JP2015510398A - 植物インフィルトレーション装置 - Google Patents

Abstract

植物を接種物でインフィルトレーションさせる植物インフィルトレーション装置及びこれを使用する方法が提供され、本装置は、インフィルトレーションされる植物の少なくとも１つのトレイを受け取るようになっている１つ又はそれ以上のトレイラックを有するフレームと、フレームに取り付けられ、装置内で植物トレイを移動させるように作動可能な自動化された操作機構と、フレームに取り付けられ、１つ又はそれ以上の接種物流体を収容する複数の接種物リザーバと、フレームに取り付けられ、植物トレイがインフィルトレーション位置に配置された場合に収容されるインフィルトレーションタンクと、インフィルトレーションタンクに負圧を加えて、インフィルトレーションタンク内で接種物に浸漬された植物の葉の気孔を開いて、接種物流体を植物の葉にインフィルトレーションする、インフィルトレーションタンクと連通した真空発生装置を備える。【選択図】 図３

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１２年２月１５日出願の米国特許仮出願番号６１／５９９，０９４の優先権を主張するものであり、その開示内容全体は、引用により本明細書に組み入れられる。

本発明は、一般に、植物を操作してインフィルトレーション（infiltration）させる装置及び方法に関し、詳細には、組換えタンパク質を産生するために使用される自動化された高生産性の植物のインフィルトレーションのための装置及び方法に関する。

植物源を使用した新しい治療薬の産生に対する関心が復活している。現在、哺乳類抗体、血液製剤代用品、ワクチン、ホルモン類、サイトカイン、及び様々な他の治療薬を含む、薬理活性タンパク質を産生するために遺伝子組換え植物を使用することができる。医薬の植物産生は、大きな潜在性を有し、ワクチンなどの様々な新しい生物薬剤製品の重要な製造システムとなり得る。

例えば、現在のインフルエンザワクチンは、受精卵で産生され、受精卵は、適切な産生システムを使用してウイルスを採取して精製できる前に、感染させて長期間にわたって培養する必要がある。また、昆虫又は哺乳類の細胞におけるワクチン産生には、細胞が十分な量のウイルスを分泌するのに必要な培養期間が必要である。それらのシステムのいずれかに導入可能となる前に、標的ウイルス（弱毒化ウイルス又はサブユニットウイルスとして）に行なう必要がある適応と組み合わせた場合、浮上する脅威に応じた最新の候補ワクチン産生方法は、細胞培養又は卵培養に関連した高いコストを有するだけではなく、長い時間をかかる。

植物は、潜在的に、医薬用組換えタンパク質の産生のための低コストで低汚染の安全な工場である。植物で産生された組換えタンパク質の大部分は、アミノ酸配列、立体配座、及び生物活性に関する限り、哺乳類の組換えタンパク質と区別がつかない。従来、タンパク質は、細胞培養、酵母、バクテリア、又は卵などの複雑な産生システムを使用して産生されてきた。しかしながら、タンパク質を植物で産生できる点は、いくつかの重要な利点を有する。植物は、独自に高収率及び低コストで様々な複雑性レベル及びグリコシル化パターンの効率的なタンパク質の発現が可能である。

遺伝子組換え植物の応用の限界は、多くの場合、低い転写速度、メッセンジャの不適切なスプライシング、異種ｍＲＮＡの不安定性、不良な翻訳速度、内因性プロテアーゼの動作に対する組換えタンパク質の感受性過度、若しくは、不適切で有限の成長又は最悪の場合には宿主生物への激しい悪影響につながる異種タンパク質に対する組換え生物の感受性過度の結果として、トランスジェニック生物が組換え生産物の適当な量を蓄積することができないことに由来するものである。産生レベルの不備は、利益幅が限られる場合、又は残留物質の処理及び／又は処分がバイオセーフティ上の問題又は環境問題を引き起こす場合に、用途の開発に直接的な影響を与える。従って、所望の組換え産物の蓄積レベルの向上が、分子農業の多くの用途の商業化を保証する１つの重要な要素と考えられる。

植物由来のワクチン産生システムは、従来のワクチン開発プロセスに対する実行可能な代替物に相当し、従来の卵由来の又は細胞由来のワクチン産生に関するいくつかの問題点に対するより効率的で長期的な解決策をもたらすことができる。植物は、費用効率が高いタンパク質産生物なので、限定されるものではないがワクチン開発等の商業的用途で使用を目的としたタンパク質の産生に使用すると、このようなタンパク質及び／又はワクチンを開発及び産生するために使用される従来のプロセスに対する現実的な代替物をもたらす。このような植物で産生されたタンパク質の他の使用例としては、工業プロセス用の酵素、治療抗体を挙げることができる。

ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を使用することが、このような植物由来のワクチンの産生法を用いて産生するのにより適していることが分かっている技術として浮上している。一般に、ＶＬＰは、ワクチンの標的とされることが意図された所与の疾患に特異的となる可能性がある、タンパク質又はタンパク質部分がちりばめられた脂質又はタンパク質殻を含む。従って、ＶＬＰは、標的ウイルスのように「見える」ことが意図されており、その結果、ＶＬＰを患者の免疫系が特定することができ、その標的ウイルスに対する免疫がもたらされる。しかしながら、ＶＬＰは、実際のウイルスのコア遺伝物質がないので、非感染性であり複製することができない。このようなＶＬＰ及び／又は他のタンパク質を産生することを目的とした植物の使用は、通常は非常に複雑でコストのかかる細胞培養、酵母、バクテリアなどを必要とする、いくつかの以前に使用された産生プロセスよりも効率的であることが分かっている。

しかしながら、それでもＶＬＰ及び／又はタンパク質の量産のために植物を使用するにはいくつかの課題が残っており、特に、植物のインフィルトレーション及び処理のために以前に使用されたシステムは、比較的面倒でありコスト非効率のままであるのが理由である。従って、産生の効率及びコスト効率、産生されたワクチンの品質管理及び標準化等の観点から、植物由来のワクチン産生を商業的に実行可能にする改良が依然として続いており、

従って、ワクチン開発に向けた候補タンパク質の高生産性プロセス及び組換えタンパク質産生の標準化されたプロセス等の、植物のインフィルトレーションを自動化プロセスで行うことができる改良された装置に対するにニーズがある。

