KR20140138275A

KR20140138275A - 대사 장애 치료용 약초 조성물

Info

Publication number: KR20140138275A
Application number: KR1020147028410A
Authority: KR
Inventors: 아르빈드 사크라니; 파리크시트 가이크와드; 아슬람 부르한; 소메쉬 샤르마
Original assignee: 피라말 엔터프라이지즈 리미티드
Priority date: 2012-03-13
Filing date: 2013-03-12
Publication date: 2014-12-03
Also published as: MX2014010926A; RU2014140852A; CA2866260A1; NZ630125A; EP2825183A4; AU2013233930A1; IN2014MN01933A; CN104203258A; JP2015509976A; IL234616A0; US20150050373A1; EP2825183A1; WO2013136257A1

Abstract

본 발명은 칼로필룸 ( Calophyllum ) 종에 속하는 식물 추출물을 활성 성분으로서 치료적 유효량으로, 선택적으로는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는, 약초 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 칼로필룸 이노필룸( Calophyllum inophyllum) 식물로부터 수득한 추출물을 포함하는 약초 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 추출물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 조성물을 사용하여 대사 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 칼로필룸 종 유래의 식물 추출물을 치료적 유효량으로 공지된 치료적 활성제와 조합하여 포함하는, 대사 장애 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

대사 장애 치료용 약초 조성물{HERBAL COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF METABOLIC DISORDERS}

본 발명은 칼로필룸 ( Calophyllum ) 종에 속하는 식물의 추출물을 활성 성분으로서 단독으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 치료적 유효량으로 포함하는 약초 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 대사 장애의 치료에 유용하다. 본 발명은 또한, 약초 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

대사 장애는 신체가 탄수화물, 지질, 단백질, 또는 핵산을 적절하게 대사하지 못할 때 발생하는 장애 또는 결함이다. 대부분의 대사 장애는 유전자 돌연변이로 인해, 세포가 대사 과정을 수행하는 데 필요한 효소들이 상실되거나 또는 제대로 기능을 하지 못해 야기된다. 대사 장애의 예로는, 비만, 체지방 과다, 과지질혈증, 고리포단백혈증(hyperlipoproteinemia), 고혈당증, 고콜레스테롤혈증, 과인슐린혈증, 인슐린 저항, 포도당 과민증(glucose intolerance), 및 진성 당뇨병, 상세하게는 2형 당뇨병을 포함한다.

진성 당뇨병은 개체에서 인슐린을 생성하거나 또는 사용하는 능력에 영향을 미치는 대사 장애이다. 혈당 수치는 당뇨병 환자에서 정상보다 더 높다. 방치된 당뇨병(Uncontrolled diabetes)은 실명, 신부전, 비-외상성 사지 절단 및 조기 심혈관 사망(premature cardiovascular mortality)의 주원인이다. 당뇨병 환자는 또한, 이상지질혈증, 비만, 고혈압 및 포도당 과민증과 같은 위험 인자들로 인해 심혈관 질환이 발병할 위험이 높다.

2형 당뇨병 환자는 혈당 수치를 정기적으로 모니터링하고, 정상 혈당 수치 또는 정상에 가까운 혈당 수치를 유지하는 치료를 계속 받아야 한다. NIDDM의 치료로는, 당뇨병 및 당뇨병 관련 심혈관 합병증의 위험성을 최소화할 수 있는 생활 방식 조정, 자가-케어 조치 및 의약을 포함한다. 다수의 의약들이 NIDDM을 치료하는 데 이용가능하며, 이로는, 메트포르민(metformin); 글리피자이드(glipizide)와 같은 설포닐 우레아; 엑센나타이드(exenatide)　및 리라글루타이드(liraglutide)와 같은 GLP 길항제; 피오글리타존(pioglitazone) 및 로시글리타존(rosiglitazone)과 같은 티아졸리딘다이온(　thiazolidinedione); 시타글립틴(sitagliptin), 삭사글립틴(saxagliptin), 및 빌다글립틴(vildagliptin)과 같은 DPP-IV 저해제; 및 아카보스(acarbose)　및 미글리톨(miglitol)과 같은 알파-글루코시다제 저해제를 포함한다.　

또 다른 주요 대사 장애는 비만으로, 주로 에너지 흡수와 소모 간의 불균형으로 발생한다. 에너지 흡수와 이의 소모 간의 만성적인 격차로 인한 양성적인(positive) 에너지 균형은 체중 증가와 결국에는 비만을 초래한다. 이는 일반적으로 생명을 위협하는 질환은 아니지만, 비만은 세계적으로 주요한 건강상의 문제가 되고 있다. 비만은 고혈압, 이상지질혈증, 2형 당뇨병, 심혈관 질환, 폐쇄성 수면 무호흡증(obstructive sleep apnoea), 골관절염, 및 몇몇 암의 위험성을 증폭시킨다. 비만을 극복하는 가장 보편적인 방법은 생활 방식을 변화시키는 것으로, 구체적으로는 식이요법과 운동을 하는 것이다. 그러나, 유의한 체중 감량을 달성하고 보다 낮은 체중을 유지하는 것은 장기적으로는 어려운 일이다. 나아가, 비만은 약물을 이용해서 조절될 수도 있다. 체중 감량과 일부 심혈관 위험 인자에 긍정적인 결과를 주긴 하지만, 현재까지 개발된 대부분의 항-비만 약물은 승인을 받지 못하였거나 또는 유해 부작용으로 인해 시장에서 철수되어야 하는 것들이다. 시부트라민(sibutramine)이 더 이상 이용가능하지 않기 때문에, 현재로서는 오를리스타트(orlistat)가 장기 복용용으로 승인받은 유일한 항-비만 약물이다. 따라서, NIDDM 및/또는 비만과 같은 대사 장애의 치료를 위한 안전하면서도 효과적인 치료법을 개발하는 것이 여전히 요구되고 있다.

대사 장애 치료용 신규 약물 후보물질을 선별하고 개발하기 위해, 2가지 신규 효소 표적인 다이아실글리세롤 아실트랜스퍼라제-1 (DGAT-1) 및 스테아로일-CoA 데사투라제-1 (stearoyl-CoA desaturase-1; SCD-1)가 이용될 수 있다. 이들 효소는, 체내에서 에너지 저장의 주요 형태인 트리글리세라이드의 합성에 중요한 역할을 한다.

DGAT-1은 과정의 마지막 단계에서 트리글리세라이드의 생합성을 촉매하는 소포체 막-결합 효소로서, 다이아실글리세롤 (DAG) 및 지방 아실-조효소 A (CoA)를 트리글리세라이드로 전환시킨다. 세포적인 요구에서 트리글리세라이드의 생성은 필수적이기 때문에 효소 활성은 모든 유형의 세포에 존재한다. DGAT-1은 장(intestine)과 지방질(adipose)에서는 고도로 발현되며, 간과 근육에서는 낮은 수준으로 발현된다. 이들 조직 (장, 지방질, 간 및 근육) 각각에서의 DGAT-1의 저해는 트리아실글리세롤 합성을 저해할 것이고, 인간 대사 질환에서 지질 축적 과다라는 병리 생리학적 상태를 역행시킬 수 있다 (Expert Opin. Ther. Patents 17(11), 1331-1339, (2007)).

스테아로일-CoA 데사투라제-1 (SCD-1)은 지질 대사 조절에서 주요 효소들 중 하나로서 기술된 바 있으며, 잠재적인 새로운 치료 표적을 대표할 수 있다. SCD-1은 포화 지방산으로부터 단일불포화 지방산의 생합성을 촉매하는 속도-조절 효소이다. SCD-1, 스테아레이트 (C18:0) 및 팔미테이트 (C16:0)의 바람직한 기질은 각각 올레에이트 (C18:1) 및 팔미토일레에이트 (C16:1)로 전환된다. 이들 단일불포화 지방산은 트리글리세라이드, 콜레스테릴 에스테르, 인지질 및 왁스 에스테르를 비롯한 다양한 지질의 주요 구성분으로 간주된다. 실험 동물 연구 결과, 이들 효소의 활성을 저해하거나 또는 감소시키면 비만, 당뇨병 및 관련 합병증의 발병에 대한 저항성이 유도되는 것으로 제시된다 (European Journal of Pharmacology, 618, 28-36, (2009), European Journal of Pharmacology, 650, 663-672, (2011)).

현대 의약 분야에서, 약초 물질 및 식물은 계속해서 약물의 발견과 개발에 중요한 역할을 한다. 천연물은 대규모 구조적 다양성을 제공한다. 분리, 구조 해석(structure elucidation), 스크리닝 및 조합 합성(combinatorial synthesis)을 위한 현대 기술의 이용가능성으로 인해, 식물 제품이 새로운 약물의 소스로서 재활성화되었다. 약초를 기능 식품 및 식이 보조제 형태로 도입하는 것 역시 식물-기재 약물 시장을 변화시키고 있다. 천연물 및 이들의 유사체는 유용한 약물 후보물질로서 개발될 수 있다 (Pharmacol. Res., 60(3):195-206, (2008); Drug Discov. Today, 13(3-4), 161-71, (2009)). 식물-기재 의약에 대한 요구는, 식물 유래의 미정제 산물 또는 가공품이 합성 소분자와 비교해 부작용이 최소이거나 또는 전혀 없는 것으로 여겨짐에 따라, 점점 커가고 있다.

