JP2015504893A - 変異抗体およびそのコンジュゲーション - Google Patents

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Abstract

本発明は、アミノ酸の接続鎖によって互いに順次接続されている７つのβストランドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧ、ならびにβストランドＥとＦとの間のＥＦ鎖上に連続して位置する第１のαへリックスを含むポリペプチドであって、βストランドが、βストランドＡ、Ｂ、Ｄ、およびＥを含む第１のβシートと、βストランドＣ、Ｆ、およびＧを含む第２のβシートとを形成するように配置されており、前記第１および第２のβシートは互いに共有結合されて第１のＩｇドメインを形成しており；βストランドＥとＦとの間のＥＦ鎖が配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｋ５−Ｈ６（配列番号９８）を含み、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４がそれぞれ独立に、任意のアミノ酸残基である、ポリペプチドにおいて、Ｘ２がＡ、Ｇ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｐ、Ｎ、Ｍ、Ｈ、Ｗからなる群から選択されることを特徴とするポリペプチド、ならびに薬学的に許容できるその塩、立体異性体、互変異性体、溶媒和物、およびプロドラッグに関する。

Description
二機能性治療薬の開発は、併用療法戦略を増強させる大きな将来性を有している。二機能性治療薬は、１つの治療実体で２つの異なる経路をモジュレートすることによって、併用療法の有益性をもたらし得る。加えて、二機能性治療薬は、各経路間の相乗作用による有益性も有し、一機能性薬剤と比較して増大した活性を実証し得る。さらに、二機能性治療薬は、製造、貯蔵、および輸送コストの低減、さらには、患者に施される治療の回数の低減、ならびに投与計画の簡略化の点においても有益性をもたらし得る。
本明細書におけるいずれの技術についての言及も、その言及されている技術が、共通する一般的知識の一部を成しているという何らかの形式または示唆を承認するものではなく、かつそのようにみなされるべきものでもない。
本発明は、抗体定常ドメインを配列番号６の配列とアラインさせた場合に、残基ＫおよびＨを、配列番号６の８０および８１位に対応する位置に含む抗体定常ドメインを含むポリペプチドにおいて、抗体定常ドメインが、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｐ、Ｎ、Ｍ、Ｈ、Ｗからなる群から選択される残基を、配列番号６の７７位に対応する位置にさらに含むことを特徴とするポリペプチドを提供する。
一部の態様では、本発明は、配列番号９８（および配列番号９８の範囲内に該当する本明細書に記載のすべての配列）を含む抗体定常ドメインであって、その定常ドメイン配列を配列番号６とアラインさせた場合に、前記定常ドメインにおける配列番号９８の位置は、配列番号６の残基７６〜８１に対応する、抗体定常ドメインを提供する。
２種のポリペプチドの構造が既知である場合には構造的アラインメントによって、または配列アラインメントによって、配列をアラインさせることができるが、配列アラインメントを使用する場合には、その構造が既知である相同なポリペプチドの構造的知識を使用して、その方法を好ましくは補強する。
本発明は、Ｋａｂａｔナンバリングによる残基Ｋ１８８およびＨ１８１を含む抗体定常軽鎖ドメインを含むポリペプチドにおいて、抗体定常ドメインが、Ｋａｂａｔナンバリングによる１８５位に対応する位置にＡ、Ｇ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｐ、Ｎ、Ｍ、Ｈ、Ｗからなる群から選択される残基をさらに含むことを特徴とする、ポリペプチドを提供する。
本発明は、接続アミノ酸の鎖によって互いに順次接続されている７つのβストランドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧを含む免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドであって、βストランドが、βストランドＡ、Ｂ、Ｄ、およびＥを含む第１のβシートと、βストランドＣ、Ｆ、およびＧを含む第２のβシートとを形成するように配置されており、前記第１および第２のβシートは互いに共有結合されており；βストランドＥおよびＦが、ＥＦ鎖によって互いに接続されており、前記ＥＦ鎖が、配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｋ５−Ｈ６（配列番号９８）を含み、ここで、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４はそれぞれ独立に、任意のアミノ酸残基である、ポリペプチドにおいて、Ｘ２がＡ、Ｇ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｐ、Ｎ、Ｍ、Ｈ、Ｗからなる群から選択されることを特徴とするポリペプチド、ならびに薬学的に許容できるその塩、立体異性体、互変異性体、溶媒和物、およびプロドラッグを提供する。
Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｎ、およびＭからなる群から選択され得る（配列番号９９）。Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、およびＭからなる群から選択され得る（配列番号１００）。一部の態様では、ＥＦ鎖が配列番号１０１、配列番号１０２、および配列番号１０３の配列からなる群から選択される配列を含む。Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｎ、Ｐ、およびＭからなる群から選択され得る（配列番号１２３）。Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、およびＭからなる群から選択され得る（配列番号１２４）。Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、およびＭからなる群から選択され得る（配列番号１２５）。Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、およびＭからなる群から選択され得る（配列番号１２６）。Ｘ２は、ＳまたはＴであってよい。Ｘ２は、ＡまたはＧであってよい。Ｘ２は、ＩまたはＬであってよい。本明細書に記載のＸ２の選択は、本発明の抗体定常ドメインにも適用することができ、Ｘ２位は、配列番号６の残基７７か、またはＫａｂａｔナンバリングによる定常軽鎖ドメインの残基１８５と一致する。
一部の態様では、ＥＦ鎖は、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、および配列番号１２６からなる群から選択される配列を含み、さらに、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、および配列番号２２４からなる群から選択することができる。
一部の態様では、配列番号１０；または配列番号６の残基７５〜７９と比較した場合に、単一の残基の相違が存在してよい。一部の態様では、配列番号１０；または配列番号６の残基７５〜７９と比較した場合に、２つまでの相違が存在してよい。一部の態様では、配列番号１０；または配列番号６の残基７５〜７９と比較した場合に、３つまでの相違が存在してよい。一部の態様では、配列番号１０；または配列番号６の残基７５〜７９と比較した場合に、４つまでの相違が存在してよい。一部の態様では、配列番号１０；または配列番号６の残基７５〜７９と比較した場合に、２つまでの非連続的な相違が存在してよい。一部の態様では、配列番号１０；または配列番号６の残基７５〜７９と比較した場合に、３つまでの非連続的な相違が存在してよい。
一部の態様では、配列番号１０；または配列番号６の残基７６〜７９と比較した場合に、単一の残基の相違が存在してよい。一部の態様では、配列番号１０；または配列番号６の残基７６〜７９と比較した場合に、２つまでの相違が存在してよい。一部の態様では、配列番号１０；または配列番号６の残基７６〜７９と比較した場合に、３つまでの相違が存在してよい。一部の態様では、配列番号１０；または配列番号６の残基７６〜７９と比較した場合に、４つまでの相違が存在してよい。一部の態様では、配列番号１０；または配列番号６の残基７６〜７９と比較した場合に、２つまでの非連続的な相違が存在してよい。
当該ポリペプチドは、ＥＦ鎖上に位置するＥＦαへリックスを含み得る。一部の態様では、配列番号９８の残基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のうちの１個または複数は、ＥＦαへリックスの一部を構成している。一部の態様では、配列番号９８の残基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のうちの２個以上は、ＥＦαへリックスの一部を構成している。一部の態様では、配列番号９８の残基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のうちの３個以上は、ＥＦαへリックスの一部を構成している。一部の態様では、配列番号９８の残基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４のすべてが、ＥＦαへリックスの一部を構成している。一部の態様では、配列番号９８の残基Ｋ５およびＨ６は、αへリックスの一部を形成していない。本明細書に記載のＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｋ５、およびＨ６の選択は、本発明の抗体定常ドメインにも適用することができ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｋ５、およびＨ６位は、配列番号６の残基７６、７７、７８、７９、８０、および８１、またはＫａｂａｔナンバリングによる定常軽鎖ドメインの１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、および１８９位に一致する。
一部の態様では、ＥＦ鎖は、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、および配列番号２２４からなる群から選択される配列を含む。
本発明の一部の態様では、特に、Ｘ１に対応する残基に変異性を伴う本出願中のすべての配列に関して、上記の配列によるＸ１は、Ａ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｇ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。一部の態様では、Ｘ１は、Ａ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｇ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。一部の態様では、Ｘ１は、Ａ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。一部の態様では、Ｘ１は、Ａ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。一部の態様では、Ｘ１は、Ａ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。一部の態様では、Ｘ１は、Ａ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。Ｘ１は、Ａ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。本明細書に記載のＸ１の選択は、本発明の抗体定常ドメインにも適用することができ、Ｘ１位は、配列番号６の残基７６、またはＫａｂａｔナンバリングによる定常軽鎖ドメインの残基１８４と一致する。
本発明の一部の態様では、特に、Ｘ３に対応する残基に変異性を伴う本出願中のすべての配列に関して、上記の配列によるＸ３は、Ａ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｇ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。Ｘ３は、Ａ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｇ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。Ｘ３は、Ａ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。Ｘ３は、Ａ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。Ｘ３は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。Ｘ３は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。Ｘ３は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。Ｘ３は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、およびＹからなる群から選択され得る。Ｘ３は、Ｆ、Ｗ、およびＹからなる群から選択され得る。Ｘ３は、ＷおよびＹからなる群から選択され得る。本明細書に記載のＸ３の選択は、本発明の抗体定常ドメインにも適用することができ、その際、Ｘ３位は、配列番号６の残基７８、またはＫａｂａｔナンバリングによる定常軽鎖ドメインの残基１８６と一致する。
本発明の一部の態様では、特に、Ｘ４に対応する残基に変異性を伴う本出願中のすべての配列に関して、上記の配列によるＸ４は、Ａ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｇ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。Ｘ４は、Ａ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｇ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。Ｘ４は、Ａ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｇ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。Ｘ４は、Ａ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。Ｘ４は、Ａ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。Ｘ４は、Ａ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。Ｘ４は、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。Ｘ４は、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、およびＤからなる群から選択され得る。Ｘ４は、Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、およびＥからなる群から選択され得る。Ｘ４は、Ｑ、Ｋ、およびＥからなる群から選択され得る。本明細書に記載のＸ４の選択は、本発明の抗体定常ドメインにも適用することができ、その際、Ｘ４位は、配列番号６の残基７９、またはＫａｂａｔナンバリングによる定常軽鎖ドメインの残基１８７と一致する。
一部の態様では、ＥＦ鎖は、６〜１２残基長さである。一部の態様では、ＥＦ鎖は、７〜１２残基長さである。一部の態様では、ＥＦ鎖は、８〜１２残基長さである。一部の態様では、ＥＦ鎖は、９〜１２残基長さである。一部の態様では、ＥＦ鎖は、６〜１１残基長さである。一部の態様では、ＥＦ鎖は、６〜１０残基長さである。一部の態様では、ＥＦ鎖は、６〜９残基長さである。一部の態様では、ＥＦ鎖は、７〜１１残基長さである。一部の態様では、ＥＦ鎖は、７〜１０残基長さである。一部の態様では、ＥＦ鎖は、８〜１０残基長さである。
ＥＦ鎖は、αへリックス（ＥＦαへリックス）を含み得る。ＥＦαへリックスの第１の残基は、ＥＦ鎖の最初の３個の残基内に位置し得る。ＥＦαへリックスの第１の残基は、ＥＦ鎖の最初の２個の残基内に位置し得る。ＥＦαへリックスの第１の残基は、ＥＦ鎖の残基に位置し得る。ＥＦαへリックスは、配列番号９８または配列番号９８の範囲内に該当する本明細書に記載の対応する配列のうちの１つの少なくとも残基Ｘ１およびＸ２を含み得る。一部の態様では、配列番号９８に対応する残基Ｋ５およびＨ６は、αへリックスの範囲内にはない。一部の態様では、配列番号６の８０および８１位に対応する残基ＫＨは、αへリックスの範囲内にはない。抗体定常ドメインに関する本発明の一部の態様では、配列番号６の７７位に対応する残基は、αへリックスの範囲内に該当する。
一部の態様では、ＣＬドメインであってよい本発明の免疫グロブリンドメインは、残基Ｄ、Ｅ、Ｑ、またはＮを、βストランドＣとＤとの間の接続鎖であるＣＤ鎖上にさらに含む。一部の態様では、ＣＬドメインは、残基Ｄ、Ｅ、Ｑ、またはＮをＣＤ鎖上にさらに含み、この残基は、そのアミノ酸側鎖が、配列番号９８のＫ５またはＨ６の側鎖のうちの少なくとも１個と相互作用することが可能であるようにポジショニングされている。一部の態様では、当該ポリペプチドは、一部の態様ではＢＬＡＳＴ配列アラインメントによる配列番号１０または配列番号６の４３位に対応する位置に位置しているＤ、Ｅ、Ｑ、またはＮ残基を含む。一部の態様では、残基は、Ｄ、Ｅ、またはＮである。一部の態様では、残基は、ＤまたはＥである。一部の態様では、残基は、ＤまたはＮである。
一部の態様では、βストランドＣおよびＤは、ＣＤモチーフＣ１−Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４を含むＣＤ鎖（配列番号２５５）によって互いに接続されており、ここで、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４はそれぞれ、任意のアミノ酸であってよいか、または、下記で明示するとおりにさらに規定され得る。このＣＤモチーフは、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、および配列番号２５３からなる群から選択され得、ここで、前記ＣＤモチーフは、前記ＣＤ鎖の第１または第２の残基から始まる。一部の態様では、このＣＤモチーフは、ＣＤ鎖の第１の残基から始まる。一部の態様では、このＣＤモチーフは、ＣＤ鎖の第２の残基から始まる。有利には、このＣＤモチーフは、αへリックスの一部を形成し得ない。
一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ１は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｇ、Ｖ、Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、およびＥからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ１は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、およびＷからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ１は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｐ、Ｆ、Ｙ、およびＷからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ１は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｐ、Ｆ、およびＷからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ１は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、およびＷからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ１は、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ１は、ＬおよびＶからなる群から選択され得る。一部の態様では、このＣＤモチーフの残基Ｃ１はＶであってよい。本明細書に記載のＣＤモチーフのＣ１の選択は、本発明の抗体定常ドメインに適用することもでき、このＣＤモチーフのＣ１位は、配列番号６の残基４２、またはＫａｂａｔナンバリングによる定常軽鎖ドメインの残基１５０と一致する。
一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ２は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｇ、Ｖ、Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、およびＥからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ２は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｇ、Ｖ、Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、およびＥからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ２は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｇ、Ｖ、Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、およびＥからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ２は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、およびＥからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ２は、Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、およびＥからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ２は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、およびＥからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ２は、Ｎ、Ｑ、Ｄ、およびＥからなる群から選択され得る。一部の態様では、このＣＤモチーフの残基Ｃ２はＤであってよい。本明細書に記載のＣＤモチーフのＣ２の選択は、本発明の抗体定常ドメインに適用することもでき、その際、このＣＤモチーフのＣ２位は、配列番号６の残基４３、またはＫａｂａｔナンバリングによる定常軽鎖ドメインの残基１５１と一致する。
一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ３は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｇ、Ｖ、Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、およびＥからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ３は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｇ、Ｖ、Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、およびＥからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ３は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｇ、Ｖ、Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、およびＥからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ３は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、およびＥからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ３は、Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、およびＥからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ３は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、およびＥからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ３は、Ｎ、Ｑ、Ｄ、およびＥからなる群から選択され得る。一部の態様では、このＣＤモチーフの残基Ｃ３はＮであってよい。本明細書に記載のＣＤモチーフのＣ３の選択は、本発明の抗体定常ドメインに適用することもでき、その際、このＣＤモチーフのＣ３位は、配列番号６の残基４４、またはＫａｂａｔナンバリングによる定常軽鎖ドメインの残基１５２と一致する。
一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ４は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｇ、Ｖ、Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、およびＥからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ４は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｇ、Ｖ、Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、およびＥからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ４は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｇ、Ｖ、Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、およびＨからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ４は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｇ、Ｍ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、およびＥからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ４は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、およびＥからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ４は、Ａ、Ｖ、Ｑ、およびＳからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＤモチーフの残基Ｃ４は、ＡおよびＳからなる群から選択され得る。一部の態様では、このＣＤモチーフの残基Ｃ４はＡであってよい。本明細書に記載のＣＤモチーフのＣ４の選択は、本発明の抗体定常ドメインに適用することもでき、その際、このＣＤモチーフのＣ４位は、配列番号６の残基４５、またはＫａｂａｔナンバリングによる定常軽鎖ドメインの残基１５３と一致する。
一部の態様では、ＣＤ鎖は、６〜１２残基長さである。一部の態様では、ＣＤ鎖は、７〜１２残基長さである。一部の態様では、ＣＤ鎖は、８〜１２残基長さである。一部の態様では、ＣＤ鎖は、９〜１２残基長さである。一部の態様では、ＣＤ鎖は、６〜１１残基長さである。一部の態様では、ＣＤ鎖は、６〜１０残基長さである。一部の態様では、ＣＤ鎖は、６〜９残基長さである。一部の態様では、ＣＤ鎖は、７〜１１残基長さである。一部の態様では、ＣＤ鎖は、７〜１０残基長さである。一部の態様では、ＣＤ鎖は、８〜１０残基長さである。
免疫グロブリンドメインは、抗体ドメインであってよい。この抗体ドメインは、抗体定常ドメインであってよい。この抗体定常ドメインは、定常重鎖（ＣＨ）ドメインまたは定常軽鎖（ＣＬ）ドメインであってよい。抗体ＣＨドメインは、ＣＨα１、ＣＨα２、ＣＨα３、ＣＨδ１、ＣＨδ２、ＣＨδ３，ＣＨε１、ＣＨε２、ＣＨε３、ＣＨε４、ＣＨγ１、ＣＨγ２、ＣＨγ３、ＣＨμ１、ＣＨμ２、ＣＨμ３、およびＣＨμ４からなる群から選択され得る。
一部の態様では、本発明の免疫グロブリンドメインは、哺乳類のものである（任意の人工的に変異させたか、または別段に操作したバージョンを発生させるために使用した方法には関係なく）。哺乳類種は、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、げっ歯類、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ウマ、ラクダ、霊長類、サル、イヌ、またはネコであってよい。本発明の免疫グロブリンドメインおよび、それらを含むか、またはそれらに結合する抗体などの他のタンパク質は、ヒト化されていてよい。
一部の態様では、本発明は、変異免疫グロブリンドメインを含み、ここで、変異体は、その天然の正準配列以外の配列へと操作または改変されている配列と定義されるので、本発明のポリペプチドの一定の実施形態は、定義の範囲内に該当する天然に生じる配列を特に除外するこことなる。したがって一部の態様では、本発明は、それらの天然に生じる対応する配列とは異なるＥＦ鎖を含む本発明のポリペプチドに関する。
本発明の抗体ドメインは、ボルネオオランウータンおよびボルネオオランウータン（Ｐｏｎｇｏ ｐｙｇｍａｅｕｓ）からなる群から選択される１種または複数の種に由来する１つまたは複数の天然ＩｇＡ定常重鎖ドメイン（ＣＨα１、ＣＨα２、ＣＨα３）を、かつ／またはマウス、ラット、ウマ、ウマ（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）、ハダカデバネズミ（Ｈｅｔｅｒｏｃｅｐｈａｌｕｓ ｇｌａｂｅｒ）、コウモリ、エプテシカスフスカス（Ｅｐｔｅｓｉｃｕｓ ｆｕｓｃｕｓ）からなる群から選択される１種または複数の種に由来する１つまたは複数の天然ＩｇＭ定常重鎖ドメイン（ＣＨμ１、ＣＨμ２、ＣＨμ３、およびＣＨμ４）を、かつ／またはヒト、チンパンジー、サル、パタスモンキー（Ｅｒｙｔｈｒｏｃｅｂｕｓ ｐａｔａｓ）、マウス、ラット、コウモリ、シノプテルススフィンクス（Ｃｙｎｏｐｔｅｒｕｓ ｓｐｈｉｎｘ）、ヒツジ、ヒツジ（Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ）、ハリモグラ、およびハリモグラ（Ｔａｃｈｙｇｌｏｓｓｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）からなる群から選択される１種または複数の種に由来する１つまたは複数の天然ＩｇＥ定常重鎖ドメイン（ＣＨε１、ＣＨε２、ＣＨε３、およびＣＨε４）を特に除外し得る。
一部の態様では、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、げっ歯類、ブタ、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ウマ、ラクダ、霊長類、サル、イヌ、またはネコからなる群から選択される１種または複数の種に由来するＣＨα１、ＣＨα２、ＣＨα３、ＣＨδ１、ＣＨδ２、ＣＨδ３，ＣＨε１、ＣＨε２、ＣＨε３、ＣＨε４、ＣＨγ１、ＣＨγ２、ＣＨγ３、ＣＨμ１、ＣＨμ２、ＣＨμ３、およびＣＨμ４からなる群から選択される１つまたは複数の定常重鎖ドメインを特に除外する。
一部の態様では、本発明は、アミノ酸の鎖によって互いに順次接続されている７つのβストランドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧを含む定常軽鎖（ＣＬ）ドメインであって、βストランドが、βストランドＡ、Ｂ、Ｄ、およびＥを含む第１のβシートと、βストランドＣ、Ｆ、およびＧを含む第２のβシートとを形成するように配置されており、前記第１および第２のβシートは互いに共有結合されており；βストランドＥとＦとの間の鎖が、配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｋ５−Ｈ６（配列番号９８）を含み、ここで、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４はそれぞれ独立に、任意のアミノ酸残基である、ポリペプチドにおいて、Ｘ２がＡ、Ｇ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｐ、Ｎ、Ｍ、Ｈ、およびＷからなる群から選択されることを特徴とする定常軽鎖（ＣＬ）ドメインであってよい免疫グロブリンドメイン、ならびに薬学的に許容できるその塩、立体異性体、互変異性体、溶媒和物、およびプロドラッグを提供する。本発明は、本発明のＣＬドメインを含む医薬組成物および試料も提供する。一部の態様では、αへリックスを、βストランドＥとＦとの間の接続鎖上に連続して位置させる。
一部では、本発明の態様は、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインであってよい免疫グロブリンドメインのＥＦ鎖上に位置している反応性ＫＨ基への部位特異的コンジュゲーションが、ＤまたはＥなどの酸性残基の存在を削除し、芳香族残基ＦもしくはＹ、またはＫもしくはＣなどの他の潜在的なコンジュゲーション部位の導入を回避する３アミノ酸残基上流での変異によって改善されるという意外な発見に基づく。
ＥＦ鎖上に本発明の配列をグラフトすることで、免疫グロブリンドメイン、特に、ＣＬドメイン上へのコンジュゲーションの特異性の増大を付与することができる。これは、リンカーおよび／またはエフェクター部分を免疫グロブリンドメインおよび一般にＣＬドメインに、かつ特にその抗体および抗原結合部分にコンジュゲートさせる場合に有用であり得る。したがって一部の態様では、本発明は、リンカーに、かつ／またはリンカーを介してエフェクター部分に共有結合的にコンジュゲートされている抗体またはその抗原結合部分を含む多機能性抗体コンジュゲート（ＭＡＣ）の新規のクラスにおいて、抗体またはその抗原結合部分が本発明のポリペプチドを含み、リンカーが、配列番号９８のＫ５の側鎖のε−アミノ基に共有結合されていることを特徴とする多機能性抗体コンジュゲートの新規のクラスに関する。
一部の態様では、ＣＬドメインであってよい本発明の免疫グロブリンドメインは、可変軽鎖（ＶＬ）ドメインに接続されている。これらは一緒に、抗体軽鎖を構成し得る。
一部の態様では、第１および第２のβシートの間の共有結合はジスルフィド結合である。一部の態様では、βストランドＢとＦとの間は、ジスルフィド結合である。
ＣＬドメインは、定常軽鎖カッパ（ＣＬκ）であってよく、ラット、マウス、サル、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウマ、ロバ、イヌ、ネコ、またはヒトのものであってよい。一部の態様では、ＣＬκは、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５４、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、および配列番号１２２からなる群から選択される配列を含む。
一部の態様では、ＣＬκは、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、および配列番号２２４からなる群から選択される中間配列によって互いに連続接続されている配列番号２２５によって定義されるＮ末端部分および配列番号２２６によって定義されるＣ末端部分を含む。
免疫グロブリンドメインは、ＣＬλドメインであってよく、配列番号６０、配列番号６１、配列番号１４１、配列番号１４４、配列番号１４３、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、および配列番号２４４からなる群から選択される配列を含んでよい。一部の態様では、ＣＬλドメインは、配列番号６０、配列番号６１、配列番号１４３、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、および配列番号２４４からなる群から選択される配列を含む。
ＣＬλは、中間配列によって配列番号２３４または配列番号２３５のいずれかによって定義されるＣ末端部分に互いに連続接続されている配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、または配列番号２３３の１つによって定義されるＮ末端部分を含んでよく、ここで、この中間配列は、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、および配列番号２２４からなる群から選択される。
免疫グロブリンドメインがＣＬλドメインを含む一部の実施形態では、このドメインは、本明細書に記載のとおりのＣＤモチーフをさらに含んでよい。
免疫グロブリンドメインがＣＨγ１ドメインを含む一部の実施形態では、このドメインは、本明細書に記載のとおりのＣＤモチーフをさらに含んでよい。
免疫グロブリンドメインがＣＨγ２ドメインを含む一部の実施形態では、このドメインは、本明細書に記載のとおりのＣＤモチーフをさらに含んでよい。
免疫グロブリンドメインがＣＨγ３ドメインを含む一部の実施形態では、ＥＦ鎖の残基Ｘ２は、Ｒではあり得ない；一部の態様では、ＥＦ鎖配列は、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１１７、配列番号１２５、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、および配列番号２２４からなる群から選択され得る。一部の態様では、本発明のＣＨγ３ドメインのＣＤ鎖は、本明細書に記載のとおりのＣＤモチーフをさらに含んでよい。
エフェクター部分にコンジュゲートさせるために適したリンカーにコンジュゲートさせる場合、配列番号９８のＫ５の側鎖のε−アミノ基は、リンカーに共有結合されていてよい。
一部では、本発明は、ＣＬκ−Ｄ７７をＡ、Ｇ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｐ、Ｎ、Ｍ、Ｈ、またはＷの１つに変異させると、ＣＬκ−Ｋ８０へのコンジュゲーションの特異性の程度が有意に増大するという意外な発見に基づく。
抗体のＦｃ部分とＦｃ受容体（ＦｃγＲおよびＦｃＲｎなど）との結合、または抗体とその個々の標的との結合に伴うあらゆる干渉を最小化または防止するために、エフェクター部分と抗体の定常軽鎖ドメインとの反応は特に望ましい。逆に、個々のエフェクター部分が、抗体のＦｃ部分にコンジュゲーションすると、ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗体半減期および／または免疫系と相互作用するその能力（エフェクター機能）が低下し得る。抗体の可変重鎖（ＶＨ）または可変軽鎖（ＶＬ）領域におけるエフェクター部分のコンジュゲーションは、抗体とその同族との結合を減少させるリスクを有する。
ＣＬκまたは定常軽鎖ラムダ（ＣＬλ）ドメインにエフェクター部分を優先的にコンジュゲートさせることで、抗体へのエフェクター部分のコンジュゲーション部位に影響を及ぼすことなく、抗体の定常重鎖（ＣＨ）ドメインのアイソタイプスイッチを可能にすることによって、ＭＡＣアイソタイプの作成が簡単になる。
リンカーおよび／またはエフェクター部分は、ＣＬκ−Ｋ８０の側鎖に共有結合され得る（例えば、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、および配列番号１２２からなる群から選択される配列）。このＣＬは、パラトープ領域、ＦｃＲｎ結合ドメイン、ヒンジ、ＦｃＲ結合ドメインなど、その一部を形成しているであろう典型的な抗体の重要な領域からは離れて位置している；このことによって、ＭＡＣがエフェクター部分にコンジュゲートされている場合に、これらの部位における優先的な連結が、抗体−抗原相互作用への干渉量を限定するという利点がもたらされる。
一部の態様では、ＣＬκ領域は、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、または配列番号１０９、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、または配列番号１２２の少なくとも残基６２〜１０３を含む。一部の態様では、ＣＬκ−ｘ８２は、任意のアミノ酸であってよい。一部の態様では、ＣＬκ−ｘ８２は、Ｋ、Ｒ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｆ、Ｗ、およびＹからなる群から選択され得る。一部の態様では、ＣＬκ−ｘ８２は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、またはＩであってよい。一部の態様では、ＣＬκ−ｘ８２は、Ｋ、Ｒ、Ｎ、またはＱであってよい。一部の態様では、ＣＬκ−ｘ８２は、ＤまたはＥであってよい。一部の態様では、ＣＬκ−ｘ８２は、Ｋ、Ｒ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｎ、またはＱであってよい。一部の態様では、ＣＬκ−ｘ８２は、ＤまたはＥであってよい。一部の態様では、ＣＬκ−ｘ８２は、Ｋ、Ｒ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、またはＥであってよい。一部の態様では、ＣＬκ−ｘ８２は、ＤまたはＥであってよい。一部の態様では、ＣＬκ−ｘ８２は、Ｈ、Ｆ、Ｗ、またはＹであってよい。一部の態様では、ＣＬκ−ｘ８２はプロリンではない。一部の態様では、ＣＬκ−ｘ８２はＫである。一部の態様では、ＣＬκ−ｘ８２はＲである。
一部の態様では、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、両方の軽鎖上の配列番号９８のＫ５にコンジュゲートされているエフェクター部分を含む。一部の態様では、エフェクター部分は、一方のみの軽鎖上の配列番号９８のＫ５にコンジュゲートされている。一部の態様では、エフェクター部分は、配列番号９８のＫ５のみにコンジュゲートされている。一部の態様では、エフェクター部分は、一方の軽鎖上の配列番号９８のＫ５と、抗体またはその抗原結合部分上の１つの他の位置とでコンジュゲートされている。一部の態様では、エフェクター部分は、一方の軽鎖上の配列番号９８のＫ５と、抗体またはその抗原結合部分上の２つの他の位置とでコンジュゲートされている。一部の態様では、エフェクター部分は、一方の軽鎖上の配列番号９８のＫ５と、抗体またはその抗原結合部分上の３つの他の位置とでコンジュゲートされている。一部の態様では、エフェクター部分は、両方の軽鎖上の配列番号９８のＫ５と、１つの他の位置とでコンジュゲートされている。一部の態様では、エフェクター部分は、両方の軽鎖上の配列番号９８のＫ５と、２つの他の位置とでコンジュゲートされている。一部の態様では、エフェクター部分は、両方の軽鎖上の配列番号９８のＫ５と、３つの他の位置でコンジュゲートされている。
一部の態様では、本発明は、配列番号１０；または配列番号６の７７位に対応する変異Ｉｇドメイン内の置換残基を含む変異免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインにおいて、置換残基がＡ、Ｇ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｑ、Ｎ、Ｐ、Ｈ、およびＷからなる群から選択され、ただし、変異Ｉｇドメインが、それぞれ配列番号１０；または配列番号６の８０および８１位に対応する位置に残基ＫおよびＨをさらに含むことを特徴とする、変異免疫グロブリンドメインに関する。一部の態様では、変異Ｉｇドメインは、配列番号３８、３９、４０、４１、４２、４４、４６、４７、４９、５０、５１、５２、５４、９８、９９、１００、１０１，１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１５、１１６、１１７、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、および１２６からなる群から選択される配列を含む。
寄託
一部の態様では、本発明は、ＡＴＣＣに寄託したとおりのベクターおよび核酸、前記ベクターおよび核酸によってコードされるポリペプチド、前記ベクターおよび核酸によってコードされるポリペプチドを含む組成物、ならびに前記核酸およびベクターが発現するポリペプチドを提供する。以下の材料をアメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９、ＵＳＡ（ＡＴＣＣ））に寄託してある：
Figure 2015504893
ベクターｈＣＬｋ−Ｋｍ（３）−Ｄ７７Ａは、配列番号３７で明示されるとおりのＤ７７Ａ変異を含むヒト定常軽鎖カッパ（Ｋｍ（３））ドメインをコードするポリヌクレオチドＤＮＡ挿入を含むＴＡクローニングベクターであり、ベクターｈ３８Ｃ２−［ＬＣ−Ｄ１８５Ａ］は、配列番号２５４で明示されるとおりのＤ７７Ａ変異を含むヒト化３８Ｃ２軽鎖をコードするポリヌクレオチドＤＮＡ挿入である。
一部の態様では、本発明は、本発明の免疫グロブリンドメイン、または本発明の免疫グロブリンドメイン含有タンパク質もしくは抗体を組換え産生する単離宿主細胞を提供する。本発明は、本発明のタンパク質、ドメイン、および抗体をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド、ならびに前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本発明のベクターは、ＡＴＣＣ寄託配列を含み得る。一部の態様では、本発明は、抗体、免疫グロブリンドメイン、またはタンパク質を生産する方法を提供し、その方法は、抗体、免疫グロブリンドメイン、またはタンパク質の産生が生じる条件下で、宿主細胞を培養し、宿主細胞または培養から、抗体、免疫グロブリンドメイン、またはタンパク質を単離することを含む。
一部の態様では、本発明は、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５４、配列番号６０、配列番号６１、配列番号７７、配列番号７８、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、および配列番号２５４からなる群から選択される配列を含むポリペプチド、または上述の配列のうちの１つまたは複数に対して少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％同一であるポリペプチドを提供する。
本発明の試料および組成物
一部の態様では、本発明は、エフェクター部分に共有結合的にコンジュゲートされている本発明のＣＬドメインを含む抗体またはその抗原結合部分の組成物または試料を提供し、ここで、組成物または試料中のエフェクター部分のうちの少なくとも約５０％は、配列番号９８のＫ５にコンジュゲートされている。一部の態様では、これは、少なくとも約６０％である。一部の態様では、これは、少なくとも約７０％である。一部の態様では、これは、少なくとも約８０％である。一部の態様では、これは、少なくとも約９０％である。
一部の態様では、本発明は、本発明のＣＬドメインを含む抗体またはその抗原結合部分の組成物（または試料）を提供し、ここで、抗体のうちの少なくとも約５０％は、少なくとも一方の軽鎖上の配列番号９８のＫ５に共有結合されているエフェクター部分を含む。一部の態様では、これは、少なくとも約６０％である。一部の態様では、これは、少なくとも約７０％である。一部の態様では、これは、少なくとも約８０％である。一部の態様では、これは、少なくとも約９０％である。一部の態様では、エフェクター部分は、両方の軽鎖定常領域上の配列番号９８のＫ５に共有結合的にコンジュゲートされている。
一部の態様では、本発明は、エフェクター部分に共有結合的にコンジュゲートされている本発明のＣＬドメインを含む抗体またはその抗原結合部分の組成物（または試料）を提供し、ここで、試料のうちの少なくとも約３０％は、抗体１個当たり約２つの位置でコンジュゲートされているエフェクター部分を含み、少なくとも１つのエフェクター部分コンジュゲーション部位は、配列番号９８のＫ５である。一部の態様では、この量は約４０％である。一部の態様では、この量は約５０％である。一部の態様では、この量は約６０％である。一部の態様では、この量は約７０％である。一部の態様では、この量は約８０％である。一部の態様では、この量は約９０％である。一部の態様では、この量は約９５％である。一部の態様では、この量は約９９％である。
一部の態様では、本発明は、エフェクター部分に共有結合的にコンジュゲートされている本発明のＣＬドメインを含む抗体またはその抗原結合部分の組成物（または試料）を提供し、ここで、試料のうちの少なくとも約３０％は、抗体１個当たり約３つの位置でコンジュゲートされているエフェクター部分を含み、少なくとも２つのエフェクター部分コンジュゲーション部位は、各軽鎖上の配列番号９８のＫ５である。一部の態様では、この量は約４０％である。一部の態様では、この量は約５０％である。一部の態様では、この量は約６０％である。一部の態様では、この量は約７０％である。一部の態様では、この量は約８０％である。一部の態様では、この量は約９０％である。一部の態様では、この量は約９５％である。一部の態様では、この量は約９９％である。
一部の態様では、本発明は、本発明のＣＬドメインを含む抗体またはその抗原結合部分の組成物（または試料）を提供し、ここで、軽鎖分子のうちの少なくとも５０％は、少なくとも１個のエフェクター部分と、配列番号９８のＫ５でコンジュゲートされている。
一部の態様では、これは、少なくとも約６０％である。一部の態様では、これは、少なくとも約６５％である。一部の態様では、これは、少なくとも約７０％である。一部の態様では、これは、少なくとも約７５％である。一部の態様では、これは、少なくとも約８０％である。一部の態様では、これは、少なくとも約８５％である。一部の態様では、これは、少なくとも約９０％である。一部の態様では、これは、少なくとも約９５％である。
一部の態様では、本発明は、エフェクター部分に配列番号９８のＫ５でコンジュゲートされている本発明のＣＬドメインを含む抗体またはその抗原結合部分の組成物（または試料）を提供し、ここで、重鎖分子のうちの少なくとも約７０％は、エフェクター部分とコンジュゲートされていない。一部の態様では、この量は約７５％である。一部の態様では、この量は約８０％である。一部の態様では、この量は約８５％である。一部の態様では、この量は約９０％である。一部の態様では、この量は約９５％である。一部の態様では、この量は約９９％である。一部の態様では、重鎖分子の実質的にすべてが、エフェクター部分とコンジュゲートされていない。
一部の態様では、コンジュゲートされていない個々の軽鎖断片の量は、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、および５５％からなる群から選択される下限、ならびに約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、および６０％からなる群から選択される上限を有する。一部の態様では、１つの位置でコンジュゲートされている個々の軽鎖断片の量は、約２５、３０、３５、４０、４５、５０、および５５％からなる群から選択される下限、ならびに約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、および９５％からなる群から選択される上限を有する。一部の態様では、２つの位置でコンジュゲートされている個々の軽鎖断片の量は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、５、１０、１５、２０、および２５％からなる群から選択される下限、ならびに約５、１６、７、８、９、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、および４０％からなる群から選択される上限を有する。
一部の態様では、コンジュゲートされていない個々の重鎖断片の量は、約５０、５５、６０、６５、７０、７５、および８０％からなる群から選択される下限、ならびに約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および９９％からなる群から選択される上限を有する。一部の態様では、１つの位置でコンジュゲートされている個々の重鎖断片の量は、約１、２、５、１０、１５、２０、および２５％からなる群から選択される下限、ならびに約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、および５０％からなる群から選択される上限を有する。一部の態様では、２つの位置でコンジュゲートされている個々の重鎖断片の量は、約０、１、２、３、４、５、１０、および１５％からなる群から選択される下限、ならびに約２、３、４、５、１０、１５および２０％からなる群から選択される上限を有する。
一部の態様では、本発明の試料または組成物における抗体１個当たりのコンジュゲーションの数は、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．５５、１．６、１．６５、１．７、１．７５、１．８、１．８５、１．９、１．９５、および２からなる群から選択される下限、ならびに約１．６、１．７、１．７５、１．８、１．８５、１．９、１．９５、２．０、２．０５、２．１、２．１５、２．２、２．２５、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．５、４．０、４．５、および５からなる群から選択される上限を有する。一部の態様では、本発明の試料または組成物における抗体１個当たりのコンジュゲーションの数は、約１．５〜約２．５である。一部の態様では、本発明の試料または組成物における抗体１個当たりのコンジュゲーションの数は、約１．６〜約２．４である。一部の態様では、本発明の試料または組成物における抗体１個当たりのコンジュゲーションの数は、約１．７〜約２．３である。一部の態様では、本発明の試料または組成物における抗体１個当たりのコンジュゲーションの数は、約１．８〜約２．２である。一部の態様では、本発明の試料または組成物における抗体１個当たりのコンジュゲーションの数は、約１．５、約１．５５、約１．６、約１．６５、約１．７、約１．７５、約１．８、約１．８５、約１．９、約１．９５、約２．０、約２．０５、約２．１、約２．１５、約２．２、約２．２５、約２．３、約２．４、および約２．５からなる群から選択される量である。一部の態様では、この量は約１．７である。一部の態様では、この量は約１．８である。一部の態様では、この量は約１．９である。一部の態様では、この量は約２である。一部の態様では、この量は約２．１である。一部の態様では、この量は約２．２である。一部の態様では、この量は約２．３である。
本発明の一部の態様では、抗体１個当たりのコンジュゲーションの数は２未満であり、抗体集団のうちの少なくとも５０％は、抗体１個当たり単一のコンジュゲーションのみを有する。これらの試料は、残りのＣＬκ部位を標的とする追加的なコンジュゲーション反応を可能にするので、有利である。一部の態様では、本発明の試料または組成物における抗体１個当たりのコンジュゲーションの数は、約０．５〜約１．５である。一部の態様では、本発明の試料または組成物における抗体１個当たりのコンジュゲーションの数は、約０．６〜約１．４である。一部の態様では、本発明の試料または組成物における抗体１個当たりのコンジュゲーションの数は、約０．７〜約１．３である。一部の態様では、本発明の試料または組成物における抗体１個当たりのコンジュゲーションの数は、約０．８〜約１．２である。一部の態様では、本発明の試料または組成物における抗体１個当たりのコンジュゲーションの数は、約０．９〜約１．１である。
本発明の利点の１つは、試薬および反応条件（特に、脱離基エステルおよびリンカー：抗体のモル比）に応じて、本発明の組成物および試料を、定義された数の抗体に対して定義された数のエフェクター部分を伴って生成することができることである。これは、エフェクター部分および抗体の相対的反応性および治療ウィンドウのバランスをとる場合に、特に有用であり得る。さらに、一部の状況では、一定の閾値を超えて抗体１個当たりのペプチドまたは他の活性部分の数を増加させても、標的結合または治療効果の増大が生じないおそれがある。したがって、抗体１個当たりのコンジュゲートするペプチドの数を制御し、そうする際に、Ｆｃまたは結合部位の干渉を最小化するように、コンジュゲーションの位置を方向付けることができることは有用である。したがって一部の状況では、単一のＣＬκ−Ｋ８０のみを優先的に装飾する少ないコンジュゲーションを可能にする本発明の態様が、有利であり得る。さらに、ＣＬκ−Ｋ８０へのコンジュゲーションは信頼性が高く、かつ強固であるのに対して、反応性およびｐＩがそれぞれやや異なる他の抗体表面リシンへのコンジュゲーションは、循環中および抗体認識によってエフェクター部分が標的に送達される前（またはエフェクター部分での認識によって抗体が標的に送達される前）など、時機が悪いか、または不規則な時刻にコンジュゲートされた分子を放出し得るコンジュゲート抗体の不均一な試料をもたらし得る。毒素（すなわち、腫瘍および腫瘍細胞を死滅させる際に潜在的な有用性を有する細胞毒性薬）では、このことは特に望まれ得ない。
一部の態様では、毒素はオーリスタチン；天然生成物ドラスタチン１０（ＭＭＡＤ）の誘導体である。代表的なオーリスタチンには、ＭＭＡＥ（Ｎ−メチルバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロリン−ノルエフェドリン）およびＭＭＡＦ（Ｎ−メチルバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロリン−フェニルアラニン）が包含される。
一部の態様では、抗体は、エフェクター部分と同じ経路内の異なる標的を標的化する。一部の態様では、抗体は、エフェクター部分とは異なる標的を標的化する。
一部の態様では、コンジュゲーションのために使用される抗体のＶＨおよびＶＬは、腫瘍学の分野において有用であり得る。適切な抗体には；癌、特に、非ホジキンスリンパ腫、他にも関節リウマチを治療するために使用されるキメラのＩｇＧ１κ抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（商標））；癌、特に、結腸、頭頸部癌を治療するために使用されるキメラのＩｇＧ１κ抗ＥＧＦ受容体抗体であるセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標））が包含される。
一部の態様では、コンジュゲーションのために使用される抗体は、自己免疫障害および他の免疫学的障害の分野において有用であり得る。適切な抗体には、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬、乾癬性関節炎、および強直性脊椎炎を治療するために使用されるキメラのＩｇＧ１κ抗ＴＮＦα抗体であるインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標））；関節リウマチ、クローン病、乾癬、乾癬性関節炎、若年性特発性関節炎、および強直性脊椎炎を治療するために使用されるヒトのＩｇＧ１κ抗ＴＮＦα抗体であるアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（商標））；多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、若年性特発性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病を治療するために使用されるヒト化ＩｇＧ４κ抗α４インテグリン抗体であるナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ（商標））；アレルギー性喘息を治療するために使用されるヒト化ＩｇＧ１κ抗ＩｇＥ抗体であるオマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ（商標））；滲出型ＡＭＤを治療するために使用されるヒト化ＩｇＧ１κ抗ＶＥＧＦ抗体であるラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標））；ならびに呼吸器多核体ウイルスを包含する感染性疾患を治療するために使用されるヒト化ＩｇＧ１κ抗ＲＳＶ抗体であるパリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ（商標））が包含される。
一部の態様では、本発明の化合物および組成物を使用して、上述の状態を治療することができる。
エフェクター部分
エフェクター部分は、治療薬、タンパク質、ペプチド、核酸、アプタマー、低分子、タンパク質アゴニスト、タンパク質アンタゴニスト、代謝調節物質、ホルモン、毒素、成長因子、もしくは他の調節性タンパク質であってよいか、またはホースラディッシュペルオキシダーゼなどの容易に検出または可視化することができる酵素などの診断薬であってよい。
一部の態様では、エフェクター部分は、タンパク質またはペプチドであってよく、ペプチド連結残基を介してリンカーに接続されていてよい。タンパク質またはペプチドは、アミノ末端キャッピング基Ｒ１およびカルボキシル末端キャッピング基Ｒ２の一方または両方を含んでよい。Ｒ１は、ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）Ｃ６Ｈ５、Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜５Ｍｅ、ジクロロベンゾイル（ＤＣＢ）、ジフルオロベンゾイル（ＤＦＢ）、ピリジニルカルボキシレート（ＰｙＣ）、またはアミド−２−ＰＥＧ、アミノ保護基、脂質脂肪酸基、または炭水化物であってよい。Ｒ２は、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨ（ＣＨ３）、ＮＨＣＨ２ＣＨ３、ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＮＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３、ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＮＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、ＮＨＣ６Ｈ５、ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＮＨＯＣＨ３、ＮＨＯＣＨ２ＣＨ３、カルボキシ保護基、脂質脂肪酸基、または炭水化物であってよい。
タンパク質またはペプチド連結残基は、Ｋ、ＫＳＨ、リシン同族体、Ｄａｐ、Ｄａｂ、Ｏｒｎ、Ｒ、Ｃ、チオール含有残基、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、またはＱであってよい。タンパク質またはペプチドは、Ｎ末端アミノ酸のアミノ末端を介してリンカーに接続させることができる。タンパク質またはペプチドは、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル末端を介してリンカーに接続させることができる。連結残基として機能させるために、アミノ酸側鎖を介する接続か、またはアミノもしくはカルボキシル末端を介する接続かにかかわらず、追加のアミノ酸残基をＮまたはＣ末端に加えることができる。
リンカー
エフェクター部分を有するコンジュゲート、特に、コンジュゲートおよびＭＡＣを調製する方法に関する本発明の態様では、本発明は、エフェクター部分が存在しない状態でリンカーを有するコンジュゲートにも等しく当てはまることは理解されるであろう。そのようなコンジュゲートの有用性の例は、本発明のエフェクター部分−リンカー−ポリペプチドコンジュゲートを調製するために有用に使用することができる中間体としてのものであろう。
本発明のエフェクター部分（低分子、アプタマー、核酸、タンパク質、またはペプチドなど）を抗体またはその抗原結合部分に、リンカーによって共有結合させることができる。リンカーを、ペプチド連結残基の側鎖のアミノ基によってペプチドに共有結合させることができる。これは、リシン残基であってよい。一部の実施形態では、連結残基は、ＣｙｓまたはＫＳＨなどのチオール保有残基であり、リンカーを、連結残基の末端チオール基を介してペプチドに共有結合させる。
リンカーは、直鎖または分枝（コンジュゲーション付加（ＣＡ）１つ当たり１つより多いエフェクター部分へのコンジュゲーションを可能とするために）であってよく、場合によって、１個または複数の炭素環式基または複素環式基を包含してよい。リンカーの長さは、エフェクター部分と抗体との間の直鎖原子の数の点において考えることができ、芳香環などの環式部分は、環の周りの最短経路をとることによって数えられる。一部の実施形態では、リンカーは、５〜１５原子、他の実施形態では１５〜３０原子、なお他の実施形態では３０〜５０原子、なお他の実施形態では５０〜１００原子、なお他の実施形態では１００〜２００原子の直線的伸張を有する。一部の実施形態では、リンカーの長さは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０からなる群から選択される下限と、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、および２００からなる群から選択される上限との範囲である。
