JP2015509976A - 代謝障害の治療用薬草組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、有効成分として治療上有効量のカロフィルム種に属する植物の抽出物、および所望により薬学的に許容可能な担体を含む、薬草組成物に関する。本発明は、さらにカロフィルム・イノフィルム植物から得られる抽出物を含む薬草組成物に関する。本発明は、さらに抽出物の調製方法に関する。本発明は、前記組成物を用いる代謝障害の処置のための方法に関する。本発明は、代謝障害の処置に使用するための、治療上有効量のカロフィルム種の植物由来の抽出物を、既知の治療上有効な活性剤と組み合わせて含む組成物に関する。
Description
発明の分野
本発明は、有効成分として、治療上有効量のカロフィルム(Calophyllum)種に属する植物の抽出物を、単独で、または薬学的に許容可能な担体と共に含む薬草組成物に関する。本発明の組成物は、代謝障害の処置に有用である。本発明は、該薬草組成物の製造方法にも関する。
本発明は、有効成分として、治療上有効量のカロフィルム(Calophyllum)種に属する植物の抽出物を、単独で、または薬学的に許容可能な担体と共に含む薬草組成物に関する。本発明の組成物は、代謝障害の処置に有用である。本発明は、該薬草組成物の製造方法にも関する。
代謝障害とは、身体が炭水化物、脂質、タンパク質または核酸を適切に代謝することができない場合におこる障害または異常である。殆どの代謝障害は、細胞が代謝過程を行なうに必要な酵素を、欠失または機能不全へと至らしめる遺伝子の突然変異によって引き起こされる。代謝障害の例示は、肥満、過度の体脂肪、高脂血症、高リポタンパク質血症、高血糖症、高コレステロール血症、高インスリン血症、インシュリン耐性、耐糖能低下および糖尿病(特に、II型糖尿病)を含む。
糖尿病は、個体においてインシュリンを産生する能力または使用する能力に影響を及ぼす代謝障害である。糖尿病に罹患した個体では、血中グルコースレベルは正常よりも高い。無制御な糖尿病は、失明、腎不全、非外傷性手足切断および早期の心血管死亡の主な原因である。糖尿病患者は、またさらに脂質異常症、肥満、高血圧および耐糖能低下のような危険因子により心疾患事象を発生させるリスクも高い。
II型糖尿病患者は、血中グルコースレベルを規則的にモニタリングすること、そして血中グルコースレベルを正常または正常付近に維持するように処置を維持することが必要である。NIDDMの治療には、ライフスタイルの適応、自己測定および医薬が含まれ、これらにより糖尿病および糖尿病に関連した心血管合併症に関するリスクを最小限にすることができる。多くの医薬は、NIDDMを治療するのに利用可能であり、これらにはメトホルミン;グリピジドのようなスルホニル尿素;エキセナチドおよびリラグルチドのようなGLP拮抗薬;ピオグリタゾンおよびロシグリタゾンのようなチアゾリジンジオン類;シタグリピジン、サキサグリプチンおよびビルダグリプチンのようなDPP−IV阻害剤;ならびに、アカルボースおよびミグリトールのようなα−グルコシダーゼ阻害剤が挙げられる。
別の一般的な代謝障害は、肥満であり、これはエネルギー摂取と消費との間の不均衡を主たる原因とする。エネルギー摂取と消費との間の慢性的な不均衡に起因するプラスのエネルギー収支により、体重増加、ひいては肥満に至る。肥満は、一般に生死にかかわる病気ではないが、世界的な健康上の大きな問題になってきている。肥満は、高血圧、脂質異常症、II型糖尿病、心疾患、睡眠時無呼吸症候群、変形性関節症および幾つかの癌種のリスクを増幅する。肥満を克服する最も一般的なアプローチは、ライフスタイル、特に食事および運動において変化をもたらすことである。しかし、有意な体重減少を達成して、より低い体重を長期間維持することは困難である。また、肥満は、薬剤によってコントロールすることもできる。体重減少および幾つかの心臓病リスク因子に関する有望な結果にもかかわらず、これまで開発された殆どの抗肥満薬は、副作用を理由に、承認されていないか、または市場から撤退せねばならなかった。シブトラミンがもはや利用可能でないために、オルリスタットは、現在長期的使用のために承認された唯一の抗肥満薬である。従って、NIDDMおよび/または肥満のような代謝障害を処置するための、安全かつ有効な治療方法を開発する必要性が、依然として存在している。
代謝障害を処置するための新しい医薬候補を選抜および開発するために、2つの新しい酵素の標的物、即ちジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−1(DGAT−1)およびステアロイルCoAデサチュラーゼ−1(SCD−1)を利用することができる。これらの酵素は、トリグリセリドの合成(エネルギーが体内で貯蔵される主な形態)に重要な役割を果たす。
DGAT−1は、トリグリセリドの生合成を触媒する内部原形質(endoplasmic)の膜結合酵素であって、該生合成過程の最終段階でジアシルグリセロール(DAG)および脂肪酸アシル-コエンザイムA(CoA)をトリグリセリドに変換する酵素である。該酵素活性は、細胞が必要とするトリグリセリドを産生する必要があるために、全ての細胞型に存在している。DGAT−1は、腸および脂肪組織において高度に発現しており、肝臓および筋肉においてはより低いレベルを有する。これらの各組織(腸、脂肪組織、肝臓および筋肉)におけるDGAT−1を阻害することにより、トリアシルグリセロール合成を阻害して、ヒトの代謝障害における過度な脂質蓄積の病態生理を阻止することができる[Expert. Opin. Ther. Patents 17(11), 1331-1339(2007)]。
ステアロイルCoAデサチュラーゼ−1(SCD−1)は、脂質代謝の制御における主要酵素のうちの1つとして述べられており、可能性のある新規治療標的として提示できる。SCD−1は、飽和脂肪酸から一価不飽和脂肪酸の生合成を触媒する律速酵素である。SCD−1の好ましい基質であるステアリン酸(C18:0)およびパルミチン酸(C16:0)各々は、オレイン酸(C18:1)およびパルミトイル酸(C16:1)に各々変換される。これらの一価不飽和脂肪酸は、トリグリセリド、コレステロールエステル、リン脂質およびワックスエステルを含めた様々な脂質の主要成分と考えられる。実験動物における試験から、これらの酵素の活性を阻害または低下することにより、肥満、糖尿病および関連合併症の発症に対して抵抗性となることが示唆された[Pharmacol. Res., 618, 28-36, (2009); Pharmacol. Res., 650, 663-672(2011)]。
現代の医学分野において、薬草材料および植物は、創薬および開発において重要な役割を担い続けている。天然物は、広範な構造多様性を示す。分離、構造解析、スクリーニングおよびコンビナトリアル合成に対する現行技術を利用して、新規薬物の起源として植物製品を再び活性化させてきた。栄養補給食品および栄養補助食品形態における薬草成分の導入により、植物を基にした薬品市場が変わりつつある。天然物およびそれらのアナログは、有用な薬剤候補へと開発されることが可能である[Pharmacol. 60(3):195-206, (2008);Drug Discov. Today, 13(3-4), 161-71(2009)]。植物からの粗生成物または加工生成物は、合成低分子と比較して最小の副作用を有するか、または副作用がないと考えられるため、植物を基にした医薬に対する需要は増大し続けている。
カロフィルムは、熱帯性常緑樹の約180〜200の種の顕花植物属である。カロフィルム種は、カロフィルム・ブラシリエンス(Calophyllum brasiliense)、カロフィルム・カレドニクム(Calophyllum caledonicum)、カロフィルム・イノフィルム(Calophyllum inophyllum)およびカロフィルム・ソウラットリ(Calophyllum soulattri)を含む4つの下位カテゴリーから成る。
カロフィルム・イノフィルムは、中〜大型の常緑樹であり、平均25〜65フィートの高さであり、不規則な枝の広がりがある植冠を備えている。これは、東アフリカ、インド、南東アジア、オーストラリア、南太平洋およびハワイ諸島に自生している。この植物の様々な医薬用途は文献で報告されており、例えば、この植物の樹皮の煎出物(decoction)は、内出血に使用され、また無痛潰瘍の洗液としても使用されることが報告されている。さらに、この植物の堅果から得た油は、医薬および化粧品に慣習的に使用される。カロフィルム・イノフィルムの種子から抽出した油は、関節リウマチまたは関節障害;掻痒;湿疹;頭部に現われるざ瘡;眼疾患;および腎不全に使用される(Dravyaguna-Vijneana. Chaukhambha Bharati Academy, Publisher and distributor of monumental treatise of the east, Varanasi, India, Vol. II, 787, (2003); Chakradatta of Sri Chakrapanidatta. Dwivedy R. (ed.) Chaukhambha sanskrit sansthan, Publishers and distributors of oriental cultural literature, Varanasi, India, pages 280, 354 and 499, (2002))。
II型糖尿病および肥満のような代謝障害が一般化する時流を考えれば、代謝障害の有効な処置のための新規組成物および方法を求める必要性が引き続き存在することは、本明細書の上記に示した。実際、これらの問題の解決策を見出だす事を目的とした本発明の発明者らの努力により、DGAT−1およびSCD−1阻害活性を持つ薬草組成物、即ち代謝障害の処置に有用であるカロフィルム種に属する植物の抽出物を含む薬草組成物を得た。
(発明の要旨)
本発明の一態様に従い、代謝障害の処置において使用するための、有効成分として治療上有効量のカロフィルム種に属する植物の抽出物、および所望により少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物が提供される。
本発明の一態様に従い、代謝障害の処置において使用するための、有効成分として治療上有効量のカロフィルム種に属する植物の抽出物、および所望により少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物が提供される。
本発明の一態様に従い、代謝障害の処置において使用するための、有効成分として治療上有効量のカロフィルム・ブラシリエンス、カロフィルム・カレドニクム、カロフィルム・イノフィルムおよびカロフィルム・ソウラットリから選択される植物の抽出物、ならびに所望により少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物が提供される。
本発明の別の態様に従い、代謝障害を処置するために、治療上有効な薬剤と組み合わせて使用するための、治療上有効量のカロフィルム種の植物由来の抽出物および少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物が提供される。
本発明のさらなる別の態様に従い、代謝障害の処置において使用するための、有効成分として治療上有効量のカロフィルム・イノフィルム植物の抽出物および少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物が提供される。
別のさらなる態様において、本発明は、有効成分として治療上有効量のカロフィルム種に属する植物の抽出物および所望により少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物を、対象に投与することを含む、対象における代謝性疾患の治療方法に関する。
