JP2015504893A - 変異抗体およびそのコンジュゲーション - Google Patents
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Abstract
Description
一部の態様では、本発明は、ATCCに寄託したとおりのベクターおよび核酸、前記ベクターおよび核酸によってコードされるポリペプチド、前記ベクターおよび核酸によってコードされるポリペプチドを含む組成物、ならびに前記核酸およびベクターが発現するポリペプチドを提供する。以下の材料をアメリカ培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection、10801 University Boulevard、Manassas、Virginia 20110−2209、USA(ATCC))に寄託してある:
一部の態様では、本発明は、エフェクター部分に共有結合的にコンジュゲートされている本発明のCLドメインを含む抗体またはその抗原結合部分の組成物または試料を提供し、ここで、組成物または試料中のエフェクター部分のうちの少なくとも約50%は、配列番号98のK5にコンジュゲートされている。一部の態様では、これは、少なくとも約60%である。一部の態様では、これは、少なくとも約70%である。一部の態様では、これは、少なくとも約80%である。一部の態様では、これは、少なくとも約90%である。
一部の態様では、これは、少なくとも約60%である。一部の態様では、これは、少なくとも約65%である。一部の態様では、これは、少なくとも約70%である。一部の態様では、これは、少なくとも約75%である。一部の態様では、これは、少なくとも約80%である。一部の態様では、これは、少なくとも約85%である。一部の態様では、これは、少なくとも約90%である。一部の態様では、これは、少なくとも約95%である。
エフェクター部分は、治療薬、タンパク質、ペプチド、核酸、アプタマー、低分子、タンパク質アゴニスト、タンパク質アンタゴニスト、代謝調節物質、ホルモン、毒素、成長因子、もしくは他の調節性タンパク質であってよいか、またはホースラディッシュペルオキシダーゼなどの容易に検出または可視化することができる酵素などの診断薬であってよい。
エフェクター部分を有するコンジュゲート、特に、コンジュゲートおよびMACを調製する方法に関する本発明の態様では、本発明は、エフェクター部分が存在しない状態でリンカーを有するコンジュゲートにも等しく当てはまることは理解されるであろう。そのようなコンジュゲートの有用性の例は、本発明のエフェクター部分−リンカー−ポリペプチドコンジュゲートを調製するために有用に使用することができる中間体としてのものであろう。
Z*は、抗体上のリシン側鎖に対する特異的な方向性共有結合的連結戦略が可能であるように選択することができる。例えば、いくつかの可能なアミド結合形成戦略のうちの1つを使用して、表面リシン側鎖のε−アミノと反応させるために、Zは、COOHまたは他の同様の反応性求電子試薬であってよい。
一部の態様では、本発明は、「切断不可能な」リンカーを含む本明細書に記載のとおりのMACを提供する。他の態様では、本発明は、「切断可能な」リンカーを含むMACを提供する。用語「切断可能なリンカー」は、本明細書では、所望の位置で積荷を放出するように、細胞内もしくは細胞外の酵素によってか、またはpHもしくはレドックス環境の変化を受けると分解するように設計されている、迅速に切断されるリンカーを記載するために使用される。例えば、切断可能なリンカーは、血漿中、血液中、または血清中では優先的に安定的であり得、細胞内環境では安定性が劣り得る。
適切なリンカー技術と一緒に使用する場合、本発明の標的化コンジュゲーション技術に関連して、オーリスタチンをベースとするエフェクター部分も有用である。具体的には、有用なペイロードには、薬学的に許容できる塩、水和物、および遊離塩基をすべて包含するPCT/IB2012/056224に開示されているものが包含される。
Y2は、−C2〜C20アルキレン−、−C2〜C20ヘテロアルキレン−;−C3〜C8カルボシクロ−、−アリーレン−、−C3〜C8ヘテロシクロ−、−Cl〜C10アルキレン−アリーレン−、−アリーレン−Cl〜Cl0アルキレン−、−Cl〜Cl0アルキレン−(C3〜C8カルボシクロ)−、−(C3〜C8カルボシクロ)−Cl〜C10アルキレン−、−Cl〜Cl0アルキレン−(C3〜C8ヘテロシクロ)−または−(C3〜C8ヘテロシクロ)−Cl〜Cl0アルキレン−であり、
Z2は、
R12は、水素、C1〜C8アルキル、またはC1〜C8ハロアルキルであり、
R13AおよびR13Bは、次の(i)または(ii)のいずれかであり:
(i)R13Aは、水素、C1〜C8アルキル、C1〜C8ハロアルキル、C3〜C8カルボシクリル、C1〜C10ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアラルキル、アラルキル、またはハロゲンであり、かつ
R13Bは、C1〜C8アルキル、C1〜C8ハロアルキル、C3〜C8カルボシクリル、C1〜C10ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアラルキルもしくはアラルキル、またはハロゲンであるか、または
(ii)R13AおよびR13Bは一緒になって、C2〜C8アルキレンまたはC1〜C8ヘテロアルキレンであり、
R14AおよびR14Bは、次の(i)または(ii)のいずれかであり:
(i)R14Aは、水素、C1〜C8アルキル、C1〜C8ハロアルキル、C3〜C8カルボシクリル、C1〜C10ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアラルキル、またはアラルキルであり、かつ
R14Bは、水素、C1〜C8アルキル、C1〜C8ハロアルキル、C3〜C8カルボシクリル、C1〜C10ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアラルキル、またはアラルキルであるか、または
(ii)R14AおよびR14Bは一緒になって、C2〜C8アルキレンまたはC1〜C8ヘテロアルキレンであり、
R15は、
−C1〜C8アルキル、−C1〜C8アルキル−N(R’)2、−C1〜C8アルキル−C(O)R’、−C1〜C8アルキル−C(O)OR’ −O−(C1〜C8アルキル)、−C(O)R’、−OC(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)N(R’)2、−NHC(O)R’、−S(O)2R’、−S(O)R’、−OH、ハロゲン、−N3、−N(R’)2、−CN、−NHC(=NH)NH2、−NHCONH2、−S(=O)2R’および−SR’(ここで、各R’は、水素、C1〜C8アルキル、および非置換のアリールからなる群から独立に選択されるか、または2個のR’は、それらが結合している窒素と一緒に、C1〜C10ヘテロシクリルを形成することができる)からなる群から独立に選択される1、2、3、4または5個の基で置換されていてもよい
R15は、
C1〜C8アルキル、−C1〜C8アルキル−N(R’)2、−C1〜C8アルキル−C(O)R’、−C1〜C8アルキル−C(O)OR’、−O−(C1〜C8アルキル)、−C(O)R’、−OC(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)N(R’)2、−NHC(O)R’、−S(O)2R’、−S(O)R’、−OH、ハロゲン、−N3、−N(R’)2、−CN、−NHC(=NH)NH2、−NHCONH2、−S(=O)2R’、−SR’およびアリーレン−R’(ここで、各R’は、水素、C1〜C8アルキル、C1〜C8ヘテロシクリル、C1〜C10アルキレン−C3〜C8ヘテロシクリル、およびアリールからなる群から独立に選択されるか、または2個のR’は、それらが結合している窒素と一緒に、C1〜C10ヘテロシクリルを形成することができる)からなる群から独立に選択される1、2、3、4、または5個の基で置換されていてもよい
R16は、水素、−C1〜C8アルキル、−C2〜C8アルケニル、−C2〜C8アルキニル、または−C1〜C8ハロアルキルであり、
R22は、水素、C1〜C4アルキル、C1〜C10ヘテロシクリル、またはC6〜C14アリールであり、
R23は、C1〜C10ヘテロシクリルであり、
R17は、出現する毎に、F、Cl、I、およびBrからなる群から独立に選択され、
R20は、−アリール、−Cl−Cl0アルキレン−アリールであり、その際、アリールを含むR10上のアリールは、[R17]hで置換されており、
hは、5であり、
Xは、OまたはSであるが、
ただし、R13Aが水素である場合、XはSであることを条件とする]。
一部の態様では、本発明は、抗体または抗原結合部分を含む多機能性抗体コンジュゲート(MAC)を調製する方法を提供し、抗体は、配列番号98のK5(または配列番号98の範囲内に該当する本明細書に開示されている配列番号)の側鎖に、または抗体定常ドメイン上の残基K(Kの位置は、配列番号6の残基77またはKabatナンバリングによる定常軽鎖ドメインの残基185と一致する)の側鎖に結合されているリンカーを介して、少なくとも1個のエフェクター部分に共有結合的にコンジュゲートされており、前記方法は、エフェクター部分を式:
の脱離基を含むリンカーとコンジュゲートさせるステップと、その脱離基を配列番号98のK5の側鎖と反応させるステップとを含む。
本発明は、MACおよび薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容できる担体」には、生理学的に適合性のあらゆるすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張性の吸収遅延剤などが包含される。薬学的に許容できる担体の例には、水、生理食塩水、リン酸緩衝溶液、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうちの1種または複数、さらにはこれらの組合せが包含され、等張化剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムが組成物中に包含され得る。抗体もしくは抗体部分の貯蔵寿命もしくは有効性を高める湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤、または緩衝液などの湿潤物質あるいは少量の補助物質などの薬学的に許容できる物質。
本発明は、治療方法も提供する。治療方法は、本発明の化合物または組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
免疫グロブリン(Ig)ドメインは、グリークキートポロジーで2つのβシートに配置された7〜9の逆平行βストランドの2層サンドイッチからなるタンパク質ドメインの1種である。βストランドは、ほぼ完全に伸びたコンホメーションにある主鎖を有する典型的には3〜10アミノ酸長さのポリペプチド鎖の伸張である。βシートは、少なくとも2つまたは3つの主鎖水素結合によって、側面で接続されたβストランドからなり、一般的には、ねじれたプリーツ状のシートを形成している。主鎖は、2つのβシートの間で繰り返しスイッチしている。典型的には、そのパターンは、(シート1中のN末端β−ヘアピン)−(シート2中のβ−ヘアピン)−(シート1中のβストランド)−(シート2中のC末端β−ヘアピン)である。シート間の交差は「X」を形成していて、N末端ヘアピンおよびC末端ヘアピンが、互いに向き合うようになっている。Igスーパーファミリーのメンバーは、種々の機能を有する数百種類のタンパク質において見出されている。例には、抗体、ジャイアントマッスルタイチン(giant muscle kinase titin)、および受容体チロシンキナーゼが包含される。Ig様ドメインは、タンパク質−タンパク質およびタンパク質−リガンド相互作用に関係していることもある。
抗原結合ドメインを含む一部の実施形態では、抗原結合ドメイン(例えば、これらだけに限定されないが、6つのCDRすべてを有する抗体可変領域、または抗体可変領域と少なくとも90パーセント同一である同等な領域)は、アバゴボマブ、アバタセプト(ORENCIA(登録商標))、アブシキシマブ(REOPRO(登録商標)、c7E3 Fab)、アダリムマブ(HUMIRA(登録商標))、アデカツムマブ、アレムツズマブ(CAMPATH(登録商標)、MabCampathもしくはCampath−1H)、アルツモマブ、アフェリモマブ、アナツモマブマフェナトックス、アネツムマブ、アンルキズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ、アトリズマブ、アトロリムマブ、バピネウズマブ、バシリキシマブ(SIMULECT(登録商標))、バビツキシマブ、ベクツモマブ(LYMPHOSCAN(登録商標))、ベリムマブ(LYMPHO−STAT−B(登録商標))、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、βセプト(EMBREL(登録商標))、ベバシズマブ(AVASTIN(登録商標))、ビシロマブブラロバルビタール、ビバツズマブメルタンシン、ブレンツキシマブベドチン(ADCETRIS(登録商標))、カナキヌマブ(ACZ885)、カンツズマブメルタンシン、カプロマブ(PROSTASCINT(登録商標))、カツマキソマブ(REMOV AB(登録商標))、セデリズマブ(CIMZIA(登録商標))、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ(ERBITUX(登録商標))、クレノリキシマブ、ダセツズマブ、ダクリキシマブ、ダクリズマブ(ZENAP AX(登録商標))、デノスマブ(AMG 