JP2015156831A - ルブソシドの製造方法 - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【解決手段】ステビアを、乳酸菌を用いて処理する工程を含むことを特徴とするルブソシドの製造方法。
【選択図】なし
Description
本発明者らは、上記以外にも下記するように種々の思いがけない新知見を得て、さらに鋭意検討を重ねて本発明を完成するに至った。
[1]ステビアを、乳酸菌を用いて処理する工程を含むことを特徴とするルブソシドの製造方法。
[2]乳酸菌が、ラクトバチルス属の乳酸菌である前記[1]に記載の製造方法。
[3]乳酸菌が、ラクトバチルス カゼイ ハセガワ菌株(受託番号:FERM BP−10123)である前記[1]又は[2]に記載の製造方法。
[4]ステビアが、ステビオシドを含有する前記[1]〜[3]のいずれか一項に記載の製造方法。
[5]乳酸菌を用いた処理温度が、25〜60℃である前記[1]〜[4]のいずれか一項に記載の製造方法。
[6]ステビオシドを、乳酸菌を用いて処理する工程を含むことを特徴とするルブソシドの製造方法。
[7]乳酸菌が、ラクトバチルス属の乳酸菌である前記[6]に記載の製造方法。
[8]乳酸菌が、ラクトバチルス カゼイ ハセガワ菌株(受託番号:FERM BP−10123)である前記[6]又は[7]に記載の製造方法。
[9]乳酸菌を用いた処理温度が、25〜60℃である前記[6]〜[8]のいずれか一項に記載の製造方法。
また、本発明によれば、精製酵素ではなく、生体触媒、あるいは適宜乾燥固定した死菌粉体としてそのまま利用が可能な菌を使用することができるため、簡便なルブソシドの大量生産方法を提供することができる。
さらに、本発明によれば、ルブソシドを安価で簡便に製造することができるため、ルブソシドを甘味料や天然可溶化剤として実用化する新規かつ有用な産業を創造することができる。
本発明のルブソシドの製造方法は、ステビアを、乳酸菌を用いて処理する工程を含むことを特徴とする。
本発明のルブソシドの製造方法は、ステビアを、乳酸菌を用いて処理する工程以外の工程を含んでも良い。
また、前記ステビアは、成分としてステビオシドを含有することが好ましい。ステビア中のステビオシドの含有量は、特に限定されないが、ステビア全量に対して、好ましくは、約0.1〜20重量%であり、より好ましくは、約1〜15重量%である。
前記乳酸菌処理は、例えば、ステビアを含有する培地を常法により加熱減菌処理した後、該培地に乳酸菌を接種し、培養することで処理する方法が挙げられる。また、予めステビアを含有しない培地にて乳酸菌を増殖させ、遠心分離により菌体を得た後、該菌体に滅菌蒸留水又はPBS(−)等の滅菌リン酸緩衝生理食塩水にてステビアを抽出した混合溶液をそのまま無菌的に加えて培養することで、乳酸菌処理を行ってもよい。後の精製作業を考慮すると、余計な培地成分を含有しない滅菌水中での処理がより好ましい。なお、処理に用いる乳酸菌は生菌体のままでもよい。生菌体としては増殖期の菌体でも良いし、休止菌体を用いても良い。あるいは適宜溶媒により固定・乾燥を経た死滅粉体を用いても良いが、生菌体が好ましい。
滅菌方法としては、例えば、加熱滅菌、高圧滅菌、濾過滅菌等が挙げられ、これらに限定されることなく従来公知の方法を使用することができる。また、死滅粉体は、従来公知の方法を用いて取得することができる。
培地中の炭素源及び窒素源の濃度は、乳酸菌が生育できる通常の濃度であればよく、特に限定されない。培養開始時の炭素源濃度は、通常は、培地全量に対して約0.1〜15重量%が好ましく、約1〜10重量%がより好ましい。培養開始時の窒素源の濃度は、通常は、培地全量に対して約0.05〜10重量%が好ましく、約0.1〜5重量%がより好ましい。
pH緩衝剤としては、特に限定されないが、例えば、炭酸カルシウム等が好ましく挙げられる。