本発明の別の態様に従い、治療上有効量のカロフィルム種からの植物の抽出物を含む組成物の製造方法が提供される。
発明の詳細な記載
発明の範囲内での様々な変更および修飾は当業者には明白であるため、発明の実施態様を示す一方で詳細な説明および特定の例示は、単に説明する目的でのみ提供されることを理解されたい。本明細書の記載に基づいて、当業者は、本発明を全ての範囲まで利用してもよい。以下の特定の実施態様は、本開示内容の単なる説明として理解されるものであり、いかなることがあっても開示内容以外の部分を制限するものではない。
発明の範囲内での様々な変更および修飾は当業者には明白であるため、発明の実施態様を示す一方で詳細な説明および特定の例示は、単に説明する目的でのみ提供されることを理解されたい。本明細書の記載に基づいて、当業者は、本発明を全ての範囲まで利用してもよい。以下の特定の実施態様は、本開示内容の単なる説明として理解されるものであり、いかなることがあっても開示内容以外の部分を制限するものではない。
別途定義されなければ、本明細書において使用される全ての技術および化学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。
明細書および添付の特許請求の範囲に使用されるように、単数の形態には、内容が別のものとして明確に記述されなければ、複数の形態を包含する。
用語「代謝障害」とは、身体が炭水化物、脂質、タンパク質または核酸を適切に代謝することができない場合におこる障害あるいは異常をいう。代謝障害には、インシュリン耐性、高血糖症、II型糖尿病、肥満、耐糖能低下、高コレステロール血症、脂質異常症、高インスリン血症、アテローム性動脈硬化、多嚢胞性卵巣症候群、冠動脈疾患、メタボリック症候群、高血圧、または異常な血漿リポタンパク質、トリグリセリドとの関連疾患あるいはグルコースレベルとの関連疾患、例えば膵臓のβ細胞再生が挙げられる。
本明細書に使用される用語「処置すること」、「処置する」または「処置」は、予防的(予防薬)および待機的処置を含む。
本明細書に使用される用語「薬学的に許容可能な」は、組成物中に使用される担体、希釈剤および/または賦形剤が、該製剤中の他の成分と相溶性であって、その受容者に有害ではないことを意味する。
カロフィルムは、熱帯常緑樹の約180〜200種の顕花植物属である。カロフィルム種は、カロフィルム・ブラシリエンス、カロフィルム・カレドニクム、カロフィルム・イノフィルムおよびカロフィルム・ソウラットリを含む4つの下位群からなる。用語「カロフィルム」とは、その異名全てを包含することが意図される。
用語「薬草組成物」または「組成物」は、互換的に使用され、治療上有効量のカロフィルム種に属する植物の抽出物を、単独で、あるいは少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体または賦形剤と共に含む組成物を示すことができる。用語「単独で」とは、該組成物が、その中に添加された任意の薬学的に許容可能な担体も含まずに、カロフィルム種に属する植物の抽出物のみを含むことを示すことができる。
用語「組成物」とは、広義に解釈されるべきであって、例えば、目的とする適応症に関する表示を伴う医薬製品として販売されていてもいなくも、店舗販売されていてもいなくても、植物性医薬(phytopharmaceutical)として販売されていてもいなくても、治療効果を達成するという目的を意図するあらゆる組成物を包含することに留意されたい。
本明細書に使用されるような用語「薬学的に許容可能な担体」とは、無毒かつ不活性な固体、半固形、希釈剤、封入材またはあらゆるタイプの製剤用賦形剤を意味する。薬学的に許容可能な担体として役割を果たす材料の幾つかの例には、以下のものが挙げられる:ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖類;トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンのようなデンプン類;カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体;麦芽;ゼラチン;他の無毒な相溶性の、滑沢剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム)、ならびに着色料、解離剤、コーティング剤、甘味剤、風味剤および芳香剤;保存剤および酸化防止剤も、製剤者の判断によって組成物に使用できる。
本明細書に使用されるような用語「治療上有効な量」とは、抽出物(例えば、カロフィルム・イノフィルム抽出物)または該抽出物を含有する組成物の量を意味し、これは妥当な医学的判断の範囲内において、規定または処置される条件下で、正の変化を有意に誘導するために十分であって、もしあったとしても副作用を回避するのに十分低い(合理的利益/リスク比にて)量である。抽出物または組成物の治療上有効量は、処置される特定の症状、例えばII型糖尿病または肥満、エンドユーザの年齢および身体状態、処置/治療される症状の重篤度、治療期間、併用療法の性質、利用される特定の薬学的に許容可能な担体ならびに因子類に拠って変化する。本明細書に使用されるような、全ての%は、特段の記載がなければ重量である。
本明細書に使用されるような用語「カロフィルム・イノフィルム抽出物」または「カロフィルム・イノフィルムの抽出物」は、カロフィルム・イノフィルム植物の任意の部分に存在する化合物の混合物を意味する。かかる化合物は、植物のあらゆる部分(例えば、植物の樹皮、小枝、茎および木質部など)から、当分野では十分知られた抽出方法、例えば、低級アルコール(例えば、メタノールまたはエタノール)、アルキルエステル(例えば、酢酸エチル)、アルキルエーテル(例えば、ジエチルエーテル)、アルキルケトン(例えば、アセトン、クロロホルム、石油エーテル、ヘキサン)のような有機溶媒を使用する抽出方法ならびに/または水のような水性溶剤を使用する抽出方法を実施して抽出できる。植物材もまた、好適な比率の溶剤混合物、例えばヘキサン−エチルアセトン(1:1)、クロロホルム−メタノール(1:1)またはメタノール−水(3:1)を用いて抽出することができる。
本明細書に使用されるような用語「対象」とは、動物、特に哺乳動物、より特別にはヒトをいう。
本明細書に使用される用語「哺乳動物」とは、皮膚が毛に覆われており、子供を育てるために乳を出す雌の乳腺を特徴とする、ヒトを含めた哺乳類の温血脊椎動物をいう。用語「哺乳動物」とは、ネコ、イヌ、ウサギ、クマ、キツネ、オオカミ、サル、シカ、マウス、ブタおよびヒトのような動物を含む。
実施態様において、「カロフィルム・イノフィルム抽出物」の調製方法は、溶剤としてメタノールの使用を含む。例えば、該抽出物を、溶剤としてメタノールを使用して、カロフィルム・イノフィルム植物の粉砕樹皮を抽出することによって得ることができる。
実施態様において、カロフィルム・イノフィルム植物の粉砕樹皮を、様々な比率のメタノール−水の混合液、例えばメタノール−水(9:1)混合液、メタノール−水(3:1)混合液またはメタノール−水(1:1)混合液を使用して抽出できる。
カロフィルム・イノフィルム植物の抽出物の調製方法は、大規模な製造のために容易にスケールアップできる。
「カロフィルム・イノフィルム抽出物」は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)または高性能薄層クロマトグラフィー(HPTLC)のような従来技術を使用して標準化することができる。用語「標準化抽出物」とは、抽出物中に存在する特有の生理活性成分または生理活性マーカー類を同定することにより標準化された抽出物をいう。
本明細書に使用されるような用語「有効成分」または「生理活性成分」は、1つ以上の生理活性化合物(生理活性マーカー)を含んでいる「カロフィルム・イノフィルム抽出物」をいう。生理活性成分は、高性能薄層クロマトグラフィー(HPTLC)または高速液体クロマトグラフィー(HPLC)のような様々な技術を使用して同定することができる。生理活性マーカーは、カラムクロマトグラフィー精製および分取高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって、生理活性によりカロフィルム・イノフィルム植物の抽出物から単離することができる。化合物を、スペクトルのデータの分析により特徴付けることもできる。
用語「生理活性マーカー」とは、許容可能な程度の医薬活性と関連がある活性化合物の特徴(あるいは、植物化学プロファイル)を規定するために、本明細書において使用される。活性化合物である「生理活性マーカー」は、生理活性によるクロマトグラフィー精製および分取HPLCにより、カロフィルム・イノフィルム植物から得た抽出物から単離できる。単離化合物(生理活性マーカー)を、スペクトルデータの分析により特徴付けることができる。
抽出物の生理活性の測定は、種々の十分に知られた生体外・生体内アッセイを用いて実施することができる。例えば、予備的に抽出物の生体外活性の測定は、ジアシルグリセロアシルトランスフェラーゼ−1(DGAT−1)、ステアロイル-CoAデサチュラーゼ−1(SCD−1)アッセイまたはトリグリセリド合成アッセイを使用して実施することができる。生体内活性は、高脂肪食(HFD)誘導性肥満モデルのようなアッセイを用いて測定することができる。
実施態様において、本発明は、治療上有効量のカロフィルム・イノフィルム植物の抽出物および所望により少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体を含む薬草組成物を提供する。
別の実施態様において、本発明は、カロフィルム・イノフィルム植物の標準化抽出物および所望により少なくとも一つの薬学的に許容可能な担体を含む薬草組成物に関する。
本発明の薬草組成物は、5〜100%のカロフィルム・イノフィルム植物の抽出物を含む。
本発明の薬草組成物は、少なくとも1つの生理活性マーカーを含んでいるカロフィルム・イノフィルム植物から得られる抽出物の5〜100%を含む。
実施態様において、本発明は、代謝障害を処置するための医薬製造における、治療上有効量のカロフィルム・イノフィルム植物の抽出物を含む組成物の使用を提供する。
「カロフィルム・イノフィルム抽出物」は、薬学的に許容可能な担体と混合して、治療用投薬形態へと製剤される。
治療上有効量のカロフィルム・イノフィルム植物の抽出物を含む組成物は、例えば、丸剤、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤あるいはシロップの形態で経口投与することができる。
「カロフィルム・イノフィルム抽出物」を5〜100重量%を含んでいる経口組成物は、常法を使用して、この抽出物を薬学的に許容可能な担体と完全に混合することにより製造できる。
実施態様において、前記組成物は、代謝障害の処置のために提供される。
実施態様において、前記組成物は、II型糖尿病、肥満、耐糖能低下、高コレステロール血症、脂質異常症、高インスリン血症、アテローム性動脈硬化、多嚢胞性卵巣症候群、冠動脈疾患、メタボリック症候群あるいは高血圧から選択される代謝障害の処置のために提供される。
実施態様において、前記組成物は、II型糖尿病の処置のために提供される。
実施態様において、前記組成物は、肥満の処置のために提供される。
実施態様において、前記組成物は、脂質異常症の処置のために提供される。
実施態様において、前記組成物は、異常な血漿リポタンパク質、トリグリセリドとの関連疾患に関係する代謝障害の処置のために提供される。
実施態様において、前記組成物は、グルコースレベルに関係のある代謝障害、例えば膵臓のβ細胞再生の処置のために提供される。
