JP2015509583A - 基板、ペプチドアレイ、および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2012年2月7日出願の米国仮特許出願第61/595,908号、2012年2月7日出願の米国仮特許出願第61/595,988号、2012年3月8日出願の米国仮特許出願第61/608,554号、2012年3月9日出願の米国仮特許出願第61/609,003号、2012年6月28日出願の米国仮特許出願第61/665,489号、2012年11月16日出願の米国仮特許出願第61/726,515号および2013年2月6日出願の米国仮特許出願第61/761,347号の恩典を主張し、それらの開示の全体をすべての目的のために参照により組み入れる。
一般に、典型的なマイクロアレイシステムは、ガラス、プラスチックまたはシリコンチップ等の固い平面表面にフォーマットされた生体分子プローブ、例えば、DNA、タンパク質またはペプチド、それに加えて、試料を操作するため(自動ロボット)、レポーター分子を読み取るため(スキャナー)、およびデータを分析するため(バイオインフォマティクスツール)に必要となる機器を含む。マイクロアレイ技術は、平方センチメートルあたり多数のプローブのモニタリングが可能である。多数のプローブを使用する利点は、速度、適応性、包括性および大量生産による比較的安い費用を含むがこれらに限定されない。そのようなアレイの使用は、病原体の検出および同定、抗菌薬耐性の調査、疫学的菌株タイピング、癌遺伝子の調査、宿主ゲノム発現を用いる微生物感染の分析ならびに多型プロフィールを含む、診断微生物学を含むがこれらに限定されない。
本発明は、いくつかの局面において、配合物、基板、およびアレイを包含する。本発明はまた、配合物、基板、およびアレイを、製造および使用する方法を含む。
そうでないことが示されていない限り、特許請求の範囲および明細書で使用される用語は、以下のように定義される。
配合物
本明細書には、配合物、例えば、光活性配合物(例えば、フォトレジスト配合物)、カップリング配合物、およびリンカー配合物が開示されている。これらの配合物は、例えば本明細書に開示される基板および/またはペプチドアレイを製造および/または使用する上で有用であり得る。概ね、本明細書に開示される各配合物の成分は、室温(およそ25℃)で水に溶解する。
本明細書には、光活性配合物が開示されている。1つの局面において、光活性配合物は、化学増幅レジスト配合物を含み得る。化学増幅(CA)レジストでは、1次的な光化学イベントによって移動可能な触媒が生成され、これが、典型的には後半の露光後ベーク(PEB)の間に、5〜25nm半径内で2次的な触媒イベントにつながる物質のカスケードを誘導し続ける。したがってそのような化学増幅は、最大で数百の総量子収率(物質反応の数を吸収されたフォトンの数で割ったもの)を実現する。CAレジストは、典型的に、少量(およそ1〜5重量%)の放射線感受性触媒前駆体、例えば光酸発生剤(PAG);触媒の存在下での脱離、付加または再配置によって反応することができる複数の化学基;他の成分を滑らかで透明なフィルムに分散させることができるポリマーマトリックス;ならびに性能または処理性を改善する任意の添加物、例えば界面活性剤、光増感剤、およびエッチングレジスト、を含む。
。
。
式中、nは1より大きな任意の正の整数である。
本明細書には、リンカー配合物も開示されている。リンカー配合物は、溶媒、水溶性ポリマー、水溶性リンカー分子、および水溶性カップリング試薬等の成分を含み得る。いくつかの局面において、ポリマーは1重量%のポリビニルアルコールおよび2.5重量%のポリビニルピロリドンであり、リンカー分子は1.25重量%のポリエチレンオキシドであり、カップリング試薬は1重量%の1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドであり、かつ溶媒は水を含む。いくつかの局面において、ポリマーは0.5〜5重量%のポリビニルアルコールおよび0.5〜5重量%のポリビニルピロリドンであり、リンカー分子は0.5〜5重量%のポリエチレンオキシドであり、カップリング試薬は0.5〜5重量%の1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドであり、かつ溶媒は水を含む。
式中、nは1より大きい任意の正の整数である。
カップリング配合物も開示されている。いくつかの局面において、カップリング配合物は、溶媒、水溶性ポリマー、水溶性カップリング分子、水溶性中和試薬、および水溶性カップリング試薬等の成分を含み得る。いくつかの局面において、カップリング配合物は、表2に示されている。
本明細書には、基板も開示されている。いくつかの局面において、基板は、金属を含み上表面および下表面を有する平面層と、該層の位置決めされた場所に機能的にカップリングされている複数のピラーとを含み得、各ピラーは、該層から延びる平面表面を有し、各ピラーの表面と該層の上表面の間の距離は約1,000〜5,000オングストロームの間であり、かつ複数のピラーが約10,000/cm2超の密度で存在する。基板の例は、図1に示されている。
使用することができる多孔質層は、第1のペプチドビルディングブロックを付加するための(構成要素であるポリマーが生来的に有しているまたは多孔質層に導入される)官能基を有し得る多孔質構造の透過性ポリマー物質である。官能基は、遊離カルボン酸基または遊離アミノ基を含み得る。例えば、多孔質層は、ポリマービルディングブロックを付加するための官能基がその表面に付加されている多孔質シリコンから構成され得る。別の例において、多孔質層は、架橋されたポリマー物質を含み得る。いくつかの態様において、多孔質層は、ポリスチレン、サッカロース、デキストラン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリアクリレート、ポリメチルアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアクリロールピロリドン、ポリビニルアセテート、ポリエチレングリコール、アガロース、セファロース、他の従来的なクロマトグラフィータイプの物質および誘導体ならびにそれらの混合物を含み得る。いくつかの態様において、多孔質層を構築する物質は、ポリ(ビニルアルコール)、デキストラン、アルギン酸ナトリウム、ポリ(アスパラギン酸)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(アクリル酸)-ナトリウム塩、ポリ(アクリルアミド)、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(ヒドロキシエチルアクリレート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(スチレンスルホン酸ナトリウム)、ポリ(2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸)、多糖類およびセルロース誘導体から選択される。好ましくは、多孔質層は、10〜80%の多孔性を有する。1つの態様において、多孔質層の厚みは、0.01μm〜約1,000μmの範囲である。多孔質層に含まれる孔サイズは、2nm〜約100μmの範囲であり得る。
本明細書には、アレイも開示されている。いくつかの局面において、アレイは、2次元アレイであり得る。いくつかの局面において、2次元アレイは、表面の位置決めされた場所に付加された特徴を含み得、該特徴は各々、決定可能な配列および意図された長さのペプチド鎖の集団を含み、個々の特徴において、意図された長さを有する集団内のペプチド鎖の小集団が、各カップリング工程で約98%の平均カップリング効率によって特徴付けられる。アレイの例は、図2に示されている。
基板の製造方法
本明細書には、基板の作製方法も開示されている。いくつかの局面において、基板を製造する方法は、複数のピラーに平面層をカップリングする工程を含み得、ここで、平面層は、金属を含み上表面および下表面を有し、複数のピラーは、該層の位置決めされた場所にカップリングされ、各ピラーは、層から延びる平面表面を有し、各ピラーの表面と該層の上表面の間の距離は、約1,000〜5,000オングストロームの間であり、かつ複数のピラーが約10,000/cm2超の密度で存在する。
基板は、すべての目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第20100240555号で説明されているように、半導体モジュールにおいて表面を誘導体化させることができる。本発明の典型的な基板は、表面を誘導体化させるのに適した酸化物のピラーを有する。表面の誘導体化は、基板にアミノシラン基を添加し、遊離アミノ基を生体分子のカップリングに利用できるようにする方法である。いくつかの局面において、表面が誘導体化された基板に付加される第1の分子は、tboc保護されたグリシンである。このカップリング手順は、一般に当業者に公知となっている標準的なメリフィールド固相ペプチド合成手順と同様である。