162)、デツモマブ、ドルリモマブアリトックス、ドルリキシズマブ、ダンツムマブ、デュリムルマブ、デュルムルマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ(SOLIRIS(登録商標))、エドバコマブ、エドレコロマブ(Mabl7−1A、PANOREX(登録商標))、エファリズマブ(RAPTIVA(登録商標))、エフングマブ(MYCOGRAB(登録商標))、エルシリモマブ、エンリモマブペゴール、エピツモマブシツキセタン、エファリズマブ、エピツモマブ、エプラツズマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ(REXOMUN(登録商標))、エタラシズマブ(エタラツズマブ、VITAXIN(登録商標)、ABEGRIN(商標))、エクスビビルマブ、ファノレソマブ(NEUTROSPEC(登録商標))、ファラリモマブ、フェルビズマブ、フォントリズマブ(HUZAF(登録商標))、ガリキシマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ(ABX−CBL(R))、ゲムツズマブオゾガマイシン(MYLOTARG(登録商標))、ゴリムマブ(CNTO 148)、ゴミリキシマブ、イバリズマブ(TNX−355)、イブリツモマブチウキセタン(ZEVALIN(登録商標))、イゴボマブ、イムシロマブ、インフリキシマブ(REMICAD E(登録商標))、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ(YERVOY(登録商標)、MDX−010)、イラツムマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、レマレソマブ、レブリリズマブ、レルデリムマブ、レキサツムマブ(HGS−ETR2、ETR2−ST01)、レキシツムマブ、リビビルマブ、リンツズマブ、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ(HGS−ETRI、TRM−I)、マスリモマブ、マツズマブ(EMD72000)、メポリズマブ(BOSATRIA(登録商標))、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モロリムマブ、モタビズマブ(NUMAX(商標))、ムロモナブ(OKT3)、ナコロマブタフェナトックス、ナプツモマブエスタフェナトックス、ナタリズマブ(TYSABRI(登録商標)、ANTEGREN(登録商標))、ネバクマブ、ネレリモマブ、ニモツズマブ(THERACIM hR3(登録商標)、THERA−CIM−hR3(登録商標)、THERALOC(登録商標))、ノフェツモマブメルペンタン(VERLUMA(登録商標))、オクレリズマブ、オデュリモマブ、オファツムマブ、オマリズマブ(XOLAIR(登録商標))、オレゴボマブ(OVAREX(登録商標))、オテリキシズマブ、パギバキシマブ、パリビズマブ(SYNAGIS(登録商標))、パニツムマブ(ABX−EGF、VECTIBIX(登録商標))、パスコリズマブ、ペムツモマブ(THERAGYN(登録商標))、ペルツズマブ(2C4、OMNITARG(登録商標)、ペキセリズマブ、ピンツモマブ、ポネズマブ、プリリキシマブ、プリツムマブ、ランビズマブ(LUCENTIS(登録商標))、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リツキシマブ(RITUXAN(登録商標)、MabTHERA(登録商標))、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サツモマブ、セビルマブ、シブロツズマブ、シプリズマブ(MEDI−507)、ソンツズマブ、スタムルマブ(Myo−029)、スレソマブ(LEUKOSCAN(登録商標))、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タプリツモマブパプトックス、テフィバズマブ(AUREXIS(登録商標))、テリモマブアリトックス、テネリキシマブ、テプリズマブ、チシリムマブ、トシリズマブ(ACTEMRA(登録商標))、トラリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ(HERCEPTIN(登録商標))、トレメリムマブ(CP−675,206)、ツコツズマブセルモロイキン、ツビルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ(CNTO 1275)、バパリキシマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ビシリズマブ(NUVION(登録商標))、ボロシキシマブ(M200)、ボツムマブ(HUMASPECT(登録商標))、ザルツムマブ、ザノリムマブ(HuMAX−CD4)、ジラリムマブ、またはゾリモマブアリトックスから選択される。
、SERPINFl、SHIP−I、SHIP−2、SHBl、SHB2、SHBG、SfcAZ、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、SLIT2、SPPl、SPRRlB(Sprl)、ST6GAL1、STABl、STAT6、STEAP、STEAP2、SULF−1、Sulf−2、TB4R2、TBX21、TCPlO、TDGFl、TEK、TGFA、TGFBl、TGFBlIl、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBRl、TGFBR2、TGFBR3、THlL、THBSl(トロンボスポンジン−1)、THBS2/THBS4、THPO、TIE(Tie−1)、TIMP3、組織因子、TIKI2、TLR10、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6JLR7、TLR8、TLR9、TM4SF1、TNF、TNF−a、TNFAIP2(B94)、TNFAIP3、TNFRSFIlA、TNFRSFlA、TNFRSFlB、TNFRSF21、TNFRSF5、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFSFlO(TRAIL)、TNFSFl 1(TRANCE)、TNFSF12(AP03L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM−L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF 18、TNFSF4(OX40リガンド)、TNFSF5(CD40リガンド)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27リガンド)、TNFSF8(CD30リガンド)、TNFSF9(4−1BBリガンド)、TOLLIP、Toll様受容体、TLR2、TLR4、TLR9、T0P2A(トポイソメラーゼIia)、TP53、TPMl、TPM2、TRADD、TRAFl、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、TRKA、TREMl、TREM2、TRPC6、TROY、TSLP、TWEAK、チロシナーゼ、uPAR、VEGF、VEGFB、VEGFC、バーシカン、VHL C5、VLA−4、Wnt−1、XCLl(リンホタクチン)、XCL2(SCM−Ib)、XCRl(GPR5/CCXCRl)、YYl、およびZFPM2から選択される1種または複数の標的に結合し得る。
本発明の一部の態様では、MACは、触媒抗体またはその抗原結合部分を含む。一部の態様では、抗体は、アルドラーゼ抗体であってよい。
ターゲティング作用剤(TA)を触媒抗体の結合部位に接続するために適したある種のリンカー(触媒抗体リンカー:CAb−リンカー)は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第2009098130号に開示されている。用語「ターゲティング作用剤」を、用語「エフェクター部分」と区別するために本明細書において使用するが、CAb−リンカーの末端にTAとして結合されているか、またはMAC−リンカーの末端にエフェクター部分として結合されている分子の種類が互換的であってよいことは明白である。特に、(CAb−リンカーを記載する一般式、具体的なCAb−リンカー構造、CAb−リンカーの合成、ならびにP1、Q1、およびW1の異なる要素(そこでは、それぞれX、Y、およびZ基として分類されている)の組合せに関する米国特許出願公開第2009098130号の態様は、具体的、かつ一般的に本明細書に記載されているかのように、本明細書に包含される。
アシルリシンまたは
Kac(AcKも)は、
タンパク質および時にはRNA配列に通常は特異的な構造的アラインメントでは、配列をアラインさせる際の助けとなるように、タンパク質またはRNA分子の二次および三次構造についての情報を使用する。これらの方法は、2つ以上の配列のために使用され、典型的にはローカルアラインメントをもたらす;しかしながら、これらは、構造情報の利用可能性に依存しているので、その対応する構造が既知(通常は、X線結晶学またはNMR分光法によって)である配列でしか使用することができない。タンパク質およびRNA構造は両方とも、配列よりも進化的に保存されているので、非常に離れた関連を有し、配列を比較しても、その類似性を確かに検出することができないほど広範に異なっている配列の間では、構造的アラインメントは、より信頼性が高くなり得る。タンパク質の一方について利用可能な構造データが存在しない場合でも、構造データが一方について、または好ましくは、種を超えた免疫グロブリン、特に種およびサブタイプを超えた抗体定常ドメインなどの、より近い関連タンパク質について利用可能であるならば、比較を行うことができる。
例えば、標的配列NMRまたは結晶構造データが存在しないことによって、本発明の配列との構造的アラインメントが不可能である場合には、配列アラインメントを使用することができる。当業者は、配列アラインメントツール(本明細書に記載のものなど、当業者に知られているBLAST、CLUSTALなど)を熟知しており、既知の構造モチーフに従って、特に、免疫グロブリンドメイン、抗体、および抗体定常ドメインについての、特にサブタイプおよび種を超えて既に存在する多数の例示的な構造的研究によって、配列を、特に、抗体定常ドメイン配列をアラインさせることができる。
質量分析法によってインタクトな質量測定を使用して、コンジュゲーション付加(CA)を抗体骨格で測定する。コンジュゲートすると、インタクトな生成物の全体質量は、コンジュゲートされたペプチド、毒素などの付加の質量および数の分だけ増大する。複数の付加が起こった場合、コンジュゲート形態の分布は質量スペクトルで観察され、各コンジュゲート形態の観察されたシグナル強度によって定量測定が得られる。この分析は常套的に表で、観察されたCA形態すべてに対するパーセンテージとして、各CA形態を列挙することによって提示される。平均CA(例えば:骨格上に存在するCAの全体数)は、平均コンジュゲート負荷を説明する追加の値である。2つのコンジュゲート薬物生成物の例を以下に提供する。例1は、CAの一様な分布を平均CA=2.00個で有する。例2は、2CAの存在にかなり偏った分布を、軽微な量の他のコンジュゲーション形態と共に有する。平均CAは、これらの例の間で(2.13個と2.00個とで)同様であるが;しかしながら、例1は、比較的多いコンジュゲーション形態からなるより不均一な生成物であり、例2は、主として2CAを含有するより均一な生成物である。
抗体骨格への薬物コンジュゲートの部位特異的結合を決定するために、ペプチドマップを生成する。ペプチドマップは、コンジュゲート薬物生成物のタンパク分解性消化後に生成するペプチドを詳細に特徴づけするためのタンパク質配列の分析である。タンパク質が消化されたら、生じたペプチドを、逆相液体クロマトグラフィーと質量分析検出(RPLC/MS)とによって分析する。ディスクリートな(discreet)アミノ酸残基におけるコンジュゲーション付加の存在は、コンジュゲートされていないペプチドと比較すると、対応する質量シフトとして観察される。このプロセスを、標的リシン残基に対してPFP反応性エステルを使用する複数のコンジュゲート付加でコンジュゲートされている複数の抗体で繰り返す(データは、以下に、かつ他にもその内容全体が本明細書に組み込まれているWO2012007896において提示されている)。これらの研究において、以下の観察が一致した:(1)コンジュゲート付加は、HCよりもLCにおいてより頻繁に観察され、(2)CLκ−K80は、修飾される特に好ましい残基であり、(3)複数の他の位置も、LCおよびHCの両方で修飾される;しかしながら、それぞれ別の部位が、低いレベルで修飾される。まとめると、ハロ−フェニルエステルコンジュゲーションは、CLκ−K80の好ましい修飾をもたらし、追加のコンジュゲーションは、複数の残基全体で低いレベルに分布している。この理由で、2コンジュゲート付加について高い%CA値をもたらすように、コンジュゲーションプロセスは一般的に最適化されるが、それというのも、このことによって、各LCにおいて単一の位置で完全にコンジュゲートされている生成物が促進されるためである。0〜1コンジュゲートの高い%CAレベルは好ましいCLκ−K80修飾をもたらす一方で、これらのコンジュゲート形態は、かなりの量の未反応骨格も意味する。2個を大きく超える平均CA値を示す生成物は、ディスクリートな残基を標的としないコンジュゲート付加の存在を示唆している。HCおよびLCを還元し、別々に分析すると、1CAの%値は、単一のLC種におけるコンジュゲーション%を示しており、したがって、CLκ−K80残基へのコンジュゲーション効率の信頼可能な指標である。
本発明で使用されるペプチドの例示的な合成
ペプチド鎖の組み立てを0.1mmol規模で行った。使用した樹脂は、Fmoc−Rink−PL樹脂(150mg、0.67mmol/g置換)であった。標準的なFmoc化学プロトコルを使用して、ペプチドを組み立てた。Fmocの除去は、20%ピペリジン/DMFで3×5分間であり、すべての樹脂の洗浄ステップはDMFを使用した。アミノ酸を組み込むために、各残基について、HBTU/HOBt/NMM活性化を使用する1回のカップリングステップを2時間使用した。連結残基(KSH)を、Fmoc−Lys(Nε−メルカプトプロピオン酸−S−Trt)−OHとして組み込んだ。鎖を組み立てたら、N末端Fmoc基を除去し、ペプチド樹脂をアセチル化によってキャップした。最終の樹脂をDCMで洗浄し、一晩真空中で乾燥させた。