また別の実施態様において、本発明は、代謝障害の処置において使用するための、治療上有効な薬剤と組み合わせて使用するために、治療上有効量のカロフィルム種からの植物の抽出物および少なくとも薬学的に許容可能な担体を含む組成物に関する。
また別の実施態様において、本発明は、代謝障害の治療において使用するための、治療上有効な薬剤と組み合わせて使用するために、治療上有効量のカロフィルム・イノフィルム植物の抽出物および所望により少なくとも薬学的に許容可能な担体を含む組成物に関する。
治療上有効量のカロフィルム・イノフィルム植物の抽出物を含む本発明の組成物を、代謝障害の処置において使用するために、所望により治療上有効な薬剤と組み合わせて使用してもよい。
治療上有効な薬剤は、オルリスタット、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、グリベンクラミド、グリピジド、グリメピリド、リパグリニド、またはメトホルミンのような既知の生理活性物質から選択されてもよい。
本発明はまた、治療上有効量のカロフィルム・イノフィルム植物の抽出物、および所望により少なくとも一つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物を、経口経路によって選択的に投与することを含む代謝障害を処置する方法に関する。
本発明の薬草組成物は、有効成分(即ち、抽出物)を、通常、無毒な薬学的に許容可能な担体と共に配合して、粉末剤、丸剤、錠剤、糖衣錠、残渣、顆粒剤、カプセル剤、溶液、乳剤、懸濁、エリキシル剤、シロップおよび使用に好適な他の形態として、経口投与のために製剤されてもよい。本発明の製剤は、タルク、水、グルコース、ラクトース、スクロース、アカシアガム、ゼラチン、マンニトール、スターチ、三ケイ酸マグネシウム、トウモロコシデンプン、ケラチン、コロイド様シリカ、ジャガイモデンプン、尿素およびセルロース、ならびにそれらの派生物(例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース);麦芽;ゼラチン;ならびに、その他の無毒な相溶性滑沢剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム)、放出剤、コーティング剤、および固体、半固体または液体の形態の製剤を製造する際に使用するのに好適なその他の賦形剤を含むものを包含し、さらに助剤、安定化剤、増粘剤および着色料を使用してもよい。錠剤またはカプセル剤のような固体組成物を製造するために、該抽出物を、薬学的担体(例えば、トウモロコシデンプン、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸カルシウムあるいはゴムのような従来の錠剤化成分)ならびに他の薬学的希釈剤(例えば、水)と混合して、固体組成物を形成してもよい。その後、この固体組成物は、有効量の本発明の組成物を含有する単位投薬形態へと分割される。抽出物を含有する錠剤または丸剤を、持続作用の利点を提供する投薬形態を提供するように被覆または配合することができる。
液体形態(該抽出物は、経口投与として、または注射により導入できる)には、水溶液、好適に風味付けしたシロップ剤、水性懸濁液または油性懸濁液、エリキシル剤および食用油を含む風味付けされたエマルジョン、ならびにエリキシル剤および類似の薬学用賦形剤が挙げられる。水性懸濁液に好適な分散剤または懸濁化剤は、トラガント、アカシアガム、アルギン酸塩、デキストラン、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンのような合成の天然ゴムを含む。経口投与用の液体製剤は、例えば、溶液、シロップ剤または懸濁液の形式をとることができるか、あるいは、それらは、使用前に水または他の適切な賦形剤を用いて再構成するために乾燥生成物として存在してもよい。かかる液体製剤は、常法により、懸濁化剤(例えば、ソルビトールシロップ、メチルセルロースまたは水素化食用脂);乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシアガム);非水性賦形剤(例えば、アーモンド油、油性エステルまたはエチルアルコール);保存剤(例えば、メチルまたはp-オキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸);ならびに人工または天然色素および/または甘味料などの薬学的に許容可能な添加剤と共に製造できる。
選択された投薬レベルは、用いた本発明の特定の抽出物の活性、投与経路、投与時間、用いた特定組成物の排出速度、処置の期間、その他の抽出物との併用、年齢、性別、重量、条件、患者の一般的な健康状態および処置される患者の先の病歴、医薬分野において十分に知られた要因に依存するであろう。しかし、一般的には、成人の処置に用いられる投薬量は、1日あたり0.02〜5000mgまたは1日あたり1〜1500mgの範囲内である。所望の投薬量は、単回用量にて、または好適な間隔で投与される分割用量として、例えば1日あたり2、3あるいは4つ以上の分割用量にて存在する。
本発明は、以下の実施例を参照してより容易に理解されるであろうが、これは発明を説明するために提供されるが、発明の範囲を制限するものではない。
本発明は、以下の実施例を参照してより容易に理解されるであろうが、これは発明を説明するために提供されるが、発明の範囲を制限するものではない。
植物の抽出物
カロフィルム・イノフィルムの植物材料(樹皮、木質部、茎および小枝)を、インドのマハーラーシュトラ州のムンバイ(Mumbai, Maharashtra, India)で収集した。証明のために顕微鏡試験および肉眼試験を、各植物材料について行った。カロフィルム・イノフィルム植物の各部分の試験片は、ピラマル・ヘルスケア・リミテッド(Goregaon, Mumbai, Maharashtra, Indi)の植物部門で保持される。
カロフィルム・イノフィルムの植物材料(樹皮、木質部、茎および小枝)を、インドのマハーラーシュトラ州のムンバイ(Mumbai, Maharashtra, India)で収集した。証明のために顕微鏡試験および肉眼試験を、各植物材料について行った。カロフィルム・イノフィルム植物の各部分の試験片は、ピラマル・ヘルスケア・リミテッド(Goregaon, Mumbai, Maharashtra, Indi)の植物部門で保持される。
カロフィルム・イノフィルムの植物材料(樹皮、木質部、茎および小枝)を、小片に切断して、除湿機により乾燥させた。完全に乾燥した試料を、その後粉砕機を使用して粗く挽いた。
実施例1
乾燥したカロフィルム・イノフィルム(樹皮)(500g)の粉砕植物材料を、メタノール(4L)を使用して45℃で3時間攪拌することにより抽出した。この抽出過程を、メタノール(3.5L)を用いて2回繰り返した。抽出物を合わせて、乾燥状態まで濃縮した。収量:115g(23%)。
実施例1において得られた抽出物を、「実施例1の抽出物」として本明細書において示す。
乾燥したカロフィルム・イノフィルム(樹皮)(500g)の粉砕植物材料を、メタノール(4L)を使用して45℃で3時間攪拌することにより抽出した。この抽出過程を、メタノール(3.5L)を用いて2回繰り返した。抽出物を合わせて、乾燥状態まで濃縮した。収量:115g(23%)。
実施例1において得られた抽出物を、「実施例1の抽出物」として本明細書において示す。
実施例2
乾燥したカロフィルム・イノフィルム(樹皮)(100g)の粉砕植物材料を、メタノール:水(9:1)(900mL)を使用して、45℃で3時間攪拌することにより抽出した。この抽出過程を、メタノール:水(9:1)(700mL)を用いて2回繰り返した。抽出物を、合わせて濃縮した。濃縮した試料を、凍結乾燥器(Edwards)を使用して凍結乾燥した。収量:17.72g(17.7%)。
実施例2において得られた抽出物は、本明細書において「実施例2の抽出物」として示す。
乾燥したカロフィルム・イノフィルム(樹皮)(100g)の粉砕植物材料を、メタノール:水(9:1)(900mL)を使用して、45℃で3時間攪拌することにより抽出した。この抽出過程を、メタノール:水(9:1)(700mL)を用いて2回繰り返した。抽出物を、合わせて濃縮した。濃縮した試料を、凍結乾燥器(Edwards)を使用して凍結乾燥した。収量:17.72g(17.7%)。
実施例2において得られた抽出物は、本明細書において「実施例2の抽出物」として示す。
実施例3
乾燥したカロフィルム・イノフィルム(樹皮)(50g)の粉砕植物材料を、メタノール:水(3:1)(500mL)を使用して、45℃で3時間攪拌することにより抽出した。この抽出過程を、メタノール:水(3:1)(400mL)を用いて2回繰り返した。この抽出物を、合わせて濃縮した。濃縮した試料を、凍結乾燥器(Edwards)を使用して凍結乾燥した。収量:8.2g(16.4%)。
実施例3において得られた抽出物は、本明細書において「実施例3の抽出物」として示す。
乾燥したカロフィルム・イノフィルム(樹皮)(50g)の粉砕植物材料を、メタノール:水(3:1)(500mL)を使用して、45℃で3時間攪拌することにより抽出した。この抽出過程を、メタノール:水(3:1)(400mL)を用いて2回繰り返した。この抽出物を、合わせて濃縮した。濃縮した試料を、凍結乾燥器(Edwards)を使用して凍結乾燥した。収量:8.2g(16.4%)。
実施例3において得られた抽出物は、本明細書において「実施例3の抽出物」として示す。
実施例4
乾燥したカロフィルム・イノフィルム(樹皮)(50g)の粉砕植物材料を、メタノール:水(1:1)(500mL)を使用して、45℃で3時間攪拌することにより抽出した。この抽出過程を、メタノール:水(1:1)(400mL)を用いて2回繰り返した。この抽出物を、合わせて濃縮した。濃縮した試料を、凍結乾燥器(Edwards)を使用して凍結乾燥した。収量:6.3g(12.6%)。
実施例4において得られた抽出物は、本明細書において「実施例4の抽出物」として示す。
乾燥したカロフィルム・イノフィルム(樹皮)(50g)の粉砕植物材料を、メタノール:水(1:1)(500mL)を使用して、45℃で3時間攪拌することにより抽出した。この抽出過程を、メタノール:水(1:1)(400mL)を用いて2回繰り返した。この抽出物を、合わせて濃縮した。濃縮した試料を、凍結乾燥器(Edwards)を使用して凍結乾燥した。収量:6.3g(12.6%)。
実施例4において得られた抽出物は、本明細書において「実施例4の抽出物」として示す。
実施例5
乾燥したカロフィルム・イノフィルム(茎)の粉砕植物材料を、メタノールを使用して、45℃で3時間攪拌することにより抽出した。該抽出物を濾過した。この抽出過程を、メタノール(1:8 w/v)を用いて2回繰り返した。この抽出物を、合わせて濃縮した。収量:6.5%。
実施例5において得られた抽出物は、本明細書において「実施例5の抽出物」として示す。
乾燥したカロフィルム・イノフィルム(茎)の粉砕植物材料を、メタノールを使用して、45℃で3時間攪拌することにより抽出した。該抽出物を濾過した。この抽出過程を、メタノール(1:8 w/v)を用いて2回繰り返した。この抽出物を、合わせて濃縮した。収量:6.5%。
実施例5において得られた抽出物は、本明細書において「実施例5の抽出物」として示す。
実施例6
乾燥したカロフィルム・イノフィルム(小枝)の粉砕植物材料を、メタノール(1:10 w/v)を使用して、45℃で3時間攪拌することにより抽出した。この抽出過程を、メタノール(1:8 w/v)を用いて、2回繰り返した。この抽出物を合わせて、乾燥状態まで濃縮した。収率:10%。
実施例6において得られた抽出物は、本明細書において「実施例6の抽出物」として示す。