本明細書には、アレイの製造方法も開示されている。いくつかの局面において、本明細書に開示されるアレイは、表面上で、例えば本明細書に開示される基板上でインサイチュー合成され得る。いくつかの例において、アレイは、フォトリソグラフィーを用いて作製される。例えば、保護基を有するリンカー分子が提供された表面上の特定場所への照射または露光を制御するためにマスクが使用され得る。露光された場所では、保護基が除去され、リンカー上に1つまたは複数の反応性部分が新たに露出する。次いで、表面を、カップリング分子を含む溶液と接触させる。カップリング分子は、リンカー上の新たに露出した反応性部位と反応する少なくとも1つの部位および1つもしくは複数の保護基によって保護されている少なくとも1つの第2の反応性部位を有し得る。次いで、所望のカップリング分子が、保護されていないリンカー分子とカップリングされる。このプロセスは、表面上の特定のまたは位置決めされた場所で多数の特徴を合成するために繰り返され得る(例えば、各々参照により本明細書に組入られる、Pirrungらに対する米国特許第5,143,854号、米国特許出願公開第2007/0154946号(2005年12月29日出願)、同第2007/0122841号(2005年11月30日出願)、同第2007/0122842号(2006年3月30日出願)、同第2008/0108149号(2006年10月23日出願)および同第2010/0093554号(2008年6月2日出願)を参照のこと)。
本明細書には、基板、配合物および/またはアレイを使用する方法も開示されている。本明細書に開示されるアレイの使用は、研究用途、治療目的、医学的診断および/または1もしくは複数名の患者もしくは対象の分類を含み得る。
本実施例は、基板の構築を説明する。図1にこの工程を視覚的に概略する。2.4μmの熱成長した酸化物を有するシリコンウエハはUniversity Wafersから入手した。これらのウエハを最初に噴霧モジュール内においてプライマーでプライミングした。ヘキサメチルジシラザン(HMDS)はSigma Aldrich Inc.から入手した。次に、フォトレジストモジュールにおいてウエハを市販の深紫外線用フォトレジスト、すなわちRohm and Haasから入手したP5107またはAZ Electronic Materials製のAZ DX7260p 700でスピンコーティングして厚さ6000Åを得た。次にウエハを120℃のホットプレート中で60秒間ベークした。
次に、以下の方法を用いてウエハの表面誘導体化を行った。アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)はSigma Aldrichから入手した。エタノール(200プルーフ)はVWRから入手した。最初にウエハをエタノールで5分間、次に1重量%のAPTES/エタノールで20〜30分間洗浄し、シラン層を成長させた。次に、110℃窒素ベークオーブン中でウエハをキュアして、リンカー分子を付加するための-NH2基を有するシラン単層を成長させた。
水溶性フォトレジストは、以下のように調製した:
水溶性化合物はHampford Research Inc.から入手した。これらには、水溶性チオキサンテノン誘導体および水溶性光酸発生剤(PAG)が含まれた。ポリビニルピロリドン(PVP)はPolysciences Inc.から入手した。
20種の天然アミノ酸についての水性カップリング溶液を以下のように調製した:
ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン(PVP)、またはポリエチレングリコールのような水溶性不活性ポリマーはPolysciences Inc.から入手した。
無水酢酸はSigma Aldrich Corp.から入手した。PVPをN-メチルピロリドンに溶解し、溶液全体の2重量%を占めるようにした(1〜2重量%を試験し、類似の結果を得た。データは示さず)。次に、無水酢酸を添加して、溶液の25重量%を占めるようにした(20〜30重量%を試験し、類似の結果を得た。データは示さず)。次に、ウエハを2000rpmで30秒間回転させることによってキャッピングモジュール内でこのキャッピング溶液をウエハ上にスピンコーティングした。次にキャップベークモジュール内でウエハを75℃で最大2分間ベークし、キャッピング工程を完了した。残留している溶液をストリップモジュール内にてDI水で洗い流した。
本実施例に使用した材料および方法は、実施例1〜3に記載したものと同様である。具体的には、アミノ酸Ala、AspおよびHisを以下のように調製した。脱イオン(DI)水に1:2.5の比で不活性水溶性ポリマー(3重量%のPVPおよび7重量%のPVA)を溶解し、2重量%のアミノ酸濃度に加えて、ポリマーが溶液の約10重量%を占めるようにした。アミノ酸の2倍濃度の試薬としてEDCおよびHonBのそれぞれについて4重量%を添加した。EDCおよびHoNbと同じ濃度でDIEA(4重量%)を添加した。この水カップリング溶液を誘導体化基板上にスピンコーティングし、全てが基板とのカップリングに利用できる均一な固体層を形成した。次に、ウエハを90℃のホットプレート上で2分間ベークして、残留している溶媒(DI水)を除去し、同時にカップリングさせた。次に、ストリップモジュール内でカップリングコートをDI水で洗い流した。
無水酢酸はSigma Aldrich Corp.から入手した。PVPをNメチルピロリドンに溶解し、溶液全体の2重量%を占めるようにした(1〜2重量%を試験し、類似の結果を得た。データは示さず)。次に、無水酢酸を添加して、溶液の25重量%を占めるようにした(20〜30重量%を試験し、類似の結果を得た。データは示さず)。次に、ウエハを2000rpmで30秒間回転させることによってキャッピングモジュール内でこのキャッピング溶液をウエハ上にスピンコーティングした。次にキャップベークモジュール内でウエハを75℃で最大2分間ベークし、キャッピング工程を完了させた。残留している溶液をストリップモジュール内にてDI水で洗い流した。
材料および方法:
水溶性不活性ポリマー(ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン(PVP)、またはポリエチレングリコールなど)はPolysciences Inc.から入手した。EDC(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)およびHonB(n-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド)はSigma Aldrich Corp.から入手した。DIEA(ジイソプロピルエチルアミン)はSigma Aldrich Corpから入手した。全てのt-boc/Fmoc保護アミノ酸はAAPPTEC/Anaspecから入手した。
無水酢酸はSigma Aldrich Corp.から入手した。PVPをN-メチルピロリドンに溶解し、溶液全体の2重量%を占めるようにした(1〜2重量%も試験した。データは示さず)。次に、無水酢酸を添加して、溶液の25重量%を占めるようにした(20〜30重量%も試験した。データは示さず)。
5,6FAMカルボキシフルオレセインはAnaspecから入手した。5重量%のポリビニルピロリドン(PolySciences)に加えて、0.1M Boc-Gly-OH(AAPPTeC製)、0.05M 5,6FAMおよび0.1M HoNb(Sigma Aldrich)および0.1M EDC(Sigma Aldrich)を水に溶解した。
図6の画像は1〜12merの実験からの蛍光シグナルの読み取りを示し、4行および12列を有する。4行のそれぞれは、同じ配列を表す。列は、各列に1個のアミノ酸が付加されるように合成された配列を含有する。したがって左から右にかけて、各列は以下の配列:
を表す。
で繰り返した。このペプチド合成のために使用したカップリング配合物は表2からのものであり、Boc-Ala-OHを含んでいた。カップリング収率は、上記の各合成段階での蛍光強度から決定した。表6にカップリング段階毎の蛍光シグナル強度、収量効率、およびポリAペプチド合成の各段階での全収率を示す。
材料および方法:
本発明者らは、Merrifield固相ペプチド合成に基づく標準的な先行技術ペプチドアレイ合成に従った[(R. B, Merrifield (1963). "Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide". J,. Am. Chem. Soc. 85 (14): 2149-2154) Pellois, JP et al, "Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips". Nat Biotechnology 2002 Sep: 20(9):922-6)。本発明者らは、段階毎のカップリング効率を決定した。全てのBoc保護アミノ酸およびHobt(ヒドロキシベンゾトリアゾール)はAAPPTECから入手した。酸化ケイ素を有するウエハは、University Wafersから購入した。ジイソプロピルカルボジイミドはCreosalusから入手した。水性99重量%硫酸および水性33重量%過酸化水素はSigma Aldrichから入手する。ピラニア溶液は、終濃度50%の硫酸および50%の過酸化水素の溶液を混合することによって調製した。アミノプロピルトリエトキシシランおよびエタノールはSigma Aldrichから入手する。ジメチルホルムアミド(DMF)、ジクロロメタン(DCM)、無水酢酸、N-メチル-2-ピロリジノン(NMP)、およびアセトンおよびイソプロピルアルコール溶液(IPA)はVWRから入手した。ポリメチルメタクリレート(PMMA)はPolysciences Inc.から入手し、ビス(4-tert-ブチルフェニル)イオドニウムヘキサフルオロアンチモネート(光酸発生剤(PAG)はHampford Researchから入手した。イソプロピルチオキサンテノン(ITX)はSigma Aldrichから入手した。PGMEA(プロピレングリコールメチルエーテルアセテート)はAlfa Aesarから入手した。ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)はAlfa Aesarから入手した。