従って、試験用ワクチンの候補抗原を担持するＶＬＰを含む、多数の組換えタンパク質の産生を可能にすることにより、ワクチン抗原などの治療用化合物の発見及び開発の加速を可能にする高生産性の植物由来の組換えタンパク質産生システムを開発した。本明細書で説明するシステムは、例えば、植物のＶＬＰに対する多くの抗原戦略の提示を可能にするので、ＶＬＰを植物から精製して、病原体に対して最も効率的なＶＬＰ由来のワクチンを特定するために試験を行うことができる。本システムは、植物由来の産生方法を使用する新しいワクチンの発見及び開発の迅速かつ低コストの産生システムをもたらす。

本発明の１つの態様によれば、植物を接種物でインフィルトレーションさせる植物インフィルトレーション装置が提供され、本装置は、
インフィルトレーションされる植物の１つ又はそれ以上のトレイを受け取るようになっている１つ又はそれ以上のトレイラックを有するフレームであって、該トレイが、投入ラックに配置された場合に初期位置にある、フレームと、
フレームに取り付けられ、植物トレイを装置内で移動させるように作動可能な自動化された操作機構であって、該操作機構が、少なくとも植物トレイを初期位置からインフィルトレーション位置まで移動させるように作動可能なロボットマニピュレータを有する、自動化された操作機構と、
フレームに取り付けられ、１つ又はそれ以上の接種物を収容する複数の接種物リザーバであって、該接種物リザーバが、流体移送システムと流体流連通でもって相互接続され、該流体移送システムが、接種物リザーバに流入及びそこから流出する流れを制御するように作動可能である、複数の接種物リザーバと、
フレームに取り付けられ、植物トレイがインフィルトレーション位置に配置された場合に収容されるインフィルトレーションタンクであって、流体移送システムが、インフィルトレーションタンクと流体流連通して、インフィルトレーションタンクを接種物リザーバの１つからの選択された接種物で少なくとも部分的に満たし、インフィルトレーション位置に配置された場合に植物トレイの植物の葉を少なくとも部分的に浸漬するようになっており、インフィルトレーションタンクは、植物トレイが前記インフィルトレーション位置に配置された場合に、封止された形態で密閉される、インフィルトレーションタンクと、
インフィルトレーションタンクと連通して、封止された形態のインフィルトレーションタンク内に負圧を加え、結果的に、インフィルトレーションタンク内で接種物に浸漬した植物の葉の気孔を開いて接種物が植物の葉にインフィルトレーションするようにする真空発生装置と、を備える。

自動化された植物インフィルトレーション装置を使用して、トレイに配置された植物を接種物でインフィルトレーションする方法であって、
植物トレイを収容可能なインフィルトレーションタンクを備えた植物インフィルトレーション装置を準備する段階であって、少なくとも１つの接種物リザーバが、接種物を収容すると共に独立してインフィルトレーションタンクと流体流連通しており、自動化されたトレイ操作機構がロボットマニピュレータを有する段階と、
植物にインフィルトレーションする接種物リザーバからの接種物をインフィルトレーションタンクに供給する段階と、
ロボットマニピュレータを使用して、植物トレイを装置の装入位置から移動させる段階と、を含み、
植物トレイは、インフィルトレーションするために装置内のインフィルトレーション位置に供給され、植物トレイは、植物の少なくとも葉がインフィルトレーションタンク内で選択された接種物流体に浸漬されるようにインフィルトレーションタンク内に配置され、
本方法は、更に、
植物がインフィルトレーション位置にある状態でインフィルトレーションタンクを密閉及び封止して、封止されたインフィルトレーションタンクに負圧を加える段階と、
所定期間後に、植物トレイをインフィルトレーションタンク内の接種物流体から取り出す段階と、を含む。

本開示の１つの実施形態による植物インフィルトレーション装置の側面斜視図であり、下側外部パネルを取り外した状態で示されており、組換えタンパク質産生のための接種物で植物をインフィルトレーションさせるものである。 図１の植物インフィルトレーション装置の別の斜視図であり、下側外部パネルが所定の位置にある状態で示されている。 図１の植物インフィルトレーション装置の正面斜視図である。 図１の植物インフィルトレーション装置の拡大側面図であり、接種物リザーバが示されている。 図１の植物インフィルトレーション装置の反対側の側面図であり、外部パネルを取り外した状態で示されている。 図１の植物インフィルトレーション装置の部分正面斜視図であり、トレイ投入ラック内の植物トレイの最初のインフィルトレーション前の位置を示す。 植物トレイの拡大正面図であり、操作機構のロボットアームによってトレイ投入ラックから持ち上げられている。 植物トレイの拡大斜視図であり、操作機構のロボットアームにとって装置のインフィルトレーションタンクより上方に向かって移動されている。 インフィルトレーションタンクの拡大斜視図であり、タンク内の植物を接種物溶液でインフィルトレーションするために密封されて封止されている。 植物トレイの拡大斜視図であり、インフィルトレーションタンクから取り出し後、操作機構のロボットアームによってトレイ排出ラック内に水平方向に移動されている。 操作機構のロボットアームの拡大斜視図であり、植物トレイをインフィルトレーションタンクから取り出して排出ラック内へ移動した後の状態である。 図１の植物インフィルトレーション装置の拡大斜視図であり、インフィルトレーションタンクが空にされている。 図１１のインフィルトレーションタンクの上面斜視図であり、洗浄されている。 図１２のインフィルトレーションタンクの側面斜視図であり、タンク排出機構が詳細に示されている。

添付図面全体にわたり、同じ特徴部は同の参照番号によってより特定されることに留意されたい。

前述のように、植物は、潜在的に医薬用組換えタンパク質産生の低コストで低汚染の安全な工場である。アミノ酸配列、コンフォメーション、及び生物活性に関する限り、植物で産生された組換えタンパク質の大部分は、哺乳類の組換えタンパク質と区別がつかない。組換えタンパク質を植物由来の製造方法を利用して開発する場合、植物の操作及びいくつかの可能性のある異なる接種物の１つを迅速に選択して植物にインフィルトレーションさせる能力に関するもの、及びこのような植物由来の組換えタンパク質の産生後に最も望ましい接種物を検査できる及び／又は効率的な試験を行うことができるような、異なる接種物を迅速に適用することができことを含む、現在説明される装置が対処するいくつかの課題が存在する。