コンジュゲーション戦略
5種類の異なるコンジュゲーション戦略を、ペプチドを抗体にコンジュゲートさせるために考察した(例示的な構造は、配列番号27−KSH 11および2.12.1.fxを使用して示されている)(完全な詳細は、その内容全体が本明細書に組み込まれている2011年7月11日出願のPCT/US2011/053092の実施例において提示されている)。簡単には、NHSエステル、マレイミド、スクアリン酸エステル、AZD、およびハロ−フェニルエステルをすべて、抗体への方向性コンジュゲーションを開発するための有望な機構として調査した。
ペンタフルオロフェニルエステル(PFP)の合成
抗体コンジュゲーション
MAC−1およびMAC−2の例示的抗体−エフェクター部分コンジュゲートを、抗体2.12.1.fx(配列番号1および配列番号2)をAng2結合ペプチド(配列番号27)とコンジュゲートさせることによって製造した。MAC−1は、2.12.1.fx−[PEG2−MAL−KSH 11−配列番号27]が得られるように、[PFP−PEG2−MAL−KSH 11−配列番号27]にコンジュゲートされている2.12.1.fxを含み、MAC−2は、2.12.1.fx−[PEG5−K11−配列番号27]が得られるように、[PFP−PEG5−K11−配列番号27]にコンジュゲートされている2.12.1.fxを含む。
PFPベースのコンジュゲーションのための条件の最適化
特異的コンジュゲーションのために最適な反応条件を確立するために、一連のアッセイを実行した。それぞれの反応物のコンジュゲーションの終了時に、反応物をコハク酸塩およびグリシン緩衝液でクエンチして、pHを約5.5に低下させ、あらゆる遊離ペプチドまたはペプチド/リンカーをクエンチした。エレクトロスプレー飛行時間型質量分析法検出を、続いて、サイズ排除クロマトグラフィーカラムを介しての塩および添加剤からのタンパク質の分離を使用して、MACのインタクトな分子量(MW)を測定することによって、MAC−2の分析を行った。
2.12.1.fx抗体を18mg.ml−1に、pH7.7でリン酸緩衝液を用いて、0.06Mのリン酸ナトリウムの最終濃度に調整した。[PFP−PEG5−K11−配列番号27]を、プロピレングリコール溶液中で10mg.ml−1に再構成した。[PFP−PEG5−K11−配列番号27]を、2.12.1.fx抗体に4.3:1のモル比で加え、18、22、または25℃で2時間反応させた。結果を表3に示す。
2.12.1.fx抗体を18mg.ml−1に、pH6.5、6.75、7.0、7.25、7.5、7.75、または8.0でリン酸緩衝液を用いて、0.06Mのリン酸ナトリウムの最終濃度に調整した。[PFP−PEG5−K11−配列番号27]を、プロピレングリコール溶液中で10mg.ml−1に再構成した。[PFP−PEG5−K11−配列番号27]を、2.12.1.fxに4.3:1のモル比で加え、2時間室温で反応させた。結果を表4に示す。
2.12.1.fxを18mg.ml−1に、pH7.7でリン酸緩衝液を用いて、0.06Mのリン酸ナトリウムの最終濃度に調整した。[PFP−PEG5−K11−配列番号27]を、プロピレングリコール溶液中で10mg.ml−1に再構成した。[PFP−PEG5−K11−配列番号27]を、2.12.1.fxに4.3:1のモル比で加え、30、60、120、180、240、300、または2400分間、室温で反応させた(表6)。
2.12.1.fxを18mg.ml−1に、pH7.5でHEPES緩衝液を用いて、0.2MのHEPESの最終濃度に調整した。[PFP−PEG5−K11−配列番号27]を、プロピレングリコール溶液中で10mg.ml−1に再構成した。[PFP−PEG5−K11−配列番号27]を、2.12.1.fxに1、2、3,4、および5:1のモル比で加え(表7)、室温で少なくとも2時間反応させたが、高濃度のHEPES緩衝液は、コンジュゲーションの減少をもたらした。
様々な濃度での[PFP−PEG5−K11−配列番号27]との2.12.1.fxのコンジュゲーションプロファイルを分析した。2.12.1.fxを>50mg/mLに濃縮し、20mMの酢酸ナトリウム、pH5.5の200mのトレハロースで所望の濃度に希釈し、60mMのpH7.7のリン酸ナトリウムでスパイクした。[PFP−PEG5−K11−配列番号27]を50%のプロピレングリコールで再懸濁し、抗体と4.3:1のモル比で混合し、一晩室温で反応させた。すべての試料を2mg/mlに希釈し、サイズ排除クロマトグラフィー−質量分析法(SEC−MS)によってインタクトなコンジュゲートタンパク質として分析して、タンパク質のコンジュゲート形態の数および量を決定した。この技術で、各タンパク質の形態の分子量を測定する;複数のコンジュゲーション部位は、ペプチドの質量差によって分離される別個のシグナルとして観察される。複数のコンジュゲーション種の相対的な定量化を、シグナルの大きさを測定することによって行う。表11は、抗体の様々な濃度でのペプチドとの2.12.1.fxのコンジュゲーションプロファイルを示している。10mg/mL〜50mg/mLの抗体濃度では、コンジュゲーションは、1.8個以上の付加の平均で、0〜5個の付加の分布で起こる。0.5〜5mg/mLの抗体濃度では、コンジュゲーションは、1.5個以下の付加の平均で、0〜3個の付加の分布で起こる。
2.12.1.fxを18mg.ml−1に、pH7.7で炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、またはリン酸ナトリウム緩衝液を用いて、0.05Mのリン酸ナトリウムの最終濃度に調整した。[PFP−PEG5−K11−配列番号27]を、プロピレングリコール溶液中で10mg.ml−1に再構成した。[PFP−PEG5−K11−配列番号27]を、2.12.1.fxに、1、2、3、4、または5:1のモル比で加え、室温で2時間反応させた。低い反応pHは、コンジュゲーションレベルの低下をもたらした(表12)。
プロピレングリコール:2.12.1.fxを18mg.ml−1に、pH7.7でリン酸緩衝液を用いて、0.06Mのリン酸ナトリウムの最終濃度に調整した。[PFP−PEG5−K11−配列番号27]を、プロピレングリコール溶液中で20mg.ml−1に再構成した(コンジュゲーション反応物中5%のプロピレングリコール)。[PFP−PEG5−K11−配列番号27]を、2.12.1.fxに4.3:1のモル比で加え、追加の0〜15%のプロピレングリコールでスパイクし(5、10、15、および20%の最終プロピレングリコールのパーセンテージ)、室温で2時間反応させた。結果を表15に示す。
エフェクター部分(この実施例では、ペプチド)と抗体のモル比が、約3.5:1未満に低下した場合、コンジュゲーションレベルは、表9に示すように低下する。代わって、表10は、モル比を増大させると、コンジュゲーションレベルの増大が生じることを示す。抗体1個当たりのペプチドの数を増大させることは一般的に、その抗原(この場合、IGF1R受容体)に対する抗体(この場合、2.12.1 fx)の結合効率を低下させ、したがって、ペプチドと抗体のモル比は、抗体−抗原、およびペプチド−同族の結合の両方を最大にするように最適化された。
抗体上におけるコンジュゲートされたペプチドの位置
MAC−2薬物生成物分子は、2.12.1.fx抗体(α−IGF1R−1)に結合された1〜4個の[PEG5−K11−配列番号27]分子の分布からなる。これは、サイズ排除クロマトグラフィーカラムを介しての塩および添加剤からのタンパク質の分離後に、エレクトロスプレー飛行時間型質量分析検出を使用してMAC−2のインタクトな分子量(MW)を測定することによって決定された。2.12.1.fxおよび3ロットのMAC−2のMWを実証する質量分析データを、図2に示す。図1Aは、コンジュゲーション前の2.12.1.fxを示す。これは、単一のMWを示す均一な分子である。MAC−2のロットは、2.12.1.fxにコンジュゲートされたペプチドの分布を示す;1〜4個のコンジュゲーション付加(CA)が観察される。それぞれの形態の相対量は、ロット間で一貫しており、各ロットにおける最も普通の形態は、それぞれの個々の2.12.1.fx抗体に結合された2個のペプチド(配列番号27)を有する。
断片番号:N末端からのキモトリプシン断片ナンバリング;接合された断片(すなわち、Y1−2)は、欠損した開裂部位を示す。
始点/終点:N末端からの断片位置のナンバリング。
ペプチド質量(Da):ダルトンで記載された断片の理論的質量。
保持時間(対照/分析物):LCMS断片マッピング実験におけるクロマトグラフィーの保持/溶離の時間。
MSシグナル強度(対照/分析物):MSによって観察された観察シグナルの大きさ。
質量誤差−ppm(対照/分析物):断片の理論質量と観察質量との比較;>10、特にゼロ(0)に近い値は、良好な質量確度を実証している。
修飾物質:断片に対する潜在的共有結合的付加;Lys残基のペプチド−抗体結合断片、CAM−システイン残基のカルボキシメチル化。
アステリスクは、個々の断片の修飾された(例えば、コンジュゲートされた)バージョンを示す。
Pepは、コンジュゲートされたペプチドを示す。
MAC生成物の抗力の実証
MAC−1およびMAC−2のin vitroおよびin vivoアッセイの完全な詳細は、PCT/US2011/053092(WO2012/007896)の実施例において得られる。一部の実施例では、Ang2−h38C2−IgG1を対照として使用した。Ang2−h38C2の生成および構造は、その内容が、本明細書に組み込まれているWO2008056346において化合物43として、特に化合物43の生成に関する態様について完全に記載されている。簡単には、その構造は以下のとおりである:
in vivo薬物動態
PK研究を、オスのSwiss Websterマウスおよび2匹のオスのカニクイザル(Macaca fascicularis)を使用して行った。PK研究の完全な詳細は、PCT/US2011/053092の実施例において得られる。マウスでは、MAC−1およびMAC−2は、383〜397時間のβ相半減期を有する親抗IGF1R抗体と同様の滞留時間を実証した。MAC−1およびMAC−2 Ang2結合性能は、マウスにおいて、単回静脈内投与研究で、105〜120時間のT1/2を有するAng2−h38c2と同様の滞留時間を実証した。カニクイザルでは、MAC−2は、100.4時間のT1/2を有する親抗IGF1R抗体よりもやや短い滞留時間を実証した。MAC−2 Ang2結合性能は、97.8時間のT1/2を有するAng2−h38c2と同様の滞留時間を実証した。
in vivo薬理学
MAC−2の抗腫瘍活性を、Colo205(ヒト結腸腺癌)またはMDA−MB−435(黒色腫)異種移植モデルで評価した。腫瘍研究の完全な詳細は、PCT/US2011/053092(WO2012/007896)の実施例において得られる。Ang2−h38c2または抗IGF1R抗体(2.12.1.fx)の週1回の投与は、Colo205腫瘍増殖を阻害した。週1回投与するAng2−h38c2および抗IGF1R抗体の組合せは、Colo205腫瘍増殖の阻害において追加的な利益を示した。MAC−2単独を週1回投与しても、組合せと同様の利益が示された。別の試験において、MAC−2は、Colo205腫瘍増殖および最終腫瘍重量を用量依存的に阻害した。
様々な抗体のペプチドコンジュゲーションプロファイル
いくつかの異なる抗体のペプチドとのコンジュゲーションプロファイルを、配列番号27およびPEG5をそれぞれ例示的ペプチドおよびリンカーとして使用して分析した。すべての試験された抗体は、十分に画定され、特徴づけされた抗原相互作用を持つヒトIgG抗体または完全ヒト化IgG抗体であった。hAbλテストは、CLλ(hIL22:配列番号136および137)を含む一方で、2.12.1.fx、mAbκテスト1(参照によって本明細書に組み込まれている米国特許7537762号に開示されているとおりのIgG2抗Alk1抗体)、h38C2−IgG1(配列番号64および65)、およびh38C2−IgG2(配列番号64および66)はそれぞれ、CLκを含む。それぞれの抗体を、20mMのpH7.0のHEPESに緩衝液交換し、5〜20mg/mLに濃縮した。[PFP−PEG5−K11−配列番号27]を、50%のプロピレングリコールで再懸濁し、該当する抗体と4.3:1のモル比で混合し、室温で少なくとも2時間反応させた。すべての試料を2mg/mlに希釈し、サイズ排除クロマトグラフィー−質量分析(SEC−MS)によって、インタクトなコンジュゲートされたタンパク質として分析して、コンジュゲート形態のタンパク質の数および定量化を決定した。この技術で、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定する;複数のペプチドコンジュゲーション部位は、結合したペプチドの質量差によって分離された別個のシグナルとして観察される。複数のペプチドコンジュゲーション種の相対的定量化を、シグナルの大きさを測定することによって行う。表22は、様々な抗体のペプチドコンジュゲーションプロファイルを示す。
IgG2−κ抗体のペプチドコンジュゲーションプロファイル
IgG2−κ抗体(hAbκテスト2)と39−マーペプチドとのコンジュゲーションプロファイルを分析した(配列番号164)。抗体を8mg/mLに濃縮し、pH8.0の40mMのHEPESに緩衝液交換した。ペプチドを100%のDMSOで再懸濁し、抗体と5.0:1のモル比で混合し、室温で一晩反応させた。すべての試料を2mg/mlに希釈し、サイズ排除クロマトグラフィー−質量分析(SEC−MS)によって、インタクトなコンジュゲートされたタンパク質として分析して、コンジュゲート形態のタンパク質の数および定量化を決定した。この技術で、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定する;複数のペプチドコンジュゲーション部位は、ペプチドの質量差によって分離された別個のシグナルとして観察される。複数のペプチドコンジュゲーション種の相対的定量化を、シグナルの大きさを測定することによって行う。表29は、39−マーペプチドとのhAbκテスト2のペプチドコンジュゲーションプロファイルを示している。ペプチドのコンジュゲーションは、0〜4個のCAの分布で起こり、2.03個のCAの平均であり、CLκ−K80上の方向性コンジュゲーションと一致する。
