のヒト生殖細胞系列ファミリーのメンバーと同一のフレームワーク領域の残基は、前述のストリンジェントな条件に従い「負」とスコア化されるという事実にも関わらず、これらは生殖細胞系列化について考慮することができる。この仮定は、Quおよびその同僚(Qu et la., Clin. Cancer Res. 5:3095-3100 (1999))ならびにOnoおよびその同僚(Ono et al., Mol. Immunol. 36:387-395 (1999))により行われたように、FR1、FR2、FR3、およびFR4の各々がその最もマッチングしているヒト生殖細胞系列配列と個別に比較され、かつそれゆえ生殖細胞系列化された分子は、異なるFRの組み合わせを含む、生殖細胞系列化のための「ミックスおよびマッチング」手法を基づいている。
IV. 修飾された結合分子
ある種の態様において、本発明の結合ポリペプチドは、1つまたは複数の修飾を含みうる。本発明の修飾型の結合ポリペプチドは、当技術分野において公知の任意の技法を用いて作製することができる。
(i) 免疫原性リスクの低下
ある種の態様において、本発明の結合分子(例えば、抗体またはその抗原結合断片)は、当技術分野において認識されている技法を用いてその免疫原性リスクをさらに低下させるように修飾される。例えば、抗体、またはその断片は、上述の方法にしたがって生殖細胞系列化することができる。あるいは、本発明の結合分子は、キメラ化、ヒト化、および/または脱免疫化することができる。
1つの態様において、本発明の抗体、またはその抗原結合断片は、キメラでありうる。キメラ抗体は、ラクダ科動物(例えば、ラマ)モノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体のような、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する抗体である。キメラ抗体、またはその断片を産生するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989); 米国特許第5,807,715号; 同第4,816,567号; および同第4,816,397号を参照されたく、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。前記分子の合成のために、「キメラ抗体」の産生のために開発された技法(Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985))が用いられうる。例えば、ラクダ科動物抗IL-6抗体分子の結合特異性をコードする遺伝子配列は、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の配列とともに融合されうる。本明細書において用いられる場合、キメラ抗体は、ラクダ科動物(例えば、ラマ)モノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するもの、例えば、生殖細胞系列化抗体またはヒト化抗体のような異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。
別の態様において、本発明の抗体、またはその抗原結合部分はヒト化される。ヒト化抗体は、非ヒト抗体由来の1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)およびヒト抗体分子由来のフレームワーク領域を含む結合特異性を有する。多くの場合、ヒトフレームワーク領域内のフレームワーク残基は抗原結合を改変するために、好ましくは改善するために、CDR供与体抗体由来の対応する残基と置換されるであろう。これらのフレームワーク置換は、当技術分野において周知の方法によって、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を特定するためのCDRおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリングおよび特定の位置における異常なフレームワーク残基を特定するための配列比較によって特定される。(例えば、Queenら、米国特許第5,585,089号; Riechmannら、Nature 332:323 (1988)を参照されたく、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。抗体は、例えば、CDR-グラフティング(EP 239,400; PCT公報WO 91/09967; 米国特許第5,225,539号; 同第5,530,101号; および同第5,585,089号)、ベニヤーリングまたはリサーフェシング(EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994))、ならびに連鎖シャッフリング(米国特許第5,565,332号)を含め、当技術分野において公知の種々の技法を用いてヒト化することができる。
いくつかの態様において、脱免疫を用いて、IL-6結合分子(例えば、抗体、またはその抗原結合部分)の免疫原性のリスクをさらに減少させることができる。本明細書において用いられる場合、「脱免疫」という用語は、T細胞エピトープを修飾するためのポリペプチド(例えば、抗体、またはその抗原結合部分)の改変を含む(例えば、WO9852976A1、WO0034317A2を参照のこと)。例えば、本発明の、出発のIL-6特異抗体またはその抗原結合部分由来のVHおよびVL配列を分析し、ヒトT細胞エピトープ「マップ」を各V領域から作製し、相補性決定領域(CDR)および配列内の他の重要な残基との関連でエピトープの位置を示してもよい。最終抗体の活性を変化させるリスクが低い代替的なアミノ酸置換を特定するために、T細胞エピトープマップ由来の個々のT細胞エピトープを分析する。アミノ酸置換の組み合わせを含むある範囲の代替的なVHおよびVL配列をデザインし、これらの配列をその後、本明細書において開示される診断方法および処置方法で用いるためにある範囲のIL-6特異抗体またはその断片に組み入れて、これを次に、機能について試験する。典型的には、12〜24種の変種抗体を作製し、試験する。修飾されたV領域およびヒトC領域を含む完全な重鎖および軽鎖遺伝子を次いで、発現ベクターにクローニングし、その後のプラスミドを全抗体の産生のために細胞株に導入する。その抗体を次いで、適切な生化学的および生物学的アッセイ法において比較し、最適な変種を特定する。
(ii) エフェクタ機能およびFc修飾
ある種の態様において、本発明の結合分子は、1つまたは複数のエフェクタ機能を媒介する抗体定常領域(例えばIgG定常領域、例えばヒトIgG定常領域、例えばヒトIgG1またはIgG4定常領域)を含みうる。例えば、抗体定常領域への補体C1成分の結合は、補体系を活性化しうる。補体の活性化は、オプソニン化および細胞病原体の溶解において重要である。補体の活性化はまた、炎症応答を刺激し、また自己免疫過敏症に関与しうる。さらに、抗体はFc領域を介して、細胞上のFc受容体(FcR)に結合する抗体Fc領域上のFc受容体結合部位により、さまざまな細胞上の受容体に結合する。IgG (γ受容体)、IgE (ε受容体)、IgA (α受容体)およびIgM (μ受容体)を含めて、さまざまなクラスの抗体に特異的であるいくつかのFc受容体が存在する。細胞表面上のFc受容体への抗体の結合は、抗体でコーティングされた粒子の貪食および破壊、免疫複合体のクリアランス、抗体でコーティングされた標的細胞の、キラー細胞による溶解(抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、またはADCCと呼ばれる)、炎症性メディエータの放出、胎盤通過ならびに免疫グロブリン産生の制御を含めて、いくつかの重要かつ多様な生物学的応答を誘発する。好ましい態様において、本発明の結合分子(例えば、抗体またはその抗原結合断片)は、Fc-γ受容体に結合する。代替的な態様において、本発明の結合分子は、1つもしくは複数のエフェクタ機能(例えば、ADCC活性)を欠いた、および/またはFcγ受容体を結合できない定常領域を含みうる。
本発明のある種の態様は、ほぼ同じ免疫原性の完全な未改変抗体と比較してエフェクタ機能の低下もしくは増強、非共有的に二量体化する能力、腫瘍の部位に局在化する能力の増大、血清中半減期の減少、または血清中半減期の増大のような所望の生化学的特徴を提供するように、定常領域ドメインの1つまたは複数における少なくとも1つのアミノ酸が欠失されたかまたは別の方法で改変された抗IL-6抗体を含む。例えば、本明細書において記述される診断方法および処置方法で用いるためのある種の抗体またはその断片は、免疫グロブリン重鎖と類似のポリペプチド鎖を含むが、しかし1つまたは複数の重鎖ドメインの少なくとも一部分を欠くドメイン欠失抗体である。例えば、ある種の抗体において、修飾抗体の定常領域の1つのドメイン全体が欠失され、例えば、CH2ドメインの全部または一部が欠失される。
ある種の他の態様において、結合分子は、異なる抗体アイソタイプに由来する定常領域(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4の2つまたはそれ以上由来の定常領域)を含む。他の態様において、結合分子は、キメラヒンジ(すなわち、異なる抗体アイソタイプのヒンジドメインに由来するヒンジ部分を含むヒンジ、例えば、IgG4分子由来の上部ヒンジドメインおよびIgG1中央ヒンジドメイン)を含む。1つの態様において、結合分子は、ヒトIgG4分子由来のFc領域またはその部分およびこの分子のコアヒンジ領域中のSer228Pro変異(EU番号付け)を含む。
ある種の態様において、Fc部分は、当技術分野において公知の技法を用いてエフェクタ機能を増加または減少させるために変異されうる。例えば、定常領域ドメインの欠失または不活性化(点突然変異または他の手段による)は、循環している修飾抗体のFc受容体結合を減少させ、それによって腫瘍局在性を増大しうる。他の事例では、本発明と一致する定常領域修飾は補体結合を調節し、したがって、結合された細胞毒素の血清中半減期および非特異的結合を減少させる可能性がある。定常領域の他の修飾は、抗原特異性または可動性の増大によって局在性の増強を可能にするオリゴ糖部分またはジスルフィド結合を修飾するために用いられうる。腫瘍局在性、生体内分布および血清中半減期のような、修飾に関する結果的に得られる生理学的プロファイル、生物学的利用能、および他の生化学的影響は、過度の実験なしに周知の免疫学的方法を用いて容易に測定され、定量化されうる。
ある種の態様において、本発明の抗体において用いられるFcドメインは、Fc変種である。本明細書において用いられる場合、「Fc変種」という用語は、Fcドメインが由来する野生型Fcドメインに対して少なくとも1つのアミノ酸置換を有するFcドメインをいう。例えば、FcドメインがヒトIgG1抗体に由来する場合、ヒトIgG1 FcドメインのFc変種は、該Fcドメインに対して少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。
Fc変種のアミノ酸置換は、Fcドメイン内の任意の位置(すなわち、任意のEU慣例(convention)のアミノ酸位置)に位置しうる。1つの態様において、Fc変種は、ヒンジドメインまたはその部分に位置するアミノ酸位置に置換を含む。別の態様において、Fc変種は、CH2ドメインまたはその部分に位置するアミノ酸位置に置換を含む。別の態様において、Fc変種は、CH3ドメインまたはその部分に位置するアミノ酸位置に置換を含む。別の態様において、Fc変種は、CH4ドメインまたはその部分に位置するアミノ酸位置に置換を含む。
本発明の結合分子は、エフェクタ機能および/またはFcR結合の改善(例えば、減少または増強)を与えることが公知である任意の当技術分野において認識されているFc変種を用いうる。前記のFc変種は、例えば、各々が参照により本明細書に組み入れられる国際PCT公報WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2、およびWO06/085967A2または米国特許第5,648,260号; 同第5,739,277号; 同第5,834,250号; 同第5,869,046号; 同第6,096,871号; 同第6,121,022号; 同第6,194,551号; 同第6,242,195号; 同第6,277,375号; 同第6,528,624号; 同第6,538,124号; 同第6,737,056号; 同第6,821,505号; 同第6,998,253号; および同第7,083,784号に開示されているアミノ酸置換のいずれか1つを含んでよい。1つの例示的な態様において、本発明の結合ポリペプチドは、EU位置番号268にアミノ酸置換を含むFc変種(例えば、H268DまたはH268E)を含みうる。別の例示的な態様において、本発明の結合ポリペプチドはEU位置番号239 (例えば、S239DもしくはS239E)および/またはEU位置番号332 (例えば、I332DもしくはI332Q)にアミノ酸置換を含みうる。
ある種の態様において、本発明の結合ポリペプチドは、抗体の抗原非依存的なエフェクタ機能、特に結合ポリペプチドの循環半減期を改変するアミノ酸置換を含むFc変種を含みうる。そのような結合分子は、これらの置換の無い結合分子と比較した場合にFcRnへの結合の増加または減少のどちらかを示し、それゆえ、それぞれ血清中半減期の増加または減少を有する。FcRnに対する親和性の改善を有するFc変種は、より長い血清中半減期を有するものと予測され、そのような分子には、例えば、慢性疾患または障害を処置するために、投与された抗体の長い半減期が望まれるような、哺乳動物を処置する方法において有用な用途がある。対照的に、FcRn結合親和性の減少を有するFc変種は、より短い半減期を有するものと予想され、そのような分子はまた、例えば、短縮された循環時間が有利でありうるような、哺乳動物への投与に、例えばインビボ画像診断に有用であり、または長期間にわたって循環中に存在する場合に出発抗体が毒性副作用を有するような状況において有用である。FcRn結合親和性の減少を有するFc変種はまた、胎盤を通過する可能性が低く、したがって、妊婦における疾患または障害の処置においても有用である。