乾燥したカロフィルム・イノフィルム(小枝)の粉砕植物材料を、メタノール(1:10 w/v)を使用して、45℃で3時間攪拌することにより抽出した。この抽出過程を、メタノール(1:8 w/v)を用いて、2回繰り返した。この抽出物を合わせて、乾燥状態まで濃縮した。収率:10%。
実施例6において得られた抽出物は、本明細書において「実施例6の抽出物」として示す。
実施例7
乾燥したカロフィルム・イノフィルム(木質部)の粉砕植物材料を、メタノール(1:10w/v)を使用して、45℃で3時間攪拌することにより抽出した。この抽出過程を、メタノール(1:8w/v)を用いて2回繰り返した。この抽出物を合わせて、乾燥状態まで濃縮した。収率:10.6%。
実施例7において得られた抽出物は、本明細書において「実施例7の抽出物」として示す。
乾燥したカロフィルム・イノフィルム(木質部)の粉砕植物材料を、メタノール(1:10w/v)を使用して、45℃で3時間攪拌することにより抽出した。この抽出過程を、メタノール(1:8w/v)を用いて2回繰り返した。この抽出物を合わせて、乾燥状態まで濃縮した。収率:10.6%。
実施例7において得られた抽出物は、本明細書において「実施例7の抽出物」として示す。
実施例1〜7の抽出物を、4℃〜8℃の冷蔵室内でポリプロピレンバイアルに保存した。
薬理学的アッセイ
DGAT−1およびSCD−1酵素の活性阻害における、カロフィルム・イノフィルム植物の抽出物の効力を、当業者には既知の下記に示した多くの薬理学的アッセイによって決定した。
以下の用語/略語を実施例において使用する:
DGAT−1およびSCD−1酵素の活性阻害における、カロフィルム・イノフィルム植物の抽出物の効力を、当業者には既知の下記に示した多くの薬理学的アッセイによって決定した。
以下の用語/略語を実施例において使用する:
生体外アッセイ
実施例8
hDGAT−1分析
DGAT−1アッセイを、文献(Pharmacol. Res., 650, 663-672(2011))に記載されたようにSf9細胞系において過剰発現したヒトのDGAT−1酵素を用いて設計した。文献の開示内容を、アッセイ技術の教示のために参照により本明細書に組み込む。
実施例8
hDGAT−1分析
DGAT−1アッセイを、文献(Pharmacol. Res., 650, 663-672(2011))に記載されたようにSf9細胞系において過剰発現したヒトのDGAT−1酵素を用いて設計した。文献の開示内容を、アッセイ技術の教示のために参照により本明細書に組み込む。
ヒトDGAT−1(hDGAT−1)クローンのクローニングおよび発現
hDGAT−1ORF発現クローン(pDESTベクター中RZPD0839C09146)を、RZPD(Germany)から入手した。hDGAT−1遺伝子(NM_012079)を、アンピシリン耐性マーカーと共にキンウワバ科(Autographa californica)の核多角体病ウイルス(AcNPV)の強力なポリヘドリンプロモーターのもとでpDEST8ベクターにクローニングした。この組み換えプラスミドを、トランスフェクションによりバキュロウイルス・シャトルベクター(バクミド:bacmid)を含有するDH10BACコンピテントセルに移入して、得られる細胞を、Bac−to−Bacバキュロウイルス発現系(Invitrogen, USA)に従い、アンピシリン(100μg/mL)、カナマイシン(50μg/mL)およびゲンタマイシン(10μg/mL)を含むルリアブロス(LB)寒天平板上へ筋状に塗布した。白色コロニーを摘み取り、上記抗生物質を含むLB寒天培地上に再度塗布して、37℃で一晩インキュベートした。翌日に、hDGAT−1遺伝子を含有する組み換えバクミドを有する単離白色コロニーを、抗生物質(アンピシリン(100μg/mL)、カナマイシン(50μg/mL)およびゲンタマイシン(10μg/mL))を含むルリア培地(10mL)中に植菌して、オービタルシェーカー(New Brunswick)上で、37℃、200rpmにて終夜インキュベートした。ルリア培地(10mL)を取り出し、組み換えバクミドDNA(hDGAT−1遺伝子を有する)を、Qiagen Mini prep kitを用いて調製して、ナノドロップ(Nanodrop)を用いて定量した。hDGAT−1遺伝子を含むバクミドDNAの濃度は、およそ97ng/μLであった。
hDGAT−1ORF発現クローン(pDESTベクター中RZPD0839C09146)を、RZPD(Germany)から入手した。hDGAT−1遺伝子(NM_012079)を、アンピシリン耐性マーカーと共にキンウワバ科(Autographa californica)の核多角体病ウイルス(AcNPV)の強力なポリヘドリンプロモーターのもとでpDEST8ベクターにクローニングした。この組み換えプラスミドを、トランスフェクションによりバキュロウイルス・シャトルベクター(バクミド:bacmid)を含有するDH10BACコンピテントセルに移入して、得られる細胞を、Bac−to−Bacバキュロウイルス発現系(Invitrogen, USA)に従い、アンピシリン(100μg/mL)、カナマイシン(50μg/mL)およびゲンタマイシン(10μg/mL)を含むルリアブロス(LB)寒天平板上へ筋状に塗布した。白色コロニーを摘み取り、上記抗生物質を含むLB寒天培地上に再度塗布して、37℃で一晩インキュベートした。翌日に、hDGAT−1遺伝子を含有する組み換えバクミドを有する単離白色コロニーを、抗生物質(アンピシリン(100μg/mL)、カナマイシン(50μg/mL)およびゲンタマイシン(10μg/mL))を含むルリア培地(10mL)中に植菌して、オービタルシェーカー(New Brunswick)上で、37℃、200rpmにて終夜インキュベートした。ルリア培地(10mL)を取り出し、組み換えバクミドDNA(hDGAT−1遺伝子を有する)を、Qiagen Mini prep kitを用いて調製して、ナノドロップ(Nanodrop)を用いて定量した。hDGAT−1遺伝子を含むバクミドDNAの濃度は、およそ97ng/μLであった。
Sf9細胞を使用するトランスフェクションおよびウイルス増幅
1〜3μgのhDGAT−1バクミドDNAを、6ウェル組織培養プレート中で仕様説明書に従って、Cellfectin(Invitrogen, USA)を使用して、Sf9細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされたSf9細胞を、子ウシ血清およびAntibiotic-Antimycotic(100ユニット/mL)のペニシリン(100μg/mL)、ストレプトマイシン硫酸塩(0.25μg/mL)およびアンホテリシンBを含まない不完全グレース昆虫培地(Gibco R)中で、27℃で5時間培養した。インキュベーション完了後に、この培地を増殖培地(グレース昆虫培地;(Gibco(登録商標))子ウシ血清およびAntibiotic-Antimycotic(100ユニット/mL)、ペニシリン(100μg/mL)、ストレプトマイシン硫酸塩(0.25μg/mL)およびアンホテリシンBを含有する)に置換して、細胞を、27℃で120時間、インキュベーター内でさらに培養した。
1〜3μgのhDGAT−1バクミドDNAを、6ウェル組織培養プレート中で仕様説明書に従って、Cellfectin(Invitrogen, USA)を使用して、Sf9細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされたSf9細胞を、子ウシ血清およびAntibiotic-Antimycotic(100ユニット/mL)のペニシリン(100μg/mL)、ストレプトマイシン硫酸塩(0.25μg/mL)およびアンホテリシンBを含まない不完全グレース昆虫培地(Gibco R)中で、27℃で5時間培養した。インキュベーション完了後に、この培地を増殖培地(グレース昆虫培地;(Gibco(登録商標))子ウシ血清およびAntibiotic-Antimycotic(100ユニット/mL)、ペニシリン(100μg/mL)、ストレプトマイシン硫酸塩(0.25μg/mL)およびアンホテリシンBを含有する)に置換して、細胞を、27℃で120時間、インキュベーター内でさらに培養した。
この培養中に、ウイルス粒子は、昆虫内で形成され、分泌された。このウイルスを含有する上清を、120時間終了時に収集して、Biofuge statos遠心分離機(Heraeus 400)を使用して、5分間、1500Xgで遠心分離を行い、0.22のμmフィルター(Millipore)を通して濾過した。それをP1の組み換えバキュロウイルスとして4℃で保存した。含有量>105pfu(プラーク形成単位)/mLを、製造社指示書(Invitrogen Kit)に従い行なったプラークアッセイにより決定した。
P1組み換えバキュロウイルスを、0.05〜0.1のMOI(感染多重度)にてさらに増幅させて、グレース昆虫完全培地(5mL)中に5x106Sf9細胞を含有するT−25フラスコ(Nunc)内で120時間、P2を生成させて、その後5分間、1500Xgの遠心分離に供し、0.22μmのフィルター(Millipore)による濾過を行い、P2/(>106pfu/mL)組換えバキュロウイルスとして4℃で保存した。同様に、P3およびP4組換えバキュロウイルスを、0.05〜0.1のMOIの再感染によりさらに増幅させて、P3とP4の組換えバキュロウイルスを各々生成させて、次回使用時まで4℃で保存した。P4の組換えバキュロウイルスについてのウイルス価を決定し、それが1x108pfu/mLであることが判った。P4(>108pfu/mL)組み換えバキュロウイルスを、最終的に用いて、5〜10のMOIにてsf9細胞を感染させた。
ミクロソーム調製
Sf9細胞(2x106細胞/mL)を、500mLのスピナーフラスコ内のAntibiotic-Antimycotic(GibcoR)を含むグレース昆虫細胞培地(Gibco)(250mL)中で増殖させて、5のMOIにて、hDGAT−1の組換えバキュロウイルス(25mL)に感染させた。感染細胞を、28℃で48時間維持して、細胞残渣を、室温で1000Xgにて、培地を遠心分離機にかけて回収した。残渣を、PBS(pH7.4)により洗浄して、残留培地を除去した。
Sf9細胞(2x106細胞/mL)を、500mLのスピナーフラスコ内のAntibiotic-Antimycotic(GibcoR)を含むグレース昆虫細胞培地(Gibco)(250mL)中で増殖させて、5のMOIにて、hDGAT−1の組換えバキュロウイルス(25mL)に感染させた。感染細胞を、28℃で48時間維持して、細胞残渣を、室温で1000Xgにて、培地を遠心分離機にかけて回収した。残渣を、PBS(pH7.4)により洗浄して、残留培地を除去した。
次いで、該残渣をプロテアーゼカクテル錠(Roche)の1X量および社内調製したプロテアーゼ阻害混合物を含むミクロソーム調製緩衝液(15mL)に懸濁し、溶解物を27Gのニードルに通して、その後4℃で超音波処理を穏やかに行うことにより、細胞を破砕した。細胞破片を分離して、核上清(PNS)である溶解物を、Biofuge statos遠心分離機(Heraeus 400)を用いて、4℃で10分間1000Xgにて遠心分離を行なった。その後に、得られたPNSを、Biofuge statos 遠心分離機(Heraeus)を用いて、4℃で30分間15000Xgにて遠心分離を行ない、ミトコンドリア上清(PMS)(the post mitochondrial supernatant)を分離した。最終的に、超遠心分離を、BeckmaTi-rotorを用いて4℃で1時間100,000Xgにて行い、ミクロソームペレットを得た。精製度を高めるために、このペレットを、プロテアーゼ阻害剤混合物[アプロチニン(0.8μM)、ペプスタチンA(10μM)およびロイペプチン(20μM)-Sigma]の社内調製物を含有するミクロソーム調製緩衝液で2回洗浄した。