2.12.1.fx Fabへのビオチンのコンジュゲーション
2.12.1.fxのFab領域(配列番号4および64)とPFP−ビオチンとのコンジュゲーションプロファイルを分析した。抗体Fabを20mg/mLに濃縮し、pH5.5の20mMの酢酸ナトリウム+200mMのトレハロースに緩衝液交換し、pH7.7の60mMのリン酸ナトリウムでスパイクした。PFP−ビオチンを100%のDMSOで再懸濁し、抗体と一連のモル比で混合し、室温で一晩反応させた。すべての試料を2mg/mlに希釈し、サイズ排除クロマトグラフィー−質量分析(SEC−MS)によって、インタクトなコンジュゲートされたタンパク質として分析して、コンジュゲート形態の数および定量化を決定した。この技術で、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定する;複数のコンジュゲーション部位は、コンジュゲートされたペプチドの質量差によって分離された個別のシグナルとして観察される。複数のコンジュゲーション種の相対的定量化を、シグナルの大きさを測定することによって行う。表31は、2.12.1.fxFabとPFP−ビオチンとのコンジュゲーションプロファイルをモル比で示している。コンジュゲーションは、モル比が増大するにつれて、0〜2個の付加の分布で起こる。抗体1個当たりの少ない分子の数は、使用されたモル比に基づき、先の結果と一致する。これは、反応パラメーターを変更することによって、コンジュゲーションの量を制御するためのこのプロセスの柔軟性を実証している。
h38C2−IgG1へのビオチンのコンジュゲーション
抗体h38C2−IgG1を20mg/mLに、pH7.5のHEPES緩衝液を用いて、0.02Mの最終濃度に調整した。ビオチン−PFPを、水中で10mg/mLに再構成し、h38C2−IgG1に5:1のモル比で加え、室温で2時間反応させた。未反応のPFP−ビオチンを、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去し、pH6.5のヒスチジン、グリシン、およびスクロース緩衝液に緩衝液交換した。試料を2mg/mlに希釈し、サイズ排除クロマトグラフィー−質量分析(SEC−MS)によって、インタクトなコンジュゲートされたタンパク質として分析して、コンジュゲーション形態のタンパク質の数および定量化を決定した。表32は、h38C2−IgG1とビオチン−PFPとのコンジュゲーションプロファイルを示している。h38C2−IgG1のコンジュゲーションは、1.1個のコンジュゲーションの平均で、0〜3個のCAの分布で起こる。コンジュゲーションの増大は、反応条件の最適化後に可能となるであろう。h38C2−IgG1におけるVH−K99(KabatナンバリングによるK93)の反応性は、触媒抗体試験化合物CATC−1と反応させた場合、>95%であることが確認され、逆相クロマトグラフィーを介して分析された。
2.12.1.fxおよびCLκ−K80、CLκ−K82変異体のコンジュゲーションプロファイル
ペプチドマッピングに基づくと、Y15断片中には2個のLysが存在する。活性なコンジュゲーション部位を識別するために、CLκ−K80およびCLκ−K82をRに、個々に、または組み合わせて変異させた。試験抗体の変異体、2.12.1.fxを、QuickChange部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene(登録商標))に記載されているプロトコルに従って生成した。変異を、オリゴヌクレオチドプライマーによって導入し、DNA配列決定によって確認した。変異したmAbを、HEK293細胞中で過渡的に発現させ、タンパク質A親和カラムを使用して精製した。精製したmAbを、MSを使用して特徴づけた。配列番号12、13、および14は、変異体CLκ配列を示している。
K80への方向性コンジュゲーションの機構の解明
CLκ−H81側鎖は、CLκ−K80のε−アミノ基に非常に近い。Hisは多くの場合に、プロトン移動反応に関係するので、CLκ−H81が、CLκ−K80コンジュゲーションのために必要である可能性が非常に高い。CLκ−K80部位特異的コンジュゲーションにおけるCLκ−H81の役割を研究するために、CLκ−H81A変異によって、イミダゾール環を除去した。部位特異的コンジュゲーションにおけるCLκ−D43の役割ならびにCLκ−D43およびCLκ−H81の組合せ作用を研究するために、CLκ−D43AおよびCLκ−D43A/H81A変異体を製造した。
ラムダ/カッパ置換
hAbλテスト1中のCLλ(配列番号136および137)を、LCκで置換して、これがCL特異的コンジュゲーションのレベル、方向性、および/または制御を増大させるかを決定した。CLλ/CLκドメイン置換ハイブリッドコンストラクトを、オーバーラップPCRを使用して生成した。VLλおよびCLκを、hAbλテストおよびカッパmAb軽鎖を、別々にテンプレートとして使用してPCR増幅した。これらの2種のPCR産物をテンプレートとして混合し;hAbλテスト1フォワードプライマーおよびLCLκリバースプライマーを、オーバーラップPCR反応中で使用して、全長のhAbλテストVL/CLκDNAを増幅した。ハイブリッド抗体コンストラクトを、HEK293細胞中で過渡的に発現させ、タンパク質A親和カラムを使用して精製した。精製した抗体を、MSを使用して特徴づけた。hAbλテストCLκハイブリッドは、その同族リガンドに、天然のmAb(hAbλテスト)と同様に結合した(表35)。配列番号59、60、および61は、hAbλテスト、hAbλテスト−λκ(λJを伴う)、およびhAbλテスト−λκJ(κJを伴う)からの軽鎖定常領域である。
hAbλテスト1変異体:モチーフ修飾
短いモチーフ「KH」が、CLλの対応する領域でのMAC形成のために十分であるかを確立するために、hAbλテスト中の残基CLλ81/82の簡単な配列スイッチを有する変異体を、K80のそばにヒスチジンに入れるために製造し、したがって「K80S81H82」は、「K80H81S82」となった。変異体を、QuickChange部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)に記載されたプロトコルに従って生成した。変異を、オリゴヌクレオチドプライマーによって導入し、DNA配列決定によって確認した。変異抗体コンストラクトを、HEK293細胞中で過渡的に発現させ、タンパク質A親和カラムを使用して精製した。精製した抗体をMSを使用して特徴づけた。hAbλテスト−[CLλ−S81H/H82S](CL:配列番号62)変異体は、そのリガンド、さらには親hAbλテスト抗体に結合した(表36)。
hAbλTest1変異体のコンジュゲーションプロファイル
各抗体(hAbλテスト、hAbλテスト−λκ、hAbλテスト−λκJ、およびhAbλテスト−[CLλ−S81H/H82S])を、pH5.5の20mM酢酸ナトリウム、200mのトレハロースに、20mg/mlで緩衝液交換した。次いで、タンパク質をpH7.7の60mMのリン酸ナトリウムでスパイクした。[PFP−PEG5−K11−配列番号27]を、50%のプロピレングリコールで再懸濁し、抗体と4.3:1のモル比で混合し、室温で一晩反応させた。すべての試料を2mg/mlに希釈し、サイズ排除クロマトグラフィー−質量分析(SEC−MS)によって、インタクトなコンジュゲートされたタンパク質として分析して、コンジュゲート形態のタンパク質の数および定量化を決定した。この技術で、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定し;複数のペプチドコンジュゲーション部位は、ペプチドの質量差によって分離された別個のシグナルとして観察される。複数のペプチドコンジュゲーション種の相対的定量化を、シグナルの大きさを測定することによって行う。表37は、コンジュゲーションの全体のレベルが、2つのLCがスイッチされたハイブリッドにおいて増大したことを示している(λκおよびλκJ−前者はλJ断片を包含し、後者はκJ断片を包含する)。コンジュゲーションレベルは、hAbλテスト対照の平均CAを超えて増大し、1.66個から、それぞれ2.19個(λκ)および2.53個(λκJ)になった。変異体は、天然の配列と比較してほとんど影響を有さず、単独の「KH」モチーフでは、MACを形成するために十分ではないことを示唆していた。
種々の脱離基を使用してのMACの生成
活性なエステル脱離基の活性化の程度および/または構造が、方向性コンジュゲーション作用の決定において重要であるかを調査するために、[PFP−PEG2−MAL−KSH 11−配列番号27]の一連の代替活性化エステル類似体を合成した。コンジュゲート生成物の分布を、インタクトなコンジュゲートのMSによって試験し、インタクトなコンジュゲートの還元ならびに軽鎖および重鎖の分離の後に、軽鎖および重鎖の両方へのペプチド付加の程度もMSによって決定した。
それぞれの最終コンジュゲートについての経時的な付加速度を、表39、40、41、および42に示す。0CAは、誘導体化されていない2.12.1.fx抗体を表す一方で、1CA、2CA、または3CAは、それぞれの試験時点での2.12.1.fx抗体への1、2、または3個のペプチドの付加を表す。
それぞれの代替活性化エステルについてのペプチドコンジュゲーションの程度を、軽鎖および重鎖について別々に試験した。それぞれの試料を変性し、ジスルフィド結合を、グアニジン塩酸塩およびジチオトレイトールを使用して還元した。生じた遊離の軽鎖および重鎖を、LCMSを使用して分析して、それぞれのコンジュゲーションプロファイルを決定した。2.12.1.fxおよび変異体の軽鎖および重鎖上のペプチドコンジュゲーションプロファイルを、表44に示す。同様のコンジュゲーションレベルを示した2,3,6−トリフルオロフェニル(Z3)を除いて、表に列挙したほとんどすべての活性化ペプチドは、PFP(Z1)を使用する化合物と比較して、軽鎖上のコンジュゲーションレベルの低下を示した。N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)から誘導された活性化されたエステル、すなわち、N−ヒドロキシル−5−ノルボルネン−2,3−ジカルボン酸イミドおよび2−ヒドロキシル−イソインドリン−1,3−ジオン(Z8およびZ9)は、重鎖の誘導体化に対してより大きな傾向を示した。
代替活性化エステルのさらなる例を、表45に示す。PFPエステルのいくつかの類似体のコンジュゲーションの時間経過を試験した。PFP中のフッ素基の数および位置を低減することによって、より反応性の低い活性なエステルの形態を合成することができ、調査した。2,3,5,6−テトラフルオロフェニルエステルおよび2,4,6−トリフルオロフェニルエステルの両方を、[PEG2−MAL−KSH 11−配列番号27]へのコンジュゲーション後に試験した。1−ヒドロキシル−ピロリジン−2,5−ジオン(NHS)を、[PEG2−MAL−KSH 11−]にコンジュゲートさせた。
MAC−1(ペプチドとPFP活性化基との間にPEG2−MAL−メルカプトプロピオニルリンカー)とMAC−2(ペプチドとPFP活性化基との間に直鎖PEG5リンカー)とでコンジュゲーションの速度を評価した。表46は、2.12.1xに対して、これらの活性化されたペプチドを比較している。結果は、これらの活性化されたペプチドは、これらの僅かに異なるリンカーの構造にもかかわらず、誘導体化の速度および程度の点においてかなり同様の行動をとることを示している。
リンカーの長さの作用
異なる長さのリンカーを有することによる最終コンジュゲート分布プロファイルに対する作用を試験した。ペプチドをPFP基に接合する種々のPEG長さのリンカーを用いて、化合物を合成した。0、1、2、3、および4個のペプチドの2.12.1.fxへの付加についての結果を、表47にまとめる。概して、PEGリンカーの長さを変化させることは一般的に、得られるコンジュゲートの分布にほとんど作用を有さなかった。
代替ペプチド配列のコンジュゲーション
他のペプチド配列への本発明の適用可能性を確認するために、配列番号80および配列番号81(テスト−ペプチド−1および−2)をコンジュゲートさせた。[PFP−PEG5−K11−配列番号27]との反応のために先に最適化した条件下で、配列番号80および81を[PFP−PEG5]と、次いで、2.12.1.fxとコンジュゲートさせた。コンジュゲーションプロファイルおよびLC/HCコンジュゲーションの分析の結果を表48に示す。配列番号80および配列番号81は両方とも、軽鎖に対する方向性コンジュゲーションを示した。LC/HC分布をさらに分析すると、約70%のLCの誘導体化およびHCでは10%未満の誘導体化で、MAC−2のプロファイルと同様のプロファイルが観察された。
ペプチドコンジュゲーションの分析のまとめ
ペプチドマッピング実験を、抗体の軽鎖上のCLκ−K80での方向性コンジュゲーションへと導く重要なパラメーターを確認する目的で、ある範囲のタンパク質/コンジュゲートの組合せについて行った。表49に、行ったペプチドマッピング実験の結果を列挙する。各研究パラメーターのために、先に記載したペプチドマッピング手順を使用した。「***」は、CLκ−K80に対する高いレベルの方向性コンジュゲーションを示す。「**」およびより低い程度に対する「*」は、方向性コンジュゲーションはまだ観察されるが、より遅い反応条件、より少ない全体コンジュゲーション、または一方の軽鎖のみにおける平均などの差を示すことができ、したがって、抗体1個当たり0.5〜1.5個のペプチドを有するMACを生成するなどの特殊な状況(例えば)には、より適し得ることを示す。「−」は、これらの反応条件が、CLκ−K80での方向性コンジュゲーションに対して好ましいとは考えられないことを示す。
CLκ−D77の試験