칼로필룸은 약 180종 내지 200종의 열대 상록수로 구성된 현화 식물 속이다. 칼로필룸 종은 칼로필룸 브라실리엔세 ( Calophyllum brasiliense ), 칼로필룸 칼레도니쿰( Calophyllum caledonicum ), 칼로필룸 이노필룸 ( Calophyllum inophyllum ) 및 칼로필 룸 소울라트리(Calophyllum soulattri)를 포함하는 4개의 하위 범주로 이루어진다.

칼로필룸 이노필룸은 중간 크기 내지 큰 크기의 상록수로서, 높이는 평균 25 피트(feet) 내지 65 피트이며, 불규칙한 가지들로 이루어진 넓게 퍼지는 수관(crown)을 가진다. 이는 동아프리카, 인도, 동남아시아, 오스트레일리아, 남태평양 및 하와이 제도가 원산지이다. 이 식물의 서로 다른 의약적 용도는 문헌에 보고된 바 있으며, 예를 들어, 이 식물의 나무껍질을 달인 즙(decoction)은 내출혈, 및 무통 궤양(indolent ulcer)용 세정제로서 사용되는 것으로 보고되어 있다. 또한, 이 식물의 나무 열매(nuts)로부터 수득한 오일은 전통적으로 의약 및 미용 분야에 사용된다. 칼로필룸 이노필룸 씨앗으로부터 추출한 오일은 류마티스 관절염 또는 관절 장애; 가려움; 습진; 머리에 난 뾰루지; 안 질환; 및 신부전에 사용된다 (Dravyaguna-Vijnana. Chaukhambha Bharati Academy, Publisher and distributor of monumental treatise of the east, Varanasi, India, Vol. II, 787, (2003); Chakradatta of Sri Chakrapanidatta. Dwivedy R. (ed.) Chaukhambha sanskrit sansthan, Publishers and distributors of oriental cultural literature, Varanasi, India, pages 280, 354 and 499, (2002)).

본원의 상기에서, 2형 당뇨병 및 비만과 같은 대사 장애의 유병률(prevalence)이 높아지는 것을 고려하여, 대사 장애의 효과적인 치료를 위한 새로운 조성물 및 방법이 계속해서 요구되고 있는 것으로 기술하였다. 사실상, 이들 문제점에 대한 해결책을 구하려는 본 발명의 발명자들의 노력은, 칼로필룸 종에 속하는 식물의 추출물을 포함하며 DGAT-1 및 SCD-1 저해 활성을 가지고 따라서 대사 장애 치료에 유용한 약초 조성물을 제조하였다.

본 발명의 일 측면에 따라, 칼로필룸 종에 속하는 식물 추출물을 활성 성분으로서 치료적 유효량으로, 선택적으로는 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는, 대사 장애 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 측면에 따라, 칼로필룸 브라실리엔세 , 칼로필룸 칼레도니쿰 , 칼로필룸 이노필룸 및 칼로필룸 소울라트리로부터 선택되는 식물 추출물을 활성 성분으로서 치료적 유효량으로, 선택적으로는 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는, 대사 장애 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 칼로필룸 종에 속하는 식물 추출물을 치료적 활성제와 조합하여 사용하기 위한 치료적 유효량으로, 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는, 대사 장애 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 보다 다른 측면에 따라, 칼로필룸 이노필룸의 식물 추출물을 활성 성분으로서 치료적 유효량으로 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는, 대사 장애 치료용 조성물을 제공한다.

또 다른 추가적인 측면에서, 본 발명은, 칼로필룸 종에 속하는 식물 추출물을 활성 성분으로서 치료적 유효량으로, 선택적으로는 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 대사 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 칼로필룸 종에 속하는 식물 추출물을 치료적 유효량으로 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 사상 및 범위 내에서 다양한 변화 및 변형이 당해 기술분야의 당업자에게 명확해질 것이기 때문에, 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 본 발명의 구현예를 나타내며 단지 예시로써 제공될 뿐임을 이해해야 한다. 당해 기술분야의 당업자는 본원의 상세한 설명을 토대로 본 발명을 이의 전체 범위로까지 이용할 수 있다. 하기의 구체적인 구현예는 단지 예시로서 간주되어야 하며, 본 개시내용의 다른 부분들을 어떤 식으로든 한정하는 것이 아니다.

다르게 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 보편적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

명세서 및 첨부된 청구하에서 사용되는 바와 같이, 단수형 ("a", 'an", 및 "the")은 문맥상 다르게 명시되지 않는 한, 복수형을 포함한다.

용어 "대사 장애"는 신체가 탄수화물, 지질, 단백질, 또는 핵산을 적절하게 대사하지 못할 때 발생하는 장애 또는 결함을 지칭한다. 대사 장애로는, 인슐린 저항, 고혈당증, 2형 당뇨병, 비만, 포도당 과민증, 고콜레스테롤혈증, 이상지질혈증, 과인슐린혈증, 아테롬성 동맥경화증 질환, 다낭성 난소 증후군(polycystic ovary syndrome), 관상동맥 질환, 대사 증후군, 고혈압, 또는 비정상적인 혈장 지질단백질, 트리글리세라이드와 관련된 연관 장애, 또는 포도당 수치와 관련된 장애, 예컨대 췌장 베타 세포 재생(pancreatic beta cell regeneration)을 포함한다.

본원에서, 용어 "~을 치료하는", "~을 치료하다" 또는 "치료"는 방지적 (예방적) 및 완화적 처치를 포함한다.

본원에서, 용어 "약학적으로 허용가능한"은 조성물에 사용되는 담체, 희석제, 및/또는 부형제가 제형의 다른 성분들과 융화성이어야 하며 이의 수여자에게 유해하지 않아야 함을 의미한다.

칼로필룸은 약 180종 내지 200종의 열대 상록수로 구성된 현화 식물 속이다. 칼로필룸 종은 칼로필룸 브라실리엔세 ( Calophyllum brasiliense ), 칼로필룸 칼레도 니쿰( Calophyllum caledonicum ), 칼로필룸 이노필룸 ( Calophyllum inophyllum) 및 칼로필룸 소울라트리(Calophyllum soulattri)를 포함하는 4개의 하위 범주로 이루어진다. 용어 "칼로필룸"은 이의 모든 동의어를 포함하는 것으로 의도된다.

용어 "약초 조성물" 또는 "조성물"은 상호호환적으로 사용되며, 칼로필룸 종에 속하는 식물 추출물을 치료적 유효량으로 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 조성물을 지칭할 수 있다. 용어 "단독으로"는, 조성물이 임의의 약학적으로 허용가능한 담체를 첨가하지 않고 칼로필룸 종에 속하는 식물 추출물만 포함함을 추가로 의미할 수 있다. 용어 "조성물"은 넓은 의미에서 간주되어야 하며, 예를 들어, 의도하는 지침에 관한 라벨을 붙인 약제학적 제품으로서 판매되든지, 처방 없이 판매되든지, 또는 식물약학제(phytopharmaceutical)로서 판매되든지 간에, 치료학적 효과를 달성하기 위한 것인 임의의 조성물을 포함하는 것을 주지해야 한다.

본원에서, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 무독성, 불활성 고체, 반-고체, 희석제, 캡슐화재, 또는 임의의 유형의 보조 제형을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예로는, 락토스, 포도당, 및 수크로스와 같은 당; 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 셀룰로스 및 이의 유도체; 맥아; 젤라틴이 있으며; 뿐만 아니라 기타 무독성 융화성 윤활제, 예컨대 소듐 라우릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트, 뿐만 아니라 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 풍미제 및 방향제; 보존제 및 항산화제가 또한 제형자(formulator)의 판단에 따라 조성물에 사용될 수 있다.

본원에서, 용어 "치료적 유효량"은 이상적인 의학적 판단의 범위 내에서, 조절되거나 또는 치료되는 병태에서 긍정적인 변화를 유의하게 유도하기에 충분하지만 임의의 부작용을 피하기에 충분히 낮은, (합리적인 유익/위험 비(benefit/risk ratio)의) 추출물 (예를 들어, "칼로필룸 이노필룸" 추출물) 또는 상기 추출물을 포함하는 조성물의 양을 의미한다. 추출물 또는 조성물의 치료적 유효량은, 2형 당뇨병 또는 비만과 같이 치료되는 특정 병태, 최종 사용자의 연령 및 신체적 상태, 치료/예방되는 병태의 중증도, 치료 기간, 동시수반되는 치료법의 특성, 사용되는 특정한 약학적으로 허용가능한 담체, 및 유사한 인자들에 따라 다를 것이다. 본원에서, 모든 백분율은 다르게 명시되지 않는 한, 중량%이다.

본원에서, 용어 "칼로필룸 이노필룸 추출물" 또는 "칼로필룸 이노필룸의 추출물"은 칼로필룸 이노필룸 식물의 임의의 부분에 존재하는 화합물들의 블렌드를 의미한다. 이러한 화합물들은 식물의 나무껍질, 잔가지, 줄기 및 나무와 같이 식물의 임의의 부분으로부터 당해 기술분야에 잘 공지된 추출 절차를 이용해, 예를 들어 메탄올 또는 에탄올과 같은 저급 알코올, 에틸 아세테이트와 같은 알킬 에스테르, 다이에틸 에테르와 같은 알킬 에테르, 아세톤과 같은 알킬 케톤, 클로로포름, 석유 에테르, 헥산과 같은 유기 용매 및/또는 물과 같은 수성 용매를 사용한 추출 절차를 수행함으로써, 추출될 수 있다. 식물 재료는 또한, 헥산-에틸 아세테이트 (1:1), 클로로포름-메탄올 (1:1) 또는 메탄올-물 (3:1)과 같이 적절한 비율의 용매 혼합물을 사용함으로써 추출될 수도 있다.