発明者らは、PGMEA(88.5重量%)に溶解した2.5重量%のPMMA、5重量%のPAGおよび5重量%のITXのフォトレジスト溶液を調製した。このレジスト配合物を2000rpmで60秒間スピンコーティングし、次に85℃で90秒間、ポストベークした。次にウエハを23℃で5分間冷却した。次に深UVスキャナーでウエハ全体にわたり1つのレチクルを用いて40mJ/cm2でこれらのウエハを露光した。次に65℃のホットプレート上でウエハを1分間ベークした。次にウエハをアセトンおよびDI水にそれぞれ2分間漬けた。次にそれらを窒素で風乾した。ウエハをDMF中の5%DIEAで10分間洗浄した。
として合成した。
5,6FAMカルボキシフルオレセインはAnaspecから入手した。0.1M Boc-Gly-OH(AAPPTeC製)、0.1M Hobt(Sigma Aldrich)および0.1M DIC(Creosalus)をNMPに溶解した。暗く覆ったこの溶液の中にウエハを1時間浸してカップリング収率を検出した。
の1〜12種のペプチドの全合成の効率の尺度(下)およびスポット毎の強度プロファイルのグラフ(上)を提供する。表7に、図7Aからの蛍光シグナル強度の数値、カップリング段階毎の収量効率、および全収率を示す。図8Aに、Vibrantチップおよび上記方法を用いたチップ上でのペプチド:
の段階的合成の全収率のプロット(表5における結果)を、チップの標準合成(表7における結果)に対比して示す。図8Cに、Vibrantチップおよび上記方法を用いたチップ上でのペプチド:
の段階的合成のカップリング効率のプロット(表5における結果)を、チップの標準合成(表7における結果)に対比して示す。結果から分かるように、合成効率は、3アミノ酸長よりも長いペプチドについて本発明者らの方法を用いたときに有意に改善している。
本発明者らは、PGMEA(88.5重量%)に溶解した2.5重量%のPMMA、5重量%のPAGおよび5重量%のITXのフォトレジスト溶液を調製した。このレジストを2000rpmで60秒間スピンコーティングし、次に85℃で90秒間、ポストベークした。次にウエハを23℃で5分間冷却した。次に深UVスキャナーで1つのレチクルを用いてウエハ全体にわたり40mJ/cm2でこれらのウエハを露光した。次に、65℃のホットプレート上でウエハを1分間ベークした。次にウエハをアセトンおよびDI水にそれぞれ2分間漬けた。次にそれらを窒素で風乾した。次にウエハをDMF中の5%DIEAで10分間洗浄した。
5,6FAMカルボキシフルオレセインはAnaspecから入手した。0.1M Boc-Gly-OH(AAPPTeC製)、0.1M Hobt(Sigma Aldrich)および0.1M DIC(Creosalus)をNMPに溶解した。暗く覆ったこの溶液の中にウエハを1時間浸してカップリング収率を検出した。
本実施例は、2枚の基板(すなわちウエハ)に水性カップリング溶液に溶かした20種のアミノ酸全ておよび読み取り値としてシグナル強度を使用して、マイクロアレイプラットフォームでカップリング段階がどのような性能であるのかの典型的なシグネチャーを提供する。この試験は、性能を釣り合わせるためのウエハ(基板)の各バッチに対する品質管理として実行した。実験毎に、測定されたシグナル強度はカップリング収率との直接関係を与える。
無水酢酸はSigma Aldrich Corp.から入手した。PVPをNメチルピロリドンに溶解し、全溶液の約1〜2%を占めるようにすることで、溶液中の含量は以下のようになった。PVP 1〜2重量%、無水酢酸20〜30重量%、残りはNメチルピロリドンであった。次に無水酢酸を添加して溶液の約20〜30重量%を占めるようにした。ウエハを2000rpmで30秒間回転させることによってキャッピングモジュール内でこのキャッピング溶液をウエハ上にスピンコーティングした。次にキャップベークモジュール内でウエハを75℃で最大2分間ベークし、キャッピング工程を完了した。残留している溶液をストリップモジュール内にてDI水で洗い流した。
を使用した。図9に各層での各アミノ酸の蛍光シグナル強度を示す。アミノ酸His、Asn、およびTrpは、フルオレセインのクエンチングにより、より低い値を示した。図9のグラフに、これらのアミノ酸の後に上向きになる(ゆえに、各合成段階で高いカップリング収率を示す)曲線を示す。
材料および方法
ポリマーであるポリエチレングリコールモノメチルエーテル、ポリビニルピロリドン、ポリ(2-ジメチルアミノエチルメタクリレート)、ポリ(2-ヒドロキシプロピルメタクリレート)、ポリ4ビニルピリジンはPolysciencesから入手した。
水性レジスト-1は、ポリマーであるポリエチレングリコールモノメチルエーテル(2重量%)とポリビニルピロリドン(2重量%)とを水中で混合し、一晩溶解することによって調製した。4メトキシフェニル)フェニルヨードニウムトリフルオロメタンスルホネート(5重量%)をイソプロピルチオキサンテノン(5重量%)と共に添加し、一晩溶解した。水性レジスト-2は、ポリマーであるポリ(2-ジメチルアミノエチルメタクリレート)(2.5重量%)を、溶媒である水(90重量%)および乳酸エチル(10重量%)中で混合し、一晩溶解することによって調製した。(4メトキシフェニル)ジメチルスルホニウムトリフレート(5重量%)をイソプロピルチオキサンテノンと共に添加し、一晩溶解した。
無水酢酸はSigma Aldrich Corp.から入手した。PVPをNメチルピロリドンに溶解し、溶液全体の約1〜2重量%を占めるようにした。次に無水酢酸を添加して、溶液の約20〜30重量%を占めるようにした。ウエハを2000rpmで30秒間回転させることによってキャッピングモジュール内でこのキャッピング溶液をウエハ上にスピンコーティングした。次にキャップベークモジュール内でウエハを75℃で最大2分間ベークし、キャッピング工程を完了させた。残留している溶液をストリップモジュール内にてDI水で洗い流した。
水性レジスト-1および水性レジスト-2は、化学増幅型レジストではない。これらのレジストは、骨格にt-bocを有さず、ゆえに化学増幅は起こらない。形成した初期の酸を拡散させて基板に到達させるためにポスト露光ベークを行う。ゆえに、フォトレジストが薄いほど、光酸の拡散が容易である。
光学活性配合物:
水性レジスト-1は、ポリマーであるポリエチレングリコールモノメチルエーテル(2重量%)およびポリビニルピロリドン(2重量%)を水に混合し、それを一晩溶解することによって調製した。4メトキシフェニル)フェニルヨードニウムトリフルオロメタンスルホネート(5重量%)をイソプロピルチオキサンテノン(5重量%)と共に添加し、一晩溶解した。水性レジスト-2は、ポリマーであるポリ(2-ジメチルアミノエチルメタクリレート)(2.5重量%)を、水(90重量%)および乳酸エチル(10重量%)の溶媒に混合し、それを一晩溶解することによって調製した。(4メトキシフェニル)ジメチルスルホニウムトリフレート(5重量%)をイソプロピルチオキサンテノンと共に添加し、一晩溶解した。水性レジスト-3は、ポリマーであるポリエチレングリコールモノメチルエーテル(2重量%)およびポリビニルピロリドン(2重量%)を、50%の水および50%の乳酸エチルを含む溶媒混合物に溶解することによって調製した。2,4-ジヒドロキシフェニル)ジメチルスルホニウムトリフレート(2.5重量%)および(4メトキシフェニル)ジメチルスルホニウムトリフレート(2.5重量%)をこれに添加し、一晩溶解した。5重量%の水溶性ITXを添加した。水性レジスト-4は、ポリマーであるポリ(2-ジメチルアミノエチルメタクリレート)(2.5重量%)を、50%の水および50%の乳酸エチルを含む溶媒混合物に溶解することによって調製した。これに2,4-ジヒドロキシフェニル)ジメチルスルホニウムトリフレート2.5%および(4メトキシフェニル)ジメチルスルホニウムトリフレート(2.5重量%)を添加し、一晩溶解した。5重量%の水溶性ITXを添加した。水性レジスト-5は、ポリマーであるポリ(2-ヒドロキシプロピルメタクリレート)(2.5重量%)を、50%の水および50%の乳酸エチルを含む溶媒混合物に溶解することによって調製した。2,4-ジヒドロキシフェニルジメチルスルホニウムトリフレート(2.5重量%)および(4メトキシフェニル)ジメチルスルホニウムトリフレート(2.5重量%)をこれに添加し、一晩溶解した。5重量%の水溶性ITXを添加した。水性レジスト-6は、ポリマーであるポリ4ビニルピリジン(5重量%)を、50%の水および50%の乳酸エチルを含む溶媒混合物に溶解することによって調製した。2,4-ジヒドロキシフェニルジメチルスルホニウムトリフレート(2.5重量%)および(4メトキシフェニル)ジメチルスルホニウムトリフレート(2.5重量%)をこれに添加し、一晩溶解した。5重量%の水溶性ITXを添加した。