他のリンカーの検討事項には、溶解度、親油性、親水性、疎水性、安定性（おおよそ安定的、さらに、計画分解）、剛性、柔軟性、免疫原性、抗体結合のモジュレーション、ミセルまたはリポソームに組み込まれる能力などの、生じた化合物の物理的または薬物動態学的特性に対する作用が包含される。
リンカーは、ペプチジルリンカーであってよい。一部の実施形態では、ペプチジルリンカーは、好ましいエフェクター部分の提示または薬物動態を付与するペプチドリンカーが得られるように、単一アミノ酸残基の繰返し（例えば、ポリグリシン）またはアミノ酸残基の組合せなど、３〜２０アミノ酸長さであってよい。活性化基の存在と最も適合性であろうペプチジルリンカーは、リシンおよびヒスチジン残基を欠いてよい。配列番号７９は、例示的なペプチジルリンカーである。
別法では、リンカーは、非ペプチジルリンカーであってよい。これらの種類のリンカーの典型的な例は、直鎖もしくは分枝鎖炭化水素、または様々な長さのポリエチレングリコールに基づくものであろう。これらに、芳香環または非芳香環、ハロゲン、ケトン、アルデヒド、エステル、スルホニル、ホスファート基などの他の基を組み込んで、溶解度、剛性、等電点に影響を及ぼすことができる。
本発明の一部の態様では、リンカーは、式：−Ｘ１−Ｙ１−Ｚ−を含んでよく；ここで、Ｘ１はエフェクター部分への結合基であり（例えば、ペプチド連結残基を介する）、Ｙ１は、スペーサー領域であり、Ｚは、抗体（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体）上のリシン残基の側鎖への結合部分である。一部の態様では、リンカーは、抗体に結合されていない場合、式Ｘ１Ｙ１Ｚ＊のものであってよく、ここで、Ｚ＊は、抗体にコンジュゲートさせた場合に、脱離基Ｚ＊が抗体のコンジュゲーション部位と反応して、コンジュゲートリンカーＸ１Ｙ１Ｚを形成するような脱離基である。
Ｘ１は、エフェクター部分への（例えば、ペプチド連結残基を介しての）特異的な方向性共有結合的連結戦略が可能であるように選択することができる。一部の態様では、Ｘ１は、ＣＯＯＨ、イソシアナート、イソチオシアナート、アシルアジド、スルホン酸、スルホニルハライド、アルデヒド、ケトン、エポキシド、カルボナート、アリール化試薬、イミドエステル、アミン基、およびマレイミド基からなる群から選択することができる。例えば、ペプチド連結残基が求核性基を含んでいる場合、Ｘ１は、求電子性基であってよく、逆も同様である。例えば、ペプチド連結残基の側鎖がＫ、Ｈ、オルニチン、Ｄａｐ、またはＤａｂなどのアミン基を含んでいるならば、Ｘ１は、ＣＯＯＨ、または他の同様の反応性求電子試薬、例えば、イソシアナート、イソチオシアナート、アシルアジド、スルホン酸もしくはスルホニルハライド、アルデヒドもしくはケトン、エポキシド、カルボナート、アリール化試薬、またはイミドエステルであってよい。ペプチド連結残基がＤまたはＥであるならば、Ｘ１は、アミン基などの求核性基を含んでよい。これらの戦略のいずれも、アミド結合形成戦略によって、Ｘ１基とペプチド連結残基との間に共有結合が形成されることを可能にする。例えば、Ｘ１がＣＯＯＨである場合、これは、ペンタフルオロフェニルエステルとして活性化され得る。この場合、ペプチド連結ペプチド上のアミン基との反応は、アミド結合の形成をもたらす一方で、ペンタフルオロフェノールは脱離基（これはＸ１＊と称され得る）である。
Figure 2015504893
 矢印は、ペプチド連結残基への結合点を示し、平行線は、リンカーのＹ１基への結合点を表す。
Figure 2015504893
 ペプチド連結基が、Ｃ、Ｃの同族体、または他のチオール基含有残基（ＫＳＨなど）である場合、Ｘ１は、Ｘ１基をペプチド連結残基に共有結合的に連結するためのチオール−マレイミド付加反応戦略を可能にするマレイミド基を含んでよい。一部の態様では、Ｘ１は、下式のマレイミドであってよい：
Figure 2015504893
 ［式中、矢印は、ペプチド連結残基への結合点を示し、平行線は、リンカーのＹ１基への結合を表す］。命名が容易であるので、マレイミド基を使用して構築された本明細書に記載のリンカーは、リンカーの構築後に、マレイミド基が一般的にスクシンイミド環に転換されるとしても、マレイミド含有リンカーと記載され、これを示すためにＭＡＬと呼ばれる。
Figure 2015504893
一部の態様では、連結残基はＫＳＨであり、Ｘ１基はマレイミドである。一部の態様では、Ｘ１は、ペンタフルオロフェニルエステルで活性化されたカルボキシル官能基を含んでよく、これは、ペプチド上のリシン側鎖と共にアミドを形成することができる。
Figure 2015504893
一部の態様では、Ｘ１は、チオール基を含んでよく、ペプチド連結残基とＸ１基との間にジスルフィド橋が形成されることが可能となっている。
一部の実施形態では、Ｙ１は、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択される任意の原子を包含する生物学的に適合性の接続鎖であり、１つまたは複数のアミノ酸、ポリマー、またはブロックコポリマーを含んでよい。Ｙ１は、２〜１００原子のリンカーの全体長さが得られるように選択することができる。Ｙ１は、リンカーの全体長さが５〜３０原子であるように選択することができる。Ｙ１は、リンカーの全体長さが１５〜２５原子であるように選択することができる。Ｙ１は、リンカーの全体長さが約１７〜約１９原子であるように選択することができる。
一部の態様では、Ｙ１は、下式：
Figure 2015504893
 ［式中、ｎ＝０〜２０、一部の態様では、１〜１０、一部の態様では、１〜５、一部の態様では、１、一部の態様では、２である］などのアミノアルカン酸であってよい。
一部の態様では、Ｙ１は、下式：
Figure 2015504893
 ［式中、ｎ＝０〜２０、一部の態様では、１〜１０、一部の態様では、１〜５、一部の態様では、１、一部の態様では、２である］などのアルカン二酸であってよい。
一部の態様では、Ｙ１は、下式：
Figure 2015504893
 ［式中、ｎ＝０〜１０、一部の態様では、１〜１０、一部の態様では、１〜５、一部の態様では、１、一部の態様では、２である］などのポリグリシンであってよい。
一部の態様では、Ｙ１、Ｘ１−Ｙ１、Ｙ１−Ｚ、およびＸ１−Ｙ１−Ｚは、
Figure 2015504893
 ［式中、ｍ、ｎ、ｊ、およびｋはそれぞれ独立に、０〜３０である］からなる群から選択することができる。一部の態様では、ｎ＝１〜１０、一部の態様では、ｎ＝１〜５である。一部の態様では、ｎの値の範囲の下限は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０からなる群から選択され、ｎの値の範囲の上限は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０からなる群から選択される。ｎは１であってよい。ｎは２であってよい。ｎは３であってよい。ｎは４であってよい。ｎは５であってよい。ｎは６であってよい。一部の態様では、ｍ＝１〜１０、一部の態様では、ｍ＝１〜５である。一部の態様では、ｍの値の範囲の下限は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０からなる群から選択され、ｍの値の範囲の上限は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０からなる群から選択される。ｍは１であってよい。ｍは２であってよい。ｍは３であってよい。ｍは４であってよい。ｍは５であってよい。ｍは６であってよい。一部の態様では、ｊ＝１〜１０、一部の態様では、ｊ＝１〜５である。一部の態様では、ｊの値の範囲の下限は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０からなる群から選択され、ｊの値の範囲の上限は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０からなる群から選択される。ｊは１であってよい。ｊは２であってよい。ｊは３であってよい。ｊは４であってよい。ｊは５であってよい。ｊは６であってよい。一部の態様では、ｋ＝１〜１０、一部の態様では、ｋ＝１〜５である。一部の態様では、ｋの値の範囲の下限は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０からなる群から選択され、ｋの値の範囲の上限は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０からなる群から選択される。ｋは１であってよい。ｋは２であってよい。ｋは３であってよい。ｋは４であってよい。ｋは５であってよい。ｋは６であってよい。一部の態様では、Ｙ１の全体長さは、２００原子を超えない。一部の態様では、Ｙ１の全体長さは、１５０原子を超えない。一部の態様では、Ｙ１の全体長さは、１００原子を超えない。一部の態様では、Ｙ１の全体長さは、５０原子を超えない。一部の態様では、原子の数におけるＹ１の全体鎖長の範囲は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、および６０からなる群から選択される下限、ならびに５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および１００からなる群から選択される上限を有し得る。一部の態様では、Ｘ１Ｙ１Ｚリンカーは、上記のＹ１基と同一であってよい。一部の態様では、波線は、Ｘ１基に接続している。一部の態様では、平行線は、Ｘ１基に接続している。一部の態様では、波線は、Ｚ基に接続している。一部の態様では、平行線は、Ｚ基に接続している。一部の態様では、波線はＣＬκ−Ｋ８０の側鎖に接続している。一部の態様では、平行線は、ＣＬκ−Ｋ８０の側鎖に接続している。一部の態様では、波線は、エフェクター部分に接続している。一部の態様では、平行線は、エフェクター部分に接続している。一部の態様では、波線または平行線の一方は、リンカー（Φ）の切断部分への結合点である。
脱離基
Ｚ＊は、抗体上のリシン側鎖に対する特異的な方向性共有結合的連結戦略が可能であるように選択することができる。例えば、いくつかの可能なアミド結合形成戦略のうちの１つを使用して、表面リシン側鎖のε−アミノと反応させるために、Ｚは、ＣＯＯＨまたは他の同様の反応性求電子試薬であってよい。
一部の態様では、Ｚ＊を、活性なエステルを形成するために使用することができる。活性なエステルは、アミンに接続し、したがって、抗体のリシン側鎖のε−アミノにコンジュゲートすることができる。活性なエステルの形成を可能にするＺカルボキシル官能基は、Ｙ基の末端に存在するはずである。活性なエステルのアルコールまたはフェノール官能基は、コンジュゲーション反応中に脱離基Ｚ＊として作用して、アミドの生成を介しての抗体上のリシン側鎖との接続を可能にする。
一部の実施形態では、Ｚ＊基は、下式：
Figure 2015504893
 ［式中、Ｒ’は、脂肪族または芳香族基である］の構造を含む。
一部の実施形態では、Ｚ＊基は、下式：
Figure 2015504893
 ［式中、Ｒ’＝単独か、または組合せでのＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチルのうちのいずれかであり、１〜５個の量で存在してよい］の基である。一部の実施形態では、Ｒ‘はハロゲンであってよく、４または５個のハロゲン原子が存在してよい。一部の実施形態では、４個のＲ１原子が存在してよい。一部の実施形態では、５個のＲ‘原子が存在してよい。一部の実施形態では、Ｚ＊は、テトラフルオロフェニルであってよい。一部の実施形態では、Ｚ＊は、下式：
Figure 2015504893
 ［式中、平行線は、リンカーのＹ１部分への結合点を表す］を含んでよい。
一部の実施形態では、Ｚ＊は、下式：
Figure 2015504893
 ［式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７はそれぞれ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７のうちの２個以下がＨであり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７のうちの１個がＣＲ８Ｒ９Ｒ１０であるように、Ｆ、ＣＬ、Ｈ、および式ＣＲ８Ｒ９Ｒ１０からなる群から独立に選択され、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０はそれぞれ、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０のうちの１個以下がＨであるように、Ｆ、Ｃｌ、およびＨからなる群から独立に選択され、平行線は、リンカーのＹ１部分への結合点を表す］を含んでよい。一部の態様では、基ＣＲ８Ｒ９Ｒ１０は、Ｒ４、Ｒ５、またはＲ６のうちの１つに位置する。一部の態様では、基ＣＲ８Ｒ９Ｒ１０は、Ｒ５に位置する。
一部の態様では、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７はそれぞれ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７のうちの１個以下がＨであり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７のうちの１個がＣＲ８Ｒ９Ｒ１０であるように、Ｆ、Ｃｌ、Ｈ、および式ＣＲ８Ｒ９Ｒ１０からなる群から独立に選択される。一部の態様では、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７はそれぞれ、Ｆ、Ｃｌ、および式ＣＲ８Ｒ９Ｒ１０からなる群から独立に選択され、１個はＣＲ８Ｒ９Ｒ１０である。
一部の態様では、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、およびＲ７はそれぞれ、Ｆである。一部の態様では、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０はそれぞれ、ＦおよびＣｌからなる群から独立に選択される。一部の態様では、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０はそれぞれ、Ｆである。
一部の実施形態では、Ｚ＊は、下式：
Figure 2015504893
 ［式中、平行線は、リンカーのＹ１部分への結合点を表す］を含んでよい。
一部の態様では、Ｚ＊基は、下式：
Figure 2015504893
 ［式中、Ｒ’＝単独か、または組合せでのＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチルのうちのいずれかであり、ｈ＝１、２、３、４、または５である］の基である。一部の実施形態では、Ｒ１はハロゲンであってよい。一部の実施形態では、Ｒ１は、ＦまたはＣｌであり、ｈ＝４または５である。一部の実施形態では、Ｒ１は、ＦまたはＣｌであり、ｈ＝５である。一部の実施形態では、Ｒ１は、Ｆであり、ｈ＝２、３、４、または５である。一部の実施形態では、Ｒ１はＦであり、ｈ＝３、４、または５である。一部の実施形態では、Ｒ１はＦであり、ｈ＝４または５である。一部の実施形態では、Ｒ１は、Ｆであり、ｈ＝５である。一部の態様では、Ｚ＊は、
Figure 2015504893
 からなる群から選択され得る。
一部の態様では、Ｚ＊は、
Figure 2015504893
 からなる群から選択され得る。
一部の態様では、Ｚ＊は、下式
Figure 2015504893
 からなる群から選択され得る。
一部の態様では、Ｚ＊は、
Figure 2015504893
 からなる群から選択され得る。
このような活性なエステルでは、脱離基はＺ＊であり、Ｚ基自体は、Ｙ１基に結合されているカルボニルである。抗体と反応した場合、Ｚ＊基は、以下に示すとおり、アミドを形成する。
Figure 2015504893
一部の実施形態では、Ｚは、
Figure 2015504893
 である。
一部の実施形態では、Ｚ＊基は、
Figure 2015504893
 ［式中、Ｒ＝脂肪族基または置換芳香族であり、
Figure 2015504893
 からなる群から選択され得る］などのスクアリン酸エステルを含む。
一部の実施形態では、Ｚ基は、マレイミド基を含む：
Figure 2015504893
一部の態様では、Ｘ１＊Ｙ１Ｚ＊リンカーは、構造：
Figure 2015504893
 ［式中、ｎ＝１〜１２］のマレイミド−ＰＥＧ−ＰＦＰエステルを含む。一部の態様では、ｎ＝１〜５である。一部の態様では、ｎ＝２である。一部の態様では、ｎ＝１である。
一部の態様では、Ｘ１＊Ｙ１Ｚ＊リンカーは、
Figure 2015504893
 ［式中、ｍ、ｎ、およびｊはそれぞれ独立に、０〜３０であり、Ｒ１はＦであり、ｈ＝２、３、４、または５である］からなる群から選択される構造を含む。一部の態様では、ｎ＝１〜１０、一部の態様では、ｎ＝１〜５である。一部の態様では、ｎの値の範囲の下限は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０からなる群から選択され、ｎの値の範囲の上限は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０からなる群から選択される。ｎは１であってよい。ｎは２であってよい。ｎは３であってよい。ｎは４であってよい。ｎは５であってよい。ｎは６であってよい。一部の態様では、ｍ＝１〜１０、一部の態様では、ｍ＝１〜５である。一部の態様では、ｍの値の範囲の下限は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０からなる群から選択され、ｍの値の範囲の上限は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０からなる群から選択される。ｍは１であってよい。ｍは２であってよい。ｍは３であってよい。ｍは４であってよい。ｍは５であってよい。ｍは６であってよい。一部の態様では、ｊ＝１〜１０、一部の態様では、ｊ＝１〜５である。一部の態様では、ｊの値の範囲の下限は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０からなる群から選択され、ｊの値の範囲の上限は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０からなる群から選択される。ｊは１であってよい。ｊは２であってよい。ｊは３であってよい。ｊは４であってよい。ｊは５であってよい。ｊは６であってよい。一部の態様では、ｋ＝１〜１０、一部の態様では、ｋ＝１〜５である。一部の態様では、ｋの値の範囲の下限は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０からなる群から選択され、ｋの値の範囲の上限は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０からなる群から選択される。ｋは１であってよい。ｋは２であってよい。ｋは３であってよい。ｋは４であってよい。ｋは５であってよい。ｋは６であってよい。一部の態様では、Ｙ１の全体長さは、２００原子を超えない。一部の態様では、Ｙ１の全体長さは、１５０原子を超えない。一部の態様では、Ｙ１の全体長さは、１００原子を超えない。一部の態様では、Ｙ１の全体長さは、５０原子を超えない。一部の態様では、原子の数におけるＹ１の全体鎖長の範囲は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、および６０からなる群から選択される下限、ならびに５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および１００からなる群から選択される上限を有し得る。
一部の態様では、ＭＡＣは、下式：
Figure 2015504893
 のＸ１Ｙ１Ｚリンカーを含む。
一部の態様では、Ｘ１＊Ｙ１Ｚ＊リンカーは、下式：
Figure 2015504893
 ［式中、ｎ＝１〜２５］のＰＥＧ−ビス−ペンタフルオロフェニルエステルを含む。一部の態様では、ｎ＝１〜２０である。一部の態様では、ｎ＝１〜１０である。一部の態様では、ｎ＝４である。一部の態様では、ｎ＝３である。一部の態様では、ｎ＝２である。一部の態様では、ｎ＝１である。
一部の態様では、ＭＡＣは、抗体１個当たり２個のコンジュゲートされたペプチドを含む。一部の態様では、１個のペプチドが、抗体またはその抗原結合断片の２個のＣＬκ−Ｋ８０残基のそれぞれにコンジュゲートされている。
一部の態様では、本発明のポリペプチドは、
Figure 2015504893
 ［式中、−ＫＨ−は、配列番号９８のＫ５の側鎖への共有結合的連結部であり、エフェクター部分−ＬＲは、エフェクター部分への共有結合的連結部であり、ｍ、ｎ、およびｊはそれぞれ独立に、０〜３０である］からなる群から選択される式を含む。一部の態様では、ｎ＝１〜１０、一部の態様では、ｎ＝１〜５である。一部の態様では、ｎの値の範囲の下限は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０からなる群から選択され、ｎの値の範囲の上限は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０からなる群から選択される。ｎは１であってよい。ｎは２であってよい。ｎは３であってよい。ｎは４であってよい。ｎは５であってよい。ｎは６であってよい。一部の態様では、ｍ＝１〜１０、一部の態様では、ｍ＝１〜５である。一部の態様では、ｍの値の範囲の下限は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０からなる群から選択され、ｍの値の範囲の上限は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０からなる群から選択される。ｍは１であってよい。ｍは２であってよい。ｍは３であってよい。ｍは４であってよい。ｍは５であってよい。ｍは６であってよい。一部の態様では、ｊ＝１〜１０、一部の態様では、ｊ＝１〜５である。一部の態様では、ｊの値の範囲の下限は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０からなる群から選択され、ｊの値の範囲の上限は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０からなる群から選択される。ｊは１であってよい。ｊは２であってよい。ｊは３であってよい。ｊは４であってよい。ｊは５であってよい。ｊは６であってよい。一部の態様では、Ｙ１の全体長さは、２００原子を超えない。一部の態様では、Ｙ１の全体長さは、１５０原子を超えない。一部の態様では、Ｙ１の全体長さは、１００原子を超えない。一部の態様では、Ｙ１の全体長さは、５０原子を超えない。一部の態様では、原子の数におけるＹ１の全体鎖長の範囲は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、および６０からなる群から選択される下限、ならびに５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および１００からなる群から選択される上限を有し得る。
一部の態様では、リンカーは、
Figure 2015504893
 からなる群から選択される。
切断可能なリンカー
一部の態様では、本発明は、「切断不可能な」リンカーを含む本明細書に記載のとおりのＭＡＣを提供する。他の態様では、本発明は、「切断可能な」リンカーを含むＭＡＣを提供する。用語「切断可能なリンカー」は、本明細書では、所望の位置で積荷を放出するように、細胞内もしくは細胞外の酵素によってか、またはｐＨもしくはレドックス環境の変化を受けると分解するように設計されている、迅速に切断されるリンカーを記載するために使用される。例えば、切断可能なリンカーは、血漿中、血液中、または血清中では優先的に安定的であり得、細胞内環境では安定性が劣り得る。
切断可能な部分（Φ）を、リンカーのＹ１部分（または、リンカーが、触媒抗体結合部位のためのものである場合には、Ｐ１部分）に付加することによって、切断可能なリンカーを形成することができる。したがって、リンカーは、式Ｘ１−Φ−Ｙ１−Ｚ、Ｘ１−Φ−Ｙ１−Ｚ＊およびＰ１−Φ−Ｑ１−Ｗ１となるであろう。
リンカーの切断可能な部分の代表的な例は、カテプシンＢなどの細胞内プロテアーゼによって切断されるバリン−シトルリンｐ−アミノベンジルカルバマート（ＶｉｔＣｉｔＡＢＣ）である。
Figure 2015504893
 ［式中、波線は典型的には、リンカーのＹ１（またはＱ１）部分への結合点を示し、平行線は、リンカーのＸ１（またはＰ１）部分への、またはさらにはエフェクター部分自体への結合点を表す］。一部の態様ではもちろん、波線は、Ｘ１またはＰ１リンカー部分（またはエフェクター部分）への結合点を示してよく、平行線は、リンカーのＹ１またはＱ１部分への結合点を示してよい。
したがって、一部の態様では、本発明は、下式：
Figure 2015504893
 ［式中、ｍ、ｎ、およびｊはそれぞれ独立に、０〜３０であり、Ｒ１はＦであり、ｈ＝２、３、４、または５である］のリンカーを提供する。一部の態様では、ｎ＝１〜１０、一部の態様では、ｎ＝１〜５である。一部の態様では、ｎの値の範囲の下限は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０からなる群から選択され、ｎの値の範囲の上限は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０からなる群から選択される。ｎは１であってよい。ｎは２であってよい。ｎは３であってよい。ｎは４であってよい。ｎは５であってよい。ｎは６であってよい。一部の態様では、ｍ＝１〜１０、一部の態様では、ｍ＝１〜５である。一部の態様では、ｍの値の範囲の下限は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０からなる群から選択され、ｍの値の範囲の上限は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０からなる群から選択される。ｍは１であってよい。ｍは２であってよい。ｍは３であってよい。ｍは４であってよい。ｍは５であってよい。ｍは６であってよい。一部の態様では、ｊ＝１〜１０、一部の態様では、ｊ＝１〜５である。一部の態様では、ｊの値の範囲の下限は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０からなる群から選択され、ｊの値の範囲の上限は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０からなる群から選択される。ｊは１であってよい。ｊは２であってよい。ｊは３であってよい。ｊは４であってよい。ｊは５であってよい。ｊは６であってよい。一部の態様では、ｋ＝１〜１０、一部の態様では、ｋ＝１〜５である。一部の態様では、ｋの値の範囲の下限は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０からなる群から選択され、ｋの値の範囲の上限は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０からなる群から選択される。ｋは１であってよい。ｋは２であってよい。ｋは３であってよい。ｋは４であってよい。ｋは５であってよい。ｋは６であってよい。一部の態様では、Ｙ１の全体長さは、２００原子を超えない。一部の態様では、Ｙ１の全体長さは、１５０原子を超えない。一部の態様では、Ｙ１の全体長さは、１００原子を超えない。一部の態様では、Ｙ１の全体長さは、５０原子を超えない。一部の態様では、原子の数におけるＹ１の全体鎖長の範囲は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、および６０からなる群から選択される下限、ならびに５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および１００からなる群から選択される上限を有し得る。
オーリスタチンをベースとするペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）の使用
適切なリンカー技術と一緒に使用する場合、本発明の標的化コンジュゲーション技術に関連して、オーリスタチンをベースとするエフェクター部分も有用である。具体的には、有用なペイロードには、薬学的に許容できる塩、水和物、および遊離塩基をすべて包含するＰＣＴ／ＩＢ２０１２／０５６２２４に開示されているものが包含される。
したがって、次のエフェクター部分およびリンカー、またはその薬学的に許容できる塩もしくは溶媒和物を、本発明の態様で使用することができる：
Figure 2015504893
 ［式中、出現する毎に独立に、
Ｗ２は、
Figure 2015504893
 であり、
Ｒ１１は、
Figure 2015504893
 であり、
Ｙ２は、−Ｃ２〜Ｃ２０アルキレン−、−Ｃ２〜Ｃ２０ヘテロアルキレン−；−Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ−、−アリーレン−、−Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ−、−Ｃｌ〜Ｃ１０アルキレン−アリーレン−、−アリーレン−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−、−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−（Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ）−、−（Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ）−Ｃｌ〜Ｃ１０アルキレン−、−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−（Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ）−または−（Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ）−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−であり、
Ｚ２は、
Figure 2015504893
 であり、
Ｒ１２は、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、またはＣ１〜Ｃ８ハロアルキルであり、
Ｒ１３ＡおよびＲ１３Ｂは、次の（ｉ）または（ｉｉ）のいずれかであり：
（ｉ）Ｒ１３Ａは、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８カルボシクリル、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアラルキル、アラルキル、またはハロゲンであり、かつ
Ｒ１３Ｂは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８カルボシクリル、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアラルキルもしくはアラルキル、またはハロゲンであるか、または
（ｉｉ）Ｒ１３ＡおよびＲ１３Ｂは一緒になって、Ｃ２〜Ｃ８アルキレンまたはＣ１〜Ｃ８ヘテロアルキレンであり、
Ｒ１４ＡおよびＲ１４Ｂは、次の（ｉ）または（ｉｉ）のいずれかであり：
（ｉ）Ｒ１４Ａは、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８カルボシクリル、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアラルキル、またはアラルキルであり、かつ
Ｒ１４Ｂは、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８カルボシクリル、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアラルキル、またはアラルキルであるか、または
（ｉｉ）Ｒ１４ＡおよびＲ１４Ｂは一緒になって、Ｃ２〜Ｃ８アルキレンまたはＣ１〜Ｃ８ヘテロアルキレンであり、
Ｒ１５は、
−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’ −Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＨ、ハロゲン、−Ｎ３、−Ｎ（Ｒ’）２、−ＣＮ、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＮＨＣＯＮＨ２、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’および−ＳＲ’（ここで、各Ｒ’は、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、および非置換のアリールからなる群から独立に選択されるか、または２個のＲ’は、それらが結合している窒素と一緒に、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリルを形成することができる）からなる群から独立に選択される１、２、３、４または５個の基で置換されていてもよい
Figure 2015504893
 、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル、Ｃ３〜Ｃ８カルボシクリルおよびＣ６〜Ｃ１４アリールであるか、または
Ｒ１５は、
Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＨ、ハロゲン、−Ｎ３、−Ｎ（Ｒ’）２、−ＣＮ、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＮＨＣＯＮＨ２、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’、−ＳＲ’およびアリーレン−Ｒ’（ここで、各Ｒ’は、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８ヘテロシクリル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクリル、およびアリールからなる群から独立に選択されるか、または２個のＲ’は、それらが結合している窒素と一緒に、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリルを形成することができる）からなる群から独立に選択される１、２、３、４、または５個の基で置換されていてもよい
Figure 2015504893
 であり、
Ｒ１６は、水素、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、−Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、または−Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキルであり、
Ｒ２２は、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル、またはＣ６〜Ｃ１４アリールであり、
Ｒ２３は、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリルであり、
Ｒ１７は、出現する毎に、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ、およびＢｒからなる群から独立に選択され、
Ｒ２０は、−アリール、−Ｃｌ−Ｃｌ０アルキレン−アリールであり、その際、アリールを含むＲ１０上のアリールは、［Ｒ１７］ｈで置換されており、
ｈは、５であり、
Ｘは、ＯまたはＳであるが、
ただし、Ｒ１３Ａが水素である場合、ＸはＳであることを条件とする］。
一部の態様では、エフェクター部分は、表７３から選択され得る。一部の態様では、エフェクター部分は毒素＃５４である。一部の態様では、エフェクター部分は毒素＃１１５である。一部の態様では、エフェクター部分は毒素＃６９である。
一部の態様では、本発明のリンカーにコンジュゲートされている場合のエフェクター部分は、下式：
Figure 2015504893
 からなる群から選択される式を含む。
本発明に関連して有用な、リンカーにコンジュゲートされているエフェクター部分には、ＰＣＴ／ＩＢ２０１２／０５６２２４に開示されているものなどのオーリスタチンをベースとする毒素−リンカーが包含される。一部の態様では、本発明の毒素−リンカーは、
Figure 2015504893
 からなる群から選択され得る。
コンジュゲーション方法
一部の態様では、本発明は、抗体または抗原結合部分を含む多機能性抗体コンジュゲート（ＭＡＣ）を調製する方法を提供し、抗体は、配列番号９８のＫ５（または配列番号９８の範囲内に該当する本明細書に開示されている配列番号）の側鎖に、または抗体定常ドメイン上の残基Ｋ（Ｋの位置は、配列番号６の残基７７またはＫａｂａｔナンバリングによる定常軽鎖ドメインの残基１８５と一致する）の側鎖に結合されているリンカーを介して、少なくとも１個のエフェクター部分に共有結合的にコンジュゲートされており、前記方法は、エフェクター部分を式：
Figure 2015504893
 ［式中、Ｒ１は、単独か、または組合せでのＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチルのいずれかであり、ｈ＝１、２、３、４、または５である］の脱離基Ｚ＊で終結するリンカーに共有結合させるステップと、こうして形成されたエフェクター部分−リンカー−脱離基複合体を抗体と、約３．５：１から約４．５：１のエフェクター部分：抗体のモル比で反応させるステップとを含む。一部の態様では、このモル比は、約３．７：１から約４．３：１である。一部の実施形態では、Ｒ１はハロゲンであってよい。一部の実施形態では、Ｒ１は、ＦまたはＣｌであり、ｈ＝４または５である。一部の実施形態では、Ｒ１は、ＦまたはＣｌであり、ｈ＝５である。一部の実施形態では、Ｒ１はＦであり、ｈ＝２、３、４、または５である。一部の実施形態では、Ｒ１はＦであり、ｈ＝３、４、または５である。一部の実施形態では、Ｒ１はＦであり、ｈ＝４または５である。一部の実施形態では、Ｒ１はＦであり、ｈ＝５である。一部の態様では、Ｚ＊は、下式：
Figure 2015504893
 からなる群から選択され得る。Ｒ１は、３〜５の量で存在し得る。３個のＲ１基が存在し得る。Ｒ１は、４〜５の量で存在し得る。４個のＲ１基が存在し得る。５個のＲ１基が存在し得る。Ｒ１はフッ素であってよい。Ｒ１は塩素であってよい。Ｒ１は臭素であってよい。脱離基は、下式：
Figure 2015504893
 を含み得る。
一部の態様では、本発明は、追加の標的を結合する少なくとも１個のエフェクター部分（ペプチド、低分子、アプタマー、核酸分子、またはタンパク質など）に共有結合的に連結されている抗体またはその断片を含むＭＡＣを生産する方法であって、エフェクター部分が、抗体の表面リシン残基のε−アミノと反応し得るＰＦＰ脱離基を有するリンカーを含むことを特徴とする方法を提供する。一部の態様では、本発明は、エフェクター部分（ペプチドなど）を、配列番号９８を含む本発明のＣＬドメインにコンジュゲートさせるための方法を提供し、この方法は、エフェクター部分を、下式：
Figure 2015504893
 ［式中、Ｒ１は、単独か、または組合せでのＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチルのいずれかであり、１〜５の量で存在し得る］
の脱離基を含むリンカーとコンジュゲートさせるステップと、その脱離基を配列番号９８のＫ５の側鎖と反応させるステップとを含む。
一部の態様では、当該方法は、抗体またはその抗原結合部分を、ＰＦＰ脱離基を含むリンカーに共有結合されているエフェクター部分と組み合わせることを含む。
一部の態様では、エフェクター部分：抗体のモル比は、約２．５から約４．６：１である。本発明の一部の態様では、このモル比は、約３．７：１および約４．３：１である。本発明の一部の態様では、エフェクター部分：抗体のモル比は、約４：１である。一部の態様では、このモル比は、約２：１から約７：１である。一部の態様では、このモル比は、約３：１から約６：１である。一部の態様では、このモル比は、約３：１から約７：１である。一部の態様では、このモル比は、約３：１から約５：１である。
抗体１個当たり１．５未満のコンジュゲーションを有することが望ましい本発明の態様では（単一のエフェクター部分が必要とされる場合など）、このモル比は、約１：１から約６：１であってよく、ここで、緩衝液は、ＨＥＰＥＳを少なくとも０．０２Ｍの濃度で含む。ＨＥＰＥＳの濃度は、約０．１Ｍ〜約１Ｍであってよい。ＨＥＰＥＳの濃度は、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍであってよい。抗体１個当たり１．５未満のコンジュゲーションを有することが望ましい本発明の態様では（単一のエフェクター部分が必要とされる場合など）、このモル比は、約１：１から約３：１であってよい。
一部の態様では、好ましいモル比は、約１、約１．２、約１．４、約１．５、約１．６、約１．８、約２、約２．２、約２．４、約２．５、約２．６、約２．８、約３、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５、約５．２、約５．４、約５．５、約５．６、約５．８、約６、約６．２、約６．４、約６．５、約６．６、約６．８、約７、約７．３、約７．５、約７．７、約８、約８．５、約９、約９．５、および約１５対１からなる群から選択される下限と、約１．５、約１．６、約１．８、約２、約２．２、約２．４、約２．５、約２．６、約２．８、約３、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５、約５．２、約５．４、約５．５、約５．６、約５．８、約６、約６．２、約６．４、約６．５、約６．６、約６．８、約７、約７．３、約７．５、約７．７、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０、および約１５対１からなる群から選択される上限とを有する範囲である。
一部の態様では、本発明は、エフェクター部分およびタンパク質を少なくとも約３０分間互いにコンジュゲートさせることをさらに含む。一部の態様では、この継続時間は少なくとも約６０分である。一部の態様では、この継続時間は少なくとも約２時間である。一部の態様では、本発明は、エフェクター部分および抗体を約４℃〜約４０℃でコンジュゲートさせることをさらに含む。一部の態様では、本発明は、エフェクター部分および抗体を約１０℃〜約３０℃でコンジュゲートさせることをさらに含む。一部の態様では、本発明は、エフェクター部分および抗体を約１５℃〜約３０℃でコンジュゲートさせることをさらに含む。一部の態様では、反応を約１８℃〜約２５℃で行う。一部の態様では、反応を約２２℃で行う。一部の態様では、反応をほぼ室温で行う。
一部の態様では、コンジュゲーション反応をｐＨ約６．５〜ｐＨ約８．０で行う。一部の態様では、コンジュゲーション反応をｐＨ約６．７５〜ｐＨ約８．０で行う。一部の態様では、コンジュゲーション反応をｐＨ約７．７で行う。一部の態様では、コンジュゲーション反応をｐＨ約７で行う。一部の態様では、コンジュゲーション反応をｐＨ約７．２で行う。一部の態様では、コンジュゲーション反応をｐＨ約７．５で行う。一部の態様では、コンジュゲーション反応を、その下限が５．５、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、および８からなる群から選択され、その上限が６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．５、および９からなる群から選択されるｐＨ値の範囲の間で行う。
一部の態様では、ｐＨは６．５未満であってよい；これは特に、抗体１個当たり約１．５未満のコンジュゲーションを必要とする用途において特に有用である。一部の態様では、ｐＨは、約５．５〜約６．５である。
一部の態様では、塩濃度は、約０．２Ｍ未満であってよい。塩は、ハロゲン化物塩（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）であってよく、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｂｅ、Ｍｇ、Ｃａなどの金属を含んでよい。塩は、ＮａＣｌであってよい。塩は、ＫＣｌであってよい。約０．１Ｍ超の塩濃度を、抗体１個当たりのコンジュゲーションの率および／または数を制限するために使用することができる。塩濃度は、約０〜約０．１Ｍであってよい。塩濃度は、約０〜約０．５Ｍであってよい。塩濃度は、約０〜約０．３Ｍであってよい。
一部の態様では、本発明の方法は、抗体またはその抗原結合部分をｐＨ約５．５の製剤緩衝液中で製剤化することを含む。製剤緩衝液は、酢酸ナトリウムおよびトレハロース緩衝液であってよい。この緩衝液は、いずれの第一級アミンも含有しないという利点を有し、それ自体がｐＨ調節のために十分に役立つ。当該抗体は、約１５〜約２５ｍｇ．ｍｌ−１の量で存在し得る。一部の態様では、抗体は、２０ｍｇ．ｍｌ−１の量で存在し得る。
製剤緩衝液のｐＨを、ｐＨ約７．２〜ｐＨ約８．０に調整することができる。一部の実施形態では、製剤緩衝液を、ｐＨ７．７に調整することができる。製剤緩衝液のｐＨを、リン酸緩衝液で調整することができる。リン酸緩衝液は、約４０ｍＭ〜約８０ｍＭの濃度であってよい。リン酸緩衝液は、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度であってよい。
一部の態様では、エフェクター部分／リンカーおよび脱離基Ｚ＊とのコンジュゲーション反応中の抗体の濃度は、範囲の下限が、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約３０、および約４０ｍｇ．ｍｌ−１から選択され、範囲の上限が、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１５０、約２００、約５００ｍｇ．ｍｌ−１からなる群から選択される範囲であってよい。
エフェクター部分は、少なくとも約２ｍｇ．ｍｌ−１の濃度で再構成することができる。エフェクター部分は、使用する前に希釈されたプロピレングリコール中で、約５〜約２０ｍｇ．ｍｌ−１の濃度で再構成することができ、一部の実施形態では、１０ｍｇ．ｍｌ−１の濃度であってよい。
コンジュゲーション反応は、抗体またはその抗原結合部分およびエフェクター部分を、抗体１モルに対してエフェクター部分４モルのモル比で組合せることによって行い、約１８℃〜約２５℃で約２時間〜約２４時間インキュベートすることができる。一部の実施形態では、抗体とエフェクター部分との間のコンジュゲーション反応は、室温で２時間である。一部の実施形態では、コンジュゲーション反応は、少なくとも約２時間である。一部の実施形態では、コンジュゲーション反応は、少なくとも約３０分間である。
反応物をクエンチし、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約６．０に調整することができる。一部の実施形態では、クエンチした反応物を、ｐＨ５．５に調整することができる。これは、コハク酸塩およびグリシン緩衝液を、例えばｐＨ約４．０で使用して達成することができる。この緩衝液は、ＴＲＩＳまたは他のアミノ酸緩衝液などの他のより一般的な緩衝液を上回る利点を有する。コハク酸塩は、コンジュゲート分子に対してストレス性であり得る透析濾過中の凝集および沈殿の制限を援助し、グリシンは追加の第一級アミンを含有する。
反応物を濃縮することができ、未反応のエフェクター部分、関連する種（水溶媒との反応によってリンカーが加水分解された場合のペプチドなど）および反応混合物の他の未反応成分（ＰＦＰなど）を、例えば５０ｋＤａ膜またはサイズ排除クロマトグラフィーを使用する透析濾過によって、ｐＨ５．５、３０ｍｇ．ｍｌ−１でコハク酸塩、グリシン、塩化ナトリウム、およびトレハロース緩衝液に除去することができる。
一部の態様では、この方法は、エフェクター部分をＣＬκ−Ｋ８０にコンジュゲートさせることを含み得る。一部の態様では、本発明は、エフェクター部分をＩｇドメインにコンジュゲートさせることを含み、これは、βストランドＥとＦとの間のＥＦ接続鎖ループ上に配列番号９８を含むようにＣＬλを変異させることと、エフェクター部分に、本明細書で定義したとおりの脱離基Ｚ＊を含むリンカーを結合させることと、前記エフェクター部分−リンカー−脱離基複合体を配列番号９８のＫ５の側鎖と反応させることとを含む。
本発明の医薬組成物
本発明は、ＭＡＣおよび薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容できる担体」には、生理学的に適合性のあらゆるすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張性の吸収遅延剤などが包含される。薬学的に許容できる担体の例には、水、生理食塩水、リン酸緩衝溶液、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうちの１種または複数、さらにはこれらの組合せが包含され、等張化剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムが組成物中に包含され得る。抗体もしくは抗体部分の貯蔵寿命もしくは有効性を高める湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤、または緩衝液などの湿潤物質あるいは少量の補助物質などの薬学的に許容できる物質。
本発明の組成物は、様々な形態であってよい。これらには例えば、液体液剤（例えば、注射用および注入用液剤）、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、散剤、リポソーム、および坐剤などの液体、半固体、および固体剤形が包含される。好ましい形態は、意図されている投与様式および治療適用に左右される。典型的な好ましい組成物は、一般的に抗体でヒトを受動免疫化するために使用されるものと同様の組成物などの注射用または注入用液剤の形態である。好ましい投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい実施形態では、抗体を、静脈内点滴または注射によって投与する。他の好ましい実施形態では、抗体を、筋肉内または皮下注射によって投与する。
医薬組成物は、抗腫瘍薬または画像診断薬などの別の成分をさらに含んでよい。本発明の別の態様は、本発明のＭＡＣおよびこれらの抗体を含む医薬組成物を含むキットを提供する。キットは、ＭＡＣまたは医薬組成物に加えて、診断薬または治療薬を包含することができる。キットは、診断法または治療法において使用するための説明書を包含することもできる。一部の実施形態では、キットは、抗体またはその医薬組成物および診断薬を包含する。他の実施形態では、キットは、抗体またはその医薬組成物および１種または複数の追加の抗新生物薬、抗腫瘍薬、または化学療法薬などの治療薬を包含する。
これらの薬剤および本発明の化合物を、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液などの薬学的に許容できるビヒクルと組み合わせることができる。特定の投与計画、すなわち、用量、タイミング、および頻度は、特定の個体およびその個体の病歴に左右されるはずである。
許容できる担体、添加剤、または安定剤は、使用される投薬量および濃度において受容者にとって非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；塩化ナトリウムなどの塩；アスコルビン酸およびメチオニンを包含する抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、またはＩｇなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを包含する他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含み得る。
本発明のリポソーム含有化合物は、米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号中に記載されている方法などの当技術分野において知られている方法によって調製される。拡張された循環時間を伴うリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＤ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームを、規定の空孔サイズのフィルターを介して押し出して、所望の直径を持つリポソームを得る。
活性成分を、例えば、コアセルベーション技術もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロ乳剤、ナノ粒子、およびナノカプセル）中に、またはマクロ乳剤中に封入することもできる。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に開示されている。
持続放出製剤を調製することができる。持続放出製剤の適切な例には、抗体を含有する固体の疎水性ポリマーの半浸透性マトリックスが包含され、このマトリックスは、成形された物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸および７エチル−Ｌ−グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドからなる注射用マイクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、イソ酪酸酢酸スクロース、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が包含される。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために使用される製剤は、滅菌でなければならない。これは、例えば、滅菌濾過膜での濾過によって容易に達成される。本発明の治療用化合物を一般的に、滅菌アクセスポートを有するコンテナ、例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアル内に入れる。
適切な乳剤は、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（商標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ（商標）、およびＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ（商標）などの市販の脂肪乳剤を使用して調製することができる。活性成分を、事前混合された乳剤組成物中に溶解させるか、または別法では、これを油（例えば、ダイズ油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油、またはアーモンド油）およびリン脂質（例えば、卵リン脂質、ダイズリン脂質、または大豆レシチン）と水との混合によって形成された乳剤中に溶解させることができるか、いずれでもよい。乳剤の等張性を調整するために、他の成分、例えばグリセロールまたはグルコースを加えることができることは分かるであろう。適切な乳剤は典型的には、２０％まで、例えば５〜２０％の油を含有するはずである。脂肪乳剤は、０．１〜１．０μｍの間、特に０．１〜０．５μｍの脂肪液滴を含むことができ、５．５〜８．０の範囲のｐＨを有する。
乳剤組成物は、本発明の化合物をＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）またはその成分（ダイズ油、卵リン脂質、グリセロール、および水）と混合することによって調製されたものであってよい。
吸入または吹送のための組成物には、薬学的に許容できる水性もしくは有機溶媒、またはこれらの混合物中の溶液および懸濁液、ならびに粉末が包含される。液体または固体の組成物は、上記で提示したとおりの適切な薬学的に許容できる添加剤を含有し得る。一部の実施形態では、組成物を、局所または全身作用のために、経口あるいは経鼻呼吸経路によって投与する。好ましい薬学的に許容できる滅菌溶媒中の組成物を、ガスの使用によって噴霧することができる。噴霧された溶液を、噴霧デバイスから直接呼吸することができるか、または噴霧デバイスを、フェイスマスク、テント、または間欠的正圧呼吸器に取り付けることができる。溶液、懸濁液、または粉末組成物を、好ましくは経口または経鼻で、製剤を適切な手法で送達するデバイスから投与することができる。
本発明の化合物および組成物は、関連する適応症について確立された治療と一緒に使用することができる。例には、血管新生障害、詳細には特に癌を治療するための５−フルオロウラシル、イリノテカン、オキサリプラチン、セツキシマブ、スニチニブ、およびリツキシマブが包含される。他の例には、ラニビズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、およびパリビズマブが包含される。
本発明の治療方法
本発明は、治療方法も提供する。治療方法は、本発明の化合物または組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
本発明は、血管新生を阻害もしくは低減する、または血管新生障害に関連する疾患もしくは症状を治療もしくは防止する方法における本発明の化合物または本発明の医薬組成物の使用を提供する。本発明は、血管新生を阻害もしくは低減する、または血管新生障害に関連する疾患もしくは症状を治療もしくは防止する方法を提供し、この方法は、治療上有効な用量の本発明の化合物および組成物を患者に投与することを含む。本発明の化合物または組成物を送達または投与する方法、および本発明の化合物または組成物を使用する治療方法も提供する。癌を治療する方法も提供し、この方法は、治療有効量の本発明による化合物または医薬組成物を対象に投与することを含む。本明細書で使用する場合、血管新生が媒介する状態は、異常な血管新生活性に起因する状態、または血管新生活性をモジュレートする化合物が治療用途を有する状態である。本発明の化合物および組成物で治療および／または診断することができる疾患および状態には、癌、関節炎、高血圧、腎臓疾患、乾癬、眼疾患に伴う眼の血管新生、感染または外科的介入、黄斑変性、糖尿病性網膜症などが包含される。
より具体的には、本発明に関連して本明細書で使用する場合、「癌」の例には、肺（ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣ）、頭頸部、卵巣、結腸、直腸、前立腺、肛門領域、胃、乳房、腎臓もしくは尿管、腎盂、甲状腺、膀胱、脳腫瘍、腎細胞癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の癌腫、その新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、非ホジキンスリンパ腫、脊髄軸腫瘍、中咽頭、下咽頭、食道、膵臓、肝臓、胆嚢および胆管、小腸、尿路の癌腫；またはリンパ腫、あるいは上述の癌のうちの１種または複数の癌の組合せが包含される。いっそうより具体的には、本発明に関連して本明細書で使用する場合、「癌」の例には、肺癌（ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣ）、乳癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、肛門領域の癌から選択される癌、または上述の癌のうちの１種もしくは複数の癌の組合せが包含される。
他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、限定ではないが、加齢性黄斑変性、血管形成術後の再狭窄、および乾癬などの非癌性過剰増殖性障害に関する。別の実施形態では、本発明は、ＩＧＦ１Ｒおよび／またはＡｎｇ２の活性化を必要とする哺乳類を治療するための医薬組成物に関し、この際、この医薬組成物は、治療有効量の本発明の活性化抗体および薬学的に許容できる担体を含む。本発明の医薬組成物は、骨粗鬆症、虚弱、または哺乳類が少なすぎる活性成長ホルモンを分泌するか、もしくは成長ホルモンに反応し得ない障害を治療するために使用することができる。
本明細書で使用する場合、薬物、化合物、または医薬組成物の「有効な投薬量」または「有効量」は、任意の１種または複数の有益か、または所望の結果に影響を及ぼすために十分な量である。予防的使用では、有益か、または所望の結果には、リスクを排除または低減すること、重症度を低下させること、あるいは疾患の生化学的、組織学的、および／または行動的症状、疾患の発生中に存在するその合併症および中間の病理学的表現型を包含する疾患の発症を遅延することが包含される。治療的使用では、有益か、または所望の結果には、腫瘍のサイズ、伝播、腫瘍の血管系、または癌もしくは血管新生の増大に伴う他の疾患の１つもしくは複数の症状を低減すること、疾患を治療するために必要な他の薬物の用量を減少させること、他の薬物の作用を強化すること、および／あるいは患者の疾患の進行を遅延させることなどの臨床結果が包含される。有効な投薬量は、１回または複数回の投与で投与することができる。本発明の目的のために、薬物、化合物、または医薬組成物の有効な投薬量は、予防的または治療的治療を直接的または間接的のいずれかで達成するために十分な量である。臨床的文脈において理解されるとおり、薬物、化合物、または医薬組成物の有効な投薬量は、別の薬物、化合物、または医薬組成物との関連で、達成されることもあれば、達成されないこともある。したがって、「有効な投薬量」は、１種または複数の治療薬を投与する文脈において判断することができ、単一の薬剤は、１種または複数の他の薬剤との関連において所望の結果を達成することができるか、または達成しているならば、有効な量で与えられたと判断することができる。
「個体」または「対象」は、哺乳類、より好ましくは、ヒトである。哺乳類にはまた、これらだけに限定されないが、家畜、競技動物、愛玩動物、霊長類、およびウマが包含される。
有利には、本発明の化合物の治療的投与は、血管新生の減少および／または癌の場合には、腫瘍体積の安定化または縮小をもたらす。好ましくは、腫瘍体積は、本発明のＭＡＣの投与前よりも少なくとも約１０％または約１５％低い。より好ましくは、腫瘍体積は、ＭＡＣの投与前よりも少なくとも約２０％低い。まだより好ましくは、腫瘍体積は、ＭＡＣの投与前よりも少なくとも３０％低い。有利には、腫瘍体積は、ＭＡＣの投与前よりも少なくとも４０％低い。より有利には、腫瘍体積は、ＭＡＣの投与前よりも少なくとも５０％低い。非常に好ましくは、腫瘍体積は、ＭＡＣの投与前よりも少なくとも６０％低い。最も好ましくは、腫瘍体積は、ＭＡＣの投与前よりも少なくとも７０％低い。
本発明の方法による本発明の化合物の投与は、例えば、受容者の生理学的状態、投与の目的が治療的または予防的のいずれであるか、かつ熟練した医師が知っている他の因子に応じて、連続的または間欠的であってよい。本発明の化合物の投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的であってよいか、または一連の間隔を空けた投与であってよい。
抗体
免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインは、グリークキートポロジーで２つのβシートに配置された７〜９の逆平行βストランドの２層サンドイッチからなるタンパク質ドメインの１種である。βストランドは、ほぼ完全に伸びたコンホメーションにある主鎖を有する典型的には３〜１０アミノ酸長さのポリペプチド鎖の伸張である。βシートは、少なくとも２つまたは３つの主鎖水素結合によって、側面で接続されたβストランドからなり、一般的には、ねじれたプリーツ状のシートを形成している。主鎖は、２つのβシートの間で繰り返しスイッチしている。典型的には、そのパターンは、（シート１中のＮ末端β−ヘアピン）−（シート２中のβ−ヘアピン）−（シート１中のβストランド）−（シート２中のＣ末端β−ヘアピン）である。シート間の交差は「Ｘ」を形成していて、Ｎ末端ヘアピンおよびＣ末端ヘアピンが、互いに向き合うようになっている。Ｉｇスーパーファミリーのメンバーは、種々の機能を有する数百種類のタンパク質において見出されている。例には、抗体、ジャイアントマッスルタイチン（ｇｉａｎｔ ｍｕｓｃｌｅ ｋｉｎａｓｅ ｔｉｔｉｎ）、および受容体チロシンキナーゼが包含される。Ｉｇ様ドメインは、タンパク質−タンパク質およびタンパク質−リガンド相互作用に関係していることもある。
αへリックスは、アミノ酸の右巻きコイルまたはらせんコンホメーションであり、その際、いずれの主鎖Ｎ−Ｈ基も、４残基前のアミノ酸の主鎖Ｃ＝Ｏ基に水素結合を供与している。この二次構造は時として、古典的Ｐａｕｌｉｎｇ−Ｃｏｒｅｙ−Ｂｒａｎｓｏｎ αへリックスとも称される。タンパク質におけるローカル構造の種類のうち、αへリックスは、最も規則的であり、配列から最も予測可能であり、さらには、最も優勢である。
免疫グロブリン（Ｉｇ）は、四量体の分子である。天然に存在するＩｇにおいて、各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一のペアからなり、各ペアは、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。
各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を包含する。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を画定する。ヒトの軽鎖は、κおよびλ軽鎖として分類される。重鎖は、α、δ、ε、γ、およびμとして分類され、抗体のアイソタイプをＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭとしてそれぞれ決定する。軽鎖および重鎖内で、可変および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって接合され、その際、重鎖も約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を包含する。各軽鎖／重鎖ペアの可変領域は、インタクトなＩｇが２つの結合部位を有するように抗体結合部位を形成している。