さらに、減少したFcRn結合親和性が望まれうる他の用途には、脳、腎臓、および/または肝臓における局所化が望まれる用途が含まれる。1つの例示的な態様において、本発明の改変された結合分子(例えば、抗体またはその抗原結合断片)は、血管系から腎臓糸球体の上皮に渡って運搬の減少を示す。別の態様において、本発明の、改変された結合分子(例えば、抗体またはその抗原結合断片)は、脳から血液脳関門(BBB)を渡る脈管性間隙への運搬の減少を示す。1つの態様において、改変されたFcRn結合を有する抗体は、Fcドメインの「FcRn結合ループ」内に1つまたは複数のアミノ酸置換を有するFcドメインを含む。FcRn結合ループは、アミノ酸残基番号280〜299 (EU番号付けによる)から構成される。FcRn結合活性を変化させた例示的なアミノ酸置換は、国際PCT公報番号WO05/047327に開示されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。
ある種の例示的な態様において、本発明の結合分子(例えば、抗体またはその抗原結合断片)は、以下の置換の1つまたは複数を有するFcドメインを含む: V284E、H285E、N286D、K290EおよびS304D (EU番号付け)。他の例示的な態様において、本発明の結合分子は、二重変異H433K/N434Fを有するヒトFcドメインを含む(例えば、米国特許第8,163,881号を参照のこと)。具体的な態様において、本発明の結合分子は、表16から選択される1つまたは複数の可変領域および二重変異H433K/N434Fを有するヒトFcドメインを含む。別の具体的な態様において、本発明の結合分子は、表17由来の1つまたは複数のCDR配列および二重変異H433K/N434Fを有するヒトFcドメインを含む。別の具体的な態様において、本発明の結合分子は、SEQ ID NO. 152のVHドメインおよび二重変異H433K/N434Fを有するヒトFcドメインを含む。別の具体的な態様において、本発明の結合分子は、1つまたは複数の位置の、例えば位置番号1、3、5、もしくは16またはその任意の組み合わせのグルタミンがグルタミン酸に変更されたSEQ ID NO. 152のVHドメイン、および二重変異H433K/N434Fを有するヒトFcドメインを含む。別の具体的な態様において、本発明の結合分子は、位置番号1のグルタミンがグルタミン酸に変更されたSEQ ID NO. 152のVHドメイン、および二重変異H433K/N434Fを有するヒトFcドメインを含む。
他の態様において、本明細書において記述される診断方法および処置方法で用いるための結合分子は、グリコシル化を減少させるかまたは除外するように改変されている、定常領域、例えば、IgG1またはIgG4重鎖定常領域を有する。例えば、本発明の結合分子(例えば、抗体またはその抗原結合断片)はまた、抗体Fcのグリコシル化を改変させるアミノ酸置換を含むFc変種を含みうる。例えば、Fc変種は減少したグリコシル化(例えば、N結合型またはO結合型グリコシル化)を有しうる。例示的な態様において、Fc変種は、アミノ酸位置番号297 (EU番号付け)に通常見出されるN結合型グリカンのグリコシル化の減少を含む。別の態様において、抗体は、グリコシル化モチーフ、例えば、アミノ酸配列NXTまたはNXSを含むN結合型グリコシル化モチーフの近傍または内部にアミノ酸置換を有する。具体的な態様において、抗体は、アミノ酸位置番号228または299 (EU番号付け)にアミノ酸置換を有するFc変種を含む。より具体的な態様において、抗体は、S228PおよびT299A変異(EU番号付け)を含むIgG1またはIgG4定常領域を含む。
減少したまたは改変されたグリコシル化を付与する例示的なアミノ酸置換は、国際PCT公報番号WO05/018572に開示されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。好ましい態様において、本発明の抗体またはその断片は、グリコシル化を除外するように修飾される。そのような抗体またはその断片は、「アグリ(agly)」抗体またはその断片(例えば「アグリ」抗体)といわれうる。理論によって拘束されるわけではないが、「アグリ」抗体、またはその断片は、インビボでの安全性および安定性プロファイルの改善を有しうるものと考えられる。アグリ抗体は、任意のアイソタイプまたはそのサブクラス、例えばIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のものであることができる。ある種の態様において、アグリ抗体、またはその断片は、Fc-エフェクタ機能がないIgG4抗体の脱グリコシル化(aglycosylated)Fc領域を含み、それによって、IL-6を発現する正常な重要臓器に対するFcを介した毒性の可能性を排除する。他の態様において、本発明の抗体またはその断片は、改変されたグリカンを含む。例えば、抗体は、Fc領域のAsn297のN-グリカンでのフコース残基数の減少を有しうる、すなわち、脱フコシル化(afucosylated)される。脱フコシル化はNK細胞上のFcRgII結合を増大し、ADCCを強く増大する。抗IL-6 scFvおよび抗CD3 scFvを含むダイアボディは、ADCCによるIL-6発現細胞の死滅化を誘導することが示されている。したがって、1つの態様において、IL-6発現細胞を標的化および死滅化するために、脱フコシル化された抗IL-6抗体が用いられる。別の態様において、抗体は、Fc領域のAsn297のN-グリカンでのシアル酸残基数の改変を有しうる。「アグリ」抗体または改変されたグリカンを有する抗体を作製するために、多数の、当技術分野において認識されている方法が利用可能である。例えば、変更されたグリコシル化経路(例えば、グリコシルトランスフェラーゼ欠失)を有する遺伝子操作された宿主細胞(例えば、変更された酵母、例えば、ピキア(Picchia)、またはCHO細胞)を用いて、そのような抗体を産生させることができる。
(iii) 共有結合
本発明の結合分子は、例えば、共有結合によって結合ポリペプチドがその同族エピトープに特異的に結合するのを妨げられないような、結合ポリペプチドへの分子の共有結合により、修飾されうる。例えば、限定するためではないが、本発明の抗体、またはその断片は、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護/封鎖基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への連結などによって修飾されうる。特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化などを含むが、これらに限定されない、公知の技法によって、多数の化学修飾のうちのいずれが行われてもよい。さらに、誘導体は1つまたは複数の非古典的アミノ酸を含んでもよい。
本発明の結合ポリペプチド(例えば、抗体またはその断片)はさらに、N末端もしくはC末端で異種ポリペプチドに組換えによって融合されてもよいか、またはポリペプチドもしくは他の組成物に(共有結合および非共有結合を含めて)化学的に結合されてもよい。例えば、抗IL-6抗体は、検出アッセイ法において標識として有用な分子、ならびに異種ポリペプチド、薬物、放射性核種、または毒素のようなエフェクタ分子に組換えによって融合または結合されてもよい。例えば、PCT公報WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; 米国特許第5,314,995号; およびEP 396,387を参照されたい。
インビボ半減期を増加させるため、または当技術分野において公知の方法を用いた免疫アッセイ法で用いるため、結合分子を異種ポリペプチドに融合させてもよい。例えば、1つの態様において、PEGを本発明の結合分子に結合させて、そのインビボ半減期を増加させることができる。Leong, S. R., et al., Cytokine 16: 106 (2001); Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531 (2002); またはWeir et al., Biochem. Soc. Transactions 30:512 (2002)。
さらに、本発明の結合分子をペプチドのようなマーカー配列に融合させて、その精製または検出を促進することができる。好ましい態様において、マーカーアミノ酸配列は、数ある中でも、pQEベクター(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311)中で提供されるタグのようなヘキサヒスチジンペプチドであり、これらの多くが市販されている。Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989)に記述されるように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質(Wilson et al., Cell 37:767 (1984))に由来するエピトープに対応する「HA」タグ、および「flag」タグを含むがこれらに限定されることはない。
本発明の結合分子は非結合型で用いられてもよいか、または種々の分子のうちの少なくとも1つに結合させて、例えば、分子の治療的特性を改善するか、標的検出を促進するか、または患者の撮像もしくは治療を行ってもよい。本発明の結合分子は、精製が行われる場合、精製の前または後のいずれかに標識または結合されうる。特に、本発明の結合分子は、治療物質、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答修飾物質、薬剤、またはPEGに結合されうる。
本発明はさらに、診断物質または治療物質に結合された本発明の結合分子を包含する。結合分子を診断的に用いて、例えば、臨床試験手順の一部として免疫細胞障害(例えば、CLL)の発症または進行をモニターし、例えば、所与の処置および/または予防の計画の効果を判定することができる。検出は、結合分子を検出可能な物質にカップリングさせることによって容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、さまざまな酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、さまざまな陽電子放射断層撮影法を用いる陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。本発明による診断法として用いるための抗体に結合されうる金属イオンについては、例えば、米国特許第4,741,900号を参照されたい。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ; 適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが挙げられ; 適切な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが挙げられ; 発光材料の例としては、ルミノールが挙げられ; 生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ; かつ適切な放射性材料の例としては、125I、131I、111In、または99Tcが挙げられる。
本明細書において開示される診断方法および処置方法で用いるための結合分子は、細胞毒素(放射性同位体、細胞毒性薬、もしくは毒素のような) 治療物質、細胞分裂阻害物質、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答修飾物質、薬剤、免疫学的に活性なリガンド(例えば、リンホカインもしくは、得られる分子が新生細胞とT細胞のようなエフェクタ細胞との両方に結合する他の抗体)、またはPEGに結合されうる。
別の態様において、本明細書において開示される診断方法および処置方法で用いるための抗IL-6抗体は、腫瘍細胞成長を減少させる分子に結合されうる。他の態様において、開示される組成物は、薬物またはプロドラッグにカップリングされた、抗体またはその断片を含みうる。本発明のさらに他の態様は、リシン、ゲロニン、緑膿菌外毒素もしくはジフテリア毒素のような特定の生体毒素、またはそれらの細胞毒性断片に結合された、抗体またはその断片の使用を含む。どの結合抗体または非結合抗体を用いるかの選択は、がんの種類および段階、付加的な処置(例えば、化学療法または外部放射)の使用ならびに患者の病態に依存するであろう。当業者は、本明細書の教示を考慮して、そのような選択を容易に行いうることが理解されよう。
以前の研究において、同位体で標識された抗腫瘍抗体を用いて、動物モデルにおける、および場合によってはヒトにおける腫瘍細胞の破壊に成功していることが理解されよう。例示的な放射性同位体としては、90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、および188Reが挙げられる。放射性核種は、核DNAに複数の鎖切断を引き起こし、細胞死につながる、電離放射線を産生することによって作用する。治療用結合体を産生するために用いられる同位体は、典型的には、短い経路長を有する高エネルギーのαまたはβ粒子を産生する。そのような放射性核種は、近接する細胞、例えば、結合体が付着または進入した新生細胞を死滅させる。それらは、非局在化細胞にはほとんどまたは全く影響を与えない。放射性核種は、本質的には非免疫原性である。
V. 結合分子の発現
上記の本発明の結合分子を提供するための単離された遺伝材料の操作の後、その遺伝子は典型的には、特許請求される抗体またはその断片の所望の量を産生するために用いられうる宿主細胞への導入用の発現ベクターに挿入される。
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は本明細書において、細胞へ導入し所望の遺伝子を発現させるためのビヒクルとして、本発明によって用いられるベクターを意味するように、本明細書および特許請求の範囲のために用いられる。当業者に公知であるように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、およびレトロウイルスからなる群より容易に選択されうる。概して、本発明に適合するベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングを促進する適切な制限酵素部位、ならびに真核または原核細胞内に進入する能力および/またはその中で複製する能力を含む。