本実施例に、本発明者らがどのようにポリペプチドの合成/結合のための遊離カルボン酸基を有する多孔質層を構築したかを説明する。デキストランBio Xtra(MW40000)はSigma Aldrichから入手する。ビス-ポリエチレングリコールカルボキシメチルエーテルはSigma Aldrichから入手した。ポリビニルピロリドン1000000はPoly Sciences Inc.から入手した。Oakwood Chemicals Inc.から入手した光酸発生剤である2重量%のジメチル-2,4-ジヒドロキシフェニルスルホニウムトリフレートに加えて、上記3種のポリマーを50重量%乳酸エチル/50重量%水の溶媒組成物に重量比2:2:1で溶解した。この溶液を、シリコン基板上にニッケル1000Aを堆積したウエハにスピンコーティングした。回転速度を3000rpmに制御して厚さ100nmの均一なコーティングを得た。次にウエハを深UVスキャナーNikon S203を用いて250mJ/cm2で露光し、次に65℃のホットプレート中で90秒間ベークした。次にアセトンおよびイソプロピルアルコールでウエハからコートを剥離し、続いて脱イオン水でリンスした。基板は、ペプチド合成のために活性化およびタンパク質またはアミノ酸とのカップリングの用意ができた遊離COOH基のマトリックスを有する。平面基板よりも多孔性基板の方が層に沿ったCOOH基の2次元濃度を上げることができる。
本実施例において、公知のタンパク質(例えば抗原)を重複ペプチドのセットとしてアレイ上に提示する。対象(本実施例では血清)から入手した試料をチップ上でアッセイして、試料中に存在する抗体によって結合されたペプチドを特定する。抗体結合のパターンを分析して、対象の抗体によって認識されるエピトープを定義し、結合している抗体のクラスを任意で特定することができる。図14を参照されたい。図15に示すように、この代表的な実施例では、タンパク質であるαグリアジンを、それぞれ12アミノ酸長を有する重複ペプチド配列に分割した。図15に示す重複フレームサイズは2として選択した。本実施例は代表例であるので、αグリアジンタンパク質全体の最初のアミノ酸29個だけを示す。本実施例は、公知の配列を有するソースタンパク質から得られた部分配列を含む、特有の、入れ子になった、重複する複数のペプチド鎖を含むアレイ特徴を代表するものである。
本実施例は、公知の抗原全体の免疫活性領域を決定し、かつ免疫活性領域(1種または複数)を使用して所与の疾患に病理的に関係する抗原部分配列に非常に特異的なペプチドセットを作り出し、それによって公知の抗原全体を所与のアレイ上に提示するために必要なペプチド配列の数を減少させるための方法を説明する。
セリアック関連免疫優性ペプチド配列を決定する
本実施例において、本発明者らは、免疫調節分子と相互作用し、セリアック障害に関連するペプチド配列のセット(例えばエピトープ)を決定した。このペプチドセットを、セリアック試料を用いた2ラウンドのスクリーニング後に決定した。第1ラウンドのスクリーニングは、セリアック関連タンパク質からタイル状に並べたペプチド部分配列を含むペプチドアレイを産生することによって行った。本発明者らは、図15に示しかつ実施例10に説明した概略図により、全てのグリアジン、セカリン、ホルデインおよびサビナ(savina)を含めた関連プロラミンをタイル状に並べ、各重複ペプチド配列が最大で12アミノ酸長を有するようにした。グルタミン残基が脱アミド化されてグルタミン酸残基を形成する場合、タイル状に並べた配列はまた、グルタミンが可能な繰り返し毎にグルタミン酸によって置換されて存在する配列を模倣するように合成した。例えば、配列:
はまた、グルタミンが可能な繰り返し毎にグルタミン酸によって置換された配列、すなわち:
としても存在した。αグリアジンペプチドフラグメントの脱アミド化(例えばグルタミン酸によるグルタミンの置換)の一例を図16に示す。
試料毎に以下のHLAアッセイからTペプチドを特定した。
Bペプチドを使用して疾患を診断し、その重症度を特定した。Bペプチドを試料毎に以下の抗体アッセイから特定した。
<10,000=陰性
10,000〜20,000=弱陽性
>20,000=強陽性
セリアック陽性試料に対する弱陽性または強陽性結合シグナルを産生している12mer配列のセットをコンパイルした(例えば参照により本明細書に組み入れられる米国仮出願第61/761,347号の付録Aの表Aを参照されたい)。配列解析を行うようにプログラムされたコンピュータを使用して、このセットの12mer配列内に存在する部分配列を、最小3アミノ酸長、最大11アミノ酸長を有する一連のスライディングウインドウを使用して決定した。このように部分配列のリストを作製し、コンピューターメモリーに記憶させた。次に、12mer配列のセットを構成する各12mer配列内の各部分配列の出現についてチェックするソフトウェアを使用して、12mer配列のセットにおける各部分配列の出現数を決定した。出現数を表にまとめ、最も頻度の高い部分配列9種を特定した。本発明者らは、これらの部分配列が、セリアック試料を特異的に特定するために使用することができる合成ペプチドを産生するために有用であろう、情報価値の高い配列を表す見込みがあると仮定した。追加的な方法の詳細については、例えば実施例11および図17を参照されたい)。
炎症結合ペプチド(例えばサイトカイン、TNF)は、病状および重症度の判定に極めて有用であるが、また疾患の診断感度も増大させる。Cペプチドの別の重要な局面は、投薬への応答を炎症応答について追跡することができることである。これは、Bペプチドと共に難治性セリアック病の特定を助ける。Cペプチドは、抗炎症剤として作用し得るモノクローナル剤の設計に使用することができる。Cペプチドを、ペプチドチップで行われた以下の炎症アッセイから特定した。
本実施例は、セリアック病患者に関係する感染症を判定する方法を提供する。細菌、ウイルス、真菌、寄生虫からの抗原ペプチドを12merペプチド配列としてプラットフォーム上にタイル状に並べ、上に説明したように抗体アッセイを行う。表E(付録A)は、グルテンペプチドの分子擬態を提供できるであろうペプチドのリストを提供し、それに対する抗体はセリアック障害を有する患者に共通である。上記「Bペプチド」アッセイに記載したような抗体アッセイを、表Eからのペプチドを有するペプチドチップで行った。セリアック病を有する患者における抗体と結合するエピトープ部分配列を、このアッセイの結果から決定する。
アレイ
単一アッセイを用いたセリアック病の検出および亜型診断:
本態様は、上述の抗体アッセイおよびサイトカインアッセイを、上記アッセイで特定されたBペプチドとCペプチドとの両方を含む単一アッセイとして行うことができるアッセイプロトコールを提供する。このアッセイプロトコールは血清の使用量を減少させ、かつ診断の感度を増大させる。
上で発見されたTペプチドの治療剤としての使用を試験するためにマウスモデルを構築する。特定されたTペプチドを混合してカクテルにし、トランスジェニックマウスに投与する。上記と同じペプチドアレイプラットフォームを使用してサイトカインプロファイルおよびペプチドに対する応答を決定する。IFN、IL-10およびTGF-B応答は、ペプチドカクテルを投与後に測定する。抗炎症性のIL-10は、T細胞トレランスの誘導に調節性T細胞が存在することを示唆する。IFNレベルの減少は、免疫抑制応答を示唆する。したがって、プラットフォームを使用して高特異性免疫抑制ペプチドカクテルを特定する。
ペプチドアレイを産生するために、本発明者らは、リソグラフ深紫外線ツールと組み合わせたコーター/現像モジュールに基づく半導体製造のバッチ処理を用いたが、それにより工程を完全に自動化でき、したがってスループットを増加させることができた。いくつかの低いピークを示す文献記載の方法に比べて、このペプチド合成法から得られた質量分析データは、単一の鋭いピークを示す。
・ 独立型−露光ツール
・ 独立型−フォトレジストコートモジュール
・ 独立型−生化学追跡モジュール
a. 20merペプチドマイクロアレイについては合計400回のアミノ酸カップリング段階を行う1日24時間の合成で5日未満、
b. 40merペプチドマイクロアレイについては合計800回のアミノ酸カップリング段階を行う1日24時間の合成で10日未満、
c. 60merペプチドマイクロアレイについては合計1200回のアミノ酸カップリング段階を行う1日24時間の合成で15日未満
で生産された。
シリコンウエハは、University Wafersから入手した。図34Aに示すように、金属をウエハ上に堆積させた。この金属は、クロム、チタン、またはアルミニウムより選択した。金属はスパッタ成膜と呼ばれる工程により堆積させた。スパッタ成膜は、スパッタリングによって薄膜を堆積させる物理的蒸着(PVD)法であって、これは供給源である「ターゲット」から物質を射出し、次にそれがウエハ上に堆積する方法である。堆積した金属の厚さは、基板上面で少なくとも500Åであることを確保した。