従って、本開示の植物インフィルトレーション装置は、例えば、アグロバクテリウムなどバクテリアに組み込まれた関心のある遺伝物質を含む、いくつかの異なる接種物の１つを用いてインフィルトレーションされる植物を迅速かつ効率的に処理することができように開発したものである。本明細書で説明する植物インフィルトレーション装置及び方法は、限定されるものではないがワクチン、ＶＬＰ由来のワクチン、組換え抗体、及び／又は臨床検査薬などの組換えタンパク質の迅速な発現、精製、及び試験を可能し、結果的に、組換えタンパク質の産生及び開発を従来技術に比べて加速することを可能にする高生産性システムである。

特に、ＶＬＰは、卵由来及び細胞由来のワクチン産生技術に優る多くの利点をもつ新規なワクチン技術を提示する。大抵の場合はＶＬＰ由来のワクチンがウイルスの実際のサンプルを必要とせず、遺伝子配列のみを必要とするので、植物で産生されたＶＬＰを使用する何らかの所定のワクチン産生は、他の何らかの従来の方法による産生よりも高速であるが、浮上する脅威に対する最も効率的なワクチンを特定して産生する能力は、この浮上する脅威に対する複数の異なるＶＬＰワクチン候補を試験するために迅速かつ効率的に開発及び産生する能力に左右される。植物由来のＶＬＰの開発及び産生の特に限定的なステップは、インフィルトレーションステップ、即ち、標的ウイルスタンパク質（又は、任意の他のタンパク質）の遺伝情報を含むアグロバクテリウム接種物を植物に導入するステップである。インフィルトレーションは、インフィルトレーションタンク中で実行されるが、インフィルトレーションタンク及び関連器具は、第２の別の接種物を使用する前に全ての接種物を完全に洗浄して清浄化する必要がある。

以下に説明するように、本システムは、複数の異なる接種物製剤を迅速な連続シーケンスで植物に容易に適用できるようにすることで、複数の抗原又は抗原変種の可能性を迅速に検査することを可能にする。従って、本明細書で説明する装置及び方法を使用して多数の標的タンパク質を発現させることができるので、標的タンパク質の有意なライブラリを比較的短期間で構築することができる。次に、これらのうちで最も適切なターゲットを明らかにすること、産生すること、精製すること、及びワクチンの最終使用のために試験することができる。

以下で図１から３を参照すると、特に、組換えタンパク質産生、特にワクチンの開発分野で使用される接種物を用いて植物をインフィルトレーションするように構成された本開示の植物インフィルトレーション装置１０が示されており、全体的には、種々の構成要素が取り付けられるフレーム１２又は他の適切な固定構造体を備える。以下に詳細に説明するように、前端部１３において、本装置は複数の植物トレイ投入ラック１４及び制御パネル１６を含む。制御パネル１６は、少なくとも１つの実施形態において、装置の動作条件を示し、オペレータによる植物インフィルトレーション装置１０の動作の制御を可能にするタッチスクリーンとすることができる画面を含む。従って、制御パネル１６は、制御システム（図示せず）を構成するプログラム可能な論理回路といった適切なマイクロプロセッサ又は他のコンピュータ機器と電気通信可能に接続されており、また、装置１０が独立型ユニットとして独立して作動可能であるようにフレーム１２内に配置される。従って、ユーザは、装置を起動して本明細書で説明する方法で植物を処理するために制御パネルを使用することができ、この処理は、各ステップを個々に起動させること、装置をプログラミングして単独で全てのステップを実行すること、本明細書で説明した全プロセスをループで繰り返すこと、本システムで供給された複数のものから所望の接種物を選択すること、及び１つの接種物から他の接種物への迅速な切り替えを行うことを含む。従って、直列の連続的な植物トレイ上に異なる接種物溶液を迅速に使用することで、複数の候補接種物を用いてインフィルトレーションされた植物の高生産性の試験が可能になる。

また、図１から図３、及び図４で分かるように、装置は、装置１０のフレーム１２の第１の側面上配置された少なくとも１つに接種物リザーバ２０を含み、複数のリザーバ２０が存在する場合、これらの独立した接種物リザーバ２０の各々は、異なる接種物溶液を収容することができ、これらの複数の接種物溶液の任意の１つ又はそれ以上を、本装置１０を使用して処理される植物にインフィルトレーションするために、オペレータが手作業で又は自動的に選択することができるようになっている。もしくは、リザーバ２０の一部又は全ては、多くの植物を同じ接種物でインフィルトレーションする必要がある場合には同じ接種物を収容することができる。接種物リザーバ２０の各々は、図１に図示されている流体移送システム２２を介して装置フレーム１２内に配置されたインフィルトレーションタンク１８に流体連通しているが、流体移送システム２２は、複数の流体導管及び関連の遠隔操作で接種物リザーバ２０の各々又は全てに流入又はこれから流出する流れを独立して制御するように作動可能なバルブを含む。図５に明示するように、インフィルトレーションタンク１８が、フレームの下部の基部に配置される大型の回収タンク１９の上方で、フレーム１２の下部の内部である程度上に向かって配置される。以下に更に詳細に説明するように、インフィルトレーションタンク１８が、枢動軸２９によりフレーム１２に回転可能に取り付けられ、インフィルトレーションタンク１８を反転させることによって使用済みの接種物、及び／又インフィルトレーションステップ中には植物から欠落した葉及び植物材料を下方の回収タンク１９に捨てることができるようになっている。

以下に更に詳細に説明するように、インフィルトレーションタンク１８は、植物トレイ１１の少なくとも１つを収容できるように、詳細には、植物を収容すると同時に接種物リザーバ２０から少なくとも１つの接種物を受け入れることができるように寸法決めすることができ、接種物は、選択された接種物溶液のインフィルトレーションプロセスを実行するために植物に先だってタンク１８に受け入れられる（図２参照）。従って、植物トレイ１１が、少なくとも植物の葉が少なくとも部分的に接種物に浸漬する植物トレイ１１の位置に対応するインフィルトレーション位置において、インフィルトレーションタンク１８の上方又はこのタンク内で配置される場合、接種物は、植物を狙って、流体移送システム２２によって、詳細にはその流体出力配管２５（図４参照）によって接種物リザーバ２０の選択された１つからインフィルトレーションタンク１８に事前に導入又は追加される。例えば、図１の接種物リザーバ２０の上方に位置する流体移送システム２２の上部の配管システムは、一般に、溶液や水をリザーバ２０に導入するために使用される。