本発明のために、多数の発現ベクター系が用いられうる。例えば、あるクラスのベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス(RSV、MMTVもしくはMOMLV)、またはSV40ウイルスのような動物ウイルスに由来するDNA要素を用いる。他のクラスは、内部リボソーム結合部位を有する多シストロン系の使用を伴う。さらに、DNAを染色体に組み込んだ細胞は、形質移入された宿主細胞の選択を可能にする1つまたは複数のマーカーを導入することによって、選択されうる。このマーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性(例えば、抗生物質)、または銅のような重金属に対する耐性を提供しうる。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるDNA配列に直接連結されるか、または同時形質転換によって同一細胞に導入されるかのいずれかでありうる。また、mRNAの最適な合成には、さらなる要素が必要とされうる。これらの要素には、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルが含まれうる。特に好ましい態様において、クローニングされた可変領域遺伝子は、上記のように重鎖および軽鎖定常領域遺伝子(好ましくはヒト)合成体とともに発現ベクターに挿入される。
他の好ましい態様において、本発明の結合分子またはその断片は、多シストロン性の構築体を用いて発現されうる。そのような発現系において、抗体の重鎖および軽鎖のような、関心対象の複数の遺伝子産物は、単一の多シストロン性の構築体から産生されうる。これらの系は、内部リボソーム侵入部位(IRES)を有利に用いて、真核宿主細胞内で比較的高レベルの本発明のポリペプチドを提供する。適合するIRES配列が米国特許第6,193,980号に開示されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。当業者は、そのような発現系を用いて、本出願において開示されるあらゆる種類のポリペプチドを効果的に産生できることを理解するであろう。
より一般的には、抗体またはその断片をコードするベクターまたはDNA配列が調製されると、発現ベクターは適切な宿主細胞に導入されうる。すなわち、宿主細胞は形質転換されうる。プラスミドの宿主細胞への導入は、当業者に周知のさまざまな技法によって達成することができる。これらには、形質移入(電気泳動法および電気穿孔法を含む)、原形質融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープを有するDNAとの細胞融合、微量注入法、ならびに無傷のウイルスでの感染が含まれるが、これらに限定されることはない。Ridgway, A. A. G. 「Mammalian Expression Vectors」 Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988)を参照されたい。最も好ましくは、宿主へのプラスミドの導入は、電気穿孔法による。形質転換された細胞を、軽鎖および重鎖の産生に適した条件の下で成長させ、重鎖および/または軽鎖のタンパク質合成についてアッセイする。例示的なアッセイ技法には酵素免疫測定法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)、または蛍光活性化細胞選別装置分析(FACS)、免疫組織化学的検査などが含まれる。
本明細書において用いられる場合、「形質転換」という用語は、遺伝子型を変化させ、その結果、レシピエント細胞の変化をもたらす、レシピエント宿主細胞へのDNAの導入をいうように広い意味で用いられるものとする。
同様に、「宿主細胞」は、組換えDNA技法を用いて構築され、少なくとも1つの異種遺伝子をコードするベクターで形質転換された、細胞をいう。組換え宿主からのポリペプチドの単離の過程の記述において、「細胞」および「細胞培養物」という用語は、別様に明記されていない限り、抗体の供給源を意味するように互換的に用いられる。換言すれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、遠心沈殿された全細胞から、または培地および懸濁細胞の両方を含有する細胞培養物からのいずれかを意味しうる。
1つの態様において、抗体発現に用いられる宿主細胞株は、哺乳動物由来のものであり; 当業者は、その中で発現される所望の遺伝子産物に最も適している特定の宿主細胞株を判定することができる。例示的な宿主細胞株としては、DG44およびDUXB11 (チャイニーズハムスター卵巣株, DHFRマイナス)、HELA (ヒト子宮頸がん)、CVI (サル腎臓株)、COS (SV40 T抗原を有するCVIの派生株)、R1610 (チャイニーズハムスター線維芽細胞) BALBC/3T3 (マウス線維芽細胞)、HAK (ハムスター腎臓株)、SP2/O (マウス骨髄腫)、BFA-1c1BPT (ウシ内皮細胞)、RAJI (ヒトリンパ球)、293 (ヒト腎臓)が挙げられるが、これらに限定されることはない。1つの態様において、細胞株は、それより発現される抗体の、グリコシル化の改変、例えば、脱フコシル化を提供する(例えば、PER.C6(登録商標) (Crucell)またはFUT8-ノックアウトCHO細胞株(Potelligent(登録商標)細胞) (Biowa, Princeton, N.J.))。1つの態様において、NS0細胞が用いられうる。CHO細胞が特に好ましい。宿主細胞株は、典型的には、商業サービス、American Tissue Culture Collectionからまたは刊行された文献から入手可能である。
インビトロでの産生によって、大量の所望のポリペプチドを得るためのスケールアップが可能になる。組織培養条件の下での哺乳動物細胞の培養のための技法は、当技術分野において公知であり、例えばエアリフト反応器中もしくは連続撹拌反応器中の、均質懸濁培養、または例えば中空線維中、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズ上もしくはセラミックカートリッジ上の固定化もしくは封入された細胞培養が含まれる。必要および/または所望である場合、通例のクロマトグラフィー法、例えばゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、DEAE-セルロース上のクロマトグラフィー、および/または(免疫)親和性クロマトグラフィーによって、ポリペプチドの溶液を精製することができる。
本発明の結合分子またはその断片をコードする遺伝子は、細菌または酵母または植物細胞のような非哺乳動物細胞で発現させることもできる。この点では、細菌などのさまざまな単細胞の非哺乳類微生物; すなわち、培養液中または発酵液中において成長する能力を有するものも形質転換することができると理解されよう。形質転換に感受性である細菌には、腸内細菌科(enterobacteriaceae)、例えば大腸菌(Escherichia coli)またはサルモネラ(Salmonella)の菌株; バシラス科(bacillaceae)、例えば枯草菌(Bacillus subtilis); 肺炎球菌(Pneumococcus); 連鎖球菌(Streptococcus)、およびインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)のメンバーが含まれる。ポリペプチドは、細菌中で発現されると、封入体の一部となりうることがさらに理解されよう。ポリペプチドは、単離され、精製され、次いで集合して機能性分子に構築されなければならない。
原核生物に加えて、真核微生物も使用されうる。サッカロマイセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)、または一般的なパン酵母が、真核微生物の中で最も一般的に用いられるが、いくつかの他の菌株が一般的に利用可能である。サッカロマイセスにおける発現の場合、例えば、プラスミドYRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10: 157 (1980))が一般的に用いられる。このプラスミドは、トリプトファン中で成長する能力を欠く酵母の突然変異株、例えばATCC番号44076またはPEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977))に対する選択マーカーを提供するTRP1遺伝子をあらかじめ含んでいる。次に、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのtrpl損傷の存在は、トリプトファンの非存在下での成長によって形質転換を検出するための、効果的な環境を提供する。
VI. 結合分子の薬学的製剤および投与方法
別の局面において、本発明は、結合分子(例えば、抗体、またはその抗原結合断片)を含む薬学的組成物を提供する。
本発明の結合分子の調製および対象へのその投与のための方法は、当業者に周知であり、または当業者によって容易に判定される。本発明の抗体またはその断片の投与経路は、経口でも、非経口でも、吸入によっても、または局所であってもよい。本明細書において用いられる非経口という用語は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、または膣内投与を含む。静脈内、動脈内、皮下、および筋肉内の形態の非経口投与が一般に好ましい。これらの全ての投与形態は、明らかに本発明の範囲内であると考えられるが、例示的な投与の形態は、特に静脈内もしくは動脈内注射または点滴の場合、注射液であろう。通常、注射に適した薬学的組成物は、緩衝液(例えば酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、またはクエン酸緩衝液)、界面活性剤(例えばポリソルベート)、任意選択的に安定剤(例えばヒトアルブミン)などを含みうる。本明細書における教示に適合する他の方法では、ポリペプチドを、有害な細胞集団の部位に直接送達し、それによって病変組織の治療物質への曝露を増加させることができる。例えば、本発明の結合分子の高い熱安定性および溶解特性は、それらを、例えば皮下(Sub-Q)注射を介して、局所投与に理想的な作用物質にする。さらに、本発明の抗体の極めて高い親和性および効果は、より低い有効用量の使用を可能にし、それによって皮下注射を簡単にする。したがって、結合分子は、結合分子の局所送達が望ましい可能性がある、炎症関連障害(例えば、関節リウマチ)、がんまたは随伴症状(例えば、悪液質もしくは拒食症)の処置または予防に特に適している。
非経口投与用の調製物には、無菌の水溶液または非水溶液、懸濁液、および乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体には、生理食塩水および緩衝化培地を含む、水、アルコール溶液/水溶液、乳濁液、または懸濁液が含まれる。本発明において、薬学的に許容される担体には、0.01〜0.1 M、好ましくは0.05 Mのリン酸緩衝液または0.8%生理食塩水が含まれるが、これらに限定されることはない。他の一般的な非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲル液デキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、体液補充薬および栄養分補充薬、電解質補充薬、例えば、リンゲル液デキストロースをベースとするものなどが含まれる。防腐剤および他の添加剤、例えば、殺菌剤、抗酸化物質、キレート剤、および希ガスなども存在してよい。さらに具体的には、注射使用に適した薬学的組成物には、滅菌した水溶液(水溶性の場合)または分散液、および滅菌した注射液または分散液を即時調製するための滅菌散剤が含まれる。このような場合、組成物は滅菌されていなければならず、容易な注射可能性が存在する程度まで液状であるべきである。これは製造および保存の条件下で安定でなければならず、好ましくは、細菌および菌類などの微生物の汚染作用を防ぐように保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、ならびにその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒でもよい。例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合では必要とされる粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって適切な流動性を維持することができる。微生物の活動は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって阻止することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによって可能になる。
どのような場合でも、必要とされる量の活性化合物(例えば、抗体単独でまたは他の活性物質との組み合わせで)を、単独でまたは必要に応じて本明細書において列挙された成分の1つまたは組み合わせと、適切な溶媒に溶解して組み込み、その後にろ過滅菌することによって、滅菌注射液を調製することができる。一般的に、分散液は、活性化合物を、基本分散媒および前記で列挙された成分に由来する必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射液を調製するための滅菌散剤の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥である。真空乾燥および凍結乾燥によって、活性成分と任意のさらなる望ましい成分の予めろ過滅菌された溶液から、活性成分と任意のさらなる望ましい成分の散剤が得られる。注射用の調製物は加工され、アンプル、バック、瓶、注射器、またはバイアルなどの容器に入れられ、当技術分野において公知の方法に従って無菌条件下で密封される。さらに、調製物はキット、例えば、各々が参照により本明細書に組み入れられる同時係属中の米国特許出願第09/259,337号および米国特許出願第09/259,338号に記述されているキットの形態で包装および販売されてもよい。このような製造品には、好ましくは、関連した組成物が、自己免疫障害もしくは新生物障害に罹患している、または自己免疫障害もしくは新生物障害の素因のある対象の処置に有用なことを示すラベルまたは添付文書がありうる。