Claims (249)
- 多孔質表面層の位置決めされた場所に付加された特徴のアレイであって、特徴が各々、決定可能な配列および意図された長さのペプチド鎖の集団を含み、個々の特徴において、意図された長さを有する該集団内のペプチド鎖の小集団が、各カップリング工程で少なくとも98%の平均カップリング効率によって特徴付けられる、アレイ。
- 多孔質層が、複数の遊離カルボン酸基を含む、請求項1記載のアレイ。
- カルボン酸基が、多方向に向けられている、請求項2記載のアレイ。
- 多孔質層が、各々カルボン酸基を介してアレイに付加されている複数のカップリング分子を含む、請求項1記載のアレイ。
- 多孔質層が、各々カルボン酸基を介してアレイに付加されている複数のペプチド鎖を含む、請求項1記載のアレイ。
- 各カップリング工程の平均カップリング効率が、少なくとも98.5%である、請求項1記載のアレイ。
- 各カップリング工程の平均カップリング効率が、少なくとも92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%である、請求項1記載のアレイ。
- 各々の意図された長さが、4〜60アミノ酸長である、請求項1記載のアレイ。
- 各々の意図された長さが、少なくとも5アミノ酸長である、請求項1記載のアレイ。
- 各々の意図された長さが、少なくとも6、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、または60アミノ酸長である、請求項1記載のアレイ。
- 各ペプチド鎖が、1つまたは複数のLアミノ酸を含む、請求項1記載のアレイ。
- 各ペプチド鎖が、1つまたは複数のDアミノ酸を含む、請求項1記載のアレイ。
- 各ペプチド鎖が、1つまたは複数の天然に存在するアミノ酸を含む、請求項1記載のアレイ。
- 各ペプチド鎖が、1つまたは複数の合成アミノ酸を含む、請求項1記載のアレイ。
- 少なくとも1,000個の特徴を含む、請求項1記載のアレイ。
- 少なくとも10,000個の特徴を含む、請求項15記載のアレイ。
- 位置決めされた場所の各々が、他の位置決めされた場所の各々から物理的に離れている、異なる既知の場所である、請求項1記載のアレイ。
- 位置決めされた場所の各々が、複数の同一配列を含む、請求項17記載のアレイ。
- 位置決めされた場所の各々が、他の位置決めされた場所とは別の複数の同一配列を含む、請求項18記載のアレイ。
- 位置決めされた場所の各々が、位置的に識別可能な場所である、請求項1記載のアレイ。
- 各々の決定可能な配列が、既知の配列である、請求項1記載のアレイ。
- 各々の決定可能な配列が、特有の配列である、請求項1記載のアレイ。
- 特徴が、共有結合により表面に付加されている、請求項1記載のアレイ。
- ペプチド鎖が、リンカー分子またはカップリング分子を介して多孔質表面層に付加されている、請求項1記載のアレイ。
- 特徴が、既知の配列を有するソースタンパク質由来の部分配列を含む、特有の、入れ子になった、重複する複数のペプチド鎖を含む、請求項1記載のアレイ。
- 前記複数のうちの各ペプチド鎖が、少なくとも4アミノ酸長である、請求項25記載のアレイ。
- 前記複数のうちの各ペプチド鎖が、少なくとも5アミノ酸長である、請求項25記載のアレイ。
- 前記複数のうちの各ペプチド鎖が、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、または60アミノ酸長である、請求項25記載のアレイ。
- 特徴が、ランダムな、決定可能なアミノ酸配列を各々有する複数のペプチド鎖を含む、請求項1記載のアレイ。
- 表面が、請求項207〜240のいずれか一項記載の基板を含む、請求項1記載のアレイ。
- 表面の位置決めされた場所に付加された特徴のアレイであって、特徴が各々、決定可能な配列および意図された長さのペプチド鎖の集団を含み、個々の特徴において、意図された長さを有する該集団内のペプチド鎖の小集団が、各カップリング工程で少なくとも98%の平均カップリング効率によって特徴付けられる、アレイ。
- 各カップリング工程の平均カップリング効率が、少なくとも98.5%である、請求項31記載のアレイ。
- 各カップリング工程の平均カップリング効率が、少なくとも99%である、請求項31記載のアレイ。
- 各々の意図された長さが、4〜60アミノ酸長である、請求項31記載のアレイ。
- 各々の意図された長さが、少なくとも5アミノ酸長である、請求項31記載のアレイ。
- 各々の意図された長さが、少なくとも6、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、または60アミノ酸長である、請求項31記載のアレイ。
- 各ペプチド鎖が、1つまたは複数のLアミノ酸を含む、請求項31記載のアレイ。
- 各ペプチド鎖が、1つまたは複数のDアミノ酸を含む、請求項31記載のアレイ。
- 各ペプチド鎖が、1つまたは複数の天然に存在するアミノ酸を含む、請求項31記載のアレイ。
- 各ペプチド鎖が、1つまたは複数の合成アミノ酸を含む、請求項31記載のアレイ。
- 少なくとも1,000個の特徴を含む、請求項31記載のアレイ。
- 少なくとも10,000個の特徴を含む、請求項31記載のアレイ。
- 位置決めされた場所の各々が、他の位置決めされた場所の各々から物理的に離れている、異なる既知の場所である、請求項31記載のアレイ。
- 位置決めされた場所の各々が、位置的に識別可能な場所である、請求項31記載のアレイ。
- 各々の決定可能な配列が、既知の配列である、請求項31記載のアレイ。
- 各々の決定可能な配列が、特有の配列である、請求項31記載のアレイ。
- 特徴が、共有結合により表面に付加されている、請求項31記載のアレイ。
- ペプチド鎖が、リンカー分子またはカップリング分子を介して表面に付加されている、請求項31記載のアレイ。
- 特徴が、既知の配列を有するソースタンパク質由来の部分配列を含む、特有の、入れ子になった、重複する複数のペプチド鎖を含む、請求項31記載のアレイ。
- 前記複数のうちの各ペプチド鎖が、少なくとも5アミノ酸長である、請求項49記載のアレイ。
- 前記複数のうちの各ペプチド鎖が、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、または60アミノ酸長である、請求項49記載のアレイ。
- 特徴が、各々ランダムな、決定可能なアミノ酸配列を有する複数のペプチド鎖を含む、請求項31記載のアレイ。
- 表面が、請求項31〜52のいずれか一項記載の基板を含む、請求項31記載のアレイ。
- 特徴のアレイを製造する方法であって、以下の工程を含む、方法:
表面を得る工程;ならびに
表面に特徴を付加する工程であって、特徴が各々、決定可能な配列および意図された長さのペプチド鎖の集団を含み、個々の特徴において、該意図された長さを有する集団内のペプチド鎖の小集団が、各カップリング工程で少なくとも98%の平均カップリング効率によって特徴付けられる、工程。 - 特徴が、溶媒と、水溶性ポリマーと、水溶性カップリング分子と、水溶性中和試薬と、水溶性カップリング試薬とを含むカップリング配合物を用いて表面に付加される、請求項54記載の方法。
- 特徴のアレイを製造する方法であって、以下の工程を含む、方法:
金属を含み上表面および下表面を有する平面層と、該層の位置決めされた場所に機能的にカップリングされた複数のピラーとを含む基板を得る工程であって、各ピラーが、該層から延びる平面表面を有し、各ピラーの表面と該層の上表面の間の距離が1,000〜5,000オングストロームの間であり、各ピラーの表面が該層の上表面と平行であり、かつ複数のピラーが10,000/cm2超の密度で存在する、工程;ならびに
一連のカップリング反応を通じて複数のピラーに特徴をカップリングする工程であって、特徴が各々、決定可能な配列および意図された長さのペプチド鎖の集団を含み、個々の特徴において、該意図された長さを有する集団内のペプチド鎖の小集団が、全カップリング工程で少なくとも98%の平均カップリング効率によって特徴付けられる、工程。 - 特徴が、溶媒と、水溶性ポリマーと、水溶性カップリング分子と、水溶性中和試薬と、水溶性カップリング試薬とを含むカップリング配合物を用いてピラーにカップリングされる、請求項56記載の方法。
- 水溶性光増感剤と、水溶性光活性化合物と、水溶性ポリマーと、溶媒とを含む、光活性配合物。
- 表1に示される光活性配合物から選択される、請求項58記載の配合物。
- 水溶性光増感剤が、チオキサンテノンである、請求項58記載の配合物。
- 水溶性光増感剤が、総配合物濃度の約0.5〜5重量%である、請求項58記載の配合物。
- 水溶性光活性化合物が、光酸発生剤(PAG)、または光塩基発生剤(PBG)を含む、請求項58記載の配合物。
- 光酸発生剤が、水溶性ヨードニウム塩、水溶性ポロニウム塩または水溶性スルホニウム塩である、請求項58記載の配合物。
- 光酸発生剤が、(4-メトキシフェニル)フェニルヨードニウムまたはトリフルオロメタンスルホネートである、請求項58記載の配合物。