以下に図２、図６から図７を詳細に参照すると、装置１０の前端部１３の投入ラック１４が明示されている。植物が処理されることになる投入ラック１４は、例えば、少なくとも２つの支持体１７を含むことができ、支持体は、互いに平行に配置され、反転した植物トレイ１１を支持して植物の茎の自由な滑動を可能にするように、細長い植物トレイ１１の幅よりも狭い距離だけ離間している。２つの平行な支持体１７は、各支持体の間に比較的狭い間隙（例えば、間隙を通って植物の茎にかみ合うには十分に広いが、トレイ11の植物の葉の幅よりは狭い間隙）だけを形成するように僅かな距離だけ相互に離間することができる。以下に更に詳細に説明するように、この狭い間隙により、枢動クランプ部３７のカバーを閉鎖する前に、ロボットアームがラック１４から垂直方向に植物トレイを持ち上げる際に、植物の葉を幾らか収穫することができる。様々な構成が可能であるが、図２、図６、及び図７の示す実施形態において、植物トレイ１１は、逆さまに投入ラック１４に挿入され、植物トレイ１１内の植物の葉１５が下方を向くので、反転された植物トレイ１１によって空中に垂れ下がり、次に、植物トレイ１１は投入ラック１４の支持体１７により支持される。図６及び図７で更に詳細に示すように、植物トレイ１１は、投入ラック１４のレール１７に沿って長手方向に滑動することができる。装置１０の図示の実施形態において、１つの投入ラック１４が設けられており、また、１つの排出ラック２４が設けられており、装置のフレーム１２内の低い高さに配置されている。従って、植物トレイ１１は、装置１０で処理される前にオペレータにより投入ラック１４に挿入され、本明細書で説明するようなプロセスが接種物による植物の葉のインフィルトレーションのために実行されると、植物トレイ１１は、オペレータによる装置１０からの最終的な取り出しのために排出ラック２４上へ移動する。

以下に更に詳細に説明するように、この植物インフィルトレーション装置１０は、フレーム１２に取り付けられ、植物トレイ１１を装置内で移動させるように作動可能な自動化された操作機構３０も含む。操作機構３０は、内部の植物に損傷を与えることなく反転された植物トレイ１１を把持及び解放するように作動可能なロボットマニピュレータ３２（又は、本明細書で以下に呼ぶ「ロボットアーム」３２）を含む。従って、操作機構３０のロボットアーム３２は、例えば、接種物溶液によるインフィルトレーションのために植物トレイ１１を投入ラック１４からインフィルトレーションタンク１８に動かすために、及びその後、処理された植物トレイをインフィルトレーションタンク１８から装置内の排出ラック２４又は他の選択された排出位置まで移動させるように作動可能である。

図４を参照すると、植物インフィルトレーション装置１０のフレーム１２の側面に配置された接種物リザーバ２０が詳細に示されており、例えば、透明な（又は、少なくとも実質的に透明な）管状円柱体２１を含むことができ、オペレータは、装置の作動中に、どの接種物リザーバ２０が接種物溶液を収容しているか、その中にどれだけの量が収容されているかを目視で特定すること、使用後の円柱体の洗浄、及びどれが任意の時間に使用されたかを目視で確認することができる。リザーバ２０の透明管状円柱体２１の各々は、例えば、１つ又はそれ以上の流体入力部２３を有し、該流体入力部は、円筒形リザーバの側壁内に配置することができ、更に接種物溶液を各リザーバ内に供給することができるポンプ圧送システムを含むことができる。もしくは、接種物は、リザーバの上蓋を持ち上げて、入力部２３を経由して（装置１０の内部又は外部の懸濁溶液リザーバから到来する）懸濁溶液をリザーバに追加することにより、リザーバに手作業で追加することができる。また、１つ又は複数の入力部２３により、異なる接種物溶液でのその後の使用のためにリザーバをリンス処理するために、水又は他の洗浄流体をリザーバ２０に導入できる。従って、流体移送システム２２は、各リザーバ円柱体の入力部２３と相互接続し、更に導入される接種物溶液又は懸濁溶液又は洗浄流体の入力供給を可能にするために流体源（図示せず）に接続される、作動バルブ及び管体を含む。従って、洗浄流体を貯蔵リザーバから接種物リザーバ２０の各々にポンプ圧送するか又は他の方法で循環させ、次に洗流体を貯蔵容器又はドレーンに戻すことが可能である。この洗浄プロセスを使用してリザーバ２０の各々、及び関連する配管システム及び弁の全てを洗浄することができる。使用済み洗浄流体をタンク１８に放出することもできるので、同様にリザーバ２０とインフィルトレーションタンク１８との間の配管が洗浄され、以下に更に詳細に説明するように、次に、使用済み洗浄流体は、使用済み接種物溶液と同じ方法でインフィルトレーションタンク１８から該タンクの下の回収タンク１９（図１及び図５を参照）に放出することができる。また、流体移送システム２２は、接種物リザーバ２０の各々の流体出力２５と相互接続される作動バルブも含み、装置１０は、制御パネル１６で操作される制御システムによって、リザーバ２０の任意の１つに収容された接種物溶液を放出してインフィルトレーションタンク１８に供給することができる。例えば、リザーバ２０への又はこれからの流体流を制御する流体移送システム２２のバルブは、任意の適切な形式、例えば、手動バルブ、又は電気信号による制御システム及び／又は別の流体制御によって自動的に操作される遠隔作動バルブとすることができる。インフィルトレーションタンク１８は、リザーバ２０よりも低い高さに位置決めすることができるので、選択されたリザーバ２０からインフィルトレーションタンク１８への接種物溶液の供給は重力だけで行うことができるが、インフィルトレーションタンク１８をリザーバ２０と同じ高さ又はそれよりも高い位置に配置することも可能であり、その場合、流体移送システム２２の流体出力部２５には、接種物溶液を選択されたリザーバ２０からインフィルトレーションタンク１８に加圧状態で導入するように作動可能なポンプ圧送システムを設けることができる。