3D構造においてCLκ−K80に地理的に近い残基を試験した。当初の結晶構造分析は、CLκ−D77が、CLκ−K80方向性コンジュゲーションに対して影響を有し得るCLκ−K80との塩橋を形成し得る可能性を示唆した。CLκ−K80へのコンジュゲーションに対するCLκ−D77の作用を研究するために、CLκ−D77を2.12.1.fx抗体上でCLκ−A77に変異させて、2.12.1.fx−[CLκ−D77A](配列番号37のCLκ)を作成した。CLκ−D77A変異を、QuickChange部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene(登録商標))に記載されているプロトコルに従って抗体軽鎖上で生成した。変異をオリゴヌクレオチドプライマーによって導入し、DNA配列決定によって確認した。2.12.1.fx−[CLκ−D77A]を、HEK293細胞中で過渡的に発現させ、タンパク質A親和カラムを使用して精製した。精製したmAbを、MSを使用して特徴づけた。
2.12.1.fx−[CLκ−D77A]−[配列番号27−K11−PEG5]の重鎖および軽鎖基準生成物のペプチドマッピング特徴づけ
2.12.1.fx−[CLκ−D77A]−[PEG5−K11−配列番号27]コンジュゲート抗体を、ジチオスレイトールで還元し、システイン残基を、ヨードアセトアミドでのカルボキシメチル化によってアルキル化した。キモトリプシンをタンパク分解性消化のために使用した。溶液中の消化された断片を、LCMSを使用して分析した。個々の断片をC18のHPLCカラムで分離し、それらの正確な質量をQ−ToF質量分析計で測定した。生じた断片の質量を使用して、修飾されていない断片または[PEG5−K11−配列番号27]コンジュゲーション基で修飾された断片を同定した。この実験は、リシン残基を含有し、したがって、ペプチドコンジュゲーションのための可能な部位であるするキモトリプシン断片に焦点を当てることによって解釈された。表51および52は、それぞれ重鎖および軽鎖上のそのような断片すべてを列挙している。空白の項目は、この技術を使用して検出されなかった断片である。[PEG5−K11−配列番号27]修飾物質と共に観察された検出された断片は、ペプチドコンジュゲーションの潜在的部位であると考えられる。
断片番号:N末端からのキモトリプシン断片ナンバリング;接合された断片(すなわち、Y1〜2)は、欠損した開裂部位を示す。
始点/終点:N末端からの断片位置のナンバリング。
断片質量(Da):ダルトンで記載された断片の理論的質量。
保持時間(対照/分析物):LCMSペプチドマッピング実験におけるクロマトグラフィーの保持/溶離の時間。
MSシグナル強度(対照/分析物):MSによって観察された観察シグナルの大きさ。
質量誤差−ppm(対照/分析物):ペプチド断片の理論質量と観察質量との比較;ゼロ(0)に近い値は、良好な質量確度を実証している。保持時間、MSシグナル強度、および質量誤差についての対照タンパク質は、2.12.1.fx−[CLκ−D77A]であり、それぞれの場合の分析物であるタンパク質は、2.12.1.fx−[CLκ−D77A]+[PEG5−K11−配列番号27]である。
修飾物質:断片に対する潜在的共有結合的付加;リシン残基の[PEG5−K11−配列番号27]−抗体結合ペプチド、CAM−システイン残基のカルボキシメチル化。
CLκ−D77変異の試験
2.12.1.fx抗体のCLκ−D77残基を、CLκ−D77A変異に加えて、他の18種のアミノ酸にそれぞれ変異させた。CLκ−D77G(配列番号38)、CLκ−D77L(配列番号40)、CLκ−D77S(配列番号49)、CLκ−D77E(配列番号53)、およびCLκ−D77R(配列番号54)ならびに変異体を、QuickChange部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene(登録商標))に記載されているプロトコルに従って生成した。変異を、オリゴヌクレオチドプライマーによって導入し、DNA配列決定によって確認した。CLκ−D77部位での他の13種の変異体(CLκ−D77V(配列番号39)、CLκ−D77I(配列番号41)、CLκ−D77P(配列番号42),CLκ−D77F(配列番号43)、CLκ−D77W(配列番号44)、CLκ−D77Y(配列番号45)、CLκ−D77H(配列番号46)、CLκ−D77M(配列番号47)、CLκ−D77C(配列番号48)、CLκ−D77T(配列番号50)、CLκ−D77Q(配列番号51)、CLκ−D77N(配列番号52)、CLκ−D77K(配列番号55))を、Quick PCR Cloning Kit(BPS Bioscience)に記載されているプロトコルに従って生成した。変異を、オリゴヌクレオチドプライマーによって導入し、BglIIおよびNheIでカットされた修飾p2.12.1.fxP4ベクター(Invitrogen)にクローニングした。挿入DNAを、DNA配列決定により確認した。変異させたmAbをHEK293細胞中で過渡的に発現させ、タンパク質A親和カラムを使用して精製した。精製したmAbを、MSを使用して特徴づけた。
コンジュゲーションに対する、CHκ領域への他の変異の作用
CLκ−D77Aに加えて、CLκ−K80から10Å距離内の他の残基をアラニンに変異させた:CLκ−K41A(配列番号20)、V42A(配列番号21)、CLκ−D43A(配列番号56)、CLκ−N44A(配列番号22)、CLκ−L46A(配列番号23)、CLκ−Q47A(配列番号24)、CLκ−S48A(配列番号25)、CLκ−N50A(配列番号26)、CLκ−L73A(配列番号28)、CLκ−S74A(配列番号29)、CLκ−K75A(配列番号30)、CLκ−Y78A(配列番号31)、CLκ−E79A(配列番号32)、CLκ−H81A(配列番号33)、CLκ−V83A(配列番号34)、CLκ−Y84A(配列番号35)、およびCLκ−R103A(配列番号36)もAlaに変異させた。CLκ−D43AおよびCLκ−H81Aのデータは実施例14において検討している。
CLκ−D43AおよびCLκ−H81A変異体の分析
CLκ−D43の電荷、水素結合、またはサイズが、CLκ−K80方向性コンジュゲーションにとって重要であるかを決定するために、CLκ−D43をCLκ−D43E(配列番号107)、CLκ−D43N(配列番号108)、およびCLκ−D43L(配列番号109)にそれぞれ変異させた。変異体を、2.12.1.fx抗体軽鎖でQuickChange部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene(登録商標))に記載されているプロトコルに従って生成した。変異を、オリゴヌクレオチドプライマーによって導入し、DNA配列決定によって確認した。変異させたmAbを、HEK293細胞中で過渡的に発現させ、タンパク質A親和カラムを使用して精製した。精製したmAbを、MSを使用して特徴づけた。
種々の反応性エステルを使用しての2.12.1.fx−[CLκ−D77A]コンジュゲーション
2.12.1.fxおよび2.12.1.fx−[CLκ−D77A]を、種々の反応性エステル(実施例18および19を参照されたい)を使用して[PEG5−K11−配列番号27]にコンジュゲートさせた(結果は表56に示す)。種々の活性化エステルのすべてについて、2.12.1.fx−[CLκ−D77A]変異体は、コンジュゲートすると、wtの2.12.1.fxと比較して、より高いレベルのインタクトな平均CAをもたらした。他の明瞭な傾向は、野生型2.12.1.fxにおける0および1CAのレベルが、2.12.1.fx−[CLκ−D77A]変異体ではそれぞれの活性化エステルについて顕著に低下したこと、および2CAのレベルが、Z9を除く大抵の活性化エステルについてそれぞれの場合に上昇したことであった。
トラスツズマブ(Herceptin(登録商標))コンジュゲーション
CLκ−D77変異に起因するCLκ−K80への方向性コンジュゲーションの向上を、CLκを含む他の抗体に適用することができることを確認するために、D77A変異を、トラスツズマブ(hTrast)のCLκにも挿入した。トラスツズマブ軽鎖および重鎖DNAを、Drug Bank、受託番号DB00072(BIOD00098、BTD00098)でのアミノ酸配列に基づき合成した。
トラスツズマブとMMADとのコンジュゲーション
表58は、トラスツズマブ−[PEG5−MMAD](オーリスタチン誘導体)とhTrast−[CLκ−D77A]−[PEG5−MMAD]とのコンジュゲーションプロファイルを比較している。
標的に結合するコンジュゲートトラスツズマブの能力
コンジュゲートされていない、および[PEG5−K11−配列番号27]もしくは[PEG5−MMAD]のいずれかにコンジュゲートされているトラスツズマブおよびhTrast−[CLκ−D77A]の、Her2受容体に結合する能力を、Her2結合ELISAアッセイを使用して研究した。ハーフウェルELISAプレートを、PBS中1ug/mlのFc−ErbB2融合タンパク質でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートをKPL洗浄緩衝液で3回洗浄し、その後、Superblockで室温で1時間ブロックした。試料の10×系列希釈物をSuperblock中、100μg/mlの最高濃度で調製した。試料をウェルに加え、プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートをKPL洗浄緩衝液で3回洗浄した。抗ヒトFab−HRP二次抗体の1:1000希釈物と共に室温で1時間インキュベートすることによって、結合した試料を検出した。プレートを再び、KPL洗浄緩衝液で3回洗浄し、HRPをTMB基質で検出した。反応を2MのH2SO4で停止し、ODを、Spectramaxプレートリーダーで450nmで測定した。
PFPおよびNHSコンジュゲーション戦略の比較
2つの別の戦略:PFPエステル(Z1)をZ*基として使用するCLκ−K80への方向性コンジュゲーション(トラスツズマブ−[5PEG−MMAD]を生成)、または抗体全体により幅広いコンジュゲーションパターンをもたらすNHS(Z13;トラスツズマブ−[MMAD]nを生成)を使用して、トラスツズマブを[PEG5−MMAD]にコンジュゲートさせ、抗体薬物コンジュゲートの耐容性を比較するために、ラットに投与した。両方のコンジュゲートを、10、30および100mg/kgの単回ボーラス用量として与えた。1週間の研究期間の間に10、および30mg/kg用量の両方のコンジュゲートを投薬されたすべての動物は、有意な体重減少を伴うことなく生存した。しかしながら、100mg/kg用量群は、無作為コンジュゲーション(Z13)と、CLκ−K80(Z1)への部位選択的コンジュゲーションとで明確な相違を示した。無作為コンジュゲート(NHSコンジュゲーション)の100mg/kg用量における動物のうちの50%超が、1週間の研究期間内に死亡したのに対して、部位選択的コンジュゲート(PFPコンジュゲーション)の100mg/kg用量における動物はすべて、有意な体重減少を伴うことなく生存した(表59)。このことは、CLκ−K80での優先的コンジュゲーションが、エフェクター部分のコンジュゲーションについてより信頼性の高い機構を提供し得ていて、複数の表面リシン残基でのコンジュゲーションである従来の「無作為」手法は、より信頼性の低い開裂および分解パターンを有するエフェクター部分をもたらしているおそれがあることを示唆している可能性がある。
毒素および切断可能なリンカーとコンジュゲートさせたh38C2
ターゲティングペプチドを、触媒抗体h38C2(HC=配列番号65およびLC=配列番号37および67)のCLκ−D77A変異バージョンの結合部位に、本明細書において記載したとおりの、W基としてβ−ラクタム基を有する式P−Q−Wのリンカーを使用してコンジュゲートさせて、配列番号65のK99の側鎖との共有結合を形成した。次いで、このコンジュゲート抗体を、バリン−シトルリンp−アミノベンジルカルバマート切断可能なリンカーに結合させた例示的なオーリスタチンをベースとする毒素([PFP−PEG2−ValCitABC−毒素])のPFP−活性化エステルとさらにコンジュゲートさせた。
パラフッ素原子に置き換わってトリフルオロメチル基を有するPFPの構造的類似体を使用して、誘導体Z*基;2,3,5,6−テトラフルオロ−4−(トリフルオロメチル)フェニル(Z16)を製造した:
毒素0101の合成
毒素0101(図解中の#54)についての実験
2−メチルアラニル−N−[(3R,4S,5S)−3−メトキシ−1−{(2S)−2−[(1R,2R)−1−メトキシ−2−メチル−3−オキソ−3−{[(1S)−2−フェニル−1−(1,3−チアゾール−2−イル)エチル]アミノ}プロピル]ピロリジン−1−イル}−5−メチル−1−オキソヘプタン−4−イル]−N−メチル−L−バリンアミドの調製(#54)
965.4[M+H+]、保持時間=11.344分(純度>97%);1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), 回転異性体と推定され、特徴的シグナル:δ7.86-7.91 (m, 2H), [7.77 (d, J=3.3 Hz)および7.79 (d, J=3.2 Hz), 合計1H], 7.67-7.74 (m,
2H), [7.63 (d, J=3.2 Hz)および7.65 (d, J=3.2 Hz), 合計1H], 7.38-7.44 (m, 2H), 7.30-7.36 (m, 2H), 7.11-7.30 (m, 5H), [5.39
(ddd, J=11.4, 8.4, 4.1 Hz)および5.52 (ddd, J=11.7, 8.8,
4.2 Hz), 合計1H], [4.49 (dd, J=8.6, 7.6 Hz)および4.59 (dd, J=8.6, 6.8 Hz), 合計1H], 3.13, 3.17,
3.18および3.24 (4 s, 合計6H), 2.90および3.00 (2 br s, 合計3H), 1.31および1.36 (2 br s, 合計6H), [1.05 (d, J=6.7 Hz)および1.09 (d, J=6.7 Hz), 合計3H].