最後に、ミクロソーム残渣を、ミクロソーム調製緩衝液(1.5mL)に懸濁して、タンパク濃度をブラッドフォード法によって決定した。
ミクロソームを、生体外アッセイのために−70℃で各々100μlのアリコートとして保存した。
最後に、ミクロソーム残渣を、ミクロソーム調製緩衝液(1.5mL)に懸濁して、タンパク濃度をブラッドフォード法によって決定した。
ミクロソームを、生体外アッセイのために−70℃で各々100μlのアリコートとして保存した。
緩衝液および試薬調製
ストック溶液
hDGAT−1アッセイ緩衝液ストック:アッセイ緩衝液(pH7.4)を、0.25Mのスクロース(Sigma)および1mM EDTA(Sigma)を150mM Tris HCl(Sigma)に溶解することにより調製した。
停止液:10mLの停止液を作成するために、イソプロパノール(Qualigens)(7.84mL)およびn−ヘプタン(Qualigens)(1.96mL)を、脱イオン化水(0.2mL)に添加した。
A.E.S.S.M(アルカリ性エタノール停止混合液):A.E.S.S.M溶液(10mL)を作るために、変性エタノール(1.25mL)、脱イオン水(1.0mL)および1N NaOH(Qualigens)(0.25mL)を、停止液(7.5mL)に添加した。
シンチレーション溶液:2.5Lのシンチレーション溶液を作るために、トルエン(Merck)(1667mL)、トライトンX−100(Sigma)(833mL)、2,5−ジフェニルオキサゾール(PPO;Sigma)(12.5g)および(1,4−ビス(5−フェニル−2−オキサゾリル)ベンゼン(POPOP;Sigma)(500mg)を混合した。
ストック溶液
hDGAT−1アッセイ緩衝液ストック:アッセイ緩衝液(pH7.4)を、0.25Mのスクロース(Sigma)および1mM EDTA(Sigma)を150mM Tris HCl(Sigma)に溶解することにより調製した。
停止液:10mLの停止液を作成するために、イソプロパノール(Qualigens)(7.84mL)およびn−ヘプタン(Qualigens)(1.96mL)を、脱イオン化水(0.2mL)に添加した。
A.E.S.S.M(アルカリ性エタノール停止混合液):A.E.S.S.M溶液(10mL)を作るために、変性エタノール(1.25mL)、脱イオン水(1.0mL)および1N NaOH(Qualigens)(0.25mL)を、停止液(7.5mL)に添加した。
シンチレーション溶液:2.5Lのシンチレーション溶液を作るために、トルエン(Merck)(1667mL)、トライトンX−100(Sigma)(833mL)、2,5−ジフェニルオキサゾール(PPO;Sigma)(12.5g)および(1,4−ビス(5−フェニル−2−オキサゾリル)ベンゼン(POPOP;Sigma)(500mg)を混合した。
処理用ストック(Working stock)
hDGAT−1分析緩衝液:0.125%BSA(遊離脂肪酸, Sigma)を含むhDGAT−1分析緩衝液を使用前に新たに調製した。
基質混合物の調製:基質混合物を、2047.5μMの1,2−ジオレオイル−sn−グリセロール(19.5mM;Sigma)および280 nCi/mLの[14C]オレオイル基−CoA(0.1mCi/mL America Radiolabelled Chemicals)を添加して新たに調製し、hDGAT−1アッセイ緩衝液を使用して最終容量を1000μLとした。
hDGAT−1酵素調製物:酵素をhDGAT−1アッセイ緩衝液中で1mg/mLの処理濃度に希釈し、この処理用酵素ストックの2.5μLを、hDGAT−1アッセイ(終濃度25μg/mL)に使用した。
hDGAT−1分析緩衝液:0.125%BSA(遊離脂肪酸, Sigma)を含むhDGAT−1分析緩衝液を使用前に新たに調製した。
基質混合物の調製:基質混合物を、2047.5μMの1,2−ジオレオイル−sn−グリセロール(19.5mM;Sigma)および280 nCi/mLの[14C]オレオイル基−CoA(0.1mCi/mL America Radiolabelled Chemicals)を添加して新たに調製し、hDGAT−1アッセイ緩衝液を使用して最終容量を1000μLとした。
hDGAT−1酵素調製物:酵素をhDGAT−1アッセイ緩衝液中で1mg/mLの処理濃度に希釈し、この処理用酵素ストックの2.5μLを、hDGAT−1アッセイ(終濃度25μg/mL)に使用した。
試験サンプルの調製
試験サンプルを、以下のように調製した。20mg/mLのストック溶液を、100%ジメチルスルホキシド(DMSO)中の各抽出物(実施例1の抽出物〜実施例7の抽出物)のために調製した。処理用ストックを、hDGAT−1アッセイ緩衝液で調製した。処理用ストック(10μL)を、抽出物の最終濃度が50μg/mLとなるように、アッセイ混合物(100μL)に添加した。
用量応答のための3つの異なる濃度(つまり、25μg/mL、50μg/mLおよび100μg/mL)を、ストック溶液の連続希釈により、実施例1の抽出物のために調製した。
試験サンプルを、以下のように調製した。20mg/mLのストック溶液を、100%ジメチルスルホキシド(DMSO)中の各抽出物(実施例1の抽出物〜実施例7の抽出物)のために調製した。処理用ストックを、hDGAT−1アッセイ緩衝液で調製した。処理用ストック(10μL)を、抽出物の最終濃度が50μg/mLとなるように、アッセイ混合物(100μL)に添加した。
用量応答のための3つの異なる濃度(つまり、25μg/mL、50μg/mLおよび100μg/mL)を、ストック溶液の連続希釈により、実施例1の抽出物のために調製した。
アッセイ
基質混合液(60μL)(上記のとおり)を、100μLのアッセイ全量に添加した。反応を、hDGAT−1含有ミクロソームタンパク質(2.5μg)を添加することにより開始して、10分間37℃で培養した。該反応を、アルカリ性エタノール停止混合液(AESSM)(300μL)を添加して停止させた。該反応は、放射活性を有するトリグリセリド([14C]トリグリセリド)を、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロールの3位の水酸基(OH)へ導入して、放射活性を有する[14C]オレオイル基−CoAを形成させることを含んでおり、これは後に上部のヘプタン相中に抽出される。このように形成した放射活性トリグリセリド生成物を、n−ヘプタン(600μL)を添加して、有機相へ移行させる。この上相のヘプタン(250μL)を、シンチレーション溶液(4mL)に添加して、液体シンチレーション計測器(Packard;1600CA)を用いて、1分当たりの壊変数(dpm)計測値として測定した。%阻害を、ビヒクルに関して計算した。結果を表1に示した。
基質混合液(60μL)(上記のとおり)を、100μLのアッセイ全量に添加した。反応を、hDGAT−1含有ミクロソームタンパク質(2.5μg)を添加することにより開始して、10分間37℃で培養した。該反応を、アルカリ性エタノール停止混合液(AESSM)(300μL)を添加して停止させた。該反応は、放射活性を有するトリグリセリド([14C]トリグリセリド)を、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロールの3位の水酸基(OH)へ導入して、放射活性を有する[14C]オレオイル基−CoAを形成させることを含んでおり、これは後に上部のヘプタン相中に抽出される。このように形成した放射活性トリグリセリド生成物を、n−ヘプタン(600μL)を添加して、有機相へ移行させる。この上相のヘプタン(250μL)を、シンチレーション溶液(4mL)に添加して、液体シンチレーション計測器(Packard;1600CA)を用いて、1分当たりの壊変数(dpm)計測値として測定した。%阻害を、ビヒクルに関して計算した。結果を表1に示した。
用量応答を、実施例1の抽出物のストック溶液をhDGAT−1アッセイ緩衝液で連続希釈して、25μg/mL、50μg/mLおよび100μg/mLの濃度で決定した。結果を表2に示した。
表1:抽出物のhDGAT−1阻害
*IN5530:社内標準化合物(2−((1s,4s)−4−(4−(7,7−ジメチル−7H−ピリミド[4,5−b][1,4]オキサジン−6−イル)フェニル)シクロヘキシル)酢酸
結論:カロフィルム・イノフィルム植物の抽出物(実施例1−5の抽出物および実施例7の抽出)は、hDGTA−1阻害アッセイにおいて活性であることが判った。
結論:カロフィルム・イノフィルム植物の抽出物(実施例1−5の抽出物および実施例7の抽出)は、hDGTA−1阻害アッセイにおいて活性であることが判った。
表2:hDGAT−1阻害アッセイにおける実施例1の抽出物の用量応答
*IN5530:社内標準化合物(2−((1s,4s)−4−(4−(7,7−ジメチル−7H−ピリミド[4,5−b][1,4]オキサジン−6−イル)フェニル)シクロヘキシル)酢酸
結論:実施例1の抽出物は、hDGAT−1阻害アッセイにおいて用量相関性の活性を示した。
結論:実施例1の抽出物は、hDGAT−1阻害アッセイにおいて用量相関性の活性を示した。
実施例9
SCD−1アッセイ
文献[Pharmacol. Res., 618, 28-36(2009)]に記載された方法に従って、アッセイを実施した。この開示内容をアッセイの教示として参照により本明細書に組み込む。
SCD−1アッセイ
文献[Pharmacol. Res., 618, 28-36(2009)]に記載された方法に従って、アッセイを実施した。この開示内容をアッセイの教示として参照により本明細書に組み込む。
SCD−1酵素の調製
SCD−1酵素を、PCT出願公開公報WO2008/074835A1に記述したラット肝臓ミクロソームから調製した。この開示内容をアッセイの教示として参照により本明細書に組み込む。
雄のスプラーグドーリーラット(150−175g)を、2日間絶食させて、次いで3日間低脂肪食餌を与え、SCD−1活性を誘導した。次いで、ラットを屠殺し、ラットの肝臓を摘出して、氷上に静置した。肝臓を、最終的に鋏で細かく切断して、ポリトロンホモジナイザーを使用して、4℃で均質化緩衝液(150mM KCl,250mM スクロース、50mM トリスHCl(pH7.5)、5mM EDTAおよび1.5mM 還元グルタチオン)中で均質化した。均質化物を、4℃、20分間、1500Xgにて遠心分離を行なった。上清を、4℃、20分間、10,000Xgにて2回遠心分離機を行い、収集した。得られた上清を集めて、4℃、60分間、100,000Xgにて遠心分離を行なった。この上清を廃棄し、ミクロソーム残渣を均質化緩衝液に再懸濁して、等分割して−80℃で保存した。再懸濁した残渣のタンパク質含有量を、ブラッドフォード分析によって同定した。
SCD−1酵素を、PCT出願公開公報WO2008/074835A1に記述したラット肝臓ミクロソームから調製した。この開示内容をアッセイの教示として参照により本明細書に組み込む。
雄のスプラーグドーリーラット(150−175g)を、2日間絶食させて、次いで3日間低脂肪食餌を与え、SCD−1活性を誘導した。次いで、ラットを屠殺し、ラットの肝臓を摘出して、氷上に静置した。肝臓を、最終的に鋏で細かく切断して、ポリトロンホモジナイザーを使用して、4℃で均質化緩衝液(150mM KCl,250mM スクロース、50mM トリスHCl(pH7.5)、5mM EDTAおよび1.5mM 還元グルタチオン)中で均質化した。均質化物を、4℃、20分間、1500Xgにて遠心分離を行なった。上清を、4℃、20分間、10,000Xgにて2回遠心分離機を行い、収集した。得られた上清を集めて、4℃、60分間、100,000Xgにて遠心分離を行なった。この上清を廃棄し、ミクロソーム残渣を均質化緩衝液に再懸濁して、等分割して−80℃で保存した。再懸濁した残渣のタンパク質含有量を、ブラッドフォード分析によって同定した。