- 光酸発生剤が、(2,4-ジヒドロキシフェニル)ジメチルスルホニウムトリフレートまたは(4 メトキシフェニル)ジメチルスルホニウムトリフレートである、請求項58記載の配合物。
- 光酸発生剤が、トリフレート、ホスフェート、および/またはアンチモネートのヨードニウムおよびスルホニウム塩である、請求項58記載の配合物。
- 光酸発生剤が、総配合物濃度の約0.5〜5重量%である、請求項58記載の配合物。
- 水溶性ポリマーが、水溶性非架橋不活性ポリマーである、請求項58記載の配合物。
- 水溶性ポリマーが、ビニルピロリドンである、請求項68記載の配合物。
- 水溶性ポリマーが、ポリビニルピロリドンである、請求項68記載の配合物。
- 水溶性ポリマーが、総配合物濃度の約0.5〜5重量%である、請求項58記載の配合物。
- 溶媒が、水、乳酸エチル、またはその組み合わせである、請求項58記載の配合物。
- 溶媒が、総配合物濃度の約80〜90重量%である、請求項58記載の配合物。
- 溶媒と、水溶性ポリマーと、水溶性リンカー分子と、水溶性カップリング試薬とを含む、リンカー配合物。
- ポリマーが1重量%のポリビニルアルコールおよび2.5重量%のポリビニルピロリドンであり、リンカー分子が1.25重量%のポリエチレンオキシドであり、カップリング試薬が1重量%の1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドであり、かつ溶媒が脱イオン水を含む、請求項74記載の配合物。
- 溶媒が、水、有機溶媒またはその組み合わせである、請求項74記載の配合物。
- 有機溶媒が、N メチルピロリドン、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、ジメチルスルホキシド、またはそれらの組み合わせである、請求項76記載の配合物。
- 水溶性ポリマーが、ポリビニルピロリドンまたはポリビニルアルコールである、請求項74記載の配合物。
- カップリング試薬が、水溶性カルボジイミドまたは水溶性トリアゾールである、請求項74記載の配合物。
- カップリング試薬が、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドである、請求項74記載の配合物。
- リンカー分子が、分子の第1の末端にカルボン酸基を、分子の第2の末端に保護基を含む、請求項74記載の配合物。
- 保護基が、t-Boc保護基またはF-Moc保護基である、請求項81記載の配合物。
- リンカー分子が、アリールアセチレン、ポリエチレングリコール、新生ポリペプチド、ジアミン、二酸、ペプチド、またはそれらの組み合わせである、請求項74記載の配合物。
- 溶媒と、水溶性ポリマーと、水溶性カップリング分子と、水溶性中和試薬と、水溶性カップリング試薬とを含む、カップリング配合物。
- 表2に示されるカップリングフィルム接触配合物から選択される、請求項84記載の配合物。
- 溶媒が、水、有機溶媒、またはその組み合わせである、請求項84記載の配合物。
- 有機溶媒が、N メチルピロリドン、ジメチルホルムアミド、またはそれらの組み合わせである、請求項86記載の配合物。
- ポリマーが、水溶性ビニルピロリドンまたは水溶性ビニルアルコールである、請求項84記載の配合物。
- ポリマーが、総配合物濃度の2.5〜5重量%である、請求項84記載の配合物。
- 中和試薬が、ヒューニッヒ塩基を含む、請求項84記載の配合物。
- 中和試薬が、総配合物濃度の1〜2重量%である、請求項90記載の配合物。
- カップリング分子が、天然に存在するかまたは人工の、アミノ酸またはポリペプチドを含む、請求項84記載の配合物。
- 人工アミノ酸が、D-アミノ酸である、請求項92記載の配合物。
- カップリング分子が、総配合物濃度の1〜2重量%である、請求項84記載の配合物。
- カップリング分子が、保護された側鎖基を含む、請求項84記載の配合物。
- カップリング試薬が、水溶性カルボジイミドまたは水溶性トリアゾールである、請求項84記載の配合物。
- カップリング試薬が、総配合物濃度の2〜4重量%である、請求項84記載の配合物。
- 金属を含み上表面および下表面を有する平面層と;
該層の位置決めされた場所に機能的にカップリングされた複数のピラーであって、各ピラーが、該層から延びる平面表面を有し、各ピラーの表面と該層の上表面の間の距離が1,000〜5,000オングストロームの間であり、かつ複数のピラーが10,000/cm2超の密度で存在する、ピラーと
を含む基板。 - 各ピラーの表面の表面積が、少なくとも1μm2である、請求項98記載の基板。
- 各ピラーの表面の表面積が、10,000μm2未満の総面積を有する、請求項98記載の基板。
- 各ピラーの表面と前記層の下表面の間の距離が、2,000〜7,000オングストロームである、請求項98記載の基板。
- 前記層が、1,000〜2,000オングストローム厚である、請求項98記載の基板。
- 各ピラーの中心が、任意の他のピラーの中心から少なくとも2,000オングストロームである、請求項98記載の基板。
- 各ピラーの表面が、前記層の上表面と平行である、請求項98記載の基板。
- 各ピラーの表面が、前記層の上表面と実質的に平行である、請求項98記載の基板。
- 金属が、クロムである、請求項98記載の基板。
- 金属が、クロム、チタン、アルミニウム、タングステン、金、銀、スズ、鉛、タリウム、またはインジウムである、請求項98記載の基板。
- 前記層が、少なくとも98.5〜99%金属である、請求項98記載の基板。
- 前記層が、金属の均質層である、請求項98記載の基板。
- 各ピラーが、二酸化ケイ素または窒化ケイ素を含む、請求項98記載の基板。
- 各ピラーが、少なくとも98〜99%二酸化ケイ素である、請求項98記載の基板。
- 各ピラーの表面に付加された遊離アミノ末端を有するリンカー分子をさらに含む、請求項98記載の基板。
- 少なくとも1つのピラーの表面に付加された遊離アミノ末端を有するリンカー分子をさらに含む、請求項98記載の基板。
- 各ピラーの表面に付加された保護基を有するリンカー分子をさらに含む、請求項98記載の基板。
- 少なくとも1つのピラーの表面に付加された保護基を有するリンカー分子をさらに含む、請求項98記載の基板。
- 少なくとも1つのピラーの表面に付加されたカップリング分子をさらに含む、請求項98記載の基板。
- 各ピラーの表面に付加されたカップリング分子をさらに含む、請求項98記載の基板。
- ピラーの少なくとも1つの表面と接触している水溶性ポリマーをさらに含む、請求項98記載の基板。
- 各ピラーの表面と接触している水溶性ポリマーをさらに含む、請求項98記載の基板。
- ピラーの少なくとも1つの表面と接触しているゼラチン形態の水溶性ポリマーをさらに含む、請求項98記載の基板。
- ピラーの少なくとも1つの表面と接触している固体形態の水溶性ポリマーをさらに含む、請求項98記載の基板。
- ピラーの少なくとも1つの表面が、誘導体化されている、請求項98記載の基板。
- ピラーの少なくとも1つの表面に付加されているポリマー鎖をさらに含む、請求項98記載の基板。
- ポリマー鎖が、ペプチド鎖を含む、請求項98記載の基板。
- 少なくとも1つのピラーの表面への付加が、共有結合を介するものである、請求項124記載の基板。
- 各ピラーの表面が、正方形または長方形の形状である、請求項98記載の基板。
- シリコンウエハにカップリングされている、請求項98記載の基板。
- 特徴を付加するための基板を調製する方法であって、以下の工程を含む、方法:
金属を含み上表面および下表面を有する平面層と、該層の位置決めされた場所に機能的にカップリングされた複数のピラーとを含む基板を得る工程であって、各ピラーが、該層から延びる平面表面を有し、各ピラーの表面と該層の上表面の間の距離が1,000〜5,000オングストロームの間であり、各ピラーの表面が該層の上表面と平行であり、かつ複数のピラーが10,000/cm2超の密度で存在する、工程;ならびに
1つまたは複数のリンカー分子を複数のピラーに付加する工程。 - リンカー分子が、溶媒と、水溶性ポリマーと、水溶性リンカー分子と、水溶性カップリング試薬とを含むリンカー配合物を用いて付加される、請求項128記載の方法。
- リンカー分子が、保護基を含む、請求項129記載の方法。
- 特徴を付加するための表面を調製する方法であって、以下の工程を含む、方法:
表面を得る工程、ならびに
溶媒と、水溶性ポリマーと、水溶性リンカー分子と、水溶性カップリング試薬とを含むリンカー配合物を用いてリンカー分子を表面に付加する工程。 - リンカー分子が、保護基を含む、請求項131記載の方法。
- カップリング試薬を基板に付加する方法であって、以下の工程を含む、方法:
金属を含み上表面および下表面を有する平面層と、該層の位置決めされた場所に機能的にカップリングされた複数のピラーとを含む基板を得る工程であって、各ピラーが、該層から延びる平面表面を有し、各ピラーの表面と該層の上表面の間の距離が1,000〜5,000オングストロームの間であり、各ピラーの表面が該層の上表面と平行であり、リンカー分子が各ピラーの表面に付加されており、かつ複数のピラーが10,000/cm2超の密度で存在する、工程;ならびに