본원에서, 용어 "개체"는 동물, 상세하게는 포유류, 보다 상세하게는 인간을 지칭한다.

본원에서, 용어 "포유류"는 인간을 비롯한 포유류 강(class)의 온혈 척추 동물을 지칭하며, 피부에 털이 덮여 있고 암컷에서는 새끼에게 영양분을 공급하기 위한 산유 유선(milk-producing mammary gland)을 특징으로 한다. 용어 포유류로는, 고양이, 개, 토끼, 곰, 여우, 늑대, 원숭이, 사슴, 마우스, 돼지 및 인간과 같은 동물을 포함한다.

일 구현예에서, "칼로필룸 이노필룸 추출물"의 제조 방법은 메탄올을 용매로서 사용하는 것을 수반한다. 예를 들어, 추출물은 메탄올을 용매로서 사용하여 칼로필룸 이노필룸 식물의 분쇄된 나무껍질을 추출함으로써 수득될 수 있다.

일 구현예에서, 칼로필룸 이노필룸 식물의 분쇄된 나무껍질은 서로 다른 비율의 메탄올-물 혼합물을 사용해 추출될 수 있는데, 예를 들어, 메탄올-물 (9:1) 혼합물, 메탄올-물 (3:1) 혼합물 또는 메탄올-물 (1:1) 혼합물이 추출에 사용될 수 있다.

칼로필룸 이노필룸 식물 추출물의 제조 방법은 대규모 제조를 위해 그 규모가 쉽게 증대될 수 있다.

"칼로필룸 이노필룸 추출물"은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 고성능 박층 크로마토그래피 (HPTLC)와 같은 통상적인 기술을 사용해 표준화될 수 있다. 용어 "표준화된 추출물"은 특징적인 추출물에 존재하는 생물활성 성분(들) 또는 생물활성 마커(들)를 확인함으로써 표준화되는 추출물을 지칭한다.

본원에서, 용어 "활성 성분" 또는 "생물활성 성분"은 1종 이상의 생물활성 화합물 (생물활성 마커)을 포함하는 "칼로필룸 이노필룸 추출물"을 지칭한다. 생물활성 성분은 고성능 박층 크로마토그래피 (HPTLC) 또는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)와 같은 다양한 기술을 이용해 확인될 수 있다. 생물활성 마커는 생물활성 가이디드 컬럼 크로마토그래피 정제(bioactivity guided column chromatographic purification) 및 조제용(preparative) 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 칼로필룸 이노필룸 식물 추출물로부터 분리될 수 있다. 화합물은 스펙트럼 데이터 분석에 의해 특징화될 수 있다.

용어 "생물활성 마커"는 허용가능한 정도의 제약학적 활성과 상관관계가 있는 활성 화합물의 특징 (또는 피토케미칼 프로파일)을 밝히는 데 사용된다. 활성 화합물인 "생물활성 마커"는 생물활성 가이디드 컬럼 크로마토그래피 정제 및 HPLC에 의해 칼로필룸 이노필룸 식물 추출물로부터 분리될 수 있다. 분리된 화합물 (생물활성 마커)은 스펙트럼 데이터 분석에 의해 특징화될 수 있다.

추출물의 생물학적 활성 측정은 여러 가지 잘 알려진 생물학적 시험관내 및 생체내 분석법을 이용해 수행될 수 있다. 예를 들어, 추출물의 예비 시험관내 활성 측정은 다이아실 글리세롤아실트랜스퍼라제-1 (DGAT-1) 분석법, 스테아로일-CoA 데사투라제-1 (SCD-1) 분석법 또는 트리글리세라이드 합성 분석법과 같은 분석법을 이용해 수행될 수 있다. 생체내 활성은 고지방 식이요법 (HFD) 유도성 비만 모델과 같은 분석법을 이용해 측정될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명은 치료적 유효량의 칼로필룸 이노필룸 식물 추출물 및 선택적으로는 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약초 조성물을 제공한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 표준화된 칼로필룸 이노필룸 식물 추출물 및 선택적으로는 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약초 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 약초 조성물은 칼로필룸 이노필룸 식물 추출물을 5% 내지 100%로 포함한다.

본 발명의 약초 조성물은 1종 이상의 생물활성 마커를 포함하는 칼로필룸 이노필룸 식물로부터 수득되는 추출물을 5% 내지 100%로 포함한다.

일 구현예에서, 본 발명은 대사 장애 치료용 의약의 제조를 위한, 치료적 유효량의 칼로필룸 이노필룸 식물 추출물을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.

"칼로필룸 이노필룸 추출물"은 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합되고, 치료적 투약 형태로 제형화된다.

치료적 유효량의 칼로필룸 이노필룸 식물 추출물을 포함하는 조성물은 예를 들어, 알약, 정제, 코팅된 정제, 캡슐, 분말, 과립, 엘릭셔 또는 시럽 형태로 경구 투여될 수 있다.

"칼로필룸 이노필룸 추출물"을 5 중량% 내지 100 중량%로 포함하는 경구 조성물은 상기 추출물을 약학적으로 허용가능한 담체(들)와 통상적인 방법에 의해 완전히 혼합함으로써 제조될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 대사 장애 치료용으로 제공된다.

일 구현예에서, 상기 조성물은, 2형 당뇨병, 비만, 포도당 과민증, 고콜레스테롤혈증, 이상지질혈증, 과인슐린혈증, 아테롬성 동맥경화증 질환, 다낭성 난소 증후군(polycystic ovary syndrome), 관상동맥 질환, 대사 증후군, 또는 고혈압으로부터 선택되는 대사 장애 치료용으로 제공된다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 2형 당뇨병의 치료를 위해 제공된다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 비만의 치료를 위해 제공된다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 이상지질혈증의 치료를 위해 제공된다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 비정상적 혈장 지질단백질, 트리글리세라이드와 관련있는 장애와 연관된 대사 장애의 치료를 위해 제공된다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 췌장 베타 세포 재생과 같이 포도당 수치와 관련된 대사 장애의 치료를 위해 제공된다.

보다 다른 구현예에서, 본 발명은 칼로필룸 종 유래의 식물 추출물을 치료적 활성제와 조합하여 사용하기 위한 치료적 유효량으로, 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는, 대사 장애 치료용 조성물을 제공한다.

보다 다른 구현예에서, 본 발명은 칼로필룸 이노필룸 식물 추출물을 치료적 활성제와 조합하여 사용하기 위한 치료적 유효량으로, 선택적으로는 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는, 대사 장애 치료용 조성물을 제공한다.

보다 다른 구현예에서, 치료적 유효량의 칼로필룸 이노필룸 식물 추출물을 포함하는 본 발명의 조성물은 선택적으로는 치료적 활성제와 조합하여 대사 장애 치료용으로 사용될 수 있다.

치료적 활성제는 오를리스타트(orlistat), 피오글리타존(pioglitazone), 로시글리타존(rosiglitazone), 글리벤클라마이드(glibenclamide), 글리피자이드, 글리메페라이드(glimeperide), 레파글리나이드(repaglinide), 나테글리나이드(nateglinide), 또는 메트포르민과 같은 공지된 생물활성 성분들로부터 선택될 수 있다.

본 발명은 또한, 치료적 유효량의 칼로필룸 이노필룸 식물 추출물 및 선택적으로 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 선택적으로는 경구 경로로 투여하는 단계를 포함하는, 대사 장애의 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명의 약초 조성물은 활성 성분, 즉, 추출물을 통상적인 무독성의 약학적으로 허용가능한 담체(들)와 혼합(compounding)함으로써, 분말, 알약, 정제, 코팅된 정제, 펠렛, 과립, 캡슐, 용액, 에멀젼, 현탁액, 엘릭셔, 시럽, 및 사용에 적절한 임의의 다른 형태의 경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 제형은 탈크, 물, 포도당, 락토스, 수크로스, 검 아카시아, 젤라틴, 만니톨, 전분 페이스트, 마그네슘 트리실리케이트, 옥수수 전분, 케라틴, 콜로이드 실리카, 감자 전분, 우레아, 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 셀룰로스와 이의 유도체; 맥아; 젤라틴을 함유하는 것들을 포함하며, 뿐만 아니라 고체, 반고체 또는 액체 형태의 조제물에 사용하기에 적절한 소듐 라우릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 기타 무독성의 융화성 윤활제, 이형제, 코팅제 및 기타 부형제, 및 이외에도 보조제, 안정화제, 증점제 및 착색제가 사용될 수 있다. 정제 또는 캡슐과 같은 고체 조성물의 제조 시, 추출물은 약제학적 담체 (예를 들어, 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 다이칼슘 포스페이트 또는 검과 같은 통상적인 정제 성분) 및 기타 약제학적 희석제 (예를 들어, 물)와 함께 혼합되어, 고체 조성물을 형성한다. 그런 다음, 이 고체 조성물은 본 발명의 조성물을 유효량으로 함유하는 단위 투약 형태로 세분된다. 추출물을 포함하는 정제 또는 알약은 코팅되거나 그렇지 않으면 혼합되어(compounded), 연장된 작용 기간이라는 이점을 제공하는 투약 형태를 제공할 수 있다.