緩衝液および試薬の調製
SCD−1分析緩衝液の調製:緩衝液は、100mM K2HPO4(Qualigens)および100mM Na2H2PO4・2H2O(Qualigens)(pH7.4)から構成される。
リン酸カリウム緩衝液の調製:緩衝液は、200mM K2HPO4(Qualigens)および200mM KH2PO4(Qualigens)(pH7.0)から成る。
SCD−1分析緩衝液の調製:緩衝液は、100mM K2HPO4(Qualigens)および100mM Na2H2PO4・2H2O(Qualigens)(pH7.4)から構成される。
リン酸カリウム緩衝液の調製:緩衝液は、200mM K2HPO4(Qualigens)および200mM KH2PO4(Qualigens)(pH7.0)から成る。
SCD−1抽出緩衝液の調製:緩衝液は、250mM スクロース(Sigma)、15mMN−アセチルシステイン(Sigma)、5mM MgCl2(Sigma)、0.1mM EDTA(Sigma)、0.15M KCl(Sigma)および62mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)から成る。
β−NADHの調製:β−NADH(Sigma)の20mM ストック溶液を、SCD−1アッセイ緩衝液中で調製して、−70℃で保存した。β−NADHの処理用ストックを、使用直前にアッセイ緩衝液を用いて、該ストックを8mMに希釈して調製した。
ステアロイルco−Aの調製:ステアロイルco−A(Sigma)の1.65mMストック溶液を、SCD−1アッセイ緩衝液において調製して、−70℃で保存した。
放射性カクテルの調製:1μCi/mL ステアロイル(9,103H)CoA(American Radiolabeled Chemicals)(100μL)および1.65mM ステアロイルco−A(144μL)を、SCD−1アッセイ緩衝液(5516μL)に添加した。
β−NADHの調製:β−NADH(Sigma)の20mM ストック溶液を、SCD−1アッセイ緩衝液中で調製して、−70℃で保存した。β−NADHの処理用ストックを、使用直前にアッセイ緩衝液を用いて、該ストックを8mMに希釈して調製した。
ステアロイルco−Aの調製:ステアロイルco−A(Sigma)の1.65mMストック溶液を、SCD−1アッセイ緩衝液において調製して、−70℃で保存した。
放射性カクテルの調製:1μCi/mL ステアロイル(9,103H)CoA(American Radiolabeled Chemicals)(100μL)および1.65mM ステアロイルco−A(144μL)を、SCD−1アッセイ緩衝液(5516μL)に添加した。
マルチスクリーンプレート内の活性炭ベッドの調製
33%の活性炭(Sigma)溶液を、アッセイ緩衝液中で作成した。該溶液(250μL)を、マルチスクリーンプレートの各ウェルに添加した。この炭ベッドを、真空マニホールドにより、該プレートを真空にして形成させた。プレートを使用まで保存した。
33%の活性炭(Sigma)溶液を、アッセイ緩衝液中で作成した。該溶液(250μL)を、マルチスクリーンプレートの各ウェルに添加した。この炭ベッドを、真空マニホールドにより、該プレートを真空にして形成させた。プレートを使用まで保存した。
試験サンプルの調製
試験サンプルを、以下のように調製した。20mg/mLのストック溶液を、100%のジメチルスルホキシド(DMSO)において各抽出物(実施例1の抽出物から実施例4の抽出物)のために調製した。処理用ストックを、SCD−1アッセイ緩衝液中で調製した。この処理用ストック(10μL)を、アッセイ混合物(100μL)に加えて、50μg/mLの抽出物の最終濃度を得た。
試験サンプルを、以下のように調製した。20mg/mLのストック溶液を、100%のジメチルスルホキシド(DMSO)において各抽出物(実施例1の抽出物から実施例4の抽出物)のために調製した。処理用ストックを、SCD−1アッセイ緩衝液中で調製した。この処理用ストック(10μL)を、アッセイ混合物(100μL)に加えて、50μg/mLの抽出物の最終濃度を得た。
アッセイ
ミクロソーム(62.5μg)を、試験サンプルにより15分間処理した。β−NADHストック溶液(25μL)および9,10−3HステアロイルCoAを含有する放射性カクテル(20μL)を添加して、該混合物を、25℃で30分間インキュベートした。この反応を、過塩素酸の添加により停止させた。次いで、該プレートを遠心分離に供して、各ウェルからの上清を、真空マニホールドを用いて、炭ベッドから保存プレートへと送出した。3H2Oを含有する濾液を、シンチレーション溶液(4mL)を入れたシンチレーションバイアルに移して、cpm計測値を、液体シンチレーション計数器を使用して測定した。%阻害を、ビヒクルコントロールを対照として計算した。陽性コントロールを、各実験にてアッセイした。結果を表3に示した。
ミクロソーム(62.5μg)を、試験サンプルにより15分間処理した。β−NADHストック溶液(25μL)および9,10−3HステアロイルCoAを含有する放射性カクテル(20μL)を添加して、該混合物を、25℃で30分間インキュベートした。この反応を、過塩素酸の添加により停止させた。次いで、該プレートを遠心分離に供して、各ウェルからの上清を、真空マニホールドを用いて、炭ベッドから保存プレートへと送出した。3H2Oを含有する濾液を、シンチレーション溶液(4mL)を入れたシンチレーションバイアルに移して、cpm計測値を、液体シンチレーション計数器を使用して測定した。%阻害を、ビヒクルコントロールを対照として計算した。陽性コントロールを、各実験にてアッセイした。結果を表3に示した。
表3:カロフィルム・イノフィルムの抽出のSCD−1阻害
*MF152:標準化合物[Bioorganic & Medical Chemistry Letters, 19, 5214-5217(2009)]。
結論:カロフィルム・イノフィルムの抽出物(実施例4の抽出物から実施例1の抽出物)は、SCD−1阻害アッセイにおいて活性であることが判った。
結論:カロフィルム・イノフィルムの抽出物(実施例4の抽出物から実施例1の抽出物)は、SCD−1阻害アッセイにおいて活性であることが判った。
実施例10
細胞を基にしたトリグリセリド(TG)合成分析
最初のアッセイより選択された実施例1の抽出物を、文献[Pharmacol. Res., 618, 28-36((2009)]に報告された方法により、HepG2細胞中のトリグリセリド合成を阻害するその能力について評価した。この開示内容を、アッセイの教示として参照により本明細書に組み込む。
細胞を基にしたトリグリセリド(TG)合成分析
最初のアッセイより選択された実施例1の抽出物を、文献[Pharmacol. Res., 618, 28-36((2009)]に報告された方法により、HepG2細胞中のトリグリセリド合成を阻害するその能力について評価した。この開示内容を、アッセイの教示として参照により本明細書に組み込む。
緩衝液、試薬および培地の調製
イーグル最小必須培地(EMEM):粉末EMEM(Sigma)の1つの小袋を、1Lの三角フラスコに添加した。空の小袋を、蒸留水(10mL)で濯いだ。粉末を、マグネチックスターラーを使用して、蒸留水(900のmL)に溶解した。炭酸水素ナトリウム(Sigma)(1.5g)、ピルビン酸ナトリウム(Sigma)(10mL)およびペニシリンストレプトマイシン(Gibco)を加えた。適切に混合した後に、pHを7.2に調整して、容量を1Lとした。該培地をフィルター滅菌して4℃で保存した。
イーグル最小必須培地(EMEM):粉末EMEM(Sigma)の1つの小袋を、1Lの三角フラスコに添加した。空の小袋を、蒸留水(10mL)で濯いだ。粉末を、マグネチックスターラーを使用して、蒸留水(900のmL)に溶解した。炭酸水素ナトリウム(Sigma)(1.5g)、ピルビン酸ナトリウム(Sigma)(10mL)およびペニシリンストレプトマイシン(Gibco)を加えた。適切に混合した後に、pHを7.2に調整して、容量を1Lとした。該培地をフィルター滅菌して4℃で保存した。
不活性化ウシ胎児血清(FBS):ウシ胎児血清(Hyclone)を、30分間56℃に予め設定した温浴中に置いた。FBSを、50mLのポリプロピレンチューブに等分(45mL)して、−80℃で保存した。
リン酸塩緩衝食塩水(PBS):PBS(Sigma)の1つ小袋の含量を、蒸留水(900mL)に溶解した。pHを、7.2に調整して、容量を1Lとした。次いで、フィルター殺菌して、−20℃で保存した。
トリプシン−EDTA溶液:トリプシン−EDTA溶液(Sigma)を溶かして、ポリプロピレンチューブ(50mL)に無菌的に等分して(45mL)、−20℃で保存した。
試験サンプルの調製
試験サンプルを、以下のように調製した。20mg/mLのストック溶液を、100%のジメチルスルホキシド(DMSO)において実施例1の抽出物のために調製した。50μg/mLで抽出物の最終濃度を得るために、処理用ストック(10μL)を、アッセイ混合物(100μL)に添加した。
用量応答のための異なる3つの濃度(即ち、25μg/mL、50μg/mLおよび100μg/mL)を、ストック溶液の連続希釈により実施例1の抽出物のために調製した。
試験サンプルを、以下のように調製した。20mg/mLのストック溶液を、100%のジメチルスルホキシド(DMSO)において実施例1の抽出物のために調製した。50μg/mLで抽出物の最終濃度を得るために、処理用ストック(10μL)を、アッセイ混合物(100μL)に添加した。
用量応答のための異なる3つの濃度(即ち、25μg/mL、50μg/mLおよび100μg/mL)を、ストック溶液の連続希釈により実施例1の抽出物のために調製した。
HepG2細胞の培養
HepG2細胞(ATCC番号HB−8065)の凍結バイアルを、37℃で水に溶かした。バイアルの全内容物を、EMEM(9mL)および不活性化ウシ胎児血清(1mL)を有するT−75組織培養フラスコへ移した。フラスコを、37℃で5%CO2に湿度制御されたインキュベータ内でインキュベートした。フラスコを、細胞増殖のために観察した。細胞が〜70%コンフルエントとなった場合に、使用した培地を廃棄して、細胞単層を、PBS(5mL)で洗浄した。全細胞層が覆われるように、トリプシンEDTA溶液(1.5〜2mL)をフラスコに添加した。フラスコから全ての細胞が剥離した時に、10%のウシ胎児血清を加えたEMEM(6mL)を添加して、混合し、均一な細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を、5分間、1000rpmで遠心分離を行ない、細胞残渣を得た。細胞残渣を、10%のウシ胎児血清を含むEMEM(6mL)中に穏やかに分散させた。6つのT−75フラスコを上記のとおりに調製して、細胞懸濁液(1mL)を、各フラスコに添加した。フラスコを、湿度制御されたインキュベータ内で、5%CO2、37℃で24時間培養した。培地を、48時間毎に換えた。72時間までに、フラスコは〜70%のコンフルエントとなり、播種する準備が整った。