カップリング試薬を1つまたは複数のリンカー分子に付加する工程。 - カップリング試薬が、溶媒と、水溶性ポリマーと、水溶性カップリング分子と、水溶性中和試薬と、水溶性カップリング試薬とを含むカップリング配合物を用いて1つまたは複数のリンカー分子に付加される、請求項133記載の方法。
- 少なくとも1つのリンカー分子が、脱保護されたリンカー分子である、請求項133記載の方法。
- カップリング試薬が、アミノ酸である、請求項133記載の方法。
- カップリング試薬が、保護分子を含む、請求項133記載の方法。
- カップリング試薬を表面に付加する方法であって、以下の工程を含む、方法:
リンカー分子が付加された表面を得る工程、ならびに
溶媒と、水溶性ポリマーと、水溶性カップリング分子と、水溶性中和試薬と、水溶性カップリング試薬とを含むカップリング配合物を用いてカップリング試薬をリンカー分子に付加する工程。 - リンカー分子が、脱保護されたリンカー分子である、請求項138記載の方法。
- カップリング試薬が、アミノ酸である、請求項138記載の方法。
- カップリング試薬が、保護分子を含む、請求項138記載の方法。
- カップリング試薬を付加するための基板を調製する方法であって、以下の工程を含む、方法:
金属を含み上表面および下表面を有する平面層と、該層の位置決めされた場所に機能的にカップリングされた複数のピラーとを含む基板を得る工程であって、各ピラーが、該層から延びる平面表面を有し、各ピラーの表面と該層の上表面の間の距離が1,000〜5,000オングストロームの間であり、各ピラーの表面が該層の上表面と平行であり、リンカー分子が各ピラーの表面に付加されており、基板が光活性配合物と接触しており、かつ複数のピラーが10,000/cm2超の密度で存在する、工程;ならびに
紫外線光を基板に適用する工程。 - 光活性配合物が、水溶性光増感剤と、水溶性光活性化合物と、水溶性ポリマーと、溶媒とを含む、請求項142記載の方法。
- リンカー分子が、保護基を含む、請求項142記載の方法。
- 基板に対する光の適用により、リンカー分子から保護基が除去される、請求項142記載の方法。
- 光が、248nm光である、請求項142記載の方法。
- カップリング試薬を付加するための表面を調製する方法であって、以下の工程を含む、方法:
リンカー分子が付加されており、かつ水溶性光増感剤と、水溶性光活性化合物と、水溶性ポリマーと、溶媒とを含む光活性配合物と接触している表面を得る工程;ならびに
紫外線光を表面に適用する工程。 - リンカー分子が、保護基を含む、請求項147記載の方法。
- 基板に対する光の適用により、リンカー分子から保護基が除去される、請求項148記載の方法。
- 光が、248nm光である、請求項147記載の方法。
- 平面層を複数のピラーにカップリングさせる工程を含む、基板を製造する方法であって、平面層が金属を含みかつ上表面および下表面を有し、複数のピラーが該層の位置決めされた場所にカップリングされており、各ピラーが、該層から延びる平面表面を有し、各ピラーの表面と該層の上表面の間の距離が1,000〜5,000オングストロームの間であり、各ピラーの表面が該層の上表面と平行であり、かつ複数のピラーが10,000/cm2超の密度で存在する、方法。
- 表面を調製する方法であって、以下の工程を含む、方法:
二酸化ケイ素を含み、かつ水溶性光増感剤と、水溶性光活性化合物と、水溶性ポリマーと、溶媒とを含む光活性配合物と接触している表面を得る工程;ならびに
表面の上面にありかつ光活性配合物と接触している位置決めされた場所に紫外線光を適用する工程であって、表面上の各々の位置決めされた場所の表面積が10,000/μm2未満の総面積を有する、工程。 - 位置決めされた場所の外側にある光活性配合物を除去する工程をさらに含む、請求項152記載の方法。
- 位置決めされた場所の外側の表面の上面の厚みを減少させる工程をさらに含む、請求項153記載の方法。
- 厚みを減少させた表面の上面に金属層を堆積させる工程をさらに含む、請求項153記載の方法。
- 表面の上面にある位置決めされた場所と接触している光活性配合物を除去する工程をさらに含む、請求項153記載の方法。
- 試料中の関心対象のタンパク質の存在または非存在を検出する方法であって、以下の工程を含む、方法:
関心対象のタンパク質を含むことが疑われる試料と接触している請求項31記載のアレイを得る工程;および
アレイの1つまたは複数の特徴への結合の存在または非存在を検出することによって、関心対象のタンパク質が試料中に存在するかどうかを判定する工程。 - 候補ワクチンを同定する方法であって、以下の工程を含む、方法:
候補ワクチンを事前に投与された対象由来の試料と接触している請求項31記載のアレイを得る工程であって、試料が複数の抗体を含む、工程;および
アレイの1つまたは複数の特徴に対する該複数の抗体の結合特異性を決定する工程。 - 特徴が、既知の配列を有するソースタンパク質由来の部分配列を含む、特有の、入れ子になった、重複する複数のペプチド鎖を含む、請求項158記載の方法。
- 支持体にカップリングされた複数のペプチドを含むペプチドアレイであって、複数のペプチドが、既知の配列のソースタンパク質の重複する部分配列を含む、ペプチドアレイ。
- ソースタンパク質が、アルファグリアジンタンパク質、セカリンタンパク質、ホルデインタンパク質、サビナ(savina)タンパク質、プロラミンタンパク質、またはトランスグルタミナーゼタンパク質からなる群より選択される、請求項160記載のペプチドアレイ。
- ソースタンパク質が、アルファグリアジンタンパク質であり、重複する部分配列が、グルタミン残基からグルタミン酸残基への置換を含む少なくとも1つの変種配列をさらに含む、請求項160記載のペプチドアレイ。
- 支持体にカップリングされた複数のペプチドを含むペプチドアレイであって、複数のペプチドが、セリアック病と診断された対象由来の抗体によって認識されるエピトープを含むペプチド配列を含む、ペプチドアレイ。
- 複数のペプチドが、対象由来の抗体によって認識される少なくとも2つのエピトープ配列をさらに含むペプチドを含む、請求項163記載のペプチドアレイ。
- アレイが、基板表面の平方センチメートルあたり少なくとも10,000個のペプチド分子の密度で調製される、請求項160または163記載のペプチドアレイ。
- 支持体が、ペプチドアレイの表面上にピラーを含む、請求項160または163記載のペプチドアレイ。
- ペプチドアレイが、12アミノ酸長またはそれより短いアミノ酸長の複数のペプチドを含む、請求項160または163記載のペプチドアレイ。
- 障害を有することが疑われる対象において障害を診断する方法であって、以下の工程を含む、方法:
a. 請求項160〜167のいずれか一項記載のペプチドアレイを得る工程であって、ペプチドアレイが、障害を有すると診断された対象から得られる抗体によって認識されるエピトープを含むペプチド配列を含む、工程;
b. シグナルを生成するために、障害を有することが疑われる対象から得られた試料をペプチドアレイと接触させる工程;および
c. シグナルに基づき、対象において障害を診断する工程。 - 障害が、自己免疫障害または感染症である、請求項168記載の方法。
- 抗体が、自己免疫抗体である、請求項168記載の方法。
- 抗体が、IgG、IgA、IgM、IgDおよびIgEからなる群より選択される、請求項168記載の方法。
- エピトープを含むペプチド配列が、障害を有することが疑われる対象においてまたは障害を有することが疑われる対象から得られるリンパ球を含む試料において免疫応答を刺激することができる、請求項168記載の方法。
- 免疫応答が、エピトープを含むペプチドの存在下でのインターフェロンの増量によって測定される、請求項172記載の方法。
- エピトープが、対象由来のB細胞を刺激することができる、請求項168記載の方法。
- ペプチドアレイが、平方センチメートルあたり少なくとも10,000個のペプチド分子という特徴の密度を有する、請求項168記載の方法。
- ペプチドアレイが、請求項160または163記載のアレイである、請求項168記載の方法。
- ペプチドアレイが、複数のエピトープを含むペプチドを含む、請求項168記載の方法。
- エピトープが、配列「QPEQPF」を含む、請求項168記載の方法。
- 99%超の感度を有する、請求項168記載の方法。
- 99%超の特異性を有する、請求項168記載の方法。
- 障害のサブタイプを判定する、請求項168記載の方法。
- 障害の重篤度を判定する、請求項168記載の方法。
- 障害が、セリアック病である、請求項168記載の方法。
- 障害に関連するエピトープ配列を同定する方法であって、以下の工程を含む、方法:
a. 請求項160〜167のいずれか一項記載の第1のペプチドアレイを提供する工程;
b. 障害を有することが既知の対象から得られる生物学的流体と第1のペプチドアレイを接触させる工程;
c. 第1のペプチドアレイに付加された少なくとも1つのペプチド配列に対する、障害に関連する抗体の結合を検出するために、第1のペプチドアレイを分析する工程;および
d. 第1のペプチドアレイの表面に付加されたエピトープペプチド配列に対する抗体の結合パターンを比較することによって、少なくとも3個の連続するアミノ酸を含むエピトープ配列を同定する工程。 - 障害が、自己免疫障害、感染症、または癌である、請求項184記載の方法。