抗体分子中の各ドメインは、圧縮された逆平行βバレル内において相対して密にパックされた２つのβシートからなる同様の構造を有する。この保存構造は、免疫グロブリン（Ｉｇ）フォールドと称される。定常ドメインのＩｇフォールドは、４ストランドβシートに対してパックされた３ストランドβシートを含有し、その際、各シートは鎖によって分離され；これらの鎖は典型的には、α−へリックス、ループ、ターン、およびショート、シャープターンをβ−ヘアピンと呼ばれる２つのβシートの間に含む。
Ｉｇ鎖は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって接合された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。各ペアの２つの鎖からのＣＤＲは、フレームワーク領域によってアラインされて、特異的エピトープへの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖および重鎖は両方とも、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸のアサインメントは、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７および１９９１））の定義による。
ＣＤＲを構成する特定の抗体中のアミノ酸残基の同一性は、当技術分野においてよく知られている方法を使用して決定することができる。例えば、抗体のＣＤＲは、元々はＫａｂａｔらによって定義された超可変領域として同定することができる（Ｋａｂａｔら、１９９２、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、ＮＩＨ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）。ＣＤＲの位置はまた、元々はＣｈｏｔｈｉａらによって記載された構造的ループ構造として同定することができる（Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７〜８８３）。ＣＤＲ同定のための他の手法には、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの折衷であり、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ抗体モデル化ソフトウェア（現在はＡｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））を使用して誘導される「ＡｂＭ定義」、またはＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２：７３２〜７４５中に提示された、観察された抗原接触に基づくＣＤＲの「接触定義」が包含される。ＣＤＲの「コンホメーション定義」として本明細書において言及される別の手法では、ＣＤＲの位置は、抗原結合に対してエンタルピー的寄与をする残基として同定することができる（Ｍａｋａｂｅら、２００８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６〜１１６６）。さらに他のＣＤＲ境界定義は、上記手法のうちの１つに厳密に従うことはできないが、それにもかかわらず、それらは、ＫａｂａｔのＣＤＲの少なくとも一部と重複するはずであり、ただし、それらを、特定の残基もしくは残基の群またはＣＤＲ全体さえも、抗原の結合に有意に強い影響を及ぼさないという予測または実験所見に照らして、短く、または長くすることはできる。本明細書で使用する場合、ＣＤＲは、手法の組合せを包含する当技術分野で知られているあらゆる手法によって定義されるＣＤＲを指し得る。本明細書で使用する方法は、これらの手法のうちのいずれかによって定義されたＣＤＲを利用することができる。１つより多いＣＤＲを含有する任意の所与の実施形態において、ＣＤＲ（または抗体の他の残基）は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、延長、ＡｂＭ、接触、および／またはコンホメーション定義のいずれかに従って定義することができる。
ＣＬκおよびＣＬλドメインの残基のナンバリングは、様々であり得る。例えば、ＣＬκのナンバリングは、ＫａｂａｔナンバリングによるＬＣ−Ｒ１０８（例えば、配列番号２のＲ１０８）またはＫａｂａｔナンバリングによるＬＣ−Ｔ１０９（例えば、配列番号２のＴ１０９）のいずれかから始まり得る。本明細書で使用するナンバリング規則は、Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓの一部であるＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔグループによって提供されたものであり、ＬＣ−Ｔ１０９から始まる。異なるナンバリングシステムが好ましい場合には、本発明の指定の残基のナンバリングを、それに応じて調整することができることは分かるであろう。ＬＣは、軽鎖を指す。
「抗体」は、特異的結合のためにインタクトな抗体と競合するインタクトなＩｇまたはその抗原結合部分を指す。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術、またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的開裂によって生産することができる。抗原結合部分には特に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、二重特異性抗体、およびポリペプチドに特異的抗原結合を与えるために十分であるＩｇの少なくとも一部を含有するポリペプチドが包含される。Ｆａｂ断片は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ Ｉドメインからなる一価断片であり；Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であり；Ｆｄ断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなり；Ｆｖ断片は、抗体の一本腕のＶＬおよびＶＨドメインからなり；ｄＡｂ断片は、ＶＨドメインまたはＶＬドメイン（例えば、ヒト、ラクダ科、またはサメ）からなる。
一般に、抗体に対する言及は、その抗原結合部分を、特に、それらのＥおよびＦのβストランド間の配列番号９８を含むその抗原結合部分も指すと解釈されるべきである。
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬおよびＶＨ領域がペアとなって、それらが１本のタンパク質鎖となることを可能にする合成リンカーを介して一価の分子を形成している抗体である。二重特異性抗体は、ＶＨおよびＶＬドメインが１本のポリペプチド鎖上に発現しているが、同じ鎖上で２つのドメインの間でのペア形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインが別の鎖の相補的ドメインとペアを形成し、２つの抗原結合部位を作成させる二価の二重特異性抗体である。１個または複数のＣＤＲを、共有結合的または非共有結合的のいずれかで分子に組み込んで、これをイムノアドヘシンにすることができる。イムノアドヘシンは、ＣＤＲ（複数可）をより大きいポリペプチド鎖の一部として組み込むことができるか、ＣＤＲ（複数可）を別のポリペプチド鎖に共有結合的に連結することができるか、またはＣＤＲ（複数可）を非共有結合的に組み込むことができる。ＣＤＲは、イムノアドヘシンが、該当する特定の抗原に特異的に結合することを可能にする。
哺乳類軽鎖は、２つの種類κおよびλからなり、あらゆる所与の抗体分子において、１種類のみが存在する。ヒトにおいては、κ分子がλ分子よりも約２倍多く産生されるが、他の哺乳類では、この比は様々であり得る。各遊離軽鎖分子は、折り畳まれて、定常領域ドメインおよび可変領域ドメインを形成している１本のポリペプチド鎖中に約２２０のアミノ酸を含有する。
Ｂ細胞の発生中には、ＤＮＡレベルでの組換え事象によって、１本の可変（Ｖ）セグメントが接合（Ｊ）セグメントと接合し；定常（Ｃ）セグメントは後で、ＲＮＡレベルでのスプライシングによって接合される。多くの異なるＶセグメントがいくつかのＪセグメントで組み換えられることで、広範な抗原認識が得られる。追加の多様性は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによる、およびＢ細胞の成熟中に脾臓およびリンパ節で生じる体細胞超変異によるヌクレオチドの無作為の追加から生じる接合多様性によって達成される。定常カッパ（ＣＬκ）領域は単一遺伝子によってコードされるのに対して、ラムダ定常（ＣＬλ）領域は、同義遺伝子によってコードされ、スプライシングを受ける。ＣＬλの特定の多型種に関連するいくつかのマーカーが知られており：例えば、ＩｇＣＬλ１（Ｍｃｇマーカー）；ＩＧＬＣ２−ＩｇＣＬλ２（Ｋｅｒｎ−Ｏｚ−マーカー）；ＩｇＣＬλ ３（Ｋｅｒｎ−Ｏｚ＋マーカー）、およびＩｇＣＬλ７である。当業者であれば、ヒトＣＬλ鎖においてこれまでに同定された多型のすべてを容易に確立することができる。配列番号９３は、現在同定されている多型のうちの多くを組み込んでいる。本発明の配列は、ＣＬκおよびＣＬλ、ならびに抗体の他の知られている多型を一般に包含する。２つの多型遺伝子座、すなわち、ＣＬκ−Ｖ／Ａ４５およびＣＬκ−Ｌ／Ｖ８３が、ＣＬκにおいて同定されており、これまでに同定された３つの多型は：Ｋｍ（１）：ＣＬκ−Ｖ４５／Ｌ８３；Ｋｍ（１，２）：ＣＬκ−Ａ４５／Ｌ８３；およびＫｍ（３）：ＣＬκ−Ａ４５／Ｖ８３である。
抗体は、１つまたは複数の結合部位を有することができる。１つより多い結合部位が存在する場合、結合部位は、互いに同一であってもよいし、または異なってもよい。例えば、天然に存在するＩｇは、２つの同一の結合部位を有し、単鎖抗体またはＦａｂ断片は、１つの結合部位を有する一方で、「二重特異性」または「二機能性」抗体は、２つの異なる結合部位を有する。
「単離された抗体」は、（１）その天然の状態では、天然に会合される成分を伴う他の天然に会合される抗体を包含する、天然に会合される成分と会合していない抗体、（２）同一の種からの他のタンパク質を含まない抗体、（３）抗体を天然には発現しない細胞によって発現されるか、もしくは異なる種に由来する細胞によって発現される抗体、または（４）天然に存在しない抗体である。
用語「ヒト抗体」には、ヒトＩｇ配列から誘導される１つまたは複数の可変および定常領域を有するすべての抗体が包含される。本発明の一部の実施形態では、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体のすべての可変および定常ドメインは、ヒトＩｇ配列から誘導される（全ヒト抗体）。ヒト化抗体は、重鎖および軽鎖のフレームワークおよび定常ドメイン中のある種のアミノ酸が、ヒトにおける免疫応答を回避または抑制するように変異されている非ヒト種から誘導される抗体である。別法では、ヒト化抗体は、ヒト抗体からの定常ドメインを非ヒト種の可変ドメインに融合することによって生産することができる。
用語「キメラ抗体」は、１つの抗体からの１つまたは複数の領域および１つまたは複数の他の抗体からの１つまたは複数の領域を含有する抗体を指す。
用語「エピトープ」には、ＩｇまたはＴ細胞受容体に特異的に結合し得るあらゆるタンパク質決定基が包含される。エピトープの決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面分子団からなり、通常、特異的な三次元構造的特性、さらには特異的電荷特性を有する。抗体は、解離定数が＜１ｕＭ、好ましくは＜１００ｎＭ、より好ましくは：＜１０ｎＭである場合に、抗原を特異的に結合すると言われる。
多機能性抗体コンジュゲートまたはＭＡＣという用語は、標的に結合する少なくとも１個のエフェクター部分に共有結合的にコンジュゲートされている本明細書において定義するとおりの抗体またはその抗原結合部分を指す。エフェクター部分は、ペプチド、低分子、タンパク質、核酸分子、毒素、アプタマー、もしくは抗原結合性抗体、またはその断片であってよい。本明細書を通じて言及されるペプチドなどのコンジュゲーションに対する言及は一般的に、タンパク質および（抗原結合性）抗体またはその断片へのコンジュゲーションについて当てはまる。
完全ヒト抗体は、マウスまたはマウス由来のモノクローナル抗体（Ｍａｂ）に固有の免疫原性およびアレルギー性応答を最小化する、したがって、投与される抗体の有効性および安全性を増大させると予期される。完全ヒト抗体の使用は、繰り返しの抗体投与を必要とし得る炎症および癌などの慢性および再発性のヒト疾患を治療する際に、実質的な利点を提供すると予期され得る。別の実施形態では、本発明は、補体を結合しない抗体を含むＭＡＣを提供する。
加えて、２つ（またはそれ以上）の単鎖抗体が互いに連結されている融合抗体を作成することができる。これは、１本のポリペプチド鎖上に二価もしくは多価の抗体を作成することを所望する場合、または二重特異性抗体を作成することを所望する場合に有用である。
１つの種類の誘導された抗体は、２つ以上の抗体（同一の種類または異なる種類；例えば二重特異性抗体を作成するため）を架橋することによって生産される。適切な架橋剤には、適切なスペーサーによって分離された２つの別個の反応性基を有するヘテロ二機能性であるもの（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、またはホモ二機能性（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）が包含される。
別の種類の誘導された抗体は、標識された抗体である。本発明の抗体または抗体の一部を誘導することができる有用な検出薬には、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン、ランタニドリンなどを包含する蛍光化合物が包含される。抗体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出のために有用な酵素で標識することもできる。抗体が検出可能な酵素で標識された場合、これは、識別することができる反応生成物を産生するために酵素が使用する追加の試薬を加えることによって検出される。例えば、薬剤ホースラディッシュペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンを添加することで、反応生成物は着色されて、それを検出することができる。抗体を、ビオチンで標識し、アビジンまたはストレプトアビジン結合の間接的測定を介して検出することもできる。抗体を、ガドリニウムなどの磁性薬剤で標識することもできる。抗体を、二次レポーター（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識される予め決定されたポリペプチドエピトープで標識することもできる。一部の実施形態では、標識は、様々な長さのスペーサーアームによって結合されて、潜在的な立体障害を低減する。
抗体を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルもしくはエチル基、または炭水化物基などの化学基で誘導することもできる。これらの基は、抗体の生物学的特性を改良するために、例えば、血清半減期を増大させるか、または組織結合を増大させるために有用であり得る。
抗体特異性
抗原結合ドメインを含む一部の実施形態では、抗原結合ドメイン（例えば、これらだけに限定されないが、６つのＣＤＲすべてを有する抗体可変領域、または抗体可変領域と少なくとも９０パーセント同一である同等な領域）は、アバゴボマブ、アバタセプト（ＯＲＥＮＣＩＡ（登録商標））、アブシキシマブ（ＲＥＯＰＲＯ（登録商標）、ｃ７Ｅ３ Ｆａｂ）、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、アデカツムマブ、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）、ＭａｂＣａｍｐａｔｈもしくはＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ）、アルツモマブ、アフェリモマブ、アナツモマブマフェナトックス、アネツムマブ、アンルキズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ、アトリズマブ、アトロリムマブ、バピネウズマブ、バシリキシマブ（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標））、バビツキシマブ、ベクツモマブ（ＬＹＭＰＨＯＳＣＡＮ（登録商標））、ベリムマブ（ＬＹＭＰＨＯ−ＳＴＡＴ−Ｂ（登録商標））、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、βセプト（ＥＭＢＲＥＬ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ビシロマブブラロバルビタール、ビバツズマブメルタンシン、ブレンツキシマブベドチン（ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標））、カナキヌマブ（ＡＣＺ８８５）、カンツズマブメルタンシン、カプロマブ（ＰＲＯＳＴＡＳＣＩＮＴ（登録商標））、カツマキソマブ（ＲＥＭＯＶ ＡＢ（登録商標））、セデリズマブ（ＣＩＭＺＩＡ（登録商標））、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、クレノリキシマブ、ダセツズマブ、ダクリキシマブ、ダクリズマブ（ＺＥＮＡＰ ＡＸ（登録商標））、デノスマブ（ＡＭＧ １６２）、デツモマブ、ドルリモマブアリトックス、ドルリキシズマブ、ダンツムマブ、デュリムルマブ、デュルムルマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ（ＳＯＬＩＲＩＳ（登録商標））、エドバコマブ、エドレコロマブ（Ｍａｂｌ７−１Ａ、ＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標））、エファリズマブ（ＲＡＰＴＩＶＡ（登録商標））、エフングマブ（ＭＹＣＯＧＲＡＢ（登録商標））、エルシリモマブ、エンリモマブペゴール、エピツモマブシツキセタン、エファリズマブ、エピツモマブ、エプラツズマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ（ＲＥＸＯＭＵＮ（登録商標））、エタラシズマブ（エタラツズマブ、ＶＩＴＡＸＩＮ（登録商標）、ＡＢＥＧＲＩＮ（商標））、エクスビビルマブ、ファノレソマブ（ＮＥＵＴＲＯＳＰＥＣ（登録商標））、ファラリモマブ、フェルビズマブ、フォントリズマブ（ＨＵＺＡＦ（登録商標））、ガリキシマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ（ＡＢＸ−ＣＢＬ（Ｒ））、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標））、ゴリムマブ（ＣＮＴＯ １４８）、ゴミリキシマブ、イバリズマブ（ＴＮＸ−３５５）、イブリツモマブチウキセタン（ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標））、イゴボマブ、イムシロマブ、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤ Ｅ（登録商標））、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）、ＭＤＸ−０１０）、イラツムマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、レマレソマブ、レブリリズマブ、レルデリムマブ、レキサツムマブ（ＨＧＳ−ＥＴＲ２、ＥＴＲ２−ＳＴ０１）、レキシツムマブ、リビビルマブ、リンツズマブ、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ（ＨＧＳ−ＥＴＲＩ、ＴＲＭ−Ｉ）、マスリモマブ、マツズマブ（ＥＭＤ７２０００）、メポリズマブ（ＢＯＳＡＴＲＩＡ（登録商標））、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モロリムマブ、モタビズマブ（ＮＵＭＡＸ（商標））、ムロモナブ（ＯＫＴ３）、ナコロマブタフェナトックス、ナプツモマブエスタフェナトックス、ナタリズマブ（ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標）、ＡＮＴＥＧＲＥＮ（登録商標））、ネバクマブ、ネレリモマブ、ニモツズマブ（ＴＨＥＲＡＣＩＭ ｈＲ３（登録商標）、ＴＨＥＲＡ−ＣＩＭ−ｈＲ３（登録商標）、ＴＨＥＲＡＬＯＣ（登録商標））、ノフェツモマブメルペンタン（ＶＥＲＬＵＭＡ（登録商標））、オクレリズマブ、オデュリモマブ、オファツムマブ、オマリズマブ（ＸＯＬＡＩＲ（登録商標））、オレゴボマブ（ＯＶＡＲＥＸ（登録商標））、オテリキシズマブ、パギバキシマブ、パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））、パニツムマブ（ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、パスコリズマブ、ペムツモマブ（ＴＨＥＲＡＧＹＮ（登録商標））、ペルツズマブ（２Ｃ４、ＯＭＮＩＴＡＲＧ（登録商標）、ペキセリズマブ、ピンツモマブ、ポネズマブ、プリリキシマブ、プリツムマブ、ランビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）、ＭａｂＴＨＥＲＡ（登録商標））、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サツモマブ、セビルマブ、シブロツズマブ、シプリズマブ（ＭＥＤＩ−５０７）、ソンツズマブ、スタムルマブ（Ｍｙｏ−０２９）、スレソマブ（ＬＥＵＫＯＳＣＡＮ（登録商標））、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タプリツモマブパプトックス、テフィバズマブ（ＡＵＲＥＸＩＳ（登録商標））、テリモマブアリトックス、テネリキシマブ、テプリズマブ、チシリムマブ、トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標））、トラリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、トレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６）、ツコツズマブセルモロイキン、ツビルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ（ＣＮＴＯ １２７５）、バパリキシマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ビシリズマブ（ＮＵＶＩＯＮ（登録商標））、ボロシキシマブ（Ｍ２００）、ボツムマブ（ＨＵＭＡＳＰＥＣＴ（登録商標））、ザルツムマブ、ザノリムマブ（ＨｕＭＡＸ−ＣＤ４）、ジラリムマブ、またはゾリモマブアリトックスから選択される。
抗原結合ドメインを含む一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、６つのＣＤＲを有する重鎖および軽鎖可変ドメインを含み、かつ／または結合について、先行するリストから選択される抗体と競合する。抗原結合ドメインを含む一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、先行するリストにおける抗体と同じエピトープを結合する。抗原結合ドメインを含む一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、６つ全部のＣＤＲを有する重鎖および軽鎖可変ドメインを含み、先行するリストにおける抗体と同じ抗原に結合する。
抗原結合ドメインを含む一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、６つ全部のＣＤＲを有する重鎖および軽鎖可変ドメインを含み、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−Ｆ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＦＧＦ、ＦＧＦ２、ＨＧＦ、ＫＤＲ、ｆｌｔ−１、ＦＬＫ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−１、ＰＬＧＦ、ＣＥＡ、ＣＸＣＬ１３、Ｂａｆｆ、ＩＬ−２１、ＣＣＬ２１、ＴＮＦ−α、ＣＸＣＬ１２、ＳＤＦ−Ｉ、ｂＦＧＦ、ＭＡＣ−Ｉ、ＩＬ２３ｐｌ９、ＦＰＲ、ＩＧＦＢＰ４、ＣＸＣＲ３、ＴＬＲ４、ＣＸＣＲ２、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈｒｉｎＢ２、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢｌ）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２またはｐｌ８５ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、ＨＥＲ４ ＥｒｂＢ４またはｔｙｒｏ２）、ＳＣｌ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＲＡＧＥ、ｓ１００Ａ８、ｓ１００Ａ９、Ｎａｖｌ．７、ＧＬＰｌ、ＲＳＶ、ＲＳＶ Ｆタンパク質、インフルエンザＨＡタンパク質、インフルエンザＮＡタンパク質、ＨＭＧＢｌ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ６４、ＣＤ７９、ＣＤ２２、ＩＣＡＭ−Ｉ、ＦＧＦＲｌ、ＦＧＦＲ２、ＨＤＧＦ、ＥｐｈＢ４、ＧＩＴＲ、β−アミロイド、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ−Ｉ、ＰＩＶ−２、ＯＸ４０Ｌ、ＩＧＦＢＰ３、ｃＭｅｔ、ＰＤ−Ｉ、ＰＬＧＦ、ネプリライシン（Ｎｅｐｒｏｌｙｓｉｎ）、ＣＴＤ、ＩＬ−１８、ＩＬ−６、ＣＸＣＬ−１３、ＩＬ−ＩＲｌ、ＩＬ−１５、ＩＬ−４Ｒ、ＩｇＥ、ＰＡＩ−Ｉ、ＮＧＦ、ＥｐｈＡ２、ｕＰＡＲｔ、ＤＬＬ−４、αｖβ５、αｖβ６、α５β１、α３β１、インターフェロン受容体Ｉ型およびＩＩ型、ＣＤ １９、ＩＣＯＳ、ＩＬ−１７、第ＩＩ因子、Ｈｓｐ９０、ＩＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＣＤ １９、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＰＩＶ−３、ＣＭＶ、ＩＬ−１３、ＩＬ−９、およびＥＢＶから選択される抗原に特異的に結合する。
抗原結合ドメインを含む一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー（受容体またはリガンド）に特異的に結合する。様々な分子は、これだけに限定されないが、腫瘍壊死因子−α（「ＴＮＦ−α」）、腫瘍壊死因子−β（「ＴＮＦ−β」）、リンホトキシン−α（「ＬＴ−α」）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、４−１ＢＢリガンド、Ａｐｏ−１リガンド（ＦａｓリガンドまたはＣＤ９５リガンドとも呼ばれる）、Ａｐｏ−２リガンド（ＴＲＡＩＬとも呼ばれる）、Ａｐｏ−３リガンド（ＴＷＥＡＫとも呼ばれる）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、ＡＰＲＩＬ、ＲＡＮＫリガンド（ＴＲＡＮＣＥとも呼ばれる）、ＴＡＬＬ−１（ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦまたはＴＨＡＮＫとも呼ばれる）、ＤＲ４、ＤＲ５（Ａｐｏ−２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ−６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２、またはＫＩＬＬＥＲとしても知られる）、ＤＲ６、ＤｃＲＩ、ＤｃＲ２、ＤｃＲ３（ＴＲ６またはＭ６８としても知られる）、ＣＡＲＩ、ＨＶＥＭ（ＡＴＡＲまたはＴＲ２としても知られる）、ＧＩＴＲ、ＺＴＮＦＲ−５、ＮＴＲ−Ｉ、ＴＮＦＬＩ、ＣＤ３０、ＬＴＢｒ、４−１ＢＢ受容体およびＴＲ９を包含する。
抗原結合ドメインを含む一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、５Ｔ４、ＡＢＬ、ＡＢＣＢ５、ＡＢＣＦｌ、ＡＣＶＲｌ、ＡＣＶＲｌＢ、ＡＣＶＲ２、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＣＶＲＬｌ、ＡＤ０ＲＡ２Ａ、アグレカン、ＡＧＲ２、ＡＩＣＤＡ、ＡＩＦＩ、ＡＩＧｌ、ＡＫＡＰｌ、ＡＫＡＰ２、ＡＭＨ、ＡＭＨＲ２、アンギオゲニン（ＡＮＧ）、ＡＮＧＰＴｌ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４、アネキシンＡ２、ＡＮＰＥＰ、ＡＰＣ、ＡＰＯＣｌ、ＡＲ、アロマターゼ、ＡＴＸ、ＡＸｌ、ＡＺＧＰｌ（亜鉛−ａ−糖タンパク質）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７−Ｈ１、ＢＡＤ、ＢＡＦＦ、ＢＡＧｌ、ＢＡＩｌ、ＢＣＲ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＢＤＮＦ、ＢＬＮＫ、ＢＬＲｌ（ＭＤＲ１５）、ＢＩｙＳ、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦｌＯ）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１２、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＢＭＰＲ２、ＢＰＡＧｌ（プレクチン）、ＢＲＣＡｌ、Ｃ１９ｏｒｆｌＯ（ＩＬ２７ｗ）、Ｃ３、Ｃ４Ａ、Ｃ５、Ｃ５Ｒ１、ＣＡＮＴｌ、ＣＡＳＰｌ、ＣＡＳＰ４、ＣＡＶｌ、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＬｌ（１−３０９）、ＣＣＬＩ １（エオタキシン）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ−４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−Ｉｄ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ−４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＩＰ−３ｂ）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＭＣＡＦ、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３ａ）、ＣＣＬ２１（ＭＥＰ−２）、ＳＬＣ、エクソダス−２、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ−Ｉ）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ−Ｉ）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−Ｉａ）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−Ｉｂ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２）、ＣＣＮＡｌ、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＤｌ、ＣＣＮＥｌ、ＣＣＮＥ２、ＣＣＲｌ（ＣＫＲｌ／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ−ＩＲＢ／ＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ−Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩ１）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲｌ／ＣＫＲ−Ｌｌ）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ−９−６）、ＣＣＲＬｌ（ＶＳＨＫｌ）、ＣＣＲＬ２（Ｌ−ＣＣＲ）、ＣＤ１６４、ＣＤ１９、ＣＤｌＣ、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ−２２、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ３５、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１３７、ＣＤＨｌ（Ｅ−カドヘリン）、ＣＤＣＰ１ＣＤＨ１０、ＣＤＨ１２、ＣＤＨ１３、ＣＤＨ１８、ＣＤＨ１９、ＣＤＨ２０、ＣＤＨ５、ＣＤＨ７、ＣＤＨ８、ＣＤＨ９、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７、ＣＤＫ９、ＣＤＫＮｌＡ（ｐ２１Ｗａｐｌ／Ｃｉｐｌ）、ＣＤＫＮｌＢ（ｐ２７Ｋｉｐｌ）、ＣＤＫＮｌＣ、ＣＤＫＮ２Ａ（ｐｌ６ＩＮＫ４ａ）、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＫＮ３、ＣＥＢＰＢ、ＣＥＲｌ、ＣＨＧＡ、ＣＨＧＢ、キチナーゼ、ＣＨＳＴｌＯ、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ７（クラウジン−７）、ＣＬＮ３、ＣＬＵ（クラステリン）、ＣＭＫＬＲｌ、ＣＭＫＯＲｌ（ＲＤＣｌ）、ＣＮＲｌ、ＣＯＬｌ ８Ａｌ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＲ２、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＲＰ、ＣＳＦｌ（Ｍ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）、ＣＴＬＡ４、ＣＴＬ８、ＣＴＮＮＢｌ（ｂ−カテニン）、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤｌ）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＬｌ（ＧＲＯｌ）、ＣＸＣＬｌＯ（ＩＰ−ＩＯ）、ＣＸＣＬＩｌ（Ｉ−ＴＡＣ／ＩＰ−９）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦｌ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ １４、ＣＸＣＬ １６、ＣＸＣＬ２（ＧＲ０２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲ０３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８／ＬＩＸ）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ−２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ−Ｌ２）、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＣＹＢ５、ＣＹＣｌ、Ｃｙｒ６１、ＣＹＳＬＴＲｌ、ｃ−Ｍｅｔ、ＤＡＢ２ＩＰ、ＤＥＳ、ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１１８、ＤＮＣＬｌ、ＤＰＰ４、Ｅ２Ｆ１、ＥＣＧＦｌ５ＥＤＧｌ、ＥＦＮＡｌ、ＥＦＮＡ３、ＥＦＮＢ２、ＥＧＦ、ＥＬＡＣ２、ＥＮＧ、エンドグリン、ＥＮＯｌ、ＥＮ０２、ＥＮ０３、ＥＰＨＡｌ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＡ８、ＥＰＨＡ９、ＥＰＨＡｌＯ、ＥＰＨＢｌ、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ５、ＥＰＨＢ６、ＥＰＨＲＩＮ−Ａｌ、ＥＰＨＲＩＮ−Ａ２、ＥＰＨＲＩＮ−Ａ３、ＥＰＨＲＩＮ−Ａ４、ＥＰＨＲＩＮ−Ａ５、ＥＰＨＲＩＮ−Ａ６、ＥＰＨＲＩＮ−Ｂｌ、ＥＰＨＲＩＮ−Ｂ２、ＥＰＨＲＴＮ−Ｂ３、ＥＰＨＢ４、ＥＰＧ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ−２）、ＥＲＥＧ、ＥＲＫ８、エストロゲン受容体、ＥＳＲｌ、ＥＳＲ２、Ｆ３（ＴＦ）、ＦＡＤＤ、ファルネシルトランスフェラーゼ、ＦａｓＬ、ＦＡＳＮｆ、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ２、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＧＦ、ＦＧＦｌ（ａＦＧＦ）、ＦＧＦｌＯ、ＦＧＦｌ １、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１（例えばｍｉｍＡｂ１）、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、ＦＧＦ３（ｉｎｔ−２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ−２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦＲ３、ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＦＩＬｌ（ＥＰＳＩＬＯＮ）、ＦＢＬｌ（ＺＥＴＡ）、ＦＬＪ１２５８４、ＦＬＪ２５５３０、ＦＬＲＴｌ（フィブロネクチン）、ＦＬＴｌ、ＦＬＴ−３、ＦＯＳ、ＦＯＳＬｌ（ＦＲＡ−Ｉ）、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）、ＧＡＧＥＢｌ、ＧＡＧＥＣｌ、ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ−６ＳＴ、ＧＡＴＡ３、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ８、ＧＦＩｌ、ＧＧＴｌ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＮＡＳｌ、ＧＮＲＨｌ、ＧＰＲ２（ＣＣＲｌＯ）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ４４、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＧＲＣＣｌＯ（ＣｌＯ）、ｇｒｅｍｌｉｎ、ＧＲＰ、ＧＳＮ（ゲルゾリン）、ＧＳＴＰｌ、ＨＡＶＣＲ２、ＨＤＡＣ、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７Ａ、ＨＤＡＣ９、ヘッジホッグ、ＨＧＦ、ＨＩＦｌＡ、ＨＩＰｌ、ヒスタミンおよびヒスタミン受容体、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＭ７４、ＨＭＯＸｌ、ＨＳＰ９０、ＨＵＭＣＹＴ２Ａ、ＩＣＥＢＥＲＧ、ＩＣＯＳＬ、ＩＤ２、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮＡｌ、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＥＦＮＡ６、ＢＦＮＡ７、ＩＦＮＢｌ、ＩＦＮガンマ、ＩＦＮＷｌ、ＩＧＢＰｌ、ＩＧＦｌ、ＩＧＦｌＲ、ＩＧＦ２、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ６、ＤＬ−Ｉ、ＩＬｌＯ、ＩＬｌＯＲＡ、ＩＬｌＯＲＢ、ＩＬ−１、ＩＬｌＲｌ（ＣＤ１２１ａ）、ＩＬｌＲ２（ＣＤ１２１ｂ）、ＩＬ−ＩＲＡ、ＩＬ−２、ＩＬ２ＲＡ（ＣＤ２５）、ＩＬ２ＲＢ（ＣＤ１２２）、ＩＬ２ＲＧ（ＣＤ１３２）、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ（ＣＤ１２３）、ＩＬ−５、ＩＬ５ＲＡ（ＣＤ１２５）、ＩＬ３ＲＢ（ＣＤ１３１）、ＩＬ−６、ＩＬ６ＲＡ（ＣＤ１２６）、ＩＲ６ＲＢ（ＣＤ１３０）、ＩＬ−７、ＩＬ７ＲＡ（ＣＤ１２７）、ＩＬ−８、ＣＸＣＲｌ（ＩＬ８ＲＡ）、ＣＸＣＲ２（ＩＬ８ＲＢ／ＣＤ１２８）、ＩＬ−９、ＩＬ９Ｒ（ＣＤ１２９）、ＩＬ−１０、ＩＬ１０ＲＡ（ＣＤ２１０）、ＩＬ１０ＲＢ（ＣＤＷ２１０Ｂ）、ＩＬ−１１、ＩＬｌ ＩＲＡ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２Ａ、ＩＬ−１２Ｂ、ＩＬ−１２ＲＢ１、ＩＬ−１２ＲＢ２、ＩＬ−１３、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１５ＲＡ、１Ｌ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ１９、ＩＬＩＡ、ＩＬｌＢ、ＩＬｌＦｌＯ、ＩＬ１Ｆ５、ＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ７、ＩＬ１Ｆ８、ＤＬ１Ｆ９、ＩＬｌＨＹｌ、ＩＬｌＲｌ、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬｌＲＡＰ、ＩＬｌＲＡＰＬｌ、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬｌＲＬｌ、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬｌＲＮ、ＩＬ２、ＩＬ２０、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＩＬ２３、ＤＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３、ＩＬ３０、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）、ＩＬＫ、ＩＮＨＡ、ＩＮＨＢＡ、ＩＮＳＬ３、ＩＮＳＬ４、ＩＲＡＫＩ、ＩＲＡＫ２、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ６（α６インテグリン）、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ４（β４インテグリン）、ＪＡＫｌ、ＪＡＫ３、ＪＴＢ、ＪＵＮ、Ｋ６ＨＦ、ＫＡＩｌ、ＫＤＲ、ＫＩＭ−１、ＫＩＴＬＧ、ＫＬＦ５（ＧＣボックスＢＰ）、ＫＬＦ６、ＫＬＫｌＯ、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、ＫＬＫ１５、ＫＬＫ３、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ９、ＫＲＴｌ、ＫＲＴ１９（ケラチン１９）、ＫＲＴ２Ａ、ＫＲＴＨＢ６（毛髪特異的ＩＩ型ケラチン）、ＬＡＭＡ５、ＬＥＰ（レプチン）、Ｌｉｎｇｏ−ｐ７５、Ｌｉｎｇｏ−Ｔｒｏｙ、ＬＰＳ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＴＡ（ＴＮＦ−ｂ）、ＬＴＢ、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＬＴＢ４Ｒ２、ＬＴＢＲ、ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＧまたはＯｍｇｐ、ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ−Ｊｕｎ）、ＭＣＰ−Ｉ、ＭＤＫ、ＭＩＢｌ、ミドカイン、ＭＩＦ、ＭＩＳＲＩＩ、ＭＪＰ−２、ＭＫ、ＭＫＩ６７（Ｋｉ−６７）、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＳ４Ａ１、ＭＳＭＢ、ＭＴ３（メタロチオネクチン−Ｕｉ）、ｍＴＯＲ、ＭＴＳＳｌ、ＭＵＣｌ（ムチン）、ＭＹＣ、ＭＹＤ８８、ＮＣＫ２、ニューロカン、ニューレグリン−１、ニューロピリン−１、ＮＦＫＢｌ、ＮＦＫＢ２、ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）、ＮＧＦＲ、ＮｇＲ−Ｌｉｎｇｏ、ＮｇＲ−Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）、ＮｇＲ−ｐ７５、ＮｇＲ−Ｔｒｏｙ、ＮＭＥｌ（ＮＭ２３Ａ）、ＮＯＴＣＨ、ＮＯＴＣＨｌ、Ｎ０Ｘ５、ＮＰＰＢ、ＮＲＯＢｌ、ＮＲ０Ｂ２、ＮＲｌＤｌ、ＮＲ１Ｄ２、ＮＲ１Ｈ２、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ１Ｈ４、ＮＲ１Ｉ２、ＮＲ１Ｉ３、ＮＲ２Ｃ１、ＮＲ２Ｃ２、ＮＲ２Ｅ１、ＮＲ２Ｅ３、ＮＲ２Ｆ１、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ２Ｆ６、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲ３Ｃ２、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ６Ａ１、ＮＲＰｌ、ＮＲＰ２、ＮＴ５Ｅ、ＮＴＮ４、ＯＣＴ−１、ＯＤＺ１、ＯＰＮ１、ＯＰＮ２、ＯＰＲＤｌ、Ｐ２ＲＸ７、ＰＡＰ、ＰＡＲＴｌ、ＰＡＴＥ、ＰＡＷＲ、ＰＣＡ３、ＰＣＤＧＦ、ＰＣＮＡ、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＥＣＡＭｌ、ｐｅｇ−アスパラギナーゼ、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、Ｐｌｅｘｉｎ Ｂ２（ＰＬＸＮＢ２）、ＰＧＦ、ＰＧＲ、ホスファカン、ＰＩＡＳ２、ＰＩ３キナーゼ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）、ＰＬＧ５ＰＬＸＤＣｌ、ＰＫＣ、ＰＫＣ−β、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＰＰＩＤ、ＰＲｌ、ＰＲＫＣＱ、ＰＲＫＤｌ、ＰＲＬ、ＰＲＯＣ、ＰＲＯＫ２、ｐｒｏ−ＮＧＦ、プロサポシン、ＰＳＡＰ、ＰＳＣＡ、ＰＴＡＦＲ、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ−２）、ＰＴＮ、ＲＡＣ２（Ｐ２１Ｒａｃ２）、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＲＡＲＢ、ＲＧＳｌ、ＲＧＳ１３、ＲＧＳ３、ＲＮＦＩ１０（ＺＮＦ１４４）、Ｒｏｎ、Ｒ０Ｂ０２、ＲＸＲ、セレクチン、Ｓ１００Ａ２、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＳＣＧＢ １Ｄ２（リポフィリンＢ）、ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロビン２）、ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロビン１）、ＳＣＹＥｌ（内皮単球活性化サイトカイン）、ＳＤＦ２、ＳＥＲＰＥＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＲＰＩＮＢ５（マスピン）、ＳＥＲＰＩＮＥｌ（ＰＡＩ−Ｉ）
、ＳＥＲＰＩＮＦｌ、ＳＨＩＰ−Ｉ、ＳＨＩＰ−２、ＳＨＢｌ、ＳＨＢ２、ＳＨＢＧ、ＳｆｃＡＺ、ＳＬＣ２Ａ２、ＳＬＣ３３Ａ１、ＳＬＣ４３Ａ１、ＳＬＩＴ２、ＳＰＰｌ、ＳＰＲＲｌＢ（Ｓｐｒｌ）、ＳＴ６ＧＡＬ１、ＳＴＡＢｌ、ＳＴＡＴ６、ＳＴＥＡＰ、ＳＴＥＡＰ２、ＳＵＬＦ−１、Ｓｕｌｆ−２、ＴＢ４Ｒ２、ＴＢＸ２１、ＴＣＰｌＯ、ＴＤＧＦｌ、ＴＥＫ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢｌ、ＴＧＦＢｌＩｌ、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲｌ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＨｌＬ、ＴＨＢＳｌ（トロンボスポンジン−１）、ＴＨＢＳ２／ＴＨＢＳ４、ＴＨＰＯ、ＴＩＥ（Ｔｉｅ−１）、ＴＩＭＰ３、組織因子、ＴＩＫＩ２、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６ＪＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＭ４ＳＦ１、ＴＮＦ、ＴＮＦ−ａ、ＴＮＦＡＩＰ２（Ｂ９４）、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦＩｌＡ、ＴＮＦＲＳＦｌＡ、ＴＮＦＲＳＦｌＢ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）、ＴＮＦＲＳＦ７、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＳＦｌＯ（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦｌ １（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰ０３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ−Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ １８、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド）、ＴＯＬＬＩＰ、Ｔｏｌｌ様受容体、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９、Ｔ０Ｐ２Ａ（トポイソメラーゼＩｉａ）、ＴＰ５３、ＴＰＭｌ、ＴＰＭ２、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦｌ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、ＴＲＫＡ、ＴＲＥＭｌ、ＴＲＥＭ２、ＴＲＰＣ６、ＴＲＯＹ、ＴＳＬＰ、ＴＷＥＡＫ、チロシナーゼ、ｕＰＡＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、バーシカン、ＶＨＬ Ｃ５、ＶＬＡ−４、Ｗｎｔ−１、ＸＣＬｌ（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ−Ｉｂ）、ＸＣＲｌ（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲｌ）、ＹＹｌ、およびＺＦＰＭ２から選択される１種または複数の標的に結合し得る。
触媒抗体
本発明の一部の態様では、ＭＡＣは、触媒抗体またはその抗原結合部分を含む。一部の態様では、抗体は、アルドラーゼ抗体であってよい。
抗体技術の他の要素の中でも、抗体、その有用な断片およびバリアントおよび修飾、結合部位およびＣＤＲ、抗体製剤、発現、ヒト化、アミノ酸修飾、糖鎖形成、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、抗体の血清半減期の増大、発現ベクター、哺乳類宿主系、ならびに折畳みを記載している米国特許出願公開第２００６２０５６７０号の内容、特に段落［０１５３］〜［０２３３］は、参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用する場合、「結合部位」（抗原結合部位としても知られている）は、適切な抗原（または構造的に同様のタンパク質）の決定基と結合する（または結合することができる）Ｉｇの領域またはＩｇドメインを指す。この用語は一般的に、ＣＤＲおよび抗原結合に関係する隣接するフレームワーク残基を包含する。
本明細書で使用する場合、「アルドラーゼ抗体」は、（例えばコンジュゲーションによって）妨害がなくなった場合に、脂肪族ケトンドナーとアルデヒドアクセプターとの間のアルドール付加反応を触媒する結合部位部分を含有する抗体を指す。アルドラーゼ抗体は、担体タンパク質にカップリングされている下式：
Figure 2015504893
 の１，３−ジケトンハプテンを包含する免疫原で免疫反応性動物を免疫化することによって生成され得、抗体の結合部位において反応性ε−アミノ基を有するリシンを有することによってさらに特徴づけられる。アルドラーゼ抗体は、１，３−ジケトンハプテンと触媒抗体のリシンのε−アミノ基との間での複合体の形成によって１，３−ジケトンハプテンでの阻害を受けるその触媒活性によってさらに特徴づけられる。
検討したとおり、ある種の実施形態では、本発明のＭＡＣ、組成物、および試料を製造するために使用され得るある種の抗体は、反応性側鎖を抗体結合部位に含むことができる。反応性側鎖は、天然に存在してもよいか、または変異によって抗体中に入れることもできる。抗体を製造するために最初に同定されたリンパ系細胞中に存在する核酸によって残基がコードされる場合のように、抗体結合部位の反応性残基は抗体に随伴されてよい。別法では、アミノ酸残基を、特定の残基をコードするようにＤＮＡを意図的に変異させることによって生じさせることができる。反応性残基は、例えば、本明細書において検討したとおりの独特なコドン、ｔＲＮＡ、およびアミノアシル−ｔＲＮＡを使用する生合成による組込みによって生じる非天然の残基であってよい。別の手法では、アミノ酸残基またはその反応性官能基（例えば、求核性アミノ基またはスルフヒドリル基）を、抗体結合部位中のアミノ酸残基に結合させることができる。したがって、「抗体の結合部位中のアミノ酸残基を介して」生じる抗体との共有結合的連結は、本明細書で使用する場合、連結が、抗体結合部位のアミノ酸残基に直接的であるか、または抗体結合部位のアミノ酸残基の側鎖に連結される化学部分を介することができることを意味する。一部の実施形態では、アミノ酸はシステインであり、側鎖の反応性基はスルフヒドリル基である。他の実施形態では、アミノ酸残基はリシンであり、側鎖の反応性基はε−アミノ基である。一部の実施形態では、アミノ酸は、Ｋａｂａｔナンバリングによる重鎖上のＫ９３である。一部の実施形態では、アミノ酸は、配列番号６５および６６のナンバリングによるｈ３８Ｃ２のＨＣ−Ｋ９９上にある。
触媒抗体は、１個または複数の反応性アミノ酸側鎖を含む適切な結合部位を伴う抗体の１つの供給源である。このような抗体には、アルドラーゼ抗体、βラクタマーゼ抗体、エステラーゼ抗体、およびアミダーゼ抗体が包含される。
一実施形態は、マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ３３Ｆ１２およびｍＡｂ３８Ｃ２（そのＶＬおよびＶＨは、配列番号６８および６９を含む）などのアルドラーゼ抗体、さらには、そのような抗体の適切なキメラバージョンおよびヒト化バージョン（例えば、ｈ３８Ｃ２ＩｇＧ１：配列番号６４および６５、ならびにｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ２：配列番号６４および６６）を含む。好ましい態様では、配列番号６５または配列番号６６などの重鎖を、配列番号９８を含む本発明のＣＬドメインの１つに融合しているｈ３８Ｃ２ ＶＬ（配列番号６７）と一緒に使用する。
マウスｍＡｂ３８Ｃ２（およびｈ３８Ｃ２）は、反応性リシンをＨＣＤＲ３の近くに、ただし、その外側に有し、反応性免疫化によって産生され、機構的に天然のアルドラーゼ酵素を模倣する触媒抗体の新しいクラスのプロトタイプである。使用することができる他のアルドラーゼ触媒抗体には、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１５を有するハイブリドーマ８５Ａ２；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１４を有するハイブリドーマ８５Ｃ７；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１７を有するハイブリドーマ９２Ｆ９；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２３を有するハイブリドーマ９３Ｆ３；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２４を有するハイブリドーマ８４Ｇ３；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１８を有するハイブリドーマ８４Ｇ１１；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１９を有するハイブリドーマ８４Ｈ９；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８２５を有するハイブリドーマ８５Ｈ６；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０１６を有するハイブリドーマ９０Ｇ８によって産生される抗体が包含される。反応性リシンを介して、これらの抗体は、天然のアルドラーゼのエナミン機構を使用してアルドールおよびレトロ−アルドール反応を触媒する。
本発明の化合物は、チオエステラーゼおよびエステラーゼ触媒抗体の結合部位において見出されるものなどの反応性システインにターゲティング作用剤を連結させることによって形成することもできる。反応性アミノ酸を含有する抗体は、反応性アミノ酸をコードするように抗体結合部位残基を変異させるか、または抗体結合部位中のアミノ酸側鎖を、反応性基を含有するリンカーで化学的に誘導することを包含する当技術分野においてよく知られている手段によって調製することができる。
抗体は、ヒト化抗体であってよい。本発明の化合物が抗体の結合部位に共有結合的に連結され、そのような抗体がヒト化される場合、そのような抗体が、Ｗ基に対する高い連結親和性を維持しつつヒト化されることが重要である。様々な形態のヒト化マウスアルドラーゼ抗体が企図される。一実施形態では、ヒト定常ドメインＣＬκおよびＣＨγ１１を有するヒト化アルドラーゼ触媒抗体ｈ３８ｃ２ＩｇＧ１またはｈ３８ｃ２Ｆａｂを使用する。ヒト生殖細胞系ＶＬｋ遺伝子ＤＰＫ−９およびヒトＪｋ遺伝子ＪＫ４を、ｍ３８ｃ２のカッパ軽鎖可変ドメインのヒト化のためのフレームワークとして使用し、ヒト生殖細胞系遺伝子ＤＰ−４７およびヒトＪＨ遺伝子ＪＨ４を、ｍ３８ｃ２の重鎖可変ドメインのヒト化のためのフレームワークとして使用した。図８Ａは、ｍ３８ｃ２、ｈ３８ｃ２、およびヒト生殖細胞系中の可変軽鎖と重鎖との間の配列アラインメントを図示している。ｈ３８ｃ２は、あらゆるそのアロタイプを包含するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の定常ドメインを利用することができる。別の実施形態では、ｈ３８ｃ２の可変ドメイン（ＶＬおよびＶＨ）（配列番号６７および６８）と、配列番号９８をβシートＥとＦとの間に含む本発明のポリペプチドを含むＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体からの定常ドメインとを含むキメラ抗体を使用する。ＬＣは、配列番号２５４を含んでよい。抗体は、全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＶＨ、ＶＬ、二重特異性抗体、またはｈ３８ｃ２からのＶＨおよびＶＬドメインを含むミニボディであってよい。抗体は、ｈ３８ｃ２からのＶＬおよびＶＨドメインと、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択される定常ドメインとを含む抗体であってよい。抗体は、ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ抗体からの定常領域を含むマウスアルドラーゼ抗体のヒト化バージョンであってよい。別の実施形態では、抗体は、マウスアルドラーゼ抗体からのＶＬおよびＶＨ領域（例えば、配列番号６９および７０）と、配列番号９８をβシートＥとＦとの間に含む本発明のポリペプチドを含むヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ抗体からの定常領域とを含むキメラ抗体である。さらなる実施形態では、抗体は、天然または未変性のヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ抗体からのポリペプチド配列を含むマウスアルドラーゼ抗体の完全なヒトバージョンである。
一実施形態では、ｈ３８ｃ２ Ｆ（ａｂ’）２を使用する。ｈ３８ｃ２ Ｆ（ａｂ’）２は、ｈ３８ｃ２ ＩｇＧ１のタンパク分解性消化によって生産することができる。
本発明で使用する場合、「薬物動態」は、経時的な血清中における投与化合物の濃度を指す。薬力学は、経時的な標的および非標的組織中における投与化合物の濃度、ならびに標的組織（例えば、有効性）および非標的組織（例えば、毒性）に対する作用を指す。特定のターゲティング作用剤あるいは生物学的薬剤について、不安定な連結を使用するか、または任意のリンカーの化学的性質を改変する（例えば、溶解度、電荷などを変更する）ことなどによって、例えば、薬物動態または薬力学における改善を設計することができる。用語「Ｋｏｆｆ」は、抗体／抗原複合体からの抗体の解離の切断速度定数を指す。用語「Ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指す。
一部の態様では、本発明は、本発明の化合物の薬学的に許容できる塩、立体異性体、互変異性体、溶媒和物、およびプロドラッグ、試料、組成物、ならびに医薬組成物を提供する。
触媒抗体リンカー
ターゲティング作用剤（ＴＡ）を触媒抗体の結合部位に接続するために適したある種のリンカー（触媒抗体リンカー：ＣＡｂ−リンカー）は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００９０９８１３０号に開示されている。用語「ターゲティング作用剤」を、用語「エフェクター部分」と区別するために本明細書において使用するが、ＣＡｂ−リンカーの末端にＴＡとして結合されているか、またはＭＡＣ−リンカーの末端にエフェクター部分として結合されている分子の種類が互換的であってよいことは明白である。特に、（ＣＡｂ−リンカーを記載する一般式、具体的なＣＡｂ−リンカー構造、ＣＡｂ−リンカーの合成、ならびにＰ１、Ｑ１、およびＷ１の異なる要素（そこでは、それぞれＸ、Ｙ、およびＺ基として分類されている）の組合せに関する米国特許出願公開第２００９０９８１３０号の態様は、具体的、かつ一般的に本明細書に記載されているかのように、本明細書に包含される。
ＣＡｂ−リンカーは、直鎖または分枝であってよく、場合によって、１個または複数の炭素環式基または複素環式基を包含する。ＣＡｂ−リンカーの長さは、直鎖原子の数の点において考えることができ、その際、芳香環などの環式部分は、環の周りの最短経路をとることによって数えられる。一部の実施形態では、ＣＡｂ−リンカーは、５〜１５原子、他の実施形態では、１５〜３０原子、なお他の実施形態では３０〜５０原子、なお他の実施形態では５０〜１００原子、なお他の実施形態では１００〜２００原子の直線的伸張を有する。他のＣＡｂ−リンカーの検討事項には、溶解度、親油性、親水性、疎水性、安定性（多かれ少なかれ安定的、さらには、計画された分解）、剛性、柔軟性、免疫原性、および抗体結合のモジュレーション、ミセルまたはリポソーム中に組み込まれる能力などの、生じた化合物の物理的または薬物動態的特性に対する作用が包含される。
一部の態様では、ＣＡｂ−リンカーは、ＴＡ連結残基の側鎖に共有結合的に連結させることができる。リンカーは、式：Ｐ１−Ｑ１−Ｗ１を含むことができ；ここで、Ｐ１は、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から選択される任意の原子を包含する生物学的に適合性な接続鎖であり、ポリマーまたはブロックコポリマーを含むことができ、リンカーが直鎖である場合、連結残基に（適切に、側鎖、アミノ末端、またはカルボキシル末端を介して）共有結合的に連結され、Ｑ１は、少なくとも１つの環構造を含む場合によって存在する認識基であり、Ｗ１は、抗体の結合部位中のアミノ酸側鎖への共有結合的連結を含む結合部分である。
存在する場合、Ｑ１は、置換されていてもよい構造：
Figure 2015504893
 ［式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅは独立に、炭素または窒素であり、ｆは、炭素、窒素、酸素、または硫黄である］を有し得、Ｑ１は、Ｐ１およびＷ１に、独立に、十分な原子価の任意の２つの環位で結合されており、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、またはｆのうちの４個以下が、同時に窒素であり、好ましくは、環構造中のａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅはそれぞれ炭素である。一部の態様では、Ｑ１はフェニルであってよい。いかなる理論にも束縛されることは望まないが、Ｗ１基が反応性アミノ酸側鎖と反応することができるように、Ｑ１基は、反応性基を適切な抗体結合部位中にポジショニングすることを援助することができると考えられる。
抗体、タンパク質、またはこれらの断片などの高分子との結合を共有結合的に、または非共有結合的に形成し得る反応性基を含有するように、ＣＡｂ−リンカーを設計することができる。反応性基を、特定の結合部位中の反応性残基と共に使用するために選択する。例えば、アルドラーゼ抗体によって修飾するための化学部分は、ケトン、ジケトン、βラクタム、活性なエステルハロケトン、ラクトン、無水物、マレイミド、α−ハロアセトアミド、シクロヘキシルジケトン、エポキシド、アルデヒド、アミジン、グアニジン、イミン、エナミン、ホスファート、ホスホナート、エポキシド、アジリジン、チオエポキシド、マスクまたは保護されたジケトン（例えば、ケタール）、ラクタム、ハロケトン、アルデヒドなどであってよい。