以下に図５から７を参照すると、植物インフィルトレーション装置１０の操作機構３０は、インフィルトレーションプロセス中に植物トレイ１１を操作及び移動させるために、装置の領域内で移動可能なロボットアーム３２を含む。ロボットマニピュレータの他の構成も可能であるが、図示するような操作機構３０のロボットアーム３２は、図６及び図７に詳細に示すように、植物トレイ１１の外側リム９の真下で滑動するように構成された固定部３５（図６参照）と、枢動クランプ部３７とを含む植物トレイ把持クランプ３４を備え、植物トレイ把持クランプは、特定の１つの実施形態では実質的に透明なプラスチック製カバーを含むことができ、特に葉をよりコンパクトな包みに幾分圧縮して、葉が挿入されるインフィルトレーションタンクの小型化を可能として、結果的に各インフィルトレーションプロセスに必要なインフィルトレーションタンク内で使用される接種物溶液を少なくするために、カバーは、垂れ下がった植物の葉１５を反転されたトレイ11内に実質的に封じ込める。しかしながら、更に、植物の葉を封じ込めるクランプカバーは、装置内での操作中に植物の葉１５を保護し、少なくとも部分的に封じ込めるのを助け、全ての植物の葉がインフィルトレーションタンク１８内に導入されて接種物溶液と接触することを保証する。もしくは、枢動クランプ部３７のカバーの他の構成を使用することができるが、植物の葉を操作中に保護することができることが望ましいので、これらのカバーは、植物を少なくとも部分的に封じ込めて、例えば、移送及び／又は操作中にその周囲に保護エンクロージャを形成することが好ましい。しかしながら、カバーは、プラスチック製で透明である必要はない。それにも関わらず、これらの保護エンクロージャ３７は、内向きに枢動するように作動されるので、植物の葉１５が実質的に封じ込められ、次に、トレイ把持クランプ３４は、トレイ11全体を上方に若干移動させるようにロボットアームによって作動されるので、クランプは、支持トレイラック１４との接触から解放される。もしくは、保護エンクロージャ３７は、当接した場合に保護エンクロージャの閉鎖及び開放をもたらす下方に突出したガイドを含む、他の適切な手段及び／又は作動メカニズムによって作動させることができる。次に、図８に示すように、植物トレイ１１は、インフィルトレーションタンク１８と実質的に位置合わせされた位置に、装置の中心に向かって内向きに長手方向に移動される。

従って、図５から分かるように、ロボットアーム３２により、装置内で少なくとも２つの並進自由度を含む多自由度での植物トレイ１１の移動が可能になる。操作機構３０のロボットアーム３２は、水平搬送装置３６及び垂直搬送装置３８の両方を含むことができ、これは、独立的に作動して相対的に移動可能であり、ロボットアーム３２は少なくとも２つの横方向に位置決めされた直線軸に沿って植物トレイ１１を移動させることができる。従って、ロボットアーム３２は、植物トレイ１１を投入ラック１４の静止位置からインフィルトレーションタンク１８内のインフィルトレーション位置に移動させること、その後、インフィルトレーションタンク１８から排出ラック２４上に移動させることができる。植物トレイ１１の他の操作、例えば、インフィルトレーションタンク内のインフィルトレーションの前後に植物トレイ１１を反転させるために、例えば、ロボットアーム３２及び／又はトレイ把持クランプ部３４の１つ又はそれ以上の軸線を中心とした回転が可能であり、それにより、ロボットアームは、少なくとも１つの回転自由度を可能とする。

図８から分かるように、反転された植物トレイ１１は、植物トレイ１１が投入ラックから十分に離れて、垂直方向にインフィルトレーションタンク１８と実質的に位置合わせされるように、投入ラック１４から装置の内方に十分に水平移動が行われた状態で、ロボットアーム３２によって実質的に垂直方向４０に移動されるように示されている。従って、植物トレイ１１が垂直方向でインフィルトレーションタンク１８と位置合わせされると、水平方向の移動は、ロボットアーム３２の水平搬送装置３６の作動を中止することで停止され、その時点で、垂直方向４０の前記の移動は、上部が開いたインフィルトレーションタンク１８に植物トレイ１１を下げるために垂直搬送装置３８を作動させることによって始まる。別のタンクデザインも可能であるが、図示の実施形態において、インフィルトレーションタンク１８は、全体的に、開放された上部、密閉された側壁及び底部を有する浴槽状の構造体を備えるので、インフィルトレーションタンク１８への植物トレイ１１の移動は、下方への垂直移動によって行われる。しかしながら、インフィルトレーションタンクは、例えば、キャビティ内へのアクセスを可能とする開放された側面を有する別の構成とすることもでき、その場合、植物トレイ１１の移動は、植物トレイをインフィルトレーションタンク１８のキャビティに移動させるように実質的に水平方向となる。

図９及び図１０から分かるように、植物トレイ１１が操作機構３０のロボットアーム３２によってインフィルトレーションタンク１８内に位置決めされると、次に、インフィルトレーションタンク１８は密閉及び封止され、処理されることになる植物の葉は、インフィルトレーションタンク１８の接種物溶液内に浸漬又は少なくとも部分的に浸漬される。以下に説明するように、この植物インフィルトレーション装置１０の図示の実施形態において、本プロセスで加える真空圧に十分耐える方式で閉鎖及び封止することができるインフィルトレーションタンクに関する多くの可能性が存在するが、これは、ロボットアーム３２の移動可能な部分に取り付けられた実質的に平面のタンクカバー４４を利用して実現される。従って、ロボットアーム３２が植物トレイ１１をインフィルトレーションタンク１８内のインフィルトレーション位置に操作した際に、カバー４４は、同時に上部が開いたタンク１８の上部外周リム４６（図１０参照）に対して封止された当接係合状態にされるので、インフィルトレーションタンク１８は封止されて完全に密閉される。外周リム４６及び／又はこれに接触するカバー４４の下側との間に適切なガスケット又は他のシールを設けることができる。更に、ロボットアーム３２の垂直搬送装置３８により制御される場合、下向き方向のタンクカバー４４の垂直移動がカバーとリムとの間の密封嵌合を保証するように、タンクカバー４４は、インフィルトレーションタンク１８の上部リム４６の垂直高さを僅かに超えて移動するように選択される。更に、追加の相互連結又は嵌合位置決め部材を設けて、特にタンクとカバーとの間の相対的な垂直移動の最後の最後で、タンク及びカバーの２つの封止面の間の正確な位置合わせを確実に行うことができる。例えば、この位置合わせ部材は、他方の構成部品の対応する開口に嵌合する、カバー４４及びタンク１８の一方に配置された垂直ピンを含むことができる。従って、位置合わせ部材は、タンク及びカバーの当接する封止面の間のより正確な位置合わせを確保する一助となり、更に、位置合わせ部材は、タンクが真空下に置かれた場合にタンクとカバーとの間の完全な封止を確保するために、これらの当接する封止面が互いに完全に平行状態を維持することを保証する。