- 生物学的流体が、血液、血清、血漿、胆汁、粘液、膿汁、または尿からなる群より選択される、請求項184記載の方法。
- エピトープを含むペプチドの少なくとも60%が、障害に関連する抗体によって結合される、請求項184記載の方法。
- エピトープを含むペプチドの少なくとも70%が、障害に関連する抗体によって結合される、請求項184記載の方法。
- エピトープを含むペプチドの少なくとも80%が、障害に関連する抗体によって結合される、請求項184記載の方法。
- エピトープを含むペプチドの少なくとも90%が、障害に関連する抗体によって結合される、請求項184記載の方法。
- 第1のスクリーニング中、障害に関連する抗体に結合するエピトープを含むペプチドの百分率が、試料が障害に関して陰性である場合よりも試料が障害に関して陽性である場合の方が高い、請求項184記載の方法。
- 障害を診断するためのペプチドアレイを作製する方法であって、以下の工程を含む、方法:
a. 請求項160〜167のいずれか一項記載の第1のペプチドアレイを提供する工程;
b. 障害を有することが既知の対象から得られる生物学的流体と第1のペプチドアレイを接触させる工程;
c. 第1のペプチドアレイに付加された少なくとも1つのペプチド配列に対する、障害に関連する抗体の結合を検出するために、第1のペプチドアレイを分析する工程;
d. 第1のペプチドアレイに対する抗体の結合パターンから少なくとも3個の連続するアミノ酸を含むエピトープ配列を分析により決定する工程;および
e. 障害を診断するためのペプチドアレイを作製する工程であって、ペプチドアレイがエピトープ配列を含むペプチドを含む、工程。 - 障害が、自己免疫障害、感染症、または癌である、請求項192記載の方法。
- 自己免疫障害が、セリアック病である、請求項193記載の方法。
- 生物学的流体が、血液、血清、血漿、胆汁、粘液、膿汁または尿からなる群より選択される、請求項192記載の方法。
- 請求項192記載の方法によって同定されたエピトープを含む、単離されたペプチド。
- 請求項196記載の単離されたペプチドに結合する抗体。
- ペプチドアレイの表面に付加されている、請求項196記載の単離されたペプチド。
- 請求項196記載のペプチドを含むワクチン。
- 障害を有することが疑われる対象に請求項196記載のペプチドを含む組成物を投与する工程を含む、障害を処置する方法。
- 障害が、自己免疫障害、感染症または癌である、請求項200記載の方法。
- 自己免疫障害が、セリアック病である、請求項201記載の方法。
- ペプチドが、ワクチンの一部である、請求項200記載の方法。
- ペプチドが、アジュバントと組み合わせて対象に投与される、請求項200記載の方法。
- セリアック病を有することが疑われる対象においてセリアック病を診断するためのペプチドアレイであって、以下を含む、ペプチドアレイ:
a. セリアック病に関連する抗体に結合するエピトープ配列のセットを含むペプチドのセット;および
b. セリアック病に関連する炎症応答分子に結合するエピトープ配列を含むペプチド配列のセット。 - ペプチドアレイが、平方センチメートルあたり10,000個のペプチド分子という特徴の密度を有する、請求項205記載のペプチドアレイ。
- 複数の保護されていないカルボン酸側鎖基を含む第1の層を含む基板。
- 第1の層が、多孔質層である、請求項207記載の基板。
- カルボン酸側鎖基が、多孔質層の表面上で多方向に向けられている、請求項208記載の基板。
- 第1の層が、支持層にカップリングされている、請求項207または208記載の基板。
- 第1の層が、シリコンウエハにカップリングされている、請求項207または208記載の基板。
- 多孔質層が、デキストランを含む、請求項208記載の基板。
- 多孔質層が、多孔質シリカを含む、請求項208記載の基板。
- 多孔質層が、孔サイズ約2nm〜100μmの孔を含む、請求項208記載の基板。
- 多孔質層が、約10〜80%の多孔性を有する、請求項208記載の基板。
- 多孔質層が、約0.01μm〜約10,000μmの厚みを有する、請求項208記載の基板。
- 上表面および下表面を有する金属を含む平面層をさらに含む、請求項207または208記載の基板。
- 第1の層が、平面層にカップリングされている、請求項217記載の基板。
- 第1の層が、平面層の上面にコートされている、請求項217記載の基板。
- 複数のウェルをさらに含む、請求項217記載の基板。
- 基板が平面層の位置決めされた場所に機能的にカップリングされた複数のピラーをさらに含み、各ピラーが平面層から延びる平面表面を有し、各ピラーの表面と該層の上表面の間の距離が1,000〜5,000オングストロームの間であり、かつ複数のピラーが10,000/cm2超の密度で存在し、そして第1の層がピラーの平面表面に堆積されている、請求項217記載の基板。
- 各ピラーの表面の表面積が、少なくとも1μm2である、請求項221記載の基板。
- 各ピラーの表面の表面積が、10,000μm2未満の総面積を有する、請求項221記載の基板。
- 各ピラーの表面と前記層の下表面の間の距離が、2,000〜7,000オングストロームである、請求項221記載の基板。
- 平面層が、1,000〜2,000オングストローム厚である、請求項221記載の基板。
- 各ピラーの中心が、任意の他のピラーの中心から少なくとも2,000オングストロームである、請求項221記載の基板。
- 各ピラーの表面が、平面層の上表面と平行である、請求項221記載の基板。
- 各ピラーの表面が、平面層の上表面と実質的に平行である、請求項221記載の基板。
- 金属が、クロムである、請求項221記載の基板。
- 金属が、クロム、チタン、アルミニウム、タングステン、金、銀、スズ、鉛、タリウム、またはインジウムである、請求項221記載の基板。
- 平面層が、少なくとも98.5〜99重量%金属である、請求項221記載の基板。
- 平面層が、金属の均質層である、請求項221記載の基板。
- 各ピラーが、二酸化ケイ素または窒化ケイ素を含む、請求項221記載の基板。
- 各ピラーが、少なくとも98〜99重量%二酸化ケイ素である、請求項221記載の基板。
- カルボン酸基の少なくとも1つに付加された遊離アミノ末端を有するリンカー分子をさらに含む、請求項207または208記載の基板。
- カルボン酸基の少なくとも1つに付加された遊離カルボン酸基を有するリンカー分子をさらに含む、請求項207または208記載の基板。
- カルボン酸基の少なくとも1つに付加されたカップリング分子をさらに含む、請求項207または208記載の基板。
- カルボン酸基の少なくとも1つに付加されたポリマー鎖をさらに含む、請求項207または208記載の基板。
- ポリマー鎖が、ペプチド鎖を含む、請求項238記載の基板。
- ポリマー鎖が、共有結合を介してカルボン酸基の少なくとも1つに付加されている、請求項238記載の基板。
- 情報価値のあるペプチド配列のセットを同定する方法であって、以下の工程を含む、方法:
ある状態を有する対象から得られた試料中に存在するリガンドの、複数のペプチド配列に対する特異的結合を示す量的データを含むデータセットを得る工程;
特別にプログラムされたコンピュータを用いて、複数のペプチド配列中に存在する複数の部分配列を決定する工程;
該特別にプログラムされたコンピュータを用いて、複数のペプチド配列中での複数の部分配列の出現率の順位番号を決定する工程;および
決定された複数の部分配列の順位にしたがい情報価値のあるペプチド配列のセットを同定する工程。 - ある状態を有する対象から得られた複数の試料中に存在するリガンドの、複数の情報価値のあるペプチドに対する特異的結合を示す量的データを含むデータセットを得る工程であって、各々の情報価値のあるペプチドが複数の情報価値のあるペプチド配列を含む、工程;
特別にプログラムされたコンピュータを用いて、情報価値のあるペプチドの各々に特異的に結合する試料の小集団を決定する工程;および
該決定にしたがい、試料の少なくとも50%に特異的に結合することができる情報価値のあるペプチドのサブセットを同定する工程、
をさらに含む、請求項241記載の方法。 - 状態が、自己免疫状態、感染症状態および癌からなる群より選択される、請求項241記載の方法。
- 状態が、自己免疫状態である、請求項241記載の方法。
- 自己免疫状態が、セリアック病、エリテマトーデス、または関節リウマチである、請求項244記載の方法。
- 情報価値のあるペプチドのサブセットが、試料の少なくとも60%に特異的に結合することができる、請求項242記載の方法。
- 情報価値のあるペプチドのサブセットが、試料の少なくとも70%に特異的に結合することができる、請求項246記載の方法。
- 情報価値のあるペプチドのサブセットが、試料の少なくとも80%に特異的に結合することができる、請求項247記載の方法。
- 情報価値のあるペプチドのサブセットが、試料の少なくとも90%に特異的に結合することができる、請求項248記載の方法。
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