一部の実施形態では、Ｗ１は、抗体の結合部位中の残基の側鎖とのコンジュゲーションの前に、アゼチジノン、ジケトン、アシルβ−ラクタム、活性なエステル、ハロケトン、シクロヘキシルジケトン基、アルデヒド、マレイミド、活性化されたアルケン、活性化されたアルキン、または一般的に、求核性または求電子性置換に感受性のある脱離基を含む分子を形成するために配置された１個または複数のＣ＝Ｏ基を包含する。他の基は、ラクトン、無水物、α−ハロアセトアミド、イミン、ヒドラジド、またはエポキシドを包含することができる。抗体の結合部位中の反応性求核性基（例えば、リシンまたはシステイン側鎖）に共有結合することができる例示的なリンカーの求電子性反応性基には、アシルβ−ラクタム、単純なジケトン、スクシンイミド活性なエステル、マレイミド、リンカーを含むハロアセトアミド、ハロケトン、シクロヘキシルジケトン、アルデヒド、アミジン、グアニジン、イミン、エナミン、ホスファート、ホスホナート、エポキシド、アジリジン、チオエポキシド、マスクまたは保護されたジケトン（例えば、ケタール）、ラクタム、スルホナートなど、イミン、ケタール、アセタールなどのマスクされたＣ＝Ｏ基、ならびに任意の他の知られている求電子性基が包含される。ある種の実施形態では、反応性基は、アシルβ−ラクタム、単純なジケトン、スクシンイミド活性なエステル、マレイミド、リンカーを含むハロアセトアミド、ハロケトン、シクロヘキシルジケトン、またはアルデヒドを形成するように配置された１個または複数のＣ＝Ｏ基を包含する。Ｗ１は、置換アルキル、置換シクロアルキル、置換アリール、置換アリールアルキル、置換ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルアルキルであってよく、ここで、少なくとも１個の置換基は、１，３−ジケトン部分、アシルβ−ラクタム、活性なエステル、α−ハロケトン、アルデヒド、マレイミド、ラクトン、無水物、α−ハロアセトアミド、アミン、ヒドラジド、またはエポキシドである。一部の態様では、Ｗ１基を、本発明のペプチドに半減期の増大を提供することができる高分子骨格に共有結合的に連結させる。一部の態様では、存在する場合、Ｗ１基を、抗体の結合部位に共有結合的に連結させる。
一部の態様では、コンジュゲーションの前に（例えば、抗体の結合部位との）、Ｗ１は、構造式：
Figure 2015504893
 ［式中、ｑ＝０〜５である］を有する。ｑは１または２であってよい。ｑは１であってよい。他の態様では、ｑは２であってよい。
一部の態様では、抗体の結合部位とのコンジュゲーションの後に、Ｗ１は、構造：
Figure 2015504893
 ［式中、ｑ＝０〜５であり、抗体−Ｎ−は、抗体の結合部位中の側鎖への共有結合である］を有する。ｑは、１または２であってよい。ｑは、１であってよい。他の態様では、ｑは２であってよい。
Ｐ１は、３つの成分；Ｐ１ｐ−Ｐ１ｓ−Ｐ１ｙを含む基であってよく、ここで、Ｐ１ｐは、ターゲティング作用剤と結合可能なように特異的に適合された基であり、Ｐ１ｓは、Ｐ１基のスペーサー領域であり、Ｐ１ｙは、Ｗ１基に結合するように適合された基である。一部の態様では、Ｐ１ｙは、アミド結合、エナミン結合、またはグアニジニウム結合から選択される。Ｐ１ｙは、Ｑ１基に（２原子以内で）隣接する水素分子を提供するように選択することができる。理論に束縛されることは望まないが、Ｈ原子が、Ｈ結合相互作用を介しての疎水性ポケットの、特にｈ３８Ｃ２などの触媒抗体の結合間隙の疎水性ポケットに関するＱ１基の認識を援助することができると考えられる。したがって、例えば、ＮＨ基のＨを水素結合のために提供して、ＮＨ基がＱ１基に直接結合するように、アミド結合を方向付けすることができる。別法では、Ｑ１基に原子約２個分隣接するが、しかしなおＨ−結合のために利用可能なＮＨ基のＨで、アミドのＣ＝Ｏ基をＱ１基に結合させることができる。一部の実施形態では、Ｐ１ｙは存在しない。一部の実施形態では、Ｐ１ｙ基は下式：
Figure 2015504893
 を有する。
一部の態様では、Ｐ１ｓを、Ｐ１ｓがいずれの過度に反応性の基も提供しないように選択する。Ｐ１ｓは、２〜１５原子のＰ１基の全体長さを提供するように選択することができる。Ｐ１ｓは、２〜１０原子のＰ１基の全体長さを提供するように選択することができる。Ｘ１基は、Ｐ１基の全体長さが、４〜８原子であるように選択することができる。Ｐ１基は、Ｐ１基の全体長さが５原子であるように選択することができる。Ｐ１基は、Ｐ１基の全体長さが６原子であるように選択することができる。一部の態様では、Ｐ１基は、以下の式のうちの１つを含むことができる：
Figure 2015504893
 ［式中、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｍは、存在するか、または存在せず、ｎは、１、２、３、４、５、または６であってよく、ｎは、１、２、３、または４であってよく、ｎは１であってよく、ｎは２であってよく、ｎは３であってよく、ｎは４であってよい］。
Ｐ１ｐを理想的には、ペプチド、タンパク質、低分子、核酸、またはアプタマーなどのターゲティング分子の連結残基（ＴＡ連結残基）への特異的な方向性共有結合的連結戦略が可能となるように選択する。例えば、ＴＡ連結残基が求核性基を含む場合、Ｐ１ｐは、求電子基であってよく、逆も同様である。例えば、ＴＡ連結残基の側鎖が、Ｋ、Ｈ、Ｙ、オルニチン、Ｄａｐ、またはＤａｂなどのアミン基を含む場合、Ｘｐは、ＣＯＯＨ、または他の同様の反応性求電子試薬であってよい。ＴＡ連結残基がＤまたはＥである場合、Ｐ１ｐは、アミン基などの求核性基を含むことができる。これらの戦略のいずれかは、アミド結合形成戦略によって、Ｐ１ｐ基とＴＡ連結残基との間に共有結合が形成されることを可能にする。ＴＡ連結基がアミン基である場合、Ｐ１ｐは、下式：
Figure 2015504893
 を含み得る。
Ｐ１は、場合によって存在する生物学的に適合性のポリマーまたはブロックコポリマーであってよい。Ｐ１は、以下の構造式：
Figure 2015504893
 ［式中、ｐは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、３２、４３、４４、または４５であり、ｗ、ｒ、およびｓはそれぞれ独立に、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０であり、Ｒｂは、出現する毎に独立に、水素、置換もしくは非置換のＣ１〜１０アルキル、置換もしくは非置換のＣ３〜７シクロアルキル−Ｃ１〜６アルキル、または置換もしくは非置換のアリール−Ｃ１〜６アルキルである］のものであってよい。
ＴＡ連結残基がＣ、Ｃの同族体、または他のチオール基含有残基である場合、Ｐ１ｐは、マレイミド基（または同様のもの）を含むことができ、チオール−マレイミド付加反応戦略がＰ１ｐ基をＴＡ連結残基に共有結合的に連結させることを可能にする。一部の態様では、Ｐ１ｐは、チオール基を含むこともでき、ＴＡ連結残基とＰ１ｐ基との間にジスルフィド橋が形成されることを可能にする。一部の態様では、Ｐ１ｐは、マレイミド：
Figure 2015504893
 ［式中、矢印は、ターゲティング分子への結合点を示し、平行線は、リンカーのＱ１基への結合部を表す］であってよい。ターゲティング分子への結合点がシステイン残基または他のチオール保有側鎖を含む場合、コンジュゲーションの機構は、以下：
Figure 2015504893
 のとおりであってよい。
一部の態様では、Ｐ１ｐ基は、置換のマレイミド：
Figure 2015504893
 を含む。
一部の態様では、Ｐ１は、
Figure 2015504893
 ［式中、ｖおよびｗは、Ｘ１の主鎖長さが６〜１２原子であるように選択される］である。
一部の態様では、ＴＡ−リンカーは、下式：
Figure 2015504893
 ［式中、ｎ＝１、または２、または３、または４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｎは、１、２、３、４、５、または６であってよく、ｎは１であってよく、ｎは２であってよく、ｎは３であってよく、ｎは４であってよい］のものである。ｍは存在しなくてよい。ｍは存在してよい。
一部の態様では、ＴＡ−リンカーは、下式：
Figure 2015504893
 ［式中、ｎ＝１、または２、または３、または４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｎは、１、２、３、４、５、または６であってよく、ｎは１であってよく、ｎは２であってよく、ｎは３であってよく、ｎは４であってよい］のものである。ｍは存在しなくてよい。ｍは存在してよい。
一部の態様では、ＣＡ−リンカーのＰ１部分を、本発明のＭＡＣのためのリンカーのＹ１、Ｘ１−Ｙ１、Ｙ１−ＺおよびＸ１−Ｙ１−Ｚ部分として使用することができる。
ペプチドおよびタンパク質
アシルリシンまたは
Ｋａｃ（ＡｃＫも）は、
Figure 2015504893
 を指し、ＫＳＨは、
Figure 2015504893
 を指し、Ａｉｂ（２−アミノイソ酪酸）は
Figure 2015504893
 を指す。
Figure 2015504893
一般的に、本明細書に記載の細胞および組織培養物、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子学、ならびにタンパク質および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して、かつその技術において使用する命名法は、当技術分野においてよく知られていて、一般に使用されるものである。本発明の方法および技術は一般的に、当技術分野においてよく知られていて、別段に示さない限り、本明細書を通じて引用および検討される様々な一般的で、より具体的な参考文献中に記載されているとおりの従来の方法によって行われる。本明細書で使用する場合、２０個の天然または従来のアミノ酸およびその略語は、ＩＵＰＡＣ１文字および３文字コードに従う。「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。本明細書で使用する場合、これらの用語は、１個または複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学類似体であるアミノ酸ポリマーに適用される。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーにも適用される。アミノ酸は、結合およびペプチドの他の所望の特性が維持されている限り、Ｌ型またはＤ型であってよい。ポリペプチドは、モノマー性またはポリマー性であってよい。
別段に、「Ｄ」接頭辞、例えば、Ｄ−ＡｌａもしくはＮ−Ｍｅ−Ｄ−Ｉｌｅによって示されていない限り、または小文字様式、例えば、ａ、ｉ、ｌ、（Ａｌａ、Ｉｌｅ、ＬｅｕのＤバージョン）で書かれていない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲において記載するペプチド中のアミノ酸およびアミノアシル残基のα炭素の立体化学は、天然か、または「Ｌ」配置である。
すべてのペプチド配列は、α−Ｎ末端アミノ酸残基が左にあり、α−Ｃ末端アミノ酸残基が右にある一般的に許容されている規則に従って書かれている。本明細書で使用する場合、用語「Ｎ末端」は、ペプチド中のアミノ酸の遊離α−アミノ基を指し、用語「Ｃ末端」は、ペプチド中のアミノ酸の遊離α−カルボン酸末端を指す。１つの基でＮ終結したペプチドは、Ｎ末端アミノ酸残基のα−アミノ窒素上に１つの基を保有するペプチドを指す。１つの基でＮ終結したアミノ酸は、α−アミノ窒素上に１つの基を保有するアミノ酸を指す。
本明細書で使用する場合、「ハロ」、「ハロゲン」、または「ハライド」は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩを指す。
本明細書で使用する場合、「生物学的活性」は、化合物、組成物、もしくは他の混合物のｉｎ ｖｉｖｏ活性、または化合物、組成物、もしくは他の混合物をｉｎ ｖｉｖｏ投与すると生じる生理学的反応を指す。したがって、生物学的活性は、このような化合物、組成物、および混合物の治療作用、診断作用および医薬活性を包含する。
用語「生物学的に適合性」は、本明細書で使用する場合、細胞内および細胞外の生物学的分子と生物学的に不活性または非反応性であり、非毒性である何らかの物を意味する。
単独か、または他の用語の部分としての用語「アルキル」は、示されている数の炭素原子を有する直鎖または分枝の飽和炭化水素を指す（例えば、「Ｃ１〜Ｃ８」アルキルは、１〜８個の炭素原子を有するアルキル基を指す）。炭素原子の数が示されていない場合、そのアルキル基は、１〜８個の炭素原子を有する。代表的な直鎖Ｃ１〜Ｃ８アルキルには、これらだけに限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチルおよびｎ−オクチルが包含され；分枝Ｃ１〜Ｃ８アルキルには、これらだけに限定されないが、−イソプロピル、−ｓｅｃ−ブチル、−イソブチル、−ｔｅｎｔ−ブチル、−イソペンチル、および−２−メチルブチルが包含され；不飽和Ｃ２〜Ｃ８アルキルには、これらだけに限定されないが、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニル、１−ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニルおよび３−メチル−１−ブチニルが包含される。
語句「置換アルキル」は、炭素（複数可）または水素（複数可）に対する１つまたは複数の結合が、これらだけに限定されないが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩなどのハライド中のハロゲン原子；ヒドロキシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、およびエステル基などの基中の酸素原子；チオール基、アルキルおよびアリールスルフィド基、スルホン基、スルホニル基、およびスルホキシド基などの基中の硫黄原子；アミン、アミド、アルキルアミン、ジアルキルアミン、アリールアミン、アルキルアリールアミン、ジアリールアミン、Ｎ−オキシド、イミド、およびエナミンなどの基中の窒素原子；トリアルキルシリル基、ジアルキルアリールシリル基、アルキルジアリールシリル基、およびトリアリールシリル基などの基中のケイ素原子；ならびに様々な他の基中の他のヘテロ原子などの非水素および非炭素原子への結合によって置き換えられているアルキル基を指す。置換アルキル基はまた、炭素（複数可）または水素（複数可）原子への１つまたは複数の結合が、カルボニル、カルボキシル、およびエステル基中の酸素；イミン、オキシム、ヒドラゾン、およびニトリルなどの基中の窒素などのヘテロ原子への結合によって置き換えられている基を包含する。置換アルキル基は、特に、炭素または水素原子への１つまたは複数の結合がフッ素原子への１つまたは複数の結合によって置き換えられているアルキル基を包含する。置換アルキル基の一例は、トリフルオロメチル基およびトリフルオロメチル基を含有する他のアルキル基である。他のアルキル基には、置換アルキル基が、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ基、またはヘテロシクリルオキシ基を含有するように、炭素または水素原子への１つまたは複数の結合が酸素原子への結合によって置き換えられているものが包含される。さらに他のアルキル基には、アミン、アルキルアミン、ジアルキルアミン、アリールアミン、（アルキル）（アリール）アミン、ジアリールアミン、ヘテロシクリルアミン、（アルキル）（ヘテロシクリル）アミン、（アリール）（ヘテロシクリル）アミン、またはジヘテロシクリルアミン基を有するアルキル基が包含される。
語句「非置換のアルキル」は、上記で定義したとおりの二価の非置換アルキル基を指す。したがって、メチレン、エチレン、およびプロピレンは、非置換のアルキレンのそれぞれの例である。語句「置換アルキル」は、上記で定義したとおりの二価の置換アルキル基を指す。置換または非置換の低級アルキレン基は、１〜約６個までの炭素を有する。
語句「非置換のシクロアルキル」は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルなどの環式アルキル基、ならびに上記で定義したとおりの直鎖または分枝鎖アルキル基で置換されたそのような環を指す。この語句には、これらだけに限定されないが、アダマンチル、ノルボルニル、およびビシクロ［２．２．２］オクチルなどの多環式アルキル基、さらには上記で定義したとおりの直鎖または分枝鎖アルキル基で置換されたそのような環も包含される。したがって、この語句は、特にメチルシクロヘキシル基を包含するであろう。この語句は、ヘテロ原子を含有する環式アルキル基を包含しない。非置換のシクロアルキル基は、親化合物中の１個または複数の炭素原子（複数可）、酸素原子（複数可）、窒素原子（複数可）、および／または硫黄原子（複数可）に結合されていてよい。一部の実施形態では、非置換のシクロアルキル基は、３〜２０個の炭素原子を有する。他の実施形態では、そのような非置換のアルキル基は、３〜８個までの炭素原子を有する一方で、他では、そのような基は、３〜７個の炭素原子を有する。
語句「置換シクロアルキル」は、置換アルキル基が非置換アルキル基に対して有する意味と同じ意味を非置換シクロアルキル基に対して有する。したがって、この語句は、これらだけに限定されないが、オキソシクロヘキシル、クロロシクロヘキシル、ヒドロキシシクロペンチル、およびクロロメチルシクロヘキシル基を包含する。
単独か、または他の用語の一部としての用語「アリール」は、親芳香環系の単一の炭素原子から１個の水素原子を除去することによって誘導される６〜２０個の炭素原子の置換または非置換の一価炭素環式芳香族炭化水素ラジカルを意味する。典型的なアリール基には、これらだけに限定されないが、ベンゼン、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルなどから誘導されるラジカルが包含される。置換の炭素環式芳香族基（例えば、アリール基）は、以下の基：Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＨ、ハロゲン、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ’）、−Ｎ（Ｒ’）２、および−ＣＮのうちの１個または複数、好ましくは１〜５個で置換されていてよく、ここで、各Ｒ’は、−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、および非置換アリールから独立に選択される。一部の実施形態では、置換の炭素環式芳香族基は、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＮＨＣＯＮＨ２、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’、および−ＳＲ’のうちの１個または複数をさらに包含することができる。「アリーレン」は、対応する二価部分である。
用語「置換アルキル」は、１個または複数の水素原子がそれぞれ独立に、置換基で置き換えられているアルキルを意味する。典型的な置換基には、これらだけに限定されないが、−Ｘ、−Ｒ、−Ｏ−、−ＯＲ、−ＳＲ、−Ｓ−、−ＮＲ２、−ＮＲ３、＝ＮＲ、−ＣＸ３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ２、＝Ｎ２、−Ｎ３、−ＮＲＣ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、−ＳＯ３ −、−ＳＯ３Ｈ、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ、−ＯＳ（＝Ｏ）２ＯＲ、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）２、−ＰＯ３ ２−、ＰＯ３Ｈ２、−ＡｓＯ２Ｈ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｘ、−Ｃ（＝Ｓ）Ｒ、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯ２ −、−Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ２、または−Ｃ（＝ＮＲ）ＮＲ２、が包含され、ここで、各Ｘは独立に、ハロゲン：−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉであり、各Ｒは独立に、−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロアルキル、Ｃ６〜Ｃ２０アリール、Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクリル、保護基、またはプロドラッグ部分である。上記のとおりのアリール、アルキレン、およびヘテロアルキレン基はまた、同様に置換されていてよい。
単独か、または他の用語の一部としての用語「アラルキル」は、上記で定義したとおりのアリール基で置換されている上記で定義したとおりのアルキル基を意味する。
単独か、または他の用語の一部としての用語「アルキレン」は、規定の数の炭素原子、典型的には１〜１８個の炭素原子からなり、親アルカンの同じか、または２個の異なる炭素原子から２個の水素原子を除去することによって誘導される２つの一価ラジカル中心を有する飽和の分枝または直鎖または環式炭化水素ラジカルを指す。典型的なアルキレンラジカルには、これらだけに限定されないが：メチレン（−ＣＨ２−）、１，２−エチレン−ＣＨ２ＣＨ２−）、１，３−プロピレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、１，４−ブチレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）などが包含される。「Ｃ１〜Ｃ１０」直鎖アルキレンは、式−（ＣＨ２）１〜１０−の直鎖の飽和炭化水素基である。Ｃ１〜Ｃ１０アルキレンの例には、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン、ノニレン、およびデカレンが包含される。
単独か、または他の置換基の一部としての用語「ヘテロアルキレン」は、ヘテロアルキル（上記で検討したとおりの）から誘導される二価基を意味する。ヘテロアルキレン基では、ヘテロ原子はまた、鎖の末端の一方または両方を占めていてよい。
単独か、または他の用語の一部としての用語「Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクリル」は、３〜８個の炭素原子（環員とも称される）およびＮ、Ｏ、Ｐ、またはＳから独立に選択される１〜４個のヘテロ原子環員を有し、親環系の環原子から１個の水素原子を除去することにより誘導される一価の置換または非置換芳香族または非芳香族単環式、二環式、または三環式環系を指す。ヘテロシクリル中の１個または複数のＮ、Ｃ、またはＳ原子は、酸化していてよい。ヘテロ原子を包含する環は、芳香族または非芳香族であってよい。別段に特記されていない限り、ヘテロシクリルは、安定な構造をもたらす任意のヘテロ原子または炭素原子で、そのペンダント基に結合されている。Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクリルの代表的な例には、これらだけに限定されないが、テトラヒロフラニル（ｔｅｔｒａｈｙｒｏｆｕｒａｎｙｌ）、オキセタニル、ピラニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ベンゾフランニル、ベンゾチオフェン、インドリル、ベンゾピラゾリル、ピロリル、チオフェニル（チオペン）、フラニル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、キノリニル、ピリミジニル、ピリジニル、ピリドニル、ピラジニル、ピリダジニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、およびテトラゾリルが包含される。Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクリルは、これらだけに限定されないが、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８ヘテロアルキル、−ＯＲ’、アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、ハロゲン、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ’）、−Ｎ（Ｒ’）２および−ＣＮを包含する７個までの基で置換されていてよく、ここで、各Ｒ’は、−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８ヘテロアルキル、およびアリールから独立に選択される。一部の実施形態では、置換ヘテロシクリルには、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＮＨＣＯＮＨ２、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’、および−ＳＲ’のうちの１個または複数も包含され得る。「ヘテロシクロ」は、対応する二価部分である。
単独か、または他の用語の一部としての用語「Ｃ３〜Ｃ８カルボシクリル」は、親環系の環原子から１個の水素原子を除去することにより誘導される３員、４員、５員、６員、７員、または８員の一価の置換または非置換、飽和または不飽和の非芳香族単環式または二環式炭素環である。代表的なＣ３〜Ｃ８カルボシクリルには、これらだけに限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンタジエニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、１，３−シクロヘキサジエニル、１，４−シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、１，３−シクロヘプタジエニル、１，３，５−シクロヘプタトリエニル、シクロオクチル、シクロオクタジエニル、ビシクロ（１１１）ペンタン、およびビシクロ（２２２）オクタンが包含される。Ｃ３〜Ｃ８カルボシクリル基は、非置換であるか、または、これらに限られないが、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８ヘテロアルキル、−ＯＲ’、アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、−ＯＨ、−ハロゲン、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｒ’）、−Ｎ（Ｒ’）２および−ＣＮを包含する７個までの基で置換されていてよく、ここで、各Ｒ’は、−Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８ヘテロアルキル、およびアリールから独立に選択される。「Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ」は、対応する二価部分である。
単独か、または他の用語の一部としての用語「ヘテロアラルキル」は、上記で定義したとおりの芳香族ヘテロシクリル基で置換されている上記で定義したとおりのアルキル基を意味する。ヘテロアラルクロ（ｈｅｔｅｒｏａｒａｌｃｌｏ）は、対応する二価部分である。
「約」または「ほぼ」は、測定可能な数値の変数に関連して使用する場合、示されているその変数値と、示されている値の実験誤差の範囲内（例えば、平均に対して９５％の信頼区間の範囲内）または示されている値の１０パーセントの範囲内であり、いずれにせよより大きなすべての変数値とを指す。
本明細書で使用する場合、「接続鎖」または「鎖」は、免疫グロブリンドメインの個々のβストランドを接続するβストランド以外の任意の三次構造形態にあるアミノ酸の配列を指す。この用語には、αへリックス、ターン、ループ、およびβヘアピンの構造モチーフが包含される。用語「αへリックス」、「ターン」、「ループ」、および「βヘアピン」は、これら４つの別個の三次元構造モチーフを識別し得るように、当技術分野においてこれらに一般に与えられている意味を有する。
用語「同一性」は、当技術分野で知られているとおり、配列を比較することによって決定されるとおりの、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列の間の関係を指す。当技術分野では、「同一性」はまた、場合によって、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の列をマッチすることによって決定されるとおりの、ポリペプチドまたは核酸分子配列の間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、コンピュータプログラムの特定の数学的モデル（すなわち、「アルゴリズム」）によってアドレスされたギャップアラインメントを有する２つ以上の配列の間の同一マッチのパーセントを測定するものである。
用語「類似性」は、「同一性」と関連する概念であるが、「同一性」とは対照的に、同一マッチおよび保存的置換マッチの両方を包含する類似性の測度を指す。保存的置換はポリペプチドには当てはまるが、核酸分子には当てはまらないので、類似性は、ポリペプチド配列の比較のみを扱う。２つのポリペプチド配列が、２０のうち１０は同一のアミノ酸を有し、残りはすべて非保存的置換である場合、同一性および類似性のパーセントは両方とも、５０％であろう。同じ例で、保存的置換が存在する位置が５つ超である場合、同一性パーセントは５０％のままであるが、類似性パーセントは７５％になるであろう（２０のうち１５）。したがって、保存的置換が存在する場合には、２つのポリペプチド配列の間での類似度は、それら２つの配列の間での同一性パーセントよりも高くなるはずである。
用語「保存的アミノ酸置換」は、その位でのアミノ酸残基の極性または電荷に対してほとんど作用しないか、または全く作用しないような非天然残基での天然アミノ酸残基の置換を指す。例えば、保存的置換は、ポリペプチド中の非極性残基の、任意の他の非極性残基での置き換えから生じる。
構造的アラインメント
タンパク質および時にはＲＮＡ配列に通常は特異的な構造的アラインメントでは、配列をアラインさせる際の助けとなるように、タンパク質またはＲＮＡ分子の二次および三次構造についての情報を使用する。これらの方法は、２つ以上の配列のために使用され、典型的にはローカルアラインメントをもたらす；しかしながら、これらは、構造情報の利用可能性に依存しているので、その対応する構造が既知（通常は、Ｘ線結晶学またはＮＭＲ分光法によって）である配列でしか使用することができない。タンパク質およびＲＮＡ構造は両方とも、配列よりも進化的に保存されているので、非常に離れた関連を有し、配列を比較しても、その類似性を確かに検出することができないほど広範に異なっている配列の間では、構造的アラインメントは、より信頼性が高くなり得る。タンパク質の一方について利用可能な構造データが存在しない場合でも、構造データが一方について、または好ましくは、種を超えた免疫グロブリン、特に種およびサブタイプを超えた抗体定常ドメインなどの、より近い関連タンパク質について利用可能であるならば、比較を行うことができる。
構造的アラインメントは、相同性をベースとするタンパク質の構造予測のためにアラインメントを評価する際に「ゴールドスタンダード」として使用される。それというのも、構造的アラインメントは、配列情報に専ら頼るよりもむしろ、構造的に類似しているタンパク質配列の領域を明確にアラインするためである。
ＤＡＬＩ法または距離マトリックスアラインメント（ｄｉｓｔａｎｃｅ ｍａｔｒｉｘ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）は、問い合わせ配列中の連続ヘキサペプチドの間での接触類似性パターン（ｃｏｎｔａｃｔ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｐａｔｔｅｒｎｓ）に基づき構造的アラインメントを構築するための、断片をベースとする方法である。これは、対アラインメントまたは多重アラインメントを発生させ、問い合わせ配列の構造的隣接体（ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ）をＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）において同定することができる。これは、ＦＳＳＰ構造的アラインメントデータベース（Ｆｏｌｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、またはＦａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ Ｓｉｍｉｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を構築するために使用されている。ＤＡＬＩウェブサーバには、ＥＢＩ ＤＡＬＩからアクセスすることができ、ＦＳＳＰは、Ｔｈｅ Ｄａｌｉ Ｄａｔａｂａｓｅにある。
ＳＳＡＰ（連続構造アラインメントプログラム）は、構造空間における原子−対−原子ベクトル（ａｔｏｍ−ｔｏ−ａｔｏｍ ｖｅｃｔｏｒｓ）を比較点として使用する構造的アラインメントの、ダイナミックプログラミングをベースとする方法である。これは、そのオリジナルの記載以来、多重アラインメント、さらには対アラインメントを包含するように拡張されており、タンパク質フォールドのＣＡＴＨ（クラス（Ｃｌａｓｓ）、構造（Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）、トポロジー（Ｔｏｐｏｌｏｇｙ）、ホモロジー（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ））階層型データベース分類を構築する際に使用されている。ＣＡＴＨデータベースには、ＣＡＴＨ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎからアクセスすることができる。
構造的アラインメントの組合せ拡張法は、解析される２つのタンパク質の短い断片をアラインさせるためにローカルなジオメトリを使用することによって、一対の構造的アラインメントを生成し、次いで、これらの断片を集成して、より大きなアラインメントにする。剛体二乗平均距離（ｒｉｇｉｄ−ｂｏｄｙ ｒｏｏｔ ｍｅａｎ ｓｑｕａｒｅ ｄｉｓｔａｎｃｅ）、残基距離、ローカル二次構造、および残基隣接体の疎水性などの周囲環境特徴などの測度に基づき、「アラインされた断片対」と呼ばれるローカルアラインメントが生成され、事前定義されたカットオフ基準内で可能な構造的アラインメントのすべてを表す類似性マトリックスを作るために使用される。次いで、１つのタンパク質構造状態から他のタンパク質構造状態への経路が、マトリックスを介して、成長中のアラインメントを一度に１つの断片で拡張することによって追跡される。最適なそのような経路によって、組合せ拡張アラインメントが画定される。方法を実行し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋにおいて構造の対アラインメントのデータベースを提供するウェブベースのサーバは、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎのウェブサイトにある。
配列アラインメント
例えば、標的配列ＮＭＲまたは結晶構造データが存在しないことによって、本発明の配列との構造的アラインメントが不可能である場合には、配列アラインメントを使用することができる。当業者は、配列アラインメントツール（本明細書に記載のものなど、当業者に知られているＢＬＡＳＴ、ＣＬＵＳＴＡＬなど）を熟知しており、既知の構造モチーフに従って、特に、免疫グロブリンドメイン、抗体、および抗体定常ドメインについての、特にサブタイプおよび種を超えて既に存在する多数の例示的な構造的研究によって、配列を、特に、抗体定常ドメイン配列をアラインさせることができる。
配列アラインメントのためのコンピュータによる手法は一般的に、グローバルアラインメントおよびローカルアラインメントの２つのカテゴリーに分類される。グローバルアラインメントの計算は、アラインメントがすべての問い合わせ配列の全長さに及ぶことを「強制する」グローバル最適化の一形態である。対照的に、ローカルアラインメントは、全体では多くの場合に大きく異なる長い配列内における類似性の領域を同定する。ローカルアラインメントが多くの場合に好ましいが、これは、類似性の領域を同定する追加的なチャレンジによって、計算がより困難であり得る。様々なコンピュータアルゴリズムが、配列アラインメントの問題に適用されている。これらには、ダイナミックプログラミングのような速度は遅いが、形式上は正しい方法、また、ベストマッチを見出すことを保証するものではない大規模データベースサーチのために設計された効率的な発見的アルゴリズムまたは確率法が包含される。
問い合わせセット中の配列が類似していて、ほぼ等しいサイズを有する場合には、あらゆる配列中のあらゆる残基をアラインさせることを試みるグローバルアラインメントが最も有用である。一般的なグローバルアラインメント技術は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムであり、これは、ダイナミックプログラミングに基づく。それらの比較的大きな配列文脈内に類似性の領域または類似の配列モチーフを含有すると推測される非類似の配列では、ローカルアラインメントが、より有用である。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムは、これもダイナミックプログラミングに基づく一般的なローカルアラインメント法である。
２つの問い合わせ配列の区分的（ローカル）アラインメントまたはグローバルアラインメントのベストマッチングを見出すためには、対配列アラインメント法が使用される。対アラインメントを生成する３つの主な方法は、ドットマトリックス法、ダイナミックプログラミング、およびワード法（ｗｏｒｄ ｍｅｔｈｏｄｓ）であるが；しかしながら、多重配列アラインメント技術も、配列対をアラインさせることができる。各方法は、その個々の強みおよび弱みを有するが、情報内容の少ない高度に反復性の配列では、特に、反復回数が、アラインさせる２つの配列において異なる場合には、３つの対方法はすべて困難を伴う。所与の対アラインメントの有用性を定量化する１つの方法は、「最大ユニークマッチ（ｍａｘｉｍｕｍ ｕｎｉｑｕｅ ｍａｔｃｈ）」（ＭＵＭ）であるか、または両方の問い合わせ配列中に生じている最長部分配列である。典型的には、より長いＭＵＭ配列ほど、より近い関連性を反映している。同一性および／または類似性を決定するための好ましい方法は、試験される配列の間で最大のマッチが得られるように設計されている。同一性および類似性を決定するための方法は、公に利用可能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。２つの配列の間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法には、これらだけに限定されないが、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０（１９９０））を包含するＧＣＧプログラムパッケージが包含される。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給元（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ（ＮＣＢ ＮＬＭ ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、前出）から公に利用可能である。よく知られているＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも、同一性を決定するために使用することができる。
例として、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）を使用して、配列同一性パーセントを決定すべき２つのポリペプチドを、それらの個々のアミノ酸が最適にマッチングするようにアラインさせる（アルゴリズムによって決定される「マッチドスパン（ｍａｔｃｈｅｄ ｓｐａｎ）」）。ギャップオープニングペナルティー（平均ダイアゴナルの３倍と計算される；「平均ダイアゴナル」は、使用される比較マトリックスのダイアゴナルの平均であり；「ダイアゴナル」は特定の比較マトリックスによる、それぞれ完全なアミノ酸マッチに割り当てられるスコアまたは数である）およびギャップエクステンションペナルティー（通常、ギャップオープニングペナルティーの０．１倍である）、さらには、ＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２などの比較マトリックスを、アルゴリズムと一緒に使用する。ポリペプチド配列の比較のための好ましいパラメーターには、以下が包含される：アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜５３（１９７０）。比較マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ ６２、Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５〜１９（１９９２）。
Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ９、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ、１９９７に提示されているものを包含する、他の例示的なアルゴリズム、ギャップオープニングペナルティー、ギャップエクステンションペナルティー、比較マトリックス、類似性の閾値なども、当業者によって使用され得る。成されるべき特定の選択は、ＤＮＡとＤＮＡ、タンパク質とタンパク質、タンパク質とＤＮＡなどの成されるべき具体的な比較；加えて、その比較が所与の配列対の間のものであるか（この場合、ＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが一般的に好ましい）、または１つの配列と、大きな配列データベースとの間のものであるか（この場合、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）に左右されるはずである。
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図１Ａ：質量分析法によるＭＡＣのインタクトな分子量分析は、複数のペプチドが抗ＩＧＦ１Ｒ抗体２．１２．１．ｆｘに結合されていることを実証している。抗ＩＧＦ１Ｒ抗体２．１２．１．ｆｘの質量分析データである。 図１Ｂ：ＭＡＣ−２の質量分析データであり、３つの個別のロットの反復実験を示している。 図１Ｃ：ＭＡＣ−２の質量分析データであり、３つの個別のロットの反復実験を示している。 図１Ｄ：ＭＡＣ−２の質量分析データであり、３つの個別のロットの反復実験を示している。 図２Ａ：２．１２．１．ｆｘ（ＩＧＦ１Ｒ）および３ロットのＭＡＣ−２（ＭＡＣ）の質量分析データであり、ここで、ジスルフィド結合は還元されている。２．１２．１．ｆｘ（ＩＧＦ１Ｒ）、軽鎖の質量分析データである。 図２Ｂ：２．１２．１．ｆｘ（ＩＧＦ１Ｒ）、重鎖の質量分析データである。 図２Ｃ：ＭＡＣ−２の軽鎖、ロット１の質量分析データである。 図２Ｄ：ＭＡＣ−２の重鎖、ロット１の質量分析データである。 図２Ｅ：ＭＡＣ−２の軽鎖、ロット２の質量分析データである。 図２Ｆ：ＭＡＣ−２の重鎖、ロット２の質量分析データである。 図２Ｇ：ＭＡＣ−２の軽鎖、ロット３の質量分析データである。 図２Ｈ：ＭＡＣ−２の重鎖、ロット３の質量分析データである。 図３Ａ：黒丸で記述されたキモトリプシン開裂部位を伴う抗体２．１２．１．ｆｘの軽鎖のアミノ酸配列である。Ｌｙｓ残基（潜在的なコンジュゲーションの部位）を含有するキモトリプシン断片は、Ｎ末端からの番号によって標識されている。軽鎖のＹ１５断片は、下線を引かれている。 図３Ｂ：黒丸で記述されたキモトリプシン開裂部位を伴う抗体２．１２．１．ｆｘの重鎖のアミノ酸配列である。Ｌｙｓ残基（潜在的なコンジュゲーションの部位）を含有するキモトリプシン断片は、Ｎ末端からの番号によって標識されている。 図４Ａ：コンジュゲートされたリシン含有ペプチド：軽鎖Ｙ１５の質量分析データであり、コンジュゲートされていない抗ＩＧＦ１Ｒ抗体２．１２．１．ｆｘ（ＩＧＦ１ｒ）およびＭＡＣ−２（ＭＡＣ）についての質量分析データ、さらにはＹ１５断片の代表を示している。 図４Ｂ：コンジュゲートされていない軽鎖Ｙ１５断片の質量分析データであり、コンジュゲートされていない抗ＩＧＦ１Ｒ抗体２．１２．１．ｆｘ（ＩＧＦ１ｒ）およびＭＡＣ−２（ＭＡＣ）に対する質量分析データ、さらにはＹ１５断片の代表を示している。 図５Ａ：２．１２．１．ｆｘのトリプシン断片についての、選択されたイオンのＬＣＭＳクロマトグラムのデータである。 図５Ｂ：ＬＣ−Ｋ１８８がＭＡＣ−２のＡＢＰで修飾された場合のトリプシン断片についての、選択されたイオンのＬＣＭＳクロマトグラムのデータである。 図６Ａ：２．１２．１．ｆｘのトリプシン断片についての、選択されたイオンのＬＣＭＳクロマトグラムのデータである。 図６Ｂ：ＬＣ−Ｋ１９０がＭＡＣ−２のＡＢＰで修飾された場合のトリプシンペプチドについての、選択されたイオンのＬＣＭＳクロマトグラムのデータである。 図７Ａ：インタクトなＭＡＣ−２の質量スペクトルである。 図７Ｂ：ＭＡＣ−２についての還元重鎖の質量スペクトルである。 図７Ｃ：ＭＡＣ−２についての還元軽鎖の質量スペクトルである。 図８Ａ：ｍ３８ｃ２、ｈ３８ｃ２、およびヒト生殖細胞系の可変ドメインのアミノ酸配列アラインメントである。フレームワーク領域（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｋａｂａｔらに従って画定されている。アステリスクが、ｍ３８ｃ２とｈ３８ｃ２との、またはｈ３８ｃ２とヒト生殖細胞系との相違を明示している。 図８Ｂ：マウス定常軽鎖カッパ領域（ｍＣＬκ）、ヒト定常軽鎖カッパ領域（ｈＣＬκ）、およびヒト定常軽鎖ラムダ領域（ｈＣＬλ）のアミノ酸配列アラインメントである。ｍＣＬκとｈＣＬκとの；およびｈＣＬκとｈＣＬλとの相違はアステリスクとして示されており、保存置換は、十字記号として示されている。βストランドＡ〜Ｇは下線を引かれている。βストランドＡとＢとの間のターンおよびβストランドＥとＦとの間のαへリックスはそれぞれ、イタリック体で示されている。第１のβシート（βストランドＡＢＤＥから構成；一重下線）と第２のβシート（βストランドＣＧＦから構成、二重下線）との間にジスルフィド結合を形成するシステインは、§によって示されている。ヒト配列における既知の多型遺伝子座は太字で示されている。 図９Ａ：トラスツズマブ、および［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］とのトラスツズマブ−［ＣＬκ−Ｄ１８５Ａ］コンジュゲーション生成物の、ＨＥＲ２受容体結合についての結合ＥＬＩＳＡデータである。 図９Ｂ：ＭＭＡＤ毒素へのトラスツズマブおよびトラスツズマブ−［ＣＬκ−Ｄ１８５Ａ］コンジュゲーション生成物の、ＨＥＲ２受容体結合についての結合ＥＬＩＳＡデータである。 図１０Ａ：２つのβシートを形成する７つのβストランドを示す定常Ｉｇドメインの表示である。 図１０Ｂ：βシートＥとＦとの間のαへリックスの拡大図である。 ＣＬκの、結晶構造をベースとする最小化リボン表示（ｍｉｎｉｍｉｚｅｄ ｒｉｂｂｏｎ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）であり、ハロ−フェニルエステル反応性「結合部位」（スモールジャック（ｓｍａｌｌ ｊａｃｋ））を、３Ｄ構造によって作成される全体立体的「結合ポケット」内に示している。βストランドは標識されている。 ＣＬκ「結合ポケット」の、結晶構造をベースとする最小化リボン表示であり、ＣＬκ−Ｄ７７およびＣＬκ−Ｄ４３を（スティックモデルとして）ＣＬκ−Ｈ８１ ＮεまたはＮδとの水素結合、および原子間距離Åにおいて示している。 図１３Ａ：ＣＬκおよびＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異体「結合ポケット」の結晶構造をベースとする最小化リボン表示である。ＣＬκ−Ｄ４３のカルボニル酸素とＣＬκ−Ｈ８１のＮδとの間の距離は、ＣＬκとＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異体とで１Å異なり、ＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異体における触媒活性なＣＬκ−Ｈ８１互変異性体Ｎδの優勢を指し示している。加えて、このモデリングは、図に表されているＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異体におけるポケットの全体サイズの明確な増大を同定している。 図１３Ｂ：ＣＬκおよびＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異体「結合ポケット」の結晶構造をベースとする最小化リボン表示である。ＣＬκ−Ｄ４３のカルボニル酸素とＣＬκ−Ｈ８１のＮδとの間の距離は、ＣＬκとＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異体とで１Å異なり、ＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異体における触媒活性なＣＬκ−Ｈ８１互変異性体Ｎδの優勢を指し示している。加えて、このモデリングは、図に表されているＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異体におけるポケットの全体サイズの明確な増大を同定している。 図１３Ｃ：互いに重ね合わせたＣＬκ（灰色）およびＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異体（黒色）の「結合ポケット」の、結晶構造をベースとするリボン表示である。ＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異体では、ＣＬκ−Ｄ７７ＡがＣＬκ−Ｈ８１のＮεと水素結合を形成することができないので、ＣＬκ−Ｈ８１は、水素結合の相互作用によってＣＬκ−Ｄ４３の方へシフトしている。 ＣＬκ「結合ポケット」の、結晶構造をベースとする最小化リボン表示である。結合部位は、スモールジャックとして示されている。入ってくるハロ−フェニルエステル基質に関して最適な位置にイミダゾール環を保持する、ＣＬκ−Ｈ８１とのπ電子スタッキング相互作用が示されている。 図１５Ａ：ＣＬκおよびＣＬλ「結合ポケット」の、結晶構造をベースとする最小化リボン表示である。ＣＬκ−Ｈ８１イミダゾール環およびＮε電子対を、触媒反応中の求核的攻撃に必要な平面に維持することを援助する、ＣＬκ−Ｖ４２とＣＬκ−Ｈ８１との間のπ電子相互作用を示している。ＣＬκ−Ｈ８１イミダゾール環の中心と、ＣＬκ−Ｖ４２上の水素原子それぞれとの間の距離は、２．８Åであり、強い相互作用を可能にしている。 図１５Ｂ：ＣＬκおよびＣＬλ「結合ポケット」の、結晶構造をベースとする最小化リボン表示である。ＣＬλ−Ａ４９がＣＬλ−Ｈ８２（比較を明瞭にする目的のために、図中ではＨ８１として同定されている）から４．２Åの距離で示されている。この距離は、ＣＬλ−Ｈ８２の位置または互変異性型に有意な影響を有するには遠すぎる可能性があるとモデリングされている。 ｈＣＨλ１、ｈＣＨλ２、ｈＣＨλ３、ｈＣＬκ、およびｈＣＬλの配列アラインメントである。ＣＬκのβストランドは、下線を引いた領域に示されている。αへリックスはイタリック体で示されている。 最小化３Ｄ相同性によるｈＣＨλ１、ｈＣＨλ２、ｈＣＨλ３、ｈＣＬκ、およびｈＣＬλの配列の、結晶構造をベースとするアラインメントである。βストランドは、囲った領域として示されており、αへリックスは、波形の囲み内に示されている。ＣＬκ−Ｖ４２、ＣＬκ−Ｄ４３、ＣＬκ−Ｄ７７、ＣＬκ−Ｋ８０、およびＣＬκ−Ｈ８１に対応する重要な残基は、配列の間に垂直に延びる長方形の点線の囲みで同定されている。このアラインメントを発生させたドメインの結晶構造モデリングは、ｈＣＨλ１、ｈＣＨλ２、ｈＣＨλ３、およびｈＣＬλドメインにおけるＤ βストランドの短い破断を示唆した。他のモデリングおよび結晶構造分析は、すべてではないが多くの抗体定常ドメインが７つのβストランドを含み、Ｄ βストランドが連続していることを示している。したがって、ここでモデリングされている２つのＤ βストランドは、Ｄ’およびＤ”と示されている。ＣＬλおよびＣＨγドメインを図示している図１８Ｂ〜３１Ｂは、Ｄ βストランドが構造の左下方で下向きになっていて、Ｅ βストランドに向き合っているように配向されている。Ｄ’およびＤ”βストランドは一緒に、ＣＬκ Ｄ βストランドとほぼ同じ相対的位置を占めていることが分かる（判断基準として、図１８では、βストランドＤおよびＤ’、Ｄ’’が標識されている）。 ｈＣＬκ（Ａ）およびｈＣＬλ（Ｂ）ドメインの、結晶構造をベースとする最小化リボン表示である。 ｈＣＬκ（Ａ）およびＷＴ−ｈＣＨγ１（Ｂ）ドメインの、結晶構造をベースとする最小化リボン表示である。 ｈＣＬκ（Ａ）およびＷＴ−ｈＣＨγ１（Ｂ）ドメインの、結晶構造をベースとする最小化リボン表示であり、重要な残基の側鎖位置を示している。 ｈＣＬκ（Ａ）およびｈＣＨγ１−ｍ１−Ｄ４４変異体（Ｂ）ドメインの、結晶構造をベースとする最小化リボン表示であり、重要な残基の側鎖位置を示している。 ｈＣＬκ（Ａ）およびｈＣＨγ１−Ｔ７８Ｋ／Ｑ７９Ｈ／ＣＤループスワップ変異体（Ｂ）ドメインの、結晶構造をベースとする最小化リボン表示であり、重要な残基の側鎖位置を示している。 ｈＣＬκ（Ａ）およびＷＴ−ｈＣＨγ２（Ｂ）ドメインの、結晶構造をベースとする最小化リボン表示である。 ｈＣＬκ（Ａ）およびＷＴ−ｈＣＨγ２（Ｂ）ドメインの、結晶構造をベースとする最小化リボン表示であり、重要な残基の側鎖位置を示している。 ｈＣＬκ（Ａ）およびｈＣＨγ２ｍ変異体（Ｂ）ドメインの、結晶構造をベースとする最小化リボン表示であり、重要な残基の側鎖の位置を示している。 ｈＣＬκ（Ａ）およびｈＣＨγ２ｍ−Ｄ８２Ａ変異体（Ｂ）ドメインの、結晶構造をベースとする最小化リボン表示であり、重要な残基の側鎖の位置を示している。 ｈＣＬκ（Ａ）およびＷＴ−ｈＣＨγ３（Ｂ）ドメインの、結晶構造をベースとする最小化リボン表示である。 ｈＣＬκ（Ａ）およびＷＴ−ｈＣＨγ３（Ｂ）ドメインの、結晶構造をベースとする最小化リボン表示であり、重要な残基の側鎖の位置を示している。 ｈＣＬκ（Ａ）およびｈＣＨγ３ｍ変異体（Ｂ）ドメインの、結晶構造をベースとする最小化リボン表示であり、重要な残基の側鎖の位置を示している。 ｈＣＬκ（Ａ）およびｈＣＨγ３ｍ ＣＤ／ＥＦ変異体（Ｂ）ドメインの、結晶構造をベースとする最小化リボン表示であり、重要な残基の側鎖の位置を示している。 ｈＣＬκ（Ａ）およびｈＣＨγ３ｍ ＣＤ／ＥＦ−ｍ２変異体（Ｂ）ドメインの、結晶構造をベースとする最小化リボン表示であり、重要な残基の側鎖の位置を示している。 図３２Ａ：ＣＨγ１、ＣＨγ２、およびＣＨγ３、それらの個々の変異体および提案変異体と、ＣＬκおよびＣＬλとのアラインメントである。 図３２Ｂ：ＣＨγ１、ＣＨγ２、およびＣＨγ３、それらの個々の変異体および提案変異体と、ＣＬκおよびＣＬλとのアラインメントである。
本発明がより良く理解され得るように、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、単に例示を目的としたものであり、いずれの手法によっても、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
コンジュゲーション付加（ＣＡ）、平均ＣＡの説明
質量分析法によってインタクトな質量測定を使用して、コンジュゲーション付加（ＣＡ）を抗体骨格で測定する。コンジュゲートすると、インタクトな生成物の全体質量は、コンジュゲートされたペプチド、毒素などの付加の質量および数の分だけ増大する。複数の付加が起こった場合、コンジュゲート形態の分布は質量スペクトルで観察され、各コンジュゲート形態の観察されたシグナル強度によって定量測定が得られる。この分析は常套的に表で、観察されたＣＡ形態すべてに対するパーセンテージとして、各ＣＡ形態を列挙することによって提示される。平均ＣＡ（例えば：骨格上に存在するＣＡの全体数）は、平均コンジュゲート負荷を説明する追加の値である。２つのコンジュゲート薬物生成物の例を以下に提供する。例１は、ＣＡの一様な分布を平均ＣＡ＝２．００個で有する。例２は、２ＣＡの存在にかなり偏った分布を、軽微な量の他のコンジュゲーション形態と共に有する。平均ＣＡは、これらの例の間で（２．１３個と２．００個とで）同様であるが；しかしながら、例１は、比較的多いコンジュゲーション形態からなるより不均一な生成物であり、例２は、主として２ＣＡを含有するより均一な生成物である。
Figure 2015504893
ジスルフィド結合が還元されて、遊離の軽鎖および重鎖が生じた後にも、同様の分析処理が、これらの抗体骨格において可能である。コンジュゲート軽鎖／重鎖のインタクトな質量の測定は、これらの個々のサブユニット上でのＣＡの位置についての情報を提供する。
ＣＬκ−Ｋ８０への方向性コンジュゲーションの説明
抗体骨格への薬物コンジュゲートの部位特異的結合を決定するために、ペプチドマップを生成する。ペプチドマップは、コンジュゲート薬物生成物のタンパク分解性消化後に生成するペプチドを詳細に特徴づけするためのタンパク質配列の分析である。タンパク質が消化されたら、生じたペプチドを、逆相液体クロマトグラフィーと質量分析検出（ＲＰＬＣ／ＭＳ）とによって分析する。ディスクリートな（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）アミノ酸残基におけるコンジュゲーション付加の存在は、コンジュゲートされていないペプチドと比較すると、対応する質量シフトとして観察される。このプロセスを、標的リシン残基に対してＰＦＰ反応性エステルを使用する複数のコンジュゲート付加でコンジュゲートされている複数の抗体で繰り返す（データは、以下に、かつ他にもその内容全体が本明細書に組み込まれているＷＯ２０１２００７８９６において提示されている）。これらの研究において、以下の観察が一致した：（１）コンジュゲート付加は、ＨＣよりもＬＣにおいてより頻繁に観察され、（２）ＣＬκ−Ｋ８０は、修飾される特に好ましい残基であり、（３）複数の他の位置も、ＬＣおよびＨＣの両方で修飾される；しかしながら、それぞれ別の部位が、低いレベルで修飾される。まとめると、ハロ−フェニルエステルコンジュゲーションは、ＣＬκ−Ｋ８０の好ましい修飾をもたらし、追加のコンジュゲーションは、複数の残基全体で低いレベルに分布している。この理由で、２コンジュゲート付加について高い％ＣＡ値をもたらすように、コンジュゲーションプロセスは一般的に最適化されるが、それというのも、このことによって、各ＬＣにおいて単一の位置で完全にコンジュゲートされている生成物が促進されるためである。０〜１コンジュゲートの高い％ＣＡレベルは好ましいＣＬκ−Ｋ８０修飾をもたらす一方で、これらのコンジュゲート形態は、かなりの量の未反応骨格も意味する。２個を大きく超える平均ＣＡ値を示す生成物は、ディスクリートな残基を標的としないコンジュゲート付加の存在を示唆している。ＨＣおよびＬＣを還元し、別々に分析すると、１ＣＡの％値は、単一のＬＣ種におけるコンジュゲーション％を示しており、したがって、ＣＬκ−Ｋ８０残基へのコンジュゲーション効率の信頼可能な指標である。
（実施例１）
本発明で使用されるペプチドの例示的な合成
Figure 2015504893
ペプチド−チオール−リンカー化合物の合成
Figure 2015504893
Ａｎｇ２結合ペプチド（ＡＢＰ；配列番号２７）（２８４ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を撹拌しながら、ジメチルホルムアミド（０．５ｍｌ）に溶かした。別に、Ｓ−トリチル−メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ、６２ｍｇ、約０．１２５ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４８ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）、およびＮ−メチルモルホリン（０．０２５ｍｌ、０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．５ｍｌ）中で、溶解するまで５分間撹拌した。ＡＢＰ溶液および活性化ＭＰＡ溶液を一緒に２時間混合した。反応の進行をＬＣＭＳによってモニタリングした。２時間後に、この溶液を、氷冷エーテル（４０ｍｌ）に徐々に加え、ＡＢＰ−Ｓ−トリチル−ＭＰＡ生成物を沈殿させた。白色の沈殿物を濾過によって収集し、次いで、乾燥させた。次いで、固体残渣をトリフルオロ酢酸のジクロロメタン中の溶液（１：１０、１０ｍｌ）に溶かし、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）（０．０５０ｍｌ）を加え、１時間撹拌した。この溶液を減圧下で蒸発させて薄黄色のオイルにし、次いで、粗製のチオールペプチドを、氷冷エーテルを加えることによって沈殿させた。生成物を遠心分離によって収集し、真空乾燥させた。残渣を５０％アセトニトリル水溶液に溶かし、次いで、凍結乾燥させて、粗製のチオールペプチド（ＨＰＬＣ分析によると純度約８０％）を得た。粗製のチオールペプチドを半分取ＨＰＬＣによって精製して、配列番号２７−ＫＳＨ １１を１４５ｍｇ得た。
Ａｎｇ−２−結合ペプチド−チオール中間体の生成
ペプチド鎖の組み立てを０．１ｍｍｏｌ規模で行った。使用した樹脂は、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−ＰＬ樹脂（１５０ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ／ｇ置換）であった。標準的なＦｍｏｃ化学プロトコルを使用して、ペプチドを組み立てた。Ｆｍｏｃの除去は、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３×５分間であり、すべての樹脂の洗浄ステップはＤＭＦを使用した。アミノ酸を組み込むために、各残基について、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＮＭＭ活性化を使用する１回のカップリングステップを２時間使用した。連結残基（ＫＳＨ）を、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎε−メルカプトプロピオン酸−Ｓ−Ｔｒｔ）−ＯＨとして組み込んだ。鎖を組み立てたら、Ｎ末端Ｆｍｏｃ基を除去し、ペプチド樹脂をアセチル化によってキャップした。最終の樹脂をＤＣＭで洗浄し、一晩真空中で乾燥させた。
保護基の加酸分解による（ａｃｉｄｏｌｙｔｉｃ）除去および樹脂からのペプチドの開裂は、ＴＦＡ／水／ジチオトレイトール／トリイソプロピルシラン（９０：４：４：２の比、５ｍｌ）のカクテルを２時間使用して達成した。溶液を樹脂から濾過し、樹脂をさらなる未希釈ＴＦＡ５ｍｌで洗浄した。合わせた濾液をシロップ状まで蒸発させ、次いで、氷冷エーテルの添加によって、白色の粉末を沈殿させた。粉末を遠心分離によって収集し、次いで、５０％アセトニトリル水溶液（２０ｍｌ）に溶かし、冷凍し、一晩凍結乾燥させた。
分取ＨＰＬＣカラムを、希ＴＦＡ水溶液およびアセトニトリルで事前平衡させた。粗製のＡＢＰ−チオール中間体（すなわち、ＫＳＨを連結残基として有するＡＢＰ）をＤＭＦ（３ｍｌ）に溶かし、次いで、カラムに吸着させ、アセトニトリルから希ＴＦＡへの勾配を適用することによって溶離した。質量（Ｍ＝１４６５）によって、画分を自動的に収集した。カラムからの溶離物をＵＶによってモニタリングし、得られた画分を分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。
（実施例２）
コンジュゲーション戦略
５種類の異なるコンジュゲーション戦略を、ペプチドを抗体にコンジュゲートさせるために考察した（例示的な構造は、配列番号２７−ＫＳＨ １１および２．１２．１．ｆｘを使用して示されている）（完全な詳細は、その内容全体が本明細書に組み込まれている２０１１年７月１１日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５３０９２の実施例において提示されている）。簡単には、ＮＨＳエステル、マレイミド、スクアリン酸エステル、ＡＺＤ、およびハロ−フェニルエステルをすべて、抗体への方向性コンジュゲーションを開発するための有望な機構として調査した。
Figure 2015504893
 ＮＨＳエステルが不活性カルボキシルに変換される場合に、ＮＨＳエステルは、遊離酸形態への変換が遅いという問題を被った。ＮＨＳエステルを用いると、多少の成功は得られるが、生じたＮＨＳ−エステルの水に対する不安定性によって、後続のコンジュゲーション反応へのその適用が限られるおそれがあると思われると結論づけられた。ＮＨＳ−ＰＥＧ２−ＭＡＬのさらなる試験を以下に示す（Ｚ＊基Ｚ１３を含む）。
スクアリン酸エチルは、遊離チオールにはよくコンジュゲートするが、タンパク質および抗体上の遊離アミンに対しては、ｐＨが９超でない限り不十分である。
一般に、マレイミド活性化ペプチドは、内因性チオール（遊離システイン側鎖から誘導される）または他の化学的手段によって、例えばＴｒａｕｔ試薬を介して導入されるチオールのいずれかを欠くタンパク質または抗体には十分にはコンジュゲートしなかった。
ＡＺＤは抗体アミノ基とゆっくりと反応し、ｐＨを７〜９に上昇させる試みは、低レベルのコンジュゲーションおよび高レベルのＡＺＤ加水分解をもたらした（表面リシンのｐＫａが約９．１〜１１．２であるので、その電荷を低下させることによって、抗体表面リシンの求核傾向を増大させるために）。
（実施例３）
ペンタフルオロフェニルエステル（ＰＦＰ）の合成
Figure 2015504893
本発明はまた、相対的に安定なエフェクター部分−リンカー複合体を形成するために、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ；Ｚ＊＝Ｚ１）エステルを使用することを提供する。この方法は、標準的なＨＰＬＣ法を使用して、ＰＦＰエステル加水分解をほとんど観察することなく、それ自体を精製することができる安定な活性化ペプチド生成物から容易に、ＰＦＰ基を溶液で導入することができるということにおいて、他の手法を上回るいくつかの利点を有する。
本発明は、化学選択性反応（チオール／マレイミド化学を使用して）によるか、またはペプチド側鎖とアミドを形成するが、他の末端は活性なエステルとして残す二重活性なエステル試薬を使用するかのいずれかによって、ＰＦＰなどの活性化エステル基をペプチド上の側鎖リシンに直接カップリンさせることができる合成経路を提供する。