추출물이 경구 투여 또는 주사에 의한 투여를 위해 혼입될 수 있는 액체 형태로는, 수용액, 적절하게 풍미된 시럽, 수성 또는 유성 현탁액, 및 식용 오일 뿐만 아니라 엘릭셔 및 유사한 약제학적 비히클을 포함하는 풍미된 에멀젼을 포함한다. 수성 현탁액용으로 적절한 분산제 또는 현탁화제는 합성 천연 고무, 예컨대 트라가칸트, 아카시아, 알기네이트, 덱스트란, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 또는 젤라틴을 포함한다. 경구 투여용의 액체 조제물은 예를 들어, 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있거나, 또는 사용전에 물이나 기타 적절한 비히클로 재구성되는 건조된 산물로서 제시될 수 있다. 적절한 액체 조제물은, 현탁화제 (예를 들어, 소르비톨 시럽, 메틸 셀룰로스 또는 수소첨가된 식용 지방); 유화제 (예를 들어, 레시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클 (예를 들어, 아몬드 오일, 유성 에스테르 또는 에틸 알코올); 보존제 (예를 들어, 메틸 또는 프로필 p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산); 및 인공 색소 또는 천연 색소 및/또는 감미제와 같은 약학적으로 허용가능한 첨가제와 함께 통상적인 방법으로 제조될 수 있다.

선택되는 투약량 수준은 적용되는 본 발명의 특정 추출물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 적용되는 특정 조성물의 배출 속도, 치료 기간, 조합되어 사용되는 기타 추출물, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 병태, 일반적인 건강상태 및 과거 병력, 및 의료 분야에 잘 알려져 있는 유사 인자들을 비롯한 다양한 인자들에 따라 다를 것이다. 그러나, 일반적으로, 성인 치료에 적용되는 투약량은 전형적으로 일일 0.02 mg 내지 5000 mg 또는 일일 1 mg 내지 1500 mg의 범위일 것이다. 바람직한 투약량은 편의상 단일 투약량으로 제시될 수 있거나, 또는 일일 2회, 3회, 4회 또는 그 이상의 하위-투약량과 같이 적절한 간격으로 투여되는 분할 투약량으로 제시될 수 있다.

본 발명은 본 발명을 예시하고자 제공되지만 이의 범위를 한정하지 않는 하기의 실시예를 참조로 보다 쉽게 이해될 것이다.

실시예

하기의 용어/약어가 실시예에 사용된다:

식물의 추출

칼로필룸 이노필룸의 식물 재료 (나무껍질, 나무, 줄기 및 잔가지)를 인도, 마하라시트라, 뭄바이로부터 수집하였다. 확인을 위해 미세 및 거시 연구를 각각의 식물 재료에서 수행하였다. 칼로필룸 이노필룸 식물의 각각의 부분에 대한 표본은 인도, 마하라시트라, 뭄바이, 고레가온(Goregaon, Mumbai, Maharashtra, India) 소재의 Botany Department, Piramal Healthcare Limited에 보존하였다.

칼로필룸 이노필룸의 식물 재료 (나무껍질, 나무, 줄기 및 잔가지)를 작은 조각으로 자르고, 제습기를 이용해 건조하였다. 그런 다음, 완전히 건조된 재료를 분쇄기를 사용해 조악하게 분쇄하였다.

실시예 1

칼로필룸 이노필룸의 건조되고 분쇄된 식물 재료 (나무껍질) (500 g)를 메탄올 (4 L)을 사용해 45℃에서 3시간 동안 교반함으로써 추출하였다. 이러한 추출 과정은 메탄올 (3.5 L)을 사용해 2회 반복하였다. 추출물을 조합하고 농축 건조하였다. 수율: 115 g (23%).

실시예 1에서 수득한 추출물을 본원에서 "실시예 1의 추출물"로 지칭한다.

실시예 2

칼로필룸 이노필룸의 건조되고 분쇄된 식물 재료 (나무껍질) (100 g)를 메탄올:물 (9:1) (900 mL)을 사용해 45℃에서 3시간 동안 교반함으로써 추출하였다. 이러한 추출 과정은 메탄올:물 (9:1) (700 mL)을 사용해 2회 반복하였다. 추출물을 조합하고 농축하였다. 농축된 물질을 동결-건조기 (Edwards)를 사용해 동결건조하였다. 수율: 17.72 g (17.7%).

실시예 2에서 수득한 추출물을 본원에서 "실시예 2의 추출물"로 지칭한다.

실시예 3

칼로필룸 이노필룸의 건조되고 분쇄된 식물 재료 (나무껍질) (50 g)를 메탄올:물 (3:1) (500 mL)을 사용해 45℃에서 3시간 동안 교반함으로써 추출하였다. 이러한 추출 과정은 메탄올:물 (3:1) (400 mL)을 사용해 2회 반복하였다. 추출물을 조합하고 농축하였다. 농축된 물질을 동결-건조기 (Edwards)를 사용해 동결건조하였다. 수율: 8.2 g (16.4%).

실시예 3에서 수득한 추출물을 본원에서 "실시예 3의 추출물"로 지칭한다.

실시예 4

칼로필룸 이노필룸의 건조되고 분쇄된 식물 재료 (나무껍질) (50 g)를 메탄올:물 (1:1) (500 mL)을 사용해 45℃에서 3시간 동안 교반함으로써 추출하였다. 이러한 추출 과정은 메탄올:물 (1:1) (400 mL)을 사용해 2회 반복하였다. 추출물을 조합하고 농축하였다. 농축된 물질을 동결-건조기 (Edwards)를 사용해 동결건조하였다. 수율: 6.3 g (12.6%).

실시예 4에서 수득한 추출물을 본원에서 "실시예 4의 추출물"로 지칭한다.

실시예 5

칼로필룸 이노필룸의 건조되고 분쇄된 식물 재료 (줄기)를 메탄올 (1:10 w/v)을 사용해 45℃에서 3시간 동안 교반함으로써 추출하였다. 추출물을 여과하였다. 이러한 추출 과정은 메탄올 (1:8 w/v)을 사용해 2회 반복하였다. 추출물을 조합하고 농축하였다. 수율: 6.5%.

실시예 5에서 수득한 추출물을 본원에서 "실시예 5의 추출물"로 지칭한다.

실시예 6

칼로필룸 이노필룸의 건조되고 분쇄된 식물 재료 (잔가지)를 메탄올 (1:10 w/v)을 사용해 45℃에서 3시간 동안 교반함으로써 추출하였다. 이러한 추출 과정은 메탄올 (1:8 w/v)을 사용해 2회 반복하였다. 추출물을 조합하고 농축 건조하였다. 수율: 10%.

실시예 6에서 수득한 추출물을 본원에서 "실시예 6의 추출물"로 지칭한다.

실시예 7

칼로필룸 이노필룸의 건조되고 분쇄된 식물 재료 (나무)를 메탄올 (1:10 w/v)을 사용해 45℃에서 3시간 동안 교반함으로써 추출하였다. 이러한 추출 과정은 메탄올 (1:8 w/v)을 사용해 2회 반복하였다. 추출물을 조합하고 농축 건조하였다. 수율: 10.6%.

실시예 7에서 수득한 추출물을 본원에서 "실시예 7의 추출물"로 지칭한다.

실시예 1의 추출물 내지 실시예 7의 추출물을 4℃ 내지 8℃의 냉장실에서 폴리프로필렌 바이얼에 보관하였다.

약리학적 분석법

칼로필룸 이노필룸 식물 추출물이 DGAT-1 및 SCD-1 효소의 활성을 저해하는 효능은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며 후술하는 다수의 약리학적 분석법으로 결정하였다.

하기의 용어/약어가 실시예에 사용된다:

시험관내 분석법

실시예 8

hDGAT-1 분석법

DGAT-1 분석법은, 그 전체가 분석법의 교시를 위해 원용으로서 포함된 참조문헌인 European Journal of Pharmacology, 650, 663-672, (2011)에 기술된 바와 같이 Sf9 세포주에서 과다발현된 인간 DGAT-1 효소를 사용해 설계하였다.

인간 DGAT -1 ( hDGAT -1) 클론의 클로닝 및 발현

hDGAT-1 ORF 발현 클론 (pDEST 벡터에서 RZPD0839C09146)을 독일 소재의 RZPD사로부터 입수하였다. hDGAT-1 유전자 (NM_012079)를, 앰피실린 내성 마커를 가진 아우토그라파 칼리포르니카 ( Autographa californica ) 핵 다면체 바이러스 (AcNPV)의 강한 다면체 프로모터 하에 pDEST8 벡터에 클로닝하였다. 재조합 플라스미드를, 바큘로바이러스 셔틀 벡터 (bacmid)를 포함하는 형질전환에 의해 DH10BAC 적격 세포(competent cell) (Invitrogen, US)에 도입하고, 생성되는 세포를 Bac-to-Bac 바큘로바이러스 발현 시스템 (Invitrogen, US)에 따라 앰피실린 (100 ㎍/mL), 카나마이신 (50 ㎍/mL) 및 겐타마이신 (10 ㎍/mL)을 함유하는 루리아 브로쓰 (Luria broth; LB) 아가 플레이트에 스트리킹(streaking)하였다. 백색의 콜로니를 골라 상기 항생제들을 함유하는 LB 아가 플레이트에 다시 스트리킹하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이튿날, hDGAT-1 유전자를 함유하는 재조합 bacmid를 가진 분리된 백색 콜로니를, 항생제 (앰피실린 (100 ㎍/mL), 카나마이신 (50 ㎍/mL) 및 겐타마이신 (10 ㎍/mL))을 포함하는 루리아 브로쓰 10 mL에 접종하고, 오비탈 쉐이커(orbital shaker) (New Brunswick)에서 37℃, 200 rpm에서 밤새 인큐베이션하였다. 루리아 브로쓰 10 mL을 취하고, 재조합 bacmid DNA (with hDGAT-1 gene)를 Qiagen mini prep kit를 사용해 제조하고, 나노드랍(nanodrop)을 사용해 정량화하였다. hDGAT-1 유전자를 포함하는 bacmid DNA의 농도는 대략 97 ng/㎕였다.