本発明の結合分子は、薬学的使用のために広範囲の濃度に製剤化することができる。例えば、結合分子は、5 mg/ml〜50 mg/ml (例えば、5、10、20、50 mg/ml)の濃度に製剤化されうる。あるいは、本発明の結合分子は、局所(例えば、皮下)投与のために、より高濃度の製剤に適応されうる。例えば、結合分子は、50 mg/ml〜200 mg/ml、例えば、約50、約75、約100、約150、約175、または約200 mg/mlの濃度に製剤化されうる。
上記の状態の処置のための、本発明の結合分子の有効用量は、投与の手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトまたは動物であるかどうか、投与される他の薬物、および処置が予防的または治療的であるかどうかを含めて、多くの異なる要因に依って異なる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も処置することができる。処置投与量は、安全性および効果を最適化するために、当業者に公知の日常の方法を用いて用量設定されうる。
本発明の抗体による受動免疫の場合、投与量は、例えば、宿主の体重の約0.0001〜100 mg/kg、およびより通常では0.01〜5 mg/kg (例えば、0.02 mg/kg、0.25 mg/kg、0.5 mg/kg、0.75 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kgなど)の範囲でありうる。例えば、投与量は、1 mg/kg体重もしくは10 mg/kg体重、または1〜10 mg/kgの範囲内、好ましくは少なくとも1 mg/kgでありうる。上記の範囲の中間の用量も、本発明の範囲内であることが意図される。
対象は、そのような用量を、毎日、1日おきに、毎週、または実験的分析によって判定される任意の他の予定にしたがって、投与することができる。例示的な処置は、長期に渡る、例えば、少なくとも6ヶ月の、複数の投与量での投与を伴う。さらなる例示的な処置計画は、2週間ごとに1回、または1ヶ月に1回、または3〜6ヶ月ごとに1回の投与を伴う。例示的な投与スケジュールは、連日の1〜10 mg/kgもしくは15 mg/kg、1日おきの30 mg/kgまたは毎週60 mg/kgを含む。いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する2種またはそれ以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、その場合、投与される各抗体の投与量は、指示される範囲内にありうる。
本発明の結合分子は、何度も投与することができる。1回の投与量の間の間隔は、例えば、1日ごと、週ごと、月ごと、または年ごとでありうる。間隔は、患者におけるポリペプチドまたは標的分子の血中レベルを測定することによって示されるように不定期であってもよい。いくつかの方法では、投与量は、ある種の血漿中抗体または毒素濃度、例えば、1〜1000 μg/mlまたは25〜300 μg/mlを達成するように調節される。あるいは、抗体またはその断片は、徐放性製剤として投与することができ、その場合、低頻度投与しか必要とされない。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に依って異なる。一般に、生殖細胞系列化またはヒト化抗体は、最も長い半減期を示し、その次にキメラ抗体および非ヒト抗体が続く。1つの態様において、本発明の抗体またはその断片は、非結合型で投与することができる。別の態様において、本発明の抗体は、結合型で複数回投与することができる。別の態様において、本発明の抗体またはその断片は、非結合型で、次に結合型で投与することができるか、またはその逆の場合も同じであることができる。
投与量および投与頻度は、処置が予防的または治療的であるかどうかに依って異なりうる。予防的用途においては、本発明の抗体またはそのカクテルを含有する組成物は、患者の耐性を増強するために、まだ疾患状態にはない患者に投与される。そのような量は「予防的有効用量」であると定義される。この用途において、正確な量はやはり患者の健康状態および全身免疫に依存するが、概して1用量当たり0.1〜25 mg、特に1用量当たり0.5〜2.5 mgの範囲である。比較的低い投与量が、長期にわたって比較的頻繁ではない間隔で投与される。患者のなかには一生処置を受け続けるものもいる。
治療的用途においては、比較的短い間隔で、比較的高い投与量(例えば、1用量当たり約1〜400 mg/kgの抗体であり、放射性免疫結合体の場合には5〜25 mgの投与量がより一般的に用いられ、かつ細胞毒素-薬物結合分子の場合にはさらに高い用量)が時に、疾患の進行が緩和または終結されるまで、および好ましくは、患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、必要とされる。その後は、患者に予防的計画を施行することができる。
1つの態様において、対象は、(例えば、ベクター中の)本発明のポリペプチドをコードする核酸分子で処置することができる。ポリペプチドをコードする核酸の用量は、患者当たり約10 ng〜1 g、100 ng〜100 mg、1 μg〜10 mg、または30〜300 μgのDNAの範囲である。感染性ウイルスベクターの用量は、1用量当たり10〜100個のウイルス粒子またはそれ以上のウイルス粒子まで様々である。
治療物質は予防的および/または治療的処置のための、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、または筋肉内手段によって投与することができる。筋肉内注射または静脈内注入が、本発明の抗体の投与に好ましい。方法によっては、治療用抗体またはその断片が頭蓋内に直接注射される。方法によっては、抗体またはその断片が、徐放性組成物またはMedipad(商標)装置のような、装置として投与される。
本発明の作用物質は、処置(例えば、予防的処置または治療的処置)を必要とする障害または病態の処置で有効である他の作用物質と組み合わせて任意で投与されてもよい。好ましいさらなる作用物質は、当技術分野において認識されておりかつ特定の障害のために標準的に投与されるものである。
本発明の90Y標識抗体の有効な1回の処置投与量(すなわち、治療的有効量)は、約5〜約75 mCi、より好ましくは約10〜約40 mCiの範囲である。131I標識抗体の有効な1回の処置の非骨髄除去的投与量は、約5〜約70 mCi、より好ましくは約5〜約40 mCiの範囲である。131I標識抗体の有効な1回の処置の除去的投与量(すなわち、自家骨髄移植を必要としうる)は、約30〜約600 mCi、より好ましくは約50〜約500 mCi未満の範囲である。
131Iおよび90Yを用いて多くの臨床経験が得られているが、他の放射標識が当技術分野において公知であり、同様の目的に用いられている。画像化にはさらに他の放射性同位体が用いられる。例えば、本発明の範囲に適合するさらなる放射性同位体には、123I、125I、32P、57Co、64Cu、67Cu、77Br、81Rb、81Kr、87Sr、113In、127Cs、129Cs、132I、197Hg、203Pb、206Bi、177Lu、186Re、212Pb、212Bi、47Sc、105Rh、109Pd、153Sm、188Re、199Au、225Ac、211At、213Biが含まれるが、これらに限定されることはない。この点に関して、α、γおよびβ放射体は全て本発明に適合する。さらに、本開示に照らして、当業者は、過度な実験を行うことなく、どの放射性核種が選択した一連の処置と適合するのかを、容易に判定しうると考えられる。この目的のために、臨床診断で既に使われているさらなる放射性核種には、125I、123I、99Tc、43K、52Fe、67Ga、68Ga、および111Inが含まれる。また、抗体は、標的免疫療法における潜在的用途のために、種々の放射性核種で標識されている(Peirersz et al. Immunol. Cell Biol. 65: 111-125 (1987))。これらの放射性核種には、それほどではないにせよ、188Reおよび186Reならびに199Auおよび67Cuが含まれる。米国特許第5,460,785号は、そのような放射性同位体に関するさらなるデータを提供しており、参照により本明細書に組み入れられる。
上述のように、本発明の結合分子は、哺乳動物の障害のインビボ処置のために薬学的有効量で投与することができる。この点に関して、開示される抗体またはその断片は、投与を容易にし、活性物質の安定性を促進するように、製剤化されることが理解されよう。好ましくは、本発明による薬学的組成物は、生理食塩水、無毒の緩衝液、保存料などのような薬学的に許容される無毒の滅菌担体を含む。本出願の意図に関して、治療物質に結合されたまたは結合されていない本発明の抗体の薬学的有効量は、標的への効果的な結合を得るのに、および利益を得るのに、例えば、疾患もしくは障害の症状を改善するのに、または物質もしくは細胞を検出するのに十分な量を意味するものとする。腫瘍細胞の場合、ポリペプチドは、好ましくは、新生細胞または免疫反応細胞上で、選択した免疫反応性抗原と相互作用することが可能であり、これらの細胞死の増加をもたらすであろう。もちろん、本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量のポリペプチドを提供するために、単回または複数回の用量で投与されうる。
本開示の範囲に即して、本発明の結合分子は、治療的または予防的効果をもたらすのに十分な量で、前述の処置方法にしたがってヒトまたは他の動物に投与されうる。本発明のポリペプチドは、本発明の抗体を、公知の技法によって従来の薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせることにより調製される従来の剤形で、そのようなヒトまたは他の動物に投与することができる。当業者は、薬学的に許容される担体または希釈剤の形態および特性が、組み合わされる活性成分の量、投与経路、および他の周知の変数によって決定されることを認識するであろう。当業者は、1つまたは複数の種の本発明によるポリペプチドを含むカクテルが、特に効果的であるものと判明しうることをさらに理解するであろう。
VII. IL-6関連疾患またはIL-6関連障害を処置する方法
本発明の結合分子は、IL-6活性に拮抗するのに有用である。したがって、別の局面において、本発明は、処置を必要とする対象に、1つまたは複数の本発明の結合分子を含む薬学的組成物を投与する段階によってIL-6関連疾患またはIL-6関連障害を処置するための方法を提供する。
処置可能であるIL-6関連疾患またはIL-6関連障害は、非限定的に、炎症性疾患およびがんを含む。
当業者は、日常の実験によって、IL-6関連疾患またはIL-6関連障害を処置する目的で、抗体(またはさらなる治療物質)の有効な毒性のない量がどれくらいかを判定することができるであろう。例えば、ポリペプチドの治療的に活性な量は、病期(例えば、第I期対第IV期)、年齢、性別、医学的合併症(例えば、免疫抑制状態または疾患)および対象の体重のような要因、ならびに抗体が対象において所望の反応を誘導する能力によって異なりうる。投与計画は、最適な治療反応を提供するように調節されうる。例えば、いくつかに分割した用量を毎日投与してもよく、または治療状況の要件によって示されるように、用量を比例的に低減してもよい。しかしながら、一般に、有効な投与量は体重1キログラム当たり日量約0.05〜100ミリグラム、より好ましくは体重1キログラム当たり日量約0.5〜10ミリグラムの範囲であると予想される。
VIII. 例証
実施例1 IL-6特異的アンタゴニストFabの作製および選択
ラマに、(MACS Miltenyi Biotecから購入した、大腸菌(E.coli)において産生された(カタログ番号130-093-934)またはHumanzymeから購入したヒト胎児腎臓細胞において産生された(カタログ番号HZ-1044))ヒトIL-6を免疫した。ラマの免疫および末梢血リンパ球(PBL)の収集、ならびにその後のRNA抽出および抗体断片の増幅は、De Haardおよびその同僚(De Haard H, et al., JBC. 274: 18218-30, 1999)によって記述されているように行った。最後の免疫の後、血液を集め、調製されたPBLからFicoll-Paque勾配およびChomczynski Pら(Anal. Biochem. 162: 156-159, 1987)によって記述されている方法を用いて全RNAを抽出した。De Haard Hら(Biol. Chem. 274, 1999)によって記述されているようにFabを含むファージミドライブラリーを構築するため、抽出されたRNAを次いで、ランダムcDNA合成ならびに重鎖および軽鎖のV領域(VλおよびVκ)のPCR増幅に用いた。
Fabを発現しているファージを、標準的なプロトコールにしたがって産生し、ビオチン化され、かつニュートラアビジンによって捕捉されるか、またはmaxisorpプレートに直接コーティングされているかのどちらかの固定化ヒトIL-6にてさらに選択した。トリプシンによるIL-6結合ファージの全溶出または競合的溶出は、標準的なファージディスプレー法プロトコールにしたがって行われた。
IL-6特異的なFabを次に、ELISAに基づく競合アッセイ法を用いて、IL-6中和抗体、B-E8およびIL-6受容体との交差競合についてスクリーニングした。このアッセイ法を用いて特定された例示的なアンタゴニストのIL-6特異的FabのVHおよびVLアミノ酸配列は、下記表13に記載されている。
B-E8抗体と交差競合しえたIL-6特異的Fabの結合反応速度を、表面プラズモン共鳴(Biacore)を用いて評価した。具体的には、ビオチン化された(原核生物) IL-6をストレプトアビジンビアコアセンサチップ(CM5-SA)に捕捉し、異なる濃度の精製Fabを3分間注入し、引き続き緩衝液での5分間の洗浄を行った。洗浄相からは、オフ速度(kd)が決定されたが、注入相からは、オン速度(ka)がパラメータとして濃度およびオフ速度を用いて算出された。アンタゴニストFabの、測定されたオフ速度およびオン速度ならびに算出された親和性を表2に示す。Fab 24C9および24D10は、10-5 s-1の範囲にオフ速度を有し、それぞれ、660および270 pMの親和性を有する。アンタゴニスト精製Fab (表3)およびFabを発現している細菌のペリプラズム画分(表4)の結合反応速度をまた、CM5チップに直接コーティングされた細菌産生ヒトIL-6および真核生物産生ヒトIL-6の両方を用いて表面プラズモン共鳴(Biacore)により評価した。試験したFabは、6×10-4〜2×10-5 s-1間のオフ速度を有していた。