一部の実施形態では、この戦略は、それぞれの酸がＰＦＰエステルとして活性化されているビス−酸（ｂｉｓ−ａｃｉｄ）ＰＥＧであってよい。多少の塩基が存在する有機溶液中で、ビス−ＰＦＰリンカーの末端は、リシンのＮ−ε−アミノ側鎖と必要な繋留点で反応して、安定なアミド連結を形成する一方で、他の末端は、他のＰＦＰ基を維持した。この戦略に伴う潜在的な問題の１つは、ペプチドが、リンカーのそれぞれの末端に存在するＰＦＰ部分のそれぞれに付加しているペプチドダイマーを形成する可能性である。一部の態様では、本発明は、それぞれのペプチドおよびビス−ＰＥＧ−ＰＦＰリンカーの化学量論および付加を変更することによってこの追加の問題を克服する。本発明によって提供される解決の１つは、ペプチドを超える過剰のリンカーが常に存在するように、過剰のビス−Ｐｆｐリンカーを溶液中に有し、ペプチドを溶液にゆっくりと加えることである。リンカーとペプチドとを約３．７：１から約４．３：１の比で、または一部の実施形態では、約４：１の比で有することによって、ダイマーが存在することなく、必要なＰＦＰ活性化ペプチドを合成することができる。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］のための合成スキームを、以下のスキーム３に示す。
［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］の合成
Figure 2015504893
 ビス−ｄＰＥＧ５−酸（１ｍｍｏｌ、３３８ｍｇ）を、無水のジクロロメタン（５ｍｌ）に溶かし、次いで、ペンタフルオロフェノール（２ｍｍｏｌ、３６８ｍｇ）を、ジシクロヘキシカルボジイミド（１ｍｍｏｌ、２０８ｍｇ）と共に加えた。溶液を室温で一晩撹拌した。この時間の後に、微細な白色のジシクロヘキシル尿素副産物を濾別し、濾液を蒸発乾固させて、淡黄色の軽油状物を得た。ＴＬＣおよびＨＰＬＣによる分析は、正しいＭＳ＝６７０を有する純粋な生成物を示した。生成物をさらに精製することなく、次のステップで使用した。生成物は−２０℃で数ヶ月間安定である。
配列番号２７（７３０ｍｇ）を、無水ジメチルホルムアミド（８ｍｌ）に溶かし、Ｎ−メチルモルホリン（０．０５ｍｌ）を加えた。未希釈のビス−ｄＰＥＧ５−ＯＰｆｐ試薬の一定分量（０．５ｍｌ）をガラスバイアル（２０ｍｌ）に入れた。激しく撹拌しながら、配列番号２７／ＮＭＭ溶液を、４×２ｍｌの一定分量でビス−ｄＰＥＧ５−ＯＰｆｐ試薬に２時間かけて加え、次いで、最終混合物をさらに１時間撹拌した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］生成物への転換の進行を分析用ＨＰＬＣによってモニタリングした。反応の終了時に、溶液を濾過し、１”Ｃ８カラムでの半分取ＨＰＬＣによって直接精製した。最も純粋な画分（分析用ＨＰＬＣによって＞９５％）を合わせ、凍結乾燥させて、最終［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］ペプチドリンカー生成物４００ｍｇ（収率４８％）を得た。同様の機構を、［ＰＦＰ−ＰＥＧ２−ＭＡＬ−ＫＳＨ １１−配列番号２７］を生成するために使用することができる（スキーム４を参照されたい）。
［ＰＦＰ−ＰＥＧ２−ＫＳＨ １１−配列番号２７］の合成
Figure 2015504893
 マレイミド−ｄＰＥＧ２−酸（３２８ｍｇ、１ｍｍｏｌ、Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）、ペンタフルオロフェノール（０．１０３ｍｌ、１ｍｍｏｌ、ＰＦＰ）、およびジシクロヘキシルカルボジイミド（２０６ｍｇ、１ｍｍｏｌ、ＤＣＣ）を無水ＤＣＭ（１０ｍｌ）に溶かし、室温で１時間撹拌した。形成した微細な白色の沈殿物（ＤＣＵ副産物）を濾過によって除去し、濾液を真空中で蒸発乾固させた。生成物を微細な白色の粉末として高い収量（４９０ｍｇ、定量的）で得た。純度は、分析用ＨＰＬＣによって＞９５％であった；ＭＳは［Ｍ＋Ｈ］＋＝４９５を示した。
配列番号２７−ＫＳＨ １１の試料（３０〜４０ｍｇ）を、無水のＤＭＦ（２ｍｌ）に溶かした。マレイミド−ＰＥＧ２−ＰＦＰ（２０ｍｇ）を、Ｎ−メチルモルホリン（５ｍＬ）と共に加えた。反応物を撹拌し、生成物形成の時間経過を追跡するためにＨＰＬＣによって室温でモニタリングした。出発ペプチドの、ＰＦＰ活性化ＡＢＰ生成物への完全な転換は、最初の２時間で観察された。溶液を濾過し、生成物のピークを、半分取ＨＰＬＣによって直接単離した。それぞれの場合に、凍結乾燥後、生成物を収率約４０％で単離した。
（実施例４）
抗体コンジュゲーション
ＭＡＣ−１およびＭＡＣ−２の例示的抗体−エフェクター部分コンジュゲートを、抗体２．１２．１．ｆｘ（配列番号１および配列番号２）をＡｎｇ２結合ペプチド（配列番号２７）とコンジュゲートさせることによって製造した。ＭＡＣ−１は、２．１２．１．ｆｘ−［ＰＥＧ２−ＭＡＬ−ＫＳＨ １１−配列番号２７］が得られるように、［ＰＦＰ−ＰＥＧ２−ＭＡＬ−ＫＳＨ １１−配列番号２７］にコンジュゲートされている２．１２．１．ｆｘを含み、ＭＡＣ−２は、２．１２．１．ｆｘ−［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］が得られるように、［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］にコンジュゲートされている２．１２．１．ｆｘを含む。
ＭＡＣ−１の生成
Figure 2015504893
ＭＡＣ−２の生成
Figure 2015504893
各ＭＡＣの試料中の２．１２．１．ｆｘ抗体１個当たりのペプチドコンジュゲーションの個数を計算した（表２を参照されたい）。
Figure 2015504893
（実施例５）
ＰＦＰベースのコンジュゲーションのための条件の最適化
特異的コンジュゲーションのために最適な反応条件を確立するために、一連のアッセイを実行した。それぞれの反応物のコンジュゲーションの終了時に、反応物をコハク酸塩およびグリシン緩衝液でクエンチして、ｐＨを約５．５に低下させ、あらゆる遊離ペプチドまたはペプチド／リンカーをクエンチした。エレクトロスプレー飛行時間型質量分析法検出を、続いて、サイズ排除クロマトグラフィーカラムを介しての塩および添加剤からのタンパク質の分離を使用して、ＭＡＣのインタクトな分子量（ＭＷ）を測定することによって、ＭＡＣ−２の分析を行った。
温度
２．１２．１．ｆｘ抗体を１８ｍｇ．ｍｌ−１に、ｐＨ７．７でリン酸緩衝液を用いて、０．０６Ｍのリン酸ナトリウムの最終濃度に調整した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、プロピレングリコール溶液中で１０ｍｇ．ｍｌ−１に再構成した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、２．１２．１．ｆｘ抗体に４．３：１のモル比で加え、１８、２２、または２５℃で２時間反応させた。結果を表３に示す。
Figure 2015504893
反応ｐＨ
２．１２．１．ｆｘ抗体を１８ｍｇ．ｍｌ−１に、ｐＨ６．５、６．７５、７．０、７．２５、７．５、７．７５、または８．０でリン酸緩衝液を用いて、０．０６Ｍのリン酸ナトリウムの最終濃度に調整した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、プロピレングリコール溶液中で１０ｍｇ．ｍｌ−１に再構成した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、２．１２．１．ｆｘに４．３：１のモル比で加え、２時間室温で反応させた。結果を表４に示す。
Figure 2015504893
２．１２．１．ｆｘを２ｍｇ．ｍｌ−１に、ｐＨ７．０、７．５、および８．０でＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて、０．０２Ｍの最終濃度に調整した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、ＤＭＳＯ中で１０ｍｇ．ｍｌ−１に再構成した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、２．１２．１．ｆｘに５：１のモル比で加え、室温で一晩反応させた。結果を表５に示す。コンジュゲーションのレベルは、ｐＨ８．０超で低下した。
Figure 2015504893
コンジュゲーション反応の継続時間
２．１２．１．ｆｘを１８ｍｇ．ｍｌ−１に、ｐＨ７．７でリン酸緩衝液を用いて、０．０６Ｍのリン酸ナトリウムの最終濃度に調整した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、プロピレングリコール溶液中で１０ｍｇ．ｍｌ−１に再構成した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、２．１２．１．ｆｘに４．３：１のモル比で加え、３０、６０、１２０、１８０、２４０、３００、または２４００分間、室温で反応させた（表６）。
Figure 2015504893
ペプチドとタンパク質のモル比
２．１２．１．ｆｘを１８ｍｇ．ｍｌ−１に、ｐＨ７．５でＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて、０．２ＭのＨＥＰＥＳの最終濃度に調整した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、プロピレングリコール溶液中で１０ｍｇ．ｍｌ−１に再構成した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、２．１２．１．ｆｘに１、２、３，４、および５：１のモル比で加え（表７）、室温で少なくとも２時間反応させたが、高濃度のＨＥＰＥＳ緩衝液は、コンジュゲーションの減少をもたらした。
Figure 2015504893
２．１２．１．ｆｘを１８ｍｇ．ｍｌ−１に、ｐＨ７．７でリン酸緩衝液を用いて、０．０６Ｍのリン酸ナトリウムの最終濃度に調整した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、プロピレングリコール溶液中で１０ｍｇ．ｍｌ−１に再構成した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、２．１２．１．ｆｘに５、７、１０、１２、および１５：１のモル比で加え（表８）、室温で２時間反応させて、ＭＡＣを高いコンジュゲーションレベルで生成した。
Figure 2015504893
２．１２．１．ｆｘおよび［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］のモル比をさらに最適化するために、２．１２．１．ｆｘを１８ｍｇ．ｍｌ−１に、ｐＨ７．７でリン酸緩衝液を用いて、０．０６Ｍのリン酸ナトリウムの最終濃度に調整した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、プロピレングリコール溶液中で１０ｍｇ．ｍｌ−１に再構成した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、２．１２．１．ｆｘ抗体に２．５、２．８、３．１、３．４、３．７、４．０、４．３、または４．６：１のモル比で加え（表９）、室温で２時間反応させた。
Figure 2015504893
２．１２．１．ｆｘを２ｍｇ．ｍｌ−１に、ｐＨ７．０でＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて、０．０２Ｍの最終濃度に調整した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、ＤＭＳＯ中で１０ｍｇ．ｍｌ−１に再構成した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、２．１２．１．ｆｘに、５、６、７、８、１０：１のモル比で加え、室温で一晩反応させた。結果を表１０に示す。
Figure 2015504893
様々なタンパク質濃度での２．１２．１．ｆｘのコンジュゲーションプロファイル
様々な濃度での［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］との２．１２．１．ｆｘのコンジュゲーションプロファイルを分析した。２．１２．１．ｆｘを＞５０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５の２００ｍのトレハロースで所望の濃度に希釈し、６０ｍＭのｐＨ７．７のリン酸ナトリウムでスパイクした。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を５０％のプロピレングリコールで再懸濁し、抗体と４．３：１のモル比で混合し、一晩室温で反応させた。すべての試料を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、サイズ排除クロマトグラフィー−質量分析法（ＳＥＣ−ＭＳ）によってインタクトなコンジュゲートタンパク質として分析して、タンパク質のコンジュゲート形態の数および量を決定した。この技術で、各タンパク質の形態の分子量を測定する；複数のコンジュゲーション部位は、ペプチドの質量差によって分離される別個のシグナルとして観察される。複数のコンジュゲーション種の相対的な定量化を、シグナルの大きさを測定することによって行う。表１１は、抗体の様々な濃度でのペプチドとの２．１２．１．ｆｘのコンジュゲーションプロファイルを示している。１０ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度では、コンジュゲーションは、１．８個以上の付加の平均で、０〜５個の付加の分布で起こる。０．５〜５ｍｇ／ｍＬの抗体濃度では、コンジュゲーションは、１．５個以下の付加の平均で、０〜３個の付加の分布で起こる。
Figure 2015504893
反応緩衝液の選択
２．１２．１．ｆｘを１８ｍｇ．ｍｌ−１に、ｐＨ７．７で炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、またはリン酸ナトリウム緩衝液を用いて、０．０５Ｍのリン酸ナトリウムの最終濃度に調整した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、プロピレングリコール溶液中で１０ｍｇ．ｍｌ−１に再構成した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、２．１２．１．ｆｘに、１、２、３、４、または５：１のモル比で加え、室温で２時間反応させた。低い反応ｐＨは、コンジュゲーションレベルの低下をもたらした（表１２）。
Figure 2015504893
２．１２．１．ｆｘを１８ｍｇ．ｍｌ−１に、ｐＨ７．５、７．７、および８．０でホウ酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウム緩衝液を用いて、０．０４Ｍの最終濃度に調整した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、プロピレングリコール溶液中で１０ｍｇ．ｍｌ−１に再構成し、２．１２．１．ｆｘに、４．３：１のモル比で加え、室温で２時間反応させた（表１３）。
Figure 2015504893
２．１２．１．ｆｘを１８ｍｇ．ｍｌ−１に、ｐＨ７．７でリン酸緩衝液を用いて、０．０４Ｍ、０．０６Ｍ、または０．０８Ｍのリン酸ナトリウムの最終濃度に調整した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、プロピレングリコール溶液中で１０ｍｇ．ｍｌ−１に再構成した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、２．１２．１．ｆｘに４．３：１のモル比で加え、室温で２時間反応させた。結果を表１４に示す。
Figure 2015504893
コンジュゲーションに対する緩衝液成分の作用
プロピレングリコール：２．１２．１．ｆｘを１８ｍｇ．ｍｌ−１に、ｐＨ７．７でリン酸緩衝液を用いて、０．０６Ｍのリン酸ナトリウムの最終濃度に調整した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、プロピレングリコール溶液中で２０ｍｇ．ｍｌ−１に再構成した（コンジュゲーション反応物中５％のプロピレングリコール）。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、２．１２．１．ｆｘに４．３：１のモル比で加え、追加の０〜１５％のプロピレングリコールでスパイクし（５、１０、１５、および２０％の最終プロピレングリコールのパーセンテージ）、室温で２時間反応させた。結果を表１５に示す。
Figure 2015504893
ＮａＣｌ：２．１２．１．ｆｘを２ｍｇ．ｍｌ−１に、ｐＨ７．０でＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて、０．０２Ｍの最終濃度に、０．１４ＭのＮａＣｌの存在および不在下で調整した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、ＤＭＳＯ中で１０ｍｇ．ｍｌ−１に再構成した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、２．１２．１．ｆｘに５：１のモル比で加え、室温で一晩反応させた。コンジュゲーションレベルは、ＮａＣｌの存在下で低下する（表１６）。
Figure 2015504893
ＨＥＰＥＳ：２．１２．１．ｆｘを２ｍｇ．ｍｌ−１に、ｐＨ７．０でＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて、０．２Ｍおよび０．０２Ｍの最終濃度に調整した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、５０％のプロピレングリコール中で１０ｍｇ．ｍｌ−１に再構成した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、２．１２．１．ｆｘに５：１のモル比で加え、室温で２時間反応させた。結果を表１７に示す。コンジュゲーションレベルは、０．２ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で低下する。
Figure 2015504893
ＤＭＳＯ：２．１２．１．ｆｘを１５ｍｇ．ｍｌ−１に、ｐＨ７．７でリン酸ナトリウム緩衝液を用いて、０．０６Ｍの最終濃度に調整し、ＤＭＳＯを３０％の最終濃度まで加えた。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、プロピレングリコール溶液中で１０ｍｇ．ｍｌ−１に再構成した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、２．１２．１．ｆｘに４：１のモル比で加え、室温で２時間反応させた。結果を表１８に示す。
Figure 2015504893
コンジュゲーション反応パラメーターの検討
エフェクター部分（この実施例では、ペプチド）と抗体のモル比が、約３．５：１未満に低下した場合、コンジュゲーションレベルは、表９に示すように低下する。代わって、表１０は、モル比を増大させると、コンジュゲーションレベルの増大が生じることを示す。抗体１個当たりのペプチドの数を増大させることは一般的に、その抗原（この場合、ＩＧＦ１Ｒ受容体）に対する抗体（この場合、２．１２．１ ｆｘ）の結合効率を低下させ、したがって、ペプチドと抗体のモル比は、抗体−抗原、およびペプチド−同族の結合の両方を最大にするように最適化された。
コンジュゲーション緩衝液を変更することで、コンジュゲーションパターンを変更することができることも見出された。アミンを含有する添加剤は、これらがＰＦＰ基と反応し得るので、一般的にあまり好ましくない。炭酸塩およびホウ酸塩などの緩衝液を、コンジュゲーションのために使用することができるが、しかしこれらのｐＫａ（ホウ酸はｐＫａ約９を有し、炭酸塩は約６および約１１の２つのｐＫａを有する）が、ＭＡＣ−１およびＭＡＣ−２に最適として同定された７．７のコンジュゲーションｐＨから離れている（表１２）ために回避された。コンジュゲーションレベルは、反応の化学的条件のみに依存するのではなく、時間にも基づいている。２時間後に、ほとんどのＰＦＰ活性化ペプチドは、抗体と反応したか、またはＰＦＰＺ＊は、加水分解されている（表６）。
ＰＦＰ活性化ペプチド／リンカーは、リシン側鎖のアミノ基と迅速に反応した。コンジュゲーションを、リン酸緩衝液中でｐＨ６．５〜８で行って、表４および５に示すとおり、その電荷（表面タンパク質上のリシンのｐＫａは約９．１〜１１．２である）を減少させることによって、抗体表面リシンの求核性の傾向を増大させた。
ＭＡＣ−１およびＭＡＣ−２のコンジュゲーションのための最適な条件は、以下のとおりに記載される：２．１２．１．ｆｘ抗体をｐＨ７．７にリン酸緩衝液を用いて、０．０６Ｍのリン酸ナトリウムの最終濃度に調整した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、プロピレングリコール中で１０ｍｇ．ｍｌ−１に再構成した（反応物中での最終プロピレングリコール濃度は１０％）。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、２．１２．１．ｆｘ抗体に４．３：１のモル比で加え、室温で２時間反応させた。反応物をコハク酸塩およびグリシン緩衝液でクエンチし、ｐＨを約６．０に低下させ、あらゆる遊離ペプチドをクエンチした。一部の態様では、反応物を濃縮することができ、ペプチド関連種（水溶媒との反応によってリンカーが加水分解された場合のペプチドなど）および反応混合物中の他の要素（ＰＦＰなど）を、例えば５０ｋＤａ膜またはサイズ排除クロマトグラフィーを使用する透析濾過によって、ｐＨ５．５、３０ｍｇ／ｍｌでコハク酸塩、グリシン、塩化ナトリウム、およびトレハロース緩衝液に除去することができる。
上記で列挙したコンジュゲーション条件を、各プロセスパラメーターの範囲を決定するために変化させた。パラメーターの範囲は、コンジュゲーション中に起き得る、かつ／または種の集団中に１０％超の変化が観察されるまで拡大した変動性に基づいて設定した。表１９に、ＭＡＣ−２について同様のコンジュゲーションプロファイルをもたらすパラメーターをまとめる。
Figure 2015504893
（実施例６）
抗体上におけるコンジュゲートされたペプチドの位置
ＭＡＣ−２薬物生成物分子は、２．１２．１．ｆｘ抗体（α−ＩＧＦ１Ｒ−１）に結合された１〜４個の［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］分子の分布からなる。これは、サイズ排除クロマトグラフィーカラムを介しての塩および添加剤からのタンパク質の分離後に、エレクトロスプレー飛行時間型質量分析検出を使用してＭＡＣ−２のインタクトな分子量（ＭＷ）を測定することによって決定された。２．１２．１．ｆｘおよび３ロットのＭＡＣ−２のＭＷを実証する質量分析データを、図２に示す。図１Ａは、コンジュゲーション前の２．１２．１．ｆｘを示す。これは、単一のＭＷを示す均一な分子である。ＭＡＣ−２のロットは、２．１２．１．ｆｘにコンジュゲートされたペプチドの分布を示す；１〜４個のコンジュゲーション付加（ＣＡ）が観察される。それぞれの形態の相対量は、ロット間で一貫しており、各ロットにおける最も普通の形態は、それぞれの個々の２．１２．１．ｆｘ抗体に結合された２個のペプチド（配列番号２７）を有する。
２．１２．１．ｆｘ抗体中のジスルフィド結合を還元することによって、軽鎖および重鎖を別々に観察することができる。ジスルフィドの還元を、インタクトな２．１２．１．ｆｘ抗体を２０ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で処理することによって行う。生じた重鎖および軽鎖の混合物を、上記のとおりにインタクトな分子量のために分析する。図２に示したデータは、２．１２．１．ｆｘの上でのＡＢＰの位置に対する証拠を提供している。ＭＡＣ−２のロット中の軽鎖の大部分（＞６５％）は、コンジュゲートされている。ほとんどのコンジュゲートされた軽鎖は、１ＣＡを含有する。２ＣＡも低いレベルで観察される。ほとんどすべての観察された重鎖（＞９０％）は、修飾されてなく、これは、非常に僅かなコンジュゲートされたペプチドが重鎖上に位置することを示唆している。
ペプチドマッピングを、コンジュゲーションの正確な位置を決定するために使用した。この手順は、次のとおりであった：ＭＡＣ−２の一定分量を８Ｍのグアニジン塩酸塩で変性し、ジスルフィド結合をＴＣＥＰで還元し、生じたシステインスルフヒドリルをヨードアセトアミドでアルキル化する。次いで、この処理されたタンパク質の試料を、プロテアーゼキモトリプシン（１：１２５のプロテアーゼ：ＭＡＣの重量比）で消化した。次いで、生じたキモトリプシンペプチドを、Ｃ８液体クロマトグラフィーカラムを介しての分離の後に、質量分析によって別個に検出した。この技術で、ＭＡＣ−２は、キモトリプシンによって、重鎖および軽鎖上で図３中の配列中に（黒丸で）特記された位置で断片に消化された。次いで、各ペプチドのＭＷの液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）検出を使用して、どのリシン残基がコンジュゲートペプチドによって修飾されたかを決定した。断片がコンジュゲートペプチドの結合によって修飾された場合、そのＭＷは、それに応じてシフトした。
重鎖の断片Ｙ１、Ｙ６、Ｙ９、Ｙ１０、Ｙ２０、Ｙ２５、Ｙ２６、Ｙ２９、Ｙ３２、Ｙ３３、Ｙ３４、Ｙ３７、Ｙ４０、およびＹ４３は、Ｌｙｓ残基を含有する。これらのうち、ペプチドのコンジュゲーションは、Ｙ６、Ｙ１０、Ｙ２５、Ｙ３３、およびＹ３７において検出された。軽鎖の断片Ｙ３、Ｙ１０、Ｙ１１、Ｙ１２、Ｙ１３、Ｙ１４、Ｙ１５、およびＹ１６は、Ｌｙｓ残基を含有する。これらのうち、コンジュゲーションは、Ｙ３、Ｙ１３、およびＹ１５において検出された。
Ｙ１５と称される軽鎖断片（軽鎖上のＮ末端から１５番目のキモトリプシン断片）は、図４に示したデータに基づき、コンジュゲートされていることが見出された。ＭＡＣの修飾されたＹ１５断片のＭＷは、明確に検出された。コンジュゲートされていない２．１２．１．ｆｘ試料において、修飾されたＹ１５断片の証拠は存在しなかった。修飾されていないＹ１５断片は、ＭＡＣ−２および２．１２．１．ｆｘの両方で観察された。この断片の大きさは、この断片の全体が修飾されていない形態で存在するために、２．１２．１．ｆｘ試料において、より高い。この断片がＭＡＣ−２ではコンジュゲートされるので、修飾されていないＹ１５の観察されるレベルは低下し、これは、図４中で、より小さい面積を持つピークとして観察される。
ＭＡＣ−２の軽鎖断片Ｙ１５上で観察される［配列番号２７−Ｋ１１−ＰＥＧ５］のコンジュゲーションの量は、修飾されていないＹ１５のピーク面積の低減を測定することによって推定される。コンジュゲートされていない２．１２．１．ｆｘが、１００％を示すようにシグナル強度を正規化した後、ＭＡＣ−２の３つの独立したロットは、それぞれ１７％、２７％、および２２％のコンジュゲートされていないＹ１５断片を示した。
ＭＡＣ試料中において観察されたＹ１５の大きさを、２．１２．１．ｆｘ試料におけるＹ１５の大きさに対して正規化した。Ｙ１５断片のうちの７５〜８５％が、ＭＡＣ−２では修飾されたと決定した。ＭＡＣ−２がほとんど１〜２のコンジュゲーション付加を含有することを考慮すると、このことは、ＭＡＣ−２におけるコンジュゲーションのうちのほとんどが、軽鎖断片Ｙ１５の２個のＫ残基（ＬＣ−Ｋ１８８またはＬＣ−Ｋ１９０）の一方に位置することを示唆している。２．１２．１．ｆｘの配列に関係した断片Ｙ１５の位置を、図３に示す。
トリプシン酵素による消化を、ＬＣ−Ｋ１８８とＬＣ−Ｋ１９０とを識別するために使用した（トリプシンはＫおよびＲのＣ末端について特異性を有する）。トリプシンは、コンジュゲートされたＫ残基を消化しないので、この酵素による消化は、どのＫ残基がコンジュゲートされているかに応じて、異なったペプチドの長さを生成する。トリプシンで消化されたＭＡＣ−２からのＬＣＭＳデータの調査によって、ペプチドが、ＬＣ−Ｋ１８８に特異的に結合する証拠が得られる。修飾されたＬＣ−Ｋ１９０の証拠は、観察されなかった。
ＭＡＣ−２をＴＣＥＰで還元し、上記のとおりにグアニジン塩酸塩で変性した。タンパク質濃度を２ｍｇ／ｍｌに、ｐＨを７．８にトリス消化緩衝液を用いて調整した。精製したトリプシンを、１：１２５のプロテアーゼ：ＭＡＣの重量比で加え、３０℃で４時間インキュベートした。試料を、ＬＣＭＳによって分析するまで、−２０℃で保存した。断片の試料を、Ｃ１８逆相カラムで、水／アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡの移動相を使用して分離した。断片の検出を、２１４ｎｍのＵＶおよびＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析の両方によってモニタリングした。すべてのデータの分析を、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアを使用して行った。
ＭＡＣ−２のトリプシン消化による断片の形成は、ペプチドコンジュゲーションの部位に依存する。リシンは、コンジュゲーションのために標的化された残基である。図１〜４に示したデータは、ペプチド結合の支配的な部位が、ＬＣ−Ｋ１８８またはＬＣ−Ｋ１９０のいずれかであることを示す。以下のスキームは、２．１２．１．ｆｘ−［ＬＣ−Ｋ１８８］または２．１２．１．ｆｘ−［ＬＣ−Ｋ１９０］のいずれかでのコンジュゲーションで起こるであろうトリプシン消化反応を示している。
Figure 2015504893
問題となっている２つの潜在的な消化断片の化学構造は以下のとおりである：
Figure 2015504893
図５は、ＬＣ−Ｋ１８８がペプチドにコンジュゲートされた場合のトリプシンペプチドについての選択されたイオンのＬＣＭＳクロマトグラムデータを示す。図６は、ＬＣ−Ｋ１９０がコンジュゲートされたペプチドで修飾された場合のトリプシン断片についての選択されたイオンのＬＣＭＳクロマトグラムデータを示す。これらのデータは、唯一ＬＣ−Ｋ１８８のみがコンジュゲートされることを示唆しており；この状況は、ＭＡＣ−２においては検出されるが、２．１２．１．ｆｘ対照実験においては存在しない有意なシグナルをもたらす。ＬＣ−Ｋ１９０での修飾からの結果は、陰性対照と比較して独特であるどのようなデータも提供しない。
予測できることとは対照的に、ペプチド／リンカーは、２．１２．１．ｆｘの軽鎖のＬＣ−Ｋ１８８を優先的に装飾すると考えられる。これは、２．１２．１．ｆｘ抗体のＦｃ部分が影響を受けないという意外な利点を有する。試験は、生じたＭＡＣ−２のＰＫが、コンジュゲートされていない２．１２．１．ｆｘのＰＫとほぼ等しいことを示す。抗体上の複数の部位に対する乱雑な非特異的コンジュゲーションは、より低いＰＫを有する生成物をもたらし得る。ＭＡＣ−１およびＭＡＣ−２によって例示される本発明の方向性コンジュゲーションは、より低いＰＫを包含する乱雑な非特異的コンジュゲーションに起因し得る可能な有害作用のうちの一部を最小にする利点を提供する。軽鎖（ＬＣ）が、可変領域、さらには定常軽鎖カッパ鎖（ＣＬκ）を含むので、ＬＣ−Ｋ１８８は、ＣＬκ−Ｋ８０（すなわち、配列番号６のＫ８０）と同じ残基である。
このプロセスの再現性を確立するために、実験を繰り返した。ＭＡＣ−２を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、インタクトなコンジュゲートタンパク質として、サイズ排除クロマトグラフィー−質量分析（ＳＥＣ−ＭＳ）によって分析して、タンパク質のコンジュゲート形態の数および量を決定した。この技術は、各タンパク質の形態の分子量を測定する；複数のコンジュゲーション部位が、コンジュゲートされたペプチド／リンカーの質量差によって分離された別個のシグナルとして観察される。複数のコンジュゲーション種の相対的な定量化を、シグナルの大きさを測定することによって行う。図７Ａは、代表的なＭＡＣ−２のスペクトルを示す；定量化のために使用された計算を、表２０に示す。インタクトなＭＡＣ−２についての平均コンジュゲーション付加は、次式：ＳＵＭＰＲＯＤＵＣＴ（コンジュゲーション付加（ＣＡ）の数、ＣＡ当たりパーセント）を使用して、２．１１個と計算される。この例は、０〜４個のペプチド付加の分布として起こるペプチドのコンジュゲーションを実証し、その際、最大の形態は、２個のペプチド付加であり、ペプチド付加の平均個数は２．１１である。複数の個人による反復分析は、コンジュゲーションのプロファイルが一貫していて、再現可能であることを実証している。
Figure 2015504893
ペプチドコンジュゲーションの程度を、２．１２．１．ｆｘ ＭＡＣ−２の軽鎖および重鎖で別々に試験した。ＭＡＣ−２を変性し、ジスルフィド結合を、グアニジン塩酸塩およびジチオトレイトールを使用して還元した。生じた遊離の軽鎖および重鎖を、ＬＣＭＳを使用して分析して、それぞれのコンジュゲーションプロファイルを決定した。図７Ｂおよび７Ｃは、各鎖の代表的なスペクトルを示す；定量化のために使用した計算を、表２１に示す。次式：ＳＵＭＰＲＯＤＵＣＴ（コンジュゲーション付加（ＣＡ）の数、ＣＡ当たりパーセント）を使用すると、還元された重鎖ＭＡＣ−２についての平均コンジュゲーション付加（平均ＣＡ）は、０．１４個と計算され、還元された軽鎖ＭＡＣ−２に対する平均ＣＡは、０．８６個と計算された。これらのデータは、コンジュゲーションの位置が軽鎖において、より多いことを実証しており；軽鎖上の最も豊富な形態は、１個のペプチド付加を含有し、軽鎖は、平均０．８６個のペプチド付加を含有する。重鎖上のコンジュゲーションは、有意により低いレベルで観察される。複数の個人によるこの実験の反復分析は、コンジュゲーションのプロファイルが一貫していて、再現可能であることを実証している。
Figure 2015504893
ＭＡＣ−２をジチオトレイトールで還元し、システイン残基を、ヨードアセトアミドでのカルボキシメチル化によってアルキル化した。キモトリプシンをタンパク分解性消化のために使用した。溶液中の消化された断片を、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）を使用して分析した。個々の断片をＣ１８のＨＰＬＣカラムで分離し、それらの正確な質量を四重飛行時間（Ｑ−ＴｏＦ）質量分析計で測定した。生じた断片の質量を使用して、修飾されていない断片またはコンジュゲートペプチドで修飾された断片を確認した。この実験は、リシン残基を含有するキモトリプシン断片に焦点を当てることによって、これらがペプチドコンジュゲーションのための可能な部位であると解釈された。表２２は、すべてのそのような断片の列挙を示す。空白の項目は、この技術を使用して検出されない断片である。ペプチド修飾物質と共に観察された検出された断片は、コンジュゲーションの潜在的部位であると考えられる。
表１７について表の項目を以下に説明する：
断片番号：Ｎ末端からのキモトリプシン断片ナンバリング；接合された断片（すなわち、Ｙ１−２）は、欠損した開裂部位を示す。
始点／終点：Ｎ末端からの断片位置のナンバリング。
ペプチド質量（Ｄａ）：ダルトンで記載された断片の理論的質量。
保持時間（対照／分析物）：ＬＣＭＳ断片マッピング実験におけるクロマトグラフィーの保持／溶離の時間。
ＭＳシグナル強度（対照／分析物）：ＭＳによって観察された観察シグナルの大きさ。
質量誤差−ｐｐｍ（対照／分析物）：断片の理論質量と観察質量との比較；＞１０、特にゼロ（０）に近い値は、良好な質量確度を実証している。
修飾物質：断片に対する潜在的共有結合的付加；Ｌｙｓ残基のペプチド−抗体結合断片、ＣＡＭ−システイン残基のカルボキシメチル化。
アステリスクは、個々の断片の修飾された（例えば、コンジュゲートされた）バージョンを示す。
Ｐｅｐは、コンジュゲートされたペプチドを示す。
Ｙ１５断片へのペプチドの方向性コンジュゲーションは、コンジュゲーションレベルを定量化することによって実証される。次の分析を、２．１２．１．ｆｘ基準生成物のペプチドマッピング実験中にコンジュゲーションを有することが観察されたそれぞれのペプチド断片に対して行った。コンジュゲートされた基準生成物（ＭＡＣ−２）と比較した、コンジュゲートされていない対照（２．１２．１．ｆｘ抗体骨格−コンジュゲーション無し）中の修飾されていないペプチドについて観察されたシグナル強度の比を、表２３に示す。各試料において同じペプチドシグナルの直接的な比較が可能であるので、修飾されていないシグナルが使用される。例えば、コンジュゲートされていないペプチドは、対照と生成物試料とにおいて同じ観察シグナル強度を有し、１の比をもたらすと予測されるであろう。コンジュゲーションは、生成物試料において修飾されていないペプチドの観察量の減少をもたらし、それは、１超の比によって示されるであろう。表２３のデータは、対照と生成物との間の試料および実験の変動を補正するためにさらに正規化した。表２３は、軽鎖ペプチドＹ１５が、それぞれの他のコンジュゲートされたペプチドよりも有意に高いレベルでコンジュゲートされることを実証している。これは、コンジュゲーションが、方向性の手法で起こり、Ｋ残基全体に無作為に分布されないことを示唆している。
Figure 2015504893
Figure 2015504893
Figure 2015504893
Figure 2015504893
（実施例７）
ＭＡＣ生成物の抗力の実証
ＭＡＣ−１およびＭＡＣ−２のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイの完全な詳細は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５３０９２（ＷＯ２０１２／００７８９６）の実施例において得られる。一部の実施例では、Ａｎｇ２−ｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ１を対照として使用した。Ａｎｇ２−ｈ３８Ｃ２の生成および構造は、その内容が、本明細書に組み込まれているＷＯ２００８０５６３４６において化合物４３として、特に化合物４３の生成に関する態様について完全に記載されている。簡単には、その構造は以下のとおりである：
Figure 2015504893
 ［式中、リンカーは、抗体の結合部位のＨＣ−Ｋ９９（ＫａｂａｔナンバリングによるＫ９３）のε−アミノ基に共有結合されており、抗体は、ｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ１（配列番号６４および６５）（ＷＯ２００８／０５６３４６の配列番号１８９および配列番号１９０）である］。
まとめると、ＭＡＣ−１およびＭＡＣ−２は、Ａｎｇ２競合アッセイにおいて示されているとおり、Ａｎｇ２を結合することが可能であり、Ｔｉｅ２へのその結合を防止し、ＭＡＣ−１およびＭＡＣ−２は両方とも、ＩＧＦ１Ｒ結合についてのＩＧＦ１との競合に関して、親抗ＩＧＦ１Ｒ抗体（２．１２．１．ｆｘ）と同様の活性を有する（表２４）。意外にも、Ａｎｇ２−ｈ３８ｃ２との比較において、ＭＡＣ−１およびＭＡＣ−２は両方とも、Ａｎｇ２を競合的に結合する能力の増大を示した。したがって、限られたＡｎｇ２ペプチドのコンジュゲーションは、抗体の自然の結合および阻害を変化させるとは考えられず、場合によっては、エフェクター部分の活性を向上させ得る。
ＭＡＣを、ヒト結腸癌細胞系Ｃｏｌｏ２０５上のＩＧＦ１Ｒレベルを下方調節する能力について試験した。細胞を、培養液中でＭＡＣ化合物の滴定で３時間処理した。細胞を収集し、ＩＧＦ１Ｒの表面発現をフローサイトメトリーによって決定した。陰性対照のｈＩｇＧ２と比較した場合のＩＧＦ１Ｒの下方調節のパーセンテージを決定した（表２４）。
Figure 2015504893
抗体１個当たり２個のペプチドをコンジュゲートすることがＩＧＦ１Ｒの自己リン酸化および下方調節を行うにあたっては理想的であり、抗体１個当たり２個より多いか、または少ないペプチドのコンジュゲーションが、これらの機能をＭＡＣが行う能力を低下させることも実証された。
ＩＧＦ１Ｒ活性をモジュレートするための２．１２．１．ｆｘの能力に対する、抗体１個当たりのペプチドの数の作用を評価するために、ＭＡＣ−１の２種類の試料を調製したが、ここで、反応条件を、コンジュゲーションを低減する（低ＭＡＣ−１）か、またはコンジュゲーションを増大させる（高ＭＡＣ−１）かのいずれかをもたらすように設定した（表２５）。試料を、ＩＧＦ１Ｒを下方調節およびリン酸化する能力について分析した（表２５）。ＩＧＦ１Ｒ経路を有効にモジュレートする低ＭＡＣ−１の能力と比較すると、高ＭＡＣ−１の能力には、有意な差が存在する。抗体１個当たり約２個超のペプチドのコンジュゲーションは、抗体１個当たり約２個以下のペプチドのコンジュゲーションと比較して、ＩＧＦ１Ｒの自己リン酸化を阻害することと、ＩＧＦ１Ｒの下方調節を誘導することとの両方のＭＡＣの機能活性を制限する。したがって、１つの二重機能性実体中の２つの異なる生物学的経路を効率よくモジュレートするために、抗体１個当たり約２個のペプチドのコンジュゲーションが理想的であり得る（ペプチドおよび標的の薬物動態プロファイルに応じて）。
Figure 2015504893
（実施例８）
ｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態
ＰＫ研究を、オスのＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスおよび２匹のオスのカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を使用して行った。ＰＫ研究の完全な詳細は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５３０９２の実施例において得られる。マウスでは、ＭＡＣ−１およびＭＡＣ−２は、３８３〜３９７時間のβ相半減期を有する親抗ＩＧＦ１Ｒ抗体と同様の滞留時間を実証した。ＭＡＣ−１およびＭＡＣ−２ Ａｎｇ２結合性能は、マウスにおいて、単回静脈内投与研究で、１０５〜１２０時間のＴ１／２を有するＡｎｇ２−ｈ３８ｃ２と同様の滞留時間を実証した。カニクイザルでは、ＭＡＣ−２は、１００．４時間のＴ１／２を有する親抗ＩＧＦ１Ｒ抗体よりもやや短い滞留時間を実証した。ＭＡＣ−２ Ａｎｇ２結合性能は、９７．８時間のＴ１／２を有するＡｎｇ２−ｈ３８ｃ２と同様の滞留時間を実証した。
Figure 2015504893
（実施例９）
ｉｎ ｖｉｖｏ薬理学
ＭＡＣ−２の抗腫瘍活性を、Ｃｏｌｏ２０５（ヒト結腸腺癌）またはＭＤＡ−ＭＢ−４３５（黒色腫）異種移植モデルで評価した。腫瘍研究の完全な詳細は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５３０９２（ＷＯ２０１２／００７８９６）の実施例において得られる。Ａｎｇ２−ｈ３８ｃ２または抗ＩＧＦ１Ｒ抗体（２．１２．１．ｆｘ）の週１回の投与は、Ｃｏｌｏ２０５腫瘍増殖を阻害した。週１回投与するＡｎｇ２−ｈ３８ｃ２および抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の組合せは、Ｃｏｌｏ２０５腫瘍増殖の阻害において追加的な利益を示した。ＭＡＣ−２単独を週１回投与しても、組合せと同様の利益が示された。別の試験において、ＭＡＣ−２は、Ｃｏｌｏ２０５腫瘍増殖および最終腫瘍重量を用量依存的に阻害した。
２８日目に、化合物で処理した後の腫瘍の微小血管密度は、ＭＡＣ−２（１０ｍｇ／ｋｇ、週１回）によって、ビヒクル処置群との比較において、有意に低減し（約４２％）、ＭＡＣ−２処理の抗血管新生活性が確認された。
ＭＡＣ−２が、ｉｎ ｖｉｖｏでＡｎｇ２およびＩＧＦ１Ｒの両方を標的化するかを調査するために、Ａｎｇ２およびＩＧＦ１Ｒ発現レベルに対するＭＡＣ−２の作用を、ビヒクル、Ａｎｇ２−ｈ３２ｃ２、ＩＧＦ１Ｒ抗体（２．１２．１．ｆｘ）、またはＭＡＣ−２（０．３ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇまでの用量反応範囲）で処置された２つの独立したＣｏｌｏ２０５異種移植腫瘍で評価した。結果は、Ａｎｇ２およびＩＧＦ１Ｒの免疫反応性は、ＭＡＣ−２処理によって用量依存的手法（１、３、および１０ｍｇ／ｋｇ）で、ビヒクル処置群との比較において有意に低下したことを示した。ＩＧＦ１Ｒレベルに対するＭＡＣ−２の作用は、ＩＧＦ１Ｒ拮抗性抗体について観察されたものと同様であった。加えて、リン酸化されたＩＧＦ１Ｒのレベルは、ＭＡＣ−２で処置された動物からの腫瘍では低下した。これらのデータは、ＭＡＣ−２処置が、Ｃｏｌｏ２０５異種移植モデルのＡｎｇ２およびＩＧＦ１Ｒ経路の両方に影響を及ぼすことを実証している。ＭＡＣ−２処置は、体重増加に影響を及ぼすことはなく、マウスは、研究を通じて良好な健康状態にあったと考えられた。ＭＡＣ−２の抗腫瘍有効性を、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５黒色腫異種移植モデルにおいても評価した。ＭＡＣ−２の週１回の投与（３および２０ｍｇ／ｋｇＩＰ）は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５モデルにおける腫瘍増殖の有意な４０％の減少（６７日目）をもたらした。したがって、ＭＡＣ−２は、２つの異なるヒト異種移植腫瘍モデルにおいて有意な抗腫瘍有効性を実証している。
（実施例１０）
様々な抗体のペプチドコンジュゲーションプロファイル
いくつかの異なる抗体のペプチドとのコンジュゲーションプロファイルを、配列番号２７およびＰＥＧ５をそれぞれ例示的ペプチドおよびリンカーとして使用して分析した。すべての試験された抗体は、十分に画定され、特徴づけされた抗原相互作用を持つヒトＩｇＧ抗体または完全ヒト化ＩｇＧ抗体であった。ｈＡｂλテストは、ＣＬλ（ｈＩＬ２２：配列番号１３６および１３７）を含む一方で、２．１２．１．ｆｘ、ｍＡｂκテスト１（参照によって本明細書に組み込まれている米国特許７５３７７６２号に開示されているとおりのＩｇＧ２抗Ａｌｋ１抗体）、ｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ１（配列番号６４および６５）、およびｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ２（配列番号６４および６６）はそれぞれ、ＣＬκを含む。それぞれの抗体を、２０ｍＭのｐＨ７．０のＨＥＰＥＳに緩衝液交換し、５〜２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、５０％のプロピレングリコールで再懸濁し、該当する抗体と４．３：１のモル比で混合し、室温で少なくとも２時間反応させた。すべての試料を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、サイズ排除クロマトグラフィー−質量分析（ＳＥＣ−ＭＳ）によって、インタクトなコンジュゲートされたタンパク質として分析して、コンジュゲート形態のタンパク質の数および定量化を決定した。この技術で、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定する；複数のペプチドコンジュゲーション部位は、結合したペプチドの質量差によって分離された別個のシグナルとして観察される。複数のペプチドコンジュゲーション種の相対的定量化を、シグナルの大きさを測定することによって行う。表２２は、様々な抗体のペプチドコンジュゲーションプロファイルを示す。
ＣＬκを含有する抗体では、ペプチドコンジュゲーションは、０〜４個のペプチド付加の分布で起こり、最大の形態は２〜３個のペプチド付加である。対照的に、ＣＬλを含む抗体、ｈＡｂλテストでは、ペプチドのコンジュゲーションは、０〜４個のペプチド付加の分布で起こり、最大の形態は、１〜２個のペプチド付加である。
ペプチドコンジュゲーションの程度を、軽鎖および重鎖で別々に調査した。それぞれの試料を変性し、ジスルフィド結合を、グアニジン塩酸塩およびジチオトレイトールを使用して還元した。生じた遊離の軽鎖および重鎖を、ＬＣＭＳを使用して分析して、それぞれのコンジュゲーション特性を決定した。様々な抗体の軽鎖および重鎖上のペプチドコンジュゲーションプロファイルを、表２７に示す。２．１２．１．ｆｘおよびｈＡｂκテスト１において、データは、コンジュゲーションの位置が軽鎖において、より多いことを実証している；軽鎖において最も豊富な形態は、１個のペプチド付加を含有する。重鎖におけるコンジュゲーションは、有意に低いレベルで観察される。ｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ１およびｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ２においては、コンジュゲーションの匹敵するレベルが軽鎖および重鎖上で観察され、その際、軽鎖に、僅かなコンジュゲーションの優先性がある。ＣＬλを含有する抗体（ｈＡｂλテスト；配列番号１３６および１３７）を含む）においては、コンジュゲーションの大部分は重鎖において起こり、低いレベルのコンジュゲーションが軽鎖において観察された。
Figure 2015504893
それぞれの抗体２．１２．１．ｆｘ、ｈＡｂλテストおよびｈＡｂκテスト１を、コンジュゲーションプロセスの後に評価して、その受容体結合を保持する抗体骨格の能力に対するコンジュゲーション付加の作用を決定した（天然のｍＡｂと比較）（表２８）。結果は、試験抗体へのペプチドの方向性コンジュゲーションが、抗体結合を変更しないと考えられたことを示している。
Figure 2015504893
（実施例１１）
ＩｇＧ２−κ抗体のペプチドコンジュゲーションプロファイル
ＩｇＧ２−κ抗体（ｈＡｂκテスト２）と３９−マーペプチドとのコンジュゲーションプロファイルを分析した（配列番号１６４）。抗体を８ｍｇ／ｍＬに濃縮し、ｐＨ８．０の４０ｍＭのＨＥＰＥＳに緩衝液交換した。ペプチドを１００％のＤＭＳＯで再懸濁し、抗体と５．０：１のモル比で混合し、室温で一晩反応させた。すべての試料を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、サイズ排除クロマトグラフィー−質量分析（ＳＥＣ−ＭＳ）によって、インタクトなコンジュゲートされたタンパク質として分析して、コンジュゲート形態のタンパク質の数および定量化を決定した。この技術で、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定する；複数のペプチドコンジュゲーション部位は、ペプチドの質量差によって分離された別個のシグナルとして観察される。複数のペプチドコンジュゲーション種の相対的定量化を、シグナルの大きさを測定することによって行う。表２９は、３９−マーペプチドとのｈＡｂκテスト２のペプチドコンジュゲーションプロファイルを示している。ペプチドのコンジュゲーションは、０〜４個のＣＡの分布で起こり、２．０３個のＣＡの平均であり、ＣＬκ−Ｋ８０上の方向性コンジュゲーションと一致する。
Figure 2015504893
別の実験では、３９−マーペプチドを上記のとおり、ＭＡＬ−ＰＥＧ２−ＰＦＰと共に、ｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ２に異なるモル濃度でコンジュゲートさせた。加えて、３９−マーペプチドに対する同族受容体の結合をアッセイした。示した結果（表３０）は、ＣＬκ−Ｋ８０での方向性コンジュゲーションと一致する。さらに、抗体１個当たりのペプチドの平均個数の増大は、標的への結合全体を、実質的に増大させなかった。このことは、ある種のシナリオでは、抗体１個当たりのコンジュゲーションの増大が標的結合を増大させ得ないことを実証しており、本発明の利点の１つを実証している；抗体１個当たりのコンジュゲートするペプチドの数を制御することで、単位ペプチド１個当たりの最大の標的結合の達成を助けることができる。
Figure 2015504893
（実施例１２）
２．１２．１．ｆｘ Ｆａｂへのビオチンのコンジュゲーション
２．１２．１．ｆｘのＦａｂ領域（配列番号４および６４）とＰＦＰ−ビオチンとのコンジュゲーションプロファイルを分析した。抗体Ｆａｂを２０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、ｐＨ５．５の２０ｍＭの酢酸ナトリウム＋２００ｍＭのトレハロースに緩衝液交換し、ｐＨ７．７の６０ｍＭのリン酸ナトリウムでスパイクした。ＰＦＰ−ビオチンを１００％のＤＭＳＯで再懸濁し、抗体と一連のモル比で混合し、室温で一晩反応させた。すべての試料を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、サイズ排除クロマトグラフィー−質量分析（ＳＥＣ−ＭＳ）によって、インタクトなコンジュゲートされたタンパク質として分析して、コンジュゲート形態の数および定量化を決定した。この技術で、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定する；複数のコンジュゲーション部位は、コンジュゲートされたペプチドの質量差によって分離された個別のシグナルとして観察される。複数のコンジュゲーション種の相対的定量化を、シグナルの大きさを測定することによって行う。表３１は、２．１２．１．ｆｘＦａｂとＰＦＰ−ビオチンとのコンジュゲーションプロファイルをモル比で示している。コンジュゲーションは、モル比が増大するにつれて、０〜２個の付加の分布で起こる。抗体１個当たりの少ない分子の数は、使用されたモル比に基づき、先の結果と一致する。これは、反応パラメーターを変更することによって、コンジュゲーションの量を制御するためのこのプロセスの柔軟性を実証している。
Figure 2015504893
（実施例１３）
ｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ１へのビオチンのコンジュゲーション
抗体ｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ１を２０ｍｇ／ｍＬに、ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて、０．０２Ｍの最終濃度に調整した。ビオチン−ＰＦＰを、水中で１０ｍｇ／ｍＬに再構成し、ｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ１に５：１のモル比で加え、室温で２時間反応させた。未反応のＰＦＰ−ビオチンを、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去し、ｐＨ６．５のヒスチジン、グリシン、およびスクロース緩衝液に緩衝液交換した。試料を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、サイズ排除クロマトグラフィー−質量分析（ＳＥＣ−ＭＳ）によって、インタクトなコンジュゲートされたタンパク質として分析して、コンジュゲーション形態のタンパク質の数および定量化を決定した。表３２は、ｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ１とビオチン−ＰＦＰとのコンジュゲーションプロファイルを示している。ｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ１のコンジュゲーションは、１．１個のコンジュゲーションの平均で、０〜３個のＣＡの分布で起こる。コンジュゲーションの増大は、反応条件の最適化後に可能となるであろう。ｈ３８Ｃ２−ＩｇＧ１におけるＶＨ−Ｋ９９（ＫａｂａｔナンバリングによるＫ９３）の反応性は、触媒抗体試験化合物ＣＡＴＣ−１と反応させた場合、＞９５％であることが確認され、逆相クロマトグラフィーを介して分析された。
Figure 2015504893
（実施例１４）
２．１２．１．ｆｘおよびＣＬκ−Ｋ８０、ＣＬκ−Ｋ８２変異体のコンジュゲーションプロファイル
ペプチドマッピングに基づくと、Ｙ１５断片中には２個のＬｙｓが存在する。活性なコンジュゲーション部位を識別するために、ＣＬκ−Ｋ８０およびＣＬκ−Ｋ８２をＲに、個々に、または組み合わせて変異させた。試験抗体の変異体、２．１２．１．ｆｘを、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標））に記載されているプロトコルに従って生成した。変異を、オリゴヌクレオチドプライマーによって導入し、ＤＮＡ配列決定によって確認した。変異したｍＡｂを、ＨＥＫ２９３細胞中で過渡的に発現させ、タンパク質Ａ親和カラムを使用して精製した。精製したｍＡｂを、ＭＳを使用して特徴づけた。配列番号１２、１３、および１４は、変異体ＣＬκ配列を示している。
抗体を、ｐＨ７．５または６．５の０．０２ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に、２ｍｇ／ｍＬで緩衝液交換した。ｐＨが６．５の場合、次いで、抗体をｐＨ７．７の６０ｍＭのリン酸ナトリウムでスパイクした。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、５０％のプロピレングリコールで再懸濁し、タンパク質と４．３：１のモル比で混合し、室温で一晩反応させた。すべての試料を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、サイズ排除クロマトグラフィー−質量分析（ＳＥＣ−ＭＳ）によって、インタクトなコンジュゲートされたタンパク質として分析して、コンジュゲート形態のタンパク質の数および定量化を決定した。この技術で、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定する；複数のコンジュゲーション部位は、コンジュゲートされたタンパク質の質量差によって分離された個別のシグナルとして観察される。複数のタンパク質コンジュゲーション種の相対的定量化を、シグナルの大きさを測定することによって行う。表３３は、修飾されていない２．１２．１．ｆｘ、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｋ８０Ｒ］（ＣＬκ：配列番号１２）、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｋ８２Ｒ］（ＣＬκ：配列番号１３）、および２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｋ８０Ｒ−Ｋ８２Ｒ］（ＣＬκ：配列番号１４）のコンジュゲーションプロファイルを示している。ＣＬκ−Ｋ８０Ｒ変異体は、コンジュゲーションの低減を示した。ＣＬκ−Ｋ８２Ｒは、コンジュゲートされていない２．１２．１．ｆｘと同様のコンジュゲーションを有した。ＭＡＣ−２のコンジュゲーションは、組合せのＨＥＰＥＳ／リン酸緩衝液を使用することによる他のアッセイで観察されたものより低かった。
Figure 2015504893
（実施例１５）
Ｋ８０への方向性コンジュゲーションの機構の解明
ＣＬκ−Ｈ８１側鎖は、ＣＬκ−Ｋ８０のε−アミノ基に非常に近い。Ｈｉｓは多くの場合に、プロトン移動反応に関係するので、ＣＬκ−Ｈ８１が、ＣＬκ−Ｋ８０コンジュゲーションのために必要である可能性が非常に高い。ＣＬκ−Ｋ８０部位特異的コンジュゲーションにおけるＣＬκ−Ｈ８１の役割を研究するために、ＣＬκ−Ｈ８１Ａ変異によって、イミダゾール環を除去した。部位特異的コンジュゲーションにおけるＣＬκ−Ｄ４３の役割ならびにＣＬκ−Ｄ４３およびＣＬκ−Ｈ８１の組合せ作用を研究するために、ＣＬκ−Ｄ４３ＡおよびＣＬκ−Ｄ４３Ａ／Ｈ８１Ａ変異体を製造した。
変異体を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標））に記載されたプロトコルに従って生成した。変異を、オリゴヌクレオチドプライマーによって導入し、ＤＮＡ配列決定によって確認した。変異したｍＡｂを、ＨＥＫ２９３細胞中で過渡的に発現させ、タンパク質Ａ親和カラムを使用して精製した。精製したｍＡｂを、ＭＳを使用して特徴づけた。次の２．１２．１．ｆｘ ｌ ＣＬκ変異体を生成した：ＣＬκ−Ｄ４３Ａ（配列番号１５）、ＣＬκ−Ｋ８０Ａ（配列番号１６）、ＣＬκ−Ｈ８１Ａ（配列番号１７）、ＣＬκ−Ｋ８２Ａ（配列番号１８）、およびＣＬκ−Ｄ４３Ａ／Ｈ８１Ａ（配列番号１９）。
それぞれの抗体を、ｐＨ５．５の２０ｍＭの酢酸ナトリウム、２００ｍのトレハロースに２０ｍｇ／ｍｌで緩衝液交換した。次いで、タンパク質をｐＨ７．７の６０ｍＭのリン酸ナトリウムでスパイクした。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、５０％のプロピレングリコールで再懸濁し、抗体と４．３：１のモル比で混合し、室温で一晩反応させた。すべての試料を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、サイズ排除クロマトグラフィー−質量分析（ＳＥＣ−ＭＳ）によって、インタクトなコンジュゲートされたタンパク質として分析して、コンジュゲート形態のタンパク質の数および定量化を決定した。この技術で、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定する；複数のコンジュゲーション部位は、コンジュゲートされたペプチドの質量差によって分離された個別のシグナルとして観察される。複数のペプチドコンジュゲーション種の相対的定量化を、シグナルの大きさを測定することによって行う。
表３４は、２．１２．１．ｆｘ、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ４３Ａ］、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｋ８０Ａ］、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｈ８１Ａ］、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｋ８２Ａ］、および２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ４３Ａ／Ｈ８１Ａ］変異体のコンジュゲーションプロファイルを示している。方向性コンジュゲーションを維持したＣＬκ−Ｋ８０Ａを除いて、すべての変異体は、修飾されていない２．１２．１．ｆｘ抗体と比較して、平均コンジュゲーションレベルの低下を示した。
コンジュゲーションの程度を、軽鎖および重鎖上で別々に試験した。それぞれの試料を変性し、ジスルフィド結合を、グアニジン塩酸塩およびジチオトレイトールを使用して還元した。生じた遊離の軽鎖および重鎖を、ＬＣＭＳを使用して分析して、それぞれのコンジュゲーションプロファイルを決定した。２．１２．１．ｆｘおよび変異体上の軽鎖および重鎖上のコンジュゲーションプロファイルを表３４に示す。表に記載したすべての変異体は、ＣＬκ−Ｋ８０Ａを除いて、修飾されていない２．１２．１．ｆｘと比較して軽鎖上でのコンジュゲーションレベルの低下を示した。変異体の重鎖のコンジュゲーションレベルは、修飾されていない２．１２．１．ｆｘと同様のレベルであった。個々のＷＴ操作に対する１−ＬＣ％の％を、表３４に記載されているとおり、右欄に示す。
Figure 2015504893
（実施例１６）
ラムダ／カッパ置換
ｈＡｂλテスト１中のＣＬλ（配列番号１３６および１３７）を、ＬＣκで置換して、これがＣＬ特異的コンジュゲーションのレベル、方向性、および／または制御を増大させるかを決定した。ＣＬλ／ＣＬκドメイン置換ハイブリッドコンストラクトを、オーバーラップＰＣＲを使用して生成した。ＶＬλおよびＣＬκを、ｈＡｂλテストおよびカッパｍＡｂ軽鎖を、別々にテンプレートとして使用してＰＣＲ増幅した。これらの２種のＰＣＲ産物をテンプレートとして混合し；ｈＡｂλテスト１フォワードプライマーおよびＬＣＬκリバースプライマーを、オーバーラップＰＣＲ反応中で使用して、全長のｈＡｂλテストＶＬ／ＣＬκＤＮＡを増幅した。ハイブリッド抗体コンストラクトを、ＨＥＫ２９３細胞中で過渡的に発現させ、タンパク質Ａ親和カラムを使用して精製した。精製した抗体を、ＭＳを使用して特徴づけた。ｈＡｂλテストＣＬκハイブリッドは、その同族リガンドに、天然のｍＡｂ（ｈＡｂλテスト）と同様に結合した（表３５）。配列番号５９、６０、および６１は、ｈＡｂλテスト、ｈＡｂλテスト−λκ（λＪを伴う）、およびｈＡｂλテスト−λκＪ（κＪを伴う）からの軽鎖定常領域である。
Figure 2015504893
（実施例１７）
ｈＡｂλテスト１変異体：モチーフ修飾
短いモチーフ「ＫＨ」が、ＣＬλの対応する領域でのＭＡＣ形成のために十分であるかを確立するために、ｈＡｂλテスト中の残基ＣＬλ８１／８２の簡単な配列スイッチを有する変異体を、Ｋ８０のそばにヒスチジンに入れるために製造し、したがって「Ｋ８０Ｓ８１Ｈ８２」は、「Ｋ８０Ｈ８１Ｓ８２」となった。変異体を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に記載されたプロトコルに従って生成した。変異を、オリゴヌクレオチドプライマーによって導入し、ＤＮＡ配列決定によって確認した。変異抗体コンストラクトを、ＨＥＫ２９３細胞中で過渡的に発現させ、タンパク質Ａ親和カラムを使用して精製した。精製した抗体をＭＳを使用して特徴づけた。ｈＡｂλテスト−［ＣＬλ−Ｓ８１Ｈ／Ｈ８２Ｓ］（ＣＬ：配列番号６２）変異体は、そのリガンド、さらには親ｈＡｂλテスト抗体に結合した（表３６）。
Figure 2015504893
（実施例１８）
ｈＡｂλＴｅｓｔ１変異体のコンジュゲーションプロファイル
各抗体（ｈＡｂλテスト、ｈＡｂλテスト−λκ、ｈＡｂλテスト−λκＪ、およびｈＡｂλテスト−［ＣＬλ−Ｓ８１Ｈ／Ｈ８２Ｓ］）を、ｐＨ５．５の２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２００ｍのトレハロースに、２０ｍｇ／ｍｌで緩衝液交換した。次いで、タンパク質をｐＨ７．７の６０ｍＭのリン酸ナトリウムでスパイクした。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を、５０％のプロピレングリコールで再懸濁し、抗体と４．３：１のモル比で混合し、室温で一晩反応させた。すべての試料を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、サイズ排除クロマトグラフィー−質量分析（ＳＥＣ−ＭＳ）によって、インタクトなコンジュゲートされたタンパク質として分析して、コンジュゲート形態のタンパク質の数および定量化を決定した。この技術で、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定し；複数のペプチドコンジュゲーション部位は、ペプチドの質量差によって分離された別個のシグナルとして観察される。複数のペプチドコンジュゲーション種の相対的定量化を、シグナルの大きさを測定することによって行う。表３７は、コンジュゲーションの全体のレベルが、２つのＬＣがスイッチされたハイブリッドにおいて増大したことを示している（λκおよびλκＪ−前者はλＪ断片を包含し、後者はκＪ断片を包含する）。コンジュゲーションレベルは、ｈＡｂλテスト対照の平均ＣＡを超えて増大し、１．６６個から、それぞれ２．１９個（λκ）および２．５３個（λκＪ）になった。変異体は、天然の配列と比較してほとんど影響を有さず、単独の「ＫＨ」モチーフでは、ＭＡＣを形成するために十分ではないことを示唆していた。