本発明において、ステビアは、原料として培地に添加される。ステビアは、天然物でもその加工品でも良い。加工品としては、例えば、ステビアの乾燥物、裁断物、粉砕物、抽出物、ペースト等が挙げられる。
ステビアの使用量は、特に限定されないが、培地全量に対して、好ましくは、約1〜50重量%であり、より好ましくは、約5〜40重量%である。
前記培地は、本発明の効果を奏する限り、上述したステビア以外の成分や添加剤を含んでも良い。
予めステビアを含有しない培地に乳酸菌を接種して培養し、遠心分離により菌体を得た後、該菌体に滅菌蒸留水又はPBS(−)等の減菌リン酸緩衝生理食塩水を加えることにより、乳酸菌を含有する培地が好ましく得られる。該乳酸菌含有培地に、予め公知の方法で滅菌処理を施した前記ステビア又はその加工品を別途添加して、培養することにより、ステビアを乳酸菌を用いて処理した生産物を好ましく取得することができる。前記乳酸菌含有培地に添加するステビア又はその加工品としては、前記[0012]に記載のステビアを使用することができるし、ステビアに抽出溶媒を添加してステビア成分を抽出させることにより得られる抽出液、ステビア及び抽出溶媒の懸濁液そのままのもの、又は該懸濁液を常法により加熱して得られる熱水抽出液を使用することもできる。前記懸濁液を加熱する温度は、特に限定されないが、通常、約40〜90℃である。
また、培地として、前記抽出液、懸濁液又は熱水抽出液を使用することもでき、該培地を減菌した後、該培地に乳酸菌を直接接種して培養することにより、ステビアを乳酸菌を用いて処理した生産物を好ましく取得することもできる。
これらの工程において使用されるステビアは、ステビアの葉を乾燥粉末化したもの、あるいは該粉末を適宜溶媒で抽出したものが好ましい。
また、乳酸菌を用いて処理する処理時間は、前記培地の組成、該培地の乳酸菌接種量、前記処理温度等に応じて適宜設定され得るが、例えば、約12〜336時間が好ましく、約24〜168時間がより好ましい。乳酸菌処理は、好気条件下で行ってもよく、嫌気条件下で行っても良い。
ステビオシドを溶解させる溶媒は、特に限定されないが、例えば、蒸留水、イオン交換水、生理食塩水、有機溶媒等が挙げられる。これらは1種単独で又は2種以上を組合せて使用することができる。前記有機溶媒としては、アセトニトリル;ジメチルスルホキシド;メタノール、エタノール、n−プロパノール、イソプロパノール、t−ブタノール等の低級アルコール;グリセリン、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール等の液状多価アルコール;アセトン等のケトン類;酢酸エチルエステル等のエステル類等が挙げられる。これらは1種単独で又は2種以上を組合せて使用することができる。前記ステビオシドを溶解させる溶媒は、好ましくは、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、蒸留水、エタノール、含水エタノール等であり、より好ましくは、蒸留水、含水エタノール等である。
粉末食品としては、例えば、野菜・果実類、植物、酵母、藻類等を粉末にした各種粉末;油脂類・香料類(バニラ、柑橘類、かつお等)を粉末固形化したもの等が挙げられる。
尚、以下の実施例及び図において、PBS(−)とは、リン酸緩衝生理食塩水を意味し、乳酸菌とはラクトバチルス カゼイ ハセガワ菌株(受託番号:FERM−BP−10123)を意味する。
<ステビオシド−乳酸菌処理サンプル及びステビオシドサンプルの調製>