（表２）選択され精製されたアンタゴニストFabクローンの結合反応速度
Figure 2015518857
（表３）選択され精製されたアンタゴニストFabクローンの結合反応速度
Figure 2015518857
（表４）Fabを含むペリプラズム画分の結合反応速度
Figure 2015518857
実施例2. 改善された親和性のためのVH/VLシャッフリング
VL鎖シャッフリングを用いて、Fab 17F10、18C7、18C9、18C11、20A4、29B11、16D2、および28A6の親和性を改善した。この方法では、これらのクローンの重鎖(VHCH1断片としての)を一次ファージミド軽鎖ライブラリーに再導入した(実施例1参照)。親和性選択を行って、IL-6に対する改善された親和性を有する鎖シャッフルされたFabを選択した。鎖シャッフルされたFabの結合反応速度を、細菌産生ヒトIL-6および真核生物産生ヒトIL-6の両方、ならびにカニクイザルIL-6を用いて表面プラズモン共鳴(Biacore)により評価した(表5〜7)。VL鎖シャッフリング法によって選択された例示的なIL-6特異的FabのVHおよびVLアミノ酸配列は、下記表14に記載されている。
また、VH鎖シャッフリングを用いて、Fab 24D10の親和性を改善した。この方法では、24D10の軽鎖を一次ファージミド重鎖ライブラリーに再導入し(実施例1参照)、オフ速度アッセイ法を用いて選択した。この種の選択においては、ファージを1.5〜2時間、基材上の抗原に結合させた。ラウンド2で、PBS-Tweenによる15回の洗浄後に、過剰の可溶性IL-6を存在させてさらなる洗浄を行った。その原理は、劣ったオフ速度を有する、それゆえ、より迅速に解離するファージ抗体が過剰の可溶性標的により捕捉され、洗浄中に除去されるというものである。この手順によって、コーティングされた標的へのそのようなファージの再結合が回避される。さらなる洗浄工程の時間を、行われるラウンド数により増加させ、温度も37℃に上昇させて、より安定なFab変種を選択した。鎖フャッフルされたFabならびにベンチマーク抗体BE8およびGL18の結合反応速度を、細菌産生ヒトIL-6および真核生物産生ヒトIL-6の両方を用いて表面プラズモン共鳴(Biacore)により評価した(表8および9)。VH鎖シャッフリング法によって選択された例示的なIL-6特異的FabのVHおよびVLアミノ酸配列は、下記表14に記載されている。
（表５）精製された17F10、18C11、18C7、および20A4鎖シャッフルFabの結合反応速度
Figure 2015518857
（表６）29B11鎖シャッフルFabを含有するペリプラズム画分の結合反応速度
Figure 2015518857
（表７）28A6鎖シャッフルFabを含有するペリプラズム画分の結合反応速度
Figure 2015518857
（表８）24D10鎖シャッフルFabを含有するペリプラズム画分の結合反応速度
Figure 2015518857
（表９）精製された24D10鎖シャッフルFabの結合反応速度
Figure 2015518857
実施例3 IL-6との複合体におけるFab 61H7の結晶構造
(i) IL-6/Fab 61H7複合体の特徴決定
0.5 ml/分の流速で50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaClにより溶出されるSilica Gel KW803カラム(Shodex)を用いたAlliance 2695 HPLCシステム(Waters)にてサイズ排除クロマトグラフィーを行った。3倍角の光散乱検出器(Mini-DAWN(商標) TREOS, Wyatt technology, Sanata Barbara, USA)を用いて検出を行った。分子量の決定は、ASTRA Vソフトウェア(Wyatt technology)により行った。
(ii) 結晶化
IL-6/Fab 61H7複合体の初期結晶化スクリーニングは、市販のキットStructure screen 1および2、Proplex screenならびにStura Footprint screen (Molecular Dimensions Ltd)で行った。Cartesian MicroSys SQロボットを用いてGreiner 96ウェルプレートに対し全容量200 nl中、比率1 : 1 (v/v)のタンパク質(8.45 mg/ml)対母液で液滴を設定した。27.14% PEG MME 2K, 0.1 M Na Hepes pH 7.14中で最適化した後に277 Kでのシッティングドロップ蒸気拡散法によって、複合体の回折品質の結晶を得た。結晶はC2空間群に属し、単位セル寸法: a= 108.2Å、b= 47.5Å、およびc=148.3Åならびにβ=97°を有する。それらは、非対称ユニット当たりに1つのILF/Fab複合体を含み、48%の溶媒含量に相当する2.36Å3/DaのVm値を有する。
(iii) IL-6:61H7複合体の構造の分析
61H7 mAbのCDRループに対して予測されたカノニカル構造は、それぞれH1およびH2に対して1および3、ならびにそれぞれL1、L2、およびL3に対して7、1および4である(www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html)。Protein Data Bank (PDB)のエントリ1dfb (HIV-1タンパク質gp41に対する患者由来抗体から得られた)との61H7 VHの重ね合わせから、H1およびH2が、予測されるカノニカルな折り畳みを採用していることが示される(図3A参照)。Protein Data Bank (PDB)のエントリ1mfaとの61H7 VLの重ね合わせから、全3つの軽鎖CDRが、予測される高次構造を採用していることが実証される(図3B参照)。したがって、構造解析から、61H7のVH (VH3ファミリーのメンバー)がカノニカルH1-H2構造のヒト1-3の組み合わせに属し、その一方で61H7のVL (VL8ファミリーのメンバー)がヒトカノニカル構造のヒト7λ1-4の組み合わせに属することが確認されるものである。
IL-6は、これまでに結晶化されており、ループおよびさらにミニヘリックスによって連結された4ヘリックスバンドルとして分類されている(Somers et al., 1997, EMBO Journal 16, 989-997、これは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。IL-6:61H7複合体からのIL-6とのアポIL-6 (pdb 1 ALU)の重ね合わせから、両モデル間の良好な一致が示される(rms 0.54Å)。これは、61H7 FabがIL-6の天然立体構造を認識かつ結合することを確認するものである。
IL-6受容体およびシグナル伝達受容体gp130との複合体におけるIL-6の結晶構造から、六量体複合体が示された(Boulanger et al., 2003, Science 27, 2101-2104, これは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。IL-6は、部位Iを通じてIL-6Rと非シグナル伝達複合体を形成する。部位IIは、IL-6およびIL-6Rの二元複合体によって形成される複合エピトープである。gp130との部位IIIの相互作用は、シグナル伝達複合体を形成する。
IL-6:61H7構造とのIL-6:IL-6R構造(pdb 1P9M)の重ね合わせから、両IL-6構造間の良好な一致が示される(rms 1.2Å)。2つのループは立体構造が異なる。残基Asn48〜Asn61を網羅する第1のループは、アポIL-6およびIL-6:61H7複合体において構造化されていない長いループである。このループは、IL-6Rの結合によりIL-6:IL-6R構造において安定化される。立体構造が異なる第2のループは、いわゆるBCループである。
結晶の非対称ユニットは、単一の1:1複合体を含む。IL-6:61H7複合体の全体的構造から、VH (60%)およびVL (40%)の両方が大きな相互作用表面(940Å2)に寄与することが示される。結晶構造から、IL-6との相互作用に重要な残基が判定された。61H7 Fabとサイトカインとの間で形成される水素結合および塩橋は、表10に記載されている。相互作用は、軽鎖のCDR1およびCDR3ならびに重鎖のCDR1、CDR2およびCDR3に限定される。
（表１０）61H7:IL-6複合体における水素結合および塩橋
Figure 2015518857
IL-6:61H7複合体およびIL-6:IL-6R複合体の重ね合わせから、61H7 FabとIL-6R
との間に立体障害が存在することが示される。それは主に、IL-6Rとの立体衝突をもたらすVLである。IL-6Rおよび61H7のエピトープは、お互い非常に近いものと考えられる。両エピトープ間に重複が存在するかを検証するために、IL-6Rの4.0Å内の残基および61H7 Fabの4.0Å内の残基をマップし、両エピトープ間の重複について探索した。両エピトープ間の重複は、かなり小さく、VHパラトープによって主に形成される。重複は、IL-6R分子と61H7のHCDR3ループの両方によって占有される空隙の周囲に集中している。IL-6上のIL-6Rのこの結合部位は、部位Iといわれている(Boulanger et al., 2003, Science 27, 2101-2104、これは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。部位Iを形成する空隙は、IL-6RのPhe 229の疎水性側鎖によって占有される。このアミノ酸は、突然変異誘発試験によって、受容体とサイトカインとの間の相互作用におけるその重要な役割が示されているため、Boulangerらによりホットスポット残基と呼ばれている。この残基の、バリンまたはセリンへの変異によって、IL-6へのIL-6Rの結合が完全になくなった(Kalai et al., 1997, Blood, 1319-1333、これは、参照によりその全体が本明細書にともに組み入れられる)。Fab 61H7の重鎖CDR3ループの中央のTrp98は、同じ空隙を占有していることから、それがそれゆえに、(図5に示されている) IL-6RとのIL-6の相互作用をブロックするためのIL-6における重要なエピトープに当たることが示唆される。Trp98は、IL-6に対するFab61H7の超高親和性に重要な残基である可能性が高い。
実施例4 IL-6との複合体におけるFab 68F2および129D3の結晶構造
（i) IL-6:68F2結晶の作製、データ収集、および構造決定
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(d-PBS) pH 7.2中の68F2 mAb (4 mg/ml) 8 mgを、Zeba TM Desalt Spin Column (Pierce Fab Preparation Kit Thermo Scientific)にて、20 mMシステイン-HClを含有する消化用緩衝液に緩衝液交換した。サンプルを固定化パパイン(Pierce Thermo Scientific)とともにインキュベートし、6時間37℃で消化した。d-PBS中で平衡化されたCaptureSelectヒトFc親和性マトリックス(BAC BV Unilever)を用いてFab断片からFc断片を分離した。Fab断片は素通りの中に回収され、Fc断片は0.1 MグリシンpH 2.0を用いて溶出された。UV分光測定により280 nmでの吸光度からタンパク質濃度を決定した。精製Fab 68F2 4.6 mg (>50%)が回収され、これをAmicon-Ultra (カットオフ値10 kDa)にて1.53 mg/mlに濃縮した。
rh IL-6 (Immunotools) 2.5 mgを、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(d-PBS) pH 7.2中のFab 68F2 2.6 mgとともに4℃で1時間インキュベートした後に、Amicon-Ultra (カットオフ値10 kDa)にて1 mlに濃縮した。IL-6:68F2複合体を次いで、d-PBS中、Superdex75カラムに対するゲルろ過クロマトグラフィーにより過剰の遊離IL-6から分離し、最終的に、Amicon-Ultra濃縮器(カットオフ値10 kDa)にて8.1 mg/mlに濃縮した。複合体の精製をSDS-PAGEにて評価した。
0.5 ml/分の流速で50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaClにより溶出されるSilica Gel KW803カラム(Shodex)を用いたAlliance 2695 HPLCシステム(Waters)にてサイズ排除クロマトグラフィーを行った。3倍角の光散乱検出器(Mini-DAWN(商標) TREOS, Wyatt technology, Santa Barbara, USA)を用いて検出を行った。分子量の決定は、ASTRA Vソフトウェア(Wyatt technology)により行った。IL-6:68F2複合体の初期結晶化スクリーニングは、市販のキットStructure screen 1および2、Proplex screenならびにStura Footprint screen (Molecular Dimensions Ltd)で行った。Cartesian MicroSys SQロボットを用いてGreiner 96ウェルプレートに対し全容量200 nl中、比率1 : 1 (v/v)のタンパク質(8.1 mg/ml)対母液で液滴を設定した。25% PEG 4K、0.15 M (NH4)2SO4、0.1 M MES pH 5.5中で9ヵ月後に277 Kでのシッティングドロップ蒸気拡散法によって、複合体の回折品質の結晶を得た。