インフィルトレーションタンク１８がカバー４４によって密閉されて閉鎖された状態で封止されると、植物インフィルトレーション装置１０全体のインフィルトレーションタンク１８及び流体移送システム及び／又は制御システムに圧力連通する真空発生装置４８（１０図を参照されたい）を用いて、封止タンク１８内に負圧が生成される。他の構成も可能であるが、本実施形態では、真空発生装置４８は、カバー４４の真下に配置されたロボットアームのトレイ把持クランプ３４の一部に一体化され、これはカバー４４がタンク上の封止置で位置決めされた場合、インフィルトレーションタンク１８内で取り囲まれた状態である。従って、真空発生装置４８を使用して、封止されたインフィルトレーションタンク１８内で真空が生成されるので、タンク内で生じる真空によって開いた植物の葉の気孔への接種物溶液のインフィルトレーションが向上する。

植物は、接種物溶液が植物の気孔にインフィルトレーションするのを良好に可能にするように予め定められた所定期間にわたってインフィルトレーションタンク内に維持する。この所定期間の後に、タンク内で生じた真空は、タンク内の圧力を例えば大気で均一にすることによって放出し、その時点で、以下で説明するように、植物トレイを接種物溶液及びタンクから取り出す。

図１０から分かるように、植物への接種物溶液のインフィルトレーションがインフィルトレーションタンク１８内で完了すると、カバー４４をタンク１８から取り外し、タンク内の植物を露出させてタンク内の植物へのアクセスを可能にし、ロボットアーム３２を装置１０の制御システムによって作動させて、この時点では開放状態であるインフィルトレーションタンク１８から植物トレイ１１を上向きに引き上げて植物の葉１５を接種物溶液から取り出すようになっている。本装置１０の図示の実施形態において、図１０から分かるように、カバー４４は、ロボットアーム３２の一部を構成するか、又はロボットアーム３２に取り付けられるので、ロボットアーム３２の上向きの動きは、同時に、カバー４４をタンク１８から取り外すように作用する。しかしながら、代替的に、カバーは、ロボットアームの一部を構成するか又はロボットアームに直接に結合される必要はなく、その場合、カバーは、ロボットアームが植物トレイ１１を開放状態のインフィルトレーションタンク１８から上方に引き上げるように作動できる前に、ロボットアームによって又は他の方法で、最初に取り外す必要がある。次に、植物トレイ１１を取り出すために、例えば、植物トレイ１１を、装置の前端部１３に配置される排出ラック２４に向けて装置１０の中心部から外方の方向４２に水平に移動させるように操作する。図示の装置は、投入ラック１４とは異なるが、やはり植物トレイ１１が垂れ下がることを可能にすると共に、例えば、装置フレーム内において垂直方向で低い高さに位置決めできる、１つ又はそれ以上の別個の排出ラック２４を含むが、代替的に植物トレイを投入及び排出するために単一のラックを使用できる可能性がある。しかしながら、少なくとも１つの投入ラック及び少なくとも１つの排出ラックを、又は代替的にやはり各々の複数のものを設けることで、本装置１０を使用してより高容量及び／又は高生産性の植物トレイ１１を処理することができる。

以下に図１１を参照すると、植物トレイが排出ラック２４に下ろされると、把持クランプ３４は枢動クランプ部３７の外向きの枢動によって解放され、植物トレイ１１は排出ラック２４上で吊り下げたままとなり、その時点で、ロボットアーム３２は、トレイ把持クランプ３４を装置の中心に向かって後ろに動かす。可能性のある１つの実施形態において、投入ラック及び排出ラック１４、２４をその内部でロボットアームが作動する装置１０の中央部から分離するために、スライディングドア２８を設けることができ、例えば、装置が植物トレイ１１をインフィルトレーションタンク１８に導入するか又は取り出す際には開き、植物トレイ１１のインフィルトレーション及び移動時には閉じる。装置の投入ラック／排出ラック及び主要インフィルトレーション領域を分離するこれらのドア２８は、単純に、投入ラック及び／又は排出ラックに吊り下げられた場合の植物の汚染を防止すること、及びこれらのラック内に位置決めされた場合の植物トレイの望ましくない移動を防止することを助ける。また、これは投入ラック１４が排出ラック２４の上方に位置決めされるのを助け、接種物が排出ラック２４に向かって案内されるトレイ11から落ちることによって投入ラック１４の各部分を汚染しないようになっている。更に、単に安全性の観点から、ドア２８を閉鎖すると、装置のオペレータがアクセスされる装填及び排出ステーション（投入ラック及び排出ラックを備える）をロボットアーム３０及び自動操作機構３０の他の可動部品から隔離するように機能する。

所定の植物トレイ１１のインフィルトレーションプロセスが完了すると、図１２に示すように、ロボットアーム３２のトレイ把持クランプ３４は装置内で上方に移動して静止位置になり、次に処理される植物トレイに対する準備が整う。ここで、同じ接種物を別の植物に使用することが望ましい場合を除き、最後に処理した植物トレイに使用した接種物流体を依然として収容するインフィルトレーションタンク１８を空にすることができる。可能性のある別の１つの実施形態において、タンクは、重力又は真空アシストを利用して作動可能な底部のドレーンを使用して空にすることができる。しかしながら、インフィルトレーションタンク１８に落下した可能性のある葉も排出できることが望ましいので、少なくとも図示の実施形態において（図５及び図１２から図１４を参照されたい）、インフィルトレーションタンク１８は装置のフレーム１２に回転可能に取り付けられ、作動時、インフィルトレーションタンク１８は、接種物溶液及びこの溶液に入っている離脱した何らかの葉をインフィルトレーションタンクからインフィルトレーションタンク１８の下に配置された回収タンク１９又は適切なドレーンに排出することを可能にするために、例えば、長手軸を規定する枢動軸２９の周りで回転させることによって少なくともある程度反転させることができる。前述のように、例えば、インフィルトレーションタンク１８に直接ドレーンを設けることによって別の解決手法及び／又は放出機構が可能であるが、ドレーンは、必要に応じて開閉することができるので、インフィルトレーションタンクの溶液を必要な場合に空にすることができるが、他の期間では封止状態にすることが可能である。