予め一般乳酸菌接種用培地(ニッスイ社製)に乳酸菌(ラクトバチルス カゼイ ハセガワ菌株)を一白金耳植え、37℃で静置培養した後、遠心及びPBS(−)にて菌体ペレットの洗浄を行い、乳酸菌1×1010cfuを含むPBS(−)1mL溶液を1.5mLチューブへ用意した。一方で、市販のステビオシド(長良サイエンス社製)を、予め80%アセトニトリル溶液に20mg/mLのステビオシド濃度となるように溶解したストック溶液を用意した。該ストック溶液を、乳酸菌菌体が含まれているPBS(−)溶液へステビオシドの最終濃度が40μg/mLになるように加え、37℃で48時間静置した。これをステビオシド−乳酸菌処理サンプル1とした。また、ネガティブコントロールとして、乳酸菌を含まないPBS(−)にステビオシドを最終濃度40μg/mLになるよう前記ストック溶液を加え、同様に37℃で48時間静置したものも用意した。これをステビオシドサンプル1とした。
<HPLCによる分析>
上記の通り得られたステビオシド−乳酸菌処理サンプル1及びステビオシドサンプル1を遠心し、上清10μLを以下の条件下でHPLCへ供した。HPLC(島津製作所社製)では分離カラムにYMC−Pack ODS−A (I.D. 250×4.6mm、S−5μm、12nm;YMC社製)を用いた逆相系を使用し、移動相として水及びアセトニトリルを用いたグラジエント条件下で分析を行った。カラムオーブンを37℃に設定したまま10%アセトニトリル溶液から開始し、0分から25分までに100%まで濃度を上げ、その後100%アセトニトリルによる洗浄工程を経る条件を用いた。流速1mL/分で210nmでの検出を行った。
ステビオシド−乳酸菌処理サンプル1及びステビオシドサンプル1のHPLC測定データを、それぞれ図1及び図2に示す。
予め一般乳酸菌接種用培地(ニッスイ社製)に乳酸菌(ラクトバチルス カゼイ ハセガワ菌株)を植え、37℃で静置培養した後、遠心及びPBS(−)にて菌体ペレットの洗浄を行い、乳酸菌1×1010cfuを含むPBS(−)1mL溶液を1.5mLチューブへ用意した。これを乳酸菌含有サンプルとした。本サンプルを遠心し、上清10μLを上述のHPLC条件で分析に供した。
乳酸菌含有サンプルのHPLC測定データを図3に示す。
市販のルブソシド(和光社製)を予めジメチルスルホキシシド(DMSO)(ナカライテスク社製)に20mg/mLの濃度となるように溶解したストック溶液を用意した。乳酸菌を含まないPBS(−)にルブソシドを最終濃度40μg/mLになるよう加え、37℃で48時間静置したものも用意した。これをルブソシドサンプルとした。このサンプル10μLを上述のHPLC条件で分析に供した。
ルブソシドサンプルのHPLC測定データを図4に示す。
図1〜4の結果から、ステビオシドの乳酸菌処理物であるステビオシド−乳酸菌処理サンプル1(図1)では、14.2min付近のステビオシドのピーク(図2のピーク)が消失し、15.5min付近のルブソシドのピーク(図4のピーク)が生成したことが確認された。
実施例1において、80%アセトニトリル溶液をDMSOに変更した以外は、実施例1と同様の操作を行ない、ステビオシド−乳酸菌処理サンプル2、及びステビオシドサンプル2を調製し、実施例1と同様の方法を用いてHPLCを測定した。ステビオシド−乳酸菌処理サンプル2、及びステビオシドサンプル2のHPLC測定結果を、それぞれ図5及び図6に示す。
これらの図5及び図6の結果からも、乳酸菌を用いたステビオシドの処理により、ステビオシドが消失し、ルブソシドが生成したことが確認された。
実施例1及び2のHPLC測定で使用した6種の各サンプル溶液、各6μLを、TLC(薄層クロマトグラフィー)シリカゲルプレート(TLC silica gel 60 F254、メルク社製)へスポットし、移動相をクロロホルム:メタノール:水が15:13:2(v/v/v)の割合となるよう調整し、展開した後、該TLCシリカゲルプレートを乾燥し、10%硫酸溶液により噴霧した後、ドライヤーにて発色させた。その写真を図7に示す。
図7において、1はステビオシドサンプル1、2はステビオシドサンプル2、3はルブソシドサンプル、4はステビオシド−乳酸菌処理サンプル1、5はステビオシド−乳酸菌処理サンプル2、6は乳酸菌含有サンプルの展開パターンを示す。