ペプチドコンジュゲーションの程度を、軽鎖および重鎖上で別々に試験した（表３７）。各試料を変性し、ジスルフィド結合をグアニジン塩酸塩およびジチオトレイトールを使用して還元した。生じた遊離の軽鎖および重鎖を、ＬＣＭＳを使用して分析して、それぞれのコンジュゲーションプロファイルを決定した。還元分析において、天然のｈＡｂλテストのＬＣは、５％のみの１ＣＡを有するが、これは、ｈＡｂλテスト−λκでは５８％の１ＣＡに、かつｈＡｂλテスト−λκＪでは６３％の１ＣＡに劇的に跳ね上がる。ＬＣスイッチは、ＨＣコンジュゲーションのレベルにほとんど作用を有さず、これは、明らかに一定なままであった（ＨＣコンジュゲーションが中程度に増大するλκＪを除いて）。再び、変異体は、天然の配列と比較してほとんど作用を有さず、単独の「ＫＨ」モチーフではＭＡＣ形成のために十分ではないことを示唆していた。個々のＷＴ操作に対する１−ＬＣ％の％を、表３７に記載されているとおり、右欄に示す。
Figure 2015504893
これらのコンジュゲート形態の受容体結合の特質も評価して、コンジュゲートされた抗体がそのリガンドになお結合する能力に対する、［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］とのコンジュゲーションの作用を決定した（表３８）。
Figure 2015504893
（実施例１９）
種々の脱離基を使用してのＭＡＣの生成
活性なエステル脱離基の活性化の程度および／または構造が、方向性コンジュゲーション作用の決定において重要であるかを調査するために、［ＰＦＰ−ＰＥＧ２−ＭＡＬ−ＫＳＨ １１−配列番号２７］の一連の代替活性化エステル類似体を合成した。コンジュゲート生成物の分布を、インタクトなコンジュゲートのＭＳによって試験し、インタクトなコンジュゲートの還元ならびに軽鎖および重鎖の分離の後に、軽鎖および重鎖の両方へのペプチド付加の程度もＭＳによって決定した。
代替活性化エステルの構造および命名を、以下に示す。代替活性化ペプチドを、上記で示したものと同じ戦略および方法を使用して合成した。簡単には、それぞれの活性化された基を、Ｚ＊がＰＦＰに置き換わる新しい脱離基を表すＭＡＬ−ＰＥＧ２−Ｚ＊リンカーに組み込んだ。上記の化合物を合成するために、精製されたＡＢＰ−チオールペプチド（すなわち、連結残基としてＫＳＨを有するＡＢＰ）の試料（３０〜４０ｍｇ）を無水のＤＭＦ（２ｍｌ）に溶かした。ＭＡＬ−ＰＥＧ２−Ｚ＊（２０ｍｇ）を、Ｎ−メチルモルホリン（５ｍＬ）と共に加えた。反応物を撹拌し、生成物の形成の時間経過を追跡するために室温でＨＰＬＣによってモニタリングした。活性化エステルが連結されたＡＢＰ生成物への出発ペプチドの完全な転換は、２〜６時間以内に観察された。溶液を濾過し、生成物のピークを、半分取ＨＰＬＣによって直接単離した。生成物を、凍結乾燥後、約３０〜５０％の範囲の収率で単離した。
コンジュゲーション反応を標準的な条件下で行った。簡単には、２．１２．１．ｆｘ溶液をｐＨ７．７のリン酸ナトリウムで０．０６Ｍの最終濃度に希釈することによって、２．１２．１．ｆｘ抗体溶液を調製した。別に、ペプチドを２０ｍｇ／ｍｌまでプロピレングリコールに溶かし、次いで、この溶液を水で１０ｍｇ／ｍｌに希釈することによって、ペプチド溶液を調製した。コンジュゲーション反応のために、ペプチドおよび抗体溶液を４：１のモル比で、規定された時間混合した。時間経過研究のために、コンジュゲーション反応の試料を、ｐＨ４．０の４０ｍＭのコハク酸、２００ｍＭのグリシン（１：１、ｖ／ｖ）の溶液と混合することによって、コンジュゲーション溶液の試料を様々な時点でクエンチした。コンジュゲーション反応の時間経過を、ＨＰＬＣによって追跡した。配列番号２７を、例示的なペプチドとして使用した。
Figure 2015504893
表３９は、コンジュゲーション反応が開始してから２４時間後のインタクトなコンジュゲートの最終生成物分布を示す。結果は、エステルの一部は全く反応せず（Ｚ４、Ｚ１２）、他は鈍く反応した（例えば、Ｚ５）一方で、いくつかはＰＦＰ（Ｚ１）のプロファイルに迫るプロファイルをもたらした（例えば、Ｚ３）ことを示している。
コンジュゲーションの動態
それぞれの最終コンジュゲートについての経時的な付加速度を、表３９、４０、４１、および４２に示す。０ＣＡは、誘導体化されていない２．１２．１．ｆｘ抗体を表す一方で、１ＣＡ、２ＣＡ、または３ＣＡは、それぞれの試験時点での２．１２．１．ｆｘ抗体への１、２、または３個のペプチドの付加を表す。
Figure 2015504893
Figure 2015504893
Figure 2015504893
Figure 2015504893
軽鎖および重鎖の分布
それぞれの代替活性化エステルについてのペプチドコンジュゲーションの程度を、軽鎖および重鎖について別々に試験した。それぞれの試料を変性し、ジスルフィド結合を、グアニジン塩酸塩およびジチオトレイトールを使用して還元した。生じた遊離の軽鎖および重鎖を、ＬＣＭＳを使用して分析して、それぞれのコンジュゲーションプロファイルを決定した。２．１２．１．ｆｘおよび変異体の軽鎖および重鎖上のペプチドコンジュゲーションプロファイルを、表４４に示す。同様のコンジュゲーションレベルを示した２，３，６−トリフルオロフェニル（Ｚ３）を除いて、表に列挙したほとんどすべての活性化ペプチドは、ＰＦＰ（Ｚ１）を使用する化合物と比較して、軽鎖上のコンジュゲーションレベルの低下を示した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）から誘導された活性化されたエステル、すなわち、Ｎ−ヒドロキシル−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミドおよび２−ヒドロキシル−イソインドリン−１，３−ジオン（Ｚ８およびＺ９）は、重鎖の誘導体化に対してより大きな傾向を示した。
Figure 2015504893
Figure 2015504893
Figure 2015504893
Figure 2015504893
（実施例２０）
代替活性化エステルのさらなる例を、表４５に示す。ＰＦＰエステルのいくつかの類似体のコンジュゲーションの時間経過を試験した。ＰＦＰ中のフッ素基の数および位置を低減することによって、より反応性の低い活性なエステルの形態を合成することができ、調査した。２，３，５，６−テトラフルオロフェニルエステルおよび２，４，６−トリフルオロフェニルエステルの両方を、［ＰＥＧ２−ＭＡＬ−ＫＳＨ １１−配列番号２７］へのコンジュゲーション後に試験した。１−ヒドロキシル−ピロリジン−２，５−ジオン（ＮＨＳ）を、［ＰＥＧ２−ＭＡＬ−ＫＳＨ １１−］にコンジュゲートさせた。
Figure 2015504893
 ２時間のコンジュゲーションの後に、これらのより低く活性化された形態は、ＰＦＰよりも低い２．１２．１．ｆｘに対する全体コンジュゲーションをもたらした。ＮＨＳ基も、より低い全体コンジュゲーションを示した。ＮＨＳおよびＰＦＰを含有するペプチドは、２．１２．１．ｆｘにコンジュゲートされた。還元された形態を、２時間目での分布を観察するために分析した。ＰＦＰは、１−ヒドロキシル−ピロリジン−２，５−ジオン（ＮＨＳ）（ＬＣには全体で３１％、ただし重鎖には全体で３４％）と比較して、軽鎖の誘導体化について、はるかに大きい傾向（ＬＣには全体で７７％、重鎖には６％のみ）を示した。
Figure 2015504893
化合物Ｚ１〜Ｚ１５は、様々な異なる構造の種類の活性なエステルを表す。これは、芳香環の周りに異なる数およびパターンのフッ素原子の置換を有する一連のフッ素化された芳香族の活性なエステル（化合物Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ１１、Ｚ１４、およびＺ１５）を考慮し、これらの構造が、タンパク質の誘導体化のためのその反応性および傾向にどのような影響を及ぼすかを考慮することを啓発している。これらの誘導体の抗体コンジュゲーションの動態は、ペンタフルオロフェニル（Ｚ１）の反応が完了している２時間の時点で好都合に比較することができる。環の周りでのフッ素置換のレベルが上昇するにつれて、全体のコンジュゲーションレベルは上昇し、それに随伴して、未反応抗体が減少する。反応の速度は、フッ素化されたフェノール脱離基のｐＫａに直接関係し、その際、最も酸性のフェノールがより高い反応速度をもたらす。コンジュゲーションの速度は、Ｚ１＞Ｚ１４＞Ｚ３＞Ｚ１５＞Ｚ２＞Ｚ１１である。フッ素置換パターンの些少の影響は、化合物Ｚ２、Ｚ３、およびＺ１５を比較することによって観察することができる。
活性なエステルの構造も、コンジュゲーション反応の方向性に有意に影響を及ぼした。一般的に、フッ素化された芳香族エステルは、軽鎖誘導体化（先に記述したとおり主としてＣＬκ−Ｋ８０）に対する顕著な傾向を示した。対照的に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体をベースとするいくつかのエステル（Ｚ８、Ｚ９、およびＺ１３）は、より低い優先性を示し、その際、多くの場合に、より高いレベルの重鎖誘導体化が観察された。
（実施例２１）
ＭＡＣ−１（ペプチドとＰＦＰ活性化基との間にＰＥＧ２−ＭＡＬ−メルカプトプロピオニルリンカー）とＭＡＣ−２（ペプチドとＰＦＰ活性化基との間に直鎖ＰＥＧ５リンカー）とでコンジュゲーションの速度を評価した。表４６は、２．１２．１ｘに対して、これらの活性化されたペプチドを比較している。結果は、これらの活性化されたペプチドは、これらの僅かに異なるリンカーの構造にもかかわらず、誘導体化の速度および程度の点においてかなり同様の行動をとることを示している。
Figure 2015504893
（実施例２２）
リンカーの長さの作用
異なる長さのリンカーを有することによる最終コンジュゲート分布プロファイルに対する作用を試験した。ペプチドをＰＦＰ基に接合する種々のＰＥＧ長さのリンカーを用いて、化合物を合成した。０、１、２、３、および４個のペプチドの２．１２．１．ｆｘへの付加についての結果を、表４７にまとめる。概して、ＰＥＧリンカーの長さを変化させることは一般的に、得られるコンジュゲートの分布にほとんど作用を有さなかった。
Figure 2015504893
（実施例２３）
代替ペプチド配列のコンジュゲーション
他のペプチド配列への本発明の適用可能性を確認するために、配列番号８０および配列番号８１（テスト−ペプチド−１および−２）をコンジュゲートさせた。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］との反応のために先に最適化した条件下で、配列番号８０および８１を［ＰＦＰ−ＰＥＧ５］と、次いで、２．１２．１．ｆｘとコンジュゲートさせた。コンジュゲーションプロファイルおよびＬＣ／ＨＣコンジュゲーションの分析の結果を表４８に示す。配列番号８０および配列番号８１は両方とも、軽鎖に対する方向性コンジュゲーションを示した。ＬＣ／ＨＣ分布をさらに分析すると、約７０％のＬＣの誘導体化およびＨＣでは１０％未満の誘導体化で、ＭＡＣ−２のプロファイルと同様のプロファイルが観察された。
Figure 2015504893
（実施例２４）
ペプチドコンジュゲーションの分析のまとめ
ペプチドマッピング実験を、抗体の軽鎖上のＣＬκ−Ｋ８０での方向性コンジュゲーションへと導く重要なパラメーターを確認する目的で、ある範囲のタンパク質／コンジュゲートの組合せについて行った。表４９に、行ったペプチドマッピング実験の結果を列挙する。各研究パラメーターのために、先に記載したペプチドマッピング手順を使用した。「＊＊＊」は、ＣＬκ−Ｋ８０に対する高いレベルの方向性コンジュゲーションを示す。「＊＊」およびより低い程度に対する「＊」は、方向性コンジュゲーションはまだ観察されるが、より遅い反応条件、より少ない全体コンジュゲーション、または一方の軽鎖のみにおける平均などの差を示すことができ、したがって、抗体１個当たり０．５〜１．５個のペプチドを有するＭＡＣを生成するなどの特殊な状況（例えば）には、より適し得ることを示す。「−」は、これらの反応条件が、ＣＬκ−Ｋ８０での方向性コンジュゲーションに対して好ましいとは考えられないことを示す。
ＣＬκ−Ｋ８０が、ＭＡＣ−２では方向性コンジュゲーションの位置であると観察されたので、別のパラメーターでのペプチドマッピング研究は、この位置に焦点を合わせた。それぞれの研究のパラメーターについての詳細なペプチドマッピングデータは包含されていないが、しかし、他のＫ残基では有意なコンジュゲーションレベルは観察されず、他のＭＡＣの観察は、ＣＬκ−Ｋ８０における方向性コンジュゲーションと一致した。
２．１２．１．ｆｘのＣＬκ−Ｋ８０ＲおよびＣＬκ−Ｋ８０Ａの変異は、この部位での方向性コンジュゲーションの喪失をもたらし；この特異的残基の本質的な役割を示唆していた。ＣＬκ−Ｋ８２ＲおよびＣＬκ−Ｋ８２Ａの変異は、ＣＬκ−Ｋ８０に対する方向性コンジュゲーションを妨害せず、なおこれを増大させ得る。試験された他の研究パラメーターのうち、軽鎖定常領域のサブタイプの少なくとも一部は、方向性コンジュゲーションに対して有意な影響を有することが観察された；軽鎖サブタイプカッパの少なくとも一部は、必要であると決定された。ＣＬλサブタイプへのコンジュゲーション（例示的なλ含有抗体、ｈＡｂλテスト１を使用）は、方向性コンジュゲーションを実証しなかった。ｈＡｂλテスト１のＬＣλをＣＬκに変異させると、Ｋ８０における方向性コンジュゲーションは回復された。
Figure 2015504893
（実施例２５）
ＣＬκ−Ｄ７７の試験
３Ｄ構造においてＣＬκ−Ｋ８０に地理的に近い残基を試験した。当初の結晶構造分析は、ＣＬκ−Ｄ７７が、ＣＬκ−Ｋ８０方向性コンジュゲーションに対して影響を有し得るＣＬκ−Ｋ８０との塩橋を形成し得る可能性を示唆した。ＣＬκ−Ｋ８０へのコンジュゲーションに対するＣＬκ−Ｄ７７の作用を研究するために、ＣＬκ−Ｄ７７を２．１２．１．ｆｘ抗体上でＣＬκ−Ａ７７に変異させて、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］（配列番号３７のＣＬκ）を作成した。ＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標））に記載されているプロトコルに従って抗体軽鎖上で生成した。変異をオリゴヌクレオチドプライマーによって導入し、ＤＮＡ配列決定によって確認した。２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］を、ＨＥＫ２９３細胞中で過渡的に発現させ、タンパク質Ａ親和カラムを使用して精製した。精製したｍＡｂを、ＭＳを使用して特徴づけた。
２．１２．１．ｆｘおよび２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］（反応サイズは１ｍｇ）を１８ｍｇ／ｍｌに、ｐＨ７．７にリン酸緩衝液を用いて、０．０６Ｍのリン酸ナトリウム最終濃度に調整した。例示的な試験ペプチド−リンカー対［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］をプロピレングリコール溶液中で１０ｍｇ／ｍｌに再構成した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］を抗体に４．３：１のモル比で加え、室温で２時間反応させた。コンジュゲート生成物を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、ＳＥＣ−ＭＳによって、インタクトなコンジュゲートされたタンパク質として分析して、コンジュゲート形態のタンパク質の数および定量化を決定した。複数のペプチド−リンカーコンジュゲーション種の相対的定量化を、シグナルの大きさを測定することによって行った。
表５０は、［２．１２．１．ｆｘ］−［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］および［２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］−［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］のコンジュゲーションプロファイルを比較している。［２．１２．１．ｆｘ］−［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］のコンジュゲーションプロファイルは、０〜４個のペプチド付加の分布として、最大形態は２個のペプチド付加であるように起こり、ペプチドの付加の平均個数は２．１６個である。骨格タンパク質において残基ＣＬκ−Ｄ７７をＣＬκ−Ａ７７に変異させた場合のプロファイル変化；ペプチド付加の平均個数は２．３８個に上昇し、かなり少ない単一ペプチド付加が観察される。この結果は、単一の点突然変異ＣＬκ−Ｄ７７Ａは、骨格に対する全体コンジュゲーションを増大させる効果を有することを示唆している。両方の条件において、反復分析（ｎ＝３）は、観察されたコンジュゲーションプロファイルは再現可能であることを実証している。
ペプチドコンジュゲーションの程度を２．１２．１．ｆｘおよび２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］の軽鎖および重鎖で別々に試験した。生成したＭＡＣを変性し、ジスルフィド結合を、グアニジン塩酸塩およびジチオトレイトールを使用して還元した。生じた遊離の軽鎖および重鎖を、ＬＣＭＳを使用して分析して、それぞれのコンジュゲーションプロファイルを決定した。表５０は、平均コンジュゲーションが、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］の軽鎖において、２．１２．１．ｆｘの軽鎖よりも多いこと；２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］での平均コンジュゲート付加値が、２．１２．１．ｆｘでの０．８５個と比較すると１．１５個であることを実証している。加えて、コンジュゲートされていない軽鎖は、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］では検出されない。重鎖上でのコンジュゲーションは、かなり低いレベルで観察される。２．１２．１．ｆｘおよび２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］の両方について、観察された重鎖の大部分はコンジュゲートされていない；このことは特に、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］重鎖の場合に当てはまる。これらの結果は、ＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異は、軽鎖を、それが有意によりコンジュゲートされやすいように変更することを示唆している。複数の科学者によるこの実験の反復分析を、コンジュゲーションのプロファイルが一貫しており、再現可能であることを実証する表５０に示す。
Figure 2015504893
（実施例２６）
２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］−［配列番号２７−Ｋ１１−ＰＥＧ５］の重鎖および軽鎖基準生成物のペプチドマッピング特徴づけ
２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］−［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］コンジュゲート抗体を、ジチオスレイトールで還元し、システイン残基を、ヨードアセトアミドでのカルボキシメチル化によってアルキル化した。キモトリプシンをタンパク分解性消化のために使用した。溶液中の消化された断片を、ＬＣＭＳを使用して分析した。個々の断片をＣ１８のＨＰＬＣカラムで分離し、それらの正確な質量をＱ−ＴｏＦ質量分析計で測定した。生じた断片の質量を使用して、修飾されていない断片または［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］コンジュゲーション基で修飾された断片を同定した。この実験は、リシン残基を含有し、したがって、ペプチドコンジュゲーションのための可能な部位であるするキモトリプシン断片に焦点を当てることによって解釈された。表５１および５２は、それぞれ重鎖および軽鎖上のそのような断片すべてを列挙している。空白の項目は、この技術を使用して検出されなかった断片である。［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］修飾物質と共に観察された検出された断片は、ペプチドコンジュゲーションの潜在的部位であると考えられる。
２個の［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］−コンジュゲーション断片を、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］−［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］生成物のＬＣＭＳペプチドマッピングを使用して検出した。これらのコンジュゲート断片は両方とも、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］抗体の軽鎖上に存在した。これに対して、［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］にコンジュゲートされた８個の断片が、２．１２．１．ｆｘ−［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］では検出された。
総じて、これらの結果は、ＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異体におけるコンジュゲーションレベルが、より僅かなコンジュゲーション部位で上昇することを示唆しており、変異されていない抗体に対してコンジュゲーション特異性の増大をおそらく示唆している。さらに、構造分析は、ＣＬκ−Ｄ７７残基が、同定された主なコンジュゲーション部位ＣＬκ−Ｋ８０の近接（＜１０Å）にあることを示している。おそらく塩橋である静電相互作用が、ＣＬκ−Ｄ７７のカルボン酸とＣＬκ−Ｋ８０の第一級アミンとの間に存在し得ることが推量された。ＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異は、そのような静電相互作用を破壊して、ＣＬκ−Ｋ８０上の反応性アミンをより露出させて、本発明の反応性エステルとコンジュゲーションしやすいものとするのであろう。精巧なモデリングと結びつけられる後続の分析は、より完全な反応部位の画像を構成するために役立ち、ＣＬκ−Ｄ７７がその作用を主に、ＣＬκ−Ｈ８１とのその相互作用を介して発揮することを示しているが、ＣＬκ−Ｄ７７とＣＬκ−Ｋ８０との間の相互作用の当初の仮定は、ＣＬκ−Ｄ７７残基の重要性を裏打ちする際に役立った。
２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］−［ＰＥＧ５−Ｋ１１配列：２７］生成物において観察されたコンジュゲーション部位は、軽鎖キモトリプシン断片Ｙ３およびＹ１５である。これらの断片についてのシグナル強度の分析は、ＣＬκ−Ｋ８０残基を持つ断片Ｙ１５が主なコンジュゲーション部位であることを示唆している。断片Ｙ１５は、［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］−修飾断片として、非常に高いシグナル強度（１１１８５７２カウント、表５２）で観察されるに過ぎないが、Ｙ１５の修飾されていない形態は観察されず、このことは、すべて、またはほぼすべてのＹ１５の断片が、修飾された形態で存在することを示唆している。断片Ｙ３は、［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］−修飾された形態および修飾されていない形態の両方で観察された；２．１２．１．ｆｘ−［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］および２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］−［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］における修飾されていないＹ３のシグナル強度は、１５％以内である。［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］−修飾Ｙ３は、相対的に低いレベル（９７３７カウント、表５２）で観察された。
表５１および５２についての表の項目を以下に説明する：
断片番号：Ｎ末端からのキモトリプシン断片ナンバリング；接合された断片（すなわち、Ｙ１〜２）は、欠損した開裂部位を示す。
始点／終点：Ｎ末端からの断片位置のナンバリング。
断片質量（Ｄａ）：ダルトンで記載された断片の理論的質量。
保持時間（対照／分析物）：ＬＣＭＳペプチドマッピング実験におけるクロマトグラフィーの保持／溶離の時間。
ＭＳシグナル強度（対照／分析物）：ＭＳによって観察された観察シグナルの大きさ。
質量誤差−ｐｐｍ（対照／分析物）：ペプチド断片の理論質量と観察質量との比較；ゼロ（０）に近い値は、良好な質量確度を実証している。保持時間、ＭＳシグナル強度、および質量誤差についての対照タンパク質は、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］であり、それぞれの場合の分析物であるタンパク質は、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］＋［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］である。
修飾物質：断片に対する潜在的共有結合的付加；リシン残基の［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］−抗体結合ペプチド、ＣＡＭ−システイン残基のカルボキシメチル化。
Figure 2015504893
Figure 2015504893
Figure 2015504893
（実施例２７）
ＣＬκ−Ｄ７７変異の試験
２．１２．１．ｆｘ抗体のＣＬκ−Ｄ７７残基を、ＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異に加えて、他の１８種のアミノ酸にそれぞれ変異させた。ＣＬκ−Ｄ７７Ｇ（配列番号３８）、ＣＬκ−Ｄ７７Ｌ（配列番号４０）、ＣＬκ−Ｄ７７Ｓ（配列番号４９）、ＣＬκ−Ｄ７７Ｅ（配列番号５３）、およびＣＬκ−Ｄ７７Ｒ（配列番号５４）ならびに変異体を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標））に記載されているプロトコルに従って生成した。変異を、オリゴヌクレオチドプライマーによって導入し、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ＣＬκ−Ｄ７７部位での他の１３種の変異体（ＣＬκ−Ｄ７７Ｖ（配列番号３９）、ＣＬκ−Ｄ７７Ｉ（配列番号４１）、ＣＬκ−Ｄ７７Ｐ（配列番号４２），ＣＬκ−Ｄ７７Ｆ（配列番号４３）、ＣＬκ−Ｄ７７Ｗ（配列番号４４）、ＣＬκ−Ｄ７７Ｙ（配列番号４５）、ＣＬκ−Ｄ７７Ｈ（配列番号４６）、ＣＬκ−Ｄ７７Ｍ（配列番号４７）、ＣＬκ−Ｄ７７Ｃ（配列番号４８）、ＣＬκ−Ｄ７７Ｔ（配列番号５０）、ＣＬκ−Ｄ７７Ｑ（配列番号５１）、ＣＬκ−Ｄ７７Ｎ（配列番号５２）、ＣＬκ−Ｄ７７Ｋ（配列番号５５））を、Ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に記載されているプロトコルに従って生成した。変異を、オリゴヌクレオチドプライマーによって導入し、ＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩでカットされた修飾ｐ２．１２．１．ｆｘＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。挿入ＤＮＡを、ＤＮＡ配列決定により確認した。変異させたｍＡｂをＨＥＫ２９３細胞中で過渡的に発現させ、タンパク質Ａ親和カラムを使用して精製した。精製したｍＡｂを、ＭＳを使用して特徴づけた。
２．１２．１．ｆｘおよび２．１２．１．ｆｘ変異体を１８ｍｇ／ｍｌに、ｐＨ７．７にリン酸緩衝液を用いて、０．０６Ｍのリン酸ナトリウムの濃度に調整した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］をプロピレングリコール溶液中で、１０ｍｇ／ｍｌに再構成した。ペプチド／リンカーを抗体に、４．３：１のモル比で加え、室温で２時間反応させた。
表５３に、ＣＬκ−Ｄ７７変異体の全体コンジュゲーションプロファイルを記載する。ＣＬκ−Ｄ７７Ｃは、遊離システインの導入によって凝集し、結果を解釈することができなかった。変異ＣＬκ−Ｄ７７Ｗ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｍ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｈ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｑ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｎ、およびＣＬκ−Ｄ７７Ｖは、野生型２．１２．１．ｆｘと比較して、全体コンジュゲーションプロファイルを変化させなかった。変異ＣＬκ−Ｄ７７Ｆ、ＣＬκ−ＣＬκ−Ｄ７７Ｋ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｙ、およびＣＬκ−Ｄ７７Ｅは、コンジュゲーションの全体レベルを低下させた。変異ＣＬκ−Ｄ７７Ｐ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｉ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｔ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｒ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｌ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｓ、およびＣＬκ−Ｄ７７Ｇは、コンジュゲーションレベルを上昇させた。
還元されたＬＣおよびＨＣの分析は、変異ＣＬκ−Ｄ７７Ｆ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｋ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｙ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｅ、およびＣＬκ−Ｄ７７Ｃのみが、軽鎖におけるコンジュゲーションレベルの低下をもたらすことを示した。軽鎖におけるコンジュゲーションレベルは、ＣＬκ−Ｄ７７Ｍ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｈ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｑ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｎ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｗ、およびＣＬκ−Ｄ７７Ｖでは上昇した（そして、重鎖におけるコンジュゲーションはやや低下した）。変異ＣＬκ−Ｄ７７Ｐ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｉ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｔ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｒ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｌ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｓ、およびＣＬκ−Ｄ７７Ｇは、コンジュゲートされていない軽鎖のレベルの低下によって、軽鎖におけるコンジュゲーションのレベルを上昇させた。ＣＬκ−Ｄ７７Ｋは、潜在的なコンジュゲーション部位である別のリシンの導入によって、軽鎖における２コンジュゲートのレベルを上昇させた。
Figure 2015504893
（実施例２８）
コンジュゲーションに対する、ＣＨκ領域への他の変異の作用
ＣＬκ−Ｄ７７Ａに加えて、ＣＬκ−Ｋ８０から１０Å距離内の他の残基をアラニンに変異させた：ＣＬκ−Ｋ４１Ａ（配列番号２０）、Ｖ４２Ａ（配列番号２１）、ＣＬκ−Ｄ４３Ａ（配列番号５６）、ＣＬκ−Ｎ４４Ａ（配列番号２２）、ＣＬκ−Ｌ４６Ａ（配列番号２３）、ＣＬκ−Ｑ４７Ａ（配列番号２４）、ＣＬκ−Ｓ４８Ａ（配列番号２５）、ＣＬκ−Ｎ５０Ａ（配列番号２６）、ＣＬκ−Ｌ７３Ａ（配列番号２８）、ＣＬκ−Ｓ７４Ａ（配列番号２９）、ＣＬκ−Ｋ７５Ａ（配列番号３０）、ＣＬκ−Ｙ７８Ａ（配列番号３１）、ＣＬκ−Ｅ７９Ａ（配列番号３２）、ＣＬκ−Ｈ８１Ａ（配列番号３３）、ＣＬκ−Ｖ８３Ａ（配列番号３４）、ＣＬκ−Ｙ８４Ａ（配列番号３５）、およびＣＬκ−Ｒ１０３Ａ（配列番号３６）もＡｌａに変異させた。ＣＬκ−Ｄ４３ＡおよびＣＬκ−Ｈ８１Ａのデータは実施例１４において検討している。
三方向連結法（ｔｈｒｅｅ ｗａｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を使用して、Ｌ７３Ａ変異体を、２．１２．１．ｆｘ ＣＬκに導入した。２．１２．１．ｆｘ−ＬＣの５’末端に特異的なプライマー（２．１２．１．ｆｘ．ＬＣ．ＦＯＲ：配列番号８５）および所望のＬ７３Ａ変異を含有するリバースプライマー（Ｌ１８１Ａ．ＲＥＶ：配列番号８８）を使用して、２．１２．１．ｆｘ−ＬＣ ＤＮＡをＰＣＲテンプレートとして使用して、２．１２．１．ｆｘ−ＬＣの最初の半分をＰＣＲした。次いで、このＰＣＲ断片を、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＢｓａＩを使用して消化した。２．１２．１．ｆｘ−ＬＣの３’末端に特異的なリバースプライマー（２．１２．１．ｆｘ．ＬＣ．ＲＥＶ：配列番号８６）と対になっているＣＬκ−Ｌ７３Ａ変異（Ｌ１８１Ａ．ＦＯＲ：配列番号８７）を含有するフォワードプライマーを使用して、２．１２．１．ｆｘ−ＬＣ ＤＮＡをＰＣＲテンプレートとして使用して、変異を有する２．１２．１．ｆｘ−ＬＣ ＤＮＡ断片の後の半分をＰＣＲ増幅した。次いで、このＰＣＲ断片を、制限酵素ＢｓａＩおよびＮｈｅＩを使用して消化した。２つの制限酵素で消化されたＰＣＲ断片を、ＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩでカットされた修飾ｐ２．１２．１．ｆｘＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））と連結させた。挿入配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｌ７３Ａ］（すなわち、配列番号２８を含む）をＨＥＫ２９３細胞中で過渡的に発現させ、タンパク質Ａ親和カラムを使用して精製した。精製したｍＡｂを、ＭＳを使用して特徴づけた。
ＣＬκ−Ｖ４２ＡおよびＣＬκ−Ｋ７５Ａ変異体をオーバーラップＰＣＲを使用して生成した。変異をオリゴヌクレオチドプライマーによって導入した。所望の変異を有するリバースプライマーと対になっている２．１２．１．ｆｘ−ＬＣ（２．１２．１．ｆｘ．ＬＣ．ＦＯＲ）の５’末端に特異的なプライマー、および２．１２．１．ｆｘ軽鎖の３’末端に特異的なリバースプライマーと対になっている所望の変異を有するフォワードプライマー（２．１２．１．ｆｘ．ＬＣ．ＦＯＲ）を使用して、２．１２．１．ｆｘ−ＬＣをテンプレートとして使用して、２．１２．１．ｆｘ−ＬＣ ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。これら２種のＰＣＲ生成物を、テンプレートとして混合し；２．１２．１．ｆｘ−ＬＣフォワードプライマーおよびリバースプライマーを、オーバーラップＰＣＲ反応において使用して、所望の変異を有する全長２．１２．１．ｆｘ−ＬＣ ＤＮＡを増幅した。次いで、ＰＣＲを制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩで消化した。消化されたＰＣＲを、ＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩでカットされた修飾ｐ２．１２．１．ｆｘＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））と連結させた。挿入配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。変異させたｍＡｂをＨＥＫ２９３細胞中で過渡的に発現させ、タンパク質Ａ親和カラムを使用して精製した。精製したｍＡｂを、ＭＳを使用して特徴づけた。
他の変異体を、２．１２．１．ｆｘ−ＬＣにおいて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標））に記載されているプロトコルに従って生成した。変異を、オリゴヌクレオチドプライマーによって導入し、ＤＮＡ配列決定によって確認した。変異したｍＡｂを、ＨＥＫ２９３細胞中で過渡的に発現させ、タンパク質Ａ親和カラムを使用して精製した。精製したｍＡｂを、ＭＳを使用して特徴づけた。
２．１２．１．ｆｘおよび２．１２．１．ｆｘ変異体（反応サイズは１ｍｇ）を１８ｍｇ／ｍｌに、ｐＨ７．７にリン酸緩衝液を用いて、０．０６Ｍのリン酸ナトリウム最終濃度に調整した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］をプロピレングリコール溶液中で１０ｍｇ／ｍｌに再構成した。ペプチド／リンカーを抗体に４．３：１のモル比で加え、室温で２時間反応させた。
表５４は、２．１２．１．ｆｘ−［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］のコンジュゲーションプロファイルを２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−変異体］−［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］のコンジュゲーションプロファイルと比較している。２．１２．１．ｆｘ−［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］のコンジュゲーションプロファイルは、０〜４個のペプチド付加の分布として起こり、その際、最多の形態は２個のペプチド付加である。残基をＡｌａに骨格タンパク質において変異させると、プロファイルが変化する；［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］付加の平均個数は、それらの対応する２．１２．１．ｆｘ−［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］対照と比較すると、低下するか（ＣＬκ−Ｖ４２Ａ、ＣＬκ−Ｌ４６Ａ、ＣＬκ−Ｓ７４Ａ、ＣＬκ−Ｙ７８ＡおよびＣＬκ−Ｙ８４Ａ）、または増大した（ＣＬκ−Ｑ４７Ａ、ＣＬκ−Ｎ５０Ａ、およびＣＬκ−Ｄ７７Ａ／Ｅ７９Ａの二重変異体）。ＣＬκ−Ｄ７７Ａ／Ｅ７９ＡのコンジュゲーションプロファイルをＣＬκ−Ｅ７９Ａのコンジュゲーションプロファイルと比較すると、抗体に対する平均［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］付加の有意な増大は、主にＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異によるものである。
［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］コンジュゲーションの程度を、２．１２．１．ｆｘおよび２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−変異体］の軽鎖および重鎖で別々に試験した。ＭＡＣを変性し、ジスルフィド結合を、グアニジン塩酸塩およびジチオトレイトールを使用して還元した。生じた遊離の軽鎖および重鎖を、ＬＣＭＳを使用して分析して、それぞれでのコンジュゲーションプロファイルを決定した。表５４は、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｑ４７Ａ］および−［ＣＬκ−Ｎ５０Ａ］の軽鎖上の１ＣＡが、２．１２．１．ｆｘにおいてよりも多いことを実証している。平均ＣＡは、２．１２．１．ｆｘ抗体の０．７８個と比較して、０．８４個および０．８５個である。ＣＬκ−Ｑ４７ＡおよびＣＬκ−Ｎ５０Ａ変異体は両方とも、２．１２．１．ｆｘ野生型抗体の５９％の１ＣＡと比較して、７０％超の１ＣＡを有する。加えて、これら２種の変異体のコンジュゲートされていない軽鎖のレベルは、野生型抗体の３１％から、２２％および１９％へと低下した。Ｖ４２Ａは、軽鎖コンジュゲーションのレベルを低下させた。平均軽鎖ＣＡは０．４５個であり、５９％のコンジュゲートされていない軽鎖および３７％の１ＣＡである。個々のＷＴ操作に対する１−ＬＣ％の％を、表５４に記載されているとおり、右欄に示す。
［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］へのＣＬκ−Ｖ４２Ａ、ＣＬκ−Ｑ４７Ａ、およびＣＬκ−Ｎ５０Ａのコンジュゲーションを繰り返し、結果を表の下部に示す。ＣＬκ−Ｑ４７ＡおよびＣＬκ−Ｎ５０Ａにおける軽鎖コンジュゲーションのレベルの上昇と、ＣＬκ−Ｖ４２Ａにおける軽鎖コンジュゲーションの減少を、インタクトおよび還元の両方のＬＣ−ＭＳ分析によって確認した。概して、コンジュゲーションデータは、ＣＬκ−Ｖ４２、ＣＬκ−Ｄ４３、およびＣＬκ−Ｈ８１がすべて、ＣＬκ−Ｋ８０でのＰＦＰ方向性コンジュゲーションについて影響を有することを示唆している。
Figure 2015504893
（実施例２９）
ＣＬκ−Ｄ４３ＡおよびＣＬκ−Ｈ８１Ａ変異体の分析
ＣＬκ−Ｄ４３の電荷、水素結合、またはサイズが、ＣＬκ−Ｋ８０方向性コンジュゲーションにとって重要であるかを決定するために、ＣＬκ−Ｄ４３をＣＬκ−Ｄ４３Ｅ（配列番号１０７）、ＣＬκ−Ｄ４３Ｎ（配列番号１０８）、およびＣＬκ−Ｄ４３Ｌ（配列番号１０９）にそれぞれ変異させた。変異体を、２．１２．１．ｆｘ抗体軽鎖でＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標））に記載されているプロトコルに従って生成した。変異を、オリゴヌクレオチドプライマーによって導入し、ＤＮＡ配列決定によって確認した。変異させたｍＡｂを、ＨＥＫ２９３細胞中で過渡的に発現させ、タンパク質Ａ親和カラムを使用して精製した。精製したｍＡｂを、ＭＳを使用して特徴づけた。
同様に、ＣＬκ−Ｈ８１の役割を評価するために、試験抗体２．１２．１．ｆｘの次の変異体バージョンを評価した：ＣＬκ−Ｈ８１Ｎ（配列番号１１０）、ＣＬκ−Ｈ８１Ｑ（配列番号１１１）、ＣＬκ−Ｈ８１Ｙ（配列番号１１２）、ＣＬκ−Ｈ８１Ｗ（配列番号１１３）、およびＣＬκ−Ｈ８１Ｆ（配列番号１１４）。
２．１２．１．ｆｘ抗体および２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−変異体］−抗体（反応サイズは１ｍｇ）を１８ｍｇ／ｍｌに、ｐＨ７．７にリン酸緩衝液を用いて、０．０６Ｍのリン酸ナトリウム最終濃度に調整した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］をプロピレングリコール溶液中で１０ｍｇ／ｍｌに再構成した。ペプチド／リンカーを抗体に４．３：１のモル比で加え、室温で２時間反応させた。
ＣＬκ−Ｄ４３Ｎは、野生型抗体と比較すると、同様の全体コンジュゲーションおよび軽鎖レベルを有する（表５５）。ＣＬκ−Ｄ４３ＥおよびＣＬκ−Ｄ４３Ｌは、全体コンジュゲーションレベル、軽鎖コンジュゲーションレベルの低下を示した。
ＣＬκ−Ｈ８１Ｎ、ＣＬκ−Ｈ８１Ｑ、ＣＬκ−Ｈ８１Ｙ、ＣＬκ−Ｈ８１Ｗ、およびＣＬκ−Ｈ８１Ｆ変異体は、全体コンジュゲーションレベル、軽鎖コンジュゲーションレベルの低下を示し、このことは、イミダゾール環が、ＰＦＰ方向性コンジュゲーションには必要であることを示唆している。コンジュゲーション反応は、π−スタッキング相互作用にも、イミダゾール環のＮε２またはＮδ１で形成されるＨ結合にも関係していない。
Figure 2015504893
（実施例３０）
種々の反応性エステルを使用しての２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］コンジュゲーション
２．１２．１．ｆｘおよび２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］を、種々の反応性エステル（実施例１８および１９を参照されたい）を使用して［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］にコンジュゲートさせた（結果は表５６に示す）。種々の活性化エステルのすべてについて、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］変異体は、コンジュゲートすると、ｗｔの２．１２．１．ｆｘと比較して、より高いレベルのインタクトな平均ＣＡをもたらした。他の明瞭な傾向は、野生型２．１２．１．ｆｘにおける０および１ＣＡのレベルが、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］変異体ではそれぞれの活性化エステルについて顕著に低下したこと、および２ＣＡのレベルが、Ｚ９を除く大抵の活性化エステルについてそれぞれの場合に上昇したことであった。
還元ＬＣ／ＨＣ分析の結果は、２．１２．１．ｆｘおよび２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］コンジュゲーション結果を比較すると、さらに明白な傾向を示した。それぞれの場合において、誘導体化されていないＬＣの程度が低下し、場合によってはかなり低下した。これは、再びそれぞれ異なる活性エステルについて、ＬＣにおける１ＣＡレベルの同時の上昇を随伴したので、ＬＣにおける誘導体化の平均量全体は増大することとなった。ＬＣについての全般的な傾向は、それぞれの場合に存在する２ＣＡの量は本質的に変化しなかったので、０ＣＡが減少した量だけ、１ＣＡの量が増大したことであった。
ＨＣを考慮すると、それぞれの活性エステルについて、既に低い量の１ＣＡ誘導体化がさらに減少するという別の傾向が明らかであった。この傾向における異常値は、Ｚ９、非フェノールエステルのみであった。このエステルは、他のフェノールエステルと比較すると、ＣＬκ−Ｋ８０に対する方向性コンジュゲーションの作用をほとんど示さず、ＬＣおよびＨＣ両方の誘導体化のレベルは同様であり、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］変異体によって付与された方向性の僅かな向上のみを伴った。概して、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］変異体は、一連の活性化エステルについて、天然２．１２．１．ｆｘと比較すると、方向性ＬＣコンジュゲーションの向上の明確な証拠をもたらす。
Figure 2015504893
（実施例３１）
トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））コンジュゲーション
ＣＬκ−Ｄ７７変異に起因するＣＬκ−Ｋ８０への方向性コンジュゲーションの向上を、ＣＬκを含む他の抗体に適用することができることを確認するために、Ｄ７７Ａ変異を、トラスツズマブ（ｈＴｒａｓｔ）のＣＬκにも挿入した。トラスツズマブ軽鎖および重鎖ＤＮＡを、Ｄｒｕｇ Ｂａｎｋ、受託番号ＤＢ０００７２（ＢＩＯＤ０００９８、ＢＴＤ０００９８）でのアミノ酸配列に基づき合成した。
ｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］変異体を２ステップで生成した。初めに、Ｄ７７Ａ変異を抗体軽鎖において、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標））に記載されているプロトコルに従って生成した。変異を、オリゴヌクレオチドプライマーによって導入し、ＤＮＡ配列決定によって確認した。トラスツズマブのＶＬを、Ｄ７７Ａ変異を有する抗体のＣＬと連結させた。プライマー対のＴＲＡＳＴ．ＶＬ．ＦＯＲ（配列番号８９）およびＴＲＡＳＴ．ＶＬ．ＲＥＶ（配列番号９０）を使用して、トラスツズマブＶＬを増幅した。ＰＣＲ断片を、ＢｇｌＩＩおよびＢｓａＩで消化した。プライマー対のＴＲＡＳＴ．ＣＬ．Ｄ１８５Ａ．ＦＯＲ（配列番号９１）およびＴＲＡＳＴ．ＣＬ．Ｄ１８５．Ａ．ＲＥＶ（配列番号９２）を使用して、Ｄ７７Ａ変異を有するＣＬを増幅した。生じたＰＣＲ断片をＢｓａＩおよびＮｈｅＩで消化した。制限酵素で消化されたＰＣＲ断片を、ＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩでカットされた修飾ｐ２．１２．１．ｆｘＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））と連結させた。挿入配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。変異させたｍＡｂを、ＨＥＫ２９３細胞中で過渡的に発現させ、タンパク質Ａ親和カラムを使用して精製した。精製したｍＡｂを、ＭＳを使用して特徴づけた。
トラスツズマブおよびｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］（反応サイズは１ｍｇ）を１８ｍｇ／ｍｌに、ｐＨ７．７にリン酸緩衝液を用いて、０．０６Ｍのリン酸ナトリウム最終濃度に調整した。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］をプロピレングリコール溶液中で１０ｍｇ／ｍｌに再構成した。ペプチド／リンカーを抗体に４．３：１のモル比で加え、室温で２時間反応させた。
表５７では、トラスツズマブ−［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］とｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］−［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］とのコンジュゲーションプロファイルを比較している。トラスツズマブ−［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］のコンジュゲーションプロファイルは、０〜４個のペプチド付加の分布として起こり、その際、ペプチド付加の平均個数は１．７５個である。プロファイルはＤ７７Ａ変異の後に変化し；ペプチド付加の平均個数は２．１８個に上昇し、かつ０個および１個のペプチド付加のかなり低い全体レベルが観察される。この結果は、テスト抗体２．１２．１．ｆｘにおいて観察されたとおり、単一の点突然変異ＣＬκ−Ｄ７７Ａは、骨格への全体コンジュゲーションを増大させる作用を有することを示唆している。
還元した軽鎖および重鎖の分析は、平均コンジュゲーションは、修飾されていないトラスツズマブよりも、ｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］の軽鎖において多いことを実証し；ｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］での平均軽鎖コンジュゲート付加値は、トラスツズマブでの０．７０と比較すると、１．０１である。加えて、コンジュゲートされていない軽鎖は、ｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］では有意に低減される。重鎖におけるコンジュゲーションは、有意に低いレベルで観察される。トラスツズマブおよびｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］の両方で観察された重鎖のうちの大部分は、コンジュゲートされてなく；このことは、ｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］重鎖の場合に特に当てはまる。これらの結果は、ＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異が軽鎖を、それが有意によりコンジュゲートされやすいように変更することを示唆している。
Figure 2015504893
（実施例３２）
トラスツズマブとＭＭＡＤとのコンジュゲーション
表５８は、トラスツズマブ−［ＰＥＧ５−ＭＭＡＤ］（オーリスタチン誘導体）とｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］−［ＰＥＧ５−ＭＭＡＤ］とのコンジュゲーションプロファイルを比較している。
Figure 2015504893
 トラスツズマブ−［ＰＥＧ５−ＭＭＡＤ］のコンジュゲーションプロファイルは、抗体１個当たり０〜４個のコンジュゲーションの分布として起こり、その際、最多の形態は、２個のコンジュゲーションであり、コンジュゲーションの平均個数は１．６５個である。ＣＬκ−Ｄ７７Ａを変異させると、コンジュゲーションの平均個数は２．００個に上昇し、０および１個のＭＭＡＤ付加の有意に低い全体レベルが観察された。この結果は、単一の点突然変異ＣＬκ−Ｄ７７Ａが、骨格への全体コンジュゲーションを増大させる作用を有すること、およびこの技術が、抗体−毒素コンジュゲーションモデルに適用可能であることを示唆している。
還元した軽鎖および重鎖の分析は、平均コンジュゲーションが、修飾されていないトラスツズマブよりも、ｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］の軽鎖において多いことを実証し；ｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］での平均軽鎖コンジュゲート付加値は、トラスツズマブでの０．５６と比較すると、０．８８である。加えて、コンジュゲートされていない軽鎖は、ｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］では有意に低減される。重鎖におけるコンジュゲーションは、有意に低いレベルで観察される。トラスツズマブおよびｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］の両方で観察された重鎖のうちの大部分は、コンジュゲートされてなく；このことは、ｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］重鎖の場合に特に当てはまる。これらの結果は、ＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異が、軽鎖を、それが有意によりコンジュゲートされやすいように変更することを示唆している。
Figure 2015504893
（実施例３３）
標的に結合するコンジュゲートトラスツズマブの能力
コンジュゲートされていない、および［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］もしくは［ＰＥＧ５−ＭＭＡＤ］のいずれかにコンジュゲートされているトラスツズマブおよびｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］の、Ｈｅｒ２受容体に結合する能力を、Ｈｅｒ２結合ＥＬＩＳＡアッセイを使用して研究した。ハーフウェルＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中１ｕｇ／ｍｌのＦｃ−ＥｒｂＢ２融合タンパク質でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＫＰＬ洗浄緩衝液で３回洗浄し、その後、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋで室温で１時間ブロックした。試料の１０×系列希釈物をＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ中、１００μｇ／ｍｌの最高濃度で調製した。試料をウェルに加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートをＫＰＬ洗浄緩衝液で３回洗浄した。抗ヒトＦａｂ−ＨＲＰ二次抗体の１：１０００希釈物と共に室温で１時間インキュベートすることによって、結合した試料を検出した。プレートを再び、ＫＰＬ洗浄緩衝液で３回洗浄し、ＨＲＰをＴＭＢ基質で検出した。反応を２ＭのＨ２ＳＯ４で停止し、ＯＤを、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダーで４５０ｎｍで測定した。
図９Ａおよび９Ｂは、市販のトラスツズマブ、利用可能な配列から生成したトラスツズマブ、およびｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］、さらには［ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］または［ＰＥＧ５−ＭＭＡＤ］のいずれかに結合させた場合のトラスツズマブおよびｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］は、それぞれ、同様のＨｅｒ２結合特性を示すことを実証している。これらの結果は、主にＣＬκ−Ｋ８０でのコンジュゲーションは、天然抗体の受容体結合機能に有意に干渉しないことを示唆している。
（実施例３４）
ＰＦＰおよびＮＨＳコンジュゲーション戦略の比較
２つの別の戦略：ＰＦＰエステル（Ｚ１）をＺ＊基として使用するＣＬκ−Ｋ８０への方向性コンジュゲーション（トラスツズマブ−［５ＰＥＧ−ＭＭＡＤ］を生成）、または抗体全体により幅広いコンジュゲーションパターンをもたらすＮＨＳ（Ｚ１３；トラスツズマブ−［ＭＭＡＤ］ｎを生成）を使用して、トラスツズマブを［ＰＥＧ５−ＭＭＡＤ］にコンジュゲートさせ、抗体薬物コンジュゲートの耐容性を比較するために、ラットに投与した。両方のコンジュゲートを、１０、３０および１００ｍｇ／ｋｇの単回ボーラス用量として与えた。１週間の研究期間の間に１０、および３０ｍｇ／ｋｇ用量の両方のコンジュゲートを投薬されたすべての動物は、有意な体重減少を伴うことなく生存した。しかしながら、１００ｍｇ／ｋｇ用量群は、無作為コンジュゲーション（Ｚ１３）と、ＣＬκ−Ｋ８０（Ｚ１）への部位選択的コンジュゲーションとで明確な相違を示した。無作為コンジュゲート（ＮＨＳコンジュゲーション）の１００ｍｇ／ｋｇ用量における動物のうちの５０％超が、１週間の研究期間内に死亡したのに対して、部位選択的コンジュゲート（ＰＦＰコンジュゲーション）の１００ｍｇ／ｋｇ用量における動物はすべて、有意な体重減少を伴うことなく生存した（表５９）。このことは、ＣＬκ−Ｋ８０での優先的コンジュゲーションが、エフェクター部分のコンジュゲーションについてより信頼性の高い機構を提供し得ていて、複数の表面リシン残基でのコンジュゲーションである従来の「無作為」手法は、より信頼性の低い開裂および分解パターンを有するエフェクター部分をもたらしているおそれがあることを示唆している可能性がある。
Figure 2015504893
（実施例３５）
毒素および切断可能なリンカーとコンジュゲートさせたｈ３８Ｃ２
ターゲティングペプチドを、触媒抗体ｈ３８Ｃ２（ＨＣ＝配列番号６５およびＬＣ＝配列番号３７および６７）のＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異バージョンの結合部位に、本明細書において記載したとおりの、Ｗ基としてβ−ラクタム基を有する式Ｐ−Ｑ−Ｗのリンカーを使用してコンジュゲートさせて、配列番号６５のＫ９９の側鎖との共有結合を形成した。次いで、このコンジュゲート抗体を、バリン−シトルリンｐ−アミノベンジルカルバマート切断可能なリンカーに結合させた例示的なオーリスタチンをベースとする毒素（［ＰＦＰ−ＰＥＧ２−ＶａｌＣｉｔＡＢＣ−毒素］）のＰＦＰ−活性化エステルとさらにコンジュゲートさせた。
Figure 2015504893
 コンジュゲートの分布は、抗体骨格１個当たり主に２〜３個の毒素で観察された（表６０）。このコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイは、強力な抗増殖作用をＡＵ５６５細胞系（ＩＣ５０＝０．４ｎＭ）およびＯＶＣＡＲ５細胞系（ＩＣ５０＝０．２ｎＭ）において実証した。
Figure 2015504893
（実施例３６）
パラフッ素原子に置き換わってトリフルオロメチル基を有するＰＦＰの構造的類似体を使用して、誘導体Ｚ＊基；２，３，５，６−テトラフルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル（Ｚ１６）を製造した：
Figure 2015504893
 これを使用して、Ｚ１６−ＰＥＧ５リンカーを生成し、これをテストペプチド配列番号２７にコンジュゲートさせ、テスト抗体２．１２．１．ｆｘとのコンジュゲーションにおいて試験した。試験した他のＺ＊基とは対照的に、この誘導体は、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］と比較して、天然２．１２．１．ｆｘに対してやや高いレベルのコンジュゲーションを有するコンジュゲートをもたらしたが、インタクトなコンジュゲーションのレベルは両方とも、対応するＰＦＰ（Ｚ１）類似体よりも、Ｚ１６基を使用するコンジュゲートについてより高かった（Ｚ１と比較すると、全体平均ＣＡの約１０％の上昇）。Ｚ１６を使用すると、天然２．１２．１．ｆｘおよび２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］コンジュゲーションは両方とも、同等レベルの１ＣＡを示し、これは、［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］とコンジュゲートされた天然２．１２．１．ｆｘで観察されたものよりも低かった：他のコンジュゲーションでは、１ＣＡのレベルは典型的には、対応する天然抗体と比較して、Ｄ７７Ａにおいて低下する。概して、結果は、脱離基Ｄ１６は、Ｚ１（ＰＦＰ）よりも反応性が高いことを示唆している（表６１）。
Ｚ１６脱離基は、天然２．１２．１．ｆｘおよび２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］抗体の両方について、およそ同等な誘導体化を示し、誘導体化されていないＬＣの量は、両方の場合に少ない。そのうえ、Ｚ１と比較すると、Ｚ＊１６を使用すると、ＬＣおよびＨＣ誘導体化の全体レベルが上昇する。脱離基Ｚ１６は、ＰＦＰよりも反応性なエステルであるようであるが、ＣＦ３基がＣＬκ−Ｋ８０領域付近で、追加の相互作用をもたらしていて、このことがまた、ＬＣの反応性および優先的誘導体化を駆動していることがあり得る。
Figure 2015504893
（実施例３７）
毒素０１０１の合成
毒素０１０１（図解中の＃５４）についての実験
２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミドの調製（＃５４）
Figure 2015504893
 ステップ１． Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（＃５３）の合成。一般的手順Ｄ（以下）に従って、ジクロロメタン（２０ｍＬ、０．１Ｍ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中の＃３２（２．０５ｇ、２．８３ｍｍｏｌ、１当量）、アミン＃１９（（２Ｒ，３Ｒ）−３−メトキシ−２−メチル−Ｎ−［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］−３−［（２Ｓ）−ピロリジン−２−イル］プロパンアミド、トリフルオロ酢酸塩）（２．５ｇ、３．４ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＨＡＴＵ（１．２９ｇ、３．３８ｍｍｏｌ、１．２当量）、ならびにトリエチルアミン（１．５７ｍＬ、１１．３ｍｍｏｌ、４当量）から、粗製の所望の物質を合成し、これを、シリカゲルクロマトグラフィー（勾配：ヘプタン中０％〜５５％のアセトン）によって精製して、＃５３（２．４２ｇ、７４％）を固体として生成した。LC-MS:m/z 965.7[M+H+]、987.6[M+Na+]、保持時間=1.04分;HPLC(プロトコルA):m/z
965.4[M+H+]、保持時間=11.344分(純度>97%)；1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), 回転異性体と推定され、特徴的シグナル:δ7.86-7.91 (m, 2H), [7.77 (d, J=3.3 Hz)および7.79 (d, J=3.2 Hz), 合計1H], 7.67-7.74 (m,
2H), [7.63 (d, J=3.2 Hz)および7.65 (d, J=3.2 Hz), 合計1H], 7.38-7.44 (m, 2H), 7.30-7.36 (m, 2H), 7.11-7.30 (m, 5H), [5.39
(ddd, J=11.4, 8.4, 4.1 Hz)および5.52 (ddd, J=11.7, 8.8,
4.2 Hz), 合計1H], [4.49 (dd, J=8.6, 7.6 Hz)および4.59 (dd, J=8.6, 6.8 Hz), 合計1H], 3.13, 3.17,
3.18および3.24 (4 s, 合計6H), 2.90および3.00 (2 br s, 合計3H), 1.31および1.36 (2 br s, 合計6H), [1.05 (d, J=6.7 Hz)および1.09 (d, J=6.7 Hz), 合計3H].