図１３及び図１４から分かるように、インフィルトレーションタンク１８が空になると、次の使用に向けてインフィルトレーションタンクを洗浄できることが必要なのでタンク洗浄システム５０が設けられており、タンク洗浄システム５０は、タンク内面をリンス処理して洗浄することを可能にするように水及び／又は別のリンス処理流体をインフィルトレーションタンク１８に注入するように作動可能な複数のノズル５２を含む。次に、この水又は代替的なリンス処理流体は、タンクを反転させて洗浄溶液又は水を下にある回収タンク１９に放出するためにタンクを軸線の周りで回転させることによって、前述の方法で空にすることができる。

前述の各ステップは、実行されるプログラム可能な動作に従って、植物インフィルトレーション装置１０によって自動的に実行される。制御パネル１６で作動される制御システムを使用して、オペレータによって全てを個別に制御できるので、本装置１０を使用して、植物に施される各インフィルトレーションプロセスを正確に制御することができる。例えば、接種物溶液の所定容積を選択して関連のリザーバ２０からインフィルトレーションタンクへ注入することができる。同様に、オペレータはリザーバ２０の別個のザーバ内に収容された複数の異なる接種物溶液のいずれか１つを選択することができ、別の複数の接種物溶液を異なる植物トレイ上に迅速に使用することができる。この全てによって、迅速かつ連続して異なる植物への候補ワクチン、ＶＬＰ由来のワクチン、組換え抗体又は臨床検査薬等の、異なる組換えタンパク質に関する多数の可能性のある接種物溶液を、迅速かつ効率的にインフィルトレーションすることは可能になるので、例えば、産生されたワクチン候補の最終的な更なる高生産性の検査のための、組換えタンパク質接種物の高生産性の検査が可能になる。また、本明細書で説明する装置及び方法は、同じ接種物で複数の植物のインフィルトレーションが可能になり、より標準化された多数の組換えタンパク質を取得するようになっており、結果的に、候補ワクチン接種物の高生産性な検査が可能になる。

前記の説明は、例示的であることが意図されており、当業者は、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲から逸脱することなく、説明した実施形態の変更を行い得ることを理解できるはずである、請求項で定義された本発明の範囲にある他の変更は、本開示踏まえて、当業者には明らかとなるはずである。

１２ フレーム
２２ 流体移送システム
２０ 接種物リザーバ
１０ 植物インフィルトレーション装置
１４ 植物トレイ投入ラック
１６ 操作パネル

Claims (28)