一般的手順A(以下)に従って、ジクロロメタン(10mL、0.07M)中の#53(701mg、0.726mmol)から、粗製の所望の物質を合成し、これを、シリカゲルクロマトグラフィー(勾配:ジクロロメタン中0%〜10%のメタノール)によって精製した。残渣を、ジエチルエーテルおよびヘプタンで希釈し、真空濃縮して、#54(406mg、75%)を白色の固体として得た。LC-MS:m/z 743.6[M+H+]、保持時間=0.70分;HPLC(プロトコルA):m/z 743.4[M+H+]、保持時間=6.903分、(純度>97%);1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), 回転異性体と推定され、特徴的シグナル:δ[8.64 (br d, J=8.5 Hz)および8.86 (br d, J=8.7 Hz), 合計1H], [8.04 (br d,
J=9.3 Hz)および8.08 (br d, J=9.3 Hz), 合計1H], [7.77 (d, J=3.3 Hz)および7.80 (d, J=3.2
Hz), 合計1H], [7.63 (d, J=3.3 Hz)および7.66 (d, J=3.2 Hz), 合計1H], 7.13-7.31 (m,
5H), [5.39 (ddd, J=11, 8.5, 4 Hz)および5.53 (ddd, J=12, 9,
4 Hz), 合計1H], [4.49 (dd, J=9, 8 Hz)および4.60 (dd, J=9, 7 Hz), 合計1H], 3.16, 3.20,
3.21および3.25 (4 s, 合計6H), 2.93および3.02 (2 br s, 合計3H), 1.21 (s, 3H), 1.13および1.13 (2 s, 合計3H), [1.05 (d, J=6.7 Hz)および1.10 (d, J=6.7 Hz), 合計3H], 0.73-0.80 (m,
3H).
mAb hu08および毒素0101を含むMACの調製
Hu08は、ヒト抗IL−13Rα2抗体であり、その内容が参照によって本明細書に組み込まれている米国特許仮出願61/723,545号に完全に記載されている。CLκ−D77A変異を含むhu08の変異体バージョンを、標準プロトコルに従って生成した(hu08−[CLκ−D77A])。毒素−0101(#54:実施例36)を、切断可能なリンカーとコンジュゲートさせて、構造:
IL−13Rα2抗原を発現する細胞系および陰性対照細胞系を、漸増する濃度のhu08−[CLκ−D77A]と共に培養した。4日後に、培養の生存率を評価した。IC50値を、ロジスティック非線形回帰によって計算し、ng Ab/mLとして表す。
雌の無胸腺(ヌード)マウスに、PC3MM2腫瘍細胞を皮下注射した。約0.1〜0.3gの段階の腫瘍を有するマウス(n=8〜10マウス/治療群)に、通常生理食塩水(ビヒクル)またはMAC−0001を4日に1回で4回、静脈内投与した。化合物を、AB含有量に基づき投薬した。腫瘍を、少なくとも週に1回測定し、そのサイズ(mm2+/−SEM)を、mm3=0.5×(腫瘍幅2)×(腫瘍長さ)として計算した。表63のデータは、hu08−[CLκ−D77A]−0101が、PC3MM2異種移植片の増殖を阻害することを示している。
トラスツズマブMMADコンジュゲートの活性
3種のトラスツズマブコンジュゲートを製造した:トラスツズマブ−[5PEG−MMAD]、hTrast−[CLκ−D77A]−[5PEG−MMAD]、およびトラスツズマブ−(MMAD)n(ここで、MMADは、脱離基としてのZ13(NHS)で5PEGリンカーに接続されており、方向性コンジュゲーション技術を用いることなく、トラスツズマブにコンジュゲートされているので、トラスツズマブ表面リシンへのMMADの非特異的コンジュゲーションが生じている)(実施例30〜33を参照されたい)。
血漿曝露(AUCに基づく)は、3種のコンジュゲートのすべてで、いずれの所与の用量でも概して同様であった。100mg/kgでのhTrast−[CLκ−D77A]−[5PEG−MMAD]、トラスツズマブ−[5PEG−MMAD]、およびトラスツズマブ−(MMAD)nのAUC(0−312)はそれぞれ、177000、174000、および139000ng・h/mLであった。hTrast−[CLκ−D77A]−[5PEG−MMAD]およびトラスツズマブ−[5PEG−MMAD]は、すべての用量において、臨床的に忍容性が良好であった。しかしながら、100mg/kgでのトラスツズマブ−(MMAD)nの投与は、顕著な臨床徴候および8日目での1/5のラットの早期安楽死に関連した。この群の他のラットは、皮膚膨張の低下および体重増加の減少を示した。
CLκおよびCLλのモデリング
図10Aは、4ストランドβシートに対してパックされた3ストランドβシートを含有する定常軽鎖ドメインのIgフォールドを図示している。それぞれのβシートのβストランドの間での水素結合によって、内側で向かい合っているβシートの残基間での疎水性結合によって、かつβシート間でのジスルフィド結合によって、このフォールドは安定化されている。3ストランドβシートは、βストランドC、F、およびGを含み、4ストランドβシートは、βストランドA、B、E、およびDを有する。AからGの文字は、Igフォールドのアミノ酸配列に沿ったβストランドの連続位置を示している。各βストランドと次のβストランドとの連結は、ターン(A/B)またはαへリックス(E/F)を含んでもよいし、または含まなくてもよいアミノ酸接続鎖である(図10B)。
CLκ−K80コンジュゲーション機構のモデリング
構造および配列の記載
2.12.1.fxおよびh38C2−[CLκ−D77A]のFabドメインの結晶構造を使用して、ハロ−フェノール(PFPなど)/エステル媒介コンジュゲーションに対するCLκ−K80反応性の特異性をモデリングした。複数の様々な抗体でのコンジュゲーションの経験、さらには初期モデリング分析によって、抗体の残りの部分は、コンジュゲーションの機構について、もしあるとしても非常に僅かな影響しか発揮しないと考えられるので、モデリングは、CLκにのみ焦点を当てればよいことが示された。
コンピュータによる計算の目的は、CLκ−K80の決定的な特質、およびこの部位をPFP−エステルコンジュゲーション反応に優先的に偏らせる残基の相互作用を明白にすることであった。CLκおよびCLκ−D77Aの3D座標を結晶構造から選択した後に(方向性コンジュゲーションに関連していると既に同定されているこれらの残基を含有する座標に基づく)、その座標を、タンパク質調製、水素原子の結合、および力場パラメーターアサインメント(force field parameters assignment)などの標準的なコンピュータプロトコルに掛けた。
CHARMm[Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics]は、エネルギー最小化技術であり、これを使用して、3D構造を平衡位置に持っていき、その原子構造について最良の幾何学的位置を見出した。CHARMmを第1のステップでは、SMART Minimizerを用いて、1000ステップの、3[Kcal/(mol*Å)]のRMS勾配許容(gradient tolerance)でのSteepest Descent最小化、続く、0.01のRMS勾配でのConjugate Gradient最小化で使用した。エネルギー変化については、3[Kcal/(mol*Å)]の許容を、最小化のサイクルの間の平均勾配に当てはめた。Steepest Descent法は、分子を最近接最小量(nearest minimum)にし、Conjugate Gradientは、得られた最終コンホメーションを改善した。Momany Rone電荷を使用した(Momany&Rone;Validation of the general purpose QUANTA 3.2/CHARMm force field.Comp.Chem.1992、13、888〜900に記載されているとおり)。CLκの最小化された構造は、最小化されていない構造と比較して1Å異なった。
それぞれの相互作用をより良く理解するために、PFPエステルと、CLκおよびCLκ−D77Aドメインとの個々の複合体をインシリコで組み立てた。Accelrys protocol Define and Edit Binding Site(Discovery Studio ソフトウェア version DS3.5)による3D CLκドメインの構造分析によって、図11に示されているとおり、CDおよびEF接続鎖の間で、かつCLκ−K80の下に位置する「結合ポケット」と称され得るであろう領域が明らかになった。CLκ−K75−E79(EF接続鎖上のEFαへリックス)、CLκ−K80−K82(EF接続鎖上のEFループ)、およびCLκ−V42(CD接続鎖上のCDループ)に位置して、触媒反応が必要とする形状および静電特性を与えるアミノ酸によって、このポケットは促進される。
コンジュゲーション中およびコンジュゲーション後にin vitro実験から観察される全作用を、段階的な概算を使用するコンピュータ技術によってモデリングして、そのような現象を:
1. PFP結合ポケットサイズ、PFPエステルの結合および方向、
2. タンパク質安定性、特に、PFP結合ポケットの安定性、
3. CLκ−H81のイミダゾール環の互変異性化、
4. 方向性PFP配置
5. PFPエステルとCLκとの初期相互作用、
6. 触媒アミノ酸それぞれの反応性
として記載することができる。
CLκドメインにおける結合ポケットの同定は、PFPエステルのモデリングおよびドッキング配置を可能にした。PFPエステルを、個々のCLκ結合部位にドッキングされたようにモデリングした後に、この複合体の3D構造を、ハイブリッド法QM/MMを使用して最小化した。この手法では、PFPエステルをQMシステムとして画定し、CLκドメインをMM法によって処理した。複合体を最小化した後に、CLκとPFPエステルとの間の分子間相互作用のネットワークが明らかとなった。このネットワークは、分子間水素結合、疎水性相互作用、およびπ電子スタッキングによって形成された。これらの力がすべて一緒に、CLκ−K80へのPFPエステルの方向性配置およびコンジュゲーションを担うネットワークの形成に関係しているようである。複合体の最小化構造は、CLκ−H81が重要な触媒アミノ酸であることを示している。
WTモデルから予測されたとおり、[CLκ−D77A]ドメインにおいて、CLκ−H81は、イミダゾールNδ原子を介してCLκ−D43と共に水素結合を形成して、PFP−PEG2分子中のエステル基のカルボニル炭素での求核的攻撃のために、Nεにおいて電子対を露出させる(スキームIII)。図13A、13B、および13Cは、結晶構造モデリングされたCLκおよびCLκ−D77Aドメインの比較を図示しており、CLκ−D77A変異体におけるCLκ−H81の空間的位置のシフトを示している。
モデリングは、CLκ−D77変異が、CLκ−K80のコンジュゲーション率に有意な影響を有するであろうことを示唆している。一連のQM/MM計算を、PFPと複合させたCLκドメインで行ったが、その際、CLκ−D77を、すべての他の天然アミノ酸(CLκ−D77Cは除いた)に変異させた。
CLκおよびCLκ−D77Aのモデルをベースとする予測モデリング
タンパク質安定性およびPFPエステルとの相互作用強度に対する変異の影響を分析して、最も適していて反応性のCLκの変異体を同定した。このコンピュータによる実験では、CLκ−K80のCα炭素から10Å距離以内にある重要なアミノ酸を選択して、分析した(それぞれの残基について特有の要件から、CLκ−K80およびCLκ−H81は除く)。
この残基は、QM/MM計算によると、天然またはCLκ−D77A変異体におけるCLκ−K80のコンジュゲーション反応性に対して、何らかの直接的な影響を有するとは考えられない。
CLκ−A76は、αへリックスの始まりに位置し、CLκ−D77の水素結合カルボキシル基およびCLκ−S74のヒドロキシル基を含有する平面上にある。この位置は、大きな側鎖を有するアミノ酸がCLκ−D77と相互作用することを可能にし、それらは、コンジュゲーション反応、特に、水素結合の形成を可能にする親水基とのコンジュゲーション反応にプラスの影響を有し得る。この残基でのほとんどのアミノ酸置換、具体的には、CLκ−S74A、CLκ−S74D、CLκ−S74E、CLκ−S74I、CLκ−S74L、CLκ−S74M、CLκ−S74F、CLκ−S74W、およびCLκ−S74Vは、コンジュゲーションにほとんど作用を有しないと予測されるであろう。水素結合の可能性をもたらし得るであろう他の残基、すなわち、CLκ−S74R、CLκ−S74N、CLκ−S74Q、CLκ−S74H、およびCLκ−S74K、ならびにより低い度合いでCLκ−S74S、CLκ−S74T、およびCLκ−S74Yは、コンジュゲーションを増強すると予測されるであろう。CLκ−S74GおよびCLκ−S74Pなどのαへリックスを破壊する残基は、CLκ−K80への方向性コンジュゲーションに対して多少のマイナスの作用を有し得るが、方向性コンジュゲーションはおそらく排除されず、単に低下する。システインの導入は、発現の際に凝集を形成する可能性のリスクを提示するであろう。
CLκ−Y78はαへリックス上に位置し、結合ポケットの反対方向に面している。CLκ−Y78は、周囲アミノ酸と共にいくつかの疎水性相互作用を成しており、CLκ構造を支持している。したがって、より小さい側鎖(Ala、Ser、Thr、およびVal)またはαへリックスの安定性もしくは形成に影響を及ぼすもの(Gly、Pro)は、CLκ−K80へのコンジュゲーション反応におそらく不利な影響を及ぼすが、ただし、これらの変異は、CLκ−K80反応性に直接的に干渉するとは予測されていないので、そのような変異は、方向性コンジュゲーションを必ずしも排除し得ない。加えて、CLκ−Y78は、CLκ−R103の側鎖と相互作用すると考えられるので、疎水性または負に帯電している側鎖(Asn、Asp、Gln、Glu、Phe、およびTrp)は、コンジュゲーションを支持して、この相互作用を促進すると予測されるであろう。他の側鎖(Arg、His、Ile、Leu、Lys、およびMet)は、コンジュゲーション反応をもたらすとは予測されないであろう。
モデリングは、CLκ−E79の側鎖が結合部位とは逆の方向に向いていることを示唆している。加えて、CLκ−E79は、CLκ−K75の側鎖と共に塩橋を形成していると考えられる。モデリングに基づき、この位置でのほとんどのアミノ酸置換は、コンジュゲーション反応に対してほとんど作用を有さないであろうと仮定される(Asn、Asp、Gln、His、Met、Phe、Ser、Thr、Tyr、およびTrp)。小さな親水性または帯電残基は、おそらくコンジュゲーション反応を支持するが(Ala、Arg、Ile、Leu、Lys、およびVal)、αへリックスの安定性または形成に影響を及ぼすもの(Gly、Pro)は、方向性コンジュゲーションを必ずしも排除しないが、CLκ−K80へのコンジュゲーション反応に不利な影響を及ぼし得る。