Sf9 세포를 사용한 형질감염 및 바이러스 증폭

1-3 ㎍의 hDGAT-1 bacmid DNA를, Cellfectin (Invitrogen, US)를 제조업체의 설명에 따라 사용해 6-웰 조직 배양 플레이트에서 Sf9 세포에 형질감염시켰다. 형질감염된 Sf9 세포를, 태아 소 혈청 및 항생제-항진균제 (100 units/mL), 페니실린, (100 ㎍/mL), 스트렙토마이신 설페이트, (0.25 ㎍/mL) 및 암포테리신 B를 포함하지 않는 incomplete Grace's 곤충 배지 (Gibco^®)에서 27℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝난 후, 배지를 10% 태아 소 혈청 (Hyclone) 및 항생제-항진균제 (100 units/mL), 페니실린 (100 ㎍/mL), 스트렙토마이신 설페이트 (0.25 ㎍/mL) 및 암포테리신 B를 포함하는 성장 배지 (Grace's 곤충 배지; (Gibco^®)로 대체하고, 세포를 인큐베이터에서 27℃에서 120시간 동안 더 인큐베이션하였다.

이 인큐베이션 동안에, 바이러스 입자들은 곤충 세포 내에서 형성되고, 분비되었다. 바이러스를 포함하는 상층액은 120시간이 끝날 때, Biofuge statos 원심분리기 (Heraeus 400)를 사용해 1500Xg에서 5분간 원심분리하여 수집하고, 0.22 ㎛ 필터 (Millipore)를 통해 여과하였다. 이를 P1 재조합 바큘로바이러스로서 4℃에서 보관하였다. cont >10⁵ pfu (플라크 형성 유닛)/mL은 제조업체 (Invitrogen 키트)의 프로토콜에 따라 수행한 플라크 분석법에 의해 결정하였다.

P1 재조합 바큘로바이러스는 0.05 내지 0.1의 MOI (감염 다중도)에서 추가로 증폭시켜, 5 mL complete Grace's 곤충 배지에 5x10⁶ Sf9 세포를 포함하는 T-25 플라스크 (Nunc)에서 P2 재조합 바큘로바이러스를 120시간 동안 생성하고, 이어서, 1500Xg에서 5분간 원심분리한 다음, 0.22 ㎛ 필터 (Millipore)를 통해 여과하고, 4℃에서 P2 /(>10⁶ pfu/mL) 재조합 바큘로바이러스로서 보관하였다. 유사하게는, P3 및 P4 재조합 바큘로바이러스를 0.05 내지 0.1의 MOI에서 재감염에 의해 추가로 증폭시켜, P3 재조합 바큘로바이러스 및 P4 재조합 바큘로바이러스를 각각 생성하고, 다음 사용 때까지 4℃에 보관하였다. P4 재조합 바큘로바이러스에 대한 바이러스 적정 농도를 결정하였으며 이는 1x10⁸ pfu/mL인 것으로 확인되었다. P4 (>10⁸ pfu/mL) 재조합 바큘로바이러스를 최종적으로 사용하여, sf9 세포를 5 내지 10의 MOI에서 감염시켰다.

마이크로좀 제조

250 mL의 Grace's 곤충 세포 배지 (Gibco)와 항생제-항진균제 (Gibco^®)를 포함하는 500 mL 스피너(spinner) 플라스크에서 생장시킨 Sf9 세포 (2x10⁶ 세포/mL)를 MOI 5에서 hDGAT-1 재조합 바큘로바이러스 (25 mL)로 감염시켰다. 감염된 세포를 28℃에서 48시간 동안 유지시키고, 세포 펠렛을 실온에서 1000Xg에서 배지를 원심분리시켜 수집하였다. 펠렛을 PBS (pH 7.4)로 세정하여, 잔여 배지를 제거하였다.

그런 다음, 세포는, 1X 양의 프로테아제 칵테일 정제 (Roche) 및 인 하우스 제조된 프로테아제 저해제 혼합물을 포함하는 마이크로좀 제조 완충제 15 mL에서 펠렛을 현탁하여 분해시키고, 27G 니들을 통해 파쇄물을 통과시킨 다음, 4℃에서 온화한 소니케이션을 수행하였다. 세포 찌꺼기(cell debris)를 분리하고, 포스트 핵 상층액 (post nuclear supernatant; PNS), 파쇄물을 4℃에서 Biofuge statos 원심분리기 (Heraeus 400)를 사용해 1000Xg에서 10분간 원심분리하였다. 그런 다음, 수득한 PNS를 4℃에서 Biofuge statos 원심분리기 (Heraeus)를 사용해 1500Xg에서 30분간 원심분리하여, 포스트 미토콘드리아 상층액 (post mitochondrial supernatant; PMS)을 분리하였다. 마지막으로, 초원심분리를 4℃에서 BeckmaTi-rotor를 사용해 100,000Xg에서 1시간 동안 수행하여, 마이크로좀 펠렛을 수득하였다. 순도를 높이기 위해, 펠렛을 프로테아제 저해제 혼합물 (아프로티닌(Aprotinin) (0.8 μM), 펩트사틴 A(pepstatin A) (10 μM) 및 레우펩틴(leupeptin) (20 μM)- Sigma)의 인 하우스 조제물을 포함하는 마이크로좀 제조 완충제에서 2회 세정하였다.

마지막으로, 마이크로좀 펠렛을 마이크로좀 제조 완충제 1.5 mL에 현탁하고, 단백질 농도를 브래드포드 방법(Bradford method)으로 측정하였다.

마이크로좀은 시험관내 분석법을 위해 -70℃에서 각각 100 ㎕의 분취물로 보관하였다.

완충제 및 시약의 제조

스탁 용액

hDGAT-1 분석법 완충제 스탁: pH 7.4의 분석법 완충제는, 0.25 M 수크로스 (Sigma) 및 1 mM EDTA (Sigma)를 150 mM tris HCl (Sigma)에 용해시켜 제조하였다.

정지 용액: 10 mL의 정지 용액을 만들기 위해, 7.84 mL의 이소프로판올 (Qualigens) 및 1.96 mL의 n-헵탄 (Qualigens)을 0.2 mL 탈이온수에 첨가하였다.

A.E.S.S.M (알칼리 에탄올 정지 용액 믹스): 10 mL의 A.E.S.S.M 용액을 만들기 위해, 1.25 mL의 변성 에탄올(denatured ethanol), 1.0 mL의 탈이온수, 및 0.25 mL의 1N NaOH (Qualigens)를 7.5 mL의 정지 용액에 첨가하였다.

섬광액(Scintillation fluid): 2.5 L의 섬광액을 만들기 위해, 1667 mL 톨루엔 (Merck), 833 mL triton X-100 (Sigma), 12.5 g 2,5-다이페닐옥사졸 (PPO; Sigma) 및 500 mg (1,4-비스(5-페닐-2-옥사졸릴) 벤젠 (POPOP; Sigma)을 혼합하였다.

작용 스탁(working stock)

hDGAT-1 분석법 완충제: 0.125%의 BSA (지방산-무첨가, Sigma)를 포함하는 새로 생성된 hDGAT-1 분석법 완충제를 사용 전에 제조하였다.

기질 믹스 제조: 기질 믹스는 2047.5 μM의 1,2-다이올레오일-sn-글리세롤 (19.5 mM; Sigma) 및 280 nCi/mL의 [¹⁴C]올레오일-CoA (0.1 mCi American Radiolabelled Chemicals/mL)를 첨가하여 방금 제조하고, 최종 부피는 hDGAT-1 분석법 완충제를 사용해 1000 ㎕ 이하로 하였다.

hDGAT-1 효소 제조: 효소는 hDGAT-1 분석법 완충제에서 1 mg/mL의 작용 농도(working 농도)로 희석시키고, 2.5 ㎕의 작용 효소 스탁을 hDGAT-1 분석법 (최종 농도 25 ㎍/mL)에 사용하였다.

테스트 샘플의 제조

테스트 샘플은 하기와 같이 제조하였다. 20 mg/mL의 스탁 용액을 각각의 추출물 (실시예 1의 추출물 내지 실시예 7의 추출물)에 대해 100% 다이메틸 설폭사이드 (DMSO)에서 제조하였다. 작용 스탁은 hDGAT-1 분석법 완충제에서 제조하였다. 10 ㎕의 작용 스탁을 100 ㎕의 분석법 혼합물에 첨가하여, 최종 농도가 50 ㎍/mL인 추출물을 수득하였다.

스탁 용액을 단계 희석함으로써, 투약량 반응에 대한 3가지의 서로 다른 농도 (즉, 25 ㎍/mL, 50 ㎍/mL 및 100 ㎍/mL)를 실시예 1의 추출물에 대해 제조하였다.