データ収集用の結晶を、7.5%エチレングリコールを有する母液に移し、液体窒素中で急速冷凍した。ESRFシンクロトロン(Grenoble, France)でのADSC Quantum 4検出器を用い、ビームラインID 14-4にて標準的な極低温状態の下で回折データを収集し、これをXDSを用いて加工処理し、XSCALEでスケーリングした。Fab 68F2との複合体におけるIL-6の結晶構造は、MOLREPを用いたFab 129D3およびIL-6構造との分子置換によって単一波長ネイティブ回折実験から判定された(表4)。精緻化はBUSTERで行った。IL-6:129D3結晶は同様に作製された。
（iii) IL-6:68F2およびIL-6:129D3複合体の構造の分析
IL-6:68F2複合体の結晶構造は2.9Åの分解能を有する。このモデルを合理的な立体化学で26.7%のR因子および29.6%のR自由因子に精緻化した(残基の95%超が許容される立体構造を採用していることを意味している)。IL-6:129D3複合体の結晶構造は、2.8Åの分解能を有する。このモデルを合理的な立体化学で28.5%のR因子および31.3%のR自由因子に精緻化した。
結晶化された68F2および129D3 Fab (平均二乗偏差1.4Å)の、VHドメイン(平均二乗偏差0.5Å)のおよびVLドメインの重ね合わせを作製した(平均二乗偏差0.4)。これらの重ね合わせから、親68F2と生殖細胞系列化された129D3 Fabの構造との間に有意差は存在しないことが示される。
68F2 mAbおよび生殖細胞系列化されたその変種129D3のCDRループに対して予測されたカノニカル構造は、それぞれH1およびH2に対して3および1、ならびにそれぞれL1、L2、およびL3に対して6λ、1および5である。重鎖のカノニカルな折り畳みは、www.bioinf.org.uk/abs/chothia.htmlのサーバーにより予測され、軽鎖のカノニカルな折り畳みは手動で判定された。軽鎖のカノニカルな折り畳みの比較のための参照基準のFab (PG16)は、Antibody Structure Summary Page (www.bioinf.org.uk/abs/sacs/antibody_structure_summary_page.html)を探索することによって手動で見出された。PG16 (Protein Data Bank (PDB)エントリ3MUG)のVLとの68F2および129D3 VLの重ね合わせから、全3つのCDRが、予測される高次構造を採用していることが実証される(図4A参照)。参照基準のPDBエントリ1ACYとの68F2/129D3 VHの重ね合わせから、H1およびH2が、予測されるカノニカルな折り畳みを採用していることが示される(図4B参照)。したがって、構造解析から、68F2/129D3のVL (VL2ファミリーのメンバー)がカノニカルL1-L3構造のヒト6λ-1-5の組み合わせに属し、その一方で68F2/129D3のVH (VH4ファミリーのメンバー)がヒトカノニカルH1-H2構造の3-1の組み合わせに属することが確認されるものである。
結晶の非対称ユニットは、単一の1:1複合体を含む。IL-6:68F2複合体の全体的構造から、VH (50%)およびVL (50%)が大きな相互作用表面(1156Å2)に等しく寄与することが示される。相互作用表面は、IL-6との61H7の相互作用表面(940Å2)よりもわずかに大きい。61H7:IL-6複合体に類似して、L2ループだけがIL-6との相互作用に直接関与していない。
重鎖と軽鎖との間の界面は、68F2構造の場合1764.7Å2および129D3構造の場合1768.5Å2に相当する。この界面面積は、61H7抗体に対して測定された面積(1580.6Å2)および27B3抗体に対して測定された面積(1700.3Å2)に匹敵していた。全ての界面面積は、EMBLウェブサービスプログラムPISAで算出された。
結晶構造から、IL-6との相互作用に重要な残基を判定した。68F2 Fabとサイトカインとの間で形成される水素結合および塩橋は、表11に記載されている。相互作用は、軽鎖のCDR1およびCDR3ならびに重鎖のCDR1、CDR2およびCDR3に限定される。
20A4クローンのVLシャッフリングは、親20A4よりも10倍良好な親和性を有する68F2クローンをもたらした。両抗体は、そのL1およびL2 CDRが主に異なる。軽鎖CDR2ループはIL-6の結合に寄与せず、したがって、親和性の改善はL1ループにおける変異に起因しているはずである。IL-6との重要な相互作用をなす3つの残基のうちの2つが、20A4クローンにおいては保存されていない: IL-6のSer76と水素結合をなすAsn26は、20A4においてはSerであり; かつIL-6と2つの水素結合をなすThr31は、20A4親L1においてはGlyである。これらの2つの残基の変化時の3つの新たな水素結合の追加によって、VLシャッフリング後に認められた親和性のいくらかの増分が説明される可能性が高い。最も重要なことには、L1の変化はおそらく、Y30 (Kabat番号付け)をF229空隙中で適切に安定化かつ/または配置し、特に高い効果を可能にする。
（表１１）68F2:IL-6複合体における水素結合および塩橋
Figure 2015518857
IL-6:68F2複合体およびIL-6:IL-6R複合体の重ね合わせから、61H7:IL-6複合体の場合に認められたように、68F2 FabとIL-6Rとの間に立体障害が存在することが示される。しかしながら、61H7:IL-6複合体とは対照的に、それは主に、68F2:IL-6複合体においてIL-6Rとの立体衝突をもたらす68F2のVHである。68F2 Fabは、ぴったりIL-6Rと同じ部位でIL-6と相互作用する。さらに、68F2はgp130結合部位と重なり合わず、それゆえIL-6Rと、のみかつ特異的に競合する。
IL-6:IL-6RおよびIL-6:68F2複合体の重ね合わせから、IL-6Rおよび68F2のエピトープがお互い非常に近いものと考えられることが示唆される。両エピトープに属する残基をIL-6上にマップし、重複を判定した。IL-6Rとの68F2エピトープの重複は、ほぼ完全である。IL-6上のIL-6Rの結合部位は、部位Iと呼ばれている(Boulanger et al., 2003, Science 27, 2101-2104)。部位Iを形成する空隙は、IL-6RのPhe 229の疎水性側鎖によって占有される。このアミノ酸は、突然変異誘発試験によって、受容体とサイトカインとの間の相互作用におけるその重要な役割が示されているため、Boulangerらによりホットスポット残基と呼ばれている。この残基の、バリンまたはセリンへの変異によって、IL-6へのIL-6Rの結合が完全になくなった(Kalai et al., 1997, Blood, 1319-1333)。IL-6:68F2構造にて部位Iとして記述されている空隙の検査から、Fab 68F2の軽鎖のCDR1ループによって占有されることが明らかである。特に、軽鎖のCDR1におけるTyr32 (Kabat番号付けでは位置番号30)は、この部位の結合で重要な役割を果たす(図5C)。
IL-6とIL-6Rとの間の相互作用における別の重要な残基は、IL-6RのPhe279である。この残基は、(Phe229の場合の28% (174Å2)と比べて)全結合界面の20% (129Å2)に相当し、これを、2番目に重要な相互作用にしている。Phe229のように、Phe279もIL-6の表面上に形成される空隙において結合する。この空隙はまた、重鎖のCDR3ループの68F2残基によって、より詳細にはVal104 (Kabat番号付けでは位置番号99)によって占有される(図6)。
IL-6は、これまでに結晶化されており、ループおよびさらにミニヘリックスによって連結された4ヘリックスバンドルとして分類されている(Somers et al., 1997, EMBO Journal 16, 989-997)。IL-6受容体およびシグナル伝達受容体gp130との複合体におけるIL-6の結晶構造も解析されている(Boulanger et al., 2003, Science 27, 2101-2104)。IL-6は、部位Iを通じてIL-6Rと非シグナル伝達複合体を形成する。部位IIは、IL-6およびIL-6Rの二元複合体によって形成される複合エピトープである。gp130との部位IIIの相互作用は、シグナル伝達複合体を形成する。
IL-6:68F2構造とのIL-6:61H7複合体の構造の比較から、両mAbがIL-6の部位Iへの結合でIL-6Rと競合するものの、この2種の抗体は2種の異なるエピトープの位置でIL-6を結合することが示される。68F2は、たる状のIL-6の側面に結合し、IL-6Rの結合で排他的に競合するが、61H7は、たる状のIL-6の底部でさらに多く相互作用し、IL-6Rおよびgp130の両方と競合する。興味深いことに、IL-6上の独特の重複エピトープは、IL-6Rのホットスポット残基Phe229によって満たされる空隙である(図5)。これは、この空隙への結合が、68F2および61H7について認められた高い効果へのカギであることを示唆している。
実施例5 61H7のHCDR3におけるW98の構造機能分析
本明細書において開示される極めて強力な抗体の顕著な特徴は、IL-6RのF229が結合するIL-6上の空隙(本明細書においてF229空隙といわれる)を占有するその能力である。61H7 (および生殖細胞系列化されたその変種、例えば、111A7)の場合、F229空隙はHCDR3のトリプトファン98残基(W98)によって占有される。IL-6への61H7の結合に対するW98の機能的重要性を評価するために、M100AまたはM100Lのバックグラウンドでの可能な全てのアミノ酸の方向へVH位置番号98を変異させた111A7の変異体を作製した。変異体Fabを含有する細菌のペリプラズム画分の結合反応速度を、表面プラズモン共鳴(Biacore)を用いて試験し、各変異体に対するオフ速度を判定した。変異分析の結果は、表12に記載されている。このデータから、位置番号98のトリプトファン(W)が、最良のオフ速度を達成するために可能な最良のアミノ酸であることが明らかに示される。W98の変異は常に、IL-6への111A7の結合に有害であった。
（表１２）位置番号98および100にVH変異を有する61H7 Fabのオフ速度
Figure 2015518857
実施例6 Fabクローン61H7および68F2のVHおよびVLの生殖細胞系列化
クローン68F2および61H7のVHおよびVL配列をヒト生殖細胞系列VHおよびVL配列に対し並置して、最も近い関連性のある生殖細胞系列配列を特定した。生殖細胞系列化のプロセスは、WO 2010/001251に記述されているように、ならびにBacaら(J. Biol. Chem. (1997) 272: 10678-10684)およびTsurushitaら(J. Immunol. Methods (2004) 295: 9-19)によって記述されているように行われた。ライブラリー/ファージディスプレー法を用いたが、ここではヒト残基およびラマ残基の両方に対して偏向しているFR残基を組み入れた。
本発明のラクダ科動物由来のIL-6抗体は、配列および構造が著しくヒト様であった。結果として、最終の、生殖細胞系列化された変種には、(生殖細胞系列化を介して)最小限の数の配列変化しか組み入れられなかった。例えば、68F2親抗体のVHおよびVLフレームワーク領域における87個(VH)および79個(VL)のアミノ酸のうち、6個(VH)および7個(VL)のアミノ酸変化しか導入されず(合計13個のアミノ酸変化)、その各VHおよびVLフレームワークにおいて93.1%および91.1%の同一性を有する最終の、生殖細胞系列化されたリード(129D3)をもたらした(図10Aのアライメントを参照のこと)。同様に、61H7親抗体のVHおよびVLフレームワーク領域における87個(VH)および79個(VL)のアミノ酸のうち、8個(VH)および5個(VL)のアミノ酸変化しか導入されず(合計13個のアミノ酸変化)、その各VHおよびVLフレームワークにおいて90.8%および93.7%の同一性を有する最終の、生殖細胞系列化されたリード(111A7)をもたらした(図10Bのアライメントを参照のこと)。
対照的に、当技術分野において認識されているIL-6抗体は、治療的使用に適した変種を作製するのに広範囲に及ぶ量の操作(CDRグラフティング)および配列変化(復帰突然変異)を要する。例えば、参照基準マウスIL-6抗体CNTO-328は、そのVHおよびVLフレームワークにおいて84%および72.5%の相同性しか持たないヒト化された変種CNTO136を作製するのに、14個(VH)および22個(VL)のアミノ酸変化(合計36個)を要した(アライメントについては、図11Aを参照のこと)。別の参照基準ウサギIL-6抗体ALD518は、親抗体と70.5%および74%の配列相同性しか持たない最終の、ヒト化された変種を作製するのに、合計46個のフレームワーク変化(VH中26個かつVL中20個)を要した。それゆえ、本IL-6抗体は明らかに、最小限の操作を要するだけで、配列がずっとヒトに近い分子を生ずる。
さらに、変更されるべきFR残基の数が少ないことで、生殖細胞系列化プロセスにCDR残基の変化を組み入れることが可能になる。そのようなCDR変異を用いて、産生の変異性(グリコシル化部位、酸化、異性化など)を導入するアミノ酸を除去することができ、または生殖細胞系列に対する異なる抗体変種において見出されるアミノ酸の方へCDR残基を変化させることができる。
ストリンジェントな選択条件を適用するファージディスプレー法を用いて、さらなる機能的Fabを選択した。個々のクローンをオフ速度についてスクリーニングし、最良のヒットを配列決定し、ヒト配列同一性について判定した。例示的な生殖細胞系列化されたIL-6特異的FabのVHおよびVLアミノ酸配列は、下記表15および16に記載されている。
129D3および111A7の変種Fabである特定された全てのVHおよびVLドメイン由来のCDR領域配列を比較し、CDRアミノ酸コンセンサス配列を判定した。129D3および111A7のCDR変種、ならびに得られたCDRコンセンサス配列は、下記表17および18に記載されている。
実施例7 インビトロ有効性アッセイ法