その結果、ステビオシドの乳酸菌処理物である4:ステビオシド−乳酸菌処理サンプル1、及び5:ステビオシド−乳酸菌処理サンプル2は、ルブソシド単体の溶液(3:ルブソシドサンプル)と同じ位置にメインバンドを示し、ステビオシドの乳酸菌処理物が、ルブソシドを主成分として含有することが確認された。
<ステビア抽出物の調製>
ステビア葉の乾燥粉末を10g測りとり、そこへ蒸留水を100mL加え、撹拌しながら80℃で3時間抽出を行った。その後、No.2のろ紙(アドバンテック社製)で濾過し、得られた溶液を凍結乾燥へと供した。
<ステビア抽出物―乳酸菌処理サンプルの調製>
予め一般乳酸菌接種用培地(ニッスイ社製)に乳酸菌(ラクトバチルス カゼイ ハセガワ菌株)を植え、37℃で静置培養した後、遠心及びPBS(−)にて菌体ペレットの洗浄を行い、乳酸菌1×1010cfuを含むPBS(−)1mL溶液を1.5mLチューブへ用意した。一方で上記のステビア抽出物を予め滅菌蒸留水(H2O)に40mg/mLの濃度となるように溶解したストック溶液を用意した。該ストック溶液を0.22μm滅菌フィルターを通して滅菌し、乳酸菌菌体が含まれているPBS(−)溶液へステビア抽出物の最終濃度が8mg/mLになるように加え、37℃で96時間静置した。これをステビア抽出物―乳酸菌処理サンプルとした。
<HPLCによる分析>
上記の通り得られたステビア抽出物―乳酸菌処理サンプルを遠心し、上清10μLを以下の条件下でHPLCへ供した。HPLC(島津製作所社製)では分離カラムにYMC−Pack ODS−A (I.D. 250×4.6mm、S−5μm、12nm;YMC社製)を用いた逆相系を使用し、移動相として水及びアセトニトリルを用いたグラジエント条件下で分析を行った。カラムオーブンを37℃に設定したまま10%アセトニトリル溶液から開始し、0分から25分までに100%まで濃度を上げ、その後100%アセトニトリルによる洗浄工程を経る条件を用いた。流速1mL/分で210nmでの検出を行った。
ステビア抽出物―乳酸菌処理サンプルのHPLC測定データを図8に示す。
<ステビア抽出物サンプルの調製>
ネガティブコントロールとして、乳酸菌を含まないPBS(−)に前記ステビア抽出物を最終濃度8mg/mLになるよう加え、同様に37℃で96時間静置したものも用意した。これをステビア抽出物サンプルとした。該サンプルを実施例4と同様の方法を用いてHPLC測定を行った。
ステビア抽出物サンプルのHPLC測定データを図8に示す。
図8の結果から、比較例1のステビア抽出物サンプルに含有される14.2min付近のステビオシドのピークが、実施例4のステビア抽出物―乳酸菌処理サンプルでは減少しており、実施例4のピークでは15.5min付近のルブソシドのピークが見られた。従って、ステビア抽出物に含有されるステビオシドを、乳酸菌を用いて処理することにより、ルブソシドを製造することができることが示された。
Claims (9)
- ステビアを、乳酸菌を用いて処理する工程を含むことを特徴とするルブソシドの製造方法。
- 乳酸菌が、ラクトバチルス属の乳酸菌である請求項1に記載の製造方法。
- 乳酸菌が、ラクトバチルス カゼイ ハセガワ菌株(受託番号:FERM BP−10123)である請求項1又は2に記載の製造方法。
- ステビアが、ステビオシドを含有する請求項1〜3のいずれか一項に記載の製造方法。
- 乳酸菌を用いた処理温度が、25〜60℃である請求項1〜4のいずれか一項に記載の製造方法。
- ステビオシドを、乳酸菌を用いて処理する工程を含むことを特徴とするルブソシドの製造方法。
- 乳酸菌が、ラクトバチルス属の乳酸菌である請求項6に記載の製造方法。
- 乳酸菌が、ラクトバチルス カゼイ ハセガワ菌株(受託番号:FERM BP−10123)である請求項6又は7に記載の製造方法。
- 乳酸菌を用いた処理温度が、25〜60℃である請求項6〜8のいずれか一項に記載の製造方法。
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