분석법

60 ㎕의 기질 믹스 (전술한 바와 같음)를 총 분석법 부피 100 ㎕로 첨가하였다. 반응은 마이크로좀 단백질을 함유하는 2.5 ㎍ hDGAT-1을 첨가하여 시작하고, 37℃에서 10분간 인큐베이션하였다. 반응은 300 ㎕의 알칼리 에탄올 정지 용액 믹스 (AESSM)를 첨가하여 정지시켰다. 반응은, 1,2-다이올레오일-sn-글리세롤의 제3의 하이드록실기 (OH)에 방사성 [¹⁴C] 올레오일-CoA를 혼입하여 방사성 트리글리세라이드 ([¹⁴C] 트리글리세라이드)를 생성한 다음, 이를 상부의 헵탄상(heptane phase)으로 추출하는 것을 수반한다. 이렇게 해서 생성된 방사성 트리글리세라이드 산물은 600 ㎕의 n-헵탄을 첨가함으로써 유기상으로 분리하였다. 상부 헵탄 중 250 ㎕를 4 mL의 섬광액에 첨가하고, 액체 섬광 계수기 (Packard; 1600CA)를 사용해 분 당 붕괴수 (dpm)로서 측정하였다. 저해%는 비히클군을 기준으로 계산하였다. 그 결과는 표 1에 제시한다.

투약량 반응은 실시예 1의 추출물의 스탁 용액을 hDGAT-1 분석법 완충제에 단계 희석시킴으로써 25 ㎍/mL, 50 ㎍/mL 및 100 ㎍/mL의 농도에서 결정하였다. 그 결과는 표 2에 제시한다.

추출물의 hDGAT-1 저해
Sr. No.	샘플	농도	hDGAT-1의 저해%
01	실시예 1의 추출물	50 ㎍/mL	72.15
02	실시예 2의 추출물	50 ㎍/mL	85.81
03	실시예 3의 추출물	50 ㎍/mL	82.37
04	실시예 4의 추출물	50 ㎍/mL	85.84
05	실시예 5의 추출물	50 ㎍/mL	42.04
06	실시예 6의 추출물	50 ㎍/ml	16.07
07	실시예 7의 추출물	50 ㎍/mL	48.50
08	IN 5530*	20 nM	46.27
09	IN 5530*	0.1 μM	66.04
*IN5530 : 인-하우스 표준 화합물 (2-((1s,4s)-4-(4-(7,7-다이메틸-7H-피리미도 [4,5-b][1,4]옥사진-6-일)페닐)사이클로헥실)아세트산).

결론: 칼로필룸 이노필룸 식물의 추출물 (실시예 1 내지 5의 추출물 및 실시예 7의 추출물)은 hDGTA-1 저해 분석법에서 활성인 것으로 확인되었다.

hDGAT-1 저해 분석법에서 실시예 1의 추출물의 투약량-반응
Sr. No.	샘플	농도	hDGAT-1의 저해%
01	실시예 1의 추출물	25 ㎍/mL	79.04
02	실시예 1의 추출물	50 ㎍/mL	87.66
03	실시예 1의 추출물	100 ㎍/mL	90.48
04	IN5530 (Std. com.)	20 nM	48.82
05	IN5530 (Std. com.)	0.1 μM	74.26
*IN5530 : 인-하우스 표준 화합물 (2-((1s,4s)-4-(4-(7,7-다이메틸-7H-피리미도 [4,5-b][1,4]옥사진-6-일)페닐)사이클로헥실)아세트산).

결론: 실시예 1의 추출물은 hDGAT-1 저해 분석법에서 투약량-연관 활성을 나타내었다.

실시예 9

SCD-1 분석법

분석법은, 그 개시내용이 분석법의 교시를 위해 원용에 의해 포함된 참조문헌인 European Journal of Pharmacology, 618, 28-36, (2009)에 기술된 방법에 따라 수행하였다.

SCD -1 효소의 제조

SCD-1 효소는, 그 개시내용이 분석법의 교시를 위해 원용에 의해 포함된 PCT 공개 출원 WO2008/074835A1에 기술된 바와 같이 래트 간 마이크로좀으로부터 제조하였다.

수컷 Sprague-Dawley 래트 (150 g 내지 175 g)를 2일간 단식시킨 다음, 3일간 저 지방 식이요법으로 급식시켜, SCD-1 활성을 유도하였다. 그런 다음, 래트를 안락사시키고, 이들의 간을 적출하여 얼음 위에 두었다. 가위로 간을 잘게 자른 다음, 4℃에서 Polytron 균질기를 사용해 균질화 완충제 (150 mM KCl, 250 mM 수크로스, 50 mM tris-HCl, pH 7.5, 5 mM EDTA, 및 1.5 mM 환원 글루타티온)에서 균질화하였다. 균질물을 4℃, 1500Xg에서 20분간 원심분리하였다. 상층액을 수집하고, 각각 4℃, 10,000Xg에서 20분간 2회 원심분리하였다. 생성되는 상층액을 수집하고, 4℃, 10,000Xg에서 60분간 원심분리하였다. 상층액을 폐기하고, 마이크로좀 펠렛을 균질화 완충제에 재현탁하고, 분취하고, -80℃에 보관하였다. 재현탁된 펠렛의 단백질 함량을 브래드포드 분석법으로 확인하였다.

완충제 및 시약의 제조

SCD-1 분석법 완충제의 제조: 완충제는 100 mM K₂HPO₄ (Qualigens) 및 100 mM Na₂H₂PO₄.2H₂O (Qualigens), pH 7.4로 구성되었다.

포타슘 포스페이트 완충제의 제조: 완충제는 200 mM K₂HPO₄ (Qualigens), and 200 mM KH₂PO₄ (Qualigens), pH 7.0으로 구성되었다.

SCD-1 추출 완충제의 제조: 완충제는 250 mM 수크로스 (Sigma), 15 mM N-아세틸 시스테인 (Sigma), 5 mM MgCl₂ (Sigma), 0.1 mM EDTA (Sigma), 0.15 M KCl (Sigma), 및 포타슘 포스페이트 완충제 62 mM, pH 7.0으로 구성되었다.

β-NADH의 제조: β-NADH (Sigma)의 20 mM 스탁 용액은 SCD-1분석법 완충제에서 제조하고, -70℃에 보관하였다. β-NADH의 작용 스탁은, 상기 스탁을 사용 전에 분석법 완충제를 사용해 8 mM로 희석함으로써 제조하였다.

스테아로일 co-A의 제조: 스테아로일 co-A (Sigma)의 1.65 mM 스탁 용액은 SCD-1 분석법 완충제에서 제조하고, -70℃에 보관하였다.

방사성 칵테일의 제조: 100 ㎕의 1μCi/mL 스테아로일 (9,10³H) CoA (American Radiolabeled Chemicals) 및 144 ㎕의 1.65 mM 스테아로일 co-A를 5516 ㎕의 SCD-1 분석법 완충제에 첨가하였다.

멀티스크린 플레이트에서 활성탄 베드(activated charcoal bed)의 제조

33% 활성탄 (Sigma) 용액을 분석법 완충제에서 제조하였다. 용액 250 ㎕를 멀티스크린 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 진공 매니폴드(vacuum manifold)를 통해 플레이트에 진공을 적용하여 챠콜 베드(charcoal bed)를 형성하였다. 플레이트는 사용 시까지 보관하였다.

테스트 샘플의 제조

테스트 샘플을 하기와 같이 제조하였다. 20 mg/mL의 스탁 용액을 각각의 추출물 (실시예 1의 추출물 내지 실시예 4의 추출물)에 대해 100% 다이메틸 설폭사이드 (DMSO)에서 제조하였다. 작용 스탁은 SCD-1 분석법 완충제에서 제조하였다. 10 ㎕의 작용 스탁을 100 ㎕의 분석법 혼합물에 첨가하여, 최종 농도가 50 ㎍/mL인 추출물을 수득하였다.

분석법

마이크로좀 (62.5 ㎍)을 테스트 샘플로 15분간 처리하였다. 이후, β-NADH 작용 스탁 25 ㎕ 및 9,10-³H 스테아로일 CoA를 포함하는 방사성 칵테일 20 ㎕를 첨가하고, 혼합물을 25℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 과염소산을 첨가하여 반응을 종료시켰다. 그런 다음, 플레이트를 원심분리하고, 각각의 웰의 상층액을 진공 매니폴드를 사용해 챠콜 베드에 통과시켜 레저보어 플레이트(reservoir plate)로 옮겼다. ³H₂O를 포함하는 여과물을, 4 mL의 섬광액을 포함하는 섬광 바이얼에 옮기고, 액체 섬광 계수기를 사용해 cpm 계수를 측정하였다. % 저해는 비히클 대조군을 기준으로 계산하였다. 각각의 실험에서 양성 대조군 역시 분석하였다. 그 결과는 표 3에 제시한다.

칼로필룸 이노필룸 추출물의 SCD-1 저해
Sr. No.	샘플	농도	SCD-1의 저해%
01	실시예 1의 추출물	50 ㎍/mL	56.7
02	실시예 2의 추출물	50 ㎍/mL	63.6
03	실시예 3의 추출물	50 ㎍/mL	65.7
04	실시예 4의 추출물	50 ㎍/mL	68.0
05	MF - 152*	100 nM	56.1
*MF-152 : 표준 화합물 [Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 19, 5214-5217, (2009)].

결론: 칼로필룸 이노필룸 추출물 (실시예 1의 추출물 내지 실시예 4의 추출물)은 SCD-1 저해 분석법에서 활성인 것으로 확인되었다.

실시예 10

세포 기재의 트리글리세라이드 (TG) 합성 분석법

1차 분석법으로부터 선택한 실시예 1의 추출물을, 그 개시내용이 분석법의 교시를 위해 원용으로 포함된 참조문헌인 European Journal of Pharmacology, 618, 28-36, (2009)에 기술된 방법대로, HepG2 세포에서 트리글리세라이드 합성을 저해하는 능력에 대해 평가하였다.