クローン129D3、68F2、61H7、133A9、133H2、133E5および132E7のインビトロでの効果を、本質的にはHelle et al. 1988, Eur. J. Immunol 18;1535-1540に記述されているように、B9細胞株を用いた細胞に基づく中和バイオアッセイ法によって判定した。B9細胞はマウスB細胞ハイブリドーマ細胞株B13.29に由来し、これは生存および増殖のためにIL-6を要し、非常に低濃度のヒトIL-6に応答する。このアッセイ法は、10 pg/ml (または0.5 pM)のヒトIL-6および濃度系列の精製129D3、B-E8、CAT6001、CNTO136、61H7、UCB124.g1を用いて行われた。B9細胞を、抗体有りおよび無しで、IL-6の存在下において、平底ウェルの中に細胞5000個/200マイクロリットルにてIL-6不含培地に播種した。64〜72時間の時点での[3H]チミジンパルスによって増殖を測定した。この結果(図1および表23に示されている)は、全てのクローンが高い有効性を有し、129D3はこのアッセイ法において0.1 pM未満のIC50を有することを実証している。興味深いことに、図1に示されるように、クローン129D3のIC50はベンチマークのCNTO136、CAT6001、UCB124、およびB-E8抗体よりも優れていた。
クローン133E5、133A9、133H2、111B1、104C1、129D3、68F2、61H7のインビトロでの効果をまた、本質的には、参照により全体が本明細書に組み入れられるVan Snick et al. PNAS; 83, :9679 (1986)に記述されているように、7TD1細胞株を用いた細胞に基づく中和バイオアッセイ法によって判定した。7TD1細胞は、融合の3日前に大腸菌(Escherichia coli)リポ多糖類で免疫されたC57BL/6マウス由来の脾臓細胞とのマウス骨髄腫細胞株Sp2/0-Ag14の融合によって形成されたマウスハイブリドーマ細胞株である。7TD1細胞株は、その増殖のためにはIL-6に依存しており、IL-6の除去はアポトーシスによる細胞死につながる。このアッセイ法は、75 pg/mlのヒトIL-6ならびに濃度系列の精製133E5、133A9、133H2、111B1、104C1、129D3、68F2、61H7、B-E8、GL18LB、CNTO136およびhu1Uを用いて行われた。手短に言えば、マイクロタイタープレートの中にIL-6 (75 pg/mlの終濃度)を加える(200 ulの終容量)前にRPMI1640培地+10%FCSの中で2〜4時間7TD1細胞(7.10E3)をインキュベートした。細胞を37Cで3日インキュベートした後に、PBSで洗浄し、4時間、基質溶液(p-ニトロフェニル-N-アセチル-β-D-グルコサミニド(Sigma N-9376); 0.05 Mクエン酸Na pH 5中7.5 mMの基質; 0.25体積%のトライトンX-100) 60 ulを加えた。酵素反応を停止溶液(100 mMグリシン + 10 mM EDTA pH 10.4) 90 ulで停止させて、405 nmでのODを測定した。この結果(表24に示されている)は、全てのクローンがこのアッセイ法において、1 pM未満のIC50で、高い有効性を有することを実証している。
実施例8 卵巣上皮がんマウス異種移植片アッセイ法
マウス異種移植片モデルを用いてクローン129D3のインビボでの有効性を判定した。IGROV-1上皮細胞(5×106個)をヌードマウスへ皮下注射した。3日後、マウスに4または20 mg/kgの投与量で、週2回、129D3またはCNT0328を投与した。1群当たりのマウスは5匹および対照群ではマウス10匹とした。各試験群におけるマウスの生存率(%)を毎週判定し、その結果を生存曲線としてプロットした。この結果(図2に示されている)は、129D3が、ベンチマークのCNT0328 IL-6抗体よりも優れたインビボでの有効性を示すことを実証している。
実施例9 免疫原性分析
本発明のIL-6抗体のVHおよびVL領域を、潜在的な免疫原性配列(例えば、TH-エピトープとしても公知である、推定上のHLAクラスII制限エピトープ)の存在についてスコア化し、Epibase(登録商標)プロファイリング法を用いて種々の市販の参照基準抗体に対する免疫原性スコアと比較した。
18種のDRB1、6種のDRB3/4/5、13種のDQおよび5種のDP、すなわち全部で42種のHLAクラスII受容体についてアロタイプレベルでプロファイリングを行った。DQおよびDPエピトープの強度の結合剤だけでなく、DRB1、DRB3/4/5の強度かつ中度の結合剤も特定された。エピトープカウンティングは、強親和性および中親和性のDRB1結合剤について別々に行われた。同じ群の複数のアロタイプへのペプチドの結合は、1つとしてカウントされた。最悪の場合の免疫原性リスクを現す近似スコアは、次のように算出された: スコア = Σ (エピトープカウント×アロタイプ頻度)。
言い換えれば、特定のHLAアロタイプに影響を与えるエピトープの数に、影響を受けたアロタイプの対立遺伝子頻度を乗じる。所与の配列に対し、その産物を、白人人口の2%またはそれ以上に存在する、本試験において用いられた全てのDRB1アロタイプについて合計した。
本発明のIL-6抗体および代表的な参照基準抗体に対するDRB1スコアは、図9に示されている。全DRB1スコアは各抗体に対するVHおよびVLスコアの混成であった。低スコアから抗体に対する低免疫原性が示唆される。したがって、図9は、本発明のIL-6抗体がベンチマークのIL-6抗体ならびに他の市販の抗体(例えば、ヒュミラおよびレミケード)に等しいか、またはそれよりも低い免疫原性であることを実証している。
実施例10 製造性
生殖細胞系列化型の68F2のVHおよびVLを、完全長IgG1抗体の一過性発現のために、pUPE重鎖および軽鎖発現ベクターに再びクローニングした。HEK293E細胞における一過性発現の後、IgG1抗体をプロテインAで精製し、OD280の測定によって定量化した。下記表19は、68F2親抗体のレベルとともに、生殖細胞系列化された誘導体の産生レベルを要約している。有効性(pM単位の)をまた、各抗体について7TD1に基づく増殖アッセイ法において測定した。
ストリンジェントな条件の下で生殖細胞系列化ライブラリーから全て選択された、変種126A3、127F1、129D3および129F1は、野生型68F2と類似(すなわち0.5〜0.7 pM)の有効性を有することが分かった。さらに、生殖細胞系列化された変種は全て、非常によく、すなわち24〜28 μg/mlで発現した。例外は、9 μg/mlの産生収量を付与した、生殖細胞系列化された変種129F2であった。
実施例11. 安定性分析
完全長ヒトIgG1の形式での生殖細胞系列化型および親型の68F2の熱安定性を調べるために、抗体サンプルを1時間、4、50、55、60、65、70および75℃にて100 μg/ml (PBS中)の濃度でインキュベートした。この後に、サンプルを15分の間25℃へゆっくり冷却し、この温度で2時間維持し、その後、それらを4℃で終夜貯蔵した。(変性した抗体の)沈殿物を除去するための遠心分離の後、溶液中に残存している機能的抗体の濃度を、Biacore (PBS中1/10希釈およびHBSEP中1/10希釈)を用いて測定した。IL-6固定化チップにて注入後に得られた結合曲線の傾きは、機能的抗体の濃度の指標である。
図7Aに示されるように、野生型68F2および生殖細胞系列化されたその誘導体の融解曲線および融解温度は、生殖細胞系列化によって明らかに影響を受けなかった。全く思いがけないことに、融解温度は改善されるように見えた。例えば、129D3は、70℃前後のTmを有し、これは68F2親抗体よりも3℃高い。また、生殖細胞系列変種129D3および親68F2の融解曲線をともに、参照基準抗体GL18およびCNTO136と比較した(図7B参照)。SIMPLE抗体68F2の、およびとりわけ、生殖細胞系列化されたその変種129D3の好ましい熱安定性(70℃のTm)は、CNTO136に対する65℃のTmおよびGL18抗体に対する61℃のTmと比べて顕著であった。驚いたことに、両方の参照基準抗体に適用された広範囲に及ぶ抗体操作(例えば、ヒト化)およびインビトロでの親和性成熟は、その安定性に強く影響を及ぼしたが、インビボで作製されたSIMPLE抗体および生殖細胞系列化による最小限の操作は、極めて良好な熱安定性をもたらした。
完全長ヒトIgG1型の68F2およびその生殖細胞系列変種(129D3) (およびSIMPLE (商標)抗体リード61H7に由来する生殖細胞系列化された変種103A1)の血清中安定性を、参照基準抗体のそれと比較した。ヒト血清中37℃でのインキュベーションの後、機能的濃度の抗体を1、2、4、8、12、16、24、32および56週目の時点で測定し、予め分取された標準物質と比較した。図8に図示しているように、本発明の抗体に対する血清中安定性は、その参照基準抗体に都合よく匹敵していた。
実施例12. CMC最適化
いくつかの残基またはモチーフは、抗体のCMC品質の製造には推奨されない。それらの中には、抗体のCDRループにおけるメチオニンの存在がある。メチオニンを酸化し、親和性、有効性、および安定性のような特性が改変されている化学的に改変された抗体変種をもたらすことができる。したがって、111A7 (および61H7のその、生殖細胞系列化された変種)のCDR3に存在するメチオニンをアラニン(111A7MA)、ロイシン(111A7ML)またはセリン(111A7MS)に変異させた。その結果得られたCMC最適化配列は、下記表20に示されている。表21に示されるように、メチオニン残基の変異は、IL-6への結合にほとんど影響を及ぼさない。
実施例13. クローン129D3およびそのFc変異体のカニクイザルにおける薬物動態(PK)研究
さまざまなIgG1分子として形式化された抗体クローン129D3の薬物動態分析を行った。以下の抗体を分析した: 野生型IgG1 129D3 (129D3-野生型)、Fc領域の中に変異M252Y/S254T/T256Eを有するIgG1 129D3 (129D3-YTE)、ならびにFc領域の中に変異H433KおよびN434Fを有するIgG1 129D3 (129D3-HN)。
カニクイザル(試験抗体当たり3頭)に単回5 mg/kg用量の129D3-野生型、129D3-YTE、または129D3-HNを静脈内注射した。サンプルを異なる時点で採取し、ELISAによりmAbの血漿濃度について試験した。具体的には、マイクロタイタープレート(Maxisorb Nunc)を4Cにて終夜PBS中1 ug/mlのIL-6 (Immunotools)でコーティングした。プレートをPBS-Tweenで2回洗浄し、PBS-1%カゼイン300 μlで2時間ブロッキングした。PBS-Tweenによる2回の洗浄後、サンプルを適用した。全ての希釈液は1%のプールブランク血漿中で作製された(これは未処置のカニクイザル3頭由来のプールであり、4.2章を参照されたい)。サンプルをRTで2時間結合させた。プレートをその後、PBS-Tweenで5回洗浄し、ヤギビオチン化抗ヒトIgG重鎖および軽鎖サル吸着ポリクローナル抗体を1000倍希釈で適用し(Bethyl, catno: A80-319B)、RTで1時間結合させた。プレートをPBS-Tweenで5回洗浄した後に、HRPを結合させたストレプトアビジン(Jackson Immunoresearch 016-030-084)を300,000倍希釈で適用し、RTで1時間結合させた。プレートをその後、PBS-Tweenで5回洗浄し、TMB (calbiochem CL07)-s(HS)TMB weakener (SDT, #sTMB-W)の1:1混合物を加えた。染色を10分間進行させ、その後、0.5 M H2SO4で停止させ、その後に光学密度を450 nmで測定した。サンプルを4回分析し、129D3-野生型 (動物に注射された同じバッチ由来)を標準曲線に用いた。
非区画分析に関連するPKパラメータを下記表22に示す。異なる129D3 IgG1抗体に対する薬物動態プロファイルを、図12に図示する(示した結果は、サル群の平均の結果である)。このデータは、129D3-YTEおよび129D3-HNが129D3-野生型親抗体よりも長い平均滞留時間(MRT)を有することを明らかに示している。さらに、129D3-YTEおよび129D3-HNは129D3-野生型と比べて遅い排出速度、したがって実質的に延長された半減期を有する。
興味深いことに、両抗体は野生型IgG1 Fc領域を含むが、129D3-野生型の半減期は、US201200344212に記述されているMedlmmune抗IL-6 IgG1抗体(GL18)の半減期よりも顕著に長い。具体的には、129D3-野生型は抗体GL18に対する約8.5日と比べて約15.6日の半減期を有する。したがって、本発明の抗体の、延長された半減期は、その各Fab領域の特性によるものであると考えられる。
実施例14. 血清アミロイドA (SAA)マウスモデル
クローン68F2および61H7のインビボでの効果を、注射されたIL-6に応じた血清アミロイドA (SAA)の誘導をブロックするこれらの抗体の能力を測定することによってさらに調べた。このアッセイ法を行うための一般的な方法は、参照により全体が本明細書に組み入れられるWO2006/119115A2に記載されている。具体的には、Balb/cマウスに68F2、61H7、ベンチマーク抗体GL18、もしくはCNTO136、または塩溶液(対照)を静脈内注射した。抗体の投与から4時間後、マウスにIL-6 0.1 ugを注射した。さらに16時間後、血液をマウスから採取し、血清アミロイドAの濃度をELISAによって判定した。実験群、投与量および結果は本明細書の、表26に記載されている。また、用量反応は図13にグラフにより図示されている。この結果は、抗体クローン68F2および61H7が高い効果のベンチマーク対照GL18およびCNTO136に少なくとも等しいインビボでの効果を有することを示す。
実施例15. ヒト化マウス乾癬異種移植片モデル
マウス異種移植片モデルを用いて、誘導された乾癬性病変の発達に及ぼすクローン68F2の予防的効果を評価した。具体的には、BNXマウスに、乾癬患者から得た非病変部皮膚由来の直径5 mmの全層皮膚生検を移植した(マウス1匹あたり1つ)。3週後、移植片に0.5×106個の活性化PBMCを注射した。クローン68F2、抗TNF抗体(レミケード)、またはジプロピオン酸ベタメタゾン(陽性対照)によるマウスの処置は、活性化細胞を移植片に注射する1日前に開始した。処置群および処置計画の詳細は、表25に示されている。
光学顕微鏡検査によって測定される、表皮索の厚さにより処置の効果を判定した。群間の有意差を、分散分析(ANOVA)、引き続き事後最小二乗法差(LSD)検定を用い統計的に分析して、処置群間の統計的有意差を確立した。p<0.05の値は、群間の有意差を意味した。