HepG2細胞(ATCC番号HB−8065)の凍結バイアルを、37℃で水に溶かした。バイアルの全内容物を、EMEM(9mL)および不活性化ウシ胎児血清(1mL)を有するT−75組織培養フラスコへ移した。フラスコを、37℃で5%CO2に湿度制御されたインキュベータ内でインキュベートした。フラスコを、細胞増殖のために観察した。細胞が〜70%コンフルエントとなった場合に、使用した培地を廃棄して、細胞単層を、PBS(5mL)で洗浄した。全細胞層が覆われるように、トリプシンEDTA溶液(1.5〜2mL)をフラスコに添加した。フラスコから全ての細胞が剥離した時に、10%のウシ胎児血清を加えたEMEM(6mL)を添加して、混合し、均一な細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を、5分間、1000rpmで遠心分離を行ない、細胞残渣を得た。細胞残渣を、10%のウシ胎児血清を含むEMEM(6mL)中に穏やかに分散させた。6つのT−75フラスコを上記のとおりに調製して、細胞懸濁液(1mL)を、各フラスコに添加した。フラスコを、湿度制御されたインキュベータ内で、5%CO2、37℃で24時間培養した。培地を、48時間毎に換えた。72時間までに、フラスコは〜70%のコンフルエントとなり、播種する準備が整った。
アッセイ
HepG2細胞の懸濁液を、10%のウシ胎児血清を含有するEMEM培地中で調製した。細胞数を、血球計を用いて測定して、計測値を、24ウェルプレートについて4x105/mL/ウェルに調整した。該プレートを、湿度制御されたインキュベータ内で5%CO2にて37℃で、細胞がコンフルエントとなるまでインキュベートした。細胞が70〜80%コンフルエントとなった場合に、該培地を廃棄して、10μMの標準化合物(MF−152)または50μg/mLの実施例1の抽出物を含有する新規培地に置きかえた。DMSOを0.1%の最終濃度にて賦形剤ウェルに添加した。該プレートを、〜18時間、終夜インキュベートした。翌日、培地を廃棄して、0.1%のBSA(脂肪酸不含)を加えた標準化合物/抽出物/DMSOを含有するものと置換した。
HepG2細胞の懸濁液を、10%のウシ胎児血清を含有するEMEM培地中で調製した。細胞数を、血球計を用いて測定して、計測値を、24ウェルプレートについて4x105/mL/ウェルに調整した。該プレートを、湿度制御されたインキュベータ内で5%CO2にて37℃で、細胞がコンフルエントとなるまでインキュベートした。細胞が70〜80%コンフルエントとなった場合に、該培地を廃棄して、10μMの標準化合物(MF−152)または50μg/mLの実施例1の抽出物を含有する新規培地に置きかえた。DMSOを0.1%の最終濃度にて賦形剤ウェルに添加した。該プレートを、〜18時間、終夜インキュベートした。翌日、培地を廃棄して、0.1%のBSA(脂肪酸不含)を加えた標準化合物/抽出物/DMSOを含有するものと置換した。
2μCiの14C標識された酢酸を、ウェルあたりに添加して、プレートを、37℃で6時間インキュベートして、その後に培地を廃棄して、脂質を抽出した。
植物抽出物の細胞毒性効果を評価するために、細胞生存試験を、インキュベーション2時間後に、MTS(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−5−(3−カルボキシメトキシフェニル)−2−(4−スルホニル)−2H−テトラゾリウム試薬を使用してパラレルプレート上で実施した。
脂質抽出
抽出を以下のプロトコルのとおりに実行した:
実験終了時に、細胞を、氷冷PBSにより2回洗浄した。細胞を、1mLの氷冷PBS中にこそぎ落とし、4mLのメタノール:クロロホルム(2:1)を含む15mLガラス管へピペットで移して、ボルテックス・ミキサーを用いて攪拌した。該チューブを4000rpmで5分間回して、上清を新しい管に移した。大部分のタンパク質を含有するペレットを廃棄した。50mM クエン酸(1mL)、水(2mL)およびクロロホルム(1mL)を、上記上清に添加して、ボルテックス・ミキサーを使用して撹拌した。混濁した2相の混合物を得た。該チューブを、冷却されていない遠心分離器において、15分間、3500rpmで回転させた。低部にクロロホルム相および上部に水/メタノール相を得た。大部分の沈殿タンパク質からなる2相の間に境界部分が存在する。上部の水/メタノール相を、相境界には触れずに廃棄した。脂質を含有する下部クロロホルム相を、新規チューブに移して、加熱ブロック上で蒸発させた。脂質を、クロロホルム:メタノール(2:1)(200μL)に再溶解した。トリグリセリドを、ヘキサン:ジエチルエーテル:酢酸(85:15:0.5)の溶媒系を使用して、TLCシリカプレート上で単離した。放射性同位体で識別されていないトリグリセリド標準物も同時に行い、さらに全てのスポットをトリグリセリド標準物と同時にスポットした。TLCプレートを、ヨード蒸気に暴露して、トリグリセリドスポットを掻き取って、シンチレーション液(4ml)を含むシンチレーションバイアルに入れた。放射活性を、cpmにて液体シンチレーション計数器で計測し、該阻害を、ビヒクルを基準として計算した。結果を表4に示した。
抽出を以下のプロトコルのとおりに実行した:
実験終了時に、細胞を、氷冷PBSにより2回洗浄した。細胞を、1mLの氷冷PBS中にこそぎ落とし、4mLのメタノール:クロロホルム(2:1)を含む15mLガラス管へピペットで移して、ボルテックス・ミキサーを用いて攪拌した。該チューブを4000rpmで5分間回して、上清を新しい管に移した。大部分のタンパク質を含有するペレットを廃棄した。50mM クエン酸(1mL)、水(2mL)およびクロロホルム(1mL)を、上記上清に添加して、ボルテックス・ミキサーを使用して撹拌した。混濁した2相の混合物を得た。該チューブを、冷却されていない遠心分離器において、15分間、3500rpmで回転させた。低部にクロロホルム相および上部に水/メタノール相を得た。大部分の沈殿タンパク質からなる2相の間に境界部分が存在する。上部の水/メタノール相を、相境界には触れずに廃棄した。脂質を含有する下部クロロホルム相を、新規チューブに移して、加熱ブロック上で蒸発させた。脂質を、クロロホルム:メタノール(2:1)(200μL)に再溶解した。トリグリセリドを、ヘキサン:ジエチルエーテル:酢酸(85:15:0.5)の溶媒系を使用して、TLCシリカプレート上で単離した。放射性同位体で識別されていないトリグリセリド標準物も同時に行い、さらに全てのスポットをトリグリセリド標準物と同時にスポットした。TLCプレートを、ヨード蒸気に暴露して、トリグリセリドスポットを掻き取って、シンチレーション液(4ml)を含むシンチレーションバイアルに入れた。放射活性を、cpmにて液体シンチレーション計数器で計測し、該阻害を、ビヒクルを基準として計算した。結果を表4に示した。
用量応答を、実施例1の抽出物のストック溶液を連続希釈することにより、25μg/mL、50μg/mLおよび100μg/mLの濃度で決定した。結果を表5に示した。
表4:実施例1の抽出物によるトリグリセリド合成の阻害
*MF152:標準化合物
(Bioorganic & Medical Chemistry Letters, 19, 5214-5217(2009))。
結論:実施例1の抽出物は、細胞を基にしたトリグリセリド合成アッセイにおいて活性であることが判った。
(Bioorganic & Medical Chemistry Letters, 19, 5214-5217(2009))。
結論:実施例1の抽出物は、細胞を基にしたトリグリセリド合成アッセイにおいて活性であることが判った。
表5:実施例1の抽出物によるトリグリセリド合成の阻害
* MF152:標準化合物(Bioorganic & Medical Chemistry Letters, 19, 5214-5217(2009))
結論:実施例1の抽出物が、細胞に基づくトリグリセリド合成アッセイにおいて活性であることが判った。
結論:実施例1の抽出物が、細胞に基づくトリグリセリド合成アッセイにおいて活性であることが判った。
生体内試験
生体内試験を、動物実験統制管理委員会(CPCSEA)および動物倫理委員会(IAEC)承認のガイドラインに従って行なった。
生体内試験を、動物実験統制管理委員会(CPCSEA)および動物倫理委員会(IAEC)承認のガイドラインに従って行なった。
実施例11
高脂肪食(HFD)誘導性の体重増加への実施例1の抽出物の効果
げっ歯類動物の高脂肪食(HFD)誘導性肥満モデルは、抗肥満剤の効果を評価するために有用なモデルであることが報告されている[Obesity, 17(12), 2127-2133(2009)]。58%kcalの脂肪を含有する高脂肪食はマウスの肥満の原因となることが報告されている(Metabolism, 47 , 1354-1359(1998))。さらに、高脂肪食で飼育されたマウスは、普通食で飼育されたマウスよりも、有意に高い体重および有意に重い内臓脂肪組織(例えば、精巣上体の脂肪組織、腹膜後方の脂肪組織および腸間膜の脂肪組織)を示す[Life Sciences, 77, 194-204(2005)]。
高脂肪食(HFD)誘導性の体重増加への実施例1の抽出物の効果
げっ歯類動物の高脂肪食(HFD)誘導性肥満モデルは、抗肥満剤の効果を評価するために有用なモデルであることが報告されている[Obesity, 17(12), 2127-2133(2009)]。58%kcalの脂肪を含有する高脂肪食はマウスの肥満の原因となることが報告されている(Metabolism, 47 , 1354-1359(1998))。さらに、高脂肪食で飼育されたマウスは、普通食で飼育されたマウスよりも、有意に高い体重および有意に重い内臓脂肪組織(例えば、精巣上体の脂肪組織、腹膜後方の脂肪組織および腸間膜の脂肪組織)を示す[Life Sciences, 77, 194-204(2005)]。
HFD誘導性体重増加モデルは、様々な天然生成物による抗肥満効果の評価について報告されている(BMC Complementary and Alternative Medicine, 5:9, 1-10, (2005);BMC Complementary and Alternative Medicine, 6:9, 1-9(2006))。
マウスにおけるHFD誘導性体重増加試験を行い、実施例1の抽出物の効果を評価した。
オスのC57BL/6jマウス(社内;Central Animal Facility, Piramal Healthcare Limited, Goregaon, Mumbai, Maharashtra, India)を、HFD(60% kcal,D12492,Research Diets, USA)を用いて2週間馴化させた。体重増加を示すマウスを、試験のために選抜して、各々10匹のマウスからなる処置群へ無作為に分けた。
試験サンプルの調製
実施例1の抽出物の懸濁液を、ポリエチレングリコール400(30%)(PEG 400, Fisher Scientific, India)および0.5%カルボキシメチルセルロース(70%)(CMC, Sigma, America)中で調製した。
実施例1の抽出物の懸濁液を、ポリエチレングリコール400(30%)(PEG 400, Fisher Scientific, India)および0.5%カルボキシメチルセルロース(70%)(CMC, Sigma, America)中で調製した。
アッセイ
実施例1の抽出物を、500mg/kg体重の投薬量で、1日1回経口投与した。オルリスタット(Biocon, India)を、標準薬として使用して、15mg/kg体重の投薬量で、1日に2回経口投与した。別の群の10匹のマウスに、正常なコントロールとして低脂肪食(LFD, 10% kcal, D12450B, Research Diet, USA)を与えた。賦形剤を、10mL/kg体重の投薬量で、HFDおよびLFD対照群に投与した。
実施例1の抽出物を、500mg/kg体重の投薬量で、1日1回経口投与した。オルリスタット(Biocon, India)を、標準薬として使用して、15mg/kg体重の投薬量で、1日に2回経口投与した。別の群の10匹のマウスに、正常なコントロールとして低脂肪食(LFD, 10% kcal, D12450B, Research Diet, USA)を与えた。賦形剤を、10mL/kg体重の投薬量で、HFDおよびLFD対照群に投与した。