완충제 , 시약 및 배지의 제조

Eagle's minimum essential 배지 (EMEM): 분말 형태의 EMEM (Sigma) 한 봉지를 1 L 원뿔형 플라스크에 첨가하였다. 빈 봉지를 10 mL의 증류수로 헹구었다. 분말을 자기 교반기를 사용해 900 mL 증류수에서 용해시켰다. 1.5 g 소듐 바이카르보네이트 (Sigma), 10 mL 소듐 피루베이트 (Sigma) 및 1 mL 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco)를 또한 보충하였다. 적절히 혼합한 후, pH를 pH 7.2로 조정하고, 부피를 1 L까지 맞추었다. 배지를 여과 멸균하고, 4℃에 보관하였다.

불활성화된 태아 소 혈청 (FBS): 태아 소 혈청 (Hyclone)을 56℃로 미리 설정해둔 수조에서 30분간 보관하였다. 그런 다음, FBS를 50 mL 폴리프로필렌 튜브에 분취하고 (45 mL), -80℃에 보관하였다.

인산염 완충 식염수 (PBS): 한 봉지의 PBS (Sigma)의 내용물을 900 mL 증류수에 용해시켰다. pH를 pH 7.2로 조정하고, 부피를 1 L까지 맞추었다. 그런 다음, 이를 여과 멸균하고, -20℃에 보관하였다.

트립신-EDTA 용액: 트립신-EDTA 용액 (Sigma)을 해동시키고, 50 mL 폴리프로필렌 튜브에 무균 분취한 다음 (45 mL), -20℃에 보관하였다.

테스트 샘플의 제조

테스트 샘플을 하기와 같이 제조하였다. 20 mg/mL의 스탁 용액을 실시예 1의 추출물에 대해 100% 다이메틸 설폭사이드 (DMSO)에서 제조하였다. 10 ㎕의 작용 스탁을 100 ㎕의 분석법 혼합물에 첨가하여, 최종 농도가 50 ㎍/mL인 추출물을 수득하였다.

HepG2 세포의 배양

냉동된 HepG2 세포 (ATCC No. HB-8065) 바이얼 하나를 37℃에서 물에 해동시켰다. 바이얼의 모든 내용물을 9 mL EMEM 및 1 mL 불활성화된 태아 소 혈청이 든 T-75 조직 배양 플라스크에 옮겼다. 플라스크를 37℃, 5% CO₂ 습도 조절 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 세포 생장에 대해 플라스크를 관찰하였다. 세포가 (플라스크를) 약 70% 정도 채울 만큼 생장했을 때, 사용한 배지를 폐기하고, 세포 단층을 5 mL의 PBS로 세정하였다. 1.5 mL 내지 2 mL의 트립신 EDTA 용액을 전체 세포 층을 덮을 정도로 플라스크에 첨가하였다. 세포가 모두 플라스크에서 떼어졌을 때, 10% 태아 소 혈청이 보충된 EMEM 6 mL을 첨가하고 혼합하여, 균일한 세포 현탁액을 수득하였다. 세포 현탁액을 1000 rpm에서 5분간 원심분리하여, 세포 펠렛을 수득하였다. 세포 펠렛을 10% 태아 소 혈청이 보충된 EMEM 6 mL에 부드럽게 분산시켰다. 6개의 T-75 플라스크를 전술한 바와 같이 만들고, 세포 현탁액 1 mL을 각각의 플라스크에 첨가하였다. 플라스크를 37℃, 5% CO₂ 습도 조절 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 48시간마다 배지를 교환하였다. 72시간 후, 플라스크는 약 70% 정도 채워졌으며 플레이팅할 준비가 되었다.

분석법

HepG2 세포의 현탁액을 10% 태아 소 혈청을 포함하는 EMEM 배지에서 제조하였다. 혈구계수기(haemocytometer)를 사용해 세포의 수를 계수하고, 그 수를 24웰 플레이트용으로 4x10⁵ 세포/mL/well로 조정하였다. 병행하는 플레이트 (parallel plate)를 또한, 실험 종료 시에 수행할 생존율 시험용으로 제작하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 습도 조절 인큐베이터에서 세포로 채워질 때까지 인큐베이션하였다. 세포가 70% 내지 80% 정도 채워졌을 때, 배지를 폐기하고, 표준 화합물 (MF-152)을 10 μM로 포함하는 신선한 배지 또는 실시예 1의 추출물을 50 ㎍/mL로 포함하는 신선한 배지로 교환하였다. DMSO를 최종 농도 0.1%에서 비히클 웰에 첨가하였다. 플레이트를 약 18시간 동안 밤새 인큐베이션하였다. 이튿날, 배지를 폐기하고, 0.1% BSA (지방산-무첨가)가 보충된 표준 화합물/추출물/DMSO를 포함하는 배지로 교환하였다.

¹⁴C 표지된 아세트산 2 μCi를 마찬가지로 웰 당 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 6시간 더 인큐베이션한 다음, 배지를 폐기하고, 지질을 추출하였다.

식물 추출물의 세포독성 효과를 평가하기 위해, 2시간의 인큐베이션 후, 세포의 생존율 시험을 MTS (3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포닐)-2H-테트라졸륨) 시약을 사용하여 병행하는 플레이트에서 수행하였다.

지질 추출

추출은 하기의 프로토콜에 따라 수행하였다:

실험 종료 시, 세포를 차가운 PBS로 2회 세정하였다. 세포를 1 mL 차가운 PBS에 긁어내고, 4 mL 메탄올:클로로포름 (2:1)을 포함하는 15 mL 유리 튜브에 파이펫팅한 다음, 보텍스 믹서(vortex mixer)를 사용해 교반하였다. 튜브를 4000 rpm에서 5분간 회전시키고, 상층액을 새 튜브에 옮겼다. 대부분 단백질로 이루어진 펠렛은 폐기하였다. 1 mL의 50 mM 시트르산, 2 mL의 물 및 1 mL의 클로로포름을 상기 상층액에 첨가하고, 보텍스 믹서를 사용해 교반하였다. 2개의 층(phase)으로 이루어진 혼탁한 혼합물을 수득하였다. 튜브를 비-냉각 원심분리기에서 3500 rpm에서 15분간 회전시켰다. 하부의 클로로포름 층과 상부의 물/메탄올 층을 수득하였다. 대부분 침전된 단백질로 이루어진 사이층(inter-phase)이 또한, 2개의 층들 사이에 존재하였다. 상부의 물/메탄올 층을 폐기하되, 사이층은 건드리지 않았다. 지질을 포함하는 하부의 클로로포름 층을 새 튜브에 옮기고, 히팅 블록(heating block) 위에서 증발시켰다. 지질을 200 ㎕의 클로로포름:메탄올 (2:1)에 재용해시켰다. 트리글리세라이드는, 헥산: 다이에틸에테르: 아세트산 (85:15:0.5)으로 구성된 용매 시스템을 사용해 TLC 실리카 플레이트에서 분리하였다. 비-방사성표지된 트리글리세라이드 표준도 함께 실험하였으며, 뿐만 아니라 모든 스폿(spot)을 트리글리세라이드 표준으로 공동-스포팅(co-spotting)하였다. TLC 플레이트를 요오드 증기에 노출시키고, 트리글리세라이드 스폿을 긁어낸 다음, 섬광액 4 mL을 함유하는 섬광 바이얼로 옮겼다. 액체 섬광 계수기에서 방사능을 cpm 단위로 측정하고, 저해는 비히클군을 기준으로 계산하였다. 그 결과는 표 4에 제시한다.

실시예 1의 추출물의 스탁 용액을 단계 희석함으로써, 투약량 반응을 25 ㎍/mL, 50 ㎍/mL 및 100 ㎍/mL에서 측정하였다. 그 결과는 표 5에 제시한다.

실시예 1의 추출물에 의한 트리글리세라이드 합성의 저해
Sr. No.	샘플	농도	Tg의 저해%
01	실시예 1의 추출물	50 ㎍/mL	69.65
02	MF-152	10 μM	34.19
*MF-152: 표준 화합물 (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 19, 5214-5217, (2009)).

결론: 실시예 1의 추출물은 세포 기재의 트리글리세라이드 합성 분석법에서 활성인 것으로 확인되었다.

실시예 1의 추출물에 의한 트리글리세라이드 합성의 저해
Sr. No.	샘플	농도	트리글리세라이드의 저해%	독성%
01	실시예 1의 추출물	25 ㎍/mL	31.12	12
02	실시예 1의 추출물	50 ㎍/mL	55.37	46
03	실시예 1의 추출물	100 ㎍/mL	84.12	66
04	MF-152	10 μM	35.13	0
*MF-152 : 표준 화합물 (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 19, 5214-5217, (2009)).

결론: 실시예 1의 추출물은 트리글리세라이드 합성의 투약량-연관 저해를 보여주었다.

생체내 연구

동물 실험 윤리 위원회(Institutional Animal Ethics Committee; IAEC)의 승인을 받고 동물 실험의 관리 및 감독을 목적으로 하는 위원회 (Committee for the Purpose of Control and Supervision of Experiments on Animals; CPCSEA)의 가이드라인에 따라 생체내 실험을 수행하였다.