1. 植物を接種物でインフィルトレーションするための植物インフィルトレーション装置において、
   インフィルトレーションされる前記植物の１つ又はそれ以上のトレイを受け取るようになっている１つ又はそれ以上のトレイラックを有するフレームであって、該トレイが、投入ラックに配置された場合に初期位置にある、フレームと、
   前記フレームに取り付けられ、前記植物トレイを前記装置内で移動させるように作動可能な自動化された操作機構であって、該操作機構が、少なくとも前記植物トレイを前記初期位置からインフィルトレーション位置まで移動させるように作動可能なロボットマニピュレータを有する、自動化された操作機構と、
   前記フレームに取り付けられ、１つ又はそれ以上の接種物を収容する複数の接種物リザーバであって、該接種物リザーバが、流体移送システムと流体流連通でもって相互接続され、該流体移送システムが、前記接種物リザーバに流入及びそこから流出する流れを制御するように作動可能である、複数の接種物リザーバと、
   前記フレームに取り付けられ、前記植物トレイが前記インフィルトレーション位置に配置された場合に収容されるインフィルトレーションタンクであって、前記流体移送システムが、前記インフィルトレーションタンクと流体流連通して、前記インフィルトレーションタンクを前記接種物リザーバの１つからの選択された接種物で少なくとも部分的に満たし、前記インフィルトレーション位置に配置された場合に前記植物トレイの植物の葉を少なくとも部分的に浸漬するようになっており、前記インフィルトレーションタンクは、前記植物トレイが前記インフィルトレーション位置に配置された場合に、封止された形態で密閉される、インフィルトレーションタンクと、
   前記インフィルトレーションタンクと連通して、前記封止された形態の前記インフィルトレーションタンク内に負圧を付与し、その結果、前記インフィルトレーションタンク内で前記接種物に浸漬した前記植物の葉の気孔を開いて前記接種物が前記植物の葉にインフィルトレーションするようにする真空発生装置と、
   を備える、植物インフィルトレーション装置。
2. 前記複数の接種物リザーバは、独立して前記インフィルトレーションタンクと流体流連通した状態で配置され、独立して制御される、請求項１に記載の植物インフィルトレーション装置。
3. 前記接種物リザーバは、前記接種物リザーバの流体内容物の少なくとも１つの特徴を視覚的に見せる実質的に透明の管状円柱体を含む、請求項１又は２に記載の植物インフィルトレーション装置。
4. 前記少なくとも１つの特徴は、前記接種物の存在、各接種物リザーバ内に残存する接種物の全容積、及び前記接種物の色を含む、請求項３に記載の植物インフィルトレーション装置。
5. 前記インフィルトレーションタンクの外周リムに密封当接するように構成された移動可能なタンクカバー更に備え、前記植物トレイが前記タンク内で前記インフィルトレーション位置に配置される場合に前記封止された形態で前記インフィルトレーションタンクを密閉する、請求項１から４のいずれかに記載の植物インフィルトレーション装置。
6. 前記タンクカバー及び前記インフィルトレーションタンク上にそれぞれ配置された相互連結部材を更に備え、前記相互連結部材は、相互に嵌合可能に係合して、前記インフィルトレーションタンクの封止面と前記タンクカバーとの間の正確な整合を確保する、請求項５に記載の植物インフィルトレーション装置。
7. 前記相互連結部材は、前記タンクカバー及び前記インフィルトレーションタンクの一方に配置され、前記タンクカバー及びインフィルトレーションタンクの他方の対応する開口に嵌合する垂直ピンを含む、請求項６に記載の植物インフィルトレーション装置。
8. 前記流体移送システムは、前記接種物をポンプ圧送して、前記接種物リザーバに流入させる又は前記接種物リザーバから流出させる遠隔操作式ポンプ圧送システムを含む、請求項１から７のいずれかに記載の植物インフィルトレーション装置。
9. 前記ロボットマニピュレータは、前記植物トレイを把持及び解放して、前記植物インフィルトレーション装置内で前記植物トレイを多自由度で移動させるように作動できる、少なくとも１つの植物トレイ把持クランプを有する遠隔操作可能なロボットアームを含む、請求項１から８のいずれかに記載の植物インフィルトレーション装置。
10. 前記植物トレイ把持クランプは、ぶら下がった前記植物の葉を前記植物トレイ内に実質的に封じ込める延長カバーを有する枢動クランプ部を含む、請求項９に記載の植物インフィルトレーション装置。
11. 前記枢動クランプ部の前記カバーは、実質的に透明のプラスチック製である、請求項１０に記載の植物インフィルトレーション装置。
12. 前記インフィルトレーションタンクは、前記インフィルトレーションタンクを空にするためのドレーンと、前記インフィルトレーションタンクの真下に前記ドレーンと流体連通した状態で配置される回収タンクとを含む、請求項１から１１のいずれかに記載の植物インフィルトレーション装置。
13. 前記インフィルトレーションタンクは、前記フレームに枢動軸によって回転可能に取り付けられ、前記インフィルトレーションタンクは、前記枢動軸の周りで回転させることによって反転され、前記インフィルトレーションタンクの真下に配置された回収タンクに注いで空にする、請求項１から１１のいずれかに記載の植物インフィルトレーション装置。
14. 前記インフィルトレーションタンクは、該インフィルトレーションタンクに流体を注入するように作動可能なタンク洗浄システムを含む、請求項１から１３のいずれかに記載の植物インフィルトレーション装置。
15. 前記フレームに取り付けられた制御パネルを含み、前記植物インフィルトレーション装置の自動化された動作を制御する制御システムを更に備える、請求項１から１４のいずれかに記載の植物インフィルトレーション装置。
16. 前記制御パネルは、所定の動作サイクルに従って前記植物インフィルトレーション装置を操作するようにプログラムされたマイクロプロセッサと電気通信状態で接続される、請求項１５に記載の植物インフィルトレーション装置。
17. 前記接種物は、遺伝物質を含有する、請求項１から１６のいずれかに記載の植物インフィルトレーション装置。
18. 前記遺伝物質は、バクテリアに組み込まれる、請求項１７に記載の植物インフィルトレーション装置。
19. 前記バクテリアは、アグロバクテリウムである、請求項１８に記載の植物インフィルトレーション装置。
20. 自動化された植物インフィルトレーション装置を使用して、トレイに配置された植物を接種物でインフィルトレーションする方法であって、
    前記植物トレイを収容可能なインフィルトレーションタンクを備えた植物インフィルトレーション装置を準備する段階であって、少なくとも１つの接種物リザーバが、前記接種物を収容すると共に独立して前記インフィルトレーションタンクと流体流連通しており、自動化されたトレイ操作機構がロボットマニピュレータを有する、前記段階と、
    前記植物にインフィルトレーションするために、前記接種物リザーバからの前記接種物を前記インフィルトレーションタンクに供給する段階と、
    前記ロボットマニピュレータを使用して、前記植物トレイを前記装置の装入位置から移動させる段階と、
    を含み、
    前記植物トレイは、インフィルトレーションするために前記装置内のインフィルトレーション位置に供給され、前記植物トレイは、前記植物の少なくとも葉が前記インフィルトレーションタンク内で前記選択された接種物流体に浸漬されるように前記インフィルトレーションタンク内に配置され、
    前記方法は、更に、
    前記植物が前記インフィルトレーション位置にある状態で前記インフィルトレーションタンクを密閉及び封止して、前記封止されたインフィルトレーションタンクに負圧を付与する段階と、
    所定期間後に、前記植物トレイを前記インフィルトレーションタンク内の前記接種物流体から取り出す段階と、
    を含む方法。
21. 前記自動化された植物インフィルトレーション装置は、複数の前記接種物リザーバを含み、前記方法は、前記接種物リザーバの選択された１つからの前記接種物を前記インフィルトレーションタンクに供給する段階を更に含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記接種物リザーバの各々は、異なる接種物を収容し、前記方法は、前記植物にインフィルトレーションされる前記接種物リザーバのそれぞれから、前記接種物の１つを選択する段階を更に含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記植物トレイを前記インフィルトレーションタンクから取り出す段階の後で、別の植物トレイの処理を可能にするために、前記植物トレイを前記植物インフィルトレーション装置から取り出す段階を更に含む、請求項２０に記載の方法。
24. 少なくとも１つの新しい植物を有する新しい植物トレイを前記インフィルトレーションタンクに導入する段階と、前記接種物を前記インフィルトレーションタンクに供給する段階、前記新しい植物が前記インフィルトレーション位置にある状態で前記インフィルトレーションタンクを密閉及び封止する段階、及び前記封止されたインフィルトレーションタンクに負圧を付与する段階を少なくとも繰り返す段階とを更に含む、請求項２３に記載の方法。
25. 前記接種物は、遺伝物質を含有する、請求項２０に記載の方法。
26. 前記遺伝物質は、バクテリアに組み込まれる、請求項２５に記載の方法。
27. 前記バクテリアは、アグロバクテリウムである、請求項２６に記載の方法。
28. 前記植物トレイを逆さまに反転させる段階を更に含み、該植物トレイに配置された前記植物は、前記インフィルトレーション位置において下方を向き、前記植物トレイは、前記植物の少なくとも葉が前記インフィルトレーションタンク内で前記選択された接種物流体に浸漬されるように、前記インフィルトレーションタンク内に配置される、請求項２０に記載の方法。

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