これらの実験の結果は本明細書の、図14に記載されている。対照群(群2)の表皮索の厚さは、156 μm±4 (平均±標準誤差)であった。ベタメタゾンによる処置(群1、n=3)は、表皮索の厚さを83 μm±13に大幅に低減した(p<0.05) (図12および13)。レミケード処置群(群3)の平均の表皮索の厚さは、125 μm±12であり、68F2処置群(群4)では125 μm±12であった。これらのデータは、ヒト化マウス乾癬モデルにおいてクローン68F2が抗TNF抗体レミケードと同じくらい効果的であることを示す。
実施例16. 腎細胞がんマウス異種移植片モデル
クローン68F2のインビボでの効果を腎細胞がんマウス異種移植片モデルにおいて調べた。このアッセイ法を行うための一般的な方法は、参照により全体が本明細書に組み入れられるWO2008/144763に記載されている。手短に言えば、RXF393細胞(2×106個)をヌードマウスの両側面に皮下注射した。抗体投与の前に、腫瘍を50〜300 mm3の体積に成長させた。注射されたマウスの90%が腫瘍を発症した。マウス40匹をマウス8匹の5群に分けた。各群にPBS (対照)または特定用量のクローン68F2 (1、3、10もしくは30 mg/kg)のいずれかの腹腔内注射を受けさせた。腫瘍サイズおよび生存を週2回モニターした。
本明細書の図15に記載されている生存データは、68F2が対照と比べてマウスの死亡の遅延で有効であることを示す。具体的には、観察された生存期間中央値は、PBS群の場合15.5日、1 mg/kg、3 mg/kgおよび30 mg/kg 68F2群の場合21日、ならびに10 mg/kg 68F2群の場合27.5日であった。本明細書の図18に記載されている生存データは、3 mg/kgで投薬された129D3および111A7が対照と比べてマウスの死亡の遅延で有効であることを示す。本明細書の図16に記載されている腫瘍成長速度データは、クローン68F2が用量依存的な形で、腫瘍成長の阻害で有効であり、10 mg/kgの用量で効果が飽和することを示す。本明細書の図17に記載されている腫瘍成長速度データは、クローン129D3および111A7SDMA>Aが3 mg/kgで投薬された場合に腫瘍成長の阻害で有効であることを示す。
さらなる表
（表１３）例示的な抗IL-6中和FabのVHおよびVLアミノ酸配列
Figure 2015518857
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（表１４）VHまたはVLシャッフリングにより作製された例示的な抗IL-6中和FabのVHおよびVLアミノ酸配列
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（表１５）Fabクローン61H7の例示的な生殖細胞系列化された変種のVHおよびVLアミノ酸配列
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（表１６）Fabクローン68F2の例示的な生殖細胞系列化された変種のVHおよびVLアミノ酸配列
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（表１７）Fab 129D3の配列変種 そのCDRアミノ酸配列およびCDRコンセンサス配列
Figure 2015518857
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（表１８）Fab 111A7の配列変種 そのCDRアミノ酸配列およびCDRコンセンサス配列
Figure 2015518857
（表１９）生殖細胞系列化された68F2変種の産生レベルおよび有効性(pM)
Figure 2015518857
（表２０）Fab 111A7のCMC最適化された配列変種
Figure 2015518857
（表２１）Fab 111A7のCMC最適化された配列変種のIL-6結合反応速度
Figure 2015518857
（表２２）カニクイザルへの単回静脈内投与後の抗IL-6 mAbの非区画PK分析
Figure 2015518857
MRT = 平均滞留時間; k = 平均排出速度定数; t1/2 = 排出半減期; Cl = 排出クリアランス。
（表２３）B9細胞を用いたインビトロでのIL-6中和アッセイ法
Figure 2015518857
（表２４）7TD1細胞を用いたインビトロでのIL-6中和アッセイ法
Figure 2015518857
（表２５）乾癬異種移植片モデルにおいて用いられた群および処置計画
Figure 2015518857
（表２６）SAAマウスモデルにおけるインビボでのIL-6中和
Figure 2015518857

Claims (25)

  1. IL-6に特異的に結合し、少なくとも1つの抗体CDRを含む結合分子であって、該CDRが少なくとも1つのアミノ酸残基を含み、該結合分子がIL-6に結合すると該アミノ酸残基がIL-6上のF229空隙またはF279空隙に埋め込まれる、結合分子。
  2. Kabatによる位置番号30のアミノ酸を有するVLドメインを含み、前記結合分子がIL-6に結合すると該アミノ酸がIL-6上のF229空隙に埋め込まれる、請求項1に記載の結合分子。
  3. 前記位置番号30のアミノ酸がチロシンである、請求項2に記載の結合分子。
  4. Kabatによる位置番号99のアミノ酸を有するVHドメインを含み、前記結合分子がIL-6に結合すると該アミノ酸がIL-6上のF279空隙に埋め込まれる、前記請求項のいずれか一項に記載の結合分子。
  5. 前記位置番号99のアミノ酸がバリンである、請求項4に記載の結合分子。
  6. 抗体またはその抗原結合断片である、前記請求項のいずれか一項に記載の結合分子。
  7. SEQ ID NO:497〜500、543、544、566、567、および568からなる群より選択されるHCDR3アミノ酸配列を含むVHドメインを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の結合分子。
  8. 前記VHが、SEQ ID NO:501〜507および545〜554からなる群より選択されるHCDR2アミノ酸配列をさらに含む、請求項7に記載の結合分子。
  9. 前記VHが、SEQ ID NO:508〜512および555〜562からなる群より選択されるHCDR1アミノ酸配列をさらに含む、請求項7または8に記載の結合分子。
  10. SEQ ID NO:513〜524および563からなる群より選択されるLCDR3アミノ酸配列を含むVLドメインをさらに含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載の結合分子。
  11. 前記VLドメインが、SEQ ID NO:525〜535および564からなる群より選択されるLCDR2アミノ酸配列をさらに含む、請求項10に記載の結合分子。
  12. 前記VLドメインが、SEQ ID NO:536〜542および565からなる群より選択されるLCDR1アミノ酸配列をさらに含む、請求項10または11に記載の結合分子。
  13. SEQ ID NO:1〜232および569〜571からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するVHドメインを含む、請求項6に記載の結合分子。
  14. SEQ ID NO:233〜496からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するVLドメインを含む、請求項6に記載の結合分子。
  15. SEQ ID NO:1〜232および569〜571からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するVHドメイン; ならびにSEQ ID NO:233〜496からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するVLドメインを含む、請求項6に記載の結合分子。
  16. VHドメインおよびVLドメインを含み、該VHドメインが超可変ループH1、H2、およびH3を含み、VHドメインポリペプチドが、超可変ループL1、L2、およびL3を含むVLドメインと対合し、超可変ループH1〜H3およびL1〜L3の少なくとも1つが、IL-6抗原によるラマ(Lama)種の能動免疫によって該ラマ種の通常型抗体から得られる、前記請求項のいずれか一項に記載の結合分子。
  17. (a) 前記超可変ループH1、H2、L1、L2、およびL3の少なくとも1つが、ヒト抗体において存在するH1、H2、L1、L2、もしくはL3超可変ループの対応するカノニカル折り畳み構造と同一もしくは実質的に同一である予測されたもしくは実際のカノニカル折り畳み構造を示し;
    (b) 超可変ループH1およびH2がそれぞれ、対応するヒトカノニカル折り畳み構造と同一もしくは実質的に同一である予測されたもしくは実際のカノニカル折り畳み構造を示し;
    (c) 超可変ループL1、L2、およびL3がそれぞれ、該対応するヒトカノニカル折り畳み構造と同一もしくは実質的に同一である予測されたもしくは実際のカノニカル折り畳み構造を示し;
    (d) 超可変ループH1およびH2が、ヒト生殖細胞系列VHドメインに存在することが公知であるカノニカル折り畳み構造の対応する組み合わせと同一もしくは実質的に同一である予測されたもしくは実際のカノニカル折り畳み構造の組み合わせを形成し;
    (e) 超可変ループH1およびH2が、1-1、1-2、1-3、1-4、1-6、2-1、3-1、および3-5からなる群より選択されるヒトカノニカル折り畳み構造の組み合わせに対応するカノニカル折り畳み構造の組み合わせを形成し;
    (f) 超可変ループL1およびL2が、ヒト生殖細胞系列VLドメインに存在することが公知であるカノニカル折り畳み構造の対応する組み合わせと同一もしくは実質的に同一である予測されたもしくは実際のカノニカル折り畳み構造の組み合わせを形成し;
    (g) 超可変ループL1およびL2が、11-7、13-7(A、B、C)、14-7 (A、B)、12-11、14-11、12-12、2-1、3-1、4-1、および6-1からなる群より選択されるヒトカノニカル折り畳み構造の組み合わせに対応するカノニカル折り畳み構造の組み合わせを形成し;
    (h) 超可変ループH1およびH2が、ヒト1ACY抗体構造に見出されるヒトカノニカル折り畳み構造の3-1の組み合わせに対応するカノニカル折り畳み構造の組み合わせを形成し;
    (i) 超可変ループL1およびL2が、ヒト3MUG抗体構造に見出されるヒトカノニカル折り畳み構造の6λ-1の組み合わせに対応するカノニカル折り畳み構造の組み合わせを形成し; かつ/または
    (j) 超可変ループL1、L2、およびL3が、該ヒト3MUG抗体構造に見出されるヒトカノニカル折り畳み構造の6λ-1-5の組み合わせに対応するカノニカル折り畳み構造の組み合わせを形成する、
    請求項16に記載の結合分子。
  18. (a) IL-6受容体へのIL-6の結合を阻害するか;
    (b) IL-6受容体へのgp130の結合を阻害するか;
    (c) ヒトおよびカニクイザル(cynomolgus monkey) IL-6に特異的に結合するか;
    (d) IL-6に特異的に結合するラクダ科動物抗体由来の少なくとも1つのCDRを含むか;
    (e) 約10.0未満のEpiBase(登録商標)スコアを特徴とするか;
    (f) HEK293細胞において一過性発現により少なくとも20 mg/mlで発現されるか;
    (g) 65℃超の融解温度(Tm)を示すか;
    (h) 0.1 pM未満のIC50でB9ハイブリドーマ細胞のIL-6誘導性増殖を阻害するか;
    (i) 2×10-5 s-1未満のオフ速度(表面プラズモン共鳴によって測定されたkオフ)でヒトIL-6に結合するか;
    (j)ラクダ科動物親抗体よりも高い融解温度を有する、該ラクダ科動物親抗体の生殖細胞系列化された変種であるか;
    (k) その後の親和性成熟なしの前記ラマの通常型抗体由来の少なくとも1つのCDRを含むか;
    (l) 天然のIgG1 Fcの形式でカニクイザルへ静脈内投与された場合に、少なくとも9日、好ましくは少なくとも15日の血清中半減期を有するか; あるいは
    (m) 親結合分子の生殖細胞系列化された変種であり、該結合分子がVHドメインおよびVLドメインを含み、かつ該結合分子の該VHドメインおよび該VLドメインの一方もしくは両方が、非ヒト親抗体の対応するVHドメインおよびVLドメインと比べてフレームワーク領域にわたり合計1〜10個のアミノ酸置換を含み; かつ/またはVHドメインおよびVLドメインを含み、該結合分子の該VHドメインもしくは該VLドメインの一方もしくは両方が、フレームワーク領域FR1、FR2、FR3、およびFR4にわたって1つまたは複数の対応するヒトVHドメインまたはVLドメインとの90%またはそれ以上の配列同一性を示す、
    前記請求項のいずれか一項に記載の結合分子。
  19. SEQ ID NO:1〜232および569〜571からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するVHドメインを含み、少なくとも1つのグルタミンがグルタミン酸に変更されている、前記請求項のいずれか一項に記載の結合分子。
  20. 二重変異H433K/N434Fを有するヒトFcドメインを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の結合分子。
  21. 前記請求項のいずれか一項に記載の結合分子および1つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
  22. IL-6関連疾患またはIL-6関連障害を処置する方法であって、その処置を必要とする対象に、請求項21に記載の薬学的組成物の有効量を投与する段階を含む、方法。
  23. 前記請求項のいずれか一項に記載の結合分子をコードする、単離された核酸。
  24. 請求項23に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
  25. 請求項24に記載の組換え発現ベクターを含む、宿主細胞。
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