この残基は、実験データおよびQM/MM計算により、CLκ−K80とのコンジュゲーション反応に対して直接的な影響を有するとは考えられない。
CLκ−V42
CLκ−V42は、βストランドCの末端、CDループの始まりにポジショニングされている。構造を慎重に試験したところ、CLκ−V42は、CLκ−H81のイミダゾール環の下に位置していることが観察された(図14および15)。CLκ−H81とCLκ−V42との間の相互作用の性質の決定を助けるために、イミダゾール環での重心のxyz座標を計算し、続いて、計算された重心とCLκ−V42の水素原子Hδとの間の距離を測定した。この2.9Åの距離は、イミダゾール環上のπ電子とCLκ−V42の水素Hδとの間の直接的な相互作用を示している。したがって、この相互作用は、ポケット内におけるCLκ−H81の最適なポジショニングに、かつNδ互変異性体への互変異性平衡のシフトのために強い影響を及ぼすと考えられる。したがって、必ずしもではないが、CLκ−V42の存在は、方向性コンジュゲーションに対してプラスの影響を発揮する。これらの分析は、CLκ−V42A変異がコンジュゲーション率の低下の原因となるということが見出された実験データによって指示されている(表54)。モデリングは、CLκ−V42Iが、CLκ−H81イミダゾール環のポジショニングを援助して、方向性コンジュゲーションをおそらく支持するが、ただし、やや大きな側鎖は、結合ポケットのサイズ全体を縮小させるであろうことを示唆している。多くの状況において、ポケットのサイズのこの縮小は、方向性コンジュゲーション機構に対して明らかな作用を有し得ない。CLκ−V42Lもまた、CLκ−H81イミダゾール環のポジショニングを援助し得ることがある。
CLκ−D43は、CDループ上に位置している。天然CLκでは、CLκ−D43は、CLκ−H81およびCLκ−K82の主鎖と相互作用して、タンパク質の安定性に寄与していると考えられる。CLκ−H81のHδとCLκ−D43のカルボキシル基との間の水素結合は、CLκの結晶構造では同定されなかった。これは、CLκ−D43がCLκ−H81のNδ触媒活性形態の互変異性平衡に軽微な影響しか発揮しないことを示唆し得る。しかしながら、2.12.1.fx−[CLκ−D43A]変異体での実験分析は、この残基の変異が、方向性コンジュゲーションに対して有意な阻害作用を有することを示した。モデル全体をまとめると、CLκ−H81が触媒活性形態と不活性形態との間を行き来して、CLκ−D43とCLκ−D77との間に水素結合を形成していて、そしてそうであるとすると、CLκ−D43残基の除去は、活性なNδ互変異性体へとCLκ−H81をプッシュする力の一方を排除する可能性がある。
CLκ−N44は、CDループの上に位置している。その側鎖は、PFP結合ポケットから離れて、外側に向いており、コンジュゲーション反応に対していずれの役割も影響も有しないと考えられる。QM/MM計算は、極性アミノ酸および負に帯電した側鎖を有するものは、やはりポケットの外側に位置しているCLκ−K41との推定の相互作用によって、タンパク質安定性を増強し得ると予測した。
実験データに基づき、さらには、本発明者らのQM/MM計算からも、CLκ−L46A変異は、コンジュゲーション率に相対的に中性の影響を有した。CLκ−L46Aは、PFP結合ポケットの外側に位置するが、これは、その側鎖のサイズによって、ポケット形状を促進し得る。ポケットの外側に位置することで、これは、同じくポケットの外側に位置するアミノ酸と相互作用し得る。大きくて親水性の側鎖への変異は、CLκ−Q39との相互作用によって、タンパク質の安定性を増大させ、QM/MM計算によれば、PFPポケットの形状を支持し得る。
CLκ−Q47A変異によって、コンジュゲーション率が向上した。この変異はおそらく、モデリング計算によれば、PFP結合部位のサイズを増大させて、複合体の形成およびタンパク質の安定性にプラスの影響を及ぼすことによって作用を発揮している。QM/MM計算によれば、より大きな側鎖を有するアミノ酸は、コンジュゲーションにややマイナスの影響をおそらく及ぼす。したがって、CLκ−Q47A、CLκ−Q47G、CLκ−Q47V、CLκ−Q47I、CLκ−Q47L、CLκ−Q47T、CLκ−Q47S、CLκ−Q47N、CLκ−Q47D、CLκ−Q47H、CLκ−Q47P、またはCLκ−Q47Eへの変異がおそらく、有利か、または中性であるのに対して;CLκ−Q47W、CLκ−Q47F、CLκ−Q47Y、またはCLκ−Q47Kへの変異は、CLκドメインへのPFPコンジュゲーションにややマイナスの影響を有し得る。前のとおり、ある種の用途では、より小さいハロ−フェノールをZ1基として使用する場合、または特定の免疫グロブリンドメインの正確な寸法がそのような形態にふさわしいと考えられる場合など、ポケットサイズを縮小させることが望ましいことがあることは理解されるであろう。
実験データによれば、CLκ−S48Aの変異によって、コンジュゲーション率が向上した:モデリングは、この理由が十中八九、ポケットの静電特性の変化によることを示唆している。したがって、この位置の疎水性アミノ酸はおそらく、方向性コンジュゲーションにプラスの影響を有する。そのため、次の変異が、特に有利であり得る:CLκ−S48A、CLκ−S48G、CLκ−S48V、CLκ−S48I、CLκ−S48L、CLκ−S48P、およびCLκ−S48M。他の変異もおそらく、許容される。
CLκ−D77Aの二重および三重変異
抗体2.12.1.fxを使用して、CLκ領域へのさらなる変異の作用を試験した。前のとおり、残基のナンバリングは、CLκ内でのそれらの位置による(例えば、配列番号6)。コンジュゲーション機構を理解するために、CLκ−D43およびCLκ−H81をそれぞれ、2.12.1.fx−[CLκ−D77A]抗体においてAlaに変異させた。変異を、QuickChange部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)に記載されているプロトコルに従って、2.12.1.fx軽鎖で生成した。抗体2.12.1.fx、2.12.1.fx−[CLκ−D77A](配列番号37を含むCLκ)、2.12.1.fx−[CLκ−D43A](配列番号15を含むCLκ)、2.12.1.fx、2.12.1.fx−[CLκ−D43A/D77A](配列番号127を含むCLκ)、2.12.1.fx−[CLκ−D77A/H81A](配列番号128を含むCLκ)、および2.12.1.fx−[CLκ−D43A/D77A/H81A](配列番号129を含むCLκ)をHEK293細胞中で過渡的に発現させ、タンパク質A親和カラムを使用して精製した。精製したmAbを、MSを使用して特徴づけた。
ウサギCLκ分析
ウサギ抗体の軽鎖カッパ領域(rCLκ)は、他の免疫グロブリンの3D構造と同じ3D構造を有する。rCLκは、151位(カバット番号)にAsp、188位にSer、および189位にHisを有する(rCLκ−D43、rCLκ−S80、rCLκ−H81)。rCLκ−S80K変異体は、PFP方向性コンジュゲーションのための反応部位を作り得ると仮定された。この仮定を確認するために、2種のトラスツズマブウサギキメラ抗体を構築した。mAb「rTrast」(ウサギトラスツズマブ)は、rCLκおよびウサギ定常重鎖(rCH)(それぞれ配列番号130および131)に融合しているトラスツズマブのVLおよびVHドメイン(それぞれ配列番号75および72)を含み、全長rTrast−LC(配列番号132)およびrTrast−HC(配列番号133)を生成する。
ラムダ鎖
上記の実施例10において実証されたとおり、hCLλは、PFPエステルとの方向性コンジュゲーションを実証しない。hCLλは、hCLκ−D43(CLλ−D45)およびhCLκ−H81(CLλ−H82)でhCLκと配列同一性を共有し、hCLκ−K80(CLλ−S81)の位置にセリンを有する。CLλ−S81K変異体は、CLλ−S81K残基でのPFPコンジュゲーションを可能にし得ることが仮定された。
CHドメイン上でのPFPコンジュゲーション部位の再現:
抗体のCHドメインも、免疫グロブリン構造を含む。実施例41および42において記載したとおりにドメインをモデリングする前に、コンジュゲーションモチーフを他のCHドメインのEF接続鎖のEFループ部分に移動させると、方向性コンジュゲーションが可能となり得ると仮定された。CHγ1(配列番号147)、CHγ2(配列番号155)、CHγ3(配列番号158)、CLκ(配列番号6)、およびCLλ(配列番号57)ドメインの配列アラインメントを図16に示す。
免疫グロブリンフォールドのモデリング
そのため、hCHγ1、hCHγ2、およびhCHγ3ドメインについての結晶構造座標を、Rutgers、the State University of New Jersey、Center for Integrative Proteomics Research、the San Diego Supercomputer Center(SDSC)およびSkaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences、San Diegoによって維持されている「Protein Data Bank」から得た。hCHλ1の構造は、「Protein Data Bank」を介して利用可能な3dvのX線構造に基づく。hCHλ2の構造は、「Protein Data Bank」を介して利用可能な2dtsのX線構造に基づく。hCHλ3の構造は、「Protein Data Bank」を介して利用可能な2dtsのX線構造に基づく。hCLλの構造は、「Protein Data Bank」を介して利用可能な4fqhのX線構造に基づく。
Claims (58)
- 接続アミノ酸の鎖によって互いに順次接続されている7つのβストランドA、B、C、D、E、F、およびGを含む免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドであって、
βストランドが、βストランドA、B、D、およびEを含む第1のβシートと、βストランドC、F、およびGを含む第2のβシートとを形成するように配置されており、前記第1および第2のβシートは互いに共有結合されており;
βストランドEおよびFが、EF鎖によって互いに接続されており、前記EF鎖が配列X1−X2−X3−X4−K5−H6(配列番号98)を含み、ここで、X1、X3、およびX4はそれぞれ独立に、任意のアミノ酸残基である、ポリペプチドにおいて、
X2がA、G、I、V、L、R、S、T、Q、P、N、M、H、Wからなる群から選択されることを特徴とするポリペプチド、ならびに薬学的に許容できるその塩、立体異性体、互変異性体、溶媒和物、およびプロドラッグ。 - EF鎖が、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176、配列番号177、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189、配列番号190、配列番号191、配列番号192、配列番号193、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、および配列番号224からなる群から選択される配列を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- EF鎖が、6〜12残基長さである、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- EF鎖が、7〜11残基長さである、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- EF鎖が、8〜10残基長さである、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- EF鎖がαへリックスを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- EF鎖上のαへリックスが残基X1およびX2を含む、請求項6に記載のポリペプチド。
- βストランドCおよびDが、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、配列番号252、および配列番号253からなる群から選択されるCDモチーフを含むCD鎖によって互いに接続されていて、前記CDモチーフが、前記CD鎖の第1または第2の残基から始まる、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- CDモチーフが配列番号251である、請求項8に記載のポリペプチド。
- CDモチーフがαへリックスの一部を形成していない、請求項8から9のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- βストランドCおよびDがCD鎖によって互いに接続されていて、前記CD鎖が6〜12残基長さである、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 免疫グロブリンドメインが抗体定常ドメインである、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 抗体定常ドメインを配列番号6の配列とアラインさせた場合に、残基KおよびHを、配列番号6の80および81位に対応する位置に含む抗体定常ドメインを含むポリペプチドにおいて、抗体定常ドメインが、A、G、I、V、L、R、S、T、Q、P、N、M、H、Wからなる群から選択される残基を、配列番号6の77位に対応する位置にさらに含むことを特徴とするポリペプチド、薬学的に許容できるその塩、立体異性体、互変異性体、溶媒和物、およびプロドラッグ。
- V、I、およびLからなる群から選択される残基を、配列番号6の残基42に対応する位置にさらに含む、請求項13に記載のポリペプチド。
- D、E、N、およびQからなる群から選択される残基を、配列番号6の残基43に対応する位置にさらに含む、請求項13から14のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 配列番号6の残基42および43に対応する位置の残基が、αへリックス形成に関係していない、請求項13から15のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- X2または配列番号6の残基77に対応する位置の残基が、A、G、I、L、R、S、T、P、N、およびMからなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- X2または配列番号6の残基77に対応する位置の残基が、A、G、I、L、S、T、P、およびMからなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- X2または配列番号6の残基77に対応する位置の残基が、A、G、S、T、P、またはMからなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 哺乳類抗体定常ドメインである、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 哺乳類抗体定常ドメインがヒト化ドメインまたはヒトドメインである、請求項17に記載のポリペプチド。