ステップ２． ２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（＃５４）の合成
一般的手順Ａ（以下）に従って、ジクロロメタン（１０ｍＬ、０．０７Ｍ）中の＃５３（７０１ｍｇ、０．７２６ｍｍｏｌ）から、粗製の所望の物質を合成し、これを、シリカゲルクロマトグラフィー（勾配：ジクロロメタン中０％〜１０％のメタノール）によって精製した。残渣を、ジエチルエーテルおよびヘプタンで希釈し、真空濃縮して、＃５４（４０６ｍｇ、７５％）を白色の固体として得た。LC-MS:m/z 743.6[M+H+]、保持時間=0.70分;HPLC(プロトコルA):m/z 743.4[M+H+]、保持時間=6.903分、(純度>97%)；1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), 回転異性体と推定され、特徴的シグナル:δ[8.64 (br d, J=8.5 Hz)および8.86 (br d, J=8.7 Hz), 合計1H], [8.04 (br d,
J=9.3 Hz)および8.08 (br d, J=9.3 Hz), 合計1H], [7.77 (d, J=3.3 Hz)および7.80 (d, J=3.2
Hz), 合計1H], [7.63 (d, J=3.3 Hz)および7.66 (d, J=3.2 Hz), 合計1H], 7.13-7.31 (m,
5H), [5.39 (ddd, J=11, 8.5, 4 Hz)および5.53 (ddd, J=12, 9,
4 Hz), 合計1H], [4.49 (dd, J=9, 8 Hz)および4.60 (dd, J=9, 7 Hz), 合計1H], 3.16, 3.20,
3.21および3.25 (4 s, 合計6H), 2.93および3.02 (2 br s, 合計3H), 1.21 (s, 3H), 1.13および1.13 (2 s, 合計3H), [1.05 (d, J=6.7 Hz)および1.10 (d, J=6.7 Hz), 合計3H], 0.73-0.80 (m,
3H).
一般的手順Ａ：ジエチルアミンを使用してのＦｍｏｃ除去。Ｆｍｏｃ含有化合物のジクロロメタン中の溶液に、等体積のジエチルアミンを加えた。反応の進行をＬＣ−ＭＳ（またはＨＰＬＣもしくはＴＬＣ）によってモニタリングした；反応は通常、３時間以内に完了した。溶媒を真空中で除去し、残渣をヘプタンと共に３回共沸させた。次いで、残渣をジクロロメタンおよび少量のメタノールで希釈し、その後、シリカ上で減量し、ジクロロメタン中のメタノールで溶離するシリカゲル上のクロマトグラフィーによって精製して、所望の物質を得た。
一般的手順Ｄ：Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）とのカップリング。アミン（１当量）および酸（１．１当量）のジクロロメタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４：１、アミン中０．３Ｍ）中の撹拌溶液に、ＨＡＴＵ（１．２当量）、続いて、Ｅｔ３Ｎ（３当量）を加えた。反応の進行をＬＣ−ＭＳ（またはＨＰＬＣもしくはＴＬＣ）によってモニタリングした；反応は通常、３時間以内に完了した。溶媒を真空中で除去し、残渣をヘプタンと共に３回共沸させ、少量の酢酸エチルで希釈し、その後、シリカ上で減量し、シリカゲルクロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーによって精製した。
（実施例３８）
ｍＡｂ ｈｕ０８および毒素０１０１を含むＭＡＣの調製
Ｈｕ０８は、ヒト抗ＩＬ−１３Ｒα２抗体であり、その内容が参照によって本明細書に組み込まれている米国特許仮出願６１／７２３，５４５号に完全に記載されている。ＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異を含むｈｕ０８の変異体バージョンを、標準プロトコルに従って生成した（ｈｕ０８−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］）。毒素−０１０１（＃５４：実施例３６）を、切断可能なリンカーとコンジュゲートさせて、構造：
Figure 2015504893
 を形成し、次いで、この毒素−リンカーを、本明細書に記載の技術に従って、ｈｕ０８−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］にコンジュゲートさせた。リンカー−毒素−０１０１種を介して抗体ｈｕ０８上で複数の毒素−０１０１の非特異的コンジュゲーションをもたらす化合物ｈｕ０８−ｖｃ−０１０１を生成した：
Figure 2015504893
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイ
ＩＬ−１３Ｒα２抗原を発現する細胞系および陰性対照細胞系を、漸増する濃度のｈｕ０８−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］と共に培養した。４日後に、培養の生存率を評価した。ＩＣ５０値を、ロジスティック非線形回帰によって計算し、ｎｇ Ａｂ／ｍＬとして表す。
データは、ｈｕ０８−ｖｃ０１０１およびｈｕ０８−［ＣＬκ４０、−Ｄ７７Ａ］は両方とも、試験されたＩＬ−１３Ｒα２陽性細胞系（ＰＣ３ＭＭ２およびＡ３７５）の両方に対して有効であり、２．５〜７．９ｎｇ Ａｂ／ｍＬの範囲のＩＣ５０を有したことを実証している（表６２）。ｈｕ０８−ｖｃ０１０１もｈｕ０８−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］も、ＩＬ−１３Ｒα２陰性細胞系、Ｈ４６０に対しては活性ではなく、非ＩＬ−１３Ｒα２結合対照、ｈＩｇＧ８．８４−ｖｃ０１０１は、試験された細胞系のいずれに対しても活性ではなかった。
Figure 2015504893
Ｃｙｓ変異体ＡＤＣの皮下異種移植モデル
雌の無胸腺（ヌード）マウスに、ＰＣ３ＭＭ２腫瘍細胞を皮下注射した。約０．１〜０．３ｇの段階の腫瘍を有するマウス（ｎ＝８〜１０マウス／治療群）に、通常生理食塩水（ビヒクル）またはＭＡＣ−０００１を４日に１回で４回、静脈内投与した。化合物を、ＡＢ含有量に基づき投薬した。腫瘍を、少なくとも週に１回測定し、そのサイズ（ｍｍ２＋／−ＳＥＭ）を、ｍｍ３＝０．５×（腫瘍幅２）×（腫瘍長さ）として計算した。表６３のデータは、ｈｕ０８−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］−０１０１が、ＰＣ３ＭＭ２異種移植片の増殖を阻害することを示している。
Figure 2015504893
（実施例３９）
トラスツズマブＭＭＡＤコンジュゲートの活性
３種のトラスツズマブコンジュゲートを製造した：トラスツズマブ−［５ＰＥＧ−ＭＭＡＤ］、ｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］−［５ＰＥＧ−ＭＭＡＤ］、およびトラスツズマブ−（ＭＭＡＤ）ｎ（ここで、ＭＭＡＤは、脱離基としてのＺ１３（ＮＨＳ）で５ＰＥＧリンカーに接続されており、方向性コンジュゲーション技術を用いることなく、トラスツズマブにコンジュゲートされているので、トラスツズマブ表面リシンへのＭＭＡＤの非特異的コンジュゲーションが生じている）（実施例３０〜３３を参照されたい）。
Figure 2015504893
 ラットでの審査毒性研究において、３種のｍＡｂコンジュゲートを評価したが、その際、動物は、それぞれのＡＤＣの単回静脈内ボーラス用量を０（ビヒクル）、１０、３０、および１００ｍｇ／ｋｇ（雄のラット５匹／群）で投与され、次いで１４日間観察された。毒性学評価は、毎日の臨床観察、１週に１回の体重測定、および検死日での臨床的病理評価を包含した。動物を１５日目に安楽死させ、選択された組織を顕微鏡検査のために収集した。加えて、血液試料をすべての動物から、投薬後約０．０８３３（５分）、６、２４（２日目）、４８（３日目）、７２（４日目）、９６（５日目）、１６８（８日目）、および３１２（１４日目）時間目に収集し、抗体−コンジュゲートおよびトラスツズマブ抗体濃度について分析した。
結果
血漿曝露（ＡＵＣに基づく）は、３種のコンジュゲートのすべてで、いずれの所与の用量でも概して同様であった。１００ｍｇ／ｋｇでのｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］−［５ＰＥＧ−ＭＭＡＤ］、トラスツズマブ−［５ＰＥＧ−ＭＭＡＤ］、およびトラスツズマブ−（ＭＭＡＤ）ｎのＡＵＣ（０−３１２）はそれぞれ、１７７０００、１７４０００、および１３９０００ｎｇ・ｈ／ｍＬであった。ｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］−［５ＰＥＧ−ＭＭＡＤ］およびトラスツズマブ−［５ＰＥＧ−ＭＭＡＤ］は、すべての用量において、臨床的に忍容性が良好であった。しかしながら、１００ｍｇ／ｋｇでのトラスツズマブ−（ＭＭＡＤ）ｎの投与は、顕著な臨床徴候および８日目での１／５のラットの早期安楽死に関連した。この群の他のラットは、皮膚膨張の低下および体重増加の減少を示した。
臨床病理変化は、ｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］−［５ＰＥＧ−ＭＭＡＤ］およびトラスツズマブ−［５ＰＥＧ−ＭＭＡＤ］で概して同様であり、特に、≧１０または≧３０ｍｇ／ｋｇでの赤血球（ＲＢＣ）量（ＲＢＣカウント、ヘモグロビンおよび／またはヘマトクリット）の軽度の低下、ならびに１００ｍｇ／ｋｇでのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の軽微な増加が包含された。ＲＢＣ質量の変化は、トラスツズマブ−（ＭＭＡＤ）ｎではさらに著しく、骨髄における赤血球細胞充実度の低下に関連していた。他の注目すべき１００ｍｇ／ｋｇでのトラスツズマブ−（ＭＭＡＤ）ｎ関連の臨床病理変化には、血小板カウントの中程度の低下、ならびにＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、および全ビリルビンの軽度の増加が包含された。
顕微鏡所見は、ｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］−［５ＰＥＧ−ＭＭＡＤ］およびトラスツズマブ−［５ＰＥＧ−ＭＭＡＤ］で概して同様であり、肺における肺胞組織球増殖／炎症、肝臓における小さな胆管の変性、および骨髄における可染小体マクロファージ（細胞破片を含有する）の増加を包含した。複数の組織における有糸分裂の増加および角膜における単細胞の壊死は、有糸分裂停止およびアポトーシスをもたらすチューブリン阻害の薬理学的に媒介される作用と考えられた。対照的に、トラスツズマブ−（ＭＭＡＤ）ｎ投与は、より顕著な顕微鏡的組織変化に関連しており、これらには、腎臓における尿細管変性／壊死および糸球体症；肝臓における単細胞壊死、胆管変性および過形成、ならびに小葉中心壊死／線維症；肺における肺胞組織球増殖／炎症；骨髄における有形体（ｔａｎｇｉｂｌｅ ｂｏｄｙ）マクロファージの増加、造血細胞の変性／減少、および骨溶解；脾臓における辺縁帯細胞充実度の低下が包含される。特に記載したもののうち、正常な小葉構成の破壊に関連した肝臓における小葉中心性線維症は、より早期で、より広範な治療関連の肝細胞損傷を示唆する修復性変化と一致した。加えて、薬理学的に媒介された有糸分裂および／または単細胞壊死の増加が、いくつかの組織において観察された。
まとめると、ｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］−［５ＰＥＧ−ＭＭＡＤ］およびトラスツズマブ−［５ＰＥＧ−ＭＭＡＤ］は、すべての用量（１０、３０、および１００ｍｇ／ｋｇ）で良好に忍容され、概して同様の毒性プロファイルを実証した。トラスツズマブ−（ＭＭＡＤ）ｎ投与は、１００ｍｇ／ｋｇで早期死亡率をもたらし、特に肝臓、腎臓、肺、および骨髄における重大な標的臓器毒性に関連した。
（実施例３９）
ＣＬκおよびＣＬλのモデリング
図１０Ａは、４ストランドβシートに対してパックされた３ストランドβシートを含有する定常軽鎖ドメインのＩｇフォールドを図示している。それぞれのβシートのβストランドの間での水素結合によって、内側で向かい合っているβシートの残基間での疎水性結合によって、かつβシート間でのジスルフィド結合によって、このフォールドは安定化されている。３ストランドβシートは、βストランドＣ、Ｆ、およびＧを含み、４ストランドβシートは、βストランドＡ、Ｂ、Ｅ、およびＤを有する。ＡからＧの文字は、Ｉｇフォールドのアミノ酸配列に沿ったβストランドの連続位置を示している。各βストランドと次のβストランドとの連結は、ターン（Ａ／Ｂ）またはαへリックス（Ｅ／Ｆ）を含んでもよいし、または含まなくてもよいアミノ酸接続鎖である（図１０Ｂ）。
図８Ｂは、マウスおよびヒトのＣＬκ、ならびにヒトＣＬλの一次配列に沿って二次構造をプロットしている。ＣＬκおよびＣＬλのβストランドＥとＦとの間のＥＦ接続鎖は、同一の二次構造を有し、５〜６残基のαへリックス領域（ＣＬκ−Ｋ７５−Ｋ８０およびＣＬλ−Ｐ７６−Ｓ８１）、続いて、２〜３アミノ酸ターン（ＣＬκ−Ｈ８１−Ｋ８２およびＣＬλ−Ｈ８２−Ｓ８４）からなる（図８Ｂおよび１０）。ＣＤ接続鎖は、ＥＦ鎖の周辺（約３．５Å）と構造的に同等なアスパラギン酸の側鎖（ＣＬκ−Ｄ５３、ＣＬλ−Ｄ４５）を持ち、ＣＬκ−Ｄ５３がＣＬκ−Ｈ８１のイミダゾール環と相互作用することを可能にしている。
ＣＬλのモデリングおよびＣＬκとの比較は、ＣＬλ−Ｄ４５がＣＬλ−Ｈ８２のイミダゾール環と同様に協力すること、ＣＬλ−Ｓ８１をＣＬλ−Ｋ８１に変異させることは、ＣＬκにおいて見出されるものと同様の局所環境を再現するので、ＣＬλへの方向性コンジュゲーションを可能にすることを示唆している。
したがって、本発明は、次の変異のうちの１つを含むＣＬλドメインも提供する：ＣＬλ−Ｓ８１ＫおよびＣＬλ−Ｋ８０ｘ／Ｓ８１Ｋ（ここで、ｘは、Ｐ、Ｋ、Ｒ、またはＨを除いた任意のアミノ酸であり、ナンバリングは、配列番号９３による）。一部の態様では、本発明は、Ｋ８１、またはｘ８０／Ｋ８１を含む新規のＣＬλドメインを提供する（ここで、ｘは、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｄ、またはＥの１つである）。一部の態様では、本発明は、配列番号９４および配列番号９５からなる群から選択される配列を含むＣＬλドメインも提供する。
モデリングはまた、ＣＬκ−Ｄ７７がＣＬκ−Ｋ８０への塩橋を形成していると考えられるので、同じ手法で、ＣＬλ−Ｅ７７を、ＣＬλ−Ｋ８０またはＣＬλ−Ｋ８１のいずれかと塩橋を形成するために利用することができるであろうことを示唆している。したがって、ＣＬλ−Ｅ７７をＲ、Ｌ、Ｓ、Ｇ、Ｑ、Ｐ、Ｎ、Ｖ、Ｉ、Ｔ、およびＭのうちのいずれかに変異させることで、Ｓ８１Δ（すなわち、Ｓ８１の欠失）の場合にはＣＬλ−Ｋ８０ＣＬλまたはＣＬλ−Ｋ８１のいずれかでの方向性コンジュゲーションをおそらく促進し得る。したがって、本発明は、配列番号９６および配列番号９７からなる群から選択される配列を含むＣＬλドメインも提供する。
（実施例４１）
ＣＬκ−Ｋ８０コンジュゲーション機構のモデリング
構造および配列の記載
２．１２．１．ｆｘおよびｈ３８Ｃ２−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］のＦａｂドメインの結晶構造を使用して、ハロ−フェノール（ＰＦＰなど）／エステル媒介コンジュゲーションに対するＣＬκ−Ｋ８０反応性の特異性をモデリングした。複数の様々な抗体でのコンジュゲーションの経験、さらには初期モデリング分析によって、抗体の残りの部分は、コンジュゲーションの機構について、もしあるとしても非常に僅かな影響しか発揮しないと考えられるので、モデリングは、ＣＬκにのみ焦点を当てればよいことが示された。
コンピュータによる手法
コンピュータによる計算の目的は、ＣＬκ−Ｋ８０の決定的な特質、およびこの部位をＰＦＰ−エステルコンジュゲーション反応に優先的に偏らせる残基の相互作用を明白にすることであった。ＣＬκおよびＣＬκ−Ｄ７７Ａの３Ｄ座標を結晶構造から選択した後に（方向性コンジュゲーションに関連していると既に同定されているこれらの残基を含有する座標に基づく）、その座標を、タンパク質調製、水素原子の結合、および力場パラメーターアサインメント（ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）などの標準的なコンピュータプロトコルに掛けた。
計算されたｐＫａ値およびｐＩ（タンパク質イオン化ポテンシャル）に従って、水素原子を、個々の３Ｄ ＣＬκドメイン上のすべてのアミノ酸原子にアサインした。ｐＫａは、中性ｐＨでの所与の滴定可能なアミノ酸のプロトン化状態の値であり（水素濃度の負対数）、タンパク質鎖におけるアミノ酸の影響を考慮する（Ｓｐａｓｓｏｖ；Ａ ｆａｓｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００８、１７、１９５５〜１９７０）。これらの計算の結果を表６４に示す。
Figure 2015504893
すべての滴定可能なアミノ酸および残りのアミノ酸でのｐＫａ値によって、原子価数に従って、水素原子を加える。計算は、ＣＬκ−Ｈ８１が、ｐＨ７．０〜７．４（生理学的ｐＨ）ではプロトン化されていないことを示した。この観察は、ＣＬκ−Ｈ８１が求核性触媒として作用する触媒反応で提案されていた機構と一致する。一般に、ｐＨがｐＨ約６．５〜７．０になると、ＣＬκ−Ｈ８１がプロトン化されるであろうために、コンジュゲーションが減少すると予測されるであろう。ｐＨが約７．４超に上昇すると、他の残基（特に、リシン）がより反応性になり、全体コンジュゲーション反応に寄与するので、より高い全体コンジュゲーションレベルが予測され、そのため本発明者らは、ｐＨが上昇するにつれて次第に、方向性作用は失われるであろうと予測した。これは、実施例４の表４において示したｐＨ研究において観察されたことと相関している。
最小化
ＣＨＡＲＭｍ［Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｔ ＨＡＲｖａｒｄ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ］は、エネルギー最小化技術であり、これを使用して、３Ｄ構造を平衡位置に持っていき、その原子構造について最良の幾何学的位置を見出した。ＣＨＡＲＭｍを第１のステップでは、ＳＭＡＲＴ Ｍｉｎｉｍｉｚｅｒを用いて、１０００ステップの、３［Ｋｃａｌ／（ｍｏｌ＊Å）］のＲＭＳ勾配許容（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）でのＳｔｅｅｐｅｓｔ Ｄｅｓｃｅｎｔ最小化、続く、０．０１のＲＭＳ勾配でのＣｏｎｊｕｇａｔｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ最小化で使用した。エネルギー変化については、３［Ｋｃａｌ／（ｍｏｌ＊Å）］の許容を、最小化のサイクルの間の平均勾配に当てはめた。Ｓｔｅｅｐｅｓｔ Ｄｅｓｃｅｎｔ法は、分子を最近接最小量（ｎｅａｒｅｓｔ ｍｉｎｉｍｕｍ）にし、Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔは、得られた最終コンホメーションを改善した。Ｍｏｍａｎｙ Ｒｏｎｅ電荷を使用した（Ｍｏｍａｎｙ＆Ｒｏｎｅ；Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｕｒｐｏｓｅ ＱＵＡＮＴＡ ３．２／ＣＨＡＲＭｍ ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１９９２、１３、８８８〜９００に記載されているとおり）。ＣＬκの最小化された構造は、最小化されていない構造と比較して１Å異なった。
ＣＬκドメインとＰＦＰ−ＰＥＧ２との複合体
それぞれの相互作用をより良く理解するために、ＰＦＰエステルと、ＣＬκおよびＣＬκ−Ｄ７７Ａドメインとの個々の複合体をインシリコで組み立てた。Ａｃｃｅｌｒｙｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｄｅｆｉｎｅ ａｎｄ Ｅｄｉｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ソフトウェア ｖｅｒｓｉｏｎ ＤＳ３．５）による３Ｄ ＣＬκドメインの構造分析によって、図１１に示されているとおり、ＣＤおよびＥＦ接続鎖の間で、かつＣＬκ−Ｋ８０の下に位置する「結合ポケット」と称され得るであろう領域が明らかになった。ＣＬκ−Ｋ７５−Ｅ７９（ＥＦ接続鎖上のＥＦαへリックス）、ＣＬκ−Ｋ８０−Ｋ８２（ＥＦ接続鎖上のＥＦループ）、およびＣＬκ−Ｖ４２（ＣＤ接続鎖上のＣＤループ）に位置して、触媒反応が必要とする形状および静電特性を与えるアミノ酸によって、このポケットは促進される。
ポケットのサイズを測定するために、Ｄｅｆｉｎｅ ａｎｄ Ｅｄｉｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅプロトコルを、先に最小化したＣＬκ構造で使用した。このプロトコルは、空洞サイズを計算し、ＰＦＰなどの特定のサイズを有する分子の結合についてのその適性を評価するために、ＣＬκドメインを、空間充填法をそこにおいて使用するための受容部として画定することを必要とする。受容部の結合部位は、多くの方式で、例えば、球またはこの球を囲む残基のリストとして表され得る。結合部位を画定するために、受容部を初めに、グリッドにマッピングする。受容部原子から所与の距離以内にあるグリッドポイントは、受容部によって占められているとマークされるので、リガンド原子のための位置としては望ましくない。結合部位を同定するための方法は２つ存在する。第１の方法は、受容部の形状に基づき部位を同定するために、「イレーザー」アルゴリズムを使用する。第２の方法は、活性な部位に既にポジショニングされている既知のリガンドによって占められる体積を使用する（Ｖｅｎｋａｔａｃｈａｌａｍら、Ｆｉｔ：ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｈａｐｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒａｐｉｄ ｄｏｃｋｉｎｇ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．Ｍｏｄｅｌ ２００３、２１、２８９〜３０７）。
プロトコルの実行の結果として、結合部位が、考察中の分子を包含するグリッド上に位置する一連のポイントとして同定される。この定義によって、結合部位としてのその資格を許可する結合部位のサイズおよび形状の測定が可能となる。ＰＦＰ−ＰＥＧ２を、触媒反応のために重要であると実験によって同定されたアミノ酸に囲まれている部位に手動でドッキングさせた。これらのアミノ酸は、ＣＬκ−Ｋ８０、ＣＬκ−Ｈ８１、ＣＬκ−Ｄ４３、およびＣＬκ−Ｋ８０から１０Å距離以内にある他のアミノ酸であった（表５４に示されている）。
ＣＨＡＲＭｍ力場をＣＬκドメインに、かつＱＭ計算をＰＦＰエステルに当てはめるＱＭ／ＭＭハイブリッド法を使用して、それぞれのＣＬκドメインとＰＦＰエステルとの初期複合体を最小化した。配置の前に、初めにＣＨＡＲＭｍを使用し、次いで、ＰＦＰエステルをＱＭシステムとして処理するＱＭ／ＭＭ手法を使用して、ＰＦＰエステルを最小化した。上記のＣＨＡＲＭｍ最小化プロトコルを使用して、構造を最小化した。
複合体を最小化するために、ＱＭ／ＭＭハイブリッドプロトコルを使用したが、その際、量子力学的（ＱＭ）計算は、ＷＴまたは変異させたタンパク質と相互作用した場合の電子密度の変化についての情報をもたらして、ＰＦＰエステル電子密度およびそのコンジュゲーション反応に対する感受性に対する周囲環境の影響を本発明者らが把握することを可能にした。ＱＭ／ＭＭプロトコルは、分子システムが２つの領域、すなわち、第１の領域、ＱＭ計算によって処理される中心領域であるＰＦＰエステルと、第２の領域、分子力学的（ＭＭ）方法によって処理される外側領域であるＣＬκドメインとに分けられるハイブリッド法である。
ＱＭ処理は、従来の力場技術と比較して、例えば、化学反応が起こるか、または分極効果が重要な役割を果たす場合に、追加の現象のモデリングを可能にするより高レベルの理論をもたらす。構造の残りのバルクを、力場ＣＬκを使用して記載する。２つの領域の相互作用を可能とする方式および全ＱＭ／ＭＭエネルギーを評価する方法が、使用される特異的なＱＭ／ＭＭプロトコルを定義する。この方法で計算されるエネルギーは、３つの基本的な部分から構成される：ＰＦＰエステル（ＥＱＭ）、ＣＤ−ｋａｐｐａ（ＥＭＭ）のＱＭエネルギー、およびこれら２つのシステム間での相互作用エネルギー（ＥＱＭＭＭ）。式Ｅｔｏｔ＝ＥＱＭ＋ＥＭＭ＋ＥＱＭ／ＭＭが使用される。
ＱＭ領域の電子密度と力場点電荷との間のクーロン相互作用に関する限り、本出願におけるＱＭ／ＭＭ法は常に、電子埋込み（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）を使用する。これは、力場原子の部分電荷がＱＭ計算値に外部ポテンシャルとして入り、それによって、ＱＭ計算値に比例してＱＭ電子密度を真空下で分極させ、ＱＭ密度と点電荷との間の静電相互作用エネルギーをもたらすことを意味している。ＱＭ／ＭＭ法における静電相互作用の取り扱いとは反対に、ファンデルワールス相互作用は、完全に古典的なレベルで処理される。これは、適切な力場パラメーターが、シミュレーションにおけるすべての原子について決定されなければならないことを意味している。ファンデルワールスＱＭ／ＭＭ相互作用エネルギー（および力）は、ＣＨＡＲＭｍシミュレーションサーバエネルギーの一部であり、出力ファイルに別のタームとして列挙される。
計算
コンジュゲーション中およびコンジュゲーション後にｉｎ ｖｉｔｒｏ実験から観察される全作用を、段階的な概算を使用するコンピュータ技術によってモデリングして、そのような現象を：
１． ＰＦＰ結合ポケットサイズ、ＰＦＰエステルの結合および方向、
２． タンパク質安定性、特に、ＰＦＰ結合ポケットの安定性、
３． ＣＬκ−Ｈ８１のイミダゾール環の互変異性化、
４． 方向性ＰＦＰ配置
５． ＰＦＰエステルとＣＬκとの初期相互作用、
６． 触媒アミノ酸それぞれの反応性
として記載することができる。
モデリング結果
ＣＬκドメインにおける結合ポケットの同定は、ＰＦＰエステルのモデリングおよびドッキング配置を可能にした。ＰＦＰエステルを、個々のＣＬκ結合部位にドッキングされたようにモデリングした後に、この複合体の３Ｄ構造を、ハイブリッド法ＱＭ／ＭＭを使用して最小化した。この手法では、ＰＦＰエステルをＱＭシステムとして画定し、ＣＬκドメインをＭＭ法によって処理した。複合体を最小化した後に、ＣＬκとＰＦＰエステルとの間の分子間相互作用のネットワークが明らかとなった。このネットワークは、分子間水素結合、疎水性相互作用、およびπ電子スタッキングによって形成された。これらの力がすべて一緒に、ＣＬκ−Ｋ８０へのＰＦＰエステルの方向性配置およびコンジュゲーションを担うネットワークの形成に関係しているようである。複合体の最小化構造は、ＣＬκ−Ｈ８１が重要な触媒アミノ酸であることを示している。
ヒスチジン側鎖中のイミダゾール部分は、酵素反応において触媒アミノ酸として役立ち得、その際、触媒遷移状態の間に、イミダゾールは求核試薬として作用し、アシルイミダゾールを形成することが知られている［Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ Ｂ．、２０１１年１０月２０日；１１５（４１）：１１８９５〜９０１．Ｅｐｕｂ ２０１１年９月２３日］。ヒスチジンのイミダゾール環は、ＮδまたはＮε原子がＨと結合するかに応じて、互変異性化を受け得ることも知られている：
Figure 2015504893
ＰＦＰ結合ポケットにおけるＣＬκ−Ｈ８１の空間ポジショニングは、ＰＦＰエステルのカルボニル炭素での求核的攻撃のためには、イミダゾール環ＣＬκ−Ｈ８１のＮδ互変異性型が必要であることを指摘している。これは、Ｎεでの孤立電子対がＰＦＰエステル基のカルボニル炭素と同じ平面にあることが必要であることも示している。これは、ＣＬκ−Ｈ８１のイミダゾール環が、Ｎδ互変異性型であると可能である（スキームＩＩを参照されたい）。互変異性平衡は、隣接する水素アクセプターアミノ酸との水素結合相互作用によって制御され得る。ＣＬκ−Ｈ８１の付近には、ＣＬκ−Ｄ７７およびＣＬκ−Ｄ４３の２個のアスパラギン酸残基があり、これらの両方が、ＣＬκ−Ｈ８１イミダゾール環の互変異性化状態を制御すると考えられる。
Figure 2015504893
図１２は、ＣＬκ−Ｈ８１、ＣＬκ−Ｄ４３、およびＣＬκ−Ｄ７７の３Ｄ配置を、アスパラギン酸の酸素原子とイミダゾール環の窒素原子との間の距離と共に図示している。ＣＬκ−Ｄ４３とＣＬκ−Ｈ８１との間の水素結合は、触媒活性な互変異性型Ｎδを促進および安定化させるが、ＣＬκ−Ｄ７７との水素結合は、ＣＬκ−Ｈ８１の触媒不活性な形態Ｎεを促進するはずである。ＣＬκ−Ｈ８１ ＮδおよびＣＬκ−Ｄ７７ Ｏδ（負に帯電）、ＣＬκ−Ｈ８１ ＮεおよびＣＬκ−Ｄ７７ Ｏδの間に形成される水素結合に加えて、ＣＬκ−Ｈ８１ Ｎδは、ＣＬκ−Ｄ７７主鎖のカルボニル酸素と共に水素結合を形成し得る。この最後の相互作用は、ＣＬκ−Ｋ８１ Ｎδの触媒活性なコンホメーションを安定させ、これを触媒作用し得るようにする。本明細書において検討した変異の分析およびコンピュータによる作業から、ＣＬκ−Ｋ８１反応性のために最適なコンホメーションは、Ｎδを介してのＣＬκ−Ｄ４３との水素結合に関係していることが分かる。それというのもこれは、ＣＬκ−Ｋ８０ Ｎεからの水素Ｈεの移動を可能にする活性なコンホメーションを安定化させるためである。したがって、他の２種のＣＬκ−Ｋ８１互変異性型はおそらく、触媒反応において活性が低いか、または不活性であるはずである。
ＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異の作用のモデリング
ＷＴモデルから予測されたとおり、［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］ドメインにおいて、ＣＬκ−Ｈ８１は、イミダゾールＮδ原子を介してＣＬκ−Ｄ４３と共に水素結合を形成して、ＰＦＰ−ＰＥＧ２分子中のエステル基のカルボニル炭素での求核的攻撃のために、Ｎεにおいて電子対を露出させる（スキームＩＩＩ）。図１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃは、結晶構造モデリングされたＣＬκおよびＣＬκ−Ｄ７７Ａドメインの比較を図示しており、ＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異体におけるＣＬκ−Ｈ８１の空間的位置のシフトを示している。
Figure 2015504893
ＣＬκ−Ｄ７７に対する変異
モデリングは、ＣＬκ−Ｄ７７変異が、ＣＬκ−Ｋ８０のコンジュゲーション率に有意な影響を有するであろうことを示唆している。一連のＱＭ／ＭＭ計算を、ＰＦＰと複合させたＣＬκドメインで行ったが、その際、ＣＬκ−Ｄ７７を、すべての他の天然アミノ酸（ＣＬκ−Ｄ７７Ｃは除いた）に変異させた。
モデリングおよび実験分析は、ＣＬκ−Ｄ７７はＰＦＰに結合し、触媒反応に関係するＰＦＰ部分のエステル原子における好ましくない電子密度を変化させることができることを示唆している。そうだとすると、ＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異は、ＰＦＰエステルの反応性原子における電子密度のより良好な分布を可能にすることによって、コンジュゲーション率を向上させるであろう。
ＣＬκ−Ｄ７７の変異体で行った計算結果の分析は、最良の性能を有する変異体（コンジュゲーション効率の点において）は、ＰＦＰ部分への水素結合を形成し得ない小さな疎水性アミノ酸である可能性があることを示している。したがって、モデリングデータは、ＣＬκ−Ｄ７７Ｇ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｐ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｍ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｌ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｉ、ＣＬκ−Ｄ７７Ａ、およびＣＬκ−Ｄ７７Ｖの変異が、方向性コンジュゲーションを向上させるであろうことを示唆している。実施例２６において見られたとおり、これは、実験試験によって支持されている。疎水性アミノ酸を有するすべてのＣＬκ７７変異体は、ＣＬκ−Ｈ８１の互変異性平衡に対して影響を有さないので、ＣＬκ−Ｈ８１はＮδ互変異性型のままであり、その結果、コンジュゲーション率は向上する。
モデリングはまた、最も親水性のアミノ酸は、ＱＭ／ＭＭ計算に従うと、ＣＬκ−Ｄ７７よりも高いタンパク質安定性をおそらくもたらし得ることを示唆しており；特にＣＬκ−Ｄ７７ＳおよびＣＬκ−Ｄ７７Ｔ、他にもＣＬκ−Ｄ７７Ｑ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｎ、ＣＬκ−Ｄ７７Ｈ、およびＣＬκ−Ｄ７７Ｒの変異が、方向性コンジュゲーションを向上させる可能性があると指摘している。実施例２６において示されているとおり、これも、実験試験によって支持されている。
相互作用エネルギーおよび電荷分布の変更に加えて、最も強い相互作用およびより低いコンジュゲーション率が、ＣＬκ−Ｄ７７ＦおよびＣＬκ−Ｄ７７Ｙ変異体で観察された。このモデルは、これらの芳香族アミノ酸の側鎖が結合ポケットに直接進入（ｉｎｄｔｕｄｅ）し、ＰＦＰ基とのπ電子スタッキング相互作用におそらく関係していて、したがって、ＰＦＰ部分の方向性配置を変化させることを示している。加えて、芳香族アミノ酸は、ＰＦＰを立体的に妨害して、ＷＴタンパク質において可能な結合様式と同様の結合様式を防止して、ＰＦＰ部分の方向性配置にマイナスの影響を及ぼし、コンジュゲーション率の低下をもたらし得る。興味深いことに、このモデルは、ＣＬκ−Ｄ７７Ｗの側鎖が、ＣＬκ−Ｄ７７ＦおよびＣＬκ−Ｄ７７Ｙの芳香族側鎖とはやや異なる空間的な位置を占めており、その際、ＣＬκ−Ｄ７７Ｗインドール基は、結合ポケットの外側にあり、結合ポケットに対するハロ−フェニルエステルの空間的アクセスを妨げるとは予測されないことを示唆している。このモデルはまた、ＣＬκ−Ｄ７７Ｅなどの保存的変異は、ＣＬκ−Ｈ８１の互変異性型に対して同様の作用をおそらく有するが、比較的長い側鎖によって、結合ポケットにおいて追加的な立体干渉をもたらすと予測している。ＣＬκ−Ｄ７７ＣまたはＣＬκ−Ｄ７７Ｋへの変異も、部位の反応性に干渉すると予測される。
ＣＬκ−Ｄ７７が、イミダゾール環のＮε上での水素原子の存在を支持する一方で、ＣＬκ−Ｄ７７Ａは、Ｎδ位に水素を維持することを支持する。この部位でのアミノ酸の空間的分布は、エステル基のカルボニル炭素でのＮεによる求核的攻撃を可能にし、方向性コンジュゲーションをさらに促進する触媒反応における、ＣＬκ−Ｈ８１のＮδ互変異性型の重要な機能を示している。
（実施例４２）
ＣＬκおよびＣＬκ−Ｄ７７Ａのモデルをベースとする予測モデリング
タンパク質安定性およびＰＦＰエステルとの相互作用強度に対する変異の影響を分析して、最も適していて反応性のＣＬκの変異体を同定した。このコンピュータによる実験では、ＣＬκ−Ｋ８０のＣα炭素から１０Å距離以内にある重要なアミノ酸を選択して、分析した（それぞれの残基について特有の要件から、ＣＬκ−Ｋ８０およびＣＬκ−Ｈ８１は除く）。
ＣＬκまたはＣＬκ−Ｄ７７ＡとのＰＦＰコンジュゲーションについてモデリングされた変異のうちの多く、またはほとんどについて、より大きいか、またはより小さいハロ−フェノールをＺ１基として使用する場合、または特定の免疫グロブリンドメインの正確な寸法がそのような形態にはふさわしいと考えられる場合など、ポケットサイズを縮小または増大させることが望ましいことがあり得るので、ある種の用途では、ＣＬκまたはＣＬκ−Ｄ７７ＡにおいてＰＦＰコンジュゲーションを低減するであろう残基を置換または保持することが適切である可能性もあることは理解されるであろう。
ＣＬκ−Ｋ７５
この残基は、ＱＭ／ＭＭ計算によると、天然またはＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異体におけるＣＬκ−Ｋ８０のコンジュゲーション反応性に対して、何らかの直接的な影響を有するとは考えられない。
ＣＬκ−Ａ７６
ＣＬκ−Ａ７６は、αへリックスの始まりに位置し、ＣＬκ−Ｄ７７の水素結合カルボキシル基およびＣＬκ−Ｓ７４のヒドロキシル基を含有する平面上にある。この位置は、大きな側鎖を有するアミノ酸がＣＬκ−Ｄ７７と相互作用することを可能にし、それらは、コンジュゲーション反応、特に、水素結合の形成を可能にする親水基とのコンジュゲーション反応にプラスの影響を有し得る。この残基でのほとんどのアミノ酸置換、具体的には、ＣＬκ−Ｓ７４Ａ、ＣＬκ−Ｓ７４Ｄ、ＣＬκ−Ｓ７４Ｅ、ＣＬκ−Ｓ７４Ｉ、ＣＬκ−Ｓ７４Ｌ、ＣＬκ−Ｓ７４Ｍ、ＣＬκ−Ｓ７４Ｆ、ＣＬκ−Ｓ７４Ｗ、およびＣＬκ−Ｓ７４Ｖは、コンジュゲーションにほとんど作用を有しないと予測されるであろう。水素結合の可能性をもたらし得るであろう他の残基、すなわち、ＣＬκ−Ｓ７４Ｒ、ＣＬκ−Ｓ７４Ｎ、ＣＬκ−Ｓ７４Ｑ、ＣＬκ−Ｓ７４Ｈ、およびＣＬκ−Ｓ７４Ｋ、ならびにより低い度合いでＣＬκ−Ｓ７４Ｓ、ＣＬκ−Ｓ７４Ｔ、およびＣＬκ−Ｓ７４Ｙは、コンジュゲーションを増強すると予測されるであろう。ＣＬκ−Ｓ７４ＧおよびＣＬκ−Ｓ７４Ｐなどのαへリックスを破壊する残基は、ＣＬκ−Ｋ８０への方向性コンジュゲーションに対して多少のマイナスの作用を有し得るが、方向性コンジュゲーションはおそらく排除されず、単に低下する。システインの導入は、発現の際に凝集を形成する可能性のリスクを提示するであろう。
ＣＬκ−Ｙ７８
ＣＬκ−Ｙ７８はαへリックス上に位置し、結合ポケットの反対方向に面している。ＣＬκ−Ｙ７８は、周囲アミノ酸と共にいくつかの疎水性相互作用を成しており、ＣＬκ構造を支持している。したがって、より小さい側鎖（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＶａｌ）またはαへリックスの安定性もしくは形成に影響を及ぼすもの（Ｇｌｙ、Ｐｒｏ）は、ＣＬκ−Ｋ８０へのコンジュゲーション反応におそらく不利な影響を及ぼすが、ただし、これらの変異は、ＣＬκ−Ｋ８０反応性に直接的に干渉するとは予測されていないので、そのような変異は、方向性コンジュゲーションを必ずしも排除し得ない。加えて、ＣＬκ−Ｙ７８は、ＣＬκ−Ｒ１０３の側鎖と相互作用すると考えられるので、疎水性または負に帯電している側鎖（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、およびＴｒｐ）は、コンジュゲーションを支持して、この相互作用を促進すると予測されるであろう。他の側鎖（Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、およびＭｅｔ）は、コンジュゲーション反応をもたらすとは予測されないであろう。
ＣＬκ−Ｅ７９
モデリングは、ＣＬκ−Ｅ７９の側鎖が結合部位とは逆の方向に向いていることを示唆している。加えて、ＣＬκ−Ｅ７９は、ＣＬκ−Ｋ７５の側鎖と共に塩橋を形成していると考えられる。モデリングに基づき、この位置でのほとんどのアミノ酸置換は、コンジュゲーション反応に対してほとんど作用を有さないであろうと仮定される（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐ）。小さな親水性または帯電残基は、おそらくコンジュゲーション反応を支持するが（Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、およびＶａｌ）、αへリックスの安定性または形成に影響を及ぼすもの（Ｇｌｙ、Ｐｒｏ）は、方向性コンジュゲーションを必ずしも排除しないが、ＣＬκ−Ｋ８０へのコンジュゲーション反応に不利な影響を及ぼし得る。
ＣＬκ−Ｖ８３
この残基は、実験データおよびＱＭ／ＭＭ計算により、ＣＬκ−Ｋ８０とのコンジュゲーション反応に対して直接的な影響を有するとは考えられない。
Figure 2015504893
追加のモデリング
ＣＬκ−Ｖ４２
ＣＬκ−Ｖ４２は、βストランドＣの末端、ＣＤループの始まりにポジショニングされている。構造を慎重に試験したところ、ＣＬκ−Ｖ４２は、ＣＬκ−Ｈ８１のイミダゾール環の下に位置していることが観察された（図１４および１５）。ＣＬκ−Ｈ８１とＣＬκ−Ｖ４２との間の相互作用の性質の決定を助けるために、イミダゾール環での重心のｘｙｚ座標を計算し、続いて、計算された重心とＣＬκ−Ｖ４２の水素原子Ｈδとの間の距離を測定した。この２．９Åの距離は、イミダゾール環上のπ電子とＣＬκ−Ｖ４２の水素Ｈδとの間の直接的な相互作用を示している。したがって、この相互作用は、ポケット内におけるＣＬκ−Ｈ８１の最適なポジショニングに、かつＮδ互変異性体への互変異性平衡のシフトのために強い影響を及ぼすと考えられる。したがって、必ずしもではないが、ＣＬκ−Ｖ４２の存在は、方向性コンジュゲーションに対してプラスの影響を発揮する。これらの分析は、ＣＬκ−Ｖ４２Ａ変異がコンジュゲーション率の低下の原因となるということが見出された実験データによって指示されている（表５４）。モデリングは、ＣＬκ−Ｖ４２Ｉが、ＣＬκ−Ｈ８１イミダゾール環のポジショニングを援助して、方向性コンジュゲーションをおそらく支持するが、ただし、やや大きな側鎖は、結合ポケットのサイズ全体を縮小させるであろうことを示唆している。多くの状況において、ポケットのサイズのこの縮小は、方向性コンジュゲーション機構に対して明らかな作用を有し得ない。ＣＬκ−Ｖ４２Ｌもまた、ＣＬκ−Ｈ８１イミダゾール環のポジショニングを援助し得ることがある。
ＣＬκ−Ｄ４３
ＣＬκ−Ｄ４３は、ＣＤループ上に位置している。天然ＣＬκでは、ＣＬκ−Ｄ４３は、ＣＬκ−Ｈ８１およびＣＬκ−Ｋ８２の主鎖と相互作用して、タンパク質の安定性に寄与していると考えられる。ＣＬκ−Ｈ８１のＨδとＣＬκ−Ｄ４３のカルボキシル基との間の水素結合は、ＣＬκの結晶構造では同定されなかった。これは、ＣＬκ−Ｄ４３がＣＬκ−Ｈ８１のＮδ触媒活性形態の互変異性平衡に軽微な影響しか発揮しないことを示唆し得る。しかしながら、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ４３Ａ］変異体での実験分析は、この残基の変異が、方向性コンジュゲーションに対して有意な阻害作用を有することを示した。モデル全体をまとめると、ＣＬκ−Ｈ８１が触媒活性形態と不活性形態との間を行き来して、ＣＬκ−Ｄ４３とＣＬκ−Ｄ７７との間に水素結合を形成していて、そしてそうであるとすると、ＣＬκ−Ｄ４３残基の除去は、活性なＮδ互変異性体へとＣＬκ−Ｈ８１をプッシュする力の一方を排除する可能性がある。
ＣＬκ−Ｄ７７Ａ結晶構造の分析は、水素ＮδとＣＬκ−Ｄ４３カルボキシル基との間のよく画定された水素結合を明らかにした。これは、図１３および１４に示されているとおり、ＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異体の最も重大な作用の１つは、ＣＬκ−Ｈ８１の触媒的に有利な互変異性型Ｎδの安定化にあることを示唆している。最終的には、ＣＬκ−Ｄ４３とＣＬκ−Ｈ８１とが近いことによって、ＣＬκ−Ｄ４３が、推定の反応機構の最後のステップにおいて、水素原子のレシピエントとして触媒反応に参加することが可能になるであろう（スキームＩＩＩ）。したがって、天然ＣＬκおよびＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異体におけるＣＬκ−Ｄ４３の役割は、ＣＬκ−Ｈ８１の触媒活性なＮδ互変異性型の安定化と、水素原子のレシピエントとしての、触媒反応への参加とにあると考えられる。
モデリング分析は、天然ＣＬκにおけるＰＦＰ分子の結合が、ＣＬκ−Ｈ８１の互変異性型によって制御され、次いで、この結合の親和性は、互変異性平衡定数の状態によって制御されることを強く示唆している。Ｎδ互変異性型の存在は、Ｎε上の孤立電子対がＰＦＰカルボニルを求核的に攻撃することを可能にする（スキームＩＩＩ）。
ＣＬκ−Ｄ４３は、水素イオンのアクセプターであることによって、触媒反応に関係している（スキームＩＩＩ）。ＣＬκ−Ｄ４３をインシリコで、１９種のアミノ酸すべてに変異させたが、最終的な一連の計算された変異体において、ＷＴタンパク質（ＣＬκ−Ｄ４３を含む）は、ＣＬκ−ＰＦＰエステル複合体で最も高い相互作用エネルギーをもたらし、その際、ＣＬκ−Ｄ４３Ｎも同様の鎖長であり、ＣＬκ−Ｈ８１ Ｎδへの水素結合を形成して、ＣＬκ−Ｈ８１の触媒活性な互変異性型Ｎδを補助し得ると予測された。おそらく許容できる置換である他の残基は、ＣＬκ−Ｄ４３Ｅ、ＣＬκ−Ｄ４３Ｑ、およびＣＬκ−Ｄ４３Ｓであり、これらは、ＣＬκ−Ｈ８１と所望のＨ結合を形成し得るが、ＰＦＰとのＣＬκコンジュゲーションのための最適なサイズであるにはやや大きすぎるか、または小さすぎるかのいずれかの鎖長をおそらく有するが、ＰＦＰとの方向性コンジュゲーションのための非ＣＬκ免疫グロブリンドメインを最適化するためか、または異なるハロ−フェニルエステルとのコンジュゲーションのためのＩｇドメインを最適化するためかのいずれかに、より良好に適していることがある。
ＣＬκ−Ｎ４４
ＣＬκ−Ｎ４４は、ＣＤループの上に位置している。その側鎖は、ＰＦＰ結合ポケットから離れて、外側に向いており、コンジュゲーション反応に対していずれの役割も影響も有しないと考えられる。ＱＭ／ＭＭ計算は、極性アミノ酸および負に帯電した側鎖を有するものは、やはりポケットの外側に位置しているＣＬκ−Ｋ４１との推定の相互作用によって、タンパク質安定性を増強し得ると予測した。
ＣＬκ−Ｌ４６
実験データに基づき、さらには、本発明者らのＱＭ／ＭＭ計算からも、ＣＬκ−Ｌ４６Ａ変異は、コンジュゲーション率に相対的に中性の影響を有した。ＣＬκ−Ｌ４６Ａは、ＰＦＰ結合ポケットの外側に位置するが、これは、その側鎖のサイズによって、ポケット形状を促進し得る。ポケットの外側に位置することで、これは、同じくポケットの外側に位置するアミノ酸と相互作用し得る。大きくて親水性の側鎖への変異は、ＣＬκ−Ｑ３９との相互作用によって、タンパク質の安定性を増大させ、ＱＭ／ＭＭ計算によれば、ＰＦＰポケットの形状を支持し得る。
ＣＬκ−Ｑ４７
ＣＬκ−Ｑ４７Ａ変異によって、コンジュゲーション率が向上した。この変異はおそらく、モデリング計算によれば、ＰＦＰ結合部位のサイズを増大させて、複合体の形成およびタンパク質の安定性にプラスの影響を及ぼすことによって作用を発揮している。ＱＭ／ＭＭ計算によれば、より大きな側鎖を有するアミノ酸は、コンジュゲーションにややマイナスの影響をおそらく及ぼす。したがって、ＣＬκ−Ｑ４７Ａ、ＣＬκ−Ｑ４７Ｇ、ＣＬκ−Ｑ４７Ｖ、ＣＬκ−Ｑ４７Ｉ、ＣＬκ−Ｑ４７Ｌ、ＣＬκ−Ｑ４７Ｔ、ＣＬκ−Ｑ４７Ｓ、ＣＬκ−Ｑ４７Ｎ、ＣＬκ−Ｑ４７Ｄ、ＣＬκ−Ｑ４７Ｈ、ＣＬκ−Ｑ４７Ｐ、またはＣＬκ−Ｑ４７Ｅへの変異がおそらく、有利か、または中性であるのに対して；ＣＬκ−Ｑ４７Ｗ、ＣＬκ−Ｑ４７Ｆ、ＣＬκ−Ｑ４７Ｙ、またはＣＬκ−Ｑ４７Ｋへの変異は、ＣＬκドメインへのＰＦＰコンジュゲーションにややマイナスの影響を有し得る。前のとおり、ある種の用途では、より小さいハロ−フェノールをＺ１基として使用する場合、または特定の免疫グロブリンドメインの正確な寸法がそのような形態にふさわしいと考えられる場合など、ポケットサイズを縮小させることが望ましいことがあることは理解されるであろう。
ＣＬκ−Ｓ４８
実験データによれば、ＣＬκ−Ｓ４８Ａの変異によって、コンジュゲーション率が向上した：モデリングは、この理由が十中八九、ポケットの静電特性の変化によることを示唆している。したがって、この位置の疎水性アミノ酸はおそらく、方向性コンジュゲーションにプラスの影響を有する。そのため、次の変異が、特に有利であり得る：ＣＬκ−Ｓ４８Ａ、ＣＬκ−Ｓ４８Ｇ、ＣＬκ−Ｓ４８Ｖ、ＣＬκ−Ｓ４８Ｉ、ＣＬκ−Ｓ４８Ｌ、ＣＬκ−Ｓ４８Ｐ、およびＣＬκ−Ｓ４８Ｍ。他の変異もおそらく、許容される。
（実施例４３）
ＣＬκ−Ｄ７７Ａの二重および三重変異
抗体２．１２．１．ｆｘを使用して、ＣＬκ領域へのさらなる変異の作用を試験した。前のとおり、残基のナンバリングは、ＣＬκ内でのそれらの位置による（例えば、配列番号６）。コンジュゲーション機構を理解するために、ＣＬκ−Ｄ４３およびＣＬκ−Ｈ８１をそれぞれ、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］抗体においてＡｌａに変異させた。変異を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に記載されているプロトコルに従って、２．１２．１．ｆｘ軽鎖で生成した。抗体２．１２．１．ｆｘ、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］（配列番号３７を含むＣＬκ）、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ４３Ａ］（配列番号１５を含むＣＬκ）、２．１２．１．ｆｘ、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ４３Ａ／Ｄ７７Ａ］（配列番号１２７を含むＣＬκ）、２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ／Ｈ８１Ａ］（配列番号１２８を含むＣＬκ）、および２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ−Ｄ４３Ａ／Ｄ７７Ａ／Ｈ８１Ａ］（配列番号１２９を含むＣＬκ）をＨＥＫ２９３細胞中で過渡的に発現させ、タンパク質Ａ親和カラムを使用して精製した。精製したｍＡｂを、ＭＳを使用して特徴づけた。
発現した抗体を、ｐＨ５．５の２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２００ｍＭのトレハロースに、２０ｍｇ／ｍｌで緩衝液交換した。次いで、抗体溶液をｐＨ７．７の６０ｍＭのリン酸ナトリウムでスパイクした。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］（ＡＢＰ）を、５０％のプロピレングリコールで再懸濁し、タンパク質と４．３：１のモル比で混合し、室温で一晩反応させた。すべての試料を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、サイズ排除クロマトグラフィー−質量分析（ＳＥＣ−ＭＳ）によって、インタクトなコンジュゲートされたタンパク質として分析して、コンジュゲート形態のタンパク質の数および定量化を決定した。この技術で、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定し；複数のＡＢＰコンジュゲーション部位は、ＡＢＰの質量差によって分離された別個のシグナルとして観察される。複数のＡＢＰコンジュゲーション種の相対的定量化を、シグナルの大きさを測定することによって行う。％ＣＡの結果を、表６６に示す。
Figure 2015504893
ＡＢＰコンジュゲーションの程度を、２．１２．１．ｆｘおよび２．１２．１．ｆｘ−［ＣＬκ変異体］の軽鎖および重鎖で別々に試験した。ＭＡＣを変性し、ジスルフィド結合を、グアニジン塩酸塩およびジチオトレイトールを使用して還元した。生じた遊離の軽鎖および重鎖を、ＬＣＭＳを使用して分析して、それぞれのコンジュゲーションプロファイルを決定した（表６７）。
Figure 2015504893
これらの結果は、Ｈｉｓ互変異性体の仮定と一致する。ＣＬκ−Ｄ７７Ａ変異体では、ＣＬκ−Ｄ４３がＣＬκ−Ｈ８１の触媒活性な互変異性体を安定させて、そしてこのことが、ＣＬκ−Ｋ８０がＰＦＰエステルに対してより受容性かつ反応性であることを可能にしている。逆に、ＣＬκ−Ｄ４３Ａ変異体では、ＣＬκ−Ｄ７７が、ＣＬκ−Ｈ８１の不活性な互変異性体を安定化させているので、ＣＬκ−Ｋ８０で観察される方向性コンジュゲーションの低減に至っている。二重変異体のＣＬκ−Ｄ４３Ａ／Ｄ７７Ａでは、ＣＬκ−Ｈ８１と、ＣＬκ−Ｄ４３またはＣＬκ−Ｄ７７のいずれかとの間に相互作用はなく、したがって、二重変異体は、ＷＴ ＣＬκとより類似して作用する。
（実施例４４）
ウサギＣＬκ分析
ウサギ抗体の軽鎖カッパ領域（ｒＣＬκ）は、他の免疫グロブリンの３Ｄ構造と同じ３Ｄ構造を有する。ｒＣＬκは、１５１位（カバット番号）にＡｓｐ、１８８位にＳｅｒ、および１８９位にＨｉｓを有する（ｒＣＬκ−Ｄ４３、ｒＣＬκ−Ｓ８０、ｒＣＬκ−Ｈ８１）。ｒＣＬκ−Ｓ８０Ｋ変異体は、ＰＦＰ方向性コンジュゲーションのための反応部位を作り得ると仮定された。この仮定を確認するために、２種のトラスツズマブウサギキメラ抗体を構築した。ｍＡｂ「ｒＴｒａｓｔ」（ウサギトラスツズマブ）は、ｒＣＬκおよびウサギ定常重鎖（ｒＣＨ）（それぞれ配列番号１３０および１３１）に融合しているトラスツズマブのＶＬおよびＶＨドメイン（それぞれ配列番号７５および７２）を含み、全長ｒＴｒａｓｔ−ＬＣ（配列番号１３２）およびｒＴｒａｓｔ−ＨＣ（配列番号１３３）を生成する。
ｒＴｒａｓｔ−［ｒＣＬκ−Ｓ８０Ｋ］は、ｒＣＬκ−Ｓ８０Ｋ（配列番号１３４）およびウサギ定常重鎖（ｒＣＨ）（配列番号１３１）に融合しているトラスツズマブのＶＬおよびＶＨドメイン（それぞれ配列番号７５および７２）を含み、全長ｒＴｒａｓｔ−ＬＣ−［ｒＣＬκ−Ｓ８０Ｋ］（配列番号１３５）およびｒＴｒａｓｔ−ＨＣ（配列番号１３３）を生成する。
ウサギＩｇＧ重鎖およびカッパ１軽鎖を、トラスツズマブ可変ドメインおよびベクターとオーバーラップしている末端をそれぞれ有するプラスミドｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｒＧおよびｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｒｋ１（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）からＰＣＲした。トラスツズマブＶＨおよびＶＬを、ベクターおよびウサギ定常ドメインとオーバーラップしている末端を有する合成遺伝子からＰＣＲした。Ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に記載されているプロトコルに従って、ＰＣＲを、ＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩでカットされた修飾ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した。挿入ＤＮＡを、ＤＮＡ配列決定によって確認した。Ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に記載されているプロトコルに従って、ｒＣＬκ−Ｓ８０Ｋ変異を生成した。変異をオリゴヌクレオチドプライマーによって導入し、ＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩでカットされた修飾ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。挿入ＤＮＡをＤＮＡ配列決定によって確認した。