실시예 11

고지방 식이요법 (HFD)-유도성 체중 증가에 대한 실시예 1의 추출물의 효과

고지방 식이요법 (HFD) 유도성 비만에 대한 설치류 모델은 항-비만 제제의 효능을 평가하는 데 있어 유용한 모델인 것으로 보고된 바 있다 (비만, 17(12), 2127-2133, (2009)). 58% kcal의 지방을 함유한 고-지방 식이요법으로 급식한 경우, 마우스에서 비만이 유발된 것으로 보고된 바도 있다 (대사, 47, 1354-1359, (1998)). 또한, 고-지방 식이요법으로 급식한 마우스는 정상적인 식이요법으로 급식한 마우스보다 상당히 더 높은 체중과 상당히 더 중량감 있는 내장 지방 조직 (예를 들어, 부고환 조직(epididymal tissue), 복막후 조직(retroperitoneal tissue) 및 장간막 지방 조직(mesenteric adipose tissue))을 나타내었다 (Life Sciences, 77, 194-204, (2005)).

HFD에 의해 유도되는 체중 증가 모델은 여러 가지 천연물의 항-비만 효과를 평가하기 위한 것으로 보고되었다 (BMC Complementary and Alternative Medicine, 5:9, 1-10, (2005); BMC Complementary and Alternative Medicine, 6:9, 1-9, (2006)).

HFD에 의해 유도되는 체중 증가 연구를 마우스에서 수행하여, 실시예 1의 추출물의 효능을 평가하였다.

수컷 C57BL/6j 마우스 (in-house; Central Animal Facility, Piramal Healthcare Limited, Goregaon, Mumbai, Maharashtra, India)를 HFD (60% Kcal, D12492, Research Diets, USA)에 2주간 적응시켰다. 연구를 위해 체중이 증가한 마우스를 선별하고, 각각 10마리의 마우스로 구성된 치료군으로 무작위로 나누었다.

테스트 샘플의 제조

실시예 1의 추출물의 현탁액을 폴리에틸렌글리콜 400 (30%) (PEG 400, Fisher Scientific, India) 및 0.5% 카르복시 메틸셀룰로스 (70%) (CMC, Sigma, USA)에서 제조하였다.

분석법

실시예 1의 추출물은 500 mg/kg 체중의 투약량으로 1일 1회 경구 투여하였다. 오를리스타트(orlistat) (Biocon, India)를 표준 약물로 사용하고, 15 mg/kg 체중의 투약량으로 1일 2회 경구 투여하였다. 10마리의 마우스로 구성된 별도의 군에는 정상 대조군으로서 저지방 식이요법 (LFD, 10% kcal, D12450B, Research Diet, USA)을 제공하였다. 비히클을 HFD 대조군 및 LFD 대조군에 10 mL/kg 체중의 투약량으로 투여하였다.

치료는 60일 동안 지속하였다. 체중 및 음식 섭취를 매일 모니터링하였다. 체중 변화% (제1 일로부터의 체중 증가%) 및 누적되는 음식 섭취 데이터를 계산하였다. 61일째에, 이소플루란(isoflurane) 마취 하에 혈액 샘플 (~200 ㎕/마우스)을 헤파린처리된 (50 IU/mL) 마이크로-원심분리 튜브에 수집하였다. 4℃, 10000 rpm에서 원심분리하여 혈장을 분리하여, 다양한 혈장 생화학 변수를 평가하였다. 생화학 분석은 BS-400 자동분석기(autoanalyzer) (Mindray, China)에서 수행하였다. 이어서, 마우스를 안락사시킨 다음, 장기/조직을 적출하고, 간, 심장, 신장, 부고환 지방 및 복막후 지방의 무게를 재었다. 모든 데이터는 one-way ANOVA와 이어서 Dunnet's post-hoc 테스트에 의해 통계학적 유의성을 분석하고, P < 0.05인 값을 유의한 것으로 간주하였다. 모든 분석은 Windows용 GraphPad Prism version 4.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)에서 수행하였다. 그 결과는 표 6, 표 7 및 표 8에 제시한다.

마우스에서 HFD 유도성 체중 증가에 대한 실시예 1의 추출물의 효과
군	체중 (g) (제0 일)	체중 (g) (제60 일)	체중 변화%
LFD + 비히클	24.8 ± 0.7	27.1 ± 0.6	9.66 ± 1.56**
HFD + 비히클	26.5 ± 0.6	32.9 ± 1.0	24.28 ± 1.15
HFD + 실시예 1의 추출물	26.5 ± 0.6	30.6 ± 1.4	14.10 ± 3.57*
HFD + 오를리스타트	26.4 ± 0.4	30.9 ± 0.9	16.74 ± 2.70
* p < 0.05, ** p < 0.01 Vs. HFD + 비히클; 평균 ± S.E.M.

실시예 1의 추출물은 HFD + 비히클 군과 비교해 체중 증가를 유의하게 저해시키는 것으로 나타났다.

누적되는 음식 섭취에 대한 실시예 1의 추출물의 효과
군	누적되는 음식 섭취 (g /마우스) (제60 일)
LFD + 비히클	120.3 ± 3.3
HFD + 비히클	110.5 ± 2.8
HFD + 실시예 1의 추출물	105.8 ± 3.1
HFD + 오를리스타트	119.7 ± 4.7
평균 ± S.E.M.

누적되는 음식 섭취의 유의한 감소는 HFD + 비히클 군과 비교해 실시예 1의 추출물에서 관찰되지 않았다.

지방 조직의 중량에 대한 실시예 1의 추출물의 효과
군	부고환 지방 (g)	복막후 지방 (g)	총 지방^# (g)
LFD + 비히클	0.43 ± 0.03**	0.17 ± 0.01**	0.60 ± 0.05**
HFD + 비히클	1.39 ± 0.13	0.65 ± 0.08	2.03 ± 0.20
HFD + 실시예 1의 추출물	1.03 ± 0.15	0.45 ± 0.08	1.48 ± 0.23
HFD + 오를리스타트	1.07 ± 0.10	0.42 ± 0.05*	1.49 ± 0.15
^#총 지방 = 부고환 지방 + 복막후 지방, * p < 0.05, ** p < 0.01 Vs. HFD + 비히클; 평균 ± S.E.M.

실시예 1의 추출물은 HFD + 비히클 군과 비교해 지방 조직의 중량을 감소시키는 성향을 나타내었다.

포도당, 트리글리세라이드, 콜레스테롤, 알라닌 아미노트랜스퍼라제, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제, 알부민, 크레아틴, 및 우레아와 같은 변수에 대한 혈장 생화학 분석은, 실시예 1의 추출물 군과 비히클 군 사이에 유의한 차이를 나타내지 않았다. 장기의 중량 (심장, 간, 및 신장)은 임의의 유의한 차이를 나타내지 않았다.

결론: 실시예 1의 추출물을 HFD 마우스에 처리하면, 유의한 체중 증가 감소를 유도하였다. 이러한 체중 증가 감소는 음식물 섭취를 유의하게 줄이지 않은 조건에서 달성되었으며, 지방 조직의 중량 (체지방 질량) 감소에 대한 증거이기도 하였다. 실시예 1의 추출물은 고지방 식이요법 (HFD)으로 유도된 비만 모델에서 항-비만 활성을 나타내었다.

Claims

칼로필룸(Calophyllum) 종 유래의 식물 추출물을 활성 성분으로서 치료적 유효량으로 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물이 칼로필룸 종 유래의 식물 추출물을 5% 내지 100%로 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서,
칼로필룸 종의 추출물이 생물활성 마커를 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는, 조성물.
칼로필룸 이노필룸 ( Calophyllum inophyllum ) 식물로부터 수득한 추출물을 활성 성분으로서 치료적 유효량으로 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 조성물.
제4항에 있어서,
상기 조성물이 칼로필룸 이노필룸 식물 추출물을 5% 내지 100%로 포함하는, 조성물.
제4항에 있어서,
추출물이 칼로필룸 이노필룸 식물의 나무껍질로부터 수득되는, 조성물.
제4항에 있어서,
칼로필룸 이노필룸의 추출물이 생물활성 마커를 포함하는, 조성물.
제1항 또는 제4항에 있어서,
상기 조성물이 대사 장애 치료가 필요한 개체에게 경구로 투여되는, 조성물.
제8항에 있어서,
조성물이 정제, 캡슐 또는 과립 형태의 경구 투여용으로 제형되는, 조성물.
제1항 또는 제4항에 있어서,
대사 장애 치료에 사용하기 위한, 조성물.
제10항에 있어서,
대사 장애가 인슐린 저항, 고혈당증, 2형 당뇨병, 비만, 포도당 과민증, 고콜레스테롤혈증, 이상지질혈증, 과인슐린혈증, 아테롬성 동맥경화증 질환, 다낭성 난소 증후군(polycystic ovary syndrome), 관상동맥 질환, 대사 증후군, 고혈압, 또는 비정상적인 혈장 지질단백질, 트리글리세라이드, 또는 포도당 수치와 관련된 장애로부터 선택되는, 조성물.
제11항에 있어서,
대사 장애가 2형 당뇨병인, 조성물.
제11항에 있어서,
대사 장애가 비만인, 조성물.
제1항 또는 제4항에 따른 조성물을 치료적 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 대사 장애를 치료하는 방법.
제14항에 있어서,
상기 조성물이 경구 투여되는, 방법.
제14항에 있어서,
대사 장애가 인슐린 저항, 고혈당증, 2형 당뇨병, 비만, 포도당 과민증, 고콜레스테롤혈증, 이상지질혈증, 과인슐린혈증, 아테롬성 동맥경화증 질환, 다낭성 난소 증후군, 관상동맥 질환, 대사 증후군, 고혈압, 또는 비정상적인 혈장 지질단백질, 트리글리세라이드, 또는 포도당 수치와 관련된 장애로부터 선택되는, 방법.
제16항에 있어서,
대사 장애가 2형 당뇨병인, 방법.
제16항에 있어서,
대사 장애가 비만인, 방법.