- 定常ドメインが抗体可変ドメインに接続されている、請求項20から21のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 配列番号98のK5の側鎖のε−アミノ基または配列番号6の残基80に対応する位置に位置するKの側鎖のε−アミノ基が、リンカーに共有結合されている、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- リンカーが、式X1−Y1−Z1、X1−Φ−Y1−Z1、およびX1−Y1−Φ−Zからなる群から選択される式を含み、ここで、Φは切断可能な基であり、X1は、少なくとも1個のエフェクター部分に共有結合的に接続可能な基であり、Y1は、直鎖または分枝の接続鎖であり、Zは、配列番号98のK5の側鎖のε−アミノ基または配列番号6の残基80に対応する位置に位置するKの側鎖のε−アミノ基に共有結合的に接続される基である、請求項23に記載のポリペプチド。
- リンカーの全体長さが、150原子を超えない、請求項23から26のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- リンカーの全体長さが、60原子を超えない、請求項27に記載のポリペプチド。
- エフェクター部分が、治療薬、タンパク質、ペプチド、核酸、アプタマー、低分子、タンパク質アゴニスト、タンパク質アンタゴニスト、代謝調節物質、ホルモン、毒素、成長因子、または診断薬である、請求項24から28のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- エフェクター部分が毒素であり、下式:
W2は、
R11は、
Y2は、−C2〜C20アルキレン−、−C2〜C20ヘテロアルキレン−;−C3〜C8カルボシクロ−、−アリーレン−、−C3〜C8ヘテロシクロ−、−Cl〜C10アルキレン−アリーレン−、−アリーレン−Cl〜Cl0アルキレン−、−Cl〜Cl0アルキレン−(C3〜C8カルボシクロ)−、−(C3〜C8カルボシクロ)−Cl〜C10アルキレン−、−Cl〜Cl0アルキレン−(C3〜C8ヘテロシクロ)−または−(C3〜C8ヘテロシクロ)−Cl〜Cl0アルキレン−であり、
Z2は、
R12は、水素、C1〜C8アルキル、またはC1〜C8ハロアルキルであり、
R13AおよびR13Bは、次の(iii)または(iv)のいずれかであり:
(iii)R13Aは、水素、C1〜C8アルキル、C1〜C8ハロアルキル、C3〜C8カルボシクリル、C1〜C10ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアラルキル、アラルキル、またはハロゲンであり、かつ
R13Bは、C1〜C8アルキル、C1〜C8ハロアルキル、C3〜C8カルボシクリル、C1〜C10ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアラルキルもしくはアラルキル、またはハロゲンであるか、または
(iv)R13AおよびR13Bは一緒になって、C2〜C8アルキレンまたはC1〜C8ヘテロアルキレンであり、
R14AおよびR14Bは、次の(iii)または(iv)のいずれかであり:
(iii)R14Aは、水素、C1〜C8アルキル、C1〜C8ハロアルキル、C3〜C8カルボシクリル、C1〜C10ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアラルキル、またはアラルキルであり、かつ
R14Bは、水素、C1〜C8アルキル、C1〜C8ハロアルキル、C3〜C8カルボシクリル、C1〜C10ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアラルキル、またはアラルキルであるか、または
(iv)R14AおよびR14Bは一緒になって、C2〜C8アルキレンまたはC1〜C8ヘテロアルキレンであり、
R15は、−C1〜C8アルキル、−C1〜C8アルキル−N(R’)2、−C1〜C8アルキル−C(O)R’、−C1〜C8アルキル−C(O)OR’ −O−(C1〜C8アルキル)、−C(O)R’、−OC(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)N(R’)2、−NHC(O)R’、−S(O)2R’、−S(O)R’、−OH、ハロゲン、−N3、−N(R’)2、−CN、−NHC(=NH)NH2、−NHCONH2、−S(=O)2R’および−SR’(ここで、各R’は、水素、C1〜C8アルキル、および非置換のアリールからなる群から独立に選択されるか、または2個のR’は、それらが結合している窒素と一緒に、C1〜C10ヘテロシクリルを形成することができる)からなる群から独立に選択される1、2、3、4または5個の基で置換されていてもよい
R15は、C1〜C8アルキル、−C1〜C8アルキル−N(R’)2、−C1〜C8アルキル−C(O)R’、−C1〜C8アルキル−C(O)OR’、−O−(C1〜C8アルキル)、−C(O)R’、−OC(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)N(R’)2、−NHC(O)R’、−S(O)2R’、−S(O)R’、−OH、ハロゲン、−N3、−N(R’)2、−CN、−NHC(=NH)NH2、−NHCONH2、−S(=O)2R’、−SR’およびアリーレン−R’(ここで、各R’は、水素、C1〜C8アルキル、C1〜C8ヘテロシクリル、C1〜C10アルキレン−C3〜C8ヘテロシクリル、およびアリールからなる群から独立に選択されるか、または2個のR’は、それらが結合している窒素と一緒に、C1〜C10ヘテロシクリルを形成することができる)からなる群から独立に選択される1、2、3、4、または5個の基で置換されていてもよい
R16は、水素、−C1〜C8アルキル、−C2〜C8アルケニル、−C2〜C8アルキニル、または−C1〜C8ハロアルキルであり、
R22は、水素、C1〜C4アルキル、C1〜C10ヘテロシクリル、またはC6〜C14アリールであり、
R23は、C1〜C10ヘテロシクリルであり、
R17は、出現する毎に、F、Cl、I、およびBrからなる群から独立に選択され、
R20は、−アリール、−Cl−Cl0アルキレン−アリールであり、アリールを含むR10上のアリールは、[R17]hで置換されており、
hは、5であり、
Xは、OまたはSであるが、
ただし、R13Aが水素である場合、XはSであることを条件とする]
または薬学的に許容できるその塩または溶媒和物を含む、請求項29に記載のポリペプチド。 - 少なくとも1個のエフェクター部分がタンパク質またはペプチドである、請求項24に記載のポリペプチド。
- リンカーのX1基が、タンパク質またはペプチド中のペプチド連結残基のアミノ末端、カルボキシル末端、または側鎖に共有結合されている、請求項32に記載のポリペプチド。
- ペプチド連結残基が、K、R、C、T、Y、S、Dap、Dab、KSH、ならびにKおよびCの同族体からなる群から選択される、請求項33に記載のポリペプチド。
- 連結残基がKである、請求項34に記載のポリペプチド。
- 抗体定常軽鎖(CL)ドメインを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- CLドメインがカッパドメイン(CLκ)である、請求項36に記載のポリペプチド。
- CLκが、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号47、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号54、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号119、配列番号120、配列番号121、および配列番号122からなる群から選択される配列を含む、請求項37に記載のポリペプチド。
- CLκが、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176、配列番号177、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189、配列番号190、配列番号191、配列番号192、配列番号193、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、および配列番号224からなる群から選択される中間配列によって互いに連続接続されている配列番号225によって定義されるN末端部分および配列番号226によって定義されるC末端部分を含む、請求項37に記載のポリペプチド。
- CLドメインがラムダドメイン(CLλ)である、請求項36に記載のポリペプチド。
- CLλが、配列番号60、配列番号61、配列番号141、配列番号144、配列番号143、配列番号236、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、配列番号242、配列番号243、および配列番号244からなる群から選択される配列を含む、請求項40に記載のポリペプチド。
- CLλが、中間配列によって、配列番号234または配列番号235のいずれかによって定義されるC末端部分に互いに連続接続されている、配列番号227、配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、または配列番号233のうちの1つによって定義されるN末端部分を含み、中間配列が、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号1
26、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176、配列番号177、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189、配列番号190、配列番号191、配列番号192、配列番号193、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197、配列番号198、配列番号199、配列番号200、配列番号201、配列番号202、配列番号203、配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223、および配列番号224からなる群から選択される、請求項40に記載のポリペプチド。 - 配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号47、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号54、配列番号60、配列番号61、配列番号77、配列番号78、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号119、配列番号120、配列番号121、配列番号122、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号134、配列番号135、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号151、配列番号156、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号163、配列番号165、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号236、配列番号237、配列番号238、配列番号239、配列番号240、配列番号241、および配列番号254からなる群から選択される配列、またはこれらと少なくとも約85%同一なポリペプチドを含む、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
- 組成物または試料中のリンカーのうちの少なくとも約70%が、配列番号98のK5の側鎖のε−アミノ基または配列番号6の残基80に対応する位置に位置するKの側鎖のε−アミノ基にコンジュゲートされている、請求項23から43のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物。
- ポリペプチドのうちの少なくとも約70%が、配列番号98のK5の側鎖のε−アミノ基または配列番号6の残基80に対応する位置に位置するKの側鎖のε−アミノ基に共有結合されているリンカーを含む、請求項23から43のいずれか一項に記載の複数種のポリペプチドを含む組成物。
- 前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合部分。
- 全長抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、VH、二重特異性抗体、またはミニボディである、請求項46に記載の抗体。
- h38C2、リツキシマブ、セツキシマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、ラニビズマブ、トラスツズマブ、およびパリビズマブからなる群から選択される抗体からのVHおよびVLドメインを含む、請求項46から47のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項1から43のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項44もしくは45のいずれか一項に記載の組成物、または請求項46から48のいずれか一項に記載の抗体を含み、かつ許容できる担体をさらに含む医薬組成物。
- 請求項1から22のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項46から48のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。
- 請求項50に記載の核酸を含む、宿主細胞。
- 請求項50に記載の核酸を含むベクター。
- R1がFである、請求項51に記載の方法。
- h=3、4、または5である、請求項53から54のいずれか一項に記載の方法。
- h=4または5である、請求項53から55のいずれか一項に記載の方法。
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