キメラｍＡｂをＨＥＫ２９３細胞中で過渡的に発現させ、タンパク質Ａ親和カラムを使用して精製した。精製したｍＡＢをＭＳを使用して特徴づけた。それぞれの抗体をｐＨ５．５の２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２００ｍＭのトレハロースに、２０ｍｇ／ｍｌで緩衝液交換し、次いで、ｐＨ７．７の６０ｍＭのリン酸ナトリウムでスパイクした。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］（ＡＢＰ）を、５０％のプロピレングリコールで再懸濁し、タンパク質と４．３：１のモル比で混合し、室温で一晩反応させた。すべての試料を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、サイズ排除クロマトグラフィー−質量分析（ＳＥＣ−ＭＳ）によって、インタクトなコンジュゲートされたタンパク質として分析して、コンジュゲート形態のタンパク質の数および定量化を決定した。この技術で、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定し；複数のＡＢＰコンジュゲーション部位は、ＡＢＰの質量差によって分離された別個のシグナルとして観察される。複数のＡＢＰコンジュゲーション種の相対的定量化を、シグナルの大きさを測定することによって行う。
ＡＢＰコンジュゲーションの程度を、抗体の軽鎖について試験した。ＭＡＣを変性し、ジスルフィド結合を、グアニジン塩酸塩およびジチオトレイトールを使用して還元した。生じた遊離の軽鎖および重鎖を、ＬＣＭＳを使用して分析して、それぞれのコンジュゲーションプロファイルを決定した（表６８）。
Figure 2015504893
ｒＣＬκ−Ｓ８０Ｋ変異は、軽鎖での全体コンジュゲーション（０．６１から１．６５７に）および１ＣＡ（３８％から７３％に）を有意に上昇させた。この結果は、重要な残基、ＣＬκ−Ｋ８０Ｈ８１が免疫グロブリン上に存在する限り、方向性コンジュゲーション部位がヒト以外の種からのＣＬκ鎖上に作られ得ることを示唆している。個々のＷＴ操作に対する１−ＬＣ％の％を、表６８に記載されているとおり、右欄に示す。
（実施例４５）
ラムダ鎖
上記の実施例１０において実証されたとおり、ｈＣＬλは、ＰＦＰエステルとの方向性コンジュゲーションを実証しない。ｈＣＬλは、ｈＣＬκ−Ｄ４３（ＣＬλ−Ｄ４５）およびｈＣＬκ−Ｈ８１（ＣＬλ−Ｈ８２）でｈＣＬκと配列同一性を共有し、ｈＣＬκ−Ｋ８０（ＣＬλ−Ｓ８１）の位置にセリンを有する。ＣＬλ−Ｓ８１Ｋ変異体は、ＣＬλ−Ｓ８１Ｋ残基でのＰＦＰコンジュゲーションを可能にし得ることが仮定された。
ＣＬκおよびＣＬλ（図１７および１８）の結晶構造を比較すると、ＣＬκ−Ｖ４２は、推定のＰＦＰ結合ポケットの底部に位置する一方で、ＣＬλにおける対応する残基はＣＬλ−Ａ４４である。上記で検討したとおり、ＣＬκ−Ｖ４２Ａ変異は、おそらくＣＬκ−Ｈ８１のイミダゾール環の配向を安定化させるＣＬκ−Ｖ４２の能力によって、方向性コンジュゲーションにマイナスの影響を有する。モデリングは、ＣＬλ−Ａ４４Ｖ変異が、ＣＬλ−Ｈ８２に対して同様の作用を発揮するはずであることを示唆している。
実施例１０および実施例１６〜１８においてのとおり、モノクローナル抗ヒトＩＬ２２抗体（ｈＩＬ２２）を、例示的な、ＣＬλを含む抗体として使用した。ｈＩＬ２２は、配列番号１３６および１３７（それぞれｈＩＬ２２−ＬＣおよびｈＩＬ２２−ＨＣ）、ならび配列番号１３８を含む可変軽鎖（ｈＩＬ２２−ＣＬλ−ＶＬ）を含んだ。
方向性コンジュゲーションに対する様々なＣＬλ変異の作用を評価するために、ｈＩＬ２２のいくつかの変異体バージョンを生成した。すべてのｈＩＬ２２変異抗体は、配列番号１３７（ｈＩＬ２２−ＨＣ）および配列番号１３８（ｈＩＬ２２−ＣＬλ−ＶＬ）を含んだ。
ｈＩＬ２２−［ＬＫＪ］は、実施例１５において記載されたとおりのλ／κスワップを含み、配列番号６１のＣＬを含んだ。ｈＩＬ２２−［ＣＬλ−Ｓ８１Ｋ］は、ＣＬλ−Ｓ８１Ｋの単一の残基スワップを含み、配列番号１４０を含んだ。ｈＩＬ２２−［ＣＬλ−Ｑ７８Ａ／Ｓ８１Ｋ］は、ループ中に二重変異を含み、配列番号１４１を含んだ。ｈＩＬ２２−［ＣＬλ−Ａ４４Ｖ／Ｓ８１Ｋ］は、ＣＬλ−Ｓ８１Ｋ残基スワップ、他にも「結合ポケット」の底部にＣＬλ−Ａ４４Ｖ変異を含み、配列番号１４２を含んだ。ｈＩＬ２２−［ＣＬλ−Ａ４４Ｖ／Ｑ７８Ａ／Ｓ８１Ｋ］は、ＣＬλ−Ｑ７８ＡおよびＣＬλ−Ｓ８１Ｋの両方のループ変異、さらには、「結合ポケット」ＣＬλ−Ａ４４Ｖ変異を含み、配列番号１４３を含んだ。すべての点突然変異を、ｈＩＬ２２−ＬＣで、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に記載されているプロトコルに従って生成した。変異を、オリゴヌクレオチドプライマーによって導入し、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
ｈＩＬ２２−［ＣＬλ−λ７６−８４／１４５］は、ＣＬλ−Ｐ７６からＣＬλ−Ｓ８３まで（それらを包括）に位置するＣＬλ Ｅ−Ｆループの代わりに、配列番号１４５の挿入を含んだ。配列番号１４５は、［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］−Ｋ７５から［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］−Ｋ８２まで（それらを包括）の［ＣＬκ−Ｄ７７Ａ］Ｅ−Ｆループ（すなわち、βストランドＥとＦとの間）に対応する配列ＫＡＡＹＥＫＨＫＶを含む。
ｈＩＬ２２−［ＣＬλ−λ７６−８４／１４５］を、オーバーラップＰＣＲによって生成した。変異を、オリゴヌクレオチドプライマーによって導入した。配列番号１４５をコードするリバースプライマーと対になっているｈＩＬ２２−ＬＣの５’末端に特異的なプライマー、およびＩＬ２２−ＬＣの３’末端に特異的なリバースプライマーと対になっている配列番号１４５をコードするフォワードプライマーを使用して、ＩＬ２２−ＬＣをテンプレートとして使用して、ＣＬκ Ｅ−Ｆループを持つＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅させた。これら２種のＰＣＲ産物をテンプレートとして混合し；ＩＬ２２−ＬＣフォワードプライマーおよびリバースプライマーをオーバーラップＰＣＲ反応において使用して、配列番号１４５を有する全長ＩＬ２２−ＬＣ ＤＮＡを増幅した。次いで、ＰＣＲを、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩで消化した。消化されたＰＣＲを、ＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩでカットされた修飾ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））と連結させた。
変異させたｍＡｂをＨＥＫ２９３細胞中で過渡的に発現させ、タンパク質Ａ親和カラムを使用して精製した。精製したｍＡｂを、ＭＳを使用して特徴づけた。
それぞれの抗体を、ｐＨ５．５の２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２００ｍＭのトレハロースに、２０ｍｇ／ｍｌで緩衝液交換し、次いで、ｐＨ７．７の６０ｍＭのリン酸ナトリウムでスパイクした。［ＰＦＰ−ＰＥＧ５−Ｋ１１−配列番号２７］（ＡＢＰ）を、５０％のプロピレングリコールで再懸濁し、タンパク質と４．３：１のモル比で混合し、室温で一晩反応させた。すべての試料を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、ＡＢＰコンジュゲーションの程度を、抗体の軽鎖および重鎖で別々に試験した。ＭＡＣを変性し、ジスルフィド結合を、グアニジン塩酸塩およびジチオトレイトールを使用して還元した。生じた遊離の軽鎖および重鎖を、ＬＣＭＳを使用して分析して、それぞれのコンジュゲーションプロファイルを決定した（表６９）。
Figure 2015504893
単一の点突然変異ＣＬλ−Ｓ８１Ｋは、ＣＬλへのＰＦＰコンジュゲーションを可能にした。ＬＣ％ １ＣＡは、変異されていないｈＩＬ２２と比較して、ＣＬλ−Ｓ８１Ｋ変異体で０％から３１％へと上昇し、その際、さらなるコンジュゲーション付加が、抗体上のいずれか他の単一部位以外の新たに作られたコンジュゲーション部位で起こっているようであった。ペプチドマッピング研究によって、コンジュゲーション事象が、ＣＬλ−Ｓ８１Ｋで起こっていることが確認された（表７０）。
Figure 2015504893
表６９を参照し直すと、ＣＬλ−Ｓ８１ＫおよびＣＬλ−Ａ４４Ｖ（ｈＩＬ２２−［ＣＬλ−Ａ４４Ｖ／Ｓ８１Ｋ］）での変異の組合せは、軽鎖１ＣＡを５２％までさらに上昇させた。
興味深いことに、ＣＬλ−Ｑ７８Ａ／ＣＬλ−Ｓ８１Ｋ二重変異は、ＷＴ ＣＬλと比較してＣＬλ−Ｓ８１Ｋのコンジュゲーションを向上させたが（１ＣＡは０％から１１％に）、この向上は、単一のＣＬλ−Ｓ８１Ｋ変異体において見られた向上よりも、顕著なものではなかった。これは、モデルとよく相関している：ＣＬκ−Ｄ７７の変異の作用は、ＣＬκ−Ｄ７７とＣＬκ−Ｈ８１との間の水素結合を除去して、ＣＬκ−Ｈ８１が、触媒互変異性なＮδ型に戻ることを可能にすることである。ＣＬκ−Ｄ７７に対応する位置はＣＬλ−Ｑ７８であり、これについては、モデリングおよび変異分析の両方が、ＣＬλ−Ｈ８２に対して限定的な作用を有するであろうと示唆している。まとめると、これは、方向性コンジュゲーションに対するＣＬλ−Ｑ７８Ａの低い作用がおそらく、結合ポケットのサイズおよび形状に対する変更に起因することを示唆している。
しかしながら、ＣＬλ−Ａ４４Ｖ／Ｑ７８Ａ／Ｓ８１Ｋの三重変異の結果が、最も意外であった。１ＣＡ％によって測定されるとおりの方向性コンジュゲーションが７０％まで上昇し；天然ＣＬκドメインにおいて典型的に見られるレベルを達成した。
これらの結果および分析は、ループスワップ（ｈＩＬ２２−［ＣＬλ−λ７６−８４／１４５］）において見られた方向性コンジュゲーションの同様のレベルによって指示された。
概して、これらのデータは、結合ポケットのサイズおよび形状が使用される特異的なＺ基に適合していることを条件として、ＣＬλ−Ｑ７８Ａ変異こそが、ＣＬλ−Ｓ８１Ｋコンジュゲーションの方向性を改善することを示唆した。さらに、ＣＬλ変異体の結果は、モチーフＫＨが、正確な３Ｄ位置に存在することを条件として、方向性コンジュゲーション部位がＣＬκ以外の免疫グロブリンの上で作られ得ることを示唆した。もちろん、結合ポケットは、使用される特異的なハロ−フェニルエステルを収容するために適したサイズおよび形状でなければならず、本明細書において実証されているとおり、ＣＬκ−Ｖ４２、ＣＬκ−Ｄ４３、およびＣＬκ−Ｄ７７に対応する残基の存在または不在などの追加の特徴が、特異的な免疫グロブリンドメインおよびハロ−フェニルエステルに関係したＫＨモチーフの方向性コンジュゲーションの率および最適化に対して有意な作用を有し得る。ＰＦＰをこれらの実施例では使用したが、許容されるレベルの方向性コンジュゲーションを伴う他のＺ基を選択することができることと、合理的なモデリング技術を使用して、所望のＺ基、結合ポケットのサイズ、および活性な結合ポケットを維持するために必要な特異的な変異の間でバランスを得ることができることとは、明らかである。
（実施例４６）
ＣＨドメイン上でのＰＦＰコンジュゲーション部位の再現：
抗体のＣＨドメインも、免疫グロブリン構造を含む。実施例４１および４２において記載したとおりにドメインをモデリングする前に、コンジュゲーションモチーフを他のＣＨドメインのＥＦ接続鎖のＥＦループ部分に移動させると、方向性コンジュゲーションが可能となり得ると仮定された。ＣＨγ１（配列番号１４７）、ＣＨγ２（配列番号１５５）、ＣＨγ３（配列番号１５８）、ＣＬκ（配列番号６）、およびＣＬλ（配列番号５７）ドメインの配列アラインメントを図１６に示す。
２種の変異体バージョンを、ＣＨ１ドメイン上で製作した。
ｈＣＨγ１−ｍ１では、配列番号１４７の残基Ｌ７６−Ｔ８０に対応する配列ＬＧＴＱＴ（配列番号１５２）を除去し、ＣＬκのＥ７９−Ｖ８３に対応するＥＫＨＫＶ（配列番号１５３）に置き換えた。生じた変異体ｈＣＨγ１−ｍ１は配列番号１４８を含んだ。
ＣＨγ１−ｍ２では、配列番号１４７の残基Ｌ７６−Ｔ８０に対応する配列ＬＧＴＱＴ（配列番号１５２）を除去し、ＣＬκ−のＹ７８−Ｖ８３に対応するＹＥＫＨＫＶ（配列番号１５４）に置き換えた。生じた変異体ｈＣＨγ１−ｍ２は配列番号１５０を含んだ。追加のＹ残基を組み込んで、ｈＣＨγ１−ｍ２配列がＣＬκ配列とより良好にアラインし得るようにした。
配列アラインメントは、ｈＣＨγ１がＣＬκ−Ｄ４３に対応するＡｓｐ残基を欠失していることを示した。そこで、２種の追加の変異体を生成したが；その際、ｈＣＨγ１−ｍ１およびｈＣＨγ１−ｍ２のそれぞれを、ＣＨγ１−Ｓ４３とＣＨγ１−Ｇ４４との間へのＡｓｐ残基の追加の挿入変異に掛けて、ｈＣＨγ１−ｍ１−Ｄ４４（配列番号１４９）およびｈＣＨγ１−ｍ２−Ｄ４４（配列番号１５１）の２種の新たな変異体を作成した。
ｈＣＨγ２（配列番号１５５）の変異体バージョンを生成したが、その際、配列番号１５５の残基Ｎ８５Ｇ８６をＫＨで置換して、ｈＣＨγ２−ｍ（配列番号１５６）を生成した。配列アラインメントは、ｈＣＨγ２（配列番号１５５）がＡｓｐ残基（Ｄ５０）を、ＣＬκ−Ｄ４３に対応し得る位置に含むことを示唆した。
ｈＣＨγ３（配列番号１５７）の変異体バージョンを生成したが、その際、配列番号１５７の残基Ｑ７９Ｇ８０をＫＨで置換して、ｈＣＨγ３−ｍ（配列番号１５８）を生成した。配列アラインメントは、ｈＣＨγ３（配列番号１５５）がＡｓｎ残基（Ｎ４４）を、ＣＬκ−Ｄ４３に対応する位置に含むことを示唆した。
トラスツズマブを、モデルＡｂとして研究において使用した。すべてのｈＴｒａｓｔ−ＣＨγ変異体が［ＣＬκ−Ｋ８０Ａ］変異を伴って発現されたので、コンジュゲーション事象は、試験ＣＨγドメインで優先的に起こったのであろう。ｈＴｒａｓｔ−ＬＣ−［ＣＬκ−Ｋ８０Ａ］（配列番号１４６）変異を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に記載されているプロトコルに従って生成した。
ＣＨγドメインでの変異を、オーバーラップＰＣＲを使用して生成した。変異を、オリゴヌクレオチドプライマーによって導入した。所望の変異を有するリバースプライマーと対になったトラスツズマブＨＣの５’末端に特異的なプライマー、およびトラスツズマブＨＣの３’末端に特異的なリバースプライマーと対になった所望の変異を有するフォワードプライマーを使用して、トラスツズマブＨＣをテンプレートとして使用して、ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。これら２種のＰＣＲ生成物をテンプレートとして混合し；トラスツズマブ重鎖フォワードプライマーおよびリバースプライマーをオーバーラップＰＣＲ反応で使用して、所望の変異を有する全長トラスツズマブＨＣ ＤＮＡを増幅した。次いで、ＰＣＲを制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩで消化した。消化されたＰＣＲを、ＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩでカットされた修飾ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））と連結させた。
変異を有するトラスツズマブ抗体をＨＥＫ２９３細胞中で過渡的に発現させ、タンパク質Ａ親和カラムを使用して精製した。精製したｍＡｂを、ＭＳを使用して特徴づけた。
発現された抗体をｐＨ５．５の２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２００ｍＭのトレハロースに、２０ｍｇ／ｍｌで緩衝液交換した。次いで、タンパク質をｐＨ７．７の６０ｍＭのリン酸ナトリウムでスパイクした。ＡＢＰを、５０％のプロピレングリコールで再懸濁し、タンパク質と４．３：１のモル比で混合し、室温で一晩反応させた。すべての試料を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、サイズ排除クロマトグラフィー−質量分析（ＳＥＣ−ＭＳ）によって、インタクトなコンジュゲートされたタンパク質として分析して、コンジュゲート形態のタンパク質の数および定量化を決定した。この技術で、それぞれのタンパク質の形態の分子量を測定し；複数のＡＢＰコンジュゲーション部位は、ＡＢＰの質量差によって分離された別個のシグナルとして観察される。複数のＡＢＰコンジュゲーション種の相対的定量化を、シグナルの大きさを測定することによって行う。
Figure 2015504893
ＡＢＰコンジュゲーションの程度を、トラスツズマブおよびトラスツズマブ変異体の軽鎖および重鎖で別々に試験した。ＭＡＣ産生物を変性し、ジスルフィド結合を、グアニジン塩酸塩およびジチオトレイトールを使用して還元した。生じた遊離の軽鎖および重鎖を、ＬＣＭＳを使用して分析して、それぞれの鎖でのコンジュゲーションプロファイルを決定した（表７２）。
Figure 2015504893
ｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｋ８０Ａ］／ＣＨγ１−ｍ１およびｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｋ８０Ａ］／ＣＨγ１−ｍ２での全コンジュゲーションは、ｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｋ８０Ａ］と比較すると、０．６６ＣＡから約１ＣＡへと増大し；これら２種の変異体のＨＣ １ＣＡは、２１％から３１％へと上昇し、約１５０％の向上であった。これは、ＫＨモチーフの導入によって、ＣＬκおよびＣＬλ以外の免疫グロブリンドメインに、方向性コンジュゲーションが導入され得るという仮定を裏付けた。
ｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｋ８０Ａ］／ＣＨγ２ｍでの全コンジュゲーションも増大したが、ＣＨγ１変異体の規模よりは低い規模であった。ＣＨγ１の配列とＣＨγ２配列との比較は、ＣＬκ−Ｄ７７に対応する残基に、ＣＨγ１はＳｅｒを含み、ＣＨγ２はＡｓｐを含むことを示している。これは、ＣＨγ２ドメインにおけるＣＬκ−Ｄ７７変異と同様の変異が、コンジュゲーションの程度を向上させ得るであろうことを示唆し得ている。
加えて、ＣＨγ３ ＨＣでのコンジュゲーションの向上も、明らかではあるが、ＣＨγ１ドメイン変異体と比較すると、中程度であった。ＣＨγ３ドメイン配列は、ＣＬκ−Ｄ７７に対応する位置にＡｒｇを、かつＣＬκ−Ｄ４３に対応する位置にＳｅｒを含むと考えられた。
さらに、ｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｋ８０Ａ］／ＣＨγ１−ｍ１−Ｄ４４およびｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｋ８０Ａ］／ＣＨγ１−ｍ２−Ｄ４４の両方でのＣＡ％ ＨＣのコンジュゲーションは、ｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｋ８０Ａ］／ＣＨγ１−ｍ１およびｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｋ８０Ａ］／ＣＨγ１−ｍ２の両方において見られる明らかなコンジュゲーションの増大が、ＷＴの約１５０％からＷＴの僅か約１１４％になるという非常に意外な結果を示した。
説明的な仮定は、図１７の配列アラインメントは、３Ｄ免疫グロブリン構造において見出されるところに従って、個々の残基を正確にアラインすることができないことを示唆した。
（実施例４７）
免疫グロブリンフォールドのモデリング
そのため、ｈＣＨγ１、ｈＣＨγ２、およびｈＣＨγ３ドメインについての結晶構造座標を、Ｒｕｔｇｅｒｓ、ｔｈｅ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｔｈｅ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ（ＳＤＳＣ）およびＳｋａｇｇｓ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏによって維持されている「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ」から得た。ｈＣＨλ１の構造は、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ」を介して利用可能な３ｄｖのＸ線構造に基づく。ｈＣＨλ２の構造は、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ」を介して利用可能な２ｄｔｓのＸ線構造に基づく。ｈＣＨλ３の構造は、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ」を介して利用可能な２ｄｔｓのＸ線構造に基づく。ｈＣＬλの構造は、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ」を介して利用可能な４ｆｑｈのＸ線構造に基づく。
構造に従って配列をアラインする相同性アラインメントを生成した（図１７）。ＣＬκおよびｈＣＨγ１−ｍ１の結晶構造の比較（図１９）は、ｈＣＨγ−ＣＤ接続鎖が、短いαへリックスを含むことを示した。モデリングは、このＣＤ αへリックスが、天然Ｓ４３およびｈＴｒａｓｔ−［ＣＬκ−Ｋ８０Ａ］／ＣＨγ１−ｍ１−Ｄ４４ Ａｓｐ挿入を、結合ポケットを離れて伸長する側鎖と共にもたらすこと（図２０および２１）、およびＣＨγ１−Ｄ４４の付加が、ＣＤ αへリックスのサイズを増大させ、伸長させることを示唆した。加えて、モデルは、ＣＨγ１−Ｑ７９Ｈ残基が、最適な平面配向になく、ＰＦＰと隣接するＣＨγ１−Ｔ７８Ｋとの間の反応に参加するその能力を低減していることを示唆している（図２１）。
図２２のＣＬκおよびＣＨγ１−ｍ１−Ｄ４４ドメインの比較は、ＣＤ接続鎖上のＣＤ αへリックスを除去し、ループ構造と置き換えることによって、ポケットの形状が最適化され得ることを示唆している。したがって、変異体ＣＨγ１ドメイン、配列番号１６５をモデリングし、最小化した。配列番号１６５は、ＣＨγ１−ｍ１変異体のＣＨγ１−Ｔ８４Ｋ／Ｑ７９Ｈ二重変異、さらには、ＣＨγ１−Ｎ４２からＣＨγ１−Ｌ４６までの（それらを包括）ＣＨγ１ ＣＤ接続鎖の、ＫＶＤＮＡＬＡ（配列番号１６６）での置換を含み；配列番号１６６は、追加のＡｌａ残基が加えられているＣＬκドメイン（配列番号６）の残基に対応する。図２２に示したモデリング結果は、ＣＨγ１−Ｑ７９Ｈが、ＣＤ接続鎖上へのＶａｌ残基の導入によって補助されて、より平面な配向を占めていることを示唆している。この残基をＬｅｕまたはＩｌｅに変異させると、天然ＣＬκにおける距離に関して、より長い側鎖がＨ残基までの大きなギャップを埋めることができることによって、イミダゾール環にさらなる安定化を与えることができる。重大なことに、モデルは、隣接するＡｓｐ残基をＣＨγ１−Ｑ７９Ｈから適切な配向および距離に置いて、δ−互変異性型を支持し、ＣＨγ１−Ｔ７８Ｋの反応性の増大を促進する。
同様のモデリングを、ＣＨγ２およびＣＨγ３ドメインで行った。図２４は、ＣＬκおよびＣＨγ２の重要なＷＴ残基を比較している。ＣＨγ２−Ｄ４９およびＣＨγ２−Ｄ５０は、方向性コンジュゲーションを援助する正確な位置および配向で存在していると考えられるが、ＣＨγ２−Ｄ８２は、３ＤモデルにおいてＣＨγ２−Ｇ８６Ｈにさらに近い位置を占めているので、ε−互変異性型を支持し、ＣＨγ２−Ｎ８５Ｋの反応性を低減している。このモデルは、ＣＨγ２−Ｄ８２残基が、ＣＨγ２ｍ変異体において見られた方向性コンジュゲーションの相対的に低い増大を説明し得ることを示唆している。図２６は、変異ＣＨγ２−Ｄ８２Ａ／Ｎ８５Ｋ／Ｇ８６Ｈを含む、ＣＨγ２について提案された変異体の最小化モデルを図示している（配列番号１６７）。直ちに相違が見られる：イミダゾール環は、より平面の配向で、δ−互変異性体の形成に偏らせるために適したＣＨγ２−Ｄ５０への距離の範囲内に出現しており、ＣＨγ２−Ｄ８２Ａ変異は、結合ポケットを広げて、おそらくＰＦＰアクセスの立体的阻害の低減に導いている可能性がある。
図２７〜２９は、ＣＬκとＣＨγ３ＷＴおよびＣＨγ３ｍ変異体との対応する比較を示している。モデルは、ＣＨγ３−Ｇ８０Ｈをε−互変異性体型へと偏らせる残基が存在しないにもかかわらず、コンジュゲートするためのＣＨγ３−Ｑ７９Ｋの利用可能性がおそらく、長いＣＨγ３−Ｒ７６側鎖によって立体的に障害されていることを示唆している。図３０は、変異ＣＨγ３−Ｓ４３Ｖ／Ｎ４４Ｄ／Ｒ７６Ａ／Ｑ７９Ｋ／Ｇ８０Ｈを含む、ＣＨγ３：ｈＣＨ３γｍ−ＣＤ１／ＥＦについて第１の提案変異体の最小化モデルを図示している（配列番号１６８）。モデリングされた相違は、図３０Ｂにおいて容易に観察され得る：結合ポケットの利用可能性が広がり、反応性Ｌｙｓ上の立体干渉を低減している。
図３０Ｂのモデリングされた構造における側鎖の距離から、ＣＨγ３−Ｓ４３ＶまたはＣＨγ３−Ｎ４４Ｄは、ＣＬκにおける対応する残基と同程度に、ＣＨγ３−Ｇ８０Ｈと相互作用することはなさそうである。したがって、ＣＨγ３についての第２の提案された変異体も最小化し、モデリングした：変異ＣＨγ３−Ｓ４３Ｌ／Ｎ４４Ｅ／Ｒ７６Ａ／Ｑ７９Ｋ／Ｇ８０Ｈを含むｈＣＨ３γｍ−ＣＤ２／ＥＦ（配列番号１６９）。ＣＬκ（図３１）の構造に対してより大きな構造相似性を有し、かつＣＨγ３−Ｎ４４ＤとＣＨγ３−Ｇ８０Ｈとの間よりも、ＣＨγ３−Ｎ４４ＥとＣＨγ３−Ｇ８０Ｈとの間に、より大きな水素結合の可能性を有する結合ポケットが得られるように、適切な残基をＣＤ接続鎖上により長い側鎖と共に導入すること（ＣＨγ３−Ｓ４３Ｖの代わりにＣＨγ３−Ｓ４３Ｌ、およびＣＨγ３−Ｅ４４Ｄの代わりに、ＣＨγ３−Ｎ４４Ｅ）をモデリングした。
ＣＨγドメインおよび変異体の配列を、ＣＬκおよびＣＬλとアラインさせた（図３２）。
このように、本発明を、上記の代表的な実施形態を参照して、幅広く開示および例示した。当業者は、様々な変更形態を、本発明の思想および範囲から逸脱することなく、本発明に対して成すことができることを認識するであろう。すべての刊行物、特許出願、および公表された特許は、それぞれ個々の刊行物、特許出願、または公表された特許が、その全体が参照によって組み込まれると具体的かつ個別に示されている場合と同程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。参照によって組み込まれた文章中に含有される定義は、それらが本開示中の定義に矛盾する限りにおいて、排除される。
明確化のために別々の実施形態の文脈において記載された本発明のある種の特徴を、単一の実施形態に組み合わせて提供することもできることは、分かるであろう。逆に、簡略化のために、単一の実施形態の文脈において記載された本発明の様々な特徴を、別々に、または任意の適切な部分的組合せにおいて提供することもできる。
本発明の１つの実施形態に関して検討したあらゆる制限を、本発明の任意の他の実施形態に適用することができることが明確に企図されている。さらに、本発明のいずれの組成物も、本発明のいずれの方法においても使用することができ、本発明のいずれの方法も、本発明のいずれの組成物を製造または利用するためにも使用することができる。特に、単独で、または１種もしくは複数の追加の請求項および／もしくは明細書の態様と組み合わせて特許請求の範囲に記載される本発明のいずれの態様も、特許請求の範囲および／または明細書および／または配列表および／または図面中の他の場所に明記された本発明の他の態様と組み合わせることができると理解されるべきである。
本明細書中に見出される具体的な例が発明の範囲内に該当しない場合に限って、上記の具体的な実施例は、明確に放棄され得る。
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替物のみを指すことが明確に示されていない限り、「および／または」、あるいは、開示が代替物のみおよび「および／または」を指す定義を支持するが、代替物が互いに排他的であることを意味するために使用される。本明細書の仕様で使用する場合、「ａ」または「ａｎ」は、別段に明確に示されていない限り、１つまたは複数を意味し得る。本明細書の請求項（複数可）で使用する場合、語「含むこと」と共に使用する場合、語「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは１つより多くを意味し得る。本明細書で使用する場合、「別の」は、少なくとも第２以上を意味し得る。本明細書において別段に定義されていない限り、本発明に関して使用される科学的および技術的用語は、当業者によって普通に理解される意味を有することとする。さらに、内容によって別段に必要とされていない限り、単数の用語は、複数を包含することとし、複数の用語は、単数を包含することとする。語「含む／含むこと」および語「有すること／包含すること」は、本発明に関して本明細書で使用する場合、記述した特徴、整数、ステップ、または成分の存在を規定するために使用されるが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、成分、または基の存在あるいは付加を排除するものではない。
Figure 2015504893
Figure 2015504893
Figure 2015504893
Figure 2015504893
Figure 2015504893
Figure 2015504893
Figure 2015504893

Claims (58)

  1. 接続アミノ酸の鎖によって互いに順次接続されている７つのβストランドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧを含む免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドであって、
    βストランドが、βストランドＡ、Ｂ、Ｄ、およびＥを含む第１のβシートと、βストランドＣ、Ｆ、およびＧを含む第２のβシートとを形成するように配置されており、前記第１および第２のβシートは互いに共有結合されており；
    βストランドＥおよびＦが、ＥＦ鎖によって互いに接続されており、前記ＥＦ鎖が配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｋ５−Ｈ６（配列番号９８）を含み、ここで、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４はそれぞれ独立に、任意のアミノ酸残基である、ポリペプチドにおいて、
    Ｘ２がＡ、Ｇ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｐ、Ｎ、Ｍ、Ｈ、Ｗからなる群から選択されることを特徴とするポリペプチド、ならびに薬学的に許容できるその塩、立体異性体、互変異性体、溶媒和物、およびプロドラッグ。
  2. ＥＦ鎖が、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、および配列番号２２４からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. ＥＦ鎖が、６〜１２残基長さである、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  4. ＥＦ鎖が、７〜１１残基長さである、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  5. ＥＦ鎖が、８〜１０残基長さである、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  6. ＥＦ鎖がαへリックスを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  7. ＥＦ鎖上のαへリックスが残基Ｘ１およびＸ２を含む、請求項６に記載のポリペプチド。
  8. βストランドＣおよびＤが、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、および配列番号２５３からなる群から選択されるＣＤモチーフを含むＣＤ鎖によって互いに接続されていて、前記ＣＤモチーフが、前記ＣＤ鎖の第１または第２の残基から始まる、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  9. ＣＤモチーフが配列番号２５１である、請求項８に記載のポリペプチド。
  10. ＣＤモチーフがαへリックスの一部を形成していない、請求項８から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  11. βストランドＣおよびＤがＣＤ鎖によって互いに接続されていて、前記ＣＤ鎖が６〜１２残基長さである、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  12. 免疫グロブリンドメインが抗体定常ドメインである、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  13. 抗体定常ドメインを配列番号６の配列とアラインさせた場合に、残基ＫおよびＨを、配列番号６の８０および８１位に対応する位置に含む抗体定常ドメインを含むポリペプチドにおいて、抗体定常ドメインが、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｐ、Ｎ、Ｍ、Ｈ、Ｗからなる群から選択される残基を、配列番号６の７７位に対応する位置にさらに含むことを特徴とするポリペプチド、薬学的に許容できるその塩、立体異性体、互変異性体、溶媒和物、およびプロドラッグ。
  14. Ｖ、Ｉ、およびＬからなる群から選択される残基を、配列番号６の残基４２に対応する位置にさらに含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
  15. Ｄ、Ｅ、Ｎ、およびＱからなる群から選択される残基を、配列番号６の残基４３に対応する位置にさらに含む、請求項１３から１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  16. 配列番号６の残基４２および４３に対応する位置の残基が、αへリックス形成に関係していない、請求項１３から１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  17. Ｘ２または配列番号６の残基７７に対応する位置の残基が、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｎ、およびＭからなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  18. Ｘ２または配列番号６の残基７７に対応する位置の残基が、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、およびＭからなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  19. Ｘ２または配列番号６の残基７７に対応する位置の残基が、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、またはＭからなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  20. 哺乳類抗体定常ドメインである、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  21. 哺乳類抗体定常ドメインがヒト化ドメインまたはヒトドメインである、請求項１７に記載のポリペプチド。
  22. 定常ドメインが抗体可変ドメインに接続されている、請求項２０から２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  23. 配列番号９８のＫ５の側鎖のε−アミノ基または配列番号６の残基８０に対応する位置に位置するＫの側鎖のε−アミノ基が、リンカーに共有結合されている、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  24. リンカーが、式Ｘ１−Ｙ１−Ｚ１、Ｘ１−Φ−Ｙ１−Ｚ１、およびＸ１−Ｙ１−Φ−Ｚからなる群から選択される式を含み、ここで、Φは切断可能な基であり、Ｘ１は、少なくとも１個のエフェクター部分に共有結合的に接続可能な基であり、Ｙ１は、直鎖または分枝の接続鎖であり、Ｚは、配列番号９８のＫ５の側鎖のε−アミノ基または配列番号６の残基８０に対応する位置に位置するＫの側鎖のε−アミノ基に共有結合的に接続される基である、請求項２３に記載のポリペプチド。
  25. 切断可能な基Φが存在し、下式：
    Figure 2015504893
     ［式中、波線および平行線はそれぞれ、適切にＸ１、Ｙ１、またはＺ１基のいずれかへの結合点を示している］の基である、請求項２４に記載のポリペプチド。
  26. リンカーが、
    Figure 2015504893
    Figure 2015504893
    Figure 2015504893
     ［式中、ｍ、ｎ、ｊ、およびｋはそれぞれ独立に、その下限が０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０からなる群から選択され、その上限が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０からなる群から選択される範囲である］からなる群から選択され、リンカーの全体長さが、２００原子を超えない、請求項２４から２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  27. リンカーの全体長さが、１５０原子を超えない、請求項２３から２６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  28. リンカーの全体長さが、６０原子を超えない、請求項２７に記載のポリペプチド。
  29. エフェクター部分が、治療薬、タンパク質、ペプチド、核酸、アプタマー、低分子、タンパク質アゴニスト、タンパク質アンタゴニスト、代謝調節物質、ホルモン、毒素、成長因子、または診断薬である、請求項２４から２８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  30. エフェクター部分が毒素であり、下式：
    Figure 2015504893
     ［式中、出現する毎に独立に、
    Ｗ２は、
    Figure 2015504893
     であり、
    Ｒ１１は、
    Figure 2015504893
     であり、
    Ｙ２は、−Ｃ２〜Ｃ２０アルキレン−、−Ｃ２〜Ｃ２０ヘテロアルキレン−；−Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ−、−アリーレン−、−Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ−、−Ｃｌ〜Ｃ１０アルキレン−アリーレン−、−アリーレン−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−、−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−（Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ）−、−（Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ）−Ｃｌ〜Ｃ１０アルキレン−、−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−（Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ）−または−（Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ）−Ｃｌ〜Ｃｌ０アルキレン−であり、
    Ｚ２は、
    Figure 2015504893
     であり、
    Ｒ１２は、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、またはＣ１〜Ｃ８ハロアルキルであり、
    Ｒ１３ＡおよびＲ１３Ｂは、次の（ｉｉｉ）または（ｉｖ）のいずれかであり：
    （ｉｉｉ）Ｒ１３Ａは、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８カルボシクリル、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアラルキル、アラルキル、またはハロゲンであり、かつ
    Ｒ１３Ｂは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８カルボシクリル、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアラルキルもしくはアラルキル、またはハロゲンであるか、または
    （ｉｖ）Ｒ１３ＡおよびＲ１３Ｂは一緒になって、Ｃ２〜Ｃ８アルキレンまたはＣ１〜Ｃ８ヘテロアルキレンであり、
    Ｒ１４ＡおよびＲ１４Ｂは、次の（ｉｉｉ）または（ｉｖ）のいずれかであり：
    （ｉｉｉ）Ｒ１４Ａは、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８カルボシクリル、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアラルキル、またはアラルキルであり、かつ
    Ｒ１４Ｂは、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８カルボシクリル、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアラルキル、またはアラルキルであるか、または
    （ｉｖ）Ｒ１４ＡおよびＲ１４Ｂは一緒になって、Ｃ２〜Ｃ８アルキレンまたはＣ１〜Ｃ８ヘテロアルキレンであり、
    Ｒ１５は、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’ −Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＨ、ハロゲン、−Ｎ３、−Ｎ（Ｒ’）２、−ＣＮ、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＮＨＣＯＮＨ２、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’および−ＳＲ’（ここで、各Ｒ’は、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、および非置換のアリールからなる群から独立に選択されるか、または２個のＲ’は、それらが結合している窒素と一緒に、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリルを形成することができる）からなる群から独立に選択される１、２、３、４または５個の基で置換されていてもよい
    Figure 2015504893
     、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル、Ｃ３〜Ｃ８カルボシクリルおよびＣ６〜Ｃ１４アリールであるか、または
    Ｒ１５は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＨ、ハロゲン、−Ｎ３、−Ｎ（Ｒ’）２、−ＣＮ、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＮＨＣＯＮＨ２、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’、−ＳＲ’およびアリーレン−Ｒ’（ここで、各Ｒ’は、水素、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８ヘテロシクリル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクリル、およびアリールからなる群から独立に選択されるか、または２個のＲ’は、それらが結合している窒素と一緒に、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリルを形成することができる）からなる群から独立に選択される１、２、３、４、または５個の基で置換されていてもよい
    Figure 2015504893
     であり、
    Ｒ１６は、水素、−Ｃ１〜Ｃ８アルキル、−Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、−Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、または−Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキルであり、
    Ｒ２２は、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリル、またはＣ６〜Ｃ１４アリールであり、
    Ｒ２３は、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロシクリルであり、
    Ｒ１７は、出現する毎に、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ、およびＢｒからなる群から独立に選択され、
    Ｒ２０は、−アリール、−Ｃｌ−Ｃｌ０アルキレン−アリールであり、アリールを含むＲ１０上のアリールは、［Ｒ１７］ｈで置換されており、
    ｈは、５であり、
    Ｘは、ＯまたはＳであるが、
    ただし、Ｒ１３Ａが水素である場合、ＸはＳであることを条件とする］
    または薬学的に許容できるその塩または溶媒和物を含む、請求項２９に記載のポリペプチド。
  31. エフェクター部分が毒素であり、下式
    Figure 2015504893
     からなる群から選択される、請求項２９に記載のポリペプチド。
  32. 少なくとも１個のエフェクター部分がタンパク質またはペプチドである、請求項２４に記載のポリペプチド。
  33. リンカーのＸ１基が、タンパク質またはペプチド中のペプチド連結残基のアミノ末端、カルボキシル末端、または側鎖に共有結合されている、請求項３２に記載のポリペプチド。
  34. ペプチド連結残基が、Ｋ、Ｒ、Ｃ、Ｔ、Ｙ、Ｓ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、ＫＳＨ、ならびにＫおよびＣの同族体からなる群から選択される、請求項３３に記載のポリペプチド。
  35. 連結残基がＫである、請求項３４に記載のポリペプチド。
  36. 抗体定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  37. ＣＬドメインがカッパドメイン（ＣＬκ）である、請求項３６に記載のポリペプチド。
  38. ＣＬκが、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５４、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、および配列番号１２２からなる群から選択される配列を含む、請求項３７に記載のポリペプチド。
  39. ＣＬκが、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、および配列番号２２４からなる群から選択される中間配列によって互いに連続接続されている配列番号２２５によって定義されるＮ末端部分および配列番号２２６によって定義されるＣ末端部分を含む、請求項３７に記載のポリペプチド。
  40. ＣＬドメインがラムダドメイン（ＣＬλ）である、請求項３６に記載のポリペプチド。
  41. ＣＬλが、配列番号６０、配列番号６１、配列番号１４１、配列番号１４４、配列番号１４３、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、および配列番号２４４からなる群から選択される配列を含む、請求項４０に記載のポリペプチド。
  42. ＣＬλが、中間配列によって、配列番号２３４または配列番号２３５のいずれかによって定義されるＣ末端部分に互いに連続接続されている、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、または配列番号２３３のうちの１つによって定義されるＮ末端部分を含み、中間配列が、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１
    ２６、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、および配列番号２２４からなる群から選択される、請求項４０に記載のポリペプチド。
  43. 配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５４、配列番号６０、配列番号６１、配列番号７７、配列番号７８、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、および配列番号２５４からなる群から選択される配列、またはこれらと少なくとも約８５％同一なポリペプチドを含む、前記請求項のいずれかに記載のポリペプチド。
  44. 組成物または試料中のリンカーのうちの少なくとも約７０％が、配列番号９８のＫ５の側鎖のε−アミノ基または配列番号６の残基８０に対応する位置に位置するＫの側鎖のε−アミノ基にコンジュゲートされている、請求項２３から４３のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物。
  45. ポリペプチドのうちの少なくとも約７０％が、配列番号９８のＫ５の側鎖のε−アミノ基または配列番号６の残基８０に対応する位置に位置するＫの側鎖のε−アミノ基に共有結合されているリンカーを含む、請求項２３から４３のいずれか一項に記載の複数種のポリペプチドを含む組成物。
  46. 前記請求項のいずれかに記載のポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合部分。
  47. 全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＶＨ、二重特異性抗体、またはミニボディである、請求項４６に記載の抗体。
  48. ｈ３８Ｃ２、リツキシマブ、セツキシマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、ナタリズマブ、オマリズマブ、ラニビズマブ、トラスツズマブ、およびパリビズマブからなる群から選択される抗体からのＶＨおよびＶＬドメインを含む、請求項４６から４７のいずれか一項に記載の抗体。
  49. 請求項１から４３のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項４４もしくは４５のいずれか一項に記載の組成物、または請求項４６から４８のいずれか一項に記載の抗体を含み、かつ許容できる担体をさらに含む医薬組成物。
  50. 請求項１から２２のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項４６から４８のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。
  51. 請求項５０に記載の核酸を含む、宿主細胞。
  52. 請求項５０に記載の核酸を含むベクター。
  53. 請求項２３〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む多機能性抗体コンジュゲート（ＭＡＣ）、または請求項４４から４５のいずれか一項に記載の組成物を調製する方法であって、リンカーを、下式：
    Figure 2015504893
     ［式中、Ｒ１はＦまたはＣｌであり、ｈ＝２、３、４または５である］の脱離基Ｚ＊に共有結合させるステップと、このリンカー−Ｚ＊基を前記ポリペプチドと反応させるステップとを含む方法。
  54. Ｒ１がＦである、請求項５１に記載の方法。
  55. ｈ＝３、４、または５である、請求項５３から５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. ｈ＝４または５である、請求項５３から５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 請求項２３から４３のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む多機能性抗体コンジュゲート（ＭＡＣ）、または請求項４４から４５のいずれか一項に記載の組成物を調製する方法であって、リンカーを、
    Figure 2015504893
     からなる群から選択される脱離基Ｚ＊に共有結合させるステップを含む方法。
  58. Ｚ＊が下式：
    Figure 2015504893
     のものである、請求項５３から５７のいずれか一項に記載の方法。
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