この処置を60日間継続した。体重および食餌摂取を、毎日モニターした。体重の%変化(1日目からの体重の%増加)および累積的な食餌摂取データを計算した。61日目に、血液サンプル(〜200μL/マウス)を、イソフルラン麻酔下にて、ヘパリン処理済(50IU/mL)の微小遠心管に収集した。種々の血漿生化学パラメーターを評価するために、血漿を、4℃で10000rpmの遠心分離により分離した。生化学分析を、BS−400自動分析装置(Mindray, China)で行った。その後、マウスを屠殺して、器官/組織を解剖して、肝臓、心臓、腎臓、精巣上体の脂肪および腹膜後方の脂肪を秤量した。データを、一元配置分散分析、その後、ダンネットのポストホックテストにより統計学的有意差を分析し、P<0.05値を有意差とみなした。全ての分析を、Windows(GraphPad Software, San Diego(CA), USA)用のGraphPad Prism version 4.00を用いて行なった。結果を、表6、表7および表8に示した。
表6:マウスにおけるHFD誘導性の体重増加に対する実施例1の抽出物の効果
* p<0.05、** p<0.01、HFD+賦形剤に対する;平均±S.E.M.
HFD+賦形剤群と比較して、実施例1の抽出物は、体重増加量の有意な阻害を示した。
HFD+賦形剤群と比較して、実施例1の抽出物は、体重増加量の有意な阻害を示した。
表8:脂肪組織重量に対する実施例1の抽出物の効果
#全脂肪=精巣上体の脂肪+腹膜後方の脂肪
*p<0.05、**p<0.01、HFD+賦形剤に対する;平均±S.E.M.
実施例1の抽出物は、HFD+賦形剤群と比較した場合に、脂肪組織重量が減少する傾向を示した。
*p<0.05、**p<0.01、HFD+賦形剤に対する;平均±S.E.M.
実施例1の抽出物は、HFD+賦形剤群と比較した場合に、脂肪組織重量が減少する傾向を示した。
グルコース、トリグリセリド、コレステロール、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルブミン、クレアチニンおよび尿素のようなパラメーターに対する血漿生化学分析は、実施例1の抽出物および賦形剤の群間の有意差を示さなかった。臓器重量(心臓、肝臓および腎臓)は、何ら有意差を示さなかった。
結論:HFDのマウスに対する実施例1の抽出物の処置により、体重増加における有意な低下が生じた。体重増加におけるこの低下は、食餌摂取量における有意な低下なしに達成され、さらに歴然とした脂肪組織重量(脂肪量)の低下があった。実施例1の抽出物は、高脂肪食(HFD)誘導性肥満モデルにおいて抗肥満活性を示した。
Claims (18)
- 有効成分として治療上有効量のカロフィルム種の植物由来の抽出物を、少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体と共に含む、組成物。
- 5〜100%のカロフィルム種の植物由来の抽出物を含む、請求項1に記載の組成物。
- カロフィルム種の抽出物が、少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体と共に、生理活性マーカーを含む、請求項1に記載の組成物。
- 有効成分として治療上有効量のカロフィルム・イノフィルム植物から得られた抽出物を、少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体と共に含む、組成物。
- 5〜100%のカロフィルム・イノフィルム植物の抽出物を含む、請求項4に記載の組成物。
- 抽出物が、カロフィルム・イノフィルム植物の樹皮から得られる、請求項4に記載の組成物。
- カロフィルム・イノフィルムの抽出物が、生理活性マーカーを含む、請求項4に記載の組成物。
- 代謝障害のための処置が必要な対象に経口投与される、請求項1または請求項4に記載の組成物。
- 錠剤、カプセル剤または顆粒の形態にある経口投与のために処方される、請求項8に記載の組成物。
- 代謝障害の処置における使用のための、請求項1または請求項4に記載の組成物。
- 代謝障害が、インシュリン耐性、高血糖症、II型糖尿病、肥満、耐糖能低下、高コレステロール血症、脂質異常症、高インスリン血症、アテローム性動脈硬化、多嚢胞性卵巣症候群、冠動脈疾患、メタボリック症候群、高血圧、または異常な血漿リポタンパク質、トリグリセリド類との関連障害もしくはグルコースレベルとの関連障害から選択される、請求項10に記載の使用のための組成物。
- 代謝障害が、II型糖尿病である、請求項11に記載の使用のための組成物。
- 代謝障害が肥満である、請求項11に記載の使用のための組成物。
- 請求項1または請求項4に記載の治療上有効量の組成物を対象に投与することを含む、対象における代謝障害を治療する方法。
- 請求項1または請求項4に記載の組成物が経口投与される、請求項14に記載方法。
- 代謝障害が、インシュリン耐性、高血糖症、II型糖尿病、肥満、耐糖能低下、高コレステロール血症、脂質異常症、高インスリン血症、アテローム性動脈硬化、多嚢胞性卵巣症候群、冠動脈疾患、メタボリック症候群、高血圧、または異常な血漿リポタンパク質、トリグリセリドとの関連障害もしくはグルコースレベルとの関連障害から選択される、請求項14に記載方法。
- 代謝障害がII型糖尿病である、請求項16に記載の方法。
- 代謝障害が肥満である、請求項16に記載の方法。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001192317A (ja) * | 2000-01-06 | 2001-07-17 | Shiseido Co Ltd | マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤 |
JP2001524938A (ja) * | 1996-10-16 | 2001-12-04 | シャーマン ファーマシューティカルズ,インコーポレーテッド | プロアントシアニジンポリマー止瀉組成物の腸溶製剤 |
JP2005272326A (ja) * | 2004-03-23 | 2005-10-06 | A Pharma Kindai Co Ltd | 抗アレルギー剤、抗掻痒剤、及び抗菌剤 |
JP2008081440A (ja) * | 2006-09-27 | 2008-04-10 | Noevir Co Ltd | アロマターゼ活性促進剤 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5211944A (en) * | 1990-10-12 | 1993-05-18 | Shaman Pharmaceuticals, Inc. | Proanthocyanidin polymers having antiviral activity and methods of obtaining same |
US6774141B1 (en) * | 1992-03-31 | 2004-08-10 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services | Calanolide and related antiviral compounds, compositions, and uses thereof |
US6004996A (en) * | 1997-02-05 | 1999-12-21 | Hoffman-La Roche Inc. | Tetrahydrolipstatin containing compositions |
FR2794973B1 (fr) * | 1999-06-18 | 2001-09-14 | Mousny Brigitte | Utilisation d'huile de plantes du genre calophyllum extraite a temperature ambiante dans des compositions cosmetiques, dietetiques et therapeutiques |
FR2886547B1 (fr) * | 2005-06-02 | 2009-06-05 | Boucher Claude Henri Marie Ghi | Composition cosmetique, dietetique, pharmaceutique obtenue a partir d'huile non raffinee exempte d'acides gras trans, d'esters phorboliques, extraite sans solvant |
DK2529626T3 (en) * | 2006-05-01 | 2018-01-22 | Napo Pharmaceuticals Inc | Compositions and Methods for Treating or Preventing Colon Cancer |
KR20090091337A (ko) * | 2006-12-20 | 2009-08-27 | 노파르티스 아게 | Scd 억제제로서의 2-치환 5-원 헤테로사이클 |
FR2915095B1 (fr) * | 2007-04-17 | 2013-08-23 | Diaye Yacine Isabelle Monique N | Creme de soin |
WO2010065528A2 (en) * | 2008-12-02 | 2010-06-10 | Kreations By Kristin, L.C. | Gymnema-containing lip balm compositions and associated methods |
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---|---|---|---|---|
JP2001524938A (ja) * | 1996-10-16 | 2001-12-04 | シャーマン ファーマシューティカルズ,インコーポレーテッド | プロアントシアニジンポリマー止瀉組成物の腸溶製剤 |
JP2001192317A (ja) * | 2000-01-06 | 2001-07-17 | Shiseido Co Ltd | マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤 |
JP2005272326A (ja) * | 2004-03-23 | 2005-10-06 | A Pharma Kindai Co Ltd | 抗アレルギー剤、抗掻痒剤、及び抗菌剤 |
JP2008081440A (ja) * | 2006-09-27 | 2008-04-10 | Noevir Co Ltd | アロマターゼ活性促進剤 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
HOLDSWORTH DK: "Traditional Medicinal Plants of Rarotonga, Cook Islands Part I", INTERNATIONAL JOURNAL OF CRUDE DRUG RESEARCH, vol. 28, no. 3, JPN6016041112, 1990, pages 209 - 218, ISSN: 0003426626 * |
メルクマニュアル 第18版 日本語版, JPN6017007618, 25 April 2007 (2007-04-25), pages 1346 - 1363, ISSN: 0003